Dankie dat u Nature.com besoek het. U gebruik 'n blaaierweergawe met beperkte CSS-ondersteuning. Vir die beste ervaring beveel ons aan dat u 'n opgedateerde blaaier gebruik (of Verenigbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer). Boonop, om voortgesette ondersteuning te verseker, wys ons die webwerf sonder style en JavaScript.
Wys 'n karrousel van drie skyfies gelyktydig. Gebruik die Vorige en Volgende knoppies om deur drie skyfies op 'n slag te beweeg, of gebruik die skuifknoppies aan die einde om deur drie skyfies op 'n slag te beweeg.
Die bloed-breinversperring en die bloed-breinversperring verhoed dat bioterapeutiese middels hul teikens in die sentrale senuweestelsel bereik, wat die effektiewe behandeling van neurologiese siektes belemmer. Om nuwe breintransporteerders in vivo te ontdek, het ons 'n T7-faagpeptiedbiblioteek bekendgestel en serieel bloed en serebrospinale vloeistof (CSF) versamel met behulp van 'n gekanuleerde bewuste groot poelmodel van rotte. Spesifieke faagklone was hoogs verryk in CSF na vier rondes van seleksie. Toetsing van individuele kandidaatpeptiede het meer as 1000-voudige verryking in CSF getoon. Die bioaktiwiteit van die peptied-gemedieerde aflewering aan die brein is bevestig deur 'n 40% vermindering in die vlak van amiloïed-β in die serebrospinale vloeistof met behulp van 'n BACE1-peptiedinhibeerder gekoppel aan die geïdentifiseerde nuwe transitpeptied. Hierdie resultate dui daarop dat die peptiede wat deur in vivo-faagseleksiemetodes geïdentifiseer is, nuttige voertuie kan wees vir sistemiese aflewering van makromolekules aan die brein met 'n terapeutiese effek.
Navorsing oor geteikende terapie in die sentrale senuweestelsel (SSS) het grootliks gefokus op die identifisering van geoptimaliseerde middels en middels wat SSS-teikenende eienskappe vertoon, met minder moeite om die meganismes te ontdek wat aktiewe geneesmiddelaflewering na die brein dryf. Dit begin nou verander, aangesien geneesmiddelaflewering, veral groot molekules, 'n integrale deel van moderne neurowetenskap-geneesmiddelontwikkeling is. Die omgewing van die sentrale senuweestelsel word goed beskerm deur die serebrovaskulêre versperringstelsel, wat bestaan ​​uit die bloed-breinversperring (BBB) ​​en die bloed-breinversperring (BCBB)1, wat dit uitdagend maak om geneesmiddels aan die brein af te lewer1,2. Daar word beraam dat byna alle grootmolekulêre geneesmiddels en meer as 98% van kleinmolekulêre geneesmiddels uit die brein uitgeskakel word3. Daarom is dit baie belangrik om nuwe breinvervoerstelsels te identifiseer wat doeltreffende en spesifieke aflewering van terapeutiese geneesmiddels aan die SSS bied 4,5. Die BBB en BCSFB bied egter ook 'n uitstekende geleentheid vir geneesmiddelaflewering, aangesien hulle alle strukture van die brein binnedring en binnedring deur sy uitgebreide vaskulatuur. Dus, die huidige pogings om nie-indringende metodes van aflewering aan die brein te gebruik, is grootliks gebaseer op die meganisme van reseptor-gemedieerde vervoer (PMT) met behulp van die endogene BBB6-reseptor. Ten spyte van onlangse belangrike vooruitgang met behulp van die transferrienreseptorroete7,8, is verdere ontwikkeling van nuwe afleweringstelsels met verbeterde eienskappe nodig. Vir hierdie doel was ons doel om peptiede te identifiseer wat in staat is om serebrovaskulêre vloeistofvervoer te bemiddel, aangesien hulle in beginsel gebruik kan word om makromolekules aan die SSS af te lewer of om nuwe reseptorpaaie oop te maak. In die besonder kan spesifieke reseptore en transporteerders van die serebrovaskulêre stelsel (BBB en BSCFB) dien as potensiële teikens vir die aktiewe en spesifieke aflewering van bioterapeutiese middels. Serebrospinale vloeistof (CSF) is 'n sekretoriese produk van die choroïedpleksus (CS) en is in direkte kontak met die interstisiële vloeistof van die brein deur die subarachnoïdale ruimte en ventrikulêre ruimte4. Onlangs is aangetoon dat subarachnoïdale serebrospinale vloeistof oormatig in die interstitium van die brein diffundeer9. Ons hoop om toegang tot die parenchimale ruimte te verkry deur hierdie subarachnoïdale invloeikanaal of direk deur die BBB te gebruik. Om dit te bereik, het ons 'n robuuste in vivo faagseleksiestrategie geïmplementeer wat ideaal gesproke peptiede identifiseer wat deur enige van hierdie twee afsonderlike bane vervoer word.
Ons beskryf nou 'n opeenvolgende in vivo faagvertoningsiftingsmetode met serebrospinale vloeistofmonsterneming gekoppel aan hoë deursetvolgordebepaling (HTS) om aanvanklike seleksierondes met die hoogste biblioteekdiversiteit te monitor. Sifting is uitgevoer op bewuste rotte met 'n permanent geïmplanteerde groot sisterna (CM) kanule om bloedkontaminasie te vermy. Dit is belangrik dat hierdie benadering beide breinteiken- en peptiede met vervoeraktiwiteit oor die serebrovaskulêre versperring selekteer. Ons het T7-fage gebruik as gevolg van hul klein grootte (~60 nm)10 en voorgestel dat hulle geskik is vir die vervoer van vesikels wat transsellulêre kruising van die endoteel- en/of epiteel-medulla-versperring moontlik maak. Na vier rondes van panning is faagpopulasies geïsoleer wat sterk in vivo serebrospinale vloeistofverryking en serebrale mikrovat-assosiasie toon. Dit is belangrik dat ons ons bevindinge kon bevestig deur aan te toon dat die voorkeur- en chemies gesintetiseerde beste kandidaatpeptiede in staat is om proteïenvrag in die serebrospinale vloeistof te vervoer. Eerstens is die farmakodinamiese effekte van die SSS vasgestel deur 'n toonaangewende transitopeptied te kombineer met 'n inhibeerder van die BACE1-peptied. Benewens die demonstrasie dat in vivo funksionele siftingsstrategieë nuwe breinvervoerpeptiede as effektiewe proteïenvragdraers kan identifiseer, verwag ons dat soortgelyke funksionele seleksiebenaderings ook belangrik sal word in die identifisering van nuwe breinvervoerpaaie.
Gebaseer op plaakvormende eenhede (PFU), is 'n biblioteek van ewekansige 12-mer lineêre T7-faagpeptiede met 'n diversiteit van ongeveer 109 ontwerp en geskep na die faagverpakkingstap (sien Materiale en Metodes). Dit is belangrik om daarop te let dat ons hierdie biblioteek noukeurig geanaliseer het voor in vivo panning. PCR-amplifikasie van faagbiblioteekmonsters met behulp van gemodifiseerde primers het amplikons gegenereer wat direk van toepassing was op HTS (Aanvullende Fig. 1a). As gevolg van a) HTS11-volgordebepalingsfoute, b) impak op die kwaliteit van primers (NNK)1-12, en c) die teenwoordigheid van wildetipe (wt) faag (skeletinvoegsels) in die bystandbiblioteek, is 'n volgordefilterprosedure geïmplementeer om slegs geverifieerde volgorde-inligting te onttrek (Aanvullende Fig. 1b). Hierdie filterstappe is van toepassing op alle HTS-volgordebepalingsbiblioteke. Vir die standaardbiblioteek is 'n totaal van 233 868 lesings verkry, waarvan 39% die filterkriteria geslaag het en gebruik is vir biblioteekanalise en seleksie vir daaropvolgende rondes (Aanvullende Fig. 1c-e). Die lesings was hoofsaaklik veelvoude van 3 basispare in lengte met 'n piek by 36 nukleotiede (Aanvullende Fig. 1c), wat die biblioteekontwerp (NNK) 1-12 bevestig. Dit is opmerklik dat ongeveer 11% van die biblioteeklede 'n 12-dimensionele wildetipe (wt) ruggraat PAGISRELVDKL-insetsel bevat het, en byna die helfte van die rye (49%) invoegings of delesies bevat het. Die HTS van die biblioteekbiblioteek het die hoë diversiteit van peptiede in die biblioteek bevestig: meer as 81% van die peptiedvolgordes is slegs een keer gevind en slegs 1.5% het in ≥4 kopieë voorgekom (Aanvullende Fig. 2a). Die frekwensies van aminosure (aa) by al 12 posisies in die repertoire het goed gekorreleer met die frekwensies wat verwag word vir die aantal kodons wat deur die gedegenereerde NKK-repertoire gegenereer word (Aanvullende Fig. 2b). Die waargenome frekwensie van aa-residue wat deur hierdie invoegings gekodeer word, het goed gekorreleer met die berekende frekwensie (r = 0.893) (Aanvullende Fig. 2c). Die voorbereiding van faagbiblioteke vir inspuiting sluit die stappe van amplifikasie en verwydering van endotoksien in. Daar is voorheen getoon dat dit die diversiteit van faagbiblioteke moontlik kan verminder12,13. Daarom het ons 'n plaat-geamplifiseerde faagbiblioteek wat endotoksienverwydering ondergaan het, gesekwensieer en dit met die oorspronklike biblioteek vergelyk om die frekwensie van AA te skat. 'n Sterk korrelasie (r = 0.995) is waargeneem tussen die oorspronklike poel en die geamplifiseerde en gesuiwerde poel (Aanvullende Fig. 2d), wat aandui dat kompetisie tussen klone wat op plate met T7-faag geamplifiseer is, nie groot vooroordeel veroorsaak het nie. Hierdie vergelyking is gebaseer op die frekwensie van tripeptiedmotiewe in elke biblioteek, aangesien die diversiteit van biblioteke (~109) nie eens met HTS volledig vasgelê kan word nie. Frekwensie-analise van aa by elke posisie het 'n klein posisie-afhanklike vooroordeel in die laaste drie posisies van die ingevoerde repertoire aan die lig gebring (Aanvullende Fig. 2e). Ten slotte het ons tot die gevolgtrekking gekom dat die kwaliteit en diversiteit van die biblioteek aanvaarbaar was en slegs geringe veranderinge in diversiteit waargeneem is as gevolg van amplifikasie en voorbereiding van faagbiblioteke tussen verskeie rondes van seleksie.
Seriële monsterneming van serebrospinale vloeistof kan uitgevoer word deur 'n kanule chirurgies in die CM van bewuste rotte in te plant om die identifisering van T7-faag wat intraveneus (iv) via die BBB en/of BCSFB ingespuit word, te vergemaklik (Fig. 1a-b). Ons het twee onafhanklike seleksie-arms (arms A en B) in die eerste drie rondes van in vivo seleksie gebruik (Fig. 1c). Ons het die strengheid van die seleksie geleidelik verhoog deur die totale hoeveelheid faag wat in die eerste drie rondes van seleksie ingebring is, te verminder. Vir die vierde ronde van panning het ons monsters van takke A en B gekombineer en drie bykomende onafhanklike seleksies uitgevoer. Om die in vivo eienskappe van T7-faagdeeltjies in hierdie model te bestudeer, is wildetipe-faag (PAGISRELVDKL-meesterinsetsel) via die stertaar in rotte ingespuit. Herwinning van fage uit serebrospinale vloeistof en bloed op verskillende tydspunte het getoon dat relatief klein T7 ikosaëdriese fage 'n vinnige aanvanklike klaringfase uit die bloedkompartement gehad het (Aanvullende Fig. 3). Gebaseer op die toegediende titers en die bloedvolume van die rotte, het ons bereken dat slegs ongeveer 1% gewigsfaag van die toegediende dosis in die bloed 10 minute na intraveneuse inspuiting opgespoor is. Na hierdie aanvanklike vinnige afname is 'n stadiger primêre klaring gemeet met 'n halfleeftyd van 27.7 minute. Dit is belangrik dat slegs baie min fage uit die serebrospinale vloeistof (CSF) herwin is, wat dui op 'n lae agtergrond vir wildetipe-faagmigrasie na die CSF-kompartement (Aanvullende Fig. 3). Gemiddeld is slegs ongeveer 1 x 10-3% titers van T7-faag in die bloed en 4 x 10-8% van aanvanklik toegediende fage in die serebrospinale vloeistof oor die hele monsternemingsperiode (0-250 min) opgespoor. Dit is opmerklik dat die halfleeftyd (25.7 min) van wildetipe-faag in serebrospinale vloeistof soortgelyk was aan dié wat in bloed waargeneem is. Hierdie data toon dat die versperring wat die serebrospinale vloeistof (CSF)-kompartement van die bloed skei, ongeskonde is in CM-gekanuleerde rotte, wat in vivo seleksie van faagbiblioteke moontlik maak om klone te identifiseer wat geredelik vanaf die bloed na die CSF-kompartement vervoer word.
(a) Opstel van 'n metode vir die hermonsterneming van serebrospinale vloeistof (CSF) uit 'n groot poel. (b) Diagram wat die sellulêre ligging van die sentrale senuweestelsel (SSS) versperring toon en die seleksiestrategie wat gebruik word om peptiede te identifiseer wat die bloed-brein versperring (BBB) ​​en die bloed-brein versperring oorsteek. (c) In vivo faagvertoningsifting vloeidiagram. In elke seleksierondte is fage (dieridentifiseerders binne die pyle) intraveneus ingespuit. Twee onafhanklike alternatiewe takke (A, B) word afsonderlik gehou tot die 4de seleksierondte. Vir seleksierondtes 3 en 4 is elke faagkloon wat uit CSF onttrek is, handmatig georden. (d) Kinetika van fage geïsoleer uit bloed (rooi sirkels) en serebrospinale vloeistof (groen driehoeke) tydens die eerste seleksierondte in twee gekanuleerde rotte na intraveneuse inspuiting van die T7 peptiedbiblioteek (2 x 1012 fage/dier). Blou vierkante dui die gemiddelde aanvanklike konsentrasie van fage in die bloed aan, bereken uit die hoeveelheid ingespuite fage, met inagneming van die totale bloedvolume. Die swart vierkante dui die snypunt van die y-lyn aan, geëkstrapoleer vanaf bloedfaagkonsentrasies. (e,f) Stel die relatiewe frekwensie en verspreiding van alle moontlike oorvleuelende tripeptiedmotiewe wat in die peptied gevind word, voor. Die aantal motiewe wat in 1000 lesings gevind is, word getoon. Beduidend (p < 0.001) word verrykte motiewe met rooi kolletjies gemerk. (e) Korrelasie-verspreidingsdiagram wat die relatiewe frekwensie van die tripeptiedmotief van die ingespuite biblioteek vergelyk met bloed-afgeleide faag van diere #1.1 en #1.2. (f) Korrelasie-verspreidingsdiagram wat die relatiewe frekwensies van dierfaag-tripeptiedmotiewe #1.1 en #1.2 wat in bloed en serebrospinale vloeistof geïsoleer is, vergelyk. (g, h) Volgorde-ID-voorstelling van faag verryk in bloed (g) teenoor ingespuite biblioteke en faag verryk in serebrospinale vloeistof (h) teenoor bloed na 'n ronde van in vivo seleksie in beide diere. Die grootte van die eenletterkode dui aan hoe gereeld daardie aminosuur op daardie posisie voorkom. Groen = polêr, pers = neutraal, blou = basies, rooi = suur en swart = hidrofobiese aminosure. Figuur 1a, b is ontwerp en vervaardig deur Eduard Urich.
Ons het 'n faagpeptiedbiblioteek in twee CM-instrumentrotte (klades A en B) ingespuit en die faag uit serebrospinale vloeistof en bloed geïsoleer (Figuur 1d). Die aanvanklike vinnige klaring van die biblioteek was minder prominent in vergelyking met die wildetipe-faag. Die gemiddelde halfleeftyd van die ingespuite biblioteek in beide diere was 24.8 minute in bloed, soortgelyk aan wildetipe-faag, en 38.5 minute in serebrospinale vloeistof-faagmonsters van elke dier is aan HTS onderwerp en alle geïdentifiseerde peptiede is geanaliseer vir die teenwoordigheid van 'n kort tripeptiedmotief. Tripeptiedmotiewe is gekies omdat hulle 'n minimale basis bied vir struktuurvorming en peptied-proteïen-interaksies14,15. Ons het 'n goeie korrelasie gevind in die verspreiding van motiewe tussen die ingespuite faagbiblioteek en klone wat uit die bloed van beide diere onttrek is (Fig. 1e). Die data dui daarop dat die samestelling van die biblioteek slegs marginaal verryk is in die bloedkompartement. Aminosuurfrekwensies en konsensusreekse is verder by elke posisie geanaliseer met behulp van 'n aanpassing van die Weblogo16-sagteware. Interessant genoeg het ons 'n sterk verryking in bloedglisienresidue gevind (Fig. 1g). Toe bloed vergelyk is met klone wat uit serebrospinale vloeistof (CSF) gekies is, is sterk seleksie en 'n mate van deseleksie van motiewe waargeneem (Fig. 1f), en sekere aminosure was verkieslik teenwoordig op voorafbepaalde posisies in die 12-lid (Fig. 1h). Dit is opmerklik dat individuele diere beduidend verskil het in serebrospinale vloeistof, terwyl bloedglisienverryking in beide diere waargeneem is (Aanvullende Fig. 4a-j). Na streng filtrering van volgordedata in die serebrospinale vloeistof van diere #1.1 en #1.2, is 'n totaal van 964 en 420 unieke 12-mer peptiede verkry (Aanvullende Fig. 1d-e). Die geïsoleerde faagklone is geamplifiseer en aan 'n tweede ronde van in vivo seleksie onderwerp. Fage wat uit die tweede ronde van seleksie onttrek is, is in elke dier aan HTS onderwerp en alle geïdentifiseerde peptiede is as invoer vir 'n motiefherkenningsprogram gebruik om die voorkoms van tripeptiedmotiewe te analiseer (Fig. 2a, b, ef). In vergelyking met die eerste siklus van die faag wat uit serebrospinale vloeistof (CSF) herwin is, het ons verdere seleksie en deseleksie van baie motiewe in CSF in takke A en B waargeneem (Fig. 2). 'n Netwerkidentifikasie-algoritme is toegepas om te bepaal of hulle verskillende patrone van konsekwente volgorde verteenwoordig. 'n Duidelike ooreenkoms is waargeneem tussen die 12-dimensionele volgordes wat deur CSF in alternatiewe klade A (Fig. 2c, d) en klade B (Fig. 2g, h) herwin is. Die gepoolde analise in elke tak het verskillende seleksieprofiele vir 12-mer peptiede (Aanvullende Fig. 5c, d) en 'n toename in die CSF/bloedtiterverhouding oor tyd vir gepoolde klone na die tweede ronde seleksie in vergelyking met die eerste ronde seleksie (Aanvullende Fig. 5e).
Verryking van motiewe en peptiede in serebrospinale vloeistof deur twee opeenvolgende rondes van in vivo funksionele faagvertoningseleksie.
Alle serebrospinale vloeistoffage wat uit die eerste rondte van elke dier herwin is (diere #1.1 en #1.2) is saamgevoeg, geamplifiseer, HT-gevolgorde bepaal en weer saam ingespuit (2 x 1010 fage/dier) 2 SM-gekanuleerde rotte (#1.1 → #). 2.1 en 2.2, 1.2 → 2.3 en 2.4). (a,b,e,f) Korrelasie-verspreidingsdiagramme wat die relatiewe frekwensie van tripeptiedmotiewe van alle CSF-afgeleide fage in die eerste en tweede seleksierondes vergelyk. Relatiewe frekwensie en verspreiding van motiewe wat alle moontlike oorvleuelende tripeptiede verteenwoordig wat in peptiede in beide oriëntasies gevind is. Die aantal motiewe wat in 1000 lesings gevind is, word getoon. Motiewe wat beduidend (p < 0.001) geselekteer of uitgesluit is in een van die vergelykde biblioteke, word met rooi kolletjies uitgelig. (c, d, g, h) Volgorde-logo-voorstelling van alle serebrospinale vloeistof (CSF)-ryke 12-aminosuur lange volgordes gebaseer op rondes 2 en 1 van in vivo seleksie. Die grootte van die eenletterkode dui aan hoe gereeld daardie aminosuur by daardie posisie voorkom. Om die logo voor te stel, word die frekwensie van CSF-volgordes wat uit individuele diere tussen twee seleksierondes onttrek is, vergelyk en die verrykte volgordes in die tweede ronde word getoon: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 en (h) #1.2–#2.4. Die mees verrykte aminosure by 'n gegewe posisie in (c, d) diere nr. 2.1 en nr. 2.2 of (g, h) in diere nr. 2.3 en nr. 2.4 word in kleur getoon. Groen = polêr, pers = neutraal, blou = basies, rooi = suur en swart = hidrofobiese aminosure.
Na die derde ronde van seleksie het ons 124 unieke peptiedvolgordes (#3.1 en #3.2) geïdentifiseer uit 332 CSF-gerekonstitueerde faagklone wat uit twee diere geïsoleer is (Aanvullende Fig. 6a). Die volgorde LGSVS (18.7%) het die hoogste relatiewe proporsie gehad, gevolg deur die wildetipe-insetsels PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), en SARGSWREIVSLS (2.2%). In die laaste vierde ronde het ons twee onafhanklik geselekteerde takke van drie afsonderlike diere saamgevoeg (Fig. 1c). Van die 925 gesekwensieerde faagklone wat uit CSF herwin is, het ons in die vierde ronde 64 unieke peptiedvolgordes gevind (Aanvullende Fig. 6b), waaronder die relatiewe proporsie wildetipe-fage tot 0.8% gedaal het. Die mees algemene CSF-klone in die vierde rondte was LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) en RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %)). Die lengtebereik van die geselekteerde peptiede is te wyte aan nukleotied-invoegings/delesies of voortydige stopkodons in die biblioteekprimers wanneer gedegenereerde kodons vir NNK-biblioteekontwerp gebruik word. Voortydige stopkodons genereer korter peptiede en word gekies omdat hulle die gunstige aa-motief bevat. Langer peptiede kan voortspruit uit invoegings/delesies in die primers van die sintetiese biblioteke. Dit posisioneer die ontwerpte stopkodon buite die raam en lees dit totdat 'n nuwe stopkodon stroomaf verskyn. Oor die algemeen het ons verrykingsfaktore vir al vier seleksierondes bereken deur die invoerdata met die monster-uitvoerdata te vergelyk. Vir die eerste rondte van sifting het ons wilde-tipe faagtiters as 'n nie-spesifieke agtergrondverwysing gebruik. Interessant genoeg was negatiewe faagseleksie baie sterk in die eerste serebrospinale vloeistofsiklus, maar nie in bloed nie (Fig. 3a), wat moontlik te wyte is aan die lae waarskynlikheid van passiewe diffusie van die meeste lede van die peptiedbiblioteek in die serebrospinale vloeistofkompartement, of relatiewe fage is geneig om meer doeltreffend behou of verwyder te word uit die bloedstroom as bakteriofage. In die tweede ronde van panning is sterk seleksie van fage in serebrospinale vloeistof egter in beide klades waargeneem, wat daarop dui dat die vorige ronde verryk was in fage wat peptiede vertoon wat serebrospinale vloeistofopname bevorder (Fig. 3a). Weereens, sonder beduidende bloedverryking. Ook in die derde en vierde rondes was die faagklone beduidend verryk in serebrospinale vloeistof. Deur die relatiewe frekwensie van elke unieke peptiedvolgorde tussen die laaste twee rondes van seleksie te vergelyk, het ons gevind dat die volgordes selfs meer verryk was in die vierde ronde van seleksie (Fig. 3b). 'n Totaal van 931 tripeptiedmotiewe is uit al 64 unieke peptiedvolgoriëntasies onttrek met behulp van beide peptiedoriëntasies. Die mees verrykte motiewe in die vierde rondte is noukeuriger ondersoek vir hul verrykingsprofiele oor alle rondtes in vergelyking met die ingespuite biblioteek (afsnypunt: 10% verryking) (Aanvullende Fig. 6c). Algemene seleksiepatrone het getoon dat die meeste van die bestudeerde motiewe in alle vorige rondtes van beide seleksietakke verryk is. Sommige motiewe (bv. SGL, VSG, LGS GSV) was egter hoofsaaklik van alternatiewe klade A, terwyl ander (bv. FGW, RTN, WGF, NTR) in alternatiewe klade B verryk is.
Validering van CSF-vervoer van CSF-verrykte faag-vertoonde peptiede en gebiotinileerde leierpeptiede gekonjugeer aan streptavidien-vragte.
(a) Verrykingsverhoudings bereken in al vier rondes (R1-R4) gebaseer op ingespuite (inset = I) faag (PFU) titers en bepaalde CSF faag titers (uitset = O). Verrykingsfaktore vir die laaste drie rondes (R2-R4) is bereken deur vergelyking met die vorige ronde en die eerste ronde (R1) met gewigsdata. Oop stawe is serebrospinale vloeistof, geskakeerde stawe is plasma. (***p<0.001, gebaseer op Student se t-toets). (b) Lys van die volopste faagpeptiede, gerangskik volgens hul relatiewe verhouding tot alle fage wat in CSF versamel is na ronde 4 van seleksie. Die ses mees algemene faagklone word in kleur uitgelig, genommer en hul verrykingsfaktore tussen rondes 3 en 4 van seleksie (insetsels). (c,d) Die ses mees verrykte faagklone, leë faag- en ouerfaagpeptiedbiblioteke van ronde 4 is individueel geanaliseer in 'n CSF-monsternemingsmodel. CSF- en bloedmonsters is op die aangeduide tydspunte versamel. (c) Gelyke hoeveelhede van 6 kandidaat-faagklone (2 x 1010 fage/diere), leë fage (#1779) (2 x 1010 fage/diere) en voorraadfaagpeptiedbiblioteke (2 x 1012 fage/diere). Ten minste 3 cm word afsonderlik via die stertaar aan die gekanuleerde dier toegedien. Die farmakokinetika van die serebrospinale vloeistof (CSF) van elke ingespuite faagkloon en faagpeptiedbiblioteek oor tyd word getoon. (d) toon die gemiddelde CSF/bloed-verhouding vir alle herwonne fage/ml oor die monsternemingstyd. (e) Vier sintetiese leierpeptiede en een gekromde kontrole is met biotien aan streptavidien gekoppel deur hul N-terminus (tetrameervertoning), gevolg deur inspuiting (stertaar iv, 10 mg streptavidien/kg). Ten minste drie geïntubeerde rotte (N = 3). CSF-monsters is op die aangeduide tydspunte versamel en streptavidien-konsentrasies is gemeet deur CSF-anti-streptavidien-ELISA (nd = nie opgespoor nie). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, gebaseer op ANOVA-toets). (f) Vergelyking van die aminosuurvolgorde van die mees verrykte faagpeptiedkloon #2002 (pers) met ander geselekteerde faagpeptiedklone van die 4de rondte van seleksie. Identiese en soortgelyke aminosuurfragmente is kleurgekodeer.
Van al die verrykte fage in die vierde ronde (Fig. 3b), is ses kandidaatklone gekies vir verdere individuele analise in die serebrospinale vloeistof (CSF) monsternemingsmodel. Gelyke hoeveelhede van ses kandidaatfaag-, leë faag- (geen invoeging) en profaagpeptiedbiblioteke is in drie gekanuleerde CM-diere ingespuit, en farmakokinetika is bepaal in CSF- (Fig. 3c) en bloed- (Aanvullende Fig. 7) toetse. Alle getoetste faagklone het die CSF-kompartement geteiken op 'n vlak 10-1000 keer hoër as dié van die leë kontrolefage (#1779). Byvoorbeeld, klone #2020 en #2077 het ongeveer 1000 keer hoër CSF-titers as kontrolefage gehad. Die farmakokinetiese profiel van elke geselekteerde peptied is anders, maar almal het 'n hoë CSF-homingvermoë. Ons het 'n konstante afname oor tyd waargeneem vir klone #1903 en #2011, terwyl 'n toename gedurende die eerste 10 minute vir klone #2077, #2002 en #2009 aktiewe vervoer kan aandui, maar dit moet geverifieer word. Klone #2020, #2002 en #2077 het op hoë vlakke gestabiliseer, terwyl die serebrospinale vloeistofkonsentrasie van kloon #2009 stadig afgeneem het na die aanvanklike toename. Ons het toe die relatiewe frekwensie van elke serebrospinale vloeistofkandidaat met sy bloedkonsentrasie vergelyk (Fig. 3d). Die korrelasie van die gemiddelde titer van elke serebrospinale vloeistofkandidaat met sy bloedtiter op alle monsternemingstye het getoon dat drie van die ses kandidate beduidend verryk was in bloed-serebrospinale vloeistof. Interessant genoeg het kloon #2077 hoër bloedstabiliteit getoon (Aanvullende Figuur 7). Om te bevestig dat die peptiede self in staat is om vrag anders as faagdeeltjies aktief na die serebrospinale vloeistofkompartement te vervoer, het ons vier leierpeptiede gesintetiseer wat met biotien by die N-terminus gederivatiseer is waar die peptiede aan die faagdeeltjie heg. Biotinileerde peptiede (nrs. 2002, 2009, 2020 en 2077) is met streptavidien (SA) gekonjugeer om multimeriese vorms te verkry wat die geometrie van faag ietwat naboots. Hierdie formaat het ons ook toegelaat om SA-blootstelling in bloed en serebrospinale vloeistof as vragvervoerende proteïenpeptiede te meet. Dit is belangrik dat faagdata dikwels gereproduseer kon word wanneer sintetiese peptiede in hierdie SA-gekonjugeerde formaat toegedien is (Fig. 3e). Die gekarringde peptiede het minder aanvanklike blootstelling en vinniger serebrospinale vloeistofopruiming met ondetecteerbare vlakke binne 48 uur gehad. Om insig te verkry in die afleweringspaaie van hierdie peptiedfaagklone in die serebrospinale vloeistofruimte, het ons die lokalisering van individuele faagpeptiedtreffers ontleed deur immunohistochemie (IHC) te gebruik om faagdeeltjies direk 1 uur na intraveneuse inspuiting in vivo op te spoor. Dit is opmerklik dat klone #2002, #2077 en #2009 opgespoor kon word deur sterk kleuring in breinkapillêre, terwyl kontrolefage (#1779) en kloon #2020 nie opgespoor is nie (Aanvullende Figuur 8). Dit dui daarop dat hierdie peptiede bydra tot die effek op die brein juis deur die BBB oor te steek. Verdere gedetailleerde analise is nodig om hierdie hipotese te toets, aangesien die BSCFB-roete ook betrokke kan wees. Wanneer die aminosuurvolgorde van die mees verrykte kloon (#2002) met ander geselekteerde peptiede vergelyk word, is opgemerk dat sommige van hulle soortgelyke aminosuuruitbreidings het, wat 'n soortgelyke vervoermeganisme kan aandui (Fig. 3f).
As gevolg van sy unieke plasmaprofiel en beduidende toename in serebrospinale vloeistof (CSF) oor tyd, is faagvertoningskloon #2077 verder ondersoek oor 'n langer tydperk van 48 uur en kon dit die vinnige toename in CSF wat waargeneem is in samehang met volgehoue ​​SA-vlakke reproduseer (Fig. 4a). Wat ander geïdentifiseerde faagklone betref, het #2077 sterk gekleur vir breinkapillêre en beduidende kolokalisering met kapillêre merkerlektien getoon toe dit teen hoër resolusie beskou is, en moontlik 'n mate van kleuring in die parenchiemruimte (Figuur 4b). Om te ondersoek of peptied-gemedieerde farmakologiese effekte in die SSS verkry kon word, het ons 'n eksperiment uitgevoer waarin gebiotinileerde weergawes van i) die #2077 transitpeptied en ii) die BACE1-inhibeerderpeptied met SA in twee verskillende verhoudings gemeng is. Vir een kombinasie het ons slegs die BACE1-peptiedinhibeerder gebruik en vir die ander het ons 'n 1:3 verhouding van BACE1-peptiedinhibeerder tot #2077-peptied gebruik. Beide monsters is intraveneus toegedien en bloed- en serebrospinale vloeistofvlakke van beta-amiloïedpeptied 40 (Abeta40) is oor tyd gemeet. Abeta40 is in serebrospinale vloeistof gemeet aangesien dit BACE1-inhibisie in die breinparenchiem weerspieël. Soos verwag, het beide komplekse die bloedvlakke van Abeta40 aansienlik verminder (Fig. 4c, d). Slegs monsters wat 'n mengsel van peptied nr. 2077 en 'n inhibeerder van die BACE1-peptied gekonjugeer aan SA bevat, het egter 'n beduidende afname in Abeta40 in die serebrospinale vloeistof veroorsaak (Fig. 4c). Die data toon dat peptied nr. 2077 die 60 kDa SA-proteïen na die SSS kan vervoer en ook farmakologiese effekte met SA-gekonjugeerde inhibeerders van die BACE1-peptied kan veroorsaak.
(a) Klonale inspuiting (2 × 10 fage/dier) van T7-faag wat langtermyn farmakokinetiese profiele van CSF-peptied #2077 (RLSSVDSDLSGC) en ongeïnjecteerde kontrolefage (#1779) in ten minste drie CM-geïntubeerde rotte toon. (b) Konfokale mikroskopiese beeld van verteenwoordigende kortikale mikrovate in faag-geïnjecteerde rotte (2 × 10 10 fage/dier) wat teenkleuring van peptied #2077 en vate (lektien) toon. Hierdie faagklone is aan 3 rotte toegedien en toegelaat om vir 1 uur te sirkuleer voor perfusie. Breine is gesny en gekleur met poliklonale FITC-gemerkte teenliggaampies teen die T7-faagkapsied. Tien minute voor perfusie en daaropvolgende fiksasie is DyLight594-gemerkte lektien intraveneus toegedien. Fluoresserende beelde wat lektienkleuring (rooi) van die luminale kant van mikrovate en fage (groen) in die lumen van kapillêre en perivaskulêre breinweefsel toon. Die skaalbalk stem ooreen met 10 µm. (c, d) Gebiotinileerde BACE1-inhiberende peptied alleen of in kombinasie met gebiotinileerde transitopeptied #2077 is aan streptavidien gekoppel, gevolg deur intraveneuse inspuiting van ten minste drie gekanuleerde CM-rotte (10 mg streptavidien/kg). BACE1-peptied-inhibeerder-gemedieerde vermindering in Aβ40 is gemeet deur Aβ1-40 ELISA in bloed (rooi) en serebrospinale vloeistof (oranje) op die aangeduide tydspunte. Vir beter duidelikheid word 'n stippellyn op die grafiek getrek op 'n skaal van 100%. (c) Persentasie vermindering in Aβ40 in bloed (rooi driehoeke) en serebrospinale vloeistof (oranje driehoeke) in rotte wat behandel is met streptavidien gekonjugeer aan transitopeptied #2077 en BACE1-inhiberende peptied in 'n 3:1-verhouding. (d) Persentasie vermindering in bloed Aβ40 (rooi sirkels) en serebrospinale vloeistof (oranje sirkels) van rotte wat behandel is met streptavidien gekoppel aan slegs 'n BACE1-inhiberende peptied. Die Aβ-konsentrasie in die kontrole was 420 pg/ml (standaardafwyking = 101 pg/ml).
Faagvertoning is suksesvol toegepas in verskeie areas van biomediese navorsing17. Hierdie metode is gebruik vir in vivo vaskulêre diversiteitstudies18,19 sowel as studies wat serebrale vate teiken20,21,22,23,24,25,26. In hierdie studie het ons die toepassing van hierdie seleksiemetode uitgebrei, nie net na die direkte identifisering van peptiede wat serebrale vate teiken nie, maar ook na die ontdekking van kandidate met aktiewe vervoer-eienskappe om die bloedbreinversperring oor te steek. Ons beskryf nou die ontwikkeling van 'n in vivo seleksieprosedure in CM-geïntubeerde rotte en demonstreer die potensiaal daarvan om peptiede met CSF-homing-eienskappe te identifiseer. Deur die T7-faag te gebruik wat 'n biblioteek van 12-mer ewekansige peptiede vertoon, kon ons demonstreer dat die T7-faag klein genoeg is (ongeveer 60 nm in deursnee)10 om aangepas te word by die bloedbreinversperring, en sodoende die bloedbreinversperring of choroïedpleksus direk oor te steek. Ons het waargeneem dat die oes van serebrospinale vloeistof (CSF) van gekanuleerde CM-rotte 'n goed beheerde in vivo funksionele siftingsmetode was, en dat die geëkstraheerde faag nie net aan die vaskulatuur gebind het nie, maar ook as 'n vervoerder oor die bloed-breinversperring gefunksioneer het. Verder, deur gelyktydig bloed te versamel en HTS op CSF en bloed-afgeleide fage toe te pas, het ons bevestig dat ons keuse van CSF nie beïnvloed is deur bloedverryking of geskiktheid vir uitbreiding tussen seleksierondes nie. Die bloedkompartement is egter deel van die seleksieprosedure, aangesien fage wat die CSF-kompartement kan bereik, lank genoeg in die bloedstroom moet oorleef en sirkuleer om hulself in die brein te verryk. Om betroubare volgorde-inligting uit rou HTS-data te onttrek, het ons filters geïmplementeer wat aangepas is vir platformspesifieke volgorde-foute in die analise-werkvloei. Deur kinetiese parameters in die siftingsmetode in te sluit, het ons die vinnige farmakokinetika van wilde-tipe T7-fage (t½ ~ 28 min) in bloed24, 27, 28 bevestig en ook hul halfleeftyd in serebrospinale vloeistof (t½ ~ 26 min) per minuut bepaal. Ten spyte van soortgelyke farmakokinetiese profiele in bloed en serebrospinale vloeistof (CSF), kon slegs 0.001% van die bloedkonsentrasie van faag in CSF opgespoor word, wat dui op lae agtergrondmobiliteit van wildetipe T7-faag oor die bloedbreinversperring. Hierdie werk beklemtoon die belangrikheid van die eerste ronde seleksie wanneer in vivo panningstrategieë gebruik word, veral vir faagstelsels wat vinnig uit die sirkulasie verwyder word, aangesien min klone die SSS-kompartement kan bereik. Dus, in die eerste ronde, was die vermindering in biblioteekdiversiteit baie groot, aangesien slegs 'n beperkte aantal klone uiteindelik in hierdie baie streng CSF-model versamel is. Hierdie in vivo panningstrategie het verskeie seleksiestappe ingesluit soos aktiewe akkumulasie in die CSF-kompartement, kloonoorlewing in die bloedkompartement en vinnige verwydering van T7-faagklone uit die bloed binne die eerste 10 minute (Fig. 1d en Aanvullende Fig. 4M). Dus, na die eerste ronde, is verskillende faagklone in CSF geïdentifiseer, alhoewel dieselfde aanvanklike poel vir individuele diere gebruik is. Dit dui daarop dat veelvuldige streng seleksiestappe vir bronbiblioteke met 'n groot aantal biblioteeklede lei tot 'n beduidende vermindering in diversiteit. Daarom sal ewekansige gebeurtenisse 'n integrale deel van die aanvanklike seleksieproses word, wat die resultaat grootliks beïnvloed. Dit is waarskynlik dat baie van die klone in die oorspronklike biblioteek 'n baie soortgelyke CSF-verrykingsgeneigdheid gehad het. Selfs onder dieselfde eksperimentele toestande kan seleksieresultate egter verskil as gevolg van die klein aantal van elke spesifieke kloon in die aanvanklike poel.
Die motiewe wat in serebrospinale vloeistof (CSF) verryk is, verskil van dié in die bloed. Interessant genoeg het ons die eerste verskuiwing na glisienryke peptiede in die bloed van individuele diere opgemerk. (Fig. 1g, Aanvullende Fig. 4e, 4f). Fage wat glisienpeptiede bevat, is dalk meer stabiel en minder geneig om uit die sirkulasie geneem te word. Hierdie glisienryke peptiede is egter nie in die serebrospinale vloeistofmonsters opgespoor nie, wat daarop dui dat die gekurateerde biblioteke deur twee verskillende seleksiestappe gegaan het: een in die bloed en 'n ander wat toegelaat is om in die serebrospinale vloeistof op te hoop. CSF-verrykte klone wat voortspruit uit die vierde rondte seleksie is breedvoerig getoets. Byna al die individueel getoetste klone is bevestig as verryk in CSF in vergelyking met die blanko kontrolefage. Een peptiedtreffer (#2077) is in meer besonderhede ondersoek. Dit het 'n langer plasma-halfleeftyd getoon in vergelyking met ander treffers (Figuur 3d en Aanvullende Fig. 7), en interessant genoeg het hierdie peptied 'n sisteïenresidu by die C-terminus bevat. Daar is onlangs getoon dat die byvoeging van sisteïen tot peptiede hul farmakokinetiese eienskappe kan verbeter deur aan albumien 29 te bind. Dit is tans onbekend vir peptied #2077 en vereis verdere studie. Sommige peptiede het 'n valensie-afhanklikheid in CSF-verryking getoon (data nie getoon nie), wat moontlik verband hou met die vertoonde oppervlakgeometrie van die T7-kapsied. Die T7-stelsel wat ons gebruik het, het 5-15 kopieë van elke peptied per faagdeeltjie getoon. IHC is uitgevoer op kandidaat-hooffaagklone wat intraveneus in die serebrale korteks van rotte ingespuit is (Aanvullende Fig. 8). Die data het getoon dat ten minste drie klone (Nr. 2002, Nr. 2009 en Nr. 2077) met die BBB interaksie gehad het. Dit moet nog bepaal word of hierdie BBB-interaksie lei tot die ophoping van CSF of die beweging van hierdie klone direk na die BCSFB. Belangrik is dat ons toon dat die geselekteerde peptiede hul CSF-vervoerkapasiteit behou wanneer hulle gesintetiseer en aan die proteïenlading gebind word. Binding van N-terminale gebiotinileerde peptiede aan SA herhaal in wese die resultate wat verkry is met hul onderskeie faagklone in bloed en serebrospinale vloeistof (Fig. 3e). Laastens toon ons dat hoofpeptied #2077 die breinwerking van 'n gebiotinileerde peptied-inhibeerder van BACE1 gekonjugeer aan SA kan bevorder, wat uitgesproke farmakodinamiese effekte in die SSS veroorsaak deur Abeta40-vlakke in CSF aansienlik te verminder (Fig. 4). Ons kon geen homoloë in die databasis identifiseer deur 'n peptiedvolgorde-homologiesoektog van alle treffers uit te voer nie. Dit is belangrik om daarop te let dat die grootte van die T7-biblioteek ongeveer 109 is, terwyl die teoretiese biblioteekgrootte vir 12-mere 4 x 1015 is. Daarom het ons slegs 'n klein fraksie van die diversiteitsruimte van die 12-mer peptiedbiblioteek gekies, wat kan beteken dat meer geoptimaliseerde peptiede geïdentifiseer kan word deur die aangrensende volgorderuimte van hierdie geïdentifiseerde treffers te evalueer. Hipoteties kan een van die redes waarom ons geen natuurlike homoloë van hierdie peptiede gevind het nie, deseleksie tydens evolusie wees om die onbeheerde toetrede van sekere peptiedmotiewe in die brein te voorkom.
Saamgevat bied ons resultate 'n basis vir toekomstige werk om die vervoerstelsels van die serebrovaskulêre versperring in vivo in meer besonderhede te identifiseer en te karakteriseer. Die basiese opstelling van hierdie metode is gebaseer op 'n funksionele seleksiestrategie wat nie net klone met serebrale vaskulêre bindingseienskappe identifiseer nie, maar ook 'n kritieke stap insluit waarin suksesvolle klone intrinsieke aktiwiteit het om biologiese versperrings in vivo in die SSS-kompartement oor te steek. Die doel is om die meganisme van vervoer van hierdie peptiede en hul voorkeur vir binding aan die mikrovaskulatuur spesifiek vir die breinstreek te verduidelik. Dit kan lei tot die ontdekking van nuwe weë vir die vervoer van die BBB en reseptore. Ons verwag dat die geïdentifiseerde peptiede direk kan bind aan serebrovaskulêre reseptore of aan sirkulerende ligande wat deur die BBB of BCSFB vervoer word. Die peptiedvektore met CSF-transportaktiwiteit wat in hierdie werk ontdek is, sal verder ondersoek word. Ons ondersoek tans die breinspesifisiteit van hierdie peptiede vir hul vermoë om die BBB en/of BCSFB oor te steek. Hierdie nuwe peptiede sal uiters waardevolle gereedskap wees vir die potensiële ontdekking van nuwe reseptore of bane en vir die ontwikkeling van nuwe hoogs doeltreffende platforms vir die aflewering van makromolekules, soos biologiese middels, aan die brein.
Kanuleer die groot sisterna (KM) met behulp van 'n wysiging van die voorheen beskryfde metode. Verdoofde Wistar-rotte (200-350 g) is op 'n stereotaksiese apparaat gemonteer en 'n mediane insnyding is oor die geskeerde en asepties voorbereide kopvel gemaak om die skedel bloot te lê. Boor twee gate in die area van die boonste raam en maak die bevestigingsskroewe in die gate vas. 'n Bykomende gat is in die laterale oksipitale kuif geboor vir stereotaktiese leiding van 'n vlekvrye staalkanule in die KM. Wend tandheelkundige sement om die kanule aan en maak dit vas met skroewe. Na foto-uitharding en sementverharding is die velwond gesluit met 4/0 supramied-hegting. Behoorlike plasing van die kanule word bevestig deur spontane lekkasie van serebrospinale vloeistof (CSF). Verwyder die rot uit die stereotaksiese apparaat, ontvang toepaslike postoperatiewe sorg en pynbestuur, en laat dit vir ten minste een week herstel totdat tekens van bloed in die serebrospinale vloeistof waargeneem word. Wistar-rotte (Crl:WI/Han) is verkry van Charles River (Frankryk). Alle rotte is onder spesifieke patogeenvrye toestande aangehou. Alle diere-eksperimente is goedgekeur deur die Veeartsenykundige Kantoor van die Stad Basel, Switserland, en is uitgevoer in ooreenstemming met Dierelisensie Nr. 2474 (Assessering van Aktiewe Breintransport deur die Meting van Vlakke van Terapeutiese Kandidate in die Serebrospinale Vloeistof en Brein van Rotte).
Hou die rot versigtig by sy bewussyn met die CM-kanule in die hand. Verwyder Datura uit die kanule en versamel 10 µl spontaan vloeiende serebrospinale vloeistof. Aangesien die deurganklikheid van die kanule uiteindelik gekompromitteer is, is slegs helder serebrospinale vloeistofmonsters sonder bewyse van bloedkontaminasie of verkleuring in hierdie studie ingesluit. Parallel is ongeveer 10–20 μl bloed geneem vanaf 'n klein insnyding aan die punt van die stert in buise met heparien (Sigma-Aldrich). Serebrospinale vloeistof (CSF) en bloed is op verskeie tydspunte versamel na intraveneuse inspuiting van T7-faag. Ongeveer 5–10 μl vloeistof is weggegooi voordat elke CSF-monster versamel is, wat ooreenstem met die dooie volume van die kateter.
Biblioteke is gegenereer met behulp van die T7Select 10-3b-vektor soos beskryf in die T7Select-stelselhandleiding (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Kortliks, 'n ewekansige 12-mer DNA-insetsel is in die volgende formaat gesintetiseer:
Die NNK-kodon is gebruik om dubbelstopkodons en aminosuur-ooruitdrukking in die invoegsel te vermy. N is 'n handmatig gemengde ekwimolêre verhouding van elke nukleotied, en K is 'n handmatig gemengde ekwimolêre verhouding van adenien- en sitosiennukleotiede. Enkelstrengige streke is omgeskakel na dubbelstrengige DNS deur verdere inkubasie met dNTP (Novagen) en Klenow-ensiem (New England Biolabs) in Klenow-buffer (New England Biolabs) vir 3 uur by 37°C. Na die reaksie is dubbelstrengige DNS herwin deur EtOH-presipitasie. Die gevolglike DNS is verteer met restriksie-ensieme EcoRI en HindIII (beide van Roche). Die gesplete en gesuiwerde (QIAquick, Qiagen) invoegsel (T4-ligase, New England Biolabs) is toe in-raam geligeer in 'n voorafgesplete T7-vektor na aminosuur 348 van die 10B-kapsiedgeen. Ligasiereaksies is vir 18 uur by 16°C geïnkubeer voor in vitro-verpakking. Faagverpakking in vitro is uitgevoer volgens die instruksies wat saam met die T7Select 10-3b kloningstel (Novagen) verskaf is en die verpakkingsoplossing is een keer geamplifiseer vir lise met behulp van Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Die lisate is gesentrifugeer, getitreer en gevries by -80°C as 'n voorraadoplossing van gliserol.
Direkte PCR-amplifikasie van faagveranderlike streke wat in sous of plaat geamplifiseer is met behulp van gepatenteerde 454/Roche-amplikon-fusieprimers. Die voorwaartse fusieprimer bevat rye wat die veranderlike streek (NNK) 12 (template-spesifiek), GS FLX Titanium Adapter A, en 'n vierbasis-biblioteeksleutelreeks (TCAG) flankeer (Aanvullende Figuur 1a):
Die omgekeerde fusie-primer bevat ook biotien wat aan vangkrale en die GS FLX Titanium Adapter B geheg is, wat benodig word vir klonale amplifikasie tydens emulsie-PCR:
Die amplikons is toe onderwerp aan 454/Roche-pirosekwensiebepaling volgens die 454 GS-FLX Titanium-protokol. Vir manuele Sanger-sekwensiebepaling (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), is T7-faag-DNS deur PCR versterk en met die volgende primerpare gesekwensieer:
Invoegsels van individuele plate is onderwerp aan PCR-amplifikasie met behulp van die Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (volgens die vervaardiger se instruksies). Voer 'n warm begin (10 min by 95 °C) en 35 hupstootsiklusse (50 s by 95 °C, 1 min by 50 °C en 1 min by 72 °C) uit.
Fage uit biblioteke, wildetipe-fage, fage wat uit serebrospinale vloeistof (CSF) en bloed gered is, of individuele klone is vir 4 uur by 37°C in Escherichia coli BL5615 in TB-bouillon (Sigma Aldrich) of in 500 cm2-bakkies (Thermo Scientific) geamplifiseer. Fage is uit die plate onttrek deur die plate met Tris-EDTA-buffer (Fluka Analytical) af te spoel of deur die plate met steriele pipetpunte te versamel. Fage is uit kultuursupernatant of ekstraksiebuffer met een rondte poliëtileenglikol (PEG 8000) presipitasie (Promega) geïsoleer en in Tris-EDTA-buffer hersuspendeer.
Die geamplifiseerde faag is onderwerp aan 2-3 rondes endotoksienverwydering met behulp van endotoksienverwyderingskrale (Miltenyi Biotec) voor intraveneuse (IV) inspuiting (500 μl/dier). In die eerste ronde is 2×1012 fage ingebring; in die tweede, 2×1010 fage; in die derde en vierde seleksierondes, 2×109 fage per dier. Faaginhoud in serebrospinale vloeistof (CSF) en bloedmonsters wat op die aangeduide tydspunte versamel is, is bepaal deur plaaktelling volgens die vervaardiger se instruksies (T7Select-stelselhandleiding). Faaggeseleksie is uitgevoer deur intraveneuse inspuiting van gesuiwerde biblioteke in die stertaar of deur herinspuiting van fage wat uit CSF van die vorige seleksieronde onttrek is, en daaropvolgende oeste is uitgevoer na onderskeidelik 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min en 240 min CSF en bloedmonsters. 'n Totaal van vier rondes in vivo panning is uitgevoer waarin die twee geselekteerde takke afsonderlik gestoor en geanaliseer is gedurende die eerste drie rondes seleksie. Alle faaginvoegsels wat uit serebrospinale vloeistof (CSF) uit die eerste twee rondes seleksie onttrek is, is onderwerp aan 454/Roche-pirosekwensiebepaling, terwyl alle klone wat uit CSF uit die laaste twee rondes seleksie onttrek is, handmatig gesekwensieer is. Alle bloedfage van die eerste ronde seleksie is ook onderwerp aan 454/Roche-pirosekwensiebepaling. Vir die inspuiting van faagklone is geselekteerde fage in E. coli (BL5615) op 500 cm2-plate by 37°C vir 4 uur geamplifiseer. Individueel geselekteerde en handmatig gesekwensieerde klone is in TB-medium gekweek. Na faagrekstraksie, suiwering en verwydering van endotoksien (soos hierbo beskryf), is 2×1010 fage/dier in 300 μl intraveneus in een stertaar ingespuit.
Voorverwerking en kwalitatiewe filtrering van volgordedata. Rou 454/Roche-data is omgeskakel van 'n binêre standaardstroomkaartformaat (sff) na 'n Pearson-mensleesbare formaat (fasta) met behulp van verskaffersagteware. Verdere verwerking van die nukleotiedvolgorde is uitgevoer met behulp van eie C-programme en skrifte (onuitgereikte sagtewarepakket) soos hieronder beskryf. Die analise van primêre data sluit streng meerstadium-filterprosedures in. Om lesings wat nie 'n geldige 12mer-insetsel-DNS-volgorde bevat het nie, uit te filter, is die lesings opeenvolgend in lyn gebring met die beginetiket (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stopetiket (TAAGCTTGGGCCGCACTCGAGTA) en agtergrondinsetsel (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) met behulp van die globale Needleman-Wunsch-toets. Belyning wat tot 2 teenstrydighede per belyning toelaat31. Daarom is lesings sonder begin- en stopetikette en lesings wat agtergrondinsetsels bevat, d.w.s. belynings wat die toegelate aantal wanpassings oorskry, uit die biblioteek verwyder. Wat die oorblywende lesings betref, is die N-mer DNS-volgorde wat strek vanaf die beginmerk en eindig voor die stopmerk, uit die oorspronklike leesvolgorde uitgesny en verder verwerk (hierna verwys as "insetsel"). Na translasie van die insetsel word die gedeelte na die eerste stopkodon aan die 5'-punt van die primer uit die insetsel verwyder. Daarbenewens is nukleotiede wat lei tot onvolledige kodons aan die 3'-punt van die primer ook verwyder. Om insetsels wat slegs agtergrondsekwensies bevat, uit te sluit, is vertaalde insetsels wat begin met die aminosuurpatroon "PAG" ook verwyder. Peptiede met 'n post-translasionele lengte van minder as 3 aminosure is uit die biblioteek verwyder. Laastens, verwyder oortolligheid in die insetpoel en bepaal die frekwensie van elke unieke insetsel. Die resultate van hierdie analise het 'n lys van nukleotiedsekwensies (insetsels) en hul (lees)frekwensies ingesluit (Aanvullende Figure 1c en 2).
Groepeer N-mer DNS-invoegings volgens volgorde-ooreenkoms: Om 454/Roche-spesifieke volgordebepalingsfoute (soos probleme met volgordebepaling van homopolimeer-uitbreidings) uit te skakel en minder belangrike oortollighede te verwyder, word voorheen gefiltreerde N-mer DNS-volgorde-invoegings (invoegings) volgens ooreenkoms gesorteer. Invoegings (tot 2 nie-ooreenstemmende basisse toegelaat) met behulp van 'n iteratiewe algoritme wat soos volg gedefinieer is: invoegings word eers gesorteer volgens hul frekwensie (hoogste na laagste), en indien hulle dieselfde is, volgens hul sekondêre sortering volgens lengte (langste na kortste). Dus definieer die mees gereelde en langste invoegings die eerste "groep". Die groepfrekwensie word ingestel op die sleutelfrekwensie. Daarna is probeer om elke invoeging wat in die gesorteerde lys oorbly, by die groep te voeg deur paarsgewyse Needleman-Wunsch-belyning. As die aantal wanpassings, invoegings of skrappings in 'n belyning nie 'n drempel van 2 oorskry nie, word 'n invoeging by die groep gevoeg, en die algehele groepfrekwensie word verhoog met hoe gereeld die invoeging bygevoeg is. Invoegings wat by 'n groep gevoeg word, word as gebruik gemerk en van verdere verwerking uitgesluit. Indien die invoegvolgorde nie by 'n reeds bestaande groep gevoeg kan word nie, word die invoegvolgorde gebruik om 'n nuwe groep met die toepaslike invoegfrekwensie te skep en as gebruik gemerk. Die iterasie eindig wanneer elke invoegvolgorde óf gebruik is om 'n nuwe groep te vorm óf in 'n reeds bestaande groep ingesluit kan word. Gegroepeerde invoegings wat uit nukleotiede bestaan, word immers uiteindelik in peptiedvolgordes (peptiedbiblioteke) vertaal. Die resultaat van hierdie analise is 'n stel invoegings en hul ooreenstemmende frekwensies wat die aantal opeenvolgende lesings uitmaak (Aanvullende Fig. 2).
Motiefgenerering: Gebaseer op 'n lys van unieke peptiede, is 'n biblioteek geskep wat alle moontlike aminosuurpatrone (aa) bevat soos hieronder getoon. Elke moontlike patroon van lengte 3 is uit die peptied onttrek en die omgekeerde patroon daarvan is bygevoeg saam met 'n gemeenskaplike motiefbiblioteek wat alle patrone (tripeptiede) bevat. Biblioteke van hoogs herhalende motiewe is georden en oortolligheid verwyder. Daarna, vir elke tripeptied in die motiefbiblioteek, het ons die teenwoordigheid daarvan in die biblioteek nagegaan met behulp van berekeningsinstrumente. In hierdie geval word die frekwensie van die peptied wat die gevonde motieftripeptied bevat, bygevoeg en aan die motief in die motiefbiblioteek toegeken ("aantal motiewe"). Die resultaat van motiefgenerering is 'n tweedimensionele skikking wat alle voorkomste van tripeptiede (motiewe) en hul onderskeie waardes bevat, wat die aantal volgordebepalinglesings is wat tot die ooreenstemmende motief lei wanneer die lesings gefiltreer, gegroepeer en vertaal word. Metrieke soos hierbo in detail beskryf.
Normalisering van die aantal motiewe en ooreenstemmende spreidingsdiagramme: Die aantal motiewe vir elke steekproef is genormaliseer met behulp van
waar ni die aantal lesings is wat onderwerp i bevat. Dus verteenwoordig vi die persentasie frekwensie van lesings (of peptiede) wat motief i in die steekproef bevat. P-waardes vir die nie-normaliseerde aantal motiewe is bereken met behulp van Fisher se eksakte toets. Wat korrelogramme van die aantal motiewe betref, is Spearman se korrelasies bereken met behulp van die genormaliseerde aantal motiewe met R.
Om die inhoud van aminosure by elke posisie in die peptiedbiblioteek te visualiseer, is weblogogramme 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) geskep. Eers word die inhoud van aminosure by elke posisie van die 12-mer peptied in 'n 20×12 matriks gestoor. Dan word 'n stel van 1000 peptiede wat dieselfde relatiewe aminosuurinhoud by elke posisie bevat, in fasta-volgordeformaat gegenereer en as invoer aan weblogo 3 verskaf, wat 'n grafiese voorstelling van die relatiewe aminosuurinhoud by elke posisie vir 'n gegewe peptiedbiblioteek genereer. Om multidimensionele datastelle te visualiseer, is hittekaarte geskep met behulp van 'n intern ontwikkelde instrument in R (biosHeatmap, 'n nog-te-vrygestelde R-pakket). Die dendrogramme wat in die hittekaarte aangebied word, is bereken met behulp van Ward se hiërargiese groeperingsmetode met die Euklidiese afstandsmetriek. Vir statistiese analise van motieftellingdata is P-waardes vir ongenormaliseerde telling bereken met behulp van Fisher se eksakte toets. P-waardes vir ander datastelle is in R bereken met behulp van Student se t-toets of ANOVA.
Geselekteerde faagklone en fage sonder inserts is intraveneus via die stertaar ingespuit (2×1010 fage/dier in 300 μl PBS). Tien minute voor perfusie en daaropvolgende fiksasie is dieselfde diere intraveneus ingespuit met 100 μl DyLight594-gemerkte lektien (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minute na faaginspuiting is rotte deur die hart geperfuseer met 50 ml PBS, gevolg deur 50 ml 4% PFA/PBS. Breinmonsters is addisioneel oornag in 4% PFA/PBS gefikseer en oornag in 30% sukrose by 4°C geweek. Monsters word blitsgevries in die OCT-mengsel. Immunohistochemiese analise van bevrore monsters is by kamertemperatuur uitgevoer op 30 µm krioseksies geblokkeer met 1% BSA en geïnkubeer met poliklonale FITC-gemerkte teenliggaampies teen T7-faag (Novus NB 600-376A) by 4°C. Inkubeer oornag. Laastens is die snitte 3 keer met PBS gewas en met 'n konfokale lasermikroskoop (Leica TCS SP5) ondersoek.
Alle peptiede met 'n minimum suiwerheid van 98% is deur GenScript VSA gesintetiseer, gebiotinileer en gevriesdroog. Biotien word gebind via 'n addisionele drievoudige glisien-spasiëerder by die N-terminus. Kontroleer alle peptiede met behulp van massaspektrometrie.
Streptavidien (Sigma S0677) is gemeng met 'n 5-voudige ekwimolêre oormaat gebiotinileerde peptied, gebiotinileerde BACE1-inhiberende peptied, of 'n kombinasie (3:1-verhouding) van gebiotinileerde BACE1-inhiberende peptied en BACE1-inhiberende peptied in 5–10% DMSO/geïnkubeer in PBS. 1 uur by kamertemperatuur voor inspuiting. Streptavidien-gekonjugeerde peptiede is intraveneus ingespuit teen 'n dosis van 10 mg/kg in een van die stertare van rotte met 'n serebrale holte.
Die konsentrasie van streptavidien-peptiedkomplekse is deur ELISA bepaal. Nunc Maxisorp mikrotiterplate (Sigma) is oornag by 4°C bedek met 1.5 μg/ml muis anti-streptavidien teenliggaam (Thermo, MA1-20011). Na blokkering (blokkeringsbuffer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatien, 1% BSA) by kamertemperatuur vir 2 uur, was die plaat met 0.05% Tween-20/PBS (wasbuffer) vir 3 sekondes, en CSF en plasmamonsters is bygevoeg by putjies verdun met blokkeringsbuffer (plasma 1:10,000, CSF 1:115). Die plaat is toe oornag by 4°C geïnkubeer met deteksie-teenliggaam (1 μg/ml, anti-streptavidien-HRP, Novus NB120-7239). Na drie wasstappe is streptavidien opgespoor deur inkubasie in TMB-substraatoplossing (Roche) vir tot 20 min. Nadat kleurontwikkeling met 1M H2SO4 gestaak is, meet die absorbansie by 450 nm.
Die funksie van die streptavidien-peptied-BACE1-inhibeerderkompleks is deur Aβ(1-40) ELISA volgens die vervaardiger se protokol (Wako, 294-64701) geassesseer. Kortliks, CSF-monsters is verdun in standaardverdunningsmiddel (1:23) en oornag by 4°C in 96-putplate bedek met BNT77-vangsteenliggaam geïnkubeer. Na vyf wasstappe is HRP-gekonjugeerde BA27-teenliggaam bygevoeg en vir 2 uur by 4°C geïnkubeer, gevolg deur vyf wasstappe. Aβ(1–40) is opgespoor deur inkubasie in TMB-oplossing vir 30 minute by kamertemperatuur. Nadat kleurontwikkeling met stopoplossing gestaak is, meet die absorbansie by 450 nm. Plasmamonsters is onderwerp aan vastefase-ekstraksie voor Aβ(1–40) ELISA. Plasma is by 0.2% DEA (Sigma) in 96-putplate gevoeg en vir 30 minute by kamertemperatuur geïnkubeer. Nadat die SPE-plate (Oasis, 186000679) opeenvolgend met water en 100% metanol gewas is, is plasmamonsters by die SPE-plate gevoeg en alle vloeistof is verwyder. Monsters is gewas (eers met 5% metanol en dan 30% metanol) en met 2% NH4OH/90% metanol geëlueer. Nadat die eluaat vir 99 minute by 55°C teen konstante N2-stroom gedroog is, is die monsters in standaardverdunningsmiddels gereduseer en Aβ(1–40) is soos hierbo beskryf gemeet.
Hoe om hierdie artikel aan te haal: Urich, E. et al. Vraglewering na die brein met behulp van transitopeptiede wat in vivo geïdentifiseer is. die wetenskap. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB en Moos T. Aflewering van makromolekulêre middels aan die brein met behulp van geteikende terapie. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., en Martinez-Martinez, P. Aflewering van peptied- en proteïenmiddels oor die bloedbreinversperring. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Die bloed-breinversperring: 'n knelpunt in die ontwikkeling van breinmiddels. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, en Byrd, A. Vooruitsigte vir verbeterde geneesmiddelaflewering en teikenstelling na die brein via die choroïedpleksus-CSF-roete. Farmaseutiese Navorsing 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernisering van biofarmaseutika met molekulêre Trojaanse perde vir breinaflewering. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM-reseptor-gemedieerde peptiedtransport oor die bloedbreinversperring. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Verhoog breinpenetrasie en doeltreffendheid van terapeutiese teenliggaampies deur gebruik te maak van monovalente molekulêre pendeltuie. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Transferrienreseptor (TfR) vervoer bepaal breinopname van affiniteitsvariante van TfR-teenliggaampies. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).