Sommige LC-foutsporing-onderwerpe is nooit verouderd nie, aangesien daar probleme in LC-praktyke is, selfs al verbeter instrumenttegnologie met verloop van tyd.Daar is baie maniere waarop probleme in 'n LC-stelsel kan ontstaan ​​en in swak piekvorm kan eindig.Wanneer kwessies wat met piekvorm verband hou, opduik, help 'n kort lys van moontlike oorsake vir hierdie resultate om ons probleemoplossingservaring te vereenvoudig.
Dit was lekker om hierdie “LC Troubleshooting”-kolom te skryf en elke maand oor onderwerpe te dink, want sommige onderwerpe raak nooit uit die mode nie. Terwyl sekere onderwerpe of idees op die gebied van chromatografienavorsing verouderd raak omdat dit vervang word deur nuwer en beter idees, in die veld van probleemoplossing, aangesien die eerste probleemoplossingsjoernaal in die LC Joernaal verskyn het, het die tyd nog in hierdie tydskrif verskyn. 983(1).Oor die afgelope paar jaar het ek verskeie LC-probleemoplossingsafdelings gefokus op kontemporêre neigings wat vloeistofchromatografie (LC) affekteer (byvoorbeeld die relatiewe vergelyking van ons begrip van die effek van druk op retensie [2] New Advances) Ons interpretasie van LC-resultate en hoe om probleme op te los wat in hierdie maand-reeks begin het,1 Desember'20m, wat met die moderne LC-instrumente begin het. , wat gefokus het op sommige van die "lewe en dood"-onderwerpe van LC-foutsporing - elemente wat wonderlik is vir enige probleemoplosser is noodsaaklik, ongeag die ouderdom van die stelsel wat ons gebruik. Die kernonderwerp van hierdie reeks is hoogs relevant vir die LCGC se beroemde "LC Troubleshooting Guide"-muurkaart (4) wat in baie laboratoriums hang, wat verband hou met die piek van hierdie reeks. bly, die muurkaart lys 44 verskillende potensiële oorsake van swak piekvorm!Ons kan nie al hierdie kwessies in detail in een artikel oorweeg nie, so in hierdie eerste aflewering oor die onderwerp, sal ek fokus op sommige van die wat ek die meeste sien. Ek hoop jong en oud LC-gebruikers sal 'n paar nuttige wenke en aanmanings oor hierdie belangrike onderwerp vind.
Ek vind myself dat ek toenemend foutsporingsvrae beantwoord met "enigiets is moontlik". Hierdie reaksie lyk dalk maklik as ek waarnemings oorweeg wat moeilik is om te interpreteer, maar ek vind dit dikwels gepas. Met baie moontlike oorsake van swak piekvorm, is dit belangrik om 'n oop gemoed te hou wanneer jy oorweeg wat die probleem kan wees, en om potensiële oorsake te kan prioritiseer om te begin met ons probleemoplossingspogings, baie belangrike moontlikhede.
'n Sleutelstap in enige probleemoplossingsoefening - maar een wat ek dink onderskat word - is om te erken dat daar 'n probleem is wat opgelos moet word. Om te erken dat daar 'n probleem is, beteken dikwels dat ons erken dat wat met die instrument gebeur verskil van ons verwagtinge, wat gevorm word deur teorie, empiriese kennis en ervaring (5). y, voorrand, stert, ens.), maar ook na die breedte. Ons verwagtinge vir werklike piekvorm is eenvoudig.Teorie (6) ondersteun goed die handboekverwagting dat, in die meeste gevalle, die chromatografiese pieke simmetries moet wees en ooreenstem met die vorm van 'n Gaussiese verspreiding, soos getoon in Figuur 1a. Die wat ons verwag van 'n piekwydte artikel in die toekoms, en ons sal van 'n toekomstige piek-artikel verwag. s in Figuur 1 wys 'n paar van die ander moontlikhede wat waargeneem kan word - met ander woorde, sommige van die maniere waarop dinge verkeerd kan loop. In die res van hierdie aflewering sal ons tyd spandeer om 'n paar spesifieke voorbeelde van situasies te bespreek wat tot hierdie vormtipes kan lei.
Soms word pieke glad nie waargeneem in die chromatogram waar dit na verwagting geëlueer sal word nie. Die bostaande muurkaart dui aan dat die afwesigheid van 'n piek (met die veronderstelling dat die monster eintlik die teikenanaliet bevat teen 'n konsentrasie wat die detektorrespons voldoende behoort te maak om dit bo die geraas te sien) gewoonlik verband hou met een of ander instrumentprobleem of verkeerde mobiele fasetoestande (indien dit waargeneem word by alle toestande).pieke, gewoonlik te “swak”). ’n Kort lys van potensiële probleme en oplossings in hierdie kategorie kan in Tabel I gevind word.
Soos hierbo genoem, is die vraag oor hoeveel piekverbreding geduld moet word voordat aandag gegee word en probeer om dit reg te stel, 'n komplekse onderwerp wat ek in 'n toekomstige artikel sal bespreek. My ervaring is dat beduidende piekverbreding dikwels gepaard gaan met 'n beduidende verandering in piekvorm, en piekstert is meer algemeen as voor-piek of splitsing.
Elkeen van hierdie kwessies is breedvoerig bespreek in vorige uitgawes van Probleemoplossing LC, en lesers wat in hierdie onderwerpe belangstel, kan na hierdie vorige artikels verwys vir inligting oor die grondoorsake en moontlike oplossings vir hierdie kwessies.Meer besonderhede.
Piekstert, piekfronting en splitsing kan almal deur chemiese of fisiese verskynsels veroorsaak word, en die lys van potensiële oplossings vir hierdie probleme verskil baie, afhangende van of ons met 'n chemiese of fisiese probleem te doen het. Dikwels, deur die verskillende pieke in 'n chromatogram te vergelyk, kan jy belangrike leidrade vind oor wat die oorsaak is van die soortgelyke oorsaak, of nie die meeste van die oorsake nie. fisies.As slegs een of 'n paar pieke aangetas word, maar die res lyk goed, is die oorsaak heel waarskynlik chemies.
Die chemiese oorsake van piekstertvorming is te kompleks om kortliks hier te bespreek. Die belangstellende leser word verwys na die onlangse uitgawe van "LC Troubleshooting" vir 'n meer in-diepte bespreking (10). 'n Maklike ding om te probeer is egter om die massa van die ingespuite analiet te verminder en te kyk of die piekvorm verbeter. Indien wel, dan is dit 'n goeie idee dat die massa oorlading in hierdie geval beperk is. , of die chromatografiese toestande moet verander word sodat goeie piekvorms verkry kan word selfs met groter massas wat ingespuit word.
Daar is ook baie potensiële fisiese redes vir piekstert.Lesers wat belangstel in 'n gedetailleerde bespreking van die moontlikhede word verwys na 'n ander onlangse uitgawe van "LC Troubleshooting" (11). Een van die meer algemene fisiese oorsake van piekstert is 'n swak verbinding by 'n punt tussen die inspuiter en detektor (12). 'n Uiterste voorbeeld word getoon in Figuur 1d. ve wat ons nie voorheen gebruik het nie, en het 'n klein volume inspuitlus geïnstalleer met 'n ferrule wat op 'n vlekvrye staal kapillêre gegiet was.Na 'n paar aanvanklike foutopsporings-eksperimente, het ons besef dat die poortdiepte in die inspuitklepstator baie dieper was as waaraan ons gewoond was, wat 'n groot dooie volume aan die onderkant van die buis tot gevolg gehad het. na die regte posisie om die dooie volume aan die onderkant van die hawe uit te skakel.
Piekfronte soos dié wat in Figuur 1e getoon word, kan ook deur fisiese of chemiese probleme veroorsaak word. 'n Algemene fisiese oorsaak van die voorrand is dat die deeltjiebed van die kolom nie goed gepak is nie, of dat die deeltjies met verloop van tyd herorganiseer het. Soos met piekstertvorming wat deur hierdie fisiese verskynsel veroorsaak word, is die beste manier om dit reg te stel om die piekvorm te vervang en voort te gaan met 'n chemikalie wat nie van oorsprong af is nie. tensietoestande.Onder ideale (lineêre) toestande is die hoeveelheid analiet wat deur die stilstaande fase (dus die retensiefaktor) behou word, lineêr verwant aan die konsentrasie van die analiet in die kolom. Chromatografies beteken dit dat as die massa analiet wat in die kolom ingespuit word toeneem, die piek groter word, maar nie wyer nie. Hierdie verhouding word verbreek as die piek meer lang is, maar nie meer breed nie, maar ook nie langer as die retensie is nie, maar ook nie meer lang nie. ed.Daarbenewens bepaal nie-lineêre vorms die vorm van chromatografiese pieke, wat lei tot voor- of agterkante. Soos met massa-oorlading wat piekstert veroorsaak (10), kan piekleier wat deur nie-lineêre retensie veroorsaak word, ook gediagnoseer word deur die ingespuite analietmassa te verminder. As piekvorm verbeter, moet die metode nie die gehalte van die voorste oorskry nie, moet die gehalte verander word om die gehalte te oorskry. hierdie gedrag naboots.
Soms neem ons waar wat lyk na 'n "gesplete" piek, soos getoon in Figuur 1f. Die eerste stap om hierdie probleem op te los is om te bepaal of die piekvorm te wyte is aan gedeeltelike ko-eluering (dws die teenwoordigheid van twee afsonderlike, maar nou eluerende verbindings). As daar eintlik twee verskillende analiete is wat naby mekaar elueer, dan is dit 'n selektiewe resolusie, of hertelling, byvoorbeeld, plaat en die oënskynlike "gesplete" pieke hou verband met fisiese Prestasie het niks met die kolom self te doen nie.Dikwels is die belangrikste leidraad vir hierdie besluit of alle pieke in die chromatogram gesplete vorms vertoon, of net een of twee. As dit net een of twee is, is dit waarskynlik 'n ko-elueringskwessie;as alle pieke verdeel is, is dit waarskynlik 'n fisiese probleem, heel waarskynlik verwant aan die kolom self.
Gesplete pieke wat verband hou met die fisiese eienskappe van die kolom self is gewoonlik as gevolg van gedeeltelik verstopte inlaat- of uitlaatfritte, of herorganisasie van deeltjies in die kolom, wat die mobiele fase in sekere areas van die kolomkanaalformasie vinniger laat vloei .in ander streke (11). Gedeeltelik verstopte frit kan soms skoongemaak word deur die vloei deur die kolom om te keer;volgens my ervaring is dit egter gewoonlik 'n korttermyn- eerder as 'n langtermyn-oplossing. Dit is dikwels noodlottig met moderne kolomme as die deeltjies binne die kolom herkombineer. Op hierdie punt is dit die beste om die kolom te vervang en voort te gaan.
Die piek in Figuur 1g, ook van 'n onlangse geval in my eie laboratorium, dui gewoonlik aan dat die sein so hoog is dat dit die hoë kant van die reaksiereeks bereik het. Vir optiese absorpsie-detektors (UV-vis in hierdie geval), wanneer die analietkonsentrasie baie hoog is, absorbeer die analiet die meeste van die lig wat deur die detektorvloeisel gaan, en laat die baie min lig onder hierdie toestande bespeur word deur die verskillende toestande. bronne van geraas, soos verdwaalde lig en "donker stroom", maak die sein baie "vaag" in voorkoms en onafhanklik van analiet konsentrasie.Wanneer dit gebeur, kan die probleem dikwels maklik opgelos word deur die inspuitvolume van die analiet te verminder—die inspuitvolume te verminder, die monster te verdun, of albei.
In die chromatografiese skool gebruik ons ​​die detektorsignaal (dit wil sê die y-as in die chromatogram) as 'n aanduiding van die analietkonsentrasie in die monster. SO lyk dit vreemd om 'n chromatogram met 'n sein onder nul te sien, aangesien die eenvoudige interpretasie is dat dit 'n negatiewe analietkonsentrasie aandui-watter natuurlik nie gebruik word nie. .
In hierdie geval beteken 'n negatiewe piek eenvoudig dat die molekules wat uit die kolom elueer minder lig absorbeer as die mobiele fase self onmiddellik voor en na die piek. Dit kan byvoorbeeld voorkom wanneer relatief lae deteksie golflengtes (<230 nm) en mobiele fase bymiddels gebruik word wat die meeste van die lig by hierdie golflengtes absorbeer. Sulke bymiddels kan in werklikheid negatiewe asetaatkomponente soos metanol-fase-oplosmiddel of buffer-komponente soos metanol-asetaat-komponente gebruik, of kan eintlik negatiewe asetaat-komponente wees. s om 'n kalibrasiekromme voor te berei en akkurate kwantitatiewe inligting te verkry, so daar is geen fundamentele rede om dit per se te vermy nie (hierdie metode word soms na verwys as "indirekte UV-deteksie") (13). As ons egter werklik negatiewe pieke heeltemal wil vermy, in die geval van absorpsie-opsporing, is die beste oplossing om 'n ander opsporingsgolflengte te gebruik as die analietfase meer absorbeer as die mobiele samestelling van die analietfase, sodat hulle minder absorbeer as die mobiele samestelling van die lig absorbeer of die lig absorbeer. .
Negatiewe pieke kan ook verskyn wanneer brekingsindeks (RI) opsporing gebruik word wanneer die brekingsindeks van komponente anders as die analiet in die monster, soos die oplosmiddelmatriks, verskil van die brekingsindeks van die mobiele fase. Dit gebeur ook met UV-vis opsporing, maar hierdie effek is geneig om verswak te word relatief tot RI bespeuring. mobiele fase.
In deel drie oor die basiese onderwerp van LC-foutsporing, het ek situasies bespreek waarin die waargenome piekvorm verskil van die verwagte of normale piekvorm. Doeltreffende foutopsporing van sulke probleme begin met kennis van verwagte piekvorms (gebaseer op teorie of vorige ondervinding met bestaande metodes), dus is afwykings van hierdie verwagtinge duidelik. In hierdie potensiële wye vormprobleme het ek baie verskillende, ens. in detail sommige van die redes wat ek die meeste sien.Om hierdie besonderhede te ken, bied 'n goeie plek om foutsporing te begin, maar vang nie alle moontlikhede in nie.Lesers wat belangstel in 'n meer in-diepte lys van oorsake en oplossings kan na die LCGC "LC Troubleshooting Guide"-muurkaart verwys.
(4) LCGC “LC Troubleshooting Guide” muurkaart.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data-analise en seinverwerking in chromatografie (Elsevier, New York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF en Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.