Sommige LC-probleemoplossingsonderwerpe is nooit verouderd nie, aangesien daar probleme in LC-praktyk is, selfs al verbeter instrumenttegnologie mettertyd. Daar is baie maniere waarop probleme in 'n LC-stelsel kan ontstaan ​​en in 'n swak piekvorm kan beland. Wanneer probleme met betrekking tot piekvorm ontstaan, help 'n kort lys van moontlike oorsake vir hierdie resultate om ons probleemoplossingservaring te vereenvoudig.
Dit was pret om hierdie "LC Probleemoplossing"-rubriek te skryf en elke maand oor onderwerpe te dink, want sommige onderwerpe raak nooit uit die mode nie. Terwyl sekere onderwerpe of idees in die veld van chromatografie-navorsing verouderd raak soos hulle deur nuwer en beter idees vervang word, in die veld van probleemoplossing, sedert die eerste probleemoplossingsartikel in hierdie joernaal (die LC Journal destyds) verskyn het (aangesien sommige onderwerpe steeds relevant is) in 1983(1). Oor die afgelope paar jaar het ek verskeie LC Probleemoplossings-afdelings gefokus op kontemporêre tendense wat vloeistofchromatografie (LC) beïnvloed (byvoorbeeld die relatiewe vergelyking van ons begrip van die effek van druk op retensie [2] Nuwe Vooruitgang) Ons interpretasie van LC-resultate en hoe om probleme op te los met moderne LC-instrumente. In hierdie maand se aflewering gaan ek voort met my reeks (3), wat in Desember 2021 begin het, wat gefokus het op sommige van die "lewe en dood"-onderwerpe van LC-probleemoplossing - elemente wat wonderlik is vir enige probleemoplosser is noodsaaklik, ongeag die ouderdom van die stelsel wat ons gebruik. Die kernonderwerp van hierdie reeks is hoogs relevant vir die LCGC se beroemde "LC Probleemoplossingsgids"-muurkaart (4) wat hang in baie laboratoriums. Vir die derde deel van hierdie reeks het ek gekies om te fokus op kwessies wat verband hou met piekvorm of piekkenmerke. Ongelooflik genoeg lys die muurkaart 44 verskillende potensiële oorsake van swak piekvorm! Ons kan nie al hierdie kwessies in detail in een artikel oorweeg nie, so in hierdie eerste aflewering oor die onderwerp sal ek fokus op sommige van die wat ek die meeste sien. Ek hoop jong en ou LC-gebruikers sal nuttige wenke en herinneringe oor hierdie belangrike onderwerp vind.
Ek vind dat ek toenemend probleme met probleemoplossingsvrae beantwoord met "enigiets is moontlik". Hierdie antwoord mag dalk maklik lyk as mens waarnemings oorweeg wat moeilik is om te interpreteer, maar ek vind dit dikwels gepas. Met baie moontlike oorsake van swak piekvorm, is dit belangrik om 'n oop gemoed te hou wanneer mens oorweeg wat die probleem mag wees, en om potensiële oorsake te kan prioritiseer om ons probleemoplossingspogings te begin, met die fokus op die mees algemene moontlikhede, hierdie punt is baie belangrik.
'n Sleutelstap in enige probleemoplossingsoefening – maar een wat ek dink onderskat word – is om te erken dat daar 'n probleem is wat opgelos moet word. Om te erken dat daar 'n probleem is, beteken dikwels om te erken dat wat met die instrument gebeur, anders is as ons verwagtinge, wat gevorm word deur teorie, empiriese kennis en ervaring (5). Die "piekvorm" waarna hier verwys word, verwys eintlik nie net na die vorm van die piek (simmetries, asimmetries, glad, donsig, voorrand, stert, ens.) nie, maar ook na die breedte. Ons verwagtinge vir die werklike piekvorm is eenvoudig. Teorie (6) ondersteun die handboekverwagting dat die chromatografiese pieke in die meeste gevalle simmetries moet wees en ooreenstem met die vorm van 'n Gaussiese verspreiding, soos getoon in Figuur 1a. Wat ons van piekwydtes verwag, is 'n meer komplekse kwessie, en ons sal hierdie onderwerp in 'n toekomstige artikel bespreek. Die ander piekvorms in Figuur 1 toon sommige van die ander moontlikhede wat waargeneem kan word – met ander woorde, sommige van die maniere waarop dinge verkeerd kan loop. In die res van hierdie aflewering sal ons tyd spandeer om 'n paar spesifieke voorbeelde van situasies te bespreek wat kan lei tot hierdie vormtipes.
Soms word pieke glad nie waargeneem in die chromatogram waar hulle verwag word om geëlueer te word nie. Die bostaande muurkaart dui aan dat die afwesigheid van 'n piek (as ons aanvaar dat die monster eintlik die teikenanaliet bevat teen 'n konsentrasie wat die detektorrespons voldoende behoort te maak om dit bo die geraas te sien) gewoonlik verband hou met 'n instrumentprobleem of verkeerde mobiele fasetoestande (indien enigsins waargeneem). Pieke, gewoonlik te "swak"). 'n Kort lys van potensiële probleme en oplossings in hierdie kategorie kan in Tabel I gevind word.
Soos hierbo genoem, is die vraag van hoeveel piekverbreding geduld moet word voordat aandag gegee word en probeer word om dit reg te stel, 'n komplekse onderwerp wat ek in 'n toekomstige artikel sal bespreek. My ervaring is dat beduidende piekverbreding dikwels gepaard gaan met 'n beduidende verandering in piekvorm, en piekstertvorming is meer algemeen as voorpiek of splitsing. Die nominaal simmetriese pieke word egter ook verbreed, wat deur 'n paar verskillende redes veroorsaak kan word:
Elk van hierdie kwessies is in detail bespreek in vorige uitgawes van Troubleshooting LC, en lesers wat in hierdie onderwerpe belangstel, kan na hierdie vorige artikels verwys vir inligting oor die oorsake en moontlike oplossings vir hierdie probleme. Meer besonderhede.
Piekstertvorming, piekfrontvorming en splitsing kan almal deur chemiese of fisiese verskynsels veroorsaak word, en die lys van potensiële oplossings vir hierdie probleme wissel wyd, afhangende van of ons met 'n chemiese of fisiese probleem te doen het. Deur die verskillende pieke in 'n chromatogram te vergelyk, kan jy dikwels belangrike leidrade vind oor watter een die oorsaak is. As alle pieke in 'n chromatogram soortgelyke vorms vertoon, is die oorsaak heel waarskynlik nie fisies nie. As slegs een of 'n paar pieke geaffekteer word, maar die res lyk goed, is die oorsaak heel waarskynlik chemies.
Die chemiese oorsake van piekstertvorming is te kompleks om hier kortliks te bespreek. Die belangstellende leser word verwys na die onlangse uitgawe van "LC Troubleshooting" vir 'n meer diepgaande bespreking (10). 'n Maklike ding om te probeer is egter om die massa van die ingespuite analiet te verminder en te kyk of die piekvorm verbeter. Indien wel, dan is dit 'n goeie aanduiding dat die probleem "massa-oorlading" is. In hierdie geval moet die metode beperk word tot die inspuiting van klein analietmassas, of die chromatografiese toestande moet verander word sodat goeie piekvorms verkry kan word selfs met groter massas wat ingespuit word.
Daar is ook baie potensiële fisiese redes vir piekstert. Lesers wat belangstel in 'n gedetailleerde bespreking van die moontlikhede word verwys na 'n ander onlangse uitgawe van "LC Troubleshooting" (11). Een van die meer algemene fisiese oorsake van piekstert is 'n swak verbinding by 'n punt tussen die inspuiter en detektor (12). 'n Ekstreme voorbeeld word in Figuur 1d getoon, wat 'n paar weke gelede in my laboratorium verkry is. In hierdie geval het ons 'n stelsel gebou met 'n nuwe inspuitklep wat ons nog nie voorheen gebruik het nie, en 'n klein volume inspuitlus geïnstalleer met 'n ferrule wat op 'n vlekvrye staalkapillêr gegiet is. Na 'n paar aanvanklike probleemoplossingseksperimente het ons besef dat die poortdiepte in die inspuitklepstator baie dieper was as waaraan ons gewoond was, wat 'n groot dooie volume aan die onderkant van die poort tot gevolg gehad het. Hierdie probleem word maklik opgelos deur die inspuitlus met 'n ander buis te vervang, ons kan die ferrule na die regte posisie aanpas om die dooie volume aan die onderkant van die poort uit te skakel.
Piekfronte soos dié wat in Figuur 1e getoon word, kan ook deur fisiese of chemiese probleme veroorsaak word. 'n Algemene fisiese oorsaak van die voorrand is dat die deeltjiebed van die kolom nie goed gepak is nie, of dat die deeltjies mettertyd herorganiseer het. Soos met piekstert wat deur hierdie fisiese verskynsel veroorsaak word, is die beste manier om dit reg te stel om die kolom te vervang en aan te hou. Fundamenteel ontstaan ​​voorrandpiekvorms met chemiese oorsprong dikwels uit wat ons "nie-lineêre" retensietoestande noem. Onder ideale (lineêre) toestande is die hoeveelheid analiet wat deur die stasionêre fase behou word (dus die retensiefaktor) lineêr verwant aan die konsentrasie van die analiet in die kolom. Chromatografies beteken dit dat soos die massa analiet wat in die kolom ingespuit word, toeneem, die piek hoër word, maar nie wyer nie. Hierdie verhouding word verbreek wanneer die retensiegedrag nie-lineêr is, en die pieke word nie net hoër nie, maar ook wyer namate meer massa ingespuit word. Daarbenewens bepaal nie-lineêre vorms die vorm van chromatografiese pieke, wat lei tot voor- of agterrande. Soos met massa-oorlading wat piekstert veroorsaak (10), word piekvoorsprong veroorsaak deur nie-lineêre retensie kan ook gediagnoseer word deur die ingespuitte analietmassa te verminder. Indien die piekvorm verbeter, moet die metode aangepas word om nie die inspuitkwaliteit wat die voorrand veroorsaak, te oorskry nie, of die chromatografiese toestande moet verander word om hierdie gedrag te minimaliseer.
Soms neem ons waar wat lyk na 'n "gesplete" piek, soos getoon in Figuur 1f. Die eerste stap in die oplossing van hierdie probleem is om te bepaal of die piekvorm te wyte is aan gedeeltelike ko-eluering (d.w.s. die teenwoordigheid van twee afsonderlike maar nou eluerende verbindings). As daar eintlik twee verskillende analiete is wat naby mekaar elueer, dan is dit 'n kwessie van die verbetering van hul resolusie (byvoorbeeld deur selektiwiteit, retensie of plaattelling te verhoog), en die skynbare "gesplete" pieke hou verband met fisiese prosesse. Prestasie het niks met die kolom self te doen nie. Dikwels is die belangrikste leidraad tot hierdie besluit of alle pieke in die chromatogram gesplete vorms vertoon, of net een of twee. As dit net een of twee is, is dit waarskynlik 'n ko-elueringsprobleem; as alle pieke gesplete is, is dit waarskynlik 'n fisiese probleem, heel waarskynlik verwant aan die kolom self.
Gesplete pieke wat verband hou met die fisiese eienskappe van die kolom self, is gewoonlik te wyte aan gedeeltelik geblokkeerde inlaat- of uitlaatfritte, of herorganisasie van deeltjies in die kolom, wat die mobiele fase toelaat om vinniger te vloei as die mobiele fase in sekere areas van die kolomkanaalvorming in ander streke (11). Gedeeltelik verstopte frit kan soms opgelos word deur die vloei deur die kolom om te keer; in my ervaring is dit egter gewoonlik 'n korttermyn- eerder as 'n langtermynoplossing. Dit is dikwels noodlottig met moderne kolomme as die deeltjies binne die kolom herkombineer. Op hierdie stadium is dit die beste om die kolom te vervang en voort te gaan.
Die piek in Figuur 1g, ook van 'n onlangse geval in my eie laboratorium, dui gewoonlik aan dat die sein so hoog is dat dit die hoë punt van die reaksiebereik bereik het. Vir optiese absorbansiedetektors (UV-vis in hierdie geval), wanneer die analietkonsentrasie baie hoog is, absorbeer die analiet die meeste van die lig wat deur die detektorvloeisel beweeg, wat baie min lig laat om waargeneem te word. Onder hierdie toestande word die elektriese sein van die fotodetektor sterk beïnvloed deur verskeie bronne van geraas, soos verdwaalde lig en "donkerstroom", wat die sein baie "vaag" in voorkoms maak en onafhanklik van analietkonsentrasie. Wanneer dit gebeur, kan die probleem dikwels maklik opgelos word deur die inspuitvolume van die analiet te verminder - die inspuitvolume te verminder, die monster te verdun, of albei.
In chromatografie-skool gebruik ons ​​die detektorsein (d.w.s. die y-as in die chromatogram) as 'n aanduiding van die analietkonsentrasie in die monster. Dit lyk dus vreemd om 'n chromatogram met 'n sein onder nul te sien, aangesien die eenvoudige interpretasie is dat dit 'n negatiewe analietkonsentrasie aandui – wat natuurlik nie fisies moontlik is nie. In my ervaring word negatiewe pieke meestal waargeneem wanneer optiese absorbansiedetektors gebruik word (bv. UV-vis).
In hierdie geval beteken 'n negatiewe piek eenvoudig dat die molekules wat uit die kolom elueer, minder lig absorbeer as die mobiele fase self onmiddellik voor en na die piek. Dit kan byvoorbeeld voorkom wanneer relatief lae deteksiegolflengtes (<230 nm) en mobiele fase-bymiddels gebruik word wat die meeste van die lig by hierdie golflengtes absorbeer. Sulke bymiddels kan mobiele fase-oplosmiddelkomponente soos metanol of bufferkomponente soos asetaat of formate wees. 'n Mens kan eintlik negatiewe pieke gebruik om 'n kalibrasiekurwe voor te berei en akkurate kwantitatiewe inligting te verkry, dus is daar geen fundamentele rede om hulle per se te vermy nie (hierdie metode word soms na verwys as "indirekte UV-deteksie") (13). As ons egter regtig negatiewe pieke heeltemal wil vermy, in die geval van absorbansiedeteksie, is die beste oplossing om 'n ander deteksiegolflengte te gebruik sodat die analiet meer absorbeer as die mobiele fase, of die samestelling van die mobiele fase te verander sodat hulle minder lig absorbeer as analiete.
Negatiewe pieke kan ook verskyn wanneer brekingsindeks (RI)-deteksie gebruik word wanneer die brekingsindeks van komponente anders as die analiet in die monster, soos die oplosmiddelmatriks, verskil van die brekingsindeks van die mobiele fase. Dit gebeur ook met UV-vis-deteksie, maar hierdie effek is geneig om relatief tot RI-deteksie te verswak. In beide gevalle kan negatiewe pieke geminimaliseer word deur die samestelling van die monstermatriks noukeuriger by dié van die mobiele fase te pas.
In deel drie oor die basiese onderwerp van LC-foutoplossing, het ek situasies bespreek waarin die waargenome piekvorm verskil van die verwagte of normale piekvorm. Doeltreffende probleemoplossing van sulke probleme begin met kennis van verwagte piekvorms (gebaseer op teorie of vorige ervaring met bestaande metodes), dus is afwykings van hierdie verwagtinge voor die hand liggend. Piekvormprobleme het baie verskillende potensiële oorsake (te wyd, stert, voorrand, ens.). In hierdie aflewering bespreek ek in detail sommige van die redes wat ek die meeste sien. Om hierdie besonderhede te ken, bied 'n goeie plek om te begin met probleemoplossing, maar dit vang nie alle moontlikhede vas nie. Lesers wat belangstel in 'n meer diepgaande lys van oorsake en oplossings, kan na die LCGC "LC Probleemoplossingsgids"-muurkaart verwys.
(4) LCGC “LC Probleemoplossingsgids” muurkaart. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data-analise en seinverwerking in chromatografie (Elsevier, New York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF en Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.