Dankie dat jy Nature.com besoek het.Die blaaierweergawe wat jy gebruik het beperkte CSS-ondersteuning.Vir die beste ervaring, beveel ons aan dat jy 'n opgedateerde blaaier gebruik (of versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer).In die tussentyd, om volgehoue ​​ondersteuning te verseker, sal ons die webwerf sonder style en JavaScript weergee.
Die evolusie van mikrobiese parasiete behels 'n teenaksie tussen natuurlike seleksie, wat parasiete laat verbeter, en genetiese drywing, wat veroorsaak dat parasiete gene verloor en skadelike mutasies ophoop.Hier, om te verstaan ​​hoe hierdie teenaksie op die skaal van 'n enkele makromolekule plaasvind, beskryf ons die krio-EM-struktuur van die ribosoom van Encephalitozoon cuniculi, 'n eukariotiese organisme met een van die kleinste genome in die natuur.Die uiterste vermindering van rRNA in E. cuniculi ribosome gaan gepaard met ongekende strukturele veranderinge, soos die evolusie van voorheen onbekende saamgesmelte rRNA skakelaars en rRNA sonder bulte.Daarbenewens het die E. cuniculi ribosoom die verlies van rRNA fragmente en proteïene oorleef deur die vermoë te ontwikkel om klein molekules te gebruik as strukturele nabootsers van gedegradeerde rRNA fragmente en proteïene.Oor die algemeen toon ons dat molekulêre strukture wat lank gedink word om verminder, degenereer en onderhewig te wees aan verswakkende mutasies 'n aantal kompenserende meganismes het wat hulle aktief hou ten spyte van uiterste molekulêre sametrekkings.
Omdat die meeste groepe mikrobiese parasiete unieke molekulêre gereedskap het om hul gashere te ontgin, moet ons dikwels verskillende terapeutika vir verskillende groepe parasiete ontwikkel1,2.Nuwe bewyse dui egter daarop dat sommige aspekte van parasiet-evolusie konvergent en grootliks voorspelbaar is, wat 'n potensiële basis aandui vir breë terapeutiese intervensies in mikrobiese parasiete3,4,5,6,7,8,9.
Vorige werk het 'n algemene evolusionêre neiging in mikrobiese parasiete geïdentifiseer wat genoomvermindering of genoomverval10,11,12,13 genoem word.Huidige navorsing toon dat wanneer mikroörganismes hul vrylewende leefstyl prysgee en intrasellulêre parasiete (of endosimbionte) word, hul genome oor miljoene jare stadige maar wonderlike metamorfoses ondergaan9,11.In 'n proses bekend as genoomverval, versamel mikrobiese parasiete skadelike mutasies wat baie voorheen belangrike gene in pseudogene verander, wat lei tot geleidelike geenverlies en mutasionele ineenstorting14,15.Hierdie ineenstorting kan tot 95% van die gene in die oudste intrasellulêre organismes vernietig in vergelyking met naverwante vrylewende spesies.Dus, die evolusie van intrasellulêre parasiete is 'n toutrekkery tussen twee opponerende kragte: Darwinistiese natuurlike seleksie, wat lei tot die verbetering van parasiete, en die ineenstorting van die genoom, wat parasiete in die vergetelheid gooi.Hoe die parasiet daarin geslaag het om uit hierdie toutrek te kom en die aktiwiteit van sy molekulêre struktuur te behou, bly onduidelik.
Alhoewel die meganisme van genoomverval nie ten volle verstaan ​​word nie, blyk dit hoofsaaklik te voorkom as gevolg van gereelde genetiese drywing.Omdat parasiete in klein, ongeslagtelike en geneties beperkte bevolkings leef, kan hulle nie skadelike mutasies wat soms tydens DNA-replikasie voorkom, effektief uitskakel nie.Dit lei tot onomkeerbare ophoping van skadelike mutasies en vermindering van die parasietgenoom.Gevolglik verloor die parasiet nie net gene wat nie meer nodig is vir sy oorlewing in die intrasellulêre omgewing nie.Dit is die onvermoë van parasietpopulasies om sporadiese skadelike mutasies effektief uit te skakel wat veroorsaak dat hierdie mutasies regdeur die genoom ophoop, insluitend hul belangrikste gene.
Baie van ons huidige begrip van genoomvermindering is uitsluitlik gebaseer op vergelykings van genoomvolgordes, met minder aandag aan veranderinge in werklike molekules wat huishoudelike funksies verrig en as potensiële dwelmteikens dien.Vergelykende studies het getoon dat die las van skadelike intrasellulêre mikrobiese mutasies blykbaar proteïene en nukleïensure vatbaar maak om verkeerd te vou en te aggregeer, wat hulle meer chaperone-afhanklik en hipersensitief maak vir hitte19,20,21,22,23.Daarbenewens het verskeie parasiete—onafhanklike evolusie soms geskei met soveel as 2,5 miljard jaar—'n soortgelyke verlies aan kwaliteitbeheersentrums in hul proteïensintese5,6 en DNA-herstelmeganismes24 ervaar.Min is egter bekend oor die impak van intrasellulêre leefstyl op alle ander eienskappe van sellulêre makromolekules, insluitend molekulêre aanpassing by 'n toenemende las van skadelike mutasies.
In hierdie werk, om die evolusie van proteïene en nukleïensure van intrasellulêre mikroörganismes beter te verstaan, het ons die struktuur van ribosome van die intrasellulêre parasiet Encephalitozoon cuniculi bepaal.E. cuniculi is 'n swamagtige organisme wat aan 'n groep parasitiese mikrosporidia behoort wat buitengewoon klein eukariotiese genome het en dus as modelorganismes gebruik word om genoomverval25,26,27,28,29,30 te bestudeer.Onlangs is cryo-EM ribosoomstruktuur bepaal vir matig verminderde genome van Microsporidia, Paranosema locustae en Vairimorpha necatrix31,32 (~3.2 Mb genoom).Hierdie strukture dui daarop dat 'n mate van verlies aan rRNA-amplifikasie vergoed word deur die ontwikkeling van nuwe kontakte tussen naburige ribosomale proteïene of die verkryging van nuwe msL131,32 ribosomale proteïene.Spesies Encephalitozoon (genoom ~2.5 miljoen bp), tesame met hul naaste familielid Ordospora, demonstreer die uiteindelike mate van genoomvermindering in eukariote – hulle het minder as 2000 proteïenkoderende gene, en daar word verwag dat hul ribosome nie net ontbloot is van rRNA-uitbreidingsfragmente (rRNA-uitbreidingsfragmente) (rRNA-fragmente wat ook diskaryotiese ribosome) het wat ook van vier bakteriese ribosome beskik. ribosomale proteïene as gevolg van hul gebrek aan homoloë in die E. cuniculi genoom26,27,28.Daarom het ons tot die gevolgtrekking gekom dat die E. cuniculi-ribosoom voorheen onbekende strategieë vir molekulêre aanpassing by genoomverval kan openbaar.
Ons kryo-EM-struktuur verteenwoordig die kleinste eukariotiese sitoplasmiese ribosoom wat gekarakteriseer moet word en bied insig in hoe die uiteindelike mate van genoomvermindering die struktuur, samestelling en evolusie van die molekulêre masjinerie wat integraal tot die sel is, beïnvloed.Ons het gevind dat die E. cuniculi-ribosoom baie van die wyd bewaarde beginsels van RNA-vou en ribosoomsamestelling oortree, en 'n nuwe, voorheen onbekende ribosomale proteïen ontdek.Heel onverwags wys ons dat mikrosporidia-ribosome die vermoë ontwikkel het om klein molekules te bind, en veronderstel dat afkappings in rRNA en proteïene evolusionêre innovasies veroorsaak wat uiteindelik nuttige eienskappe aan die ribosoom kan verleen.
Om ons begrip van die evolusie van proteïene en nukleïensure in intrasellulêre organismes te verbeter, het ons besluit om E. cuniculi-spore van kulture van besmette soogdierselle te isoleer om sodoende hul ribosome te suiwer en die struktuur van hierdie ribosome te bepaal.Dit is moeilik om 'n groot aantal parasitiese mikrosporidia te verkry omdat mikrosporidia nie in 'n voedingsmedium gekweek kan word nie.In plaas daarvan groei en reproduseer hulle slegs binne die gasheersel.Daarom, om E. cuniculi-biomassa vir ribosoomsuiwering te verkry, het ons die soogdierniersellyn RK13 met E. cuniculi-spore geïnfekteer en hierdie besmette selle vir etlike weke gekweek om E. cuniculi te laat groei en vermeerder.Met behulp van 'n besmette sel monolaag van ongeveer 'n halwe vierkante meter kon ons ongeveer 300 mg Microsporidia spore suiwer en dit gebruik om ribosome te isoleer.Ons het toe die gesuiwerde spore met glaskrale ontwrig en die ru-ribosome geïsoleer deur stapsgewyse poliëtileenglikol fraksionering van die lysate te gebruik.Dit het ons toegelaat om ongeveer 300 µg rou E. cuniculi ribosome vir strukturele analise te verkry.
Ons het toe kryo-EM-beelde versamel deur die resulterende ribosoommonsters te gebruik en hierdie beelde verwerk met maskers wat ooreenstem met die groot ribosomale subeenheid, klein subeenheidkop en klein subeenheid.Tydens hierdie proses het ons beelde van ongeveer 108 000 ribosomale deeltjies en berekende kryo-EM beelde met 'n resolusie van 2,7 Å (Aanvullende Figure 1-3) versamel.Ons het dan cryoEM-beelde gebruik om rRNA, ribosomale proteïen en hibernasiefaktor Mdf1 te modelleer wat met E. cuniculi-ribosome geassosieer word (Fig. 1a, b).
a Struktuur van die E. cuniculi-ribosoom in kompleks met die hibernasiefaktor Mdf1 (pdb id 7QEP).b Kaart van hibernasiefaktor Mdf1 wat met die E. cuniculi-ribosoom geassosieer word.c Sekondêre struktuurkaart wat herwonne rRNA in Mikrosporidiese spesies vergelyk met bekende ribosomale strukture.Die panele toon die ligging van die geamplifiseerde rRNA fragmente (ES) en ribosoom aktiewe plekke, insluitend die dekodering plek (DC), die sarcinicin lus (SRL), en die peptidyl transferase sentrum (PTC).d Die elektrondigtheid wat ooreenstem met die peptidieltransferase-sentrum van die E. cuniculi-ribosoom dui daarop dat hierdie katalitiese plek dieselfde struktuur het in die E. cuniculi-parasiet en sy gashere, insluitend H. sapiens.e, f Die ooreenstemmende elektrondigtheid van die dekoderingsentrum (e) en die skematiese struktuur van die dekoderingsentrum (f) dui aan dat E. cuniculi residue U1491 het in plaas van A1491 (E. coli-nommering) in baie ander eukariote.Hierdie verandering dui daarop dat E. cuniculi sensitief kan wees vir antibiotika wat hierdie aktiewe terrein teiken.
In teenstelling met die voorheen gevestigde strukture van V. necatrix en P. locustae ribosome (albei strukture verteenwoordig dieselfde microsporidia familie Nosematidae en is baie soortgelyk aan mekaar), ondergaan 31,32 E. cuniculi ribosome talle prosesse van rRNA en proteïen fragmentasie.Verdere denaturering (Aanvullende Figure 4-6).In rRNA het die mees opvallende veranderinge volledige verlies van die geamplifiseerde 25S rRNA-fragment ES12L en gedeeltelike degenerasie van h39, h41 en H18-helikse ingesluit (Fig. 1c, Aanvullende Fig. 4).Onder ribosomale proteïene het die mees opvallende veranderinge volledige verlies van die eS30-proteïen en verkorting van die eL8-, eL13-, eL18-, eL22-, eL29-, eL40-, uS3-, uS9-, uS14-, uS17- en eS7-figure ingesluit (Aanvullende 5, 5).
Dus, die uiterste vermindering van die genome van Encephalotozoon/Ordospora spesies word weerspieël in hul ribosoomstruktuur: E. cuniculi ribosome ervaar die mees dramatiese verlies aan proteïeninhoud in eukariotiese sitoplasmiese ribosome wat onderhewig is aan strukturele karakterisering, en hulle het nie eers daardie rRNA en proteïenfragmente wat nie net in die drie domotes gekonserveerde fragmente is nie, maar ook wyd gekonserveer in die lewe.Die struktuur van die E. cuniculi-ribosoom verskaf die eerste molekulêre model vir hierdie veranderinge en openbaar evolusionêre gebeure wat deur beide vergelykende genomika en studies van intrasellulêre biomolekulêre struktuur oor die hoof gesien is (Aanvullende Fig. 7).Hieronder beskryf ons elkeen van hierdie gebeurtenisse saam met hul waarskynlike evolusionêre oorsprong en hul potensiële impak op ribosoomfunksie.
Ons het toe gevind dat, benewens groot rRNA-afkappings, E. cuniculi-ribosome rRNA-variasies by een van hul aktiewe plekke het.Alhoewel die peptidieltransferase-sentrum van die E. cuniculi-ribosoom dieselfde struktuur as ander eukariotiese ribosome het (Fig. 1d), verskil die dekoderingsentrum as gevolg van volgordevariasie by nukleotied 1491 (E. coli-nommering, Fig. 1e, f).Hierdie waarneming is belangrik omdat die dekoderingsplek van eukariotiese ribosome tipies residue G1408 en A1491 bevat in vergelyking met bakteriese tipe residue A1408 en G1491.Hierdie variasie onderlê die verskillende sensitiwiteit van bakteriële en eukariotiese ribosome vir die aminoglikosiedfamilie van ribosomale antibiotika en ander klein molekules wat die dekoderingsplek teiken.By die dekoderingsplek van die E. cuniculi ribosoom is residu A1491 vervang met U1491, wat moontlik 'n unieke bindingskoppelvlak vir klein molekules skep wat hierdie aktiewe plek teiken.Dieselfde A14901-variant is ook teenwoordig in ander mikrosporidia soos P. locustae en V. necatrix, wat daarop dui dat dit wydverspreid onder mikrosporidia spesies voorkom (Fig. 1f).
Omdat ons E. cuniculi-ribosoommonsters geïsoleer is van metabolies onaktiewe spore, het ons die cryo-EM-kaart van E. cuniculi getoets vir voorheen beskryfde ribosoombinding onder stres- of hongertoestande.Hibernasie faktore 31,32,36,37, 38. Ons het die voorheen gevestigde struktuur van die hibernerende ribosoom met die cryo-EM kaart van die E. cuniculi ribosoom ooreenstem.Vir dok is S. cerevisiae ribosome gebruik in kompleks met hibernasie faktor Stm138, sprinkaan ribosome in kompleks met Lso232 faktor, en V. necatrix ribosome in kompleks met Mdf1 en Mdf231 faktore.Terselfdertyd het ons die kryo-EM-digtheid gevind wat ooreenstem met die rusfaktor Mdf1.Soortgelyk aan Mdf1 wat aan die V. necatrix-ribosoom bind, bind Mdf1 ook aan die E. cuniculi-ribosoom, waar dit die E-plek van die ribosoom blokkeer, wat moontlik help om ribosome beskikbaar te stel wanneer parasietspore metabolies onaktief raak met liggaamsinaktivering (Figuur 2).).
Mdf1 blokkeer die E-plek van die ribosoom, wat blykbaar help om die ribosoom te inaktiveer wanneer parasietspore metabolies onaktief word.In die struktuur van die E. cuniculi-ribosoom het ons gevind dat Mdf1 'n voorheen onbekende kontak met die L1-ribosoomstam vorm, die deel van die ribosoom wat die vrystelling van gedeasileerde tRNA vanaf die ribosoom tydens proteïensintese vergemaklik.Hierdie kontakte dui daarop dat Mdf1 van die ribosoom dissosieer deur dieselfde meganisme as gedeasetileerde tRNA te gebruik, wat 'n moontlike verduideliking verskaf vir hoe die ribosoom Mdf1 verwyder om proteïensintese te heraktiveer.
Ons struktuur het egter 'n onbekende kontak tussen Mdf1 en die L1-ribosoombeen aan die lig gebring (die deel van die ribosoom wat help om gedeasileerde tRNA van die ribosoom vry te stel tydens proteïensintese).In die besonder, Mdf1 gebruik dieselfde kontakte as die elmboogsegment van die gedeasileerde tRNA-molekule (Fig. 2).Hierdie voorheen onbekende molekulêre modellering het getoon dat Mdf1 van die ribosoom dissosieer deur dieselfde meganisme as gedeasetileerde tRNA te gebruik, wat verduidelik hoe die ribosoom hierdie hibernasiefaktor verwyder om proteïensintese te heraktiveer.
Toe ons die rRNA-model konstrueer, het ons gevind dat die E. cuniculi-ribosoom abnormaal gevoude rRNA-fragmente het, wat ons saamgesmelte rRNA genoem het (Fig. 3).In ribosome wat oor die drie lewensdomeine strek, vou rRNA in strukture waarin die meeste rRNA-basisse óf basispaar en met mekaar vou óf met ribosomale proteïene in wisselwerking tree38,39,40.In E. cuniculi-ribosome blyk dit egter dat rRNA's hierdie voubeginsel oortree deur sommige van hul helikse in ontvoude rRNA-streke om te skakel.
Struktuur van die H18 25S rRNA-heliks in S. cerevisiae, V. necatrix en E. cuniculi.Tipies, in ribosome wat oor die drie lewensdomeine strek, draai hierdie skakelaar in 'n RNA-heliks wat 24 tot 34 residue bevat.In Microsporidia, daarenteen, word hierdie rRNA-skakelaar geleidelik gereduseer tot twee enkelstrengs uridienryke koppelaars wat slegs 12 residue bevat.Die meeste van hierdie oorblyfsels word aan oplosmiddels blootgestel.Die figuur toon dat parasitiese mikrosporidia blykbaar die algemene beginsels van rRNA-vou oortree, waar rRNA-basisse gewoonlik aan ander basisse gekoppel is of betrokke is by rRNA-proteïen-interaksies.In mikrosporidia neem sommige rRNA-fragmente 'n ongunstige vou aan, waarin die voormalige rRNA-heliks 'n enkelstrengige fragment word wat amper in 'n reguit lyn verleng word.Die teenwoordigheid van hierdie ongewone streke laat mikrosporidia rRNA toe om verafgeleë rRNA fragmente te bind deur 'n minimale aantal RNA basisse te gebruik.
Die treffendste voorbeeld van hierdie evolusionêre oorgang kan in die H18 25S rRNA-heliks waargeneem word (Fig. 3).In spesies van E. coli tot mense bevat die basisse van hierdie rRNA-heliks 24-32 nukleotiede, wat 'n effens onreëlmatige heliks vorm.In voorheen geïdentifiseerde ribosomale strukture van V. necatrix en P. locustae,31,32 is die basisse van die H18-heliks gedeeltelik ontrol, maar nukleotiedbasisparing word behoue.In E. cuniculi word hierdie rRNA-fragment egter die kortste skakelaars 228UUUGU232 en 301UUUUUUUUUU307.Anders as tipiese rRNA-fragmente, krul hierdie uridienryke skakelaars nie of maak uitgebreide kontak met ribosomale proteïene nie.In plaas daarvan neem hulle oplosmiddel-oop en volledig ontvoude strukture aan waarin die rRNA-stringe amper reguit verleng word.Hierdie uitgerekte konformasie verduidelik hoe E. cuniculi slegs 12 RNA-basisse gebruik om die 33 Å-gaping tussen die H16- en H18-rRNA-helikse te vul, terwyl ander spesies minstens twee keer soveel rRNA-basisse benodig om die gaping te vul.
Ons kan dus demonstreer dat parasitiese mikrosporidia, deur energeties ongunstige vou, 'n strategie ontwikkel het om selfs daardie rRNA-segmente te kontrakteer wat breedweg bewaar bly oor spesies in die drie domeine van die lewe.Blykbaar kan E. cuniculi ongewone rRNA-fragmente vorm wat so min moontlik nukleotiede bevat vir afbinding van distale rRNA-fragmente, deur mutasies op te bou wat rRNA-helikse in kort poli-U-skakelaars transformeer.Dit help om te verduidelik hoe mikrosporidia 'n dramatiese vermindering in hul basiese molekulêre struktuur bereik het sonder om hul strukturele en funksionele integriteit te verloor.
Nog 'n ongewone kenmerk van E. cuniculi rRNA is die voorkoms van rRNA sonder verdikkings (Fig. 4).Bulte is nukleotiede sonder basispare wat uit die RNA-heliks draai in plaas daarvan om daarin weg te kruip.Die meeste rRNA-uitsteeksels dien as molekulêre kleefmiddels, wat help om aangrensende ribosomale proteïene of ander rRNA-fragmente te bind.Sommige van die bulte dien as skarniere, wat die rRNA-heliks toelaat om optimaal te buig en te vou vir produktiewe proteïensintese 41 .
a 'n rRNA-uitsteeksel (S. cerevisiae-nommering) is afwesig in die E. cuniculi-ribosoomstruktuur, maar teenwoordig in die meeste ander eukariote b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens en E. cuniculi interne ribosome.parasiete het nie baie van die ou, hoogs bewaarde rRNA-bulte nie.Hierdie verdikkings stabiliseer die ribosoomstruktuur;daarom, hul afwesigheid in mikrosporidia dui op 'n verminderde stabiliteit van rRNA vou in mikrosporidia parasiete.Vergelyking met P-stingels (L7/L12-stingels in bakterieë) toon dat die verlies van rRNA-knoppe soms saamval met die verskyning van nuwe knoppe langs die verlore knoppe.Die H42-heliks in die 23S/28S-rRNA het 'n ou bult (U1206 in Saccharomyces cerevisiae) wat na raming minstens 3,5 miljard jaar oud is as gevolg van sy beskerming in drie lewensdomeine.In mikrosporidia word hierdie bult uitgeskakel.'n Nuwe bult het egter langs die verlore bult verskyn (A1306 in E. cuniculi).
Opvallend genoeg het ons gevind dat E. cuniculi-ribosome die meeste van die rRNA-bulte ontbreek wat in ander spesies voorkom, insluitend meer as 30 bulte wat in ander eukariote bewaar word (Fig. 4a).Hierdie verlies skakel baie kontakte tussen ribosomale subeenhede en aangrensende rRNA-helikse uit, wat soms groot hol leemtes binne die ribosoom skep, wat die E. cuniculi-ribosoom meer poreus maak in vergelyking met meer tradisionele ribosome (Fig. 4b).Ons het veral gevind dat die meeste van hierdie bulte ook verlore gegaan het in die voorheen geïdentifiseerde V. necatrix en P. locustae ribosoomstrukture, wat deur vorige strukturele ontledings oor die hoof gesien is31,32.
Soms gaan die verlies van rRNA-bulte gepaard met die ontwikkeling van nuwe bulte langs die verlore bult.Byvoorbeeld, die ribosomale P-stam bevat 'n U1208-bult (in Saccharomyces cerevisiae) wat van E. coli tot by mense oorleef het en dus na raming 3,5 miljard jaar oud is.Tydens proteïensintese help hierdie bult die P-stam om tussen oop en geslote konformasies te beweeg sodat die ribosoom translasiefaktore kan werf en dit na die aktiewe plek kan aflewer.By E. cuniculi-ribosome is hierdie verdikking afwesig;'n Nuwe verdikking (G883) wat slegs in drie basispare geleë is, kan egter bydra tot die herstel van die optimale buigsaamheid van die P-stam (Fig. 4c).
Ons data oor rRNA sonder bulte dui daarop dat rRNA-minimalisering nie beperk is tot die verlies van rRNA-elemente op die oppervlak van die ribosoom nie, maar ook die ribosoomkern kan betrek, wat 'n parasiet-spesifieke molekulêre defek skep wat nie in vrylewende selle beskryf is nie.lewende spesies waargeneem word.
Nadat ons kanonieke ribosomale proteïene en rRNA gemodelleer het, het ons gevind dat konvensionele ribosomale komponente nie die drie dele van die krio-EM beeld kan verklaar nie.Twee van hierdie fragmente is klein molekules groot (Fig. 5, Aanvullende Fig. 8).Die eerste segment is ingeklem tussen die ribosomale proteïene uL15 en eL18 in 'n posisie wat gewoonlik beset word deur die C-terminus van eL18, wat in E. cuniculi verkort is.Alhoewel ons nie die identiteit van hierdie molekule kan bepaal nie, word die grootte en vorm van hierdie digtheid-eiland goed verklaar deur die teenwoordigheid van spermidienmolekules.Die binding daarvan aan die ribosoom word gestabiliseer deur mikrosporidia-spesifieke mutasies in die uL15-proteïene (Asp51 en Arg56), wat blykbaar die affiniteit van die ribosoom vir hierdie klein molekule verhoog, aangesien dit uL15 toelaat om die klein molekule in 'n ribosomale struktuur toe te draai.Aanvullende Figuur 2).8, addisionele data 1, 2).
Kryo-EM beelding wat die teenwoordigheid van nukleotiede buite die ribose aan die E. cuniculi ribosoom gebind toon.In die E. cuniculi-ribosoom neem hierdie nukleotied dieselfde plek in as die 25S rRNA A3186-nukleotied (Saccharomyces cerevisiae-nommering) in die meeste ander eukariotiese ribosome.b In die ribosomale struktuur van E. cuniculi is hierdie nukleotied tussen die ribosomale proteïene uL9 en eL20 geleë, waardeur die kontak tussen die twee proteïene gestabiliseer word.cd eL20 volgorde bewaring analise onder mikrosporidia spesies.Die filogenetiese boom van Microsporidia spesies (c) en meervoudige volgorde belyning van die eL20 proteïen (d) toon dat nukleotied-bindende residue F170 en K172 bewaar word in die meeste tipiese Microsporidia, met die uitsondering van S. lophii, met die uitsondering van vroeë vertakking Microsporidia, wat die ES39L rRNA verlenging behou het.e Hierdie figuur toon dat nukleotiedbindende residue F170 en K172 slegs in eL20 van die hoogs gereduseerde mikrosporidia genoom teenwoordig is, maar nie in ander eukariote nie.Algehele, hierdie data dui daarop dat Mikrosporidiese ribosome 'n nukleotiedbindingsplek ontwikkel het wat blykbaar AMP-molekules bind en dit gebruik om proteïen-proteïen-interaksies in die ribosomale struktuur te stabiliseer.Die hoë bewaring van hierdie bindingsplek in Microsporidia en die afwesigheid daarvan in ander eukariote dui daarop dat hierdie plek 'n selektiewe oorlewingsvoordeel vir Microsporidia kan bied.Die nukleotiedbindende sak in die mikrosporidia-ribosoom blyk dus nie 'n gedegenereerde kenmerk of eindvorm van rRNA-afbraak te wees soos voorheen beskryf nie, maar eerder 'n nuttige evolusionêre innovasie wat die mikrosporidia-ribosoom in staat stel om klein molekules direk te bind, deur hulle as molekulêre boustene te gebruik.boustene vir ribosome.Hierdie ontdekking maak die mikrosporidia-ribosoom die enigste ribosoom wat bekend is om 'n enkele nukleotied as sy strukturele bousteen te gebruik.f Hipotetiese evolusionêre weg afgelei van nukleotiedbinding.
Die tweede lae molekulêre gewig digtheid is geleë op die raakvlak tussen ribosomale proteïene uL9 en eL30 (Fig. 5a).Hierdie raakvlak is voorheen beskryf in die struktuur van die Saccharomyces cerevisiae ribosoom as 'n bindingsplek vir die 25S nukleotied van rRNA A3186 (deel van die ES39L rRNA uitbreiding)38.Daar is getoon dat in gedegenereerde P. locustae ES39L ribosome, hierdie raakvlak 'n onbekende enkele nukleotied 31 bind, en daar word aanvaar dat hierdie nukleotied 'n verminderde finale vorm van rRNA is, waarin die lengte van rRNA ~130-230 basisse is.ES39L word gereduseer tot 'n enkele nukleotied 32.43.Ons kryo-EM beelde ondersteun die idee dat digtheid deur nukleotiede verklaar kan word.Die hoër resolusie van ons struktuur het egter gewys dat hierdie nukleotied 'n ekstraribosomale molekule is, moontlik AMP (Fig. 5a, b).
Ons het toe gevra of die nukleotiedbindingsplek in die E. cuniculi-ribosoom verskyn het en of dit voorheen bestaan ​​het.Aangesien nukleotiedbinding hoofsaaklik deur die Phe170- en Lys172-residue in die eL30-ribosomale proteïen bemiddel word, het ons die bewaring van hierdie residue in 4396 verteenwoordigende eukariote beoordeel.Soos in die geval van uL15 hierbo, het ons gevind dat die Phe170- en Lys172-residu slegs in tipiese Microsporidia hoogs behoue ​​bly, maar afwesig in ander eukariote, insluitend atipiese Microsporidia Mitosporidium en Amphiamblys, waarin die ES39L rRNA-fragment nie gereduseer is 44, 45, 45, 45, 45c).-e).
Saamgevat ondersteun hierdie data die idee dat E. cuniculi en moontlik ander kanoniese mikrosporidia die vermoë ontwikkel het om groot getalle klein metaboliete doeltreffend in die ribosoomstruktuur vas te vang om te kompenseer vir die afname in rRNA en proteïenvlakke.Sodoende het hulle 'n unieke vermoë ontwikkel om nukleotiede buite die ribosoom te bind, wat wys dat parasitiese molekulêre strukture kompenseer deur volop klein metaboliete vas te vang en dit te gebruik as strukturele nabootsers van afgebreekte RNA en proteïenfragmente..
Die derde ongesimuleerde deel van ons cryo-EM kaart, gevind in die groot ribosomale subeenheid.Die relatief hoë resolusie (2.6 Å) van ons kaart dui daarop dat hierdie digtheid aan proteïene behoort met unieke kombinasies van groot sykettingreste, wat ons in staat gestel het om hierdie digtheid te identifiseer as 'n voorheen onbekende ribosomale proteïen wat ons geïdentifiseer het as Dit is genoem msL2 (Microsporidia-spesifieke proteïen L2) (metodes, figuur 6).Ons homologiesoektog het getoon dat msL2 in die Microsporidia-klade van die genus Encephaliter en Orosporidium bewaar word, maar afwesig in ander spesies, insluitend ander Microsporidia.In die ribosomale struktuur beslaan msL2 'n gaping wat gevorm word deur die verlies van die uitgebreide ES31L rRNA.In hierdie leemte help msL2 om rRNA-vou te stabiliseer en kan dit vergoed vir die verlies van ES31L (Figuur 6).
'n Elektrondigtheid en model van die Microsporidia-spesifieke ribosomale proteïen msL2 wat in E. cuniculi-ribosome gevind word.b Die meeste eukariotiese ribosome, insluitend die 80S-ribosoom van Saccharomyces cerevisiae, het ES19L rRNA-amplifikasie wat verlore gaan in die meeste Mikrosporidiese spesies.Die voorheen gevestigde struktuur van die V. necatrix microsporidia ribosoom dui daarop dat die verlies van ES19L in hierdie parasiete vergoed word deur die evolusie van die nuwe msL1 ribosomale proteïen.In hierdie studie het ons gevind dat die E. cuniculi ribosoom ook 'n bykomende ribosomale RNA nabootsende proteïen ontwikkel het as 'n oënskynlike kompensasie vir die verlies van ES19L.msL2 (tans geannoteer as die hipotetiese ECU06_1135 proteïen) en msL1 het egter verskillende strukturele en evolusionêre oorspronge.c Hierdie ontdekking van die generering van evolusionêr onverwante msL1- en msL2-ribosomale proteïene dui daarop dat indien ribosome nadelige mutasies in hul rRNA ophoop, hulle ongekende vlakke van komposisie-diversiteit in selfs 'n klein subset van naverwante spesies kan bereik.Hierdie ontdekking kan help om die oorsprong en evolusie van die mitochondriale ribosoom te verduidelik, wat bekend is vir sy hoogs verminderde rRNA en abnormale variasie in proteïensamestelling oor spesies heen.
Ons het toe die msL2-proteïen vergelyk met die voorheen beskryfde msL1-proteïen, die enigste bekende mikrosporidia-spesifieke ribosomale proteïen wat in die V. necatrix-ribosoom gevind word.Ons wou toets of msL1 en msL2 evolusionêr verwant is.Ons analise het getoon dat msL1 en msL2 dieselfde holte in die ribosomale struktuur beset, maar verskillende primêre en tersiêre strukture het, wat hul onafhanklike evolusionêre oorsprong aandui (Fig. 6).Dus, ons ontdekking van msL2 verskaf bewyse dat groepe kompakte eukariotiese spesies onafhanklik struktureel verskillende ribosomale proteïene kan ontwikkel om te vergoed vir die verlies van rRNA-fragmente.Hierdie bevinding is opmerklik deurdat die meeste sitoplasmiese eukariotiese ribosome 'n onveranderlike proteïen bevat, insluitend dieselfde familie van 81 ribosomale proteïene.Die voorkoms van msL1 en msL2 in verskeie klades van mikrosporidia in reaksie op die verlies van uitgebreide rRNA-segmente dui daarop dat agteruitgang van die parasiet se molekulêre argitektuur veroorsaak dat parasiete kompenserende mutasies soek, wat uiteindelik tot hul verkryging in verskillende parasietpopulasies kan lei.strukture.
Laastens, toe ons model voltooi is, het ons die samestelling van die E. cuniculi-ribosoom vergelyk met dié wat uit die genoomvolgorde voorspel is.Daar is voorheen gedink dat verskeie ribosomale proteïene, insluitend eL14, eL38, eL41 en eS30, in die E. cuniculi-genoom ontbreek weens die oënskynlike afwesigheid van hul homoloë van die E. cuniculi-genoom.Verlies van baie ribosomale proteïene word ook voorspel in die meeste ander hoogs verminderde intrasellulêre parasiete en endosimbionte.Byvoorbeeld, hoewel die meeste vrylewende bakterieë dieselfde familie van 54 ribosomale proteïene bevat, het slegs 11 van hierdie proteïenfamilies waarneembare homoloë in elke geanaliseerde genoom van gasheerbeperkte bakterieë.Ter ondersteuning van hierdie idee is 'n verlies aan ribosomale proteïene eksperimenteel waargeneem in V. necatrix en P. locustae microsporidia, wat nie die eL38 en eL4131,32 proteïene het nie.
Ons strukture wys egter dat slegs eL38, eL41 en eS30 eintlik verlore gaan in die E. cuniculi-ribosoom.Die eL14-proteïen is bewaar en ons struktuur het gewys waarom hierdie proteïen nie in die homologiesoektog gevind kon word nie (Fig. 7).In E. cuniculi-ribosome gaan die meeste van die eL14-bindingsplek verlore as gevolg van degradasie van die rRNA-geamplifiseerde ES39L.In die afwesigheid van ES39L het eL14 die meeste van sy sekondêre struktuur verloor, en slegs 18% van die eL14-volgorde was identies in E. cuniculi en S. cerevisiae.Hierdie swak volgordebewaring is merkwaardig omdat selfs Saccharomyces cerevisiae en Homo sapiens—organismes wat 1,5 miljard jaar uitmekaar ontwikkel het—meer as 51% van dieselfde residue in eL14 deel.Hierdie abnormale verlies aan bewaring verklaar waarom E. cuniculi eL14 tans as die vermeende M970_061160 proteïen geannoteer word en nie as die eL1427 ribosomale proteïen nie.
en Die Microsporidia ribosoom het die ES39L rRNA verlenging verloor, wat die eL14 ribosomale proteïenbindingsplek gedeeltelik uitgeskakel het.In die afwesigheid van ES39L ondergaan die eL14 mikrospoorproteïen 'n verlies aan sekondêre struktuur, waarin die voormalige rRNA-bindende α-heliks in 'n minimale lengte lus ontaard.b Meervoudige volgorde-belyning toon dat die eL14-proteïen hoogs behoue ​​bly in eukariotiese spesies (57% volgorde-identiteit tussen gis en menslike homoloë), maar swak bewaar en uiteenlopend in mikrosporidia (waarin nie meer as 24% van residue identies is aan die eL14 homoloog).van S. cerevisiae of H. sapiens).Hierdie swak volgordebewaring en sekondêre struktuurveranderlikheid verklaar waarom die eL14 homoloog nog nooit in E. cuniculi gevind is nie en waarom hierdie proteïen vermoedelik in E. cuniculi verlore gegaan het.Daarteenoor is E. cuniculi eL14 voorheen as 'n vermeende M970_061160-proteïen geannoteer.Hierdie waarneming dui daarop dat mikrosporidia genoomdiversiteit tans oorskat word: sommige gene wat tans vermoedelik verlore gaan in mikrosporidia word in werklikheid bewaar, al is dit in hoogs gedifferensieerde vorms;in plaas daarvan word gedink dat sommige kodeer vir mikrosporidia-gene vir wurmspesifieke proteïene (bv. die hipotetiese proteïen M970_061160) kodeer eintlik vir die baie diverse proteïene wat in ander eukariote voorkom.
Hierdie bevinding dui daarop dat rRNA-denaturasie kan lei tot 'n dramatiese verlies aan volgordebewaring in aangrensende ribosomale proteïene, wat hierdie proteïene onopspoorbaar maak vir homologiesoektogte.Ons kan dus die werklike mate van molekulêre agteruitgang in klein genoom-organismes oorskat, aangesien sommige proteïene wat vermoedelik verlore gaan, eintlik voortduur, al is dit in hoogs veranderde vorms.
Hoe kan parasiete die funksie van hul molekulêre masjiene behou onder toestande van uiterste genoomvermindering?Ons studie beantwoord hierdie vraag deur die komplekse molekulêre struktuur (ribosoom) van E. cuniculi, 'n organisme met een van die kleinste eukariotiese genome, te beskryf.
Dit is al byna twee dekades lank bekend dat proteïen- en RNA-molekules in mikrobiese parasiete dikwels van hul homoloë molekules in vrylewende spesies verskil omdat hulle nie gehaltebeheersentrums het nie, tot 50% van hul grootte in vrylewende mikrobes verminder word, ens.baie aftakelende mutasies wat vou en funksie benadeel.Daar word byvoorbeeld verwag dat die ribosome van klein genoom-organismes, insluitend baie intrasellulêre parasiete en endosimbionte, verskeie ribosomale proteïene en tot een derde van rRNA-nukleotiede sal ontbreek in vergelyking met vrylewende spesies 27, 29, 30, 49. Die manier waarop hierdie molekules egter hoofsaaklik in 'n parasiet-oorblyfsels funksioneer, het hoofsaaklik in mysterie bestudeer.
Ons studie toon dat die struktuur van makromolekules baie aspekte van evolusie kan openbaar wat moeilik is om uit tradisionele vergelykende genomiese studies van intrasellulêre parasiete en ander gasheerbeperkte organismes te onttrek (Aanvullende Fig. 7).Die voorbeeld van die eL14-proteïen toon byvoorbeeld dat ons die werklike graad van degradasie van die molekulêre apparaat in parasitiese spesies kan oorskat.Daar word nou geglo dat enkefalitiese parasiete honderde mikrosporidia-spesifieke gene het.Ons resultate toon egter dat sommige van hierdie oënskynlik spesifieke gene eintlik net baie verskillende variante van gene is wat algemeen in ander eukariote voorkom.Boonop wys die voorbeeld van die msL2-proteïen hoe ons nuwe ribosomale proteïene miskyk en die inhoud van parasitiese molekulêre masjiene onderskat.Die voorbeeld van klein molekules wys hoe ons die vernuftigste innovasies in parasitiese molekulêre strukture kan miskyk wat hulle nuwe biologiese aktiwiteit kan gee.
Gesamentlik verbeter hierdie resultate ons begrip van die verskille tussen die molekulêre strukture van gasheerbeperkte organismes en hul eweknieë in vrylewende organismes.Ons wys dat molekulêre masjiene, wat lank vermoedelik gereduseer, gedegenereer en onderhewig is aan verskeie aftakelende mutasies, in plaas daarvan 'n stel sistematies oorgesiene ongewone strukturele kenmerke het.
Aan die ander kant suggereer die nie-lywige rRNA-fragmente en saamgesmelte fragmente wat ons in die ribosome van E. cuniculi gevind het dat genoomvermindering selfs daardie dele van die basiese molekulêre masjinerie wat in die drie lewensdomeine bewaar word – na byna 3,5 miljard jaar kan verander.onafhanklike evolusie van spesies.
Die bultvrye en saamgesmelte rRNA-fragmente in E. cuniculi-ribosome is van besondere belang in die lig van vorige studies van RNA-molekules in endosimbiotiese bakterieë.Byvoorbeeld, in die plantluis endosymbiont Buchnera aphidicola, is getoon dat rRNA en tRNA molekules temperatuur-sensitiewe strukture het as gevolg van A+T samestelling vooroordeel en 'n hoë proporsie nie-kanoniese basispare20,50.Hierdie veranderinge in RNA, sowel as veranderinge in proteïenmolekules, word nou gedink om verantwoordelik te wees vir die oorafhanklikheid van endosimbionte op vennote en die onvermoë van endosimbionte om hitte oor te dra 21, 23 .Alhoewel parasitiese mikrosporidia rRNA struktureel duidelike veranderinge het, dui die aard van hierdie veranderinge daarop dat verminderde termiese stabiliteit en groter afhanklikheid van chaperone-proteïene algemene kenmerke van RNA-molekules in organismes met verminderde genome kan wees.
Aan die ander kant toon ons strukture dat parasietmikrosporidia 'n unieke vermoë ontwikkel het om wyd gekonserveerde rRNA en proteïenfragmente te weerstaan, wat die vermoë ontwikkel om volop en geredelik beskikbare klein metaboliete te gebruik as strukturele nabootsers van gedegenereerde rRNA en proteïenfragmente.Molekulêre struktuur agteruitgang..Hierdie mening word ondersteun deur die feit dat klein molekules wat kompenseer vir die verlies van proteïenfragmente in die rRNA en ribosome van E. cuniculi aan mikrosporidia-spesifieke residue in die uL15- en eL30-proteïene bind.Dit dui daarop dat binding van klein molekules aan ribosome 'n produk van positiewe seleksie kan wees, waarin Mikrosporidia-spesifieke mutasies in ribosomale proteïene geselekteer is vir hul vermoë om die affiniteit van ribosome vir klein molekules te verhoog, wat kan lei tot meer doeltreffende ribosomale organismes.Die ontdekking onthul 'n slim innovasie in die molekulêre struktuur van mikrobiese parasiete en gee ons 'n beter begrip van hoe parasiet molekulêre strukture hul funksie behou ten spyte van reduktiewe evolusie.
Tans is die identifikasie van hierdie klein molekules onduidelik.Dit is nie duidelik waarom die voorkoms van hierdie klein molekules in die ribosomale struktuur tussen mikrosporidia spesies verskil nie.Dit is veral nie duidelik waarom nukleotiedbinding in die ribosome van E. cuniculi en P. locustae waargeneem word nie, en nie in die ribosome van V. necatrix nie, ten spyte van die teenwoordigheid van die F170-residu in die eL20- en K172-proteïene van V. necatrix.Hierdie delesie kan veroorsaak word deur oorblyfsel 43 uL6 (geleë langs die nukleotiedbindingsak), wat tyrosien in V. necatrix is ​​en nie threonien in E. cuniculi en P. locustae nie.Die lywige aromatiese syketting van Tyr43 kan inmeng met nukleotiedbinding as gevolg van steriese oorvleueling.Alternatiewelik kan die oënskynlike nukleotieddelesie te wyte wees aan die lae resolusie van krio-EM beelding, wat die modellering van V. necatrix ribosomale fragmente belemmer.
Aan die ander kant stel ons werk voor dat die proses van genoomverval 'n vindingryke krag kan wees.Die struktuur van die E. cuniculi-ribosoom dui veral daarop dat die verlies van rRNA en proteïenfragmente in die mikrosporidia-ribosoom evolusionêre druk skep wat veranderinge in ribosoomstruktuur bevorder.Hierdie variante kom ver van die aktiewe plek van die ribosoom voor en blyk te help handhaaf (of herstel) optimale ribosoomsamestelling wat andersins deur verminderde rRNA ontwrig sou word.Dit dui daarop dat 'n groot innovasie van die mikrosporidia-ribosoom blykbaar ontwikkel het in 'n behoefte om geendrywing te buffer.
Miskien word dit die beste geïllustreer deur nukleotiedbinding, wat tot dusver nog nooit in ander organismes waargeneem is nie.Die feit dat nukleotied-bindende residue teenwoordig is in tipiese mikrosporidia, maar nie in ander eukariote nie, dui daarop dat nukleotied-bindende plekke nie net oorblyfsels is wat wag om te verdwyn, of die finale plek vir rRNA om herstel te word in die vorm van individuele nukleotiede nie.In plaas daarvan lyk hierdie webwerf na 'n nuttige kenmerk wat oor verskeie rondes van positiewe seleksie kon ontwikkel het.Nukleotiedbindingsplekke kan 'n neweproduk van natuurlike seleksie wees: sodra ES39L afgebreek is, word mikrosporidia gedwing om vergoeding te soek om optimale ribosoombiogenese te herstel in die afwesigheid van ES39L.Aangesien hierdie nukleotied die molekulêre kontakte van die A3186-nukleotied in ES39L kan naboots, word die nukleotiedmolekule 'n bousteen van die ribosoom, waarvan die binding verder verbeter word deur mutasie van die eL30-volgorde.
Met betrekking tot die molekulêre evolusie van intrasellulêre parasiete, toon ons studie dat die kragte van Darwinistiese natuurlike seleksie en genetiese drywing van genoomverval nie parallel werk nie, maar ossilleer.Eerstens skakel genetiese drywing belangrike kenmerke van biomolekules uit, wat vergoeding broodnodig maak.Slegs wanneer parasiete hierdie behoefte deur Darwinistiese natuurlike seleksie bevredig, sal hul makromolekules 'n kans hê om hul mees indrukwekkende en innoverende eienskappe te ontwikkel.Dit is belangrik dat die evolusie van nukleotiedbindingsplekke in die E. cuniculi-ribosoom daarop dui dat hierdie verlies-tot-wins-patroon van molekulêre evolusie nie net skadelike mutasies amortiseer nie, maar soms heeltemal nuwe funksies aan parasitiese makromolekules verleen.
Hierdie idee stem ooreen met Sewell Wright se bewegende ewewigsteorie, wat sê dat 'n streng stelsel van natuurlike seleksie die vermoë van organismes om te innoveer beperk51,52,53.As genetiese drywing egter natuurlike seleksie ontwrig, kan hierdie dryf veranderinge produseer wat op sigself nie aanpasbaar (of selfs nadelig) is nie, maar lei tot verdere veranderinge wat hoër fiksheid of nuwe biologiese aktiwiteit verskaf.Ons raamwerk ondersteun hierdie idee deur te illustreer dat dieselfde tipe mutasie wat die vou en funksie van 'n biomolekule verminder blyk die hoofsneller vir die verbetering daarvan te wees.In ooreenstemming met die wen-wen evolusionêre model, toon ons studie dat genoomverval, wat tradisioneel as 'n degeneratiewe proses beskou word, ook 'n groot dryfveer van innovasie is, wat soms en miskien selfs dikwels makromolekules toelaat om nuwe parasitiese aktiwiteite te verkry.hulle kan gebruik.