Dankie dat u Nature.com besoek het. Die blaaierweergawe wat u gebruik, het beperkte ondersteuning vir CSS. Vir die beste ervaring beveel ons aan dat u 'n opgedateerde blaaier gebruik (of versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer afskakel). Intussen, om voortgesette ondersteuning te verseker, sal ons die webwerf sonder style en JavaScript vertoon.
Menslike dermmorfogenese vestig kript-villus-kenmerke van 3D-epiteelmikroargitektuur en ruimtelike organisasie. Hierdie unieke struktuur is nodig om dermhomeostase te handhaaf deur die stamselnis in die basale krip te beskerm teen eksogene mikrobiese antigene en hul metaboliete. Daarbenewens bied dermvilli en afskeiende slym funksioneel gedifferensieerde epiteelselle met 'n beskermende versperring op die dermslymvliesoppervlak. Daarom is die herskepping van 3D-epiteelstrukture van kritieke belang vir die konstruksie van in vitro dermmodelle. Dit is opmerklik dat die organiese mimetiese derm-op-'n-skyfie spontane 3D-morfogenese van die dermepiteel kan veroorsaak met verbeterde fisiologiese funksies en biomeganika. Hier bied ons 'n reproduceerbare protokol om dermmorfogenese in die derm robuust te induseer op 'n mikrofluidiese skyfie sowel as in 'n Transwell-ingebedde hibriede skyfie. Ons beskryf gedetailleerde metodes vir toestelvervaardiging, kweek van Caco-2- of dermorganoïede epiteelselle in konvensionele omgewings sowel as op 'n mikrofluidiese platform, induksie van 3D-morfogenese en karakterisering. van gevestigde 3D-epiteel met behulp van verskeie beeldmodaliteite. Hierdie protokol bereik regenerasie van funksionele dermmikroargitektuur deur basolaterale vloeistofvloei vir 5 dae te beheer. Ons in vitro morfogenese-metode gebruik fisiologies relevante skuifspanning en meganiese beweging en vereis nie komplekse sel-ingenieurswese of manipulasie nie, wat ander bestaande tegnieke kan oortref. Ons voorsien dat ons voorgestelde protokol breë implikasies vir die biomediese navorsingsgemeenskap kan hê, en 'n metode bied om 3D-derm-epiteellae in vitro te regenereer vir biomediese, kliniese en farmaseutiese toepassings.
Eksperimente toon dat dermepiteel Caco-2-selle wat in derm-op-'n-skyfie1,2,3,4,5 of dubbellaag-mikrofluidiese toestelle6,7 gekweek word, spontane 3D-morfogenese in vitro kan ondergaan sonder 'n duidelike begrip van die onderliggende meganisme. In ons onlangse studie het ons gevind dat die verwydering van basolateraal-gesekreteerde morfogeen-antagoniste uit kultuurtoestelle nodig en voldoende is om 3D-epiteelmorfogenese in vitro te induseer, wat deur Caco-2 en pasiënt-afgeleide dermorganoïede gedemonstreer is. Epiteelselle is gevalideer. In hierdie studie het ons spesifiek gefokus op die selproduksie en konsentrasieverspreiding van 'n kragtige Wnt-antagonis, Dickkopf-1 (DKK-1), in derm-op-'n-skyfie en gemodifiseerde mikrofluidiese toestelle wat Transwell-insetsels bevat, genaamd "Hibriedskyfie". Ons demonstreer dat die byvoeging van eksogene Wnt-antagoniste (soos DKK-1, Wnt-repressor 1, afgeskeide frizzled-verwante proteïen 1, of Soggy-1) tot die derm op die skyfie morfogenese inhibeer of die voorafgestruktureerde 3D-epiteellaag ontwrig, wat daarop dui dat antagonistiese stres tydens kultuur verantwoordelik is vir dermmorfogenese in vitro. Daarom is 'n praktiese benadering om robuuste morfogenese by die epiteelkoppelvlak te bereik, om die vlakke van Wnt-antagoniste in die basolaterale kompartement te verwyder of minimaal te handhaaf deur aktiewe spoeling (bv. in derm-op-'n-skyfie of hibriede-op-'n-skyfie-platforms) of diffusie. Basolaterale media (bv. van Transwell-insetsels in groot basolaterale reservoirs in putte).
In hierdie protokol verskaf ons 'n gedetailleerde metode vir die vervaardiging van derm-op-'n-skyfie-mikrotoestelle en Transwell-invoegbare hibriede skyfies (stappe 1-5) om dermepiteelselle op polidimetilsiloksaan (PDMS)-gebaseerde poreuse membrane (stappe 6A, 7A, 8, 9) of poliëstermembrane van Transwell-invoegsels (stappe 6B, 7B, 8, 9) te kweek en 3D-morfogenese in vitro te geïnduseer (stap 10). Ons het ook sellulêre en molekulêre kenmerke geïdentifiseer wat dui op weefselspesifieke histogenese en afstammingsafhanklike sellulêre differensiasie deur veelvuldige beeldmodaliteite toe te pas (stappe 11-24). Ons induseer morfogenese met behulp van menslike dermepiteelselle, soos Caco-2 of dermorganoïede, in twee kultuurformate met tegniese besonderhede, insluitend oppervlakmodifikasie van poreuse membrane, skepping van 2D-monolae, en dermbiochemiese en reproduksie van die biomeganiese mikro-omgewing in vitro. Om 3D-morfogenese uit 2D-epiteelmonolae te induseer, het ons morfogeen verwyder. antagoniste in beide gekweekte vorms deur die medium in die basolaterale kompartement van die kultuur te laat vloei. Laastens verskaf ons 'n voorstelling van die nut van 'n regenereerbare 3D-epiteellaag wat gebruik kan word om morfogeen-afhanklike epiteelgroei, longitudinale gasheer-mikrobioom-ko-kulture, patogeeninfeksie, inflammatoriese besering, epiteelversperringsdisfunksie en probiotika-gebaseerde terapieë Voorbeeld.invloede te modelleer.
Ons protokol kan nuttig wees vir 'n wye reeks wetenskaplikes in basiese (bv. dermslymvliesbiologie, stamselbiologie en ontwikkelingsbiologie) en toegepaste navorsing (bv. prekliniese geneesmiddeltoetsing, siektemodellering, weefselingenieurswese en gastroënterologie) breë impak. As gevolg van die reproduceerbaarheid en robuustheid van ons protokol om 3D-morfogenese van die dermepiteel in vitro te induseer, voorsien ons dat ons tegniese strategie versprei kan word na gehore wat die dinamika van selseintransduksie tydens dermontwikkeling, regenerasie of homeostase bestudeer. Daarbenewens is ons protokol nuttig vir die ondersoek van infeksie onder verskeie aansteeklike agente soos Norovirus 8, Ernstige Akute Respiratoriese Sindroom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 of Vibrio cholerae. Gehore van siektepatologie en patogenese is ook nuttig. Die gebruik van 'n mikrofisiologiestelsel op die skyfie van die derm kan longitudinale ko-kultuur 10 en daaropvolgende assessering van gasheerverdediging, immuunresponse en patogeenverwante beseringsherstel in die gastroïntestinale (GI) kanaal 11 moontlik maak. Ander GI-afwykings wat verband hou met lekkende dermsindroom, coeliakie, Crohn se siekte, ulseratiewe kolitis, pouchitis of prikkelbare dermsindroom kan gesimuleer word wanneer 3D-derm-epiteellae voorberei word met behulp van die pasiënt se 3D-derm-epiteellae. Hierdie siektes sluit in villusatrofie, kripverkorting, mukosale skade of verswakte epiteelversperring. Biopsie of stamsel-afgeleide dermorganoïede 12,13. Om die hoër kompleksiteit van die siekteomgewing beter te modelleer, kan lesers oorweeg om siekte-relevante seltipes, soos pasiënt perifere bloedmononukleêre selle (PBMC's), by te voeg tot modelle wat 3D-dermvillus-kript-mikroargitekture bevat. weefselspesifieke immuunselle, 5.
Aangesien 3D-epiteelmikrostruktuur vasgestel en gevisualiseer kan word sonder die snitproses, kan kykers wat aan ruimtelike transkriptomika en hoë-resolusie- of super-resolusiebeelding werk, belangstel in ons kartering van die ruimtelike-temporale dinamika van gene en proteïene op epiteelnisse. Belanggestel in tegnologie. Reaksie op mikrobiese of immuunstimuli. Verder kan longitudinale gasheer-mikrobioom-kruisspraak 10, 14 wat dermhomeostase koördineer, in die 3D-dermslymvlieslaag gevestig word deur verskeie mikrobiese spesies, mikrobiese gemeenskappe of fekale mikrobiota saam te kweek, veral in die derm-op-'n-skyfie. in die platform. Hierdie benadering is veral aantreklik vir gehore wat mukosale immunologie, gastroënterologie, menslike mikrobioom, kulturomika en kliniese mikrobiologie bestudeer wat voorheen ongekweekte dermmikrobiota in die laboratorium wil kweek. Indien ons in vitro morfogenese-protokol aangepas kan word vir skaalbare kultuurformate, soos multiput-insetsels in 24-, 96- of 384-putplate wat voortdurend basolaterale kompartemente aanvul, kan die protokol ook versprei word na diegene wat farmaseutiese, biomediese of hoë-deurset sifting- of valideringsplatforms vir die voedselbedryf ontwikkel. As 'n bewys-van-beginsel het ons onlangs die uitvoerbaarheid van 'n multiplex hoë-deurset morfogenese-stelsel gedemonstreer wat skaalbaar is na 'n 24-putplaatformaat. Daarbenewens is verskeie orgaan-op-'n-skyfie-produkte gekommersialiseer16,17,18. Daarom kan die validering van ons in vitro morfogenese-metode versnel en moontlik aangeneem word deur baie navorsingslaboratoriums, industrie of regerings- en regulerende agentskappe om sellulêre herprogrammering van in vitro dermmorfogenese op die transkriptomiese vlak te verstaan ​​om medisyne of bioterapeutiese middels te toets. Die absorpsie en Die vervoer van geneesmiddelkandidate is geassesseer met behulp van 3D-dermsurrogate of met behulp van pasgemaakte of kommersiële orgaan-op-'n-skyfie-modelle om die reproduceerbaarheid van die dermmorfogenese-proses te bepaal.
'n Beperkte aantal mens-relevante eksperimentele modelle is gebruik om dermepiteelmorfogenese te bestudeer, hoofsaaklik as gevolg van die gebrek aan implementeerbare protokolle om 3D-morfogenese in vitro te induseer. Trouens, baie van die huidige kennis oor dermmorfogenese is gebaseer op dierstudies (bv. sebravisse20, muise21 of hoenders22). Hulle is egter arbeids- en koste-intensief, kan eties twyfelagtig wees, en bowenal, bepaal nie presies menslike ontwikkelingsprosesse nie. Hierdie modelle is ook baie beperk in hul vermoë om op 'n veelsydige skaalbare wyse getoets te word. Daarom oortref ons protokol vir die regenereer van 3D-weefselstrukture in vitro in vivo-diermodelle sowel as ander tradisionele statiese 2D-selkultuurmodelle. Soos voorheen beskryf, het die gebruik van 3D-epiteelstrukture ons toegelaat om die ruimtelike lokalisering van gedifferensieerde selle in die kript-villus-as te ondersoek in reaksie op verskeie mukosale of immuunstimuli. 3D-epiteellae kan 'n ruimte bied om te bestudeer hoe mikrobiese selle meeding om ruimtelike nisse te vorm en ekologiese evolusie in reaksie op gasheerfaktore (bv. binneste teenoor buitenste mukuslae, afskeiding van IgA en antimikrobiese peptiede). Verder kan 3D-epiteelmorfologie ons toelaat om te verstaan ​​hoe die dermmikrobiota sy gemeenskappe struktureer en sinergisties mikrobiese metaboliete (bv. kortketting-vetsure) produseer wat sellulêre organisasie en stamselnisse in die basale kripte vorm. Hierdie kenmerke kan slegs gedemonstreer word wanneer 3D-epiteellae in vitro gevestig word.
Benewens ons metode om 3D-derm-epiteelstrukture te skep, is daar verskeie in vitro-metodes. Dermorganoïedkultuur is 'n moderne weefselingenieurswese-tegniek gebaseer op die kweek van dermstamselle onder spesifieke morfogeentoestande23,24,25. Die gebruik van 3D-organoïedmodelle vir vervoeranalise of gasheer-mikrobioom-ko-kulture is egter dikwels uitdagend omdat die dermlumen binne die organoïed ingesluit is en daarom die bekendstelling van luminale komponente soos mikrobiese selle of eksogene antigene beperk is. Toegang tot organoïedlumens kan verbeter word deur 'n mikroinjektor te gebruik,26,27 maar hierdie metode is indringend en arbeidsintensief en vereis gespesialiseerde kennis om uit te voer. Verder weerspieël tradisionele organoïedkulture wat in hidrogel-steiers onder statiese toestande gehou word, nie akkuraat aktiewe in vivo biomeganika nie.
Ander benaderings wat deur verskeie navorsingsgroepe gebruik word, maak gebruik van voorafgestruktureerde 3D-hidrogel-steiers om die dermepiteelstruktuur na te boots deur geïsoleerde menslike dermselle op die geloppervlak te kweek. Vervaardig hidrogel-steiers met behulp van 3D-gedrukte, mikro-gemaalde of litografies vervaardigde vorms. Hierdie metode toon die selfgeorganiseerde rangskikking van geïsoleerde epiteelselle in vitro met fisiologies relevante morfogeengradiënte, wat 'n hoë-aspekverhouding epiteelstruktuur en stroma-epiteel-kruisspraak vestig deur stromale selle in die steier in te sluit. Die aard van voorafgestruktureerde steiers kan egter die vertoon van die spontane morfogenetiese proses self voorkom. Hierdie modelle bied ook nie dinamiese luminale of interstisiële vloei nie, en het nie die vloeistofskuifspanning wat dermselle nodig het om morfogenese te ondergaan en fisiologiese funksie te verkry nie. Nog 'n onlangse studie het hidrogel-steiers in 'n mikrofluidiese platform gebruik en dermepiteelstrukture gepatroneer met behulp van laser-etstegnieke. Muis-dermorganoïede volg geëtste patrone om dermbuisvormige strukture te vorm, en intraluminale vloeistofvloei kan gerekapituleer word met behulp van 'n mikrofluidika-module. Hierdie model vertoon egter nie spontane morfogenetiese prosesse nie en sluit ook nie derm-meganobiologiese bewegings in nie. 3D-druktegnieke van dieselfde groep kon miniatuur dermbuise met spontane morfogenetiese prosesse skep. Ten spyte van die komplekse vervaardiging van verskillende dermsegmente binne die buis, het hierdie model ook 'n gebrek aan luminale vloeistofvloei en meganiese vervorming. Daarbenewens kan die model se werking beperk wees, veral nadat die biodrukproses voltooi is, wat eksperimentele toestande of sel-tot-sel-interaksies versteur. In plaas daarvan bied ons voorgestelde protokol spontane dermmorfogenese, fisiologies relevante skuifspanning, biomeganika wat dermmotiliteit naboots, toeganklikheid van onafhanklike apikale en basolaterale kompartemente, en herskepping van komplekse biologiese mikro-omgewings van modulariteit. Daarom kan ons in vitro 3D-morfogenese-protokol 'n aanvullende benadering bied om die uitdagings van bestaande metodes te oorkom.
Ons protokol is geheel en al gefokus op 3D epiteelselle morfogenese, met slegs epiteelselle in kultuur en geen ander tipes omliggende selle soos mesenkiemale selle, endoteelselle en immuunselle nie. Soos voorheen beskryf, is die kern van ons protokol die induksie van epiteelselle morfogenese deur morfogeeninhibeerders wat aan die basolaterale kant van die ingevoerde medium afgeskei word, te verwyder. Terwyl die robuuste modulariteit van ons derm-op-'n-skyfie en hibriede-op-'n-skyfie ons toelaat om die golwende 3D epiteelse laag te herskep, moet bykomende biologiese kompleksiteite soos epiteelselle-mesenkiemale interaksies33,34, ekstrasellulêre Matriks (ECM) afsetting35 en, in ons model, kript-villus kenmerke wat stamselnisse in basale kripte oordra, verder oorweeg word. Stromale selle (bv. fibroblaste) in die mesenkiem speel 'n sleutelrol in die produksie van ECM proteïene en regulering van derm morfogenese in vivo35,37,38. Die byvoeging van mesenkiemale selle aan ons model het die morfogenetiese proses en selaanhegtingsdoeltreffendheid verbeter. Die endoteellaag (d.w.s. kapillêre of limfvate) speel 'n belangrike rol in die regulering van molekulêre vervoer39 en immuunselwerwing40 in die dermmikro-omgewing. Verder is vaskulêre komponente wat tussen weefselmodelle verbind kan word, 'n voorvereiste wanneer weefselmodelle ontwerp word om multi-orgaaninteraksies te demonstreer. Daarom moet endoteelselle moontlik ingesluit word om meer akkurate fisiologiese kenmerke met orgaanvlakresolusie te modelleer. Pasiënt-afgeleide immuunselle is ook noodsaaklik vir die vertoon van aangebore immuunresponse, antigeenpresentasie, aangebore aanpasbare immuunkruisspraak en weefselspesifieke immuniteit in die konteks van die nabootsing van dermsiekte.
Die gebruik van hibriede skyfies is meer eenvoudig as derm-op-'n-skyfie omdat die toestelopstelling eenvoudiger is en die gebruik van Transwell-insetsels skaalbare kultuur van dermepiteel moontlik maak. Kommersieel beskikbare Transwell-insetsels met poliëstermembrane is egter nie elasties nie en kan nie peristaltiese bewegings simuleer nie. Verder het die apikale kompartement van die Transwell-insetsel wat in die hibriede skyfie geplaas is, stilstaande gebly sonder skuifspanning aan die apikale kant. Dit is duidelik dat die statiese eienskappe in die apikale kompartement selde langtermyn bakteriële ko-kultuur in hibriede skyfies moontlik maak. Terwyl ons 3D-morfogenese in Transwell-insetsels robuust kan induseer wanneer hibriede skyfies gebruik word, kan die tekort aan fisiologies relevante biomeganika en apikale vloeistofvloei die haalbaarheid van hibriede skyfieplatforms vir potensiële toepassings beperk.
Volskaalse rekonstruksies van die menslike kript-villus-as in derm-op-'n-skyfie en hibriede-op-'n-skyfie-kulture is nog nie ten volle vasgestel nie. Aangesien morfogenese vanaf 'n epiteel-monolaag begin, bied 3D-mikroargitekture nie noodwendig morfologiese ooreenkoms met kripte in vivo nie. Alhoewel ons die prolifererende selpopulasie naby die basale kriptdomein in die mikro-geïngenieerde 3D-epiteel gekarakteriseer het, was die kript- en villusstreke nie duidelik afgebaken nie. Alhoewel hoër boonste kanale op die skyfie lei tot verhoogde hoogte van die mikro-geïngenieerde epiteel, is die maksimum hoogte steeds beperk tot ~300–400 µm. Die werklike diepte van menslike dermkripte in die dunderm en dikderm is onderskeidelik ~135 µm en ~400 µm, en die hoogte van die dundermvilli is ~600 µm41.
Vanuit 'n beeldvormingsperspektief kan in situ superresolusiebeelding van 3D-mikroargitekture beperk word tot die derm op 'n skyfie, aangesien die vereiste werkafstand van die objektieflens na die epiteellaag in die orde van 'n paar millimeter is. Om hierdie probleem te oorkom, kan 'n verafgeleë objektief benodig word. Verder is die maak van dun snitte vir die voorbereiding van beeldmonsters uitdagend as gevolg van die hoë elastisiteit van PDMS. Verder, aangesien die laag-vir-laag mikrofabrisering van die derm op 'n skyfie permanente adhesie tussen elke laag behels, is dit uiters uitdagend om die boonste laag oop te maak of te verwyder om die oppervlakstruktuur van die epiteellaag te ondersoek. Byvoorbeeld, deur 'n skandeerelektronmikroskoop (SEM) te gebruik.
Die hidrofobisiteit van PDMS was 'n beperkende faktor in mikrofluidiese studies wat met hidrofobiese klein molekules handel, aangesien PDMS sulke hidrofobiese molekules nie-spesifiek kan adsorbeer. Alternatiewe vir PDMS kan oorweeg word met ander polimeriese materiale. Alternatiewelik kan oppervlakmodifikasie van PDMS (bv. bedekking met lipofiele materiale 42 of poli(etileenglikol) 43) oorweeg word om adsorpsie van hidrofobiese molekules te minimaliseer.
Laastens is ons metode nie goed gekarakteriseer in terme van die verskaffing van 'n hoë-deurset sifting of "een-grootte-pas-almal" gebruikersvriendelike eksperimentele platform nie. Die huidige protokol vereis 'n spuitpomp per mikrotoestel, wat spasie in 'n CO2-inkubeerder opneem en grootskaalse eksperimente voorkom. Hierdie beperking kan aansienlik verbeter word deur die skaalbaarheid van innoverende kultuurformate (bv. 24-put, 96-put of 384-put poreuse inserts wat deurlopende aanvulling en verwydering van basolaterale media moontlik maak).
Om 3D-morfogenese van menslike dermepiteel in vitro te induseer, het ons 'n mikrofluidiese skyfie-dermtoestel gebruik wat twee parallelle mikrokanale en 'n elastiese poreuse membraan tussenin bevat om 'n lumen-kapillêre koppelvlak te skep. Ons demonstreer ook die gebruik van 'n enkelkanaal-mikrofluidiese toestel (’n hibriede skyfie) wat deurlopende basolaterale vloei onder gepolariseerde epiteellae wat op Transwell-insetsels gekweek word, verskaf. In beide platforms kan morfogenese van verskeie menslike dermepiteelselle gedemonstreer word deur rigtingmanipulasie van vloei toe te pas om morfogeen-antagoniste uit die basolaterale kompartement te verwyder. Die hele eksperimentele prosedure (Figuur 1) bestaan ​​uit vyf dele: (i) mikrofabrisering van die dermskyfie of Transwell-insetbare hibriede skyfie (stappe 1-5; Kassie 1), (ii) voorbereiding van dermepiteelselle (Caco-2-selle) of menslike dermorganoïede; bokse 2-5), (iii) kultuur van dermepiteelselle op dermskyfies of hibriede skyfies (stappe 6-9), (iv) induksie van 3D-morfogenese in vitro (stap 10) en (v)) om die 3D-epiteelmikrostruktuur te karakteriseer (stappe 11-24). Laastens is 'n toepaslike kontrolegroep (verder hieronder bespreek) ontwerp om die effektiwiteit van in vitro-morfogenese te valideer deur epiteelmorfogenese te vergelyk met ruimtelike, temporale, voorwaardelike of prosedurele kontroles.
Ons het twee verskillende kultuurplatforms gebruik: derm-op-'n-skyfie met reguit kanale of nie-lineêre ingewikkelde kanale, of hibriede skyfies wat Transwell (TW) insetsels in 'n mikrofluidiese toestel bevat, vervaardig soos beskryf in Kassie 1, en stap 1-5. ”Toestelvervaardiging” toon die hoofstappe in die maak van 'n enkele skyfie of 'n hibriede skyfie. ”Kultuur van Menslike Derm-epiteelselle” verduidelik die selbron (Caco-2 of menslike dermorganoïede) en kultuurprosedure wat in hierdie protokol gebruik word. ”In vitro morfogenese” toon die algehele stappe waarin Caco-2 of organoïed-afgeleide epiteelselle op 'n dermskyfie of op Transwell-insetsels van 'n hibriede skyfie gekweek word, gevolg deur induksie van 3D-morfogenese en die vorming van 'n gekarakteriseerde epiteelstruktuur. Die programstapnommer of blokkienommer word onder elke pyl vertoon. Die toepassing verskaf voorbeelde van hoe gevestigde derm-epiteellae gebruik kan word, byvoorbeeld in seldifferensiasie-karakterisering, dermfisiologiestudies, vestiging van gasheer-mikrobioom-ekosisteme en siektemodellering. Immunofluoresensie Beelde in "Seldifferensiasie" wat kerne, F-aktien en MUC2 toon wat uitgedruk word in die 3D Caco-2 epiteelse laag wat op die dermskyfie gegenereer word. MUC2-seintransduksie is teenwoordig in bekerselle en slym wat van mukosale oppervlaktes afgeskei word. Fluoreserende beelde in Gut Physiology toon slym wat geproduseer word deur kleuring vir sialiensuur en N-asetielglukosamienresidue met behulp van fluoresserende koringkiemagglutinien. Die twee oorvleuelende beelde in "Gasheer-Mikrobe Ko-Kulture" toon verteenwoordigende gasheer-mikrobioom ko-kulture in die derm op 'n skyfie. Die linkerpaneel toon die ko-kultuur van E. coli wat groen fluorescerende proteïen (GFP) uitdruk met mikro-gemanipuleerde 3D Caco-2 epiteelselle. Die regterpaneel toon die lokalisering van GFP E. coli wat saam met 3D Caco-2 epiteelselle gekweek is, gevolg deur immunofluoresensie-kleuring met F-aktien (rooi) en kerne (blou). Siektemodellering illustreer gesonde teenoor lekkende derm in dermontstekingskyfies onder fisiologiese uitdaging met bakteriële antigene (bv. lipopolisakkaried, LPS) en immuunselle (bv. PBMC; groen).Caco-2-selle is gekweek om 'n 3D-epiteellaag te vestig. Skaalbalk, 50 µm. Beelde in onderste ry: "Differensiasie van selle" aangepas met toestemming van verwysing.2. Oxford University Press; Gereproduseer met toestemming van Ref.5. NAS; "Gasheer-Mikrobe Ko-Kultuur" aangepas met toestemming van verwysing.3. NAS; "Siektemodellering" aangepas met toestemming van verwysing.5. NAS.
Beide derm-op-skyfie en hibriede skyfies is vervaardig met behulp van PDMS-replikas wat deur sagte litografie1,44 uit silikonvorms verwyder is en met SU-8 gepatroneer is. Die ontwerp van die mikrokanale in elke skyfie word bepaal deur hidrodinamika soos skuifspanning en hidrodinamiese druk1,4,12 in ag te neem. Die oorspronklike derm-op-'n-skyfie-ontwerp (Uitgebreide Data Fig. 1a), wat uit twee langs mekaar geplaasde parallelle reguit mikrokanale bestaan ​​het, het ontwikkel tot 'n komplekse derm-op-'n-skyfie (Uitgebreide Data Fig. 1b) wat 'n paar geboë mikrokanale insluit om verhoogde vloeistofverblyftyd, nie-lineêre vloeipatrone en multiaksiale vervorming van gekweekte selle te veroorsaak (Fig. 2a-f)12. Wanneer meer komplekse dermbiomeganika herskep moet word, kan komplekse derm-op-'n-skyfie gekies word. Ons het gedemonstreer dat die ingewikkelde Derm-Skyfie ook sterk 3D-morfogenese in 'n soortgelyke tydsraamwerk veroorsaak met 'n soortgelyke mate van epiteelgroei in vergelyking met die oorspronklike. Derm-skyfie, ongeag die gekweekte seltipe. Daarom, om 3D-morfogenese te veroorsaak, is lineêre en komplekse dermontwerpe op die skyfie uitruilbaar. PDMS-replikas wat op silikonvorms met SU-8-patrone uitgehard is, het negatiewe kenmerke na ontvorming verskaf (Fig. 2a). Om die derm op 'n skyfie te vervaardig, is die voorbereide boonste PDMS-laag opeenvolgend aan 'n poreuse PDMS-film gebind en dan met die onderste PDMS-laag in lyn gebring deur onomkeerbare binding met behulp van 'n koronabehandelaar (Fig. 2b-f). Om hibriede skyfies te vervaardig, is uitgeharde PDMS-replikas aan glasskyfies gebind om enkelkanaal-mikrofluidiese toestelle te skep wat Transwell-insetsels kon akkommodeer (Fig. 2h en Uitgebreide Data Fig. 2). Die bindingsproses word uitgevoer deur die oppervlaktes van die PDMS-replika en glas met suurstofplasma of koronabehandeling te behandel. Na sterilisasie van die mikrovervaardigde toestel wat aan die silikoonbuis geheg is, was die toestelopstelling gereed om 3D-morfogenese van die dermepiteel uit te voer (Figuur 2g).
a, Skematiese illustrasie van die voorbereiding van PDMS-onderdele van SU-8-patroon silikonvorms. Die ongeharde PDMS-oplossing is op 'n silikonvorm (links) gegooi, teen 60 °C (middel) gehard en uit die vorm verwyder (regs). Die uit die vorm verwyderde PDMS is in stukke gesny en skoongemaak vir verdere gebruik. b, Foto van die silikonvorm wat gebruik is om die boonste laag van die PDMS voor te berei. c, Foto van die silikonvorm wat gebruik is om die poreuse membraan van die PDMS te vervaardig. d, 'n Reeks foto's van die boonste en onderste PDMS-komponente en die saamgestelde dermtoestel op die skyfie. e, Skematiese voorstelling van die belyning van die boonste, membraan- en onderste PDMS-komponente. Elke laag word onomkeerbaar gebind deur plasma- of koronabehandeling. f, Skematiese voorstelling van die vervaardigde derm-op-'n-skyfie-toestel met gesuperponeerde ingewikkelde mikrokanale en vakuumkamers. g, Opstelling van derm-op-'n-skyfie vir mikrofluidiese selkultuur. Die vervaardigde derm op 'n skyfie wat met 'n silikonbuis en spuit saamgestel is, is op 'n dekglas geplaas. Die skyfietoestel is op die deksel van 'n 150 mm Petri-skottel vir verwerking. Die bindmiddel word gebruik om die silikoonbuis toe te maak. h, Visuele kiekies van hibriede skyfievervaardiging en 3D-morfogenese met behulp van hibriede skyfies. Transwell-insetsels wat onafhanklik voorberei is om 2D-monolae van dermepiteelselle te kweek, is in die hibriede skyfie geplaas om derm 3D-morfogenese te veroorsaak. Die medium word geperfuseer deur mikrokanale onder die sellaag wat op die Transwell-insetsel gevestig is. Skaalbalk, 1 cm. h Herdruk met toestemming van verwysing. 4. Elsevier.
In hierdie protokol is die Caco-2-sellyn en dermorganoïede as epiteelbronne gebruik (Fig. 3a). Beide tipes selle is onafhanklik gekweek (Blokkie 2 en Blokkie 5) en gebruik om die ECM-bedekte mikrokanale van on-chip derm of Transwell-insetsels te saai. Wanneer selle konfluent is (>95% bedekking in flesse), word roetinegekweekte Caco-2-selle (tussen gange 10 en 50) in T-flesse geoes om gedissosieerde selsuspensies deur tripsinisasievloeistof voor te berei (blokkie 2). Menslike dermorganoïede van dermbiopsieë of chirurgiese reseksies is in Matrigel-steierkoepels in 24-putplate gekweek om die strukturele mikro-omgewing te ondersteun. Medium wat essensiële morfogene bevat (soos Wnt, R-spondin en Noggin) en groeifaktore wat soos beskryf in Blokkie 3 voorberei is, is elke tweede dag aangevul totdat die organoïede tot ~500 µm in deursnee gegroei het. Volgegroeide organoïede word geoes en in enkele selle gedissosieer vir saai op derm of Transwell-insetsels op 'n skyfie (Blokkie 5). Soos ons voorheen berig het, kan dit gedifferensieer word volgens siektetipe12,13 (bv. ulseratiewe kolitis, Crohn se siekte, kolorektale kanker of normale skenker), letselplek (bv. letsel teenoor nie-letselarea) en gastroïntestinale ligging in die kanaal (bv. duodenum, jejunum, ileum, cecum, kolon of rektum). Ons verskaf 'n geoptimaliseerde protokol in Blokkie 5 vir die kweek van kolonorganoïede (koloïede) wat tipies hoër konsentrasies morfogene benodig as dundermorganoïede.
a, Werkvloei vir die induksie van dermmorfogenese in die dermskyfie. Caco-2 menslike dermepiteel en dermorganoïede word in hierdie protokol gebruik om 3D-morfogenese te demonstreer. Die geïsoleerde epiteelselle is in die voorbereide derm-op-'n-skyfie-toestel gesaai (skyfievoorbereiding). Sodra selle gesaai (gesaai) en aan die PDMS-poreuse membraan op dag 0 (D0) geheg (geheg) is, word apikale (AP) vloei geïnisieer en vir die eerste 2 dae gehandhaaf (vloei, AP, D0-D2). Basolaterale (BL) vloei word ook geïnisieer saam met sikliese strekbewegings (strek, vloei, AP en BL) wanneer 'n volledige 2D-monolaag gevorm word. Derm 3D-morfogenese het spontaan plaasgevind na 5 dae van mikrofluidiese kultuur (morfogenese, D5). Fasekontrasbeelde toon verteenwoordigende morfologie van Caco-2-selle by elke eksperimentele stap of tydpunt (staafgrafiek, 100 µm). Vier skematiese diagramme wat die ooreenstemmende kaskades van dermmorfogenese illustreer (regs bo). Die stippellyn pyle in die skematiese voorstelling verteenwoordig die rigting van vloeistofvloei.b, SEM-beeld wat die oppervlaktopologie van die gevestigde 3D Caco-2-epiteel toon (links). Die insetsel wat die vergrote area (wit stippelboks) uitlig, toon die geregenereerde mikrovilli op die 3D Caco-2-laag (regs).c, Horisontale vooraansig van gevestigde Caco-2 3D, claudin (ZO-1, rooi) en deurlopende kwasgrensmembrane gemerk F-aktien (groen) en kerne (blou). Immunofluoresensie-konfokale visualisering van epiteelselle op dermskyfies. Pyle wat na die middelste skematiese voorstelling wys, dui die ligging van die fokusvlak vir elke konfokale aansig aan.d, Tydsverloop van morfologiese veranderinge in organoïede gekweek op 'n skyfie verkry deur fasekontrasmikroskopie op dae 3, 7, 9, 11 en 13. Die insetsel (regs bo) toon die hoë vergroting van die verskafde beeld.e, DIC-fotomikrografie van organoïede 3D-epiteel gevestig in die derm op sny geneem op dag 7.f, Oorvleuelende immunofluoresensiebeelde wat merkers toon vir stamselle (LGR5; magenta), bekerselle (MUC2; groen), F-aktien (grys) en kerne (siaan) wat vir 3 dae op dermskyfies gekweek is, onderskeidelik (links) en 13-dae (middel) organoïede op die epiteellaag. Sien ook Uitgebreide Data Figuur 3, wat LGR5-seintransduksie sonder MUC2-seintransduksie uitlig. Fluoresensiebeelde wat die epiteelmikrostruktuur (regs) van 3D-organoïedepiteel toon wat in die derm op 'n skyfie gevestig is deur die plasmamembraan met CellMask-kleurstof (regs) op dag 13 van kultuur te kleur. Skaalbalk is 50 μm tensy anders vermeld. b Herdruk met toestemming van verwysing. 2. Oxford University Press; c Aangepas met toestemming van verwysing. 2. Oxford University Press; e en f aangepas met toestemming deur verwysing. 12 Onder Creative Commons-lisensie CC BY 4.0.
In die derm op 'n skyfie is dit nodig om die hidrofobiese oppervlak van die PDMS poreuse membraan te wysig vir suksesvolle ECM-bedekking. In hierdie protokol pas ons twee verskillende metodes toe om die hidrofobisiteit van PDMS membrane te wysig. Vir die kweek van Caco-2 selle was oppervlakaktivering deur UV/osoonbehandeling alleen voldoende om die hidrofobisiteit van die PDMS oppervlak te verminder, die ECM te bedek en Caco-2 selle aan die PDMS membraan te heg. Mikrofluidiese kultuur van organoïede epiteel vereis egter chemiese-gebaseerde oppervlakfunksionalisering om doeltreffende afsetting van ECM proteïene te bereik deur poliëtileenimien (PEI) en glutaraldehied opeenvolgend op PDMS mikrokanale toe te pas. Na oppervlakmodifikasie is ECM proteïene neergelê om die gefunksionaliseerde PDMS oppervlak te bedek en dan in die geïsoleerde organoïede epiteel ingebring. Nadat die selle geheg is, begin die mikrofluidiese selkultuur deur slegs die medium in die boonste mikrokanaal te perfuseer totdat die selle 'n volledige monolaag vorm, terwyl die onderste mikrokanaal statiese toestande handhaaf. Hierdie geoptimaliseerde metode vir oppervlakaktivering en ECM-bedekking maak die aanhegting van organoïede moontlik. epiteel om 3D-morfogenese op die PDMS-oppervlak te induseer.
Transwell-kulture benodig ook ECM-bedekking voor selsaaiing; Transwell-kulture benodig egter nie komplekse voorbehandelingstappe om die oppervlak van poreuse inserts te aktiveer nie. Vir die kweek van Caco-2-selle op Transwell-inserts versnel ECM-bedekking op poreuse inserts die aanhegting van gedissosieerde Caco-2-selle (<1 uur) en die vorming van 'n digte verbindingsversperring (<1-2 dae). Om organoïede op Transwell-inserts te kweek, word geïsoleerde organoïede op ECM-bedekte inserts gesaai, aan die membraanoppervlak geheg (<3 uur) en in stand gehou totdat die organoïede 'n volledige monolaag met versperringsintegriteit vorm. Transwell-kulture word in 24-putplate uitgevoer sonder die gebruik van hibriede skyfies.
In vitro 3D-morfogenese kan geïnisieer word deur vloeistofvloei toe te pas op die basolaterale aspek van 'n gevestigde epiteellaag. In die derm op 'n skyfie het epiteelmorfogenese begin toe die medium in die boonste en onderste mikrokanale geperfuseer is (Fig. 3a). Soos voorheen beskryf, is dit van kritieke belang om vloeistofvloei in die inferior (basolaterale) kompartement in te voer vir die voortdurende verwydering van rigtinggewende afgeskeide morfogeeninhibeerders. Om voldoende voedingstowwe en serum aan selle wat op poreuse membrane gebind is, te verskaf en luminale skuifspanning te genereer, pas ons tipies dubbele vloei in die derm op 'n skyfie toe. In hibriede skyfies is Transwell-insetsels wat epiteelmonolae bevat, in die hibriede skyfies geplaas. Daarna is die medium onder die basolaterale kant van die poreuse Transwell-insetsel deur die mikrokanaal toegedien. Dermmorfogenese het 3-5 dae na die aanvang van basolaterale vloei in beide kultuurplatforms plaasgevind.
Die morfologiese kenmerke van mikro-gemanipuleerde 3D-epiteellae kan geanaliseer word deur verskeie beeldmodaliteite toe te pas, insluitend fasekontrasmikroskopie, differensiële interferensiekontras (DIC) mikroskopie, SEM, of immunofluoresensie-konfokale mikroskopie (Figure 3 en 4). Fasekontras- of DIC-beelding kan maklik te eniger tyd tydens kultuur uitgevoer word om die vorm en uitsteeksel van 3D-epiteellae te monitor. As gevolg van die optiese deursigtigheid van PDMS- en poliësterfilms, kan beide die derm-op-'n-skyfie- en hibriede skyfieplatforms intydse in situ-beelding verskaf sonder die behoefte aan snitte of demontage van die toestel. Wanneer immunofluoresensiebeelding uitgevoer word (Figure 1, 3c, f en 4b, c), word selle tipies gefikseer met 4% (gew/vol) paraformaldehied (PFA), gevolg deur Triton X-100 en 2% (gew/vol) beeserumalbumien (BSA), in volgorde. Afhangende van die seltipe, kan verskillende fikseermiddels, permeabilisators en blokkeringsmiddels gebruik word. Primêre teenliggaampies wat teiken Afstammingsafhanklike sel- of streekmerkers word gebruik om selle wat in situ op die skyfie geïmmobiliseer is, uit te lig, gevolg deur sekondêre teenliggaampies saam met 'n teenkleurstof wat óf die kern (bv. 4′,6-diamidino-2-fenileen) indool, DAPI) óf F-aktien (bv. fluoresensieel gemerkte falloïdien) teiken. Fluoresensie-gebaseerde lewendige beeldvorming kan ook in situ uitgevoer word om slymproduksie (Fig. 1, "Seldifferensiasie" en "Darmfisiologie"), ewekansige kolonisasie van mikrobiese selle (Fig. 1, "Gasheer-mikrobe ko-kultuur"), die werwing van immuunselle (Fig. 1, 'Siektemodellering') of die kontoere van 3D-epiteelmorfologie (Fig. 3c, f en 4b, c) op te spoor. Wanneer die derm op die skyfie gewysig word om die boonste laag van die onderste mikrokanaallaag te skei, soos beskryf in verwysing. Soos getoon in Fig. 2, kan die 3D-epiteelmorfologie sowel as die mikrovilli op die apikale kwasgrens deur SEM gevisualiseer word. (Fig. 3b). Die uitdrukking van differensiasiemerkers kan bepaal word deur kwantitatiewe PCR5- of enkelsel-RNA-volgordebepaling uit te voer. In hierdie geval word 3D-lae van epiteelselle wat in dermskyfies of hibriede skyfies gekweek word, deur tripsinisering geoes en dan vir molekulêre of genetiese analise gebruik.
a, Werkvloei vir die induksie van dermmorfogenese in 'n hibriede skyfie. Caco-2 en dermorganoïede word in hierdie protokol gebruik om 3D-morfogenese in 'n hibriede skyfieplatform te demonstreer. Gedissosieerde epiteelselle is in voorbereide Transwell-insetsels gesaai (TW-voorbereiding; sien figuur hieronder). Sodra selle gesaai (gesaai) en aan poliëstermembrane in Transwell-insetsels geheg is, is alle selle onder statiese toestande gekweek (TW-kultuur). Na 7 dae is 'n enkele Transwell-insetsel wat 'n 2D-monolaag van epiteelselle bevat, in 'n hibriede skyfie geïntegreer om 'n basolaterale vloei (Flow, BL) in te voer, wat uiteindelik gelei het tot die generering van 'n 3D-epiteellaag (morfogenese). Fasekontrasmikrograwe wat morfologiese kenmerke van menslike orgaanepiteelselle toon, afgelei van normale skenker (C103-lyn) stygende kolon by elke eksperimentele stap of tydpunt. Die skematiese voorstellings in die boonste lae illustreer die eksperimentele konfigurasie vir elke stap. b, Hibriede skyfies (linker skematies) kan lei tot 3D-morfogenese van organoïede epiteelselle met Konfokale mikroskopie-aansigte van bo na onder geneem by verskillende Z-posisies (bo, middel en onder; sien regter skematiese en ooreenstemmende stippellyne). het duidelike morfologiese eienskappe getoon. F-aktien (siaan), kern (grys). c, Fluoresensie-konfokale mikrograwe (3D-hoekige aansig) van organoïed-afgeleide epiteelselle gekweek in statiese Transwell (TW; inset binne wit stippellynkassie) teenoor hibriede skyfie (grootste volle skoot) wat onderskeidelik 2D teenoor 3D-morfologie vergelyk. 'n Paar 2D vertikale dwarssnit-aansigte (inset in die regter boonste hoek; "XZ") toon ook 2D- en 3D-kenmerke. Skaalbalk, 100 µm. c Herdruk met toestemming van verwysing. 4. Elsevier.
Kontroles kan voorberei word deur dieselfde selle (Caco-2 of dermorganoïede epiteelselle) in tweedimensionele monolae te kweek onder konvensionele statiese kultuurtoestande. Dit is opmerklik dat voedingstofuitputting kan ontstaan ​​as gevolg van die beperkte volumekapasiteit van die mikrokanale (d.w.s. ~4 µL in die boonste kanaal op die oorspronklike derm-skyfie-ontwerp). Daarom kan epiteelmorfologie voor en na die toepassing van basolaterale vloei ook vergelyk word.
Die sagte litografieproses moet in 'n skoon kamer uitgevoer word. Vir elke laag op die skyfie (boonste en onderste lae en membrane) en hibriede skyfies, is verskillende fotomaskers gebruik en op aparte silikonwafers vervaardig omdat die hoogtes van die mikrokanale verskillend was. Die teikenhoogtes van die boonste en onderste mikrokanale van die derm op die skyfie is onderskeidelik 500 µm en 200 µm. Die kanaalteikenhoogte van die hibriede skyfie is 200 µm.
Plaas 'n 3-duim silikonwafel in 'n bakkie met asetoon. Draai die plaat versigtig vir 30 sekondes, en laat die wafel dan lugdroog word. Plaas die wafel oor na 'n plaat met IPA, en draai dan die plaat vir 30 sekondes om skoon te maak.
'n Piranha-oplossing ('n mengsel van waterstofperoksied en gekonsentreerde swaelsuur, 1:3 (vol/vol)) kan opsioneel gebruik word om die verwydering van organiese residue van die silikonwafeloppervlak te maksimeer.
Piranha-oplossing is uiters korrosief en genereer hitte. Bykomende veiligheidsmaatreëls is nodig. Vir afvalverwydering, laat die oplossing afkoel en oordra na 'n skoon, droë afvalhouer. Gebruik sekondêre houers en merk afvalhouers behoorlik. Volg asseblief die fasiliteit se veiligheidsriglyne vir meer gedetailleerde prosedures.
Dehidreer die wafels deur hulle vir 10 minute op 'n 200 °C warmplaat te plaas. Na dehidrasie is die wafel vyf keer in die lug geskud om af te koel.
Gooi ~10 g fotoresist SU-8 2100 in die middel van die skoongemaakte silikonwafel. Gebruik 'n pinset om die fotoresist eweredig op die wafel te versprei. Plaas die wafel af en toe op 'n 65°C warmplaat om die fotoresist minder klewerig en makliker te versprei te maak. Moenie die wafel direk op die warmplaat plaas nie.
SU-8 is eweredig op die wafer versprei deur spinbedekking uit te voer. Programmeer 'n inkomende rotasie van die SU-8 vir 5-10 s om teen 500 rpm teen 'n versnelling van 100 rpm/s voort te plant. Stel die hoofspin vir 200 µm diktepatroonvorming teen 1 500 rpm, of bereik 'n dikte van 250 µm (wat 'n hoogte van 500 µm vir die boonste laag van die derm op die skyfie maak; sien "Kritieke stappe" hieronder) en stel dit teen 'n versnelling van 300 rpm/s 30 sekondes teen 1 200 rpm.
Die hoofspinspoed kan aangepas word volgens die teikendikte van die SU-8-patroon op die silikonwafer.
Om SU-8-patrone van 500 µm hoogte vir die boonste laag van die derm op die skyfie te vervaardig, is die spinbedekking- en sagte bakstappe van hierdie boks (stappe 7 en 8) opeenvolgend herhaal (sien stap 9) om twee lae van 250 µm dik SU-8 te produseer, wat deur UV-blootstelling in stap 12 van hierdie boks gelaag en verbind kan word, wat 'n laag van 500 µm hoog maak.
Bak die SU-8-bedekte wafels saggies deur die wafels versigtig vir 5 minute op 'n warm plaat by 65 °C te plaas, skakel dan die instelling na 95 °C oor en inkubeer vir 'n bykomende 40 minute.
Om 'n hoogte van 500 μm van die SU-8-patroon in die boonste mikrokanaal te bereik, herhaal stappe 7 en 8 om twee 250 μm dik SU-8-lae te genereer.
Gebruik die UV-maskerbelyner om 'n lamptoets volgens die vervaardiger se instruksies uit te voer om die blootstellingstyd van die wafer te bereken. (blootstellingstyd, ms) = (blootstellingsdosis, mJ/cm2)/(lampkrag, mW/cm2).
Nadat die blootstellingstyd bepaal is, plaas die fotomasker op die maskerhouer van die UV-maskerbelyner en plaas die fotomasker op die SU-8-bedekte wafer.
Plaas die gedrukte oppervlak van die fotomasker direk op die SU-8-bedekte kant van die silikonwafel om UV-dispersie te verminder.
Stel die SU-8-bedekte wafer en fotomasker vertikaal bloot aan 260 mJ/cm2 UV-lig vir die voorafbepaalde blootstellingstyd (sien stap 10 van hierdie boks).
Na UV-blootstelling is SU-8-bedekte silikonwafels vir 5 minute by 65°C en vir 15 minute by 95°C op elke warmplaat gebak om patrone met 'n hoogte van 200 μm te vervaardig. Verleng die na-baktyd by 95°C tot 30 minute om patrone met 'n hoogte van 500 μm te vervaardig.
Die ontwikkelaar word in 'n glasbak gegooi, en die gebakte wafel word in die bak geplaas. Die volume SU-8-ontwikkelaar kan wissel na gelang van die grootte van die glasplaat. Maak seker dat jy genoeg SU-8-ontwikkelaar gebruik om onblootgestelde SU-8 heeltemal te verwyder. Byvoorbeeld, wanneer 'n glasbak met 'n deursnee van 150 mm en 'n kapasiteit van 1 L gebruik word, gebruik ~300 ml SU-8-ontwikkelaar. Ontwikkel die vorm vir 25 minute met af en toe sagte rotasie.
Spoel die ontwikkelde vorm af met ~10 mL vars ontwikkelaar, gevolg deur IPA deur die oplossing met 'n pipet te spuit.
Plaas die wafer in 'n plasmaskoonmaker en stel dit vir 1.5 min bloot aan suurstofplasma (atmosferiese gas, teikendruk 1 × 10−5 Torr, krag 125 W).
Plaas die wafel in 'n vakuum-eksikkator met 'n glasplaatjie binne. Wafels en plaatjies kan langs mekaar geplaas word. Indien die vakuum-eksikkator deur 'n plaat in verskeie lae verdeel word, plaas die plaatjies in die onderste kamer en die wafels in die boonste kamer. Laat 100 μL trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroktiel)silaanoplossing op 'n glasplaatjie drup en pas vakuum toe vir silanisering.
Ontdooi 'n flessie bevrore Caco-2-selle in 'n 37°C waterbad, en dra dan die ontdooide selle oor na 'n T75-fles wat 15 ml van 37°C voorafverwarmde Caco-2-medium bevat.
Om Caco-2-selle teen ~90% konfluensie deur te laat, verhit eers Caco-2-medium, PBS en 0.25% tripsin/1 mM EDTA in 'n 37°C waterbad.
Aspireer die medium deur vakuumaspirasie. Was selle twee keer met 5 ml warm PBS deur vakuumaspirasie te herhaal en vars PBS by te voeg.