Dankie dat jy Nature.com besoek het.Jy gebruik 'n blaaierweergawe met beperkte CSS-ondersteuning.Vir die beste ervaring, beveel ons aan dat jy 'n opgedateerde blaaier gebruik (of versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer).Daarbenewens, om deurlopende ondersteuning te verseker, wys ons die webwerf sonder style en JavaScript.
Vertoon 'n karrousel van drie skyfies gelyktydig.Gebruik die Vorige en Volgende-knoppies om deur drie skyfies op 'n slag te beweeg, of gebruik die skuifknoppies aan die einde om deur drie skyfies op 'n slag te beweeg.
Die bloed-brein versperring en die bloed-brein versperring verhoed dat bioterapeutiese middels hul teikens in die sentrale senuweestelsel bereik, en sodoende doeltreffende behandeling van neurologiese siektes belemmer.Om nuwe breinvervoerders in vivo te ontdek, het ons 'n T7-faagpeptiedbiblioteek bekendgestel en bloed en serebrospinale vloeistof (CSF) in serie versamel deur gebruik te maak van 'n gekanuleerde bewuste groot poel-model van rotte.Spesifieke faagklone was hoogs verryk in CSF na vier rondtes van seleksie.Toetsing van individuele kandidaat-peptiede het meer as 1000-voudige verryking in CSF aan die lig gebring.Die bioaktiwiteit van die peptied-gemedieerde aflewering na die brein is bevestig deur 'n 40% verlaging in die vlak van amyloïed-β in die serebrospinale vloeistof met behulp van 'n BACE1 peptied inhibeerder gekoppel aan die geïdentifiseerde nuwe transito peptied.Hierdie resultate dui daarop dat die peptiede geïdentifiseer deur in vivo faag seleksie metodes bruikbare voertuie kan wees vir sistemiese aflewering van makromolekules na die brein met 'n terapeutiese effek.
Sentrale senuweestelsel (SNS)-geteikende terapie-navorsing het grootliks gefokus op die identifisering van geoptimaliseerde middels en middels wat SSS-gerigte eienskappe vertoon, met minder moeite om die meganismes te ontdek wat aktiewe geneesmiddellewering na die brein aandryf.Dit begin nou verander, aangesien geneesmiddelaflewering, veral groot molekules, 'n integrale deel van moderne neurowetenskaplike geneesmiddelontwikkeling is.Die omgewing van die sentrale senuweestelsel word goed beskerm deur die serebrovaskulêre versperringstelsel, bestaande uit die bloedbreinversperring (BBB) ​​en die bloedbreinversperring (BCBB)1, wat dit uitdagend maak om dwelms aan die brein af te lewer1,2.Daar word beraam dat byna alle middels met groot molekule en meer as 98% van klein molekule middels uit die brein uitgeskakel word3.Daarom is dit baie belangrik om nuwe breinvervoerstelsels te identifiseer wat doeltreffende en spesifieke aflewering van terapeutiese middels aan die SSS 4,5 verskaf.Die BBB en BCSFB bied egter ook 'n uitstekende geleentheid vir geneesmiddelaflewering aangesien hulle alle strukture van die brein deur sy uitgebreide vaskulatuur binnedring en binnedring.Dus, die huidige pogings om nie-indringende metodes van aflewering na die brein te gebruik is grootliks gebaseer op die meganisme van reseptor-gemedieerde vervoer (PMT) deur die endogene BBB6-reseptor te gebruik.Ten spyte van onlangse sleutelvooruitgang met die gebruik van die transferrienreseptorweg7,8, word verdere ontwikkeling van nuwe afleweringstelsels met verbeterde eienskappe vereis.Vir hierdie doel was ons doelwit om peptiede te identifiseer wat in staat is om CSF-vervoer te bemiddel, aangesien hulle in beginsel gebruik kan word om makromolekules na die SSS af te lewer of om nuwe reseptorweë oop te maak.Spesifieke reseptore en vervoerders van die serebrovaskulêre stelsel (BBB en BSCFB) kan veral dien as potensiële teikens vir die aktiewe en spesifieke aflewering van bioterapeutiese middels.Serebrospinale vloeistof (CSF) is 'n sekretoriese produk van die choroid plexus (CS) en is in direkte kontak met die interstisiële vloeistof van die brein deur die subarachnoïdale ruimte en ventrikulêre ruimte4.Onlangs is getoon dat subarachnoïdale serebrospinale vloeistof oormatig in die interstitium van die brein diffundeer9.Ons hoop om toegang tot die parenchimale spasie te kry deur hierdie subarachnoïdale invloeikanaal of direk deur die BBB te gebruik.Om dit te bereik, het ons 'n robuuste in vivo-faagseleksiestrategie geïmplementeer wat ideaal peptiede identifiseer wat deur enige van hierdie twee verskillende weë vervoer word.
Ons beskryf nou 'n opeenvolgende in vivo faag vertoon siftingsmetode met CSF monsterneming tesame met hoë deurset volgordebepaling (HTS) om aanvanklike seleksie rondtes met die hoogste biblioteek diversiteit te monitor.Sifting is uitgevoer op bewuste rotte met 'n permanent ingeplante groot sisterna (CM) kanule om bloedkontaminasie te vermy.Dit is belangrik dat hierdie benadering beide breingerigtheid en peptiede selekteer met vervoeraktiwiteit oor die serebrovaskulêre versperring.Ons het T7 fage gebruik as gevolg van hul klein grootte (~60 nm)10 en het voorgestel dat hulle geskik is vir die vervoer van vesikels wat transsellulêre kruising van die endoteel en/of epiteel-medulla versperring moontlik maak.Na vier rondtes van panning is faagpopulasies geïsoleer wat sterk in vivo CSF-verryking en serebrale mikrovatassosiasie toon.Wat belangrik is, was dat ons ons bevindinge kon bevestig deur te demonstreer dat die voorkeur en chemies gesintetiseerde beste kandidaat-peptiede in staat is om proteïenvrag in die serebrospinale vloeistof te vervoer.Eerstens is die farmakodinamiese effekte van die SSS vasgestel deur 'n toonaangewende transitpeptied met 'n inhibeerder van die BACE1-peptied te kombineer.Benewens om te demonstreer dat in vivo funksionele siftingstrategieë nuwe breinvervoerpeptiede as effektiewe proteïenvragdraers kan identifiseer, verwag ons dat soortgelyke funksionele seleksiebenaderings ook belangrik sal word in die identifisering van nuwe breinvervoerpaaie.
Gebaseer op plaakvormende eenhede (PFU), na die faagverpakkingstap, is 'n biblioteek van ewekansige 12-meer lineêre T7-faagpeptiede met 'n diversiteit van ongeveer 109 ontwerp en geskep (sien Materiale en Metodes).Dit is belangrik om daarop te let dat ons hierdie biblioteek noukeurig ontleed het voor in vivo panning.PCR amplifikasie van fage biblioteek monsters met behulp van gemodifiseerde primers gegenereer amplicons wat direk van toepassing was op HTS (Aanvullende Fig. 1a).As gevolg van a) HTS11-volgordebepalingsfoute, b) impak op die kwaliteit van primers (NNK)1-12, en c) die teenwoordigheid van wildtipe (wt)-faag (skeletinsetsels) in die bystand-biblioteek, is 'n volgordefiltreringsprosedure geïmplementeer om slegs geverifieerde volgorde-inligting te onttrek (Aanvullende Fig. 1b).Hierdie filterstappe is van toepassing op alle HTS-volgorde-biblioteke.Vir die standaardbiblioteek is 'n totaal van 233 868 lesings verkry, waarvan 39% die filterkriteria geslaag het en gebruik is vir biblioteekanalise en seleksie vir daaropvolgende rondtes (Aanvullende Figuur 1c–e).Die lesings was oorwegend veelvoude van 3 basispare in lengte met 'n piek by 36 nukleotiede (Aanvullende Fig. 1c), wat die biblioteekontwerp (NNK) 1-12 bevestig.Opmerklik, ongeveer 11% van die biblioteeklede het 'n 12-dimensionele wildtipe (wt) ruggraat PAGISRELVDKL insetsel bevat, en byna die helfte van die rye (49%) het invoegings of delesies bevat.Die HTS van die biblioteekbiblioteek het die hoë diversiteit van peptiede in die biblioteek bevestig: meer as 81% van peptiedvolgordes is slegs een keer gevind en slegs 1.5% het in ≥4 kopieë voorgekom (Aanvullende Fig. 2a).Die frekwensies van aminosure (aa) by al 12 posisies in die repertorium het goed gekorreleer met die frekwensies wat verwag word vir die aantal kodons wat deur die gedegenereerde NKK-repertorium gegenereer word (Aanvullende Fig. 2b).Die waargenome frekwensie van aa-residue wat deur hierdie insetsels gekodeer is, het goed gekorreleer met die berekende frekwensie (r = 0.893) (Aanvullende Fig. 2c).Die voorbereiding van faagbiblioteke vir inspuiting sluit die stappe van amplifikasie en verwydering van endotoksien in.Dit is voorheen bewys dat dit moontlik die diversiteit van faagbiblioteke verminder12,13.Daarom het ons 'n plaat-geamplifiseerde faagbiblioteek wat endotoksienverwydering ondergaan het, in volgorde bepaal en dit vergelyk met die oorspronklike biblioteek om die frekwensie van AA te skat.'n Sterk korrelasie (r = 0.995) is waargeneem tussen die oorspronklike poel en die geamplifiseerde en gesuiwerde poel (Aanvullende Fig. 2d), wat aandui dat mededinging tussen klone wat op plate geamplifiseer is met behulp van T7-faag nie groot vooroordeel veroorsaak het nie.Hierdie vergelyking is gebaseer op die frekwensie van tripeptiedmotiewe in elke biblioteek, aangesien die diversiteit van biblioteke (~109) nie ten volle vasgelê kan word nie, selfs met HTS.Frekwensie-analise van aa by elke posisie het 'n klein posisie-afhanklike vooroordeel in die laaste drie posisies van die ingevoerde repertorium geopenbaar (Aanvullende Fig. 2e).Ten slotte het ons tot die gevolgtrekking gekom dat die kwaliteit en diversiteit van die biblioteek aanvaarbaar was en slegs geringe veranderinge in diversiteit is waargeneem as gevolg van amplifikasie en voorbereiding van faagbiblioteke tussen verskeie rondtes van seleksie.
Serebrospinale vloeistofmonsterneming kan uitgevoer word deur 'n kanule chirurgies in die CM van bewuste rotte in te plant om identifikasie van T7-faag wat binneaars ingespuit is (iv) via die BBB en/of BCSFB te fasiliteer (Fig. 1a-b).Ons het twee onafhanklike seleksie-arms (arms A en B) in die eerste drie rondtes van in vivo seleksie gebruik (Fig. 1c).Ons het die strengheid van die seleksie geleidelik verhoog deur die totale hoeveelheid fage wat in die eerste drie rondtes van seleksie ingebring is, te verminder.Vir die vierde rondte van panning het ons monsters van takke A en B gekombineer en drie bykomende onafhanklike seleksies uitgevoer.Om die in vivo eienskappe van T7-faagdeeltjies in hierdie model te bestudeer, is wildtipe-faag (PAGISRELVDKL-meesterinsetsel) via die stert-aar in rotte ingespuit.Herwinning van fage uit serebrospinale vloeistof en bloed op verskillende tydpunte het getoon dat relatief klein T7 ikosaëdriese fage 'n vinnige aanvanklike opruimingsfase van die bloedkompartement gehad het (Aanvullende Fig. 3).Gebaseer op die titers wat toegedien is en die bloedvolume van die rotte, het ons bereken dat slegs ongeveer 1% gew.faag van die toegediende dosis is 10 minute na binneaarse inspuiting in die bloed opgespoor.Na hierdie aanvanklike vinnige afname is 'n stadiger primêre opruiming gemeet met 'n halfleeftyd van 27,7 minute.Dit is belangrik dat slegs baie min fage uit die CSF-kompartement gehaal is, wat 'n lae agtergrond vir wilde-tipe fage-migrasie in die CSF-kompartement aandui (Aanvullende Fig. 3).Gemiddeld is slegs sowat 1 x 10-3% titers van T7-faag in die bloed en 4 x 10-8% van aanvanklik geïnfuseerde fage opgespoor in die serebrospinale vloeistof oor die hele monsternemingsperiode (0-250 min).Die halfleeftyd (25.7 min) van wilde-tipe fage in serebrospinale vloeistof was soortgelyk aan dié wat in bloed waargeneem is.Hierdie data demonstreer dat die versperring wat die CSF-kompartement van die bloed skei ongeskonde is in CM-gekanuleerde rotte, wat in vivo seleksie van faagbiblioteke moontlik maak om klone te identifiseer wat geredelik van die bloed na die CSF-kompartement vervoer word.
(a) Opstel van 'n metode vir hermonstering van serebrospinale vloeistof (CSF) uit 'n groot poel.(b) Diagram wat die sellulêre ligging van die sentrale senuweestelsel (SNS) versperring toon en die seleksiestrategie wat gebruik word om peptiede te identifiseer wat die bloedbreinversperring (BBB) ​​en die bloedbreinversperring oorsteek.(c) In vivo faagvertoning siftingsvloeidiagram.In elke rondte van seleksie is fage (diere-identifiseerders binne die pyle) binneaars ingespuit.Twee onafhanklike alternatiewe takke (A, B) word afsonderlik gehou tot die 4de rondte van keuring.Vir seleksie rondtes 3 en 4 is elke faagkloon wat uit CSF onttrek is, met die hand gevolgorde.(d) Kinetika van fage geïsoleer uit bloed (rooi sirkels) en serebrospinale vloeistof (groen driehoeke) tydens die eerste rondte van seleksie in twee gekanuleerde rotte na binneaarse inspuiting van die T7 peptied biblioteek (2 x 1012 fage/dier).Blou blokkies dui die gemiddelde aanvanklike konsentrasie van fage in die bloed aan, bereken uit die hoeveelheid ingespuite faag, met inagneming van die totale bloedvolume.Die swart blokkies dui die snypunt van die y-lyn aan wat uit bloedfaagkonsentrasies geëkstrapoleer is.(e,f) Bied die relatiewe frekwensie en verspreiding aan van alle moontlike oorvleuelende tripeptiedmotiewe wat in die peptied gevind word.Die aantal motiewe wat in 1000 lesings gevind is, word getoon.Beduidende (p < 0,001) verrykte motiewe word met rooi kolletjies gemerk.(e) Korrelasieverspreidingsdiagram wat die relatiewe frekwensie van die tripeptiedmotief van die ingespuite biblioteek vergelyk met bloedafgeleide fage van diere #1.1 en #1.2.(f) Korrelasieverspreidingsdiagram wat die relatiewe frekwensies van dierefaag-tripeptiedmotiewe #1.1 en #1.2 wat in bloed en serebrospinale vloeistof geïsoleer is, vergelyk.(g, h) Volgorde-ID voorstelling van faag verryk in bloed (g) teenoor ingespuite biblioteke en faag verryk in CSF (h) versus bloed na 'n ronde van in vivo seleksie in beide diere.Die grootte van die eenletterkode dui aan hoe gereeld daardie aminosuur op daardie posisie voorkom.Groen = polêr, pers = neutraal, blou = basies, rooi = suur en swart = hidrofobiese aminosure.Figuur 1a, b is ontwerp en vervaardig deur Eduard Urich.
Ons het 'n faag-peptied-biblioteek in twee CM-instrumentrotte (klade A en B) ingespuit en fage uit serebrospinale vloeistof en bloed geïsoleer (Figuur 1d).Die aanvanklike vinnige opruiming van die biblioteek was minder uitgesproke in vergelyking met die wilde-tipe fage.Die gemiddelde halfleeftyd van die ingespuite biblioteek in beide diere was 24.8 minute in bloed, soortgelyk aan wilde-tipe fage, en 38.5 minute in CSF.Bloed- en serebrospinale vloeistof-faagmonsters van elke dier is aan HTS onderwerp en alle geïdentifiseerde peptiede is ontleed vir die teenwoordigheid van 'n kort tripeptiedmotief.Tripeptiedmotiewe is gekies omdat dit 'n minimale basis vir struktuurvorming en peptied-proteïen-interaksies verskaf14,15.Ons het 'n goeie korrelasie gevind in die verspreiding van motiewe tussen die ingespuite faagbiblioteek en klone wat uit die bloed van beide diere onttrek is (Fig. 1e).Die data dui daarop dat die samestelling van die biblioteek slegs marginaal verryk is in die bloedkompartement.Aminosuurfrekwensies en konsensusvolgorde is verder ontleed by elke posisie deur gebruik te maak van 'n aanpassing van die Weblogo16 sagteware.Interessant genoeg het ons 'n sterk verryking in bloedglisienreste gevind (Fig. 1g).Wanneer bloed vergelyk is met klone wat uit CSF gekies is, is sterk seleksie en 'n mate van deseleksie van motiewe waargeneem (Fig. 1f), en sekere aminosure was verkieslik teenwoordig op voorafbepaalde posisies in die 12-lid (Fig. 1h).Opmerklik, individuele diere het aansienlik verskil in serebrospinale vloeistof, terwyl bloedglisienverryking in beide diere waargeneem is (Aanvullende Fig. 4a-j).Na streng filtering van volgordedata in die serebrospinale vloeistof van diere #1.1 en #1.2, is 'n totaal van 964 en 420 unieke 12-meer peptiede verkry (Aanvullende Fig. 1d–e).Die geïsoleerde faagklone is geamplifiseer en aan 'n tweede rondte van in vivo seleksie onderwerp.Faag wat uit die tweede rondte van seleksie onttrek is, is in elke dier aan HTS onderwerp en alle geïdentifiseerde peptiede is gebruik as insette tot 'n motiefherkenningsprogram om die voorkoms van tripeptiedmotiewe te ontleed (Fig. 2a, b, ef).In vergelyking met die eerste siklus van die fage wat van CSF herwin is, het ons verdere seleksie en deseleksie van baie motiewe in CSF in takke A en B waargeneem (Fig. 2).'n Netwerk-identifikasie-algoritme is toegepas om te bepaal of hulle verskillende patrone van konsekwente volgorde verteenwoordig.'n Duidelike ooreenkoms is waargeneem tussen die 12-dimensionele volgordes wat deur CSF in alternatiewe klade A (Fig. 2c, d) en klade B (Fig. 2g, h) herwin is.Die saamgevoegde analise in elke tak het verskillende seleksieprofiele vir 12-meer peptiede (Aanvullende Fig. 5c,d) en 'n toename in die CSF/bloedtiterverhouding oor tyd vir saamgevoegde klone na die tweede rondte van seleksie in vergelyking met die eerste rondte van seleksie (Aanvullende Fig. 5e) geopenbaar.).
Verryking van motiewe en peptiede in serebrospinale vloeistof deur twee opeenvolgende rondtes van in vivo funksionele faagvertoonseleksie.
Alle serebrospinale vloeistoffage wat van die eerste rondte van elke dier herwin is (diere #1.1 en #1.2) is saamgevoeg, geamplifiseer, HT-volgorde en weer saam (2 x 1010 fage/dier) 2 SM-gekanuleerde rotte (#1.1 → #) ingespuit.2.1 en 2.2, 1.2 → 2.3 en 2.4).(a,b,e,f) Korrelasieverspreidingsdiagramme wat die relatiewe frekwensie van tripeptiedmotiewe van alle CSF-afgeleide fage in die eerste en tweede seleksie-rondtes vergelyk.Relatiewe frekwensie en verspreiding van motiewe wat alle moontlike oorvleuelende tripeptiede verteenwoordig wat in peptiede in beide oriëntasies voorkom.Die aantal motiewe wat in 1000 lesings gevind is, word getoon.Motiewe wat beduidend (p < 0,001) geselekteer of uitgesluit is in een van die vergelykende biblioteke, word met rooi kolletjies uitgelig.(c, d, g, h) Volgorde-logo-voorstelling van alle CSF-ryke 12 aminosuur lang volgordes gebaseer op rondtes 2 en 1 van in vivo seleksie.Die grootte van die eenletterkode dui aan hoe gereeld daardie aminosuur op daardie posisie voorkom.Om die logo voor te stel, word die frekwensie van CSF-reekse wat uit individuele diere tussen twee seleksie-rondtes onttrek is vergelyk en die verrykte reekse in die tweede rondte word getoon: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 en (h) #1.2–#2.4.Die mees verrykte aminosure op 'n gegewe posisie in (c, d) diere nr.2.1 en nr.2.2 of (g, h) by diere nr.2.3 en nr.2.4 word in kleur getoon.Groen = polêr, pers = neutraal, blou = basies, rooi = suur en swart = hidrofobiese aminosure.
Na die derde rondte van seleksie het ons 124 unieke peptiedvolgordes (#3.1 en #3.2) geïdentifiseer vanaf 332 CSF-hersaamgestelde faagklone wat van twee diere geïsoleer is (Aanvullende Fig. 6a).Die volgorde LGSVS (18.7%) het die hoogste relatiewe proporsie gehad, gevolg deur die wildtipe insetsels PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%) en SARGSWREIVSLS (2.2%).In die laaste vierde rondte het ons twee onafhanklik geselekteerde takke van drie afsonderlike diere saamgevoeg (Fig. 1c).Van die 925-volgorde-faagklone wat van CSF herwin is, het ons in die vierde ronde 64 unieke peptiedvolgordes gevind (Aanvullende Fig. 6b), waaronder die relatiewe proporsie van wilde-tipe fage tot 0,8% gedaal het.Die mees algemene CSF-klone in die vierde ronde was LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) en RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Die lengtereeks van die geselekteerde peptiede is te wyte aan nukleotiedinsersies/delesies of voortydige stopkodons in die biblioteekinleiders wanneer gedegenereerde kodons vir NNK-biblioteekontwerp gebruik word.Voortydige stopkodons genereer korter peptiede en word gekies omdat hulle die gunstige aa-motief bevat.Langer peptiede kan die gevolg wees van invoegings/delesies in die primers van die sintetiese biblioteke.Dit plaas die ontwerpte stopkodon buite die raam en lees dit totdat 'n nuwe stopkodon stroomaf verskyn.Oor die algemeen het ons verrykingsfaktore vir al vier seleksie-rondtes bereken deur die insetdata met die steekproefuitsetdata te vergelyk.Vir die eerste rondte van sifting, het ons wild-tipe faag titers gebruik as 'n nie-spesifieke agtergrond verwysing.Interessant genoeg was negatiewe fage seleksie baie sterk in die eerste CSF-siklus, maar nie in bloed nie (Fig. 3a), wat kan wees as gevolg van die lae waarskynlikheid van passiewe diffusie van die meeste lede van die peptiedbiblioteek in die CSF-kompartement of relatiewe fage is geneig om meer doeltreffend behou of uit die bloedstroom verwyder te word as bakteriofage.In die tweede rondte van panning is egter sterk seleksie van fage in CSF in beide klades waargeneem, wat daarop dui dat die vorige rondte verryk is in fage wat peptiede vertoon wat CSF-opname bevorder (Fig. 3a).Weereens, sonder noemenswaardige bloedverryking.Ook in die derde en vierde rondtes was die faagklone aansienlik verryk in CSF.Deur die relatiewe frekwensie van elke unieke peptiedvolgorde tussen die laaste twee rondtes van seleksie te vergelyk, het ons gevind dat die rye selfs meer verryk is in die vierde rondte van seleksie (Fig. 3b).'n Totaal van 931 tripeptiedmotiewe is uit al 64 unieke peptiedvolgordes onttrek deur beide peptiedoriëntasies te gebruik.Die mees verrykte motiewe in die vierde ronde is van naderby ondersoek vir hul verrykingsprofiele oor alle rondtes in vergelyking met die ingespuite biblioteek (afsnypunt: 10% verryking) (Aanvullende Fig. 6c).Algemene patrone van seleksie het getoon dat die meeste van die bestudeerde motiewe in alle vorige rondtes van beide seleksietakke verryk is.Sommige motiewe (bv. SGL, VSG, LGS GSV) was egter hoofsaaklik van alternatiewe klade A, terwyl ander (bv. FGW, RTN, WGF, NTR) in alternatiewe klade B verryk is.
Validasie van CSF-vervoer van CSF-verrykte faag-vertoon-peptiede en gebiotinileerde leierpeptiede wat aan streptavidien-loonvragte gekonjugeer is.
(a) Verrykingsverhoudings bereken in al vier rondtes (R1-R4) gebaseer op ingespuite (inset = I) fage (PFU) titers en vasgestelde CSF faag titers (uitset = O).Verrykingsfaktore vir die laaste drie rondtes (R2-R4) is bereken deur vergelyking met die vorige rondte en die eerste rondte (R1) met gewigsdata.Oop stawe is serebrospinale vloeistof, gekleurde stawe is plasma.(***p<0,001, gebaseer op Student se t-toets).(b) Lys van die mees volopte fagepeptiede, gerangskik volgens hul relatiewe verhouding tot alle fage wat in CSF versamel is na rondte 4 van seleksie.Die ses mees algemene faagklone word uitgelig in kleur, genommer en hul verrykingsfaktore tussen rondtes 3 en 4 van seleksie (insets).(c,d) Die ses mees verrykte faagklone, leë faag en ouerfaagpeptiedbiblioteke van rondte 4 is individueel in 'n CSF-steekproefmodel ontleed.CSF en bloedmonsters is op die aangeduide tydpunte versamel.(c) Gelyke hoeveelhede van 6 kandidaat-faagklone (2 x 1010 fage/diere), leë fage (#1779) (2 x 1010 fage/diere) en voorraad-faagpeptiedbiblioteke (2 x 1012 fage/diere) Spuit ten minste 3 CM in die blik toegedien in die aar wat afsonderlik toegedien word.Die CSF-farmakokinetika van elke ingespuite faagkloon en faagpeptiedbiblioteek oor tyd word getoon.(d) toon die gemiddelde CSF/bloedverhouding vir alle herwonne fage/ml oor die steekproeftydperk.(e) Vier sintetiese leierpeptiede en een deurmekaar kontrole is gekoppel aan biotien aan streptavidien deur hul N-terminus (tetrameer vertoon) gevolg deur inspuiting (stert aar iv, 10 mg streptavidien/kg).Ten minste drie geïntubeerde rotte (N = 3).).CSF monsters is op die aangeduide tydpunte versamel en streptavidien konsentrasies is gemeet deur CSF anti-streptavidien ELISA (nd = nie opgespoor nie).(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, gebaseer op ANOVA-toets).(f) Vergelyking van die aminosuurvolgorde van die mees verrykte faagpeptiedkloon #2002 (pers) met ander geselekteerde faagpeptiedklone vanaf die 4de rondte van seleksie.Identiese en soortgelyke aminosuurfragmente is kleurgekodeer.
Van alle verrykte fage in die vierde rondte (Fig. 3b), is ses kandidaatklone geselekteer vir verdere individuele analise in die CSF-steekproefmodel.Gelyke hoeveelhede van ses kandidaatfaag-, leë faag- (geen invoeging) en profaagpeptiedbiblioteke is in drie gekanuleerde CM-diere ingespuit, en farmakokinetika is bepaal in CSF (Fig. 3c) en bloed (Aanvullende Fig. 7) toetse.Alle faagklone wat getoets is, het die CSF-kompartement geteiken op 'n vlak 10-1000 keer hoër as dié van die leë kontrolefaag (#1779).Byvoorbeeld, klone #2020 en #2077 het ongeveer 1000 keer hoër CSF-titers as kontrolefaag gehad.Die farmakokinetiese profiel van elke geselekteerde peptied is anders, maar almal van hulle het 'n hoë CSF homing vermoë.Ons het 'n konstante afname met verloop van tyd waargeneem vir klone #1903 en #2011, terwyl vir klone #2077, #2002 en #2009 'n toename gedurende die eerste 10 minute aktiewe vervoer kan aandui, maar geverifieer moet word.Klone #2020, #2002 en #2077 het op hoë vlakke gestabiliseer, terwyl die CSF-konsentrasie van kloon #2009 stadig afgeneem het na die aanvanklike toename.Ons het toe die relatiewe frekwensie van elke CSF-kandidaat met sy bloedkonsentrasie vergelyk (Fig. 3d).Die korrelasie van die gemiddelde titer van elke CSF-kandidaat met sy bloedtiter by alle monsternemingstye het getoon dat drie van die ses kandidate aansienlik verryk was in bloed CSF.Interessant genoeg het kloon #2077 hoër bloedstabiliteit getoon (Aanvullende Figuur 7).Om te bevestig dat die peptiede self in staat is om ander vrag as faagdeeltjies aktief na die CSF-kompartement te vervoer, het ons vier leierpeptiede gesintetiseer wat met biotien gederivatiseer is by die N-terminus waar die peptiede aan die faagdeeltjie heg.Gebiotinileerde peptiede (nrs. 2002, 2009, 2020 en 2077) is gekonjugeer met streptavidien (SA) om multimeriese vorms te verkry wat ietwat faaggeometrie naboots.Hierdie formaat het ons ook in staat gestel om SA blootstelling in bloed en serebrospinale vloeistof as vragvervoerende proteïenpeptiede te meet.Dit is belangrik dat faagdata dikwels gereproduseer kon word wanneer sintetiese peptiede in hierdie SA-gekonjugeerde formaat toegedien is (Fig. 3e).Die deurmekaar peptiede het minder aanvanklike blootstelling en vinniger CSF-opruiming gehad met onopspoorbare vlakke binne 48 uur.Om insig te verkry in die afleweringsweë van hierdie peptiedfaagklone in die CSF-ruimte, het ons die lokalisering van individuele faagpeptiedtreffers ontleed met behulp van immunohistochemie (IHC) om faagdeeltjies direk op te spoor 1 uur na binneaarse inspuiting in vivo.Veral, klone #2002, #2077 en #2009 kon opgespoor word deur sterk kleuring in breinkapillêre, terwyl kontrolefaag (#1779) en kloon #2020 nie opgespoor is nie (Aanvullende Figuur 8).Dit dui daarop dat hierdie peptiede bydra tot die effek op die brein juis deur die BBB te kruis.Verdere gedetailleerde analise is nodig om hierdie hipotese te toets, aangesien die BSCFB-roete ook betrokke kan wees.Wanneer die aminosuurvolgorde van die mees verrykte kloon (#2002) met ander geselekteerde peptiede vergelyk word, is opgemerk dat sommige van hulle soortgelyke aminosuurverlengings het, wat 'n soortgelyke vervoermeganisme kan aandui (Fig. 3f).
As gevolg van sy unieke plasmaprofiel en beduidende toename in CSF met verloop van tyd, is faag vertoon kloon #2077 verder ondersoek oor 'n langer 48-uur periode en was in staat om die vinnige toename in CSF waargeneem in assosiasie met volgehoue ​​SA vlakke te reproduseer (Fig. 4a).Met betrekking tot ander geïdentifiseerde faagklone, #2077 het sterk gekleur vir breinkapillêre en het beduidende kolokalisering met kapillêre merkerlektien getoon wanneer dit teen hoër resolusie en moontlik 'n mate van kleuring in die parenchimale ruimte bekyk word (Figuur 4b).Om te ondersoek of peptied-gemedieerde farmakologiese effekte in die SSS verkry kan word, het ons 'n eksperiment uitgevoer waarin gebiotinileerde weergawes van i) die #2077 transitpeptied en ii) die BACE1 inhibeerder peptied met SA gemeng is teen twee verskillende verhoudings.Vir een kombinasie het ons slegs die BACE1 peptied inhibeerder gebruik en vir die ander het ons 'n 1:3 verhouding van BACE1 peptied inhibeerder tot #2077 peptied gebruik.Beide monsters is binneaars toegedien en bloed- en serebrospinale vloeistofvlakke van beta-amyloïed peptied 40 (Abeta40) is oor tyd gemeet.Abeta40 is in CSF gemeet aangesien dit BACE1-inhibisie in die breinparenchiem weerspieël.Soos verwag, het beide komplekse bloedvlakke van Abeta40 aansienlik verminder (Fig. 4c, d).Slegs monsters wat egter 'n mengsel van peptied nr.2077 en 'n inhibeerder van die BACE1-peptied wat aan SA gekonjugeer is, het 'n beduidende afname in Abeta40 in die serebrospinale vloeistof veroorsaak (Fig. 4c).Die data toon dat peptied nr.2077 is in staat om die 60 kDa SA-proteïen na die SSS te vervoer en veroorsaak ook farmakologiese effekte met SA-gekonjugeerde inhibeerders van die BACE1-peptied.
(a) Klonale inspuiting (2 × 10 fage/dier) van T7-faag wat langtermyn-farmakokinetiese profiele van CSF-peptied #2077 (RLSSVDSDLSGC) en ongeinspuitte kontrole-faag (#1779) in ten minste drie CM-geïntubeerde rotte toon.(b) Konfokale mikroskopiese beeld van verteenwoordigende kortikale mikrovate in faag-ingespuitte rotte (2 × 10 10 fage/dier) wat teenkleuring van peptied #2077 en vate (lektien) toon.Hierdie faagklone is aan 3 rotte toegedien en toegelaat om vir 1 uur te sirkuleer voor perfusie.Breine is deurgesny en gekleur met poliklonale FITC-gemerkte teenliggaampies teen die T7-faagkapsied.Tien minute voor perfusie en daaropvolgende fiksasie is DyLight594-gemerkte lektien binneaars toegedien.Fluorescerende beelde wat lektienkleuring (rooi) van die luminale kant van mikrovate en fage (groen) in die lumen van kapillêre en perivaskulêre breinweefsel toon.Die skaalbalk stem ooreen met 10 µm.(c, d) Gebiotinileerde BACE1 inhiberende peptied alleen of in kombinasie met gebiotinileerde transito peptied #2077 is gekoppel aan streptavidien gevolg deur binneaarse inspuiting van ten minste drie gekanuleerde CM rotte (10 mg streptavidien/kg).BACE1 peptied inhibeerder-gemedieerde vermindering in Aβ40 is gemeet deur Aβ1-40 ELISA in bloed (rooi) en serebrospinale vloeistof (oranje) op die aangeduide tydpunte.Vir beter duidelikheid word 'n stippellyn op die grafiek op 'n skaal van 100% getrek.(c) Persentasie vermindering in Aβ40 in bloed (rooi driehoeke) en serebrospinale vloeistof (oranje driehoeke) in rotte behandel met streptavidien gekonjugeer aan transito peptied #2077 en BACE1 inhiberende peptied in 'n 3:1 verhouding.(d) Persentasie vermindering in bloed Aβ40 (rooi sirkels) en serebrospinale vloeistof (oranje sirkels) van rotte behandel met streptavidien gekoppel aan slegs 'n BACE1 inhiberende peptied.Die Aβ-konsentrasie in die kontrole was 420 pg/ml (standaardafwyking = 101 pg/ml).
Faagvertoning is suksesvol toegepas in verskeie areas van biomediese navorsing17.Hierdie metode is gebruik vir in vivo vaskulêre diversiteitstudies18,19 sowel as studies wat serebrale vate gerig is20,21,22,23,24,25,26.In hierdie studie het ons die toepassing van hierdie seleksiemetode uitgebrei, nie net na die direkte identifikasie van peptiede wat serebrale vate teiken nie, maar ook na die ontdekking van kandidate met aktiewe vervoereienskappe om die bloed-breinversperring oor te steek.Ons beskryf nou die ontwikkeling van 'n in vivo seleksieprosedure in CM-geïntubeerde rotte en demonstreer die potensiaal daarvan om peptiede te identifiseer met CSF homing eienskappe.Deur gebruik te maak van die T7-faag wat 'n biblioteek van 12-meer ewekansige peptiede vertoon, kon ons aantoon dat die T7-faag klein genoeg is (ongeveer 60 nm in deursnee)10 om by die bloed-breinversperring aangepas te word en sodoende die bloedbreinversperring of choroïedpleksus direk oor te steek.Ons het waargeneem dat CSF-oes van gekanuleerde CM-rotte 'n goed beheerde in vivo funksionele siftingsmetode was, en dat die onttrekte faag nie net aan die vaskulatuur gebind het nie, maar ook as 'n vervoerder oor die bloed-breinversperring gefunksioneer het.Verder, deur gelyktydig bloed te versamel en HTS toe te pas op CSF en bloedafgeleide fage, het ons bevestig dat ons keuse van CSF nie beïnvloed is deur bloedverryking of geskiktheid vir uitbreiding tussen seleksierondtes nie.Die bloedkompartement is egter deel van die seleksieprosedure, aangesien fage wat in staat is om die CSF-kompartement te bereik, lank genoeg in die bloedstroom moet oorleef en sirkuleer om hulself in die brein te verryk.Om betroubare volgorde-inligting uit rou HTS-data te onttrek, het ons filters geïmplementeer wat aangepas is vir platformspesifieke volgordebepalingsfoute in die analise-werkvloei.Deur kinetiese parameters in die siftingsmetode in te sluit, het ons die vinnige farmakokinetika van wildtipe T7-fage (t½ ~ 28 min) in bloed24, 27, 28 bevestig en ook hul halfleeftyd in serebrospinale vloeistof (t½ ~ 26 min) per minuut bepaal.Ten spyte van soortgelyke farmakokinetiese profiele in bloed en CSF, kon slegs 0.001% van die bloedkonsentrasie van fage in CSF opgespoor word, wat 'n lae agtergrondmobiliteit van wilde-tipe T7-faag oor die bloed-breinversperring aandui.Hierdie werk beklemtoon die belangrikheid van die eerste rondte van seleksie wanneer in vivo panning strategieë gebruik word, veral vir faagstelsels wat vinnig uit die sirkulasie verwyder word, aangesien min klone die SSS-kompartement kan bereik.Dus, in die eerste rondte was die vermindering in biblioteekdiversiteit baie groot, aangesien slegs 'n beperkte aantal klone uiteindelik in hierdie baie streng CSF-model versamel is.Hierdie in vivo panning strategie het verskeie seleksie stappe ingesluit soos aktiewe akkumulasie in die CSF kompartement, kloon oorlewing in die bloed kompartement, en vinnige verwydering van T7 faag klone uit die bloed binne die eerste 10 minute (Fig. 1d en Aanvullende Fig. 4M).).Dus, na die eerste rondte, is verskillende faagklone in CSF geïdentifiseer, alhoewel dieselfde aanvanklike poel vir individuele diere gebruik is.Dit dui daarop dat veelvuldige streng seleksiestappe vir bronbiblioteke met groot getalle biblioteeklede 'n aansienlike vermindering in diversiteit tot gevolg het.Daarom sal ewekansige gebeurtenisse 'n integrale deel van die aanvanklike keuringsproses word, wat die resultaat grootliks beïnvloed.Dit is waarskynlik dat baie van die klone in die oorspronklike biblioteek 'n baie soortgelyke CSF-verrykingsgeneigdheid gehad het.Selfs onder dieselfde eksperimentele toestande kan seleksieresultate egter verskil as gevolg van die klein aantal van elke spesifieke kloon in die aanvanklike poel.
Die motiewe wat in CSF verryk is verskil van dié in die bloed.Interessant genoeg het ons die eerste verskuiwing na glisienryke peptiede in die bloed van individuele diere opgemerk.(Fig. 1g, Aanvullende Fig. 4e, 4f).Faag wat glisienpeptiede bevat, kan meer stabiel wees en minder geneig wees om uit sirkulasie gehaal te word.Hierdie glisienryke peptiede is egter nie in die serebrospinale vloeistofmonsters opgespoor nie, wat daarop dui dat die saamgestelde biblioteke deur twee verskillende seleksiestappe gegaan het: een in die bloed en 'n ander toegelaat om in die serebrospinale vloeistof te versamel.CSF-verrykte klone wat voortspruit uit die vierde rondte van seleksie is omvattend getoets.Byna al die individueel getoetste klone is bevestig om verryk te wees in CSF in vergelyking met leë kontrole-faag.Een peptiedtreffer (#2077) is in meer besonderhede ondersoek.Dit het 'n langer plasma-halfleeftyd getoon in vergelyking met ander treffers (Figuur 3d en Aanvullende Figuur 7), en interessant genoeg het hierdie peptied 'n sisteïenresidu by die C-terminus bevat.Daar is onlangs getoon dat die byvoeging van sisteïen tot peptiede hul farmakokinetiese eienskappe kan verbeter deur aan albumien 29 te bind.Dit is tans onbekend vir peptied #2077 en vereis verdere studie.Sommige peptiede het 'n valensie-afhanklikheid in CSF-verryking getoon (data nie gewys nie), wat verband kan hou met die vertoonde oppervlakgeometrie van die T7-kapsied.Die T7-stelsel wat ons gebruik het, het 5-15 kopieë van elke peptied per faagdeeltjie getoon.IHC is uitgevoer op kandidaat-loodfaagklone wat binneaars in die serebrale korteks van rotte ingespuit is (Aanvullende Fig. 8).Die data het getoon dat ten minste drie klone (No. 2002, No. 2009 en No. 2077) met die BBB interaksie het.Dit moet nog bepaal word of hierdie BBB-interaksie lei tot die ophoping van CSF of die beweging van hierdie klone direk na die BCSFB.Dit is belangrik dat ons wys dat die geselekteerde peptiede hul CSF-vervoerkapasiteit behou wanneer dit gesintetiseer en aan die proteïenvrag gebind word.Binding van N-terminaal gebiotinileerde peptiede aan SA herhaal in wese die resultate wat verkry is met hul onderskeie faagklone in bloed en serebrospinale vloeistof (Fig. 3e).Laastens wys ons dat loodpeptied #2077 in staat is om die breinaksie van 'n gebiotinileerde peptied-inhibeerder van BACE1 wat aan SA gekonjugeer is, te bevorder, wat uitgesproke farmakodinamiese effekte in die SSS veroorsaak deur Abeta40-vlakke in CSF aansienlik te verminder (Fig. 4).Ons was nie in staat om enige homoloë in die databasis te identifiseer deur 'n peptiedvolgorde homologiesoektog van alle treffers uit te voer nie.Dit is belangrik om daarop te let dat die grootte van die T7-biblioteek ongeveer 109 is, terwyl die teoretiese biblioteekgrootte vir 12-mere 4 x 1015 is. Daarom het ons slegs 'n klein fraksie van die diversiteitsspasie van die 12-meer-peptiedbiblioteek gekies, wat kan beteken dat meer geoptimaliseerde peptiede geïdentifiseer kan word deur die aangrensende volgorde van die aangrensende reekse te evalueer.Hipoteties, een van die redes waarom ons nie enige natuurlike homoloë van hierdie peptiede gevind het nie, kan deseleksie tydens evolusie wees om die onbeheerde toegang van sekere peptiedmotiewe in die brein te voorkom.
Gesamentlik bied ons resultate 'n basis vir toekomstige werk om die vervoerstelsels van die serebrovaskulêre versperring in vivo in meer besonderhede te identifiseer en te karakteriseer.Die basiese opstelling van hierdie metode is gebaseer op 'n funksionele seleksiestrategie wat nie net klone met serebrale vaskulêre bindingseienskappe identifiseer nie, maar ook 'n kritieke stap insluit waarin suksesvolle klone intrinsieke aktiwiteit het om biologiese hindernisse in vivo oor te steek na die SSS-kompartement.is om die meganisme van vervoer van hierdie peptiede en hul voorkeur vir binding aan die mikrovaskulatuur spesifiek vir die breinstreek toe te lig.Dit kan lei tot die ontdekking van nuwe weë vir die vervoer van die BBB en reseptore.Ons verwag dat die geïdentifiseerde peptiede direk kan bind aan serebrovaskulêre reseptore of aan sirkulerende ligande wat deur die BBB of BCSFB vervoer word.Die peptiedvektore met CSF-vervoeraktiwiteit wat in hierdie werk ontdek is, sal verder ondersoek word.Ons ondersoek tans die breinspesifisiteit van hierdie peptiede vir hul vermoë om die BBB en/of BCSFB te kruis.Hierdie nuwe peptiede sal uiters waardevolle hulpmiddels wees vir die potensiële ontdekking van nuwe reseptore of weë en vir die ontwikkeling van nuwe hoogs doeltreffende platforms vir die aflewering van makromolekules, soos biologiese middels, aan die brein.
Kanuleer die groot sisterna (CM) deur 'n wysiging van die voorheen beskryf metode te gebruik.Verdoofde Wistar-rotte (200-350 g) is op 'n stereotaksiese apparaat gemonteer en 'n mediaan insnyding is oor die geskeer en asepties voorbereide kopvel gemaak om die skedel bloot te lê.Boor twee gate in die area van die boonste raam en maak die bevestigingsskroewe in die gate vas.'n Bykomende gat is in die laterale oksipitale kruin geboor vir stereotaktiese leiding van 'n vlekvrye staalkanule in die CM.Wend tandheelkundige sement om die kanule aan en bevestig met skroewe.Na foto-verharding en sement verharding, is die vel wond toegemaak met 4/0 supramid hegting.Behoorlike plasing van die kanule word bevestig deur spontane lekkasie van serebrospinale vloeistof (CSF).Verwyder die rot uit die stereotaksiese apparaat, ontvang toepaslike postoperatiewe sorg en pynbestuur, en laat dit vir ten minste een week herstel totdat tekens van bloed in die serebrospinale vloeistof waargeneem word.Wistar-rotte (Crl:WI/Han) is van Charles River (Frankryk) verkry.Alle rotte is onder spesifieke patogeenvrye toestande gehou.Alle diere-eksperimente is goedgekeur deur die Veterinêre Kantoor van die Stad Basel, Switserland, en is uitgevoer in ooreenstemming met Dierelisensie No. 2474 (Assessering van aktiewe breinvervoer deur vlakke van terapeutiese kandidate in die serebrospinale vloeistof en brein van rotte te meet).
Hou die rot liggies bewus met die CM-kanule in die hand.Verwyder Datura uit die kanule en versamel 10 µl spontaan vloeiende serebrospinale vloeistof.Aangesien die deursigtigheid van die kanule uiteindelik gekompromitteer is, is slegs duidelike serebrospinale vloeistofmonsters met geen bewyse van bloedkontaminasie of verkleuring by hierdie studie ingesluit nie.Terselfdertyd is ongeveer 10-20 μl bloed geneem uit 'n klein insnyding aan die punt van die stert in buise met heparien (Sigma-Aldrich).CSF en bloed is op verskillende tydpunte versamel na binneaarse inspuiting van T7-faag.Ongeveer 5-10 μl vloeistof is weggegooi voordat elke CSF-monster versamel is, wat ooreenstem met die dooie volume van die kateter.
Biblioteke is gegenereer met behulp van die T7Select 10-3b vektor soos beskryf in die T7Select stelsel handleiding (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Kortliks, 'n ewekansige 12-meer DNA-insetsel is in die volgende formaat gesintetiseer:
Die NNK-kodon is gebruik om dubbelstopkodons en aminosuurooruitdrukking in die insetsel te vermy.N is 'n handgemengde ekwimolêre verhouding van elke nukleotied, en K is 'n handgemengde ekwimolêre verhouding van adenien- en sitosiennukleotiede.Enkelstrengs streke is omgeskakel na dubbelstring DNA deur verdere inkubasie met dNTP (Novagen) en Klenow ensiem (New England Biolabs) in Klenow buffer (New England Biolabs) vir 3 uur by 37°C.Na die reaksie is dubbelstring-DNS deur EtOH-presipitasie herwin.Die resulterende DNA is verteer met beperkingsensieme EcoRI en HindIII (albei van Roche).Die gekliefde en gesuiwerde (QIAquick, Qiagen) insetsel (T4 ligase, New England Biolabs) is dan in die raam in 'n vooraf gekloofde T7 vektor na aminosuur 348 van die 10B kapsied geen geligeer.Ligeringsreaksies is geïnkubeer by 16°C vir 18 uur voor in vitro verpakking.Faagverpakking in vitro is uitgevoer volgens die instruksies wat saam met die T7Select 10-3b kloningstel (Novagen) voorsien is en die verpakkingsoplossing is een keer geamplifiseer tot lise met behulp van Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Die lysate is gesentrifugeer, getitreer en by -80°C gevries as 'n voorraadoplossing van gliserol.
Direkte PCR amplifikasie van faag veranderlike streke geamplifiseer in sous of plaat met behulp van eie 454/Roche-amplicon fusion primers.Die voorwaartse samesmelting-primer bevat reekse wat die veranderlike streek (NNK) 12 (sjabloon-spesifiek), GS FLX Titanium Adapter A, en 'n vier-basis biblioteek sleutel volgorde (TCAG) flankeer (Aanvullende Figuur 1a):
Die omgekeerde samesmelting-primer bevat ook biotien geheg aan vangkrale en die GS FLX Titanium Adapter B wat benodig word vir klonale amplifikasie tydens emulsie-PKR:
Die amplicons is dan onderwerp aan 454/Roche pyrosequencing volgens die 454 GS-FLX Titanium protokol.Vir handmatige Sanger-volgordebepaling (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA-analiseerder), is T7-faag-DNA geamplifiseer deur PCR en met die volgende primer-pare georden:
Invoegings van individuele plate is aan PCR-amplifikasie onderwerp deur die Roche Fast Start DNA Polimerase Kit (volgens die vervaardiger se instruksies).Voer 'n warm begin (10 min by 95 °C) en 35 hupstootsiklusse uit (50 s by 95 °C, 1 min by 50 °C en 1 min by 72 °C).
Faag van biblioteke, wilde-tipe fage, fage gered van CSF en bloed, of individuele klone is geamplifiseer in Escherichia coli BL5615 in TB sous (Sigma Aldrich) of in 500 cm2 skottelgoed (Thermo Scientific) vir 4 uur by 37°C.Faag is uit die plate onttrek deur die plate af te spoel met Tris-EDTA buffer (Fluka Analytical) of deur die plate met steriele pipetpunte te versamel.Faag is geïsoleer uit kultuursupernatant of ekstraksiebuffer met een ronde poliëtileenglikol (PEG 8000) presipitasie (Promega) en hersuspendeer in Tris-EDTA buffer.
Die geamplifiseerde faag is voor intraveneuse (IV) inspuiting (500 μl/dier) aan 2-3 rondtes endotoksienverwydering onderwerp deur gebruik te maak van endotoksienverwyderingskrale (Miltenyi Biotec).In die eerste rondte is 2×1012 fage bekendgestel;in die tweede, 2×1010 fage;in die derde en vierde seleksie-rondtes, 2×109 fage per dier.Faaginhoud in CSF en bloedmonsters wat op die aangeduide tydpunte versamel is, is bepaal deur plaaktelling volgens die vervaardiger se instruksies (T7Select-stelselhandleiding).Faagseleksie is uitgevoer deur binneaarse inspuiting van gesuiwerde biblioteke in die stertaar of deur herinspuiting van faag wat uit die vorige seleksie-rondte uit die vorige seleksie-rondte onttrek is, en daaropvolgende oeste is onderskeidelik op 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min en 240 min bloedmonsters uitgevoer.Altesaam vier rondtes van in vivo panning is uitgevoer waarin die twee geselekteerde takke afsonderlik gestoor en ontleed is tydens die eerste drie rondtes van seleksie.Alle faag-inserts wat uit die eerste twee rondtes van seleksie uit CSF onttrek is, is aan 454/Roche pyrosequencing onderwerp, terwyl alle klone wat uit CSF uit die laaste twee rondtes van seleksie onttrek is, met die hand gevolgorde is.Alle bloedfage van die eerste rondte van seleksie is ook aan 454/Roche pyrosequencing onderwerp.Vir inspuiting van fage klone, is geselekteerde fage geamplifiseer in E. coli (BL5615) op 500 cm2 plate by 37°C vir 4 uur.Individueel geselekteerde en met die hand geselekteerde klone is in TB-medium gepropageer.Na fage ekstraksie, suiwering en verwydering van endotoksien (soos hierbo beskryf), is 2×1010 fage/dier in 300 μl binneaars in een stertaar ingespuit.
Voorverwerking en kwalitatiewe filtrering van volgordedata.Rou 454/Roche data is omgeskakel van 'n binêre standaard stroomkaartformaat (sff) na 'n Pearson mens leesbare formaat (fasta) met behulp van verskaffer sagteware.Verdere verwerking van die nukleotiedvolgorde is uitgevoer met behulp van eie C-programme en skrifte (onvrygestelde sagtewarepakket) soos hieronder beskryf.Die ontleding van primêre data sluit streng multi-stadium filter prosedures in.Om leeswerk wat nie 'n geldige 12meer-inset-DNA-volgorde bevat het nie, uit te filtreer, is die lesings opeenvolgend belyn na beginetiket (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stopetiket (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) en agtergrondinsetsel (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) met behulp van die globale Needleman-Wunsch-toets.belyning wat tot 2 inkonsekwenthede per belyning toelaat31.Daarom is lees sonder begin- en stop-etikette en lees wat agtergrondinvoegsels bevat, dit wil sê belynings wat die toegelate aantal wanpassings oorskry, uit die biblioteek verwyder.Wat die oorblywende leeswerk betref, is die N-meer DNS-volgorde wat strek vanaf die beginmerk en eindig voor die stopmerk uit die oorspronklike leesvolgorde gesny en verder verwerk (hierna verwys as "insetsel").Na translasie van die insetsel word die gedeelte na die eerste stopkodon aan die 5′ einde van die primer uit die insetsel verwyder.Daarbenewens is nukleotiede wat lei tot onvolledige kodons aan die 3'-punt van die primer ook verwyder.Om invoegings wat slegs agtergrondreekse bevat uit te sluit, is vertaalde invoegings wat met die aminosuurpatroon "PAG" begin, ook verwyder.Peptiede met 'n post-translasionele lengte van minder as 3 aminosure is uit die biblioteek verwyder.Laastens, verwyder oortolligheid in die insetpoel en bepaal die frekwensie van elke unieke insetsel.Die resultate van hierdie analise het 'n lys van nukleotiedvolgordes (insetsels) en hul (lees) frekwensies ingesluit (Aanvullende Figure 1c en 2).
Groepeer N-meer DNS-invoegings volgens volgorde-ooreenkoms: Om 454/Roche-spesifieke volgordebepalingsfoute (soos probleme met volgordebepaling van homopolimeeruitbreidings) uit te skakel en minder belangrike oortollighede te verwyder, word voorheen gefiltreerde N-meer DNS-volgorde-insetsels (inserts) volgens ooreenkoms gesorteer.invoegings (tot 2 nie-ooreenstemmende basisse toegelaat) met behulp van 'n iteratiewe algoritme wat soos volg gedefinieer word: invoegings word eerste gesorteer volgens hul frekwensie (hoogste na laagste), en as hulle dieselfde is, volgens hul sekondêre sorteer volgens lengte (langste na kortste) ).Dus, die mees gereelde en langste invoegings definieer die eerste "groep".Die groepfrekwensie is ingestel op die sleutelfrekwensie.Daarna is probeer om elke invoeging wat in die gesorteerde lys oorbly, by die groep gevoeg te word deur paarsgewyse Needleman-Wunsch-belyning.As die aantal wanpassings, invoegings of skrappings in 'n belyning nie 'n drempel van 2 oorskry nie, word 'n invoeging by die groep gevoeg, en die algehele groepfrekwensie word verhoog met hoe gereeld die invoeging bygevoeg is.Insetsels wat by 'n groep gevoeg word, word as gebruik gemerk en uitgesluit van verdere verwerking.As die invoegvolgorde nie by 'n reeds bestaande groep gevoeg kan word nie, word die invoegvolgorde gebruik om 'n nuwe groep met die toepaslike invoegfrekwensie te skep en as gebruik gemerk.Die iterasie eindig wanneer elke invoegvolgorde óf gebruik is om 'n nuwe groep te vorm óf in 'n reeds bestaande groep ingesluit kan word.Gegroepeerde insetsels wat uit nukleotiede bestaan, word immers uiteindelik in peptiedvolgordes (peptiedbiblioteke) vertaal.Die resultaat van hierdie analise is 'n stel invoegings en hul ooreenstemmende frekwensies wat die aantal opeenvolgende leeswerk uitmaak (Aanvullende Fig. 2).
Motiefgenerering: Gebaseer op 'n lys unieke peptiede, is 'n biblioteek geskep wat alle moontlike aminosuurpatrone (aa) bevat soos hieronder getoon.Elke moontlike patroon van lengte 3 is uit die peptied onttrek en sy omgekeerde patroon is bygevoeg saam met 'n gemeenskaplike motiefbiblioteek wat alle patrone (tripeptiede) bevat.Biblioteke van hoogs herhalende motiewe is gerangskik en oortolligheid verwyder.Dan, vir elke tripeptied in die motiefbiblioteek, het ons gekontroleer vir die teenwoordigheid daarvan in die biblioteek met behulp van rekenaargereedskap.In hierdie geval word die frekwensie van die peptied wat die gevind motief tripeptied bevat, bygevoeg en aan die motief in die motiefbiblioteek (“aantal motiewe”) toegeken.Die resultaat van motiefgenerering is 'n twee-dimensionele skikking wat alle voorkomste van tripeptiede (motiewe) en hul onderskeie waardes bevat, wat die aantal opeenvolgingslesings is wat die ooreenstemmende motief tot gevolg het wanneer die lesings gefiltreer, gegroepeer en vertaal word.Metrieke soos hierbo in detail beskryf.
Normalisering van die aantal motiewe en ooreenstemmende spreidingsdiagramme: Die aantal motiewe vir elke monster is genormaliseer met behulp van
waar ni die aantal leesstukke is wat onderwerp i bevat.Dus verteenwoordig vi die persentasie frekwensie van lees (of peptiede) wat motief i in die monster bevat.P-waardes vir die nie-genormaliseerde aantal motiewe is met behulp van Fisher se presiese toets bereken.Wat korrelogramme van die aantal motiewe betref, is Spearman se korrelasies bereken deur die genormaliseerde aantal motiewe met R te gebruik.
Om die inhoud van aminosure by elke posisie in die peptiedbiblioteek te visualiseer, is weblogogramme 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) geskep.Eerstens word die inhoud van aminosure by elke posisie van die 12-meer peptied in 'n 20×12 matriks gestoor.Dan word 'n stel van 1000 peptiede wat dieselfde relatiewe aminosuurinhoud by elke posisie bevat, gegenereer in fasta-volgorde formaat en verskaf as invoer na web-logo 3, wat 'n grafiese voorstelling van die relatiewe aminosuurinhoud by elke posisie genereer.vir 'n gegewe peptied biblioteek.Om multidimensionele datastelle te visualiseer, is hittekaarte geskep met behulp van 'n intern ontwikkelde hulpmiddel in R (biosHeatmap, 'n R-pakket wat nog vrygestel moet word).Die dendrogramme wat in die hittekaarte aangebied word, is bereken deur Ward se hiërargiese groeperingsmetode met die Euklidiese afstandmetriek te gebruik.Vir statistiese ontleding van motiefpuntdata is P-waardes vir ongenormaliseerde puntetelling bereken met behulp van Fisher se presiese toets.P-waardes vir ander datastelle is in R bereken deur Student se t-toets of ANOVA te gebruik.
Geselekteerde fageklone en fage sonder invoegings is binneaars ingespuit via die stertaar (2×1010 fage/dier in 300 μl PBS).Tien minute voor perfusie en daaropvolgende fiksasie is dieselfde diere binneaars ingespuit met 100 μl DyLight594-gemerkte lektien (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minute na faag-inspuiting is rotte deur die hart geperfuseer met 50 ml PBS gevolg deur 50 ml 4% PFA/PBS.Breinmonsters is addisioneel oornag in 4% PFA/PBS gefixeer en oornag in 30% sukrose by 4°C geweek.Monsters word blitsgevries in die OCT-mengsel.Immunohistochemiese ontleding van bevrore monsters is uitgevoer by kamertemperatuur op 30 µm kryoseksies geblokkeer met 1% BSA en geïnkubeer met poliklonale FITC-gemerkte teenliggaampies teen T7-faag (Novus NB 600-376A) by 4 °C.Inkubeer oornag.Laastens is die afdelings 3 keer met PBS gewas en met 'n konfokale lasermikroskoop (Leica TCS SP5) ondersoek.
Alle peptiede met 'n minimum suiwerheid van 98% is deur GenScript USA gesintetiseer, gebiotinileer en gelyofiliseer.Biotien word gebind via 'n bykomende drievoudige glisienspasieerder by die N-terminus.Kontroleer alle peptiede deur massaspektrometrie te gebruik.
Streptavidien (Sigma S0677) is gemeng met 'n 5-voudige ekwimolêre oormaat van gebiotinileerde peptied, gebiotinileerde BACE1 inhiberende peptied, of 'n kombinasie (3:1 verhouding) van gebiotinileerde BACE1 inhiberende peptied en BACE1 inhiberende peptied in DMSOBS/10% peptied.1 uur by kamertemperatuur voor inspuiting.Streptavidien-gekonjugeerde peptiede is binneaars ingespuit teen 'n dosis van 10 mg/kg in een van die stertare van rotte met 'n serebrale holte.
Die konsentrasie van streptavidien-peptied komplekse is deur ELISA geassesseer.Nunc Maxisorp mikrotiterplate (Sigma) is oornag by 4°C bedek met 1,5 μg/ml muis anti-streptavidien teenliggaampie (Thermo, MA1-20011).Na blokkering (blokkeerbuffer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatien, 1% BSA) by kamertemperatuur vir 2 uur, was die plaat met 0,05% Tween-20/PBS (wasbuffer) vir 3 Tweedens, CSF,0ma-buffer,0ma, is gevoeg by CSF, en plasma-buffer0ma-monsters0ma verdund0ma. SF 1:115).Die plaat is dan oornag by 4°C geïnkubeer met opsporing teenliggaampies (1 μg/ml, anti-streptavidien-HRP, Novus NB120-7239).Na drie wasstappe is streptavidien opgespoor deur inkubasie in TMB-substraatoplossing (Roche) vir tot 20 min.Nadat kleurontwikkeling met 1M H2SO4 gestaak is, meet die absorpsie by 450 nm.
Die funksie van die streptavidien-peptied-BACE1 inhibeerder kompleks is geassesseer deur Aβ(1-40) ELISA volgens die vervaardiger se protokol (Wako, 294-64701).Kortliks, CSF-monsters is verdun in standaard verdunningsmiddel (1:23) en oornag by 4°C geïnkubeer in 96-put plate bedek met BNT77 vang teenliggaampies.Na vyf wasstappe is HRP-gekonjugeerde BA27-teenliggaampies bygevoeg en vir 2 uur by 4°C geïnkubeer, gevolg deur vyf wasstappe.Aβ(1-40) is opgespoor deur inkubasie in TMB-oplossing vir 30 minute by kamertemperatuur.Nadat kleurontwikkeling gestaak is met stopoplossing, meet die absorpsie by 450 nm.Plasmamonsters is onderwerp aan vastefase-ekstraksie voor Aβ(1-40) ELISA.Plasma is by 0.2% DEA (Sigma) in 96-put plate gevoeg en by kamertemperatuur vir 30 minute geïnkubeer.Nadat die SPE-plate (Oasis, 186000679) agtereenvolgens met water en 100% metanol gewas is, is plasmamonsters by die SPE-plate gevoeg en alle vloeistof is verwyder.Monsters is gewas (eers met 5% metanol dan 30% metanol) en geëlueer met 2% NH4OH/90% metanol.Nadat die eluaat by 55°C vir 99 min by konstante N2-stroom gedroog is, is die monsters in standaardverdunningsmiddels verminder en Aβ(1-40) is gemeet soos hierbo beskryf.
Hoe om hierdie artikel aan te haal: Urich, E. et al.Vraglewering aan die brein deur gebruik te maak van transitpeptiede wat in vivo geïdentifiseer is.die wetenskap.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB en Moos T. Aflewering van makromolekulêre middels aan die brein deur gebruik te maak van geteikende terapie.Tydskrif vir Neurochemie 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., en Martinez-Martinez, P. Lewering van peptied- en proteïenmedisyne oor die bloedbreinversperring.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Die bloed-brein versperring: 'n bottelnek in brein dwelm ontwikkeling.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, en Byrd, A. Vooruitsigte vir verbeterde geneesmiddellewering en teiken na die brein via die choroid plexus-CSF-weg.Farmaseutiese Navorsing 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernisering van biofarmaseutiese middels met molekulêre Trojaanse perde vir breinlewering.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM reseptor-gemedieerde peptied vervoer oor die bloed-brein versperring.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Verhoog breinpenetrasie en doeltreffendheid van terapeutiese teenliggaampies met behulp van monovalente molekulêre pendeltuie.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Transferrienreseptor (TfR) vervoer bepaal breinopname van affiniteitsvariante van TfR-teenliggaampies.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).