Dankie dat jy Nature.com besoek het.Die blaaierweergawe wat jy gebruik het beperkte CSS-ondersteuning.Vir die beste ervaring, beveel ons aan dat jy 'n opgedateerde blaaier gebruik (of versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer).In die tussentyd, om volgehoue ​​ondersteuning te verseker, sal ons die webwerf sonder style en JavaScript weergee.
Vloeibare biopsie (LB) is 'n konsep wat vinnig gewild raak in die biomediese veld.Die konsep is hoofsaaklik gebaseer op die opsporing van fragmente van sirkulerende ekstrasellulêre DNA (ccfDNA), wat hoofsaaklik as klein fragmente vrygestel word na seldood in verskeie weefsels.'n Klein deel van hierdie fragmente is afkomstig van vreemde (vreemde) weefsels of organismes.In huidige werk het ons hierdie konsep toegepas op mossels, 'n sentinelspesie wat bekend is vir hul hoë seewaterfiltrasievermoë.Ons gebruik die vermoë van mossels om as natuurlike filters op te tree om omgewings-DNS-fragmente van 'n verskeidenheid bronne vas te vang om inligting te verskaf oor die biodiversiteit van mariene kus-ekosisteme.Ons resultate toon dat mosselhemolif DNS-fragmente bevat wat baie in grootte verskil, van 1 tot 5 kb.Haelgeweervolgordebepaling het getoon dat 'n groot aantal DNS-fragmente van vreemde mikrobiese oorsprong is.Onder hulle het ons DNA-fragmente van bakterieë, archaea en virusse gevind, insluitend virusse wat bekend is om 'n verskeidenheid gashere te besmet wat algemeen in mariene kus-ekosisteme voorkom.Ten slotte, ons studie demonstreer dat die konsep van LB toegepas op mossels 'n ryk, maar nog onontginde bron van kennis oor mikrobiese diversiteit in mariene kus-ekosisteme verteenwoordig.
Die impak van klimaatsverandering (CC) op die biodiversiteit van mariene ekosisteme is 'n vinnig groeiende gebied van navorsing.Aardverwarming veroorsaak nie net belangrike fisiologiese spanning nie, maar stoot ook die evolusionêre grense van die termiese stabiliteit van mariene organismes uit, wat die habitat van 'n aantal spesies beïnvloed, wat hulle aanspoor om na gunstiger toestande te soek [1, 2].Benewens die affektering van die biodiversiteit van metazoë, ontwrig CC die delikate balans van gasheer-mikrobiese interaksies.Hierdie mikrobiese disbakteriose hou 'n ernstige bedreiging in vir mariene ekosisteme aangesien dit mariene organismes meer vatbaar maak vir aansteeklike patogene [3, 4].Daar word geglo dat SS 'n belangrike rol speel in massasterftes, wat 'n ernstige probleem is vir die bestuur van globale mariene ekosisteme [5, 6].Dit is 'n belangrike kwessie gegewe die ekonomiese, ekologiese en voedingsimpak van baie mariene spesies.Dit is veral waar vir tweekleppers wat in die poolstreke woon, waar die effekte van CK meer onmiddellik en ernstig is [6, 7].Trouens, tweekleppers soos Mytilus spp.word wyd gebruik om die uitwerking van CC op mariene ekosisteme te monitor.Nie verrassend nie, is 'n relatief groot aantal biomerkers ontwikkel om hul gesondheid te monitor, dikwels met behulp van 'n tweevlak-benadering wat funksionele biomerkers behels wat gebaseer is op ensiematiese aktiwiteit of sellulêre funksies soos sellewensvatbaarheid en fagositiese aktiwiteit [8].Hierdie metodes sluit ook die meting van die konsentrasie van spesifieke drukaanwysers in wat in sagte weefsel ophoop na die absorpsie van groot hoeveelhede seewater.Die hoë filtrasiekapasiteit en semi-oop sirkulasiestelsel van tweekleppers bied egter 'n geleentheid om nuwe hemolymf-biomerkers te ontwikkel deur die konsep van vloeibare biopsie (LB), 'n eenvoudige en minimaal indringende benadering tot pasiëntbestuur.bloedmonsters [9, 10].Alhoewel verskeie tipes sirkulerende molekules in menslike LB gevind kan word, is hierdie konsep hoofsaaklik gebaseer op DNA-volgordebepalingsanalise van sirkulerende ekstrasellulêre DNA (ccfDNA) fragmente in plasma.Trouens, die teenwoordigheid van sirkulerende DNA in menslike plasma is sedert die middel van die 20ste eeu bekend [11], maar dit is eers in onlangse jare dat die koms van hoë-deurset-volgordebepalingsmetodes gelei het tot kliniese diagnose gebaseer op ccfDNA.Die teenwoordigheid van hierdie sirkulerende DNA-fragmente is deels te wyte aan die passiewe vrystelling van genomiese DNA (kern en mitochondriale) na seldood. In gesonde individue is die konsentrasie van ccfDNA normaalweg laag (<10 ng/ml), maar kan met 5-10 keer verhoog word by pasiënte wat aan verskeie patologieë ly of aan stres onderwerp word, wat lei tot weefselskade. In gesonde individue is die konsentrasie van ccfDNA normaalweg laag (<10 ng/ml), maar kan met 5-10 keer verhoog word by pasiënte wat aan verskeie patologieë ly of aan stres onderwerp word, wat lei tot weefselskade. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/mл), nie может повышаться в 5–10 teen 5-10 s. логией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. By gesonde mense is die konsentrasie van cccDNA normaalweg laag (<10 ng/ml), maar dit kan met 5–10 keer toeneem by pasiënte met verskeie patologieë of onder stres wat tot weefselskade lei.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理戅嚏嚏嚗嚗嚏嚏嚗嚏嚗嚏嚏加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 刖 旅理 刖可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Gesonde ccfDNA-weergawe (<10 ng/ml) en nie meer as 5-10 jaar nie. логиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA-konsentrasies is gewoonlik laag (<10 ng/ml) in gesonde individue, maar kan 5-10-voudig verhoog word by pasiënte met verskeie patologieë of stres, wat lei tot weefselskade.Die grootte van ccfDNA-fragmente verskil baie, maar wissel gewoonlik van 150 tot 200 bp.[12].Analise van self-afgeleide ccfDNA, dws ccfDNA van normale of getransformeerde gasheerselle, kan gebruik word om genetiese en epigenetiese veranderinge wat teenwoordig is in die kern- en/of mitochondriale genoom op te spoor, om sodoende klinici te help om spesifieke molekulêre-gerigte terapieë te kies [13].ccfDNA kan egter verkry word vanaf vreemde bronne soos ccfDNA van fetale selle tydens swangerskap of van oorgeplante organe [14,15,16,17].ccfDNA is ook 'n belangrike bron van inligting vir die opsporing van die teenwoordigheid van nukleïensure van 'n aansteeklike middel (vreemde), wat nie-indringende opsporing van wydverspreide infeksies wat nie deur bloedkulture geïdentifiseer word nie moontlik maak, wat indringende biopsie van besmette weefsel vermy [18].Onlangse studies het inderdaad getoon dat menslike bloed 'n ryk bron van inligting bevat wat gebruik kan word om virale en bakteriële patogene te identifiseer, en dat ongeveer 1% van die ccfDNA wat in menslike plasma gevind word, van vreemde oorsprong is [19].Hierdie studies demonstreer dat die biodiversiteit van 'n organisme se sirkulerende mikrobioom met behulp van ccfDNA-analise geassesseer kan word.Hierdie konsep is egter tot onlangs uitsluitlik by mense gebruik en, in 'n mindere mate, in ander gewerwelde diere [20, 21].
In die huidige referaat gebruik ons ​​die LB-potensiaal om die ccfDNA van Aulacomya atra te ontleed, 'n suidelike spesie wat algemeen in die subantarktiese Kerguelen-eilande voorkom, 'n groep eilande bo-op 'n groot plato wat 35 miljoen jaar gelede gevorm het.volkaniese uitbarsting.Deur 'n in vitro eksperimentele stelsel te gebruik, het ons gevind dat DNS-fragmente in seewater vinnig deur mossels opgeneem word en die hemolimfkompartement binnedring.Haelgeweervolgordebepaling het getoon dat mosselhemolymf ccfDNA DNA-fragmente van sy eie en nie-selfoorsprong bevat, insluitend simbiotiese bakterieë en DNS-fragmente van biome tipies van koue vulkaniese mariene kus-ekosisteme.Hemolymph ccfDNA bevat ook virale volgordes afgelei van virusse met verskillende gasheerreekse.Ons het ook DNS-fragmente van meersellige diere soos beenvisse, seeanemone, alge en insekte gevind.Ten slotte, ons studie demonstreer dat die LB-konsep suksesvol toegepas kan word op mariene ongewerweldes om 'n ryk genomiese repertorium in mariene ekosisteme te genereer.
Volwassenes (55-70 mm lank) Mytilus platensis (M. platensis) en Aulacomya atra (A. atra) is versamel vanaf die tussengety rotsagtige kus van Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 O.).Kerguelen-eilande in Desember 2018. Ander volwasse bloumossels (Mytilus spp.) is verkry van 'n kommersiële verskaffer (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) en geplaas in 'n temperatuurbeheerde (4°C) deurlugte tenk wat 10–20 L van 32‰ kunsmatige pekelwater bevat.(kunsmatige seesout Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, VSA).Vir elke eksperiment is die lengte en gewig van individuele skulpe gemeet.
'n Gratis ooptoegangprotokol vir hierdie program is aanlyn beskikbaar (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Kortliks, LB-hemolymf is versamel van ontvoerderspiere soos beskryf [22].Die hemolimf is geklaar deur sentrifugering by 1200×g vir 3 minute, die supernatant is gevries (-20°C) tot gebruik.Vir isolasie en suiwering van cfDNA, is monsters (1,5-2,0 ml) ontdooi en verwerk met behulp van die NucleoSnap cfDNA-stel (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) volgens die vervaardiger se instruksies.ccfDNA is by -80°C gestoor tot verdere ontleding.In sommige eksperimente is ccfDNA geïsoleer en gesuiwer met behulp van die QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada).Gesuiwerde DNA is gekwantifiseer deur 'n standaard PicoGreen-toets te gebruik.Die fragmentverspreiding van die geïsoleerde ccfDNA is ontleed deur kapillêre elektroforese met behulp van 'n Agilent 2100 bio-ontleder (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) met behulp van 'n Hoë Sensitiwiteit DNA Kit.Die toets is uitgevoer met behulp van 1 µl van die ccfDNA-monster volgens die vervaardiger se instruksies.
Vir volgordebepaling van hemolymph ccfDNA-fragmente, het Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) haelgeweerbiblioteke voorberei met behulp van die Illumina DNA Mix-stel van die Illumina MiSeq PE75-stel.'n Standaardadapter (BioO) is gebruik.Rou datalêers is beskikbaar vanaf die NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 en SRR8924809).Basiese leeskwaliteit is geassesseer met behulp van FastQC [23].Trimmomatic [24] is gebruik vir knipadapters en lees van swak gehalte.Haelgeweerlesings met gepaarde punte is FLASH saamgevoeg in langer enkellesings met 'n minimum oorvleueling van 20 bp om wanpassings te vermy [25]. Saamgevoegde leesstukke is geannoteer met BLASTN met behulp van 'n tweekleppige NCBI Taksonomie-databasis (e-waarde <1e-3 en 90% homologie), en maskering van lae-kompleksiteit-volgordes is uitgevoer met behulp van DUST [26]. Saamgevoegde leesstukke is geannoteer met BLASTN met behulp van 'n tweekleppige NCBI Taksonomie-databasis (e-waarde <1e-3 en 90% homologie), en maskering van lae-kompleksiteit-volgordes is uitgevoer met behulp van DUST [26]. (Ontwikkeling is beskikbaar by BLASTN met die beskikking van 'n professionele <BIETS) 1e-3 en 90% гомологии). Gepoelde leesstukke is geannoteer met BLASTN deur gebruik te maak van die NCBI tweekleppige taksonomie databasis (e waarde < 1e-3 en 90% homologie), en lae kompleksiteit volgorde maskering is uitgevoer met behulp van DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的缿甌DUST 2低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 诽濹 读濹 2]行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данныхна манных двуNC е e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использов [26]. Gepoelde lesings is geannoteer met BLASTN deur gebruik te maak van die NCBI tweekleppige taksonomiese databasis (e waarde <1e-3 en 90% homologie), en lae kompleksiteit volgorde maskering is uitgevoer met behulp van DUST [26].Lees is in twee groepe verdeel: verwant aan tweekleppige volgordes (hier genoem self-lees) en onverwante (nie-self-lees).Twee groepe is afsonderlik saamgestel met MEGAHIT om contigs te genereer [27].Intussen is die taksonomiese verspreiding van uitheemse mikrobioomlesings geklassifiseer met Kraken2 [28] en grafies voorgestel deur 'n Krona-sirkelgrafiek op Galaxy [29, 30].Die optimale kmers is bepaal as kmers-59 uit ons voorlopige eksperimente. Selfkontigs is dan geïdentifiseer deur belyning met BLASTN (tweeklep NCBI databasis, e waarde < 1e−10 en 60% homologie) vir 'n finale annotasie. Selfkontigs is dan geïdentifiseer deur belyning met BLASTN (tweeklep NCBI databasis, e waarde < 1e−10 en 60% homologie) vir 'n finale annotasie. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (byvoorbeeld deur middel van BLASTN) и гомология 60%) для окончательной аннотации. Self-kontigs is dan geïdentifiseer deur passing teen BLASTN (NCBI tweekleppige databasis, e waarde <1e-10 en 60% homologie) vir finale annotasie.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐齐饿识别最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги vir окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (беспоставления с BLASTN) х моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Self-kontigs is dan geïdentifiseer vir finale annotasie deur passing teen BLASTN (NCBI tweekleppige databasis, e waarde <1e-10 en 60% homologie). Terselfdertyd is nie-selfgroepkontigs geannoteer met BLASTN (nt NCBI databasis, e waarde <1e−10 en 60% homologie). Terselfdertyd is nie-selfgroepkontigs geannoteer met BLASTN (nt NCBI databasis, e waarde <1e−10 en 60% homologie). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (byvoorbeeld NCBI, teen <10% teen 6%). Terselfdertyd is buitelandse groepkontigs geannoteer met BLASTN (NT NCBI databasis, e waarde <1e-10 en 60% homologie).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (byna 1, 1, 0 и гомология 60%. Terselfdertyd is nie-selfgroepkontigs geannoteer met BLASTN (nt NCBI databasis, e waarde <1e-10 en 60% homologie). BLASTX is ook uitgevoer op nie-self contigs met behulp van die nr en RefSeq proteïen NCBI databasisse (e waarde < 1e−10 en 60% homologie). BLASTX is ook uitgevoer op nie-self contigs met behulp van die nr en RefSeq proteïen NCBI databasisse (e waarde < 1e−10 en 60% homologie). BLASTX is beskikbaar vir несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr en RefSeq NCBI (vanaf 1-0 van 0 jaar) %). BLASTX is ook uitgevoer op nie-self contigs met behulp van die nr en RefSeq NCBI proteïen databasisse (e waarde < 1e-10 en 60% homologie).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧怉 吺 吺还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧怉 吺 吺 Blastx тажж ыыоляли на несамостоятельных контигах с и оолззованием б д да бее к и и и и и и и и з; . BLASTX is ook uitgevoer op nie-self contigs met behulp van die nr en RefSeq NCBI proteïen databasisse (e waarde <1e-10 en 60% homologie).Die BLASTN- en BLASTX-poele van nie-self-kontigs verteenwoordig die finale contigs (sien aanvullende lêer).
Die primers wat vir PCR gebruik word, word in Tabel S1 gelys.Taq DNA-polimerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) is gebruik om die ccfDNA-teikengene te versterk.Die volgende reaksietoestande is gebruik: denaturering by 95°C vir 3 minute, 95°C vir 1 minuut, stel uitgloeitemperatuur vir 1 minuut, verlenging by 72°C vir 1 minuut, 35 siklusse, en uiteindelik 72°C binne 10 minute..PCR-produkte is geskei deur elektroforese in agarose-gels (1.5%) wat SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) by 95 V bevat.
Mossels (Mytilus spp.) is geakklimatiseer in 500 ml suurstofryke seewater (32 PSU) vir 24 uur by 4°C.Plasmied-DNS wat 'n insetsel bevat wat vir die menslike galektien-7 cDNA-volgorde (NCBI-toegangsnommer L07769) kodeer, is by die flessie gevoeg teen 'n finale konsentrasie van 190 μg/μl.Mossels wat onder dieselfde toestande sonder DNA-byvoeging geïnkubeer is, was die kontrole.Die derde beheertenk het DNS sonder mossels bevat.Om die kwaliteit van DNS in seewater te monitor, is seewatermonsters (20 μl; drie herhalings) op die aangeduide tyd uit elke tenk geneem.Vir plasmied DNA-naspeurbaarheid is LB-mossels op die aangeduide tye geoes en deur qPCR en ddPCR ontleed.As gevolg van die hoë soutinhoud van seewater, is aliquots verdun in PCR kwaliteit water (1:10) voor alle PCR toetse.
Digitale druppel PCR (ddPCR) is uitgevoer met behulp van die BioRad QX200 protokol (Mississauga, Ontario, Kanada).Gebruik die temperatuurprofiel om die optimum temperatuur te bepaal (Tabel S1).Druppels is gegenereer met behulp van 'n QX200 druppelgenerator (BioRad).ddPCR is soos volg uitgevoer: 95°C vir 5 min, 50 siklusse van 95°C vir 30 s en 'n gegewe uitgloeiingstemperatuur vir 1 min en 72°C vir 30 s, 4°C vir 5 min en 90°C binne 5 minute.Die aantal druppels en positiewe reaksies (aantal kopieë/µl) is gemeet met 'n QX200 druppelleser (BioRad).Monsters met minder as 10 000 druppels is afgekeur.Patroonbeheer is nie uitgevoer elke keer as ddPCR uitgevoer is nie.
qPCR is uitgevoer met behulp van Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australië) en LGALS7 spesifieke primers.Alle kwantitatiewe PCR's is uitgevoer in 20 µl met behulp van die QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).qPCR is begin met 'n 15 min inkubasie by 95°C gevolg deur 40 siklusse by 95°C vir 10 sekondes en by 60°C vir 60 sekondes met een dataversameling.Smeltkurwes is gegenereer deur gebruik te maak van opeenvolgende metings by 95°C vir 5 s, 65°C vir 60 s en 97°C aan die einde van die qPCR.Elke qPCR is in drievoud uitgevoer, behalwe vir kontrolemonsters.
Aangesien mossels bekend is vir hul hoë filtrasietempo, het ons eers ondersoek of hulle DNA-fragmente wat in seewater teenwoordig is, kan filtreer en behou.Ons was ook geïnteresseerd in of hierdie fragmente in hul semi-oop limfatiese stelsel ophoop.Ons het hierdie probleem eksperimenteel opgelos deur die lot van oplosbare DNS-fragmente wat by bloumosseltenks gevoeg is, op te spoor.Om die opsporing van DNA-fragmente te fasiliteer, het ons vreemde (nie self) plasmied-DNA gebruik wat die menslike galektien-7-geen bevat.ddPCR spoor plasmied DNA-fragmente in seewater en mossels op.Ons resultate toon dat indien die hoeveelheid DNS-fragmente in seewater relatief konstant gebly het oor tyd (tot 7 dae) in die afwesigheid van mossels, dan het hierdie vlak in die teenwoordigheid van mossels amper heeltemal binne 8 uur verdwyn (Fig. 1a,b).Fragmente van eksogene DNA is maklik binne 15 min in intravalvulêre vloeistof en hemolymf opgespoor (Fig. 1c).Hierdie fragmente kon nog tot 4 uur na blootstelling opgespoor word.Hierdie filteraktiwiteit met betrekking tot DNA-fragmente is vergelykbaar met die filteraktiwiteit van bakterieë en alge [31].Hierdie resultate dui daarop dat mossels vreemde DNA in hul vloeistofkompartemente kan filtreer en ophoop.
Relatiewe konsentrasies van plasmied DNA in seewater in die teenwoordigheid (A) of afwesigheid (B) van mossels, gemeet deur ddPCR.In A word die resultate as persentasies uitgedruk, met die grense van die blokkies wat die 75ste en 25ste persentiele verteenwoordig.Die toegeruste logaritmiese kurwe word in rooi getoon, en die area wat in grys geskakeer is, verteenwoordig die 95% vertrouensinterval.In B verteenwoordig die rooi lyn die gemiddelde en die blou lyn verteenwoordig die 95% vertrouensinterval vir die konsentrasie.C Ophoping van plasmied-DNA in die hemolimf en klepvloeistof van mossels op verskillende tye na die byvoeging van plasmied-DNS.Resultate word aangebied as absolute kopieë waargeneem/ml (±SE).
Vervolgens het ons die oorsprong van ccfDNA ondersoek in mossels wat versamel is vanaf mosselbeddings op die Kerguelen-eilande, 'n afgeleë groep eilande met beperkte antropogeniese invloed.Vir hierdie doel is cccDNA van mosselhemolife geïsoleer en gesuiwer deur metodes wat algemeen gebruik word om menslike cccDNA te suiwer [32, 33].Ons het gevind dat gemiddelde hemolimf-ccfDNA-konsentrasies in mossels in die lae mikrogram per ml hemolimfreeks is (sien Tabel S2, Aanvullende Inligting).Hierdie reeks konsentrasies is baie groter as in gesonde mense (lae nanogram per milliliter), maar in seldsame gevalle, in kankerpasiënte, kan die vlak van ccfDNA verskeie mikrogram per milliliter bereik [34, 35].'n Ontleding van die grootteverspreiding van hemolimf ccfDNA het getoon dat hierdie fragmente baie verskil in grootte, wat wissel van 1000 bp tot 1000 bp.tot 5000 bp (Fig. 2).Soortgelyke resultate is verkry met behulp van die silika-gebaseerde QIAamp Investigator Kit, 'n metode wat algemeen in forensiese wetenskap gebruik word om genomiese DNA vinnig te isoleer en te suiwer uit lae konsentrasie DNA-monsters, insluitend ccfDNA [36].
Verteenwoordigende ccfDNA elektroforegram van mosselhemolif.Onttrek met NucleoSnap Plasma Kit (bo) en QIAamp DNA Investigator Kit.B Vioolgrafiek wat die verspreiding van hemolimf ccfDNA-konsentrasies (±SE) in mossels toon.Die swart en rooi lyne verteenwoordig onderskeidelik die mediaan en die eerste en derde kwartiele.
Ongeveer 1% van ccfDNA in mense en primate het 'n vreemde bron [21, 37].Gegewe die semi-oop bloedsomloopstelsel van tweekleppige diere, mikrobiese ryk seewater, en die grootteverspreiding van mossel ccfDNA, het ons veronderstel dat mossel hemolymph ccfDNA 'n ryk en diverse poel van mikrobiese DNA kan bevat.Om hierdie hipotese te toets, het ons hemolimf ccfDNA van Aulacomya atra-monsters wat van die Kerguelen-eilande versamel is, op volgorde gerangskik, wat meer as 10 miljoen leesstukke opgelewer het, waarvan 97.6% kwaliteitbeheer geslaag het.Die lesings is dan geklassifiseer volgens self en nie-self bronne deur gebruik te maak van die BLASTN en NCBI tweekleppige databasisse (Fig. S1, Aanvullende Inligting).
By mense kan beide kern- en mitochondriale DNA in die bloedstroom vrygestel word [38].In die huidige studie was dit egter nie moontlik om die kerngenoom-DNS van mossels in detail te beskryf nie, aangesien die A. atra-genoom nie in volgorde of beskryf is nie.Ons kon egter 'n aantal ccfDNA-fragmente van ons eie oorsprong identifiseer deur die tweekleppige biblioteek te gebruik (Fig. S2, Aanvullende Inligting).Ons het ook die teenwoordigheid van DNA-fragmente van ons eie oorsprong bevestig deur gerigte PCR-amplifikasie van daardie A. atra-gene wat in volgorde geplaas is (Fig. 3).Net so, gegewe dat die mitochondriale genoom van A. atra beskikbaar is in publieke databasisse, kan 'n mens bewyse vind vir die teenwoordigheid van mitochondriale ccfDNA-fragmente in die hemolimf van A. atra.Die teenwoordigheid van mitochondriale DNA-fragmente is bevestig deur PCR-amplifikasie (Fig. 3).
Verskeie mitochondriale gene was teenwoordig in die hemolimf van A. atra (rooi kolletjies – voorraadnommer: SRX5705969) en M. platensis (blou kolletjies – voorraadnommer: SRX5705968) versterk deur PCR.Figuur aangepas van Breton et al., 2011 B Amplifikasie van hemolimf supernatant van A. atra Geberg op FTA papier.Gebruik 'n 3 mm-pons om direk by die PCR-buis wat die PCR-mengsel bevat, te voeg.
Gegewe die oorvloedige mikrobiese inhoud in seewater, het ons aanvanklik gefokus op die karakterisering van mikrobiese DNA-volgordes in hemolimf.Om dit te doen, gebruik ons ​​twee verskillende strategieë.Die eerste strategie gebruik Kraken2, 'n algoritme-gebaseerde volgorde klassifikasie program wat mikrobiese rye kan identifiseer met 'n akkuraatheid vergelykbaar met BLAST en ander gereedskap [28].Daar is vasgestel dat meer as 6719 lesings van bakteriese oorsprong was, terwyl 124 en 64 van onderskeidelik archaea en virusse was (Fig. 4).Die volopste bakteriese DNA-fragmente was Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) en Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a).Hierdie verspreiding stem ooreen met vorige studies van die mariene bloumosselmikrobioom [39, 40].Gammaproteobakterieë was die hoofklas van Proteobakterieë (44%), insluitend baie Vibrionales (Fig. 4b).Die ddPCR metode het die teenwoordigheid van Vibrio DNA fragmente in die ccfDNA van A. atra hemolymph (Fig. 4c) [41] bevestig.Om meer inligting oor die bakteriële oorsprong van ccfDNA te verkry, is 'n bykomende benadering geneem (Fig. S2, Aanvullende Inligting). In hierdie geval, lees wat oorvleuel is saamgestel as gepaarde-end lees en is geklassifiseer as van self (tweekleppers) of nie-self oorsprong deur gebruik te maak van BLASTN en 'n e waarde van 1e−3 en 'n afsnypunt met >90% homologie. In hierdie geval, lees wat oorvleuel is saamgestel as gepaarde-end lees en is geklassifiseer as van self (tweekleppers) of nie-self oorsprong deur gebruik te maak van BLASTN en 'n e waarde van 1e−3 en 'n afsnypunt met >90% homologie. (Het is moontlik om te verseker dat dit moontlik is om te verseker dat dit moontlik is om te werk te gaan ворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN en значения e 1e-3 en отсечения> met 90%. In hierdie geval is oorvleuelende lesings versamel as gepaarde-einde-lesings en is geklassifiseer as inheems (tweekleppig) of nie-oorspronklik deur gebruik te maak van BLASTN en e-waarde van 1e-3 en afsnypunt met >90% homologie.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 皒倢 暧倢倢倢倢倢倢倢倢e值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使缄 嚄 缄的的的的的的 的和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами en классианфицович ые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN en 1e-3 en порога гомолога. In hierdie geval is oorvleuelende lesings ingesamel as gepaardgaande leeslesings en geklassifiseer as eie (tweekleppers) of nie-oorspronklik met behulp van e BLASTN- en 1e-3-waardes en 'n homologiedrempel >90%.Aangesien die A. atra-genoom nog nie georden is nie, het ons die de novo-samestellingstrategie van die MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS)-samesteller gebruik.Altesaam 147 188 contigs is geïdentifiseer as afhanklike (tweekleppige) van oorsprong.Hierdie contigs is toe ontplof met e-waardes van 1e-10 met behulp van BLASTN en BLASTX.Hierdie strategie het ons in staat gestel om 482 nie-tweekleppige fragmente teenwoordig in A. atra ccfDNA te identifiseer.Meer as die helfte (57%) van hierdie DNS-fragmente is van bakterieë verkry, hoofsaaklik van kieusimbiote, insluitend sulfotrofiese simbiote, en van kieusimbiote Solemya velum (Fig. 5).
Relatiewe oorvloed op tipe vlak.B Mikrobiese diversiteit van twee hooffilums (Firmicutes en Proteobacteria).Verteenwoordigende amplifikasie van ddPCR C Vibrio spp.A. Fragmente van die 16S rRNA geen (blou) in drie atra hemolife.
'n Totaal van 482 versamelde contigs is ontleed.Algemene profiel van die taksonomiese verspreiding van metagenomiese aantekeninge (prokariote en eukariote).B Gedetailleerde verspreiding van bakteriese DNA-fragmente geïdentifiseer deur BLASTN en BLASTX.
Kraken2-ontleding het ook getoon dat mossel-ccfDNA argaeale DNA-fragmente bevat, insluitend DNS-fragmente van Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) en Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a).Die teenwoordigheid van DNS-fragmente afkomstig van Euryarchaeota en Crenarchaeota, wat voorheen in die mikrobiese gemeenskap van Kaliforniese mossels gevind is, behoort nie as 'n verrassing te kom nie [42].Alhoewel Euryarchaeota dikwels met uiterste toestande geassosieer word, word dit nou erken dat beide Euryarchaeota en Crenarcheota van die mees algemene prokariote in die mariene kryogeniese omgewing is [43, 44].Die teenwoordigheid van metanogene mikroörganismes in mossels is nie verbasend nie, gegewe onlangse verslae van uitgebreide metaanlekke vanaf bodemlekkasies op die Kerguelen-plato [45] en moontlike mikrobiese metaanproduksie wat langs die kus van die Kerguelen-eilande waargeneem is [46].
Ons aandag het toe verskuif na lesings van DNS-virusse.Sover ons kennis strek, is dit die eerste buite-teikenstudie van die virusinhoud van mossels.Soos verwag, het ons DNA-fragmente van bakteriofage (Caudovirales) gevind (Fig. 6b).Die mees algemene virale DNA kom egter van 'n filum van nukleositovirusse, ook bekend as die nukleêre sitoplasmiese groot DNA-virus (NCLDV), wat die grootste genoom van enige virus het.Binne hierdie filum behoort die meeste DNS-volgordes aan die families Mimimidoviridae (58%) en Poxviridae (21%), wie se natuurlike gashere gewerwelde diere en geleedpotiges insluit, terwyl 'n klein deel van hierdie DNS-volgordes aan bekende virologiese alge behoort.Infekteer mariene eukariotiese alge.Die volgordes is ook verkry vanaf die Pandora-virus, die reuse-virus met die grootste genoomgrootte van enige bekende virale genera.Interessant genoeg was die reeks gashere wat bekend is dat hulle met die virus besmet is, soos bepaal deur hemolymph ccfDNA-volgordebepaling, relatief groot (Figuur S3, Aanvullende Inligting).Dit sluit virusse in wat insekte soos Baculoviridae en Iridoviridae besmet, asook virusse wat amoebes, alge en gewerwelde diere besmet.Ons het ook rye gevind wat ooreenstem met die Pithovirus sibericum genoom.Pitovirusse (ook bekend as "zombievirusse") is die eerste keer geïsoleer van 30 000 jaar oue permafrost in Siberië [47].Ons resultate stem dus ooreen met vorige verslae wat toon dat nie alle moderne spesies van hierdie virusse uitgesterf het nie [48] en dat hierdie virusse in afgeleë subarktiese mariene ekosisteme teenwoordig kan wees.
Laastens het ons getoets om te sien of ons DNS-fragmente van ander veelsellige diere kon vind.'n Totaal van 482 buitelandse kontiges is geïdentifiseer deur BLASTN en BLASTX met nt, nr en RefSeq biblioteke (genomies en proteïen).Ons resultate toon dat onder die vreemde fragmente van ccfDNA van meersellige diere DNS van benige bene oorheers (Fig. 5).DNS-fragmente van insekte en ander spesies is ook gevind.'n Relatief groot deel van die DNS-fragmente is nie geïdentifiseer nie, moontlik as gevolg van die onderverteenwoordiging van 'n groot aantal mariene spesies in genomiese databasisse in vergelyking met landspesies [49].
In die huidige referaat pas ons die LB-konsep op mossels toe, met die argument dat hemolymph ccfDNA skootvolgordebepaling insig kan gee in die samestelling van mariene kus-ekosisteme.Ons het veral gevind dat 1) mosselhemolif relatief hoë konsentrasies (mikrogramvlakke) van relatief groot (~1-5 kb) sirkulerende DNS-fragmente bevat;2) hierdie DNS-fragmente is beide onafhanklik en nie-onafhanklik 3) Onder die vreemde bronne van hierdie DNS-fragmente, het ons bakteriële, argaeale en virale DNS gevind, asook DNS van ander veelsellige diere;4) Die ophoping van hierdie vreemde ccfDNA-fragmente in die hemolimf vind vinnig plaas en dra by tot die interne filteraktiwiteit van mossels.Ten slotte demonstreer ons studie dat die konsep van LB, wat tot dusver hoofsaaklik in die veld van biogeneeskunde toegepas is, 'n ryk, maar onontginde bron van kennis kodeer wat gebruik kan word om die interaksie tussen sentinelspesies en hul omgewing beter te verstaan.
Benewens primate, is ccfDNA-isolasie in soogdiere aangemeld, insluitend muise, honde, katte en perde [50, 51, 52].Ons studie is egter volgens ons kennis die eerste wat die opsporing en volgordebepaling van ccfDNA in mariene spesies met 'n oop sirkulasiestelsel rapporteer.Hierdie anatomiese kenmerk en filtervermoë van mossels kan, ten minste gedeeltelik, die verskillende grootte-eienskappe van sirkulerende DNS-fragmente verklaar in vergelyking met ander spesies.By mense is die meeste DNS-fragmente wat in die bloed sirkuleer klein fragmente wat in grootte wissel van 150 tot 200 bp.met 'n maksimum piek van 167 bp [34, 53].'n Klein maar beduidende gedeelte van DNS-fragmente is tussen 300 en 500 bp groot, en ongeveer 5% is langer as 900 bp.[54].Die rede vir hierdie grootteverspreiding is dat die hoofbron van ccfDNA in plasma voorkom as gevolg van seldood, hetsy as gevolg van seldood of as gevolg van nekrose van sirkulerende hematopoietiese selle in gesonde individue of as gevolg van apoptose van tumorselle by kankerpasiënte (bekend as sirkulerende tumor DNA)., ctDNA).Die grootteverspreiding van hemolimf ccfDNA wat ons in mossels gevind het, het gewissel van 1000 tot 5000 bp, wat daarop dui dat mossel ccfDNA 'n ander oorsprong het.Dit is 'n logiese hipotese, aangesien mossels 'n semi-oop vaskulêre stelsel het en in mariene akwatiese omgewings leef wat hoë konsentrasies mikrobiese genomiese DNA bevat.Trouens, ons laboratoriumeksperimente wat eksogene DNA gebruik, het getoon dat mossels DNA-fragmente in seewater ophoop, ten minste na 'n paar uur word dit afgebreek na sellulêre opname en/of vrygestel en/of in verskeie organisasies gestoor.Gegewe die seldsaamheid van selle (beide prokarioties en eukarioties), sal die gebruik van intravalvulêre kompartemente die hoeveelheid ccfDNA van selfbronne sowel as van vreemde bronne verminder.Met inagneming van die belangrikheid van tweekleppige aangebore immuniteit en die groot aantal sirkulerende fagosiete, het ons verder veronderstel dat selfs vreemde ccfDNA verryk is in sirkulerende fagosiete wat vreemde DNA ophoop by inname van mikroörganismes en/of sellulêre puin.Saamgevat toon ons resultate dat tweekleppige hemolimf ccfDNA 'n unieke bewaarplek van molekulêre inligting is en hul status as 'n skildwagspesie versterk.
Ons data dui daarop dat volgordebepaling en ontleding van bakteriële-afgeleide hemolimf ccfDNA-fragmente sleutelinligting kan verskaf oor die gasheer-bakterieflora en die bakterieë wat in die omliggende mariene ekosisteem teenwoordig is.Skootvolgordebepalingstegnieke het opeenvolgings van die kommensale bakterieë A. atra-kieu aan die lig gebring wat gemis sou word as konvensionele 16S rRNA-identifikasiemetodes gebruik is, deels as gevolg van 'n verwysingsbiblioteekvooroordeel.Trouens, ons gebruik van LB-data wat van M. platensis in dieselfde mossellaag by Kerguelen ingesamel is, het getoon dat die samestelling van kieue-geassosieerde bakteriese simbiote dieselfde was vir beide mosselspesies (Fig. S4, Aanvullende Inligting).Hierdie ooreenkoms van twee geneties verskillende mossels kan die samestelling van bakteriese gemeenskappe in die koue, swaelagtige en vulkaniese afsettings van Kerguelen weerspieël [55, 56, 57, 58].Hoër vlakke van swaelverminderende mikroörganismes is goed beskryf wanneer mossels geoes word vanaf gebioturbeerde kusgebiede [59], soos die kus van Port-au-France.Nog 'n moontlikheid is dat die kommensale mosselflora deur horisontale oordrag beïnvloed kan word [60, 61].Meer navorsing is nodig om die korrelasie tussen die mariene omgewing, seebodemoppervlak en die samestelling van simbiotiese bakterieë in mossels te bepaal.Hierdie studies is tans aan die gang.
Die lengte en konsentrasie van hemolimf ccfDNA, die gemak van suiwering daarvan, en hoë gehalte om vinnige haelgeweer-volgordebepaling moontlik te maak, is van die vele voordele van die gebruik van mossel-ccfDNA om biodiversiteit in mariene kus-ekosisteme te assesseer.Hierdie benadering is veral effektief vir die karakterisering van virale gemeenskappe (virome) in 'n gegewe ekosisteem [62, 63].Anders as bakterieë, archaea en eukariote, bevat virale genome nie filogeneties geconserveerde gene soos 16S-volgordes nie.Ons resultate dui aan dat vloeibare biopsies van aanwyserspesies soos mossels gebruik kan word om relatief groot getalle ccfDNA-virusfragmente te identifiseer wat bekend is om gashere te infekteer wat tipies kus-mariene ekosisteme bewoon.Dit sluit virusse in wat bekend is om protosoë, geleedpotiges, insekte, plante en bakteriële virusse (bv. bakteriofage) te infekteer.'n Soortgelyke verspreiding is gevind toe ons die hemolymf ccfDNA-viroom van bloumossels (M. platensis) wat in dieselfde mossellaag by Kerguelen versamel is, ondersoek het (Tabel S2, Aanvullende Inligting).Haelgeweervolgordebepaling van ccfDNA is inderdaad 'n nuwe benadering wat momentum kry in die studie van die viroom van mense of ander spesies [21, 37, 64].Hierdie benadering is veral nuttig vir die bestudering van dubbelstring-DNA-virusse, aangesien geen enkele geen onder alle dubbelstring-DNS-virusse bewaar word nie, wat die mees diverse en breë klas virusse in Baltimore verteenwoordig [65].Alhoewel die meeste van hierdie virusse ongeklassifiseer bly en virusse van 'n heeltemal onbekende deel van die virale wêreld kan insluit [66], het ons gevind dat die virome en gasheerreekse van die mossels A. atra en M. platensis tussen die twee spesies val.insgelyks (sien figuur S3, bykomende inligting).Hierdie ooreenkoms is nie verbasend nie, aangesien dit 'n gebrek aan selektiwiteit in die opname van DNA teenwoordig in die omgewing kan weerspieël.Toekomstige studies wat gesuiwerde RNA gebruik, is tans nodig om die RNA-viroom te karakteriseer.
In ons studie het ons 'n baie streng pyplyn gebruik wat aangepas is uit die werk van Kowarski en kollegas [37], wat 'n twee-stap-skrapping van saamgevoegde leeswerk en samestellings voor en na samestelling van inheemse ccfDNA gebruik het, wat gelei het tot 'n hoë persentasie ongekarteerde lees.Daarom kan ons nie uitsluit dat sommige van hierdie ongekarteerde leesstukke steeds hul eie oorsprong kan hê nie, hoofsaaklik omdat ons nie 'n verwysingsgenoom vir hierdie mosselspesie het nie.Ons het ook hierdie pyplyn gebruik omdat ons bekommerd was oor die chimeras tussen self- en nie-self-lees en die leeslengtes wat deur die Illumina MiSeq PE75 gegenereer word.Nog 'n rede vir die meeste ongekarteerde lesings is dat baie van die mariene mikrobes, veral in afgeleë gebiede soos Kerguelen, nie geannoteer is nie.Ons het Illumina MiSeq PE75 gebruik, met die veronderstelling dat ccfDNA-fragmentlengtes soortgelyk is aan menslike ccfDNA.Vir toekomstige studies, gegewe ons resultate wat toon dat hemolymph ccfDNA langer lees as mense en/of soogdiere het, beveel ons aan om 'n volgordebepalingsplatform te gebruik wat meer geskik is vir langer ccfDNA-fragmente.Hierdie praktyk sal dit baie makliker maak om meer aanduidings vir dieper ontleding te identifiseer.Die verkryging van die tans onbeskikbare volledige A. atra-kerngenoomvolgorde sal ook die diskriminasie van ccfDNA uit eie- en nie-selfbronne aansienlik vergemaklik.Aangesien ons navorsing gefokus het op die moontlikheid om die konsep van vloeibare biopsie op mossels toe te pas, hoop ons dat, aangesien hierdie konsep in toekomstige navorsing gebruik word, nuwe gereedskap en pyplyne ontwikkel sal word om die potensiaal van hierdie metode te verhoog om die mikrobiese diversiteit van mossels te bestudeer.mariene ekosisteem.
As 'n nie-indringende kliniese biomerker word verhoogde menslike plasmavlakke van ccfDNA geassosieer met verskeie siektes, weefselskade en strestoestande [67,68,69].Hierdie toename word geassosieer met die vrystelling van DNA-fragmente van sy eie oorsprong na weefselskade.Ons het hierdie probleem aangespreek deur akute hittestres te gebruik, waarin mossels kortstondig aan 'n temperatuur van 30 °C blootgestel is.Ons het hierdie analise op drie verskillende tipes mossels uitgevoer in drie onafhanklike eksperimente.Ons het egter geen verandering in ccfDNA-vlakke gevind na akute hittestres nie (sien Figuur S5, bykomende inligting).Hierdie ontdekking kan, ten minste gedeeltelik, die feit verklaar dat mossels 'n semi-oop bloedsomloopstelsel het en groot hoeveelhede vreemde DNS ophoop weens hul hoë filtreeraktiwiteit.Aan die ander kant kan mossels, soos baie ongewerwelde diere, meer bestand wees teen stresgeïnduseerde weefselskade, wat die vrystelling van ccfDNA in hul hemolymf beperk [70, 71].
Tot op hede het DNS-ontleding van biodiversiteit in akwatiese ekosisteme hoofsaaklik gefokus op omgewings-DNA (eDNA) metabarcoding.Hierdie metode is egter gewoonlik beperk in biodiversiteitsanalise wanneer ondergrondse gebruik word.Die gebruik van haelgeweer-volgordebepaling omseil die beperkings van PCR en die bevooroordeelde seleksie van primer-stelle.Dus, in 'n sekere sin, is ons metode nader aan die onlangs gebruikte hoë-deurset eDNA Haelgeweer-volgorde-metode, wat in staat is om gefragmenteerde DNA direk te volg en byna alle organismes te analiseer [72, 73].Daar is egter 'n aantal fundamentele kwessies wat LB van standaard eDNA-metodes onderskei.Natuurlik is die belangrikste verskil tussen eDNA en LB die gebruik van natuurlike filtergashere.Die gebruik van mariene spesies soos sponse en tweekleppers (Dresseina spp.) as 'n natuurlike filter vir die bestudering van eDNA is aangemeld [74, 75].Dreissena se studie het egter weefselbiopsies gebruik waaruit DNS onttrek is.Analise van ccfDNA vanaf LB vereis nie weefselbiopsie, gespesialiseerde en soms duur toerusting en logistiek wat met eDNA of weefselbiopsie geassosieer word nie.Trouens, ons het onlangs berig dat ccfDNA van LB met FTA-ondersteuning gestoor en ontleed kan word sonder om 'n koue ketting te handhaaf, wat 'n groot uitdaging vir navorsing in afgeleë gebiede is [76].Die onttrekking van ccfDNA uit vloeibare biopsies is ook eenvoudig en verskaf hoë kwaliteit DNA vir haelgeweervolgordebepaling en PCR-analise.Dit is 'n groot voordeel gegewe sommige van die tegniese beperkings wat verband hou met eDNA-analise [77].Die eenvoud en lae koste van die steekproefmetode is ook besonder geskik vir langtermyn moniteringsprogramme.Benewens hul hoë filtervermoë, is 'n ander bekende kenmerk van tweekleppige die chemiese mukopolisakkariedsamestelling van hul slym, wat die absorpsie van virusse bevorder [78, 79].Dit maak tweekleppers 'n ideale natuurlike filter vir die karakterisering van biodiversiteit en die impak van klimaatsverandering in 'n gegewe akwatiese ekosisteem.Alhoewel die teenwoordigheid van gasheer-afgeleide DNA-fragmente gesien kan word as 'n beperking van die metode in vergelyking met eDNA, is die koste verbonde aan so 'n inheemse ccfDNA in vergelyking met eDNA terselfdertyd verstaanbaar vir die groot hoeveelheid inligting wat beskikbaar is vir gesondheidstudies.verreken gasheer.Dit sluit die teenwoordigheid van virale volgordes in wat geïntegreer is in die genoom van die gasheergasheer.Dit is veral belangrik vir mossels, gegewe die teenwoordigheid van horisontaal oordraagbare leukemiese retrovirusse in tweekleppige diere [80, 81].Nog 'n voordeel van LB bo eDNA is dat dit die fagositiese aktiwiteit van sirkulerende bloedselle in die hemolimf ontgin, wat mikroörganismes (en hul genome) verswelg.Fagositose is die hooffunksie van bloedselle in tweekleppe [82].Laastens trek die metode voordeel uit die hoë filtreervermoë van mossels (gemiddeld 1,5 l/h seewater) en twee-dag sirkulasie, wat die vermenging van verskillende lae seewater verhoog, wat die vaslegging van heteroloë eDNA moontlik maak.[83, 84].Dus, mossel ccfDNA-analise is 'n interessante manier gegewe die voedings-, ekonomiese en omgewingsimpakte van mossels.Soortgelyk aan die ontleding van LB wat van mense ingesamel is, maak hierdie metode ook die moontlikheid oop om genetiese en epigenetiese veranderinge in gasheer-DNS in reaksie op eksogene stowwe te meet.Byvoorbeeld, derdegenerasie-volgordebepalingstegnologieë kan in die vooruitsig gestel word om genoomwye metileringsanalise in inheemse ccfDNA uit te voer deur gebruik te maak van nanopore-volgordebepaling.Hierdie proses behoort gefasiliteer te word deur die feit dat die lengte van die mossel ccfDNA fragmente ideaal versoenbaar is met langleesvolgordebepalingsplatforms wat genoomwye DNA-metileringsanalise moontlik maak vanaf 'n enkele volgordebepalingslopie sonder die behoefte aan chemiese transformasies.85,86] Dit is 'n interessante moontlikheid, aangesien dit getoon is dat DNA-reaksie-metilering oor baie omgewingstres- en persepsiepatrone reflekteer.Daarom kan dit waardevolle insig gee in die onderliggende meganismes wat reaksie beheer na blootstelling aan klimaatsverandering of besoedelingstowwe [87].Die gebruik van LB is egter nie sonder beperkings nie.Nodeloos om te sê, dit vereis die teenwoordigheid van aanwyserspesies in die ekosisteem.Soos hierbo genoem, vereis die gebruik van LB om die biodiversiteit van 'n gegewe ekosisteem ook 'n streng bioinformatika-pyplyn wat die teenwoordigheid van DNA-fragmente van die bron in ag neem.Nog 'n groot probleem is die beskikbaarheid van verwysingsgenome vir mariene spesies.Daar word gehoop dat inisiatiewe soos die Marienesoogdiergenoomprojek en die onlangs gevestigde Fish10k-projek [88] sulke ontleding in die toekoms sal fasiliteer.Die toepassing van die LB-konsep op mariene filter-voedende organismes is ook versoenbaar met die jongste vooruitgang in volgordebepalingtegnologie, wat dit goed geskik maak vir die ontwikkeling van multi-ohm biomerkers om belangrike inligting oor die gesondheid van mariene habitatte te verskaf in reaksie op omgewingstres.
Genoomvolgordebepalingsdata is in die NCBI Sequence Read Archive gedeponeer https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 onder Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Impak van klimaatsverandering op seelewe en ekosisteme.Cole Biologie.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Oorweeg die gekombineerde impak van klimaatsverandering en ander plaaslike stressors op die mariene omgewing.algemene wetenskaplike omgewing.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Wetenskap van die eerste Maart.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Verminderde hittetoleransie onder herhalende hittestrestoestande verklaar die hoë somersterftes van bloumossels.Wetenskaplike verslag 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Onlangse veranderinge in die frekwensie, oorsake en omvang van dierevrektes.Proc Natl Acad Sci VSA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Veelvuldige nie-spesie-spesifieke patogene het moontlik massa-sterftes van Pinna nobilis veroorsaak.Lewe.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Potensiële impak van klimaatsverandering op Arktiese soönotiese siektes.Int J Sirkumpolêre gesondheid.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Bloumossels (Mytilus edulis spp.) as seinorganismes in monitering van kusbesoedeling: 'n oorsig.Mrt Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrasie van vloeibare biopsie in kankerbehandeling.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Vloeibare biopsie rypwording: Laat tumor DNA sirkuleer.Nat Rev Kanker.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleïensure in menslike plasma.Vergaderingsnotules van Soc Biol-filiale.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. 'n Nuwe rol vir selvrye DNA as 'n molekulêre merker vir kankerbehandeling.Kwantifisering van biomolêre analise.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Vloeistofbiopsie gaan die kliniek binne – implementeringskwessies en toekomstige uitdagings.Nat Ds Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW en ander.Fetale DNA is teenwoordig in moederlike plasma en serum.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studie van die verloop van swangerskap en die komplikasies daarvan met behulp van sirkulerende ekstrasellulêre RNA in die bloed van vroue tydens swangerskap.Dopediatrie.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Vloeistofbiopsie: skenkerselvrye DNA word gebruik om allogene letsels in 'n nieroorplanting op te spoor.Nat Ds Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovasies in prenatale diagnostiek: moederplasma genoom volgordebepaling.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Vinnige patogeenopsporing met die volgende generasie metagenomiese volgordebepaling van besmette liggaamsvloeistowwe.Nat Geneeskunde.2021;27:115-24.