Dankie dat jy Nature.com besoek het.Die blaaierweergawe wat jy gebruik het beperkte CSS-ondersteuning.Vir die beste ervaring, beveel ons aan dat jy 'n opgedateerde blaaier gebruik (of versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer).In die tussentyd, om volgehoue ​​ondersteuning te verseker, sal ons die webwerf sonder style en JavaScript weergee.
Die vrugbaarheid van voëls hang af van hul vermoë om genoeg lewensvatbare sperm vir 'n lang tydperk in die spermopbergbuisies (SST) te stoor.Die presiese meganisme waardeur spermatozoa die SST binnegaan, inwoon en verlaat, bly omstrede.Die sperm van sharkasi-henne het 'n hoë neiging tot agglutinasie getoon, en het mobiele filamentagtige bondels gevorm wat baie selle bevat.As gevolg van die moeilikheid om die beweeglikheid en gedrag van spermatozoa in 'n ondeursigtige fallopiese buis waar te neem, het ons 'n mikrofluïdiese toestel met 'n mikrokanaal-dwarssnit soortgelyk aan dié van spermatosoa gebruik om spermatozoa-agglutinasie en beweeglikheid te bestudeer.Hierdie studie bespreek hoe spermbundels vorm, hoe hulle beweeg, en hul moontlike rol in die verlenging van spermverblyf in die SST.Ons het spermsnelheid en reologiese gedrag ondersoek wanneer vloeistofvloei binne 'n mikrofluïdiese kanaal gegenereer is deur hidrostatiese druk (vloeitempo = 33 µm/s).Die spermatosoa is geneig om teen die stroom te swem (positiewe reologie) en die snelheid van die spermatozoonbundel is aansienlik verminder in vergelyking met enkele spermatozoa.Daar is waargeneem dat spermbundels in 'n spiraal beweeg en in lengte en dikte toeneem namate meer enkele sperms gewerf word. Spermbundels is waargeneem wat nader en aan die sywande van die mikrofluïdiese kanale vaskleef om te verhoed dat dit met vloeistofvloeisnelheid > 33 µm/s gevee word. Spermbundels is waargeneem wat nader en aan die sywande van die mikrofluïdiese kanale vaskleef om te verhoed dat dit met vloeistofvloeisnelheid > 33 µm/s gevee word. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных, микрофлюидных етания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Daar is waargeneem dat spermbundels die sywande van die mikrofluïdiese kanale nader en daaraan kleef om te verhoed dat dit weggevee word teen vloeistofvloeitempo's >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速>/33 s.33 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостног, боковым стенкам микрожидкостног метания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Daar is waargeneem dat spermbundels die sywande van die mikrovloeistofkanaal nader en daaraan kleef om te verhoed dat dit deur vloeistofvloei by >33 µm/s weggevee word.Skandering en transmissie-elektronmikroskopie het aan die lig gebring dat die spermbundels deur oorvloedige digte materiaal ondersteun is.Die data wat verkry is, demonstreer die unieke mobiliteit van Sharkazi hoenderspermatosoa, sowel as die vermoë van spermatozoa om te agglutineer en mobiele bondels te vorm, wat bydra tot 'n beter begrip van die langtermynberging van spermatosoa in SBS.
Om bevrugting by mense en meeste diere te bereik, moet sperm en eiers op die regte tyd by die plek van bevrugting aankom.Daarom moet paring voor of ten tyde van ovulasie plaasvind.Aan die ander kant stoor sommige soogdiere, soos honde, sowel as nie-soogdierspesies, soos insekte, visse, reptiele en voëls, sperm in hul voortplantingsorgane vir 'n lang tydperk totdat hul eiers gereed is vir bevrugting (asinchroniese bevrugting 1 ).Voëls is in staat om die lewensvatbaarheid van spermatosoë te handhaaf wat in staat is om eiers te bevrug vir 2-10 weke2.
Dit is 'n unieke eienskap wat voëls van ander diere onderskei, aangesien dit 'n hoë waarskynlikheid van bevrugting bied na 'n enkele inseminasie vir etlike weke sonder gelyktydige paring en ovulasie.Die hoof spermopbergorgaan, die spermopbergbuis (SST) genoem, is geleë in die interne mukosale voue by die uterovaginale aansluiting.Tot op hede is die meganismes waardeur sperm die spermbank binnegaan, woon en verlaat nie ten volle verstaan ​​nie.Op grond van vorige studies is baie hipoteses voorgehou, maar nie een daarvan is bevestig nie.
Forman4 het veronderstel dat spermatozoa hul verblyf in die SST-holte behou deur voortdurende ossillatoriese beweging teen die rigting van vloeistofvloei deur proteïenkanale geleë op SST-epiteelselle (reologie).ATP is uitgeput as gevolg van die konstante flagellêre aktiwiteit wat nodig is om die sperm in die SST-lumen te hou en beweeglikheid neem uiteindelik af totdat die sperm deur vloeistofvloei uit die spermbank gedra word en 'n nuwe reis langs die stygende fallopiese buis begin om die sperm te bevrug.Eier (Forman4).Hierdie model van spermberging word ondersteun deur die opsporing deur immunositochemie van akwaporiene 2, 3 en 9 teenwoordig in SST-epiteelselle.Tot op hede ontbreek studies oor hoendersemenreologie en die rol daarvan in SST-berging, vaginale spermseleksie en spermkompetisie.By hoenders gaan sperm die vagina binne na natuurlike paring, maar meer as 80% van die spermatosoa word kort ná paring uit die vagina uitgestoot.Dit dui daarop dat die vagina die primêre plek is vir spermseleksie by voëls.Daarbenewens is daar gerapporteer dat minder as 1% van spermatosoë wat in die vagina bevrug word, in SSTs2 beland.By kunsmatige inseminasie van kuikens in die vagina, is die aantal spermatosoë wat SST bereik geneig om 24 uur na inseminasie toe te neem.Tot dusver is die meganisme van spermseleksie tydens hierdie proses onduidelik, en spermmotiliteit kan 'n belangrike rol speel in SST-spermopname.As gevolg van die dik en ondeursigtige wande van die fallopiese buise, is dit moeilik om spermmotiliteit in die fallopiese buise van voëls direk te monitor.Daarom het ons 'n gebrek aan basiese kennis van hoe spermatozoa oorgaan na SST na bevrugting.
Reologie is onlangs erken as 'n belangrike faktor wat spermvervoer in die soogdiergenitalieë beheer.Gebaseer op die vermoë van beweeglike spermatozoa om teenstroom te migreer, het Zaferani et al8 'n corra-mikrofluïdiese sisteem gebruik om beweeglike spermatozoa passief te isoleer uit vasgemaakte semenmonsters.Hierdie tipe semensortering is noodsaaklik vir mediese onvrugbaarheidsbehandeling en kliniese navorsing, en word verkies bo tradisionele metodes wat tyd- en arbeidsintensief is en spermmorfologie en strukturele integriteit kan benadeel.Daar is egter tot op hede geen studies gedoen oor die effek van afskeidings van die geslagsorgane van hoenders op spermmotiliteit nie.
Ongeag die meganisme wat sperm in die SST bewaar, het baie ondersoekers opgemerk dat inwonende spermatosoa kop-aan-kop in die SST van hoenders 9, 10, kwartels 2 en kalkoene 11 agglutineer om geagglutineerde spermbundels te vorm.Die skrywers stel voor dat daar 'n verband is tussen hierdie agglutinasie en langtermynberging van spermatozoa in die SST.
Tingari en Lake12 het 'n sterk assosiasie tussen spermatosoë in die sperm-ontvangsklier van die hoender gerapporteer en bevraagteken of voëlspermatosoë op dieselfde manier as soogdierspermatosoë agglutineer.Hulle glo dat die diep verbande tussen sperm in die vas deferens kan wees as gevolg van die stres wat veroorsaak word deur die teenwoordigheid van 'n groot aantal sperms in 'n klein spasie.
Wanneer die gedrag van spermatozoa op vars hangende glasskyfies geëvalueer word, kan verbygaande tekens van agglutinasie gesien word, veral aan die rande van die semendruppels.Agglutinasie is egter dikwels versteur deur die rotasie-aksie wat met voortdurende beweging geassosieer word, wat die verbygaande aard van hierdie verskynsel verklaar.Die navorsers het ook opgemerk dat wanneer die verdunningsmiddel by die semen gevoeg is, langwerpige "draadagtige" selaggregate verskyn het.
Vroeë pogings om 'n spermatozoon na te boots is aangewend deur 'n dun draadjie van 'n hangende druppel te verwyder, wat gelei het tot 'n verlengde spermagtige vesikel wat by die druppel semen uitsteek.Die spermatozoa het onmiddellik in 'n parallelle wyse binne die vesikel gerangskik, maar die hele eenheid het vinnig verdwyn as gevolg van die 3D-beperking.Daarom, om spermatosoa-agglutinasie te bestudeer, is dit nodig om die beweeglikheid en gedrag van spermatozoa direk in geïsoleerde spermopbergbuisies waar te neem, wat moeilik is om te bereik.Daarom is dit nodig om 'n instrument te ontwikkel wat spermatosoë naboots om studies van spermmotiliteit en agglutinasiegedrag te ondersteun.Brillard et al13 het gerapporteer dat die gemiddelde lengte van spermopbergbuisies in volwasse kuikens 400–600 µm is, maar sommige SSTs kan so lank as 2000 µm wees.Mero en Ogasawara14 het die saadkliere in vergrote en nie-vergrote spermopbergbuisies verdeel, wat albei dieselfde was in lengte (~500 µm) en nekwydte (~38 µm), maar die gemiddelde lumen deursnee van die buisies was 56.6 en 56.6 µm.., onderskeidelik 11,2 μm, onderskeidelik.In die huidige studie het ons 'n mikrofluïdiese toestel met 'n kanaalgrootte van 200 µm × 20 µm (W × H) gebruik, waarvan die deursnit ietwat naby aan dié van die versterkte SST is.Daarbenewens het ons spermmotiliteit en agglutinasiegedrag in vloeiende vloeistof ondersoek, wat ooreenstem met Foreman se hipotese dat vloeistof wat deur SST-epiteelselle geproduseer word sperm in die lumen in 'n teenstroom (reologiese) rigting hou.
Die doel van hierdie studie was om die probleme van waarneming van spermatozoa beweeglikheid in die fallopiese buis te oorkom en om die probleme van die bestudering van die reologie en gedrag van spermatozoa in 'n dinamiese omgewing te vermy.’n Mikrofluïdiese toestel is gebruik wat hidrostatiese druk skep om spermmotiliteit in die geslagsdele van ’n hoender te simuleer.
Wanneer 'n druppel van 'n verdunde spermmonster (1:40) in die mikrokanaaltoestel gelaai is, kon twee tipes spermmotiliteit geïdentifiseer word (geïsoleerde sperm en gebonde sperm).Daarbenewens was spermatozoa geneig om teen die stroom te swem (positiewe reologie; video 1, 2). Alhoewel spermbundels laer snelheid as dié van eensame sperm gehad het (p < 0,001), het hulle die persentasie sperm wat positiewe reotaksis vertoon het, verhoog (p < 0,001; Tabel 2). Alhoewel spermbundels laer snelheid as dié van eensame sperm gehad het (p < 0,001), het hulle die persentasie sperm wat positiewe reotaksis vertoon het, verhoog (p < 0,001; Tabel 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), поливич озоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Alhoewel die spermatozoa bondels 'n laer snelheid as dié van enkel spermatozoa gehad het (p < 0,001), het hulle die persentasie spermatosoa wat positiewe reotaksis toon, verhoog (p < 0,001; Tabel 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0.001），但它们增加了显示阳显示阳分比（p < 0,001；表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001） ， 但 增加 了 显倧示 了 显倧示分比 （p <0.001； 2。。。。。。）)）)) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увелиспови положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Alhoewel die spoed van spermbundels laer was as dié van enkel spermatosoa (p < 0,001), het hulle die persentasie spermatosoa met positiewe reologie verhoog (p < 0,001; Tabel 2).Positiewe reologie vir enkel spermatosoa en klossies word op ongeveer 53% en 85% onderskeidelik geskat.
Daar is waargeneem dat die spermatozoa van sharkasi-hoenders onmiddellik na ejakulasie lineêre bondels vorm wat uit dosyne individue bestaan.Hierdie klossies neem mettertyd in lengte en dikte toe en kan 'n paar uur lank in vitro bly voordat dit verdwyn (video 3).Hierdie filamentagtige bondels is gevorm soos echidna spermatozoa wat aan die einde van die epididimis vorm.Daar is gevind dat Sharkashi-hensemen 'n hoë neiging het om te agglutineer en 'n netvormige bondel te vorm binne minder as een minuut na versameling.Hierdie balke is dinamies en kan aan enige nabygeleë mure of statiese voorwerpe vashou.Alhoewel spermbundels die spoed van spermselle verminder, is dit duidelik dat dit makroskopies hul lineariteit verhoog.Die lengte van die bondels wissel na gelang van die aantal spermselle wat in bondels versamel word.Twee dele van die bondel is geïsoleer: die aanvanklike deel, insluitend die vrye kop van die geagglutineerde sperm, en die terminale deel, insluitend die stert en die hele distale punt van die sperm.Deur 'n hoëspoedkamera (950 fps) te gebruik, is vrye koppe van geagglutineerde spermatozoa in die aanvanklike deel van die bondel waargeneem, wat verantwoordelik is vir die beweging van die bondel as gevolg van hul ossillerende beweging, wat die oorblywende koppe met 'n heliese beweging in die bondel sleep (Video 4).In lang klosse is daar egter waargeneem dat sommige vrye spermkoppe aan die liggaam vasgeheg het en die terminale gedeelte van die klossie dien as wiele om die bossie te help voortdryf.
Terwyl hulle in 'n stadige vloeistofvloei beweeg, beweeg die spermbundels parallel aan mekaar, maar begin hulle oorvleuel en vashou aan alles wat stil is, om nie deur die stroomvloei weggespoel te word namate die vloeispoed toeneem nie.Die bondels vorm wanneer 'n handvol spermselle mekaar nader, hulle begin sinchronies beweeg en om mekaar vou, en dan vashou aan 'n taai stof.Figure 1 en 2 wys hoe die sperm mekaar nader en 'n aansluiting vorm soos die sterte om mekaar vou.
Die navorsers het hidrostatiese druk toegepas om vloeistofvloei in 'n mikrokanaal te skep om spermreologie te bestudeer.'n Mikrokanaal met 'n grootte van 200 µm × 20 µm (B × H) en 'n lengte van 3.6 µm is gebruik.Gebruik mikrokanale tussen houers met spuite aan die punte.Voedselkleursel is gebruik om die kanale meer sigbaar te maak.
Bind verbindingskabels en bykomstighede aan die muur vas.Die video is geneem met 'n fasekontrasmikroskoop.Met elke beeld word fasekontrasmikroskopie en karteringbeelde aangebied.(A) Die verbinding tussen twee strome weerstaan ​​die vloei as gevolg van heliese beweging (rooi pyl).(B) Die verbinding tussen die buisbundel en die kanaalwand (rooi pyle), terselfdertyd word hulle met twee ander bondels (geel pyle) verbind.(C) Spermbundels in die mikrofluïdiese kanaal begin met mekaar verbind (rooi pyle), wat 'n maas van spermbundels vorm.(D) Vorming van 'n netwerk van spermbundels.
Wanneer 'n druppel verdunde sperm in die mikrofluïdiese toestel gelaai is en 'n vloei geskep is, is waargeneem dat die spermstraal teen die rigting van die vloei beweeg.Die bondels pas styf teen die wande van die mikrokanale, en die vrykoppe in die aanvanklike deel van die bondels pas styf daarteen (video 5).Hulle hou ook vas aan enige stilstaande deeltjies in hul pad, soos puin, om te weerstaan ​​dat hulle deur die stroom meegesleur word.Met verloop van tyd word hierdie klossies lang filamente wat ander enkele spermatosoa en korter klossies vasvang (Video 6).Soos die vloei begin verlangsaam, begin lang lyne sperm 'n netwerk van spermlyne vorm (Video 7; Figuur 2).
By 'n hoë vloeisnelheid (V > 33 µm/s) word die spiraalbewegings van drade verhoog as 'n poging om baie individuele spermvormende bondels te vang, die dryfkrag van die vloei beter te weerstaan. By 'n hoë vloeisnelheid (V > 33 µm/s) word die spiraalbewegings van drade verhoog as 'n poging om baie individuele spermvormende bondels te vang, die dryfkrag van die vloei beter te weerstaan. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку опоть маются отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. By hoë vloeitempo's (V > 33 µm/s), neem die heliese bewegings van die stringe toe namate hulle probeer om baie individuele spermatosoa te vang wat bondels vorm wat beter in staat is om die dryfkrag van die vloei te weerstaan.在高流速(V > 33 µm/s) 时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形伢成束的在高流速好地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形仲 坟 形仲 坟 形仲 坟更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 mkm/s) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захн сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. By hoë vloeitempo's (V > 33 µm/s), neem die heliese beweging van die filamente toe in 'n poging om baie individuele spermatosoavormende bondels vas te vang om die drywingskragte van die vloei beter te weerstaan.Hulle het ook probeer om mikrokanale aan die sywande te heg.
Spermbundels is geïdentifiseer as trosse van spermkoppe en krulsterte met behulp van ligmikroskopie (LM).Spermbundels met verskeie aggregate is ook geïdentifiseer as gedraaide koppe en flagellêre aggregate, veelvuldige saamgesmelte spermsterte, spermkoppe wat aan 'n stert geheg is, en spermkoppe met gebuigde kerne as veelvuldige saamgesmelte kerne.transmissie-elektronmikroskopie (TEM).Skandeerelektronmikroskopie (SEM) het getoon dat die spermbundels omhulde aggregate van spermkoppe was en die spermaggregate het 'n aangehegte netwerk van toegedraaide sterte getoon.
Die morfologie en ultrastruktuur van spermatozoa, die vorming van spermatosoa-bundels is bestudeer deur gebruik te maak van ligmikroskopie (halwe snit), skandeerelektronmikroskopie (SEM) en transmissie-elektronmikroskopie (TEM), spermsmere is met akridien oranje gekleur en met behulp van epifluoressensiemikroskopie ondersoek.
Spermsmeerkleuring met akridien-oranje (Fig. 3B) het getoon dat die spermkoppe aanmekaar vasgeplak en bedek was met sekretoriese materiaal, wat gelei het tot die vorming van groot klossies (Fig. 3D).Die spermbundels het bestaan ​​uit spermaggregate met 'n netwerk van aangehegte sterte (Fig. 4A-C).Spermbundels is saamgestel uit die sterte van baie spermatosoa wat aan mekaar vasgeplak is (Fig. 4D).Geheime (Fig. 4E,F) het die koppe van spermatozoa bondels bedek.
Vorming van die spermatosoa-bundel Deur gebruik te maak van fasekontrasmikroskopie en spermsmere wat met akridien-oranje gekleur is, het getoon dat die koppe van spermatozoa aan mekaar vashou.(A) Vroeë spermbolvorming begin met 'n sperm (wit sirkel) en drie sperm (geel sirkel), met die spiraal wat by die stert begin en by die kop eindig.(B) Mikrofoto van 'n spermsmeer gekleur met akridien-oranje wat aaneengeslote spermkoppe (pyltjies) toon.Die afskeiding bedek die kop(pe).Vergroting × 1000. (C) Ontwikkeling van 'n groot bundel wat deur vloei in 'n mikrofluïdiese kanaal vervoer word (met 'n hoëspoedkamera teen 950 fps).(D) Mikrograaf van 'n spermsmeer wat met akridien-oranje gekleur is, wat groot kolletjies (pyle) toon.Vergroting: ×200.
Skandeerelektronmikrograaf van 'n spermstraal en 'n spermsmeer wat met akridien oranje gekleur is.(A, B, D, E) is digitale kleurskanderende elektronmikrofoto's van spermatosoë, en C en F is mikrofoto's van akridien oranje gekleurde spermsmere wat aanhegting van veelvuldige spermatozoa toon wat die stertweb toevou.(AC) Spermaggregate word getoon as 'n netwerk van aangehegte sterte (pyle).(D) Adhesie van verskeie spermatozoa (met kleefstof, pienk buitelyn, pyl) wat om die stert draai.(E en F) Spermkopaggregate (wysers) bedek met kleefmateriaal (wysers).Die spermatosoa het bondels gevorm met verskeie draaikolkagtige strukture (F).(C) ×400 en (F) ×200 vergrotings.
Deur transmissie-elektronmikroskopie te gebruik, het ons gevind dat spermbundels sterte (Fig. 6A, C), koppe aan sterte (Fig. 6B) of koppe aan sterte geheg het (Fig. 6D).Die koppe van die spermatozoa in die bondel is geboë, wat in snit twee kernstreke voorstel (Fig. 6D).In die insnydingsbondel het die spermatozoa 'n gedraaide kop gehad met twee kernstreke en veelvuldige flagellêre streke (Fig. 5A).
Digitale kleur elektronmikrograaf wat die verbindende sterte in die spermbundel en die agglutinerende materiaal wat die spermkoppe verbind, aantoon.(A) Aangehegte stert van 'n groot aantal spermatosoa.Let op hoe die stert lyk in beide portret (pyl) en landskap (pyl) projeksies.(B) Die kop (pyl) van die sperm is aan die stert (pyl) verbind.(C) Verskeie spermsterte (pyle) is aangeheg.(D) Agglutinasiemateriaal (AS, blou) verbind vier spermkoppe (pers).
Skandeerelektronmikroskopie is gebruik om spermkoppe op te spoor in spermbundels bedek met afskeidings of membrane (Figuur 6B), wat aandui dat die spermbundels deur ekstrasellulêre materiaal geanker is.Die geagglutineerde materiaal is in die spermkop (jellieviskopagtige samestelling; Fig. 5B) gekonsentreer en distaal uitgebrei, wat 'n briljante geel voorkoms onder fluoressensiemikroskopie gee wanneer dit met akridien-oranje gekleur is (Fig. 6C).Hierdie stof is duidelik sigbaar onder 'n skandeermikroskoop en word as 'n bindmiddel beskou.Halfdun snitte (Fig. 5C) en spermsmere wat met akridien-oranje gekleur is, het spermbundels getoon wat diggepakte koppe en gekrulde sterte bevat (Fig. 5D).
Verskeie mikrofoto's wat samevoeging van spermkoppe en gevoude sterte toon deur verskeie metodes te gebruik.(A) Digitale deursnee-kleuroordrag-elektronmikrograaf van 'n spermbundel wat 'n opgerolde spermkop met 'n tweedelige kern (blou) en verskeie flagellêre dele (groen) toon.(B) Digitale kleurskanderings-elektronmikrograaf wat 'n groep jellievisagtige spermkoppe (pyltjies) toon wat blykbaar bedek is.(C) Halfdun gedeelte wat saamgevoegde spermkoppe (pyle) en gekrulde sterte (pyle) toon.(D) Mikrograaf van 'n spermsmeer gekleur met akridien-oranje wat aggregate van spermkoppe (pyle) en gekrulde aanhangende sterte (pyltjies) toon.Let daarop dat 'n taai stof (S) die kop van die spermatozoon bedek.(D) × 1000 vergroting.
Deur transmissie-elektronmikroskopie (Fig. 7A) te gebruik, is ook opgemerk dat die spermkoppe gedraai is en die kerne 'n spiraalvorm gehad het, soos bevestig deur spermsmere wat met akridien-oranje gekleur is en met fluoressensiemikroskopie ondersoek is (Fig. 7B).
(A) Digitale kleur transmissie elektronmikrograaf en (B) Akridien oranje gekleurde spermsmeer wat opgerolde koppe en aanhegting van spermkoppe en -sterte (pyltjies) toon.(B) × 1000 vergroting.
'n Interessante bevinding is dat Sharkazi se sperm saamvoeg om mobiele filamentagtige bondels te vorm.Die eienskappe van hierdie bondels stel ons in staat om hul moontlike rol in die absorpsie en berging van spermatozoa in die SST te verstaan.
Na paring gaan die sperm die vagina binne en ondergaan 'n intense seleksieproses, wat daartoe lei dat slegs 'n beperkte aantal sperms die SST15,16 binnegaan.Tot op datum is die meganismes waardeur sperm die SST binnekom en verlaat onduidelik.By pluimvee word spermatozoa vir 'n lang tydperk van 2 tot 10 weke in die SST geberg, afhangende van die spesie6.Omstredenheid bly oor die toestand van die semen tydens berging in die SST.Is hulle in beweging of in rus?Met ander woorde, hoe behou spermselle hul posisie in die SST vir so lank?
Forman4 het voorgestel dat SST-verblyf en uitwerping verklaar kan word in terme van spermmotiliteit.Die skrywers veronderstel dat sperms hul posisie behou deur te swem teen die vloeistofvloei wat deur die SST-epiteel geskep word en dat sperms uit die SST uitgestoot word wanneer hul snelheid onder die punt val waarop hulle agteruit begin beweeg as gevolg van 'n gebrek aan energie.Zaniboni5 het die teenwoordigheid van akwaporiene 2, 3 en 9 in die apikale gedeelte van SST-epiteelselle bevestig, wat indirek Foreman se spermbergingsmodel kan ondersteun.In die huidige studie het ons gevind dat byna die helfte van Sharkashi se spermatozoa positiewe reologie in die vloeiende vloeistof toon, en dat geagglutineerde spermbundels die aantal spermatozoa wat positiewe reologie toon, verhoog, alhoewel agglutinasie hulle vertraag.Hoe spermselle op die voël se fallopiese buis beweeg na die plek van bevrugting, word nie ten volle verstaan ​​nie.By soogdiere trek die follikulêre vloeistof spermatozoa.Daar word egter geglo dat chemoattraktante spermatosoë lei om lang afstande te nader7.Daarom is ander meganismes verantwoordelik vir spermvervoer.Die vermoë van sperm om te oriënteer en te vloei teen die fallopiese buisvloeistof wat na paring vrygestel word, is na berig as 'n belangrike faktor in die teiken van sperm in muise.Parker 17 het voorgestel dat spermatozoa die eierleiers kruis deur teen die siliêre stroom in voëls en reptiele te swem.Alhoewel dit nie eksperimenteel by voëls gedemonstreer is nie, was Adolphi18 die eerste wat gevind het dat voëlsperm positiewe resultate gee wanneer 'n dun lagie vloeistof tussen 'n dekglans en skyfie met 'n strook filtreerpapier geskep word.Reologie.Hino en Yanagimachi [19] het 'n muis-ovarium-buis-baarmoeder-kompleks in 'n perfusiering geplaas en 1 µl ink in die landengte ingespuit om vloeistofvloei in die fallopiese buise te visualiseer.Hulle het 'n baie aktiewe beweging van sametrekking en ontspanning in die fallopiese buis opgemerk, waarin al die inkballetjies geleidelik na die ampulla van die fallopiese buis beweeg het.Die skrywers beklemtoon die belangrikheid van buisvloeistofvloei van die onderste na die boonste fallopiese buise vir spermopheffing en bevrugting.Brillard20 het berig dat in hoenders en kalkoene, spermatosoë migreer deur aktiewe beweging van die vaginale ingang, waar hulle gestoor word, na die utero-vaginale aansluiting, waar hulle gestoor word.Hierdie beweging is egter nie nodig tussen die uterovaginale aansluiting en infundibulum nie, want die spermatosoa word deur passiewe verplasing vervoer.Met kennis van hierdie vorige aanbevelings en die resultate wat in die huidige studie verkry is, kan aanvaar word dat die vermoë van spermatozoa om stroomop te beweeg (reologie) een van die eienskappe is waarop die seleksieproses gebaseer is.Dit bepaal die deurgang van spermatozoa deur die vagina en hul toetrede tot die CCT vir berging.Soos Forman4 voorgestel het, kan dit ook die proses vergemaklik dat sperm die SST en sy habitat vir 'n tydperk binnegaan en dan verlaat wanneer hul spoed begin afneem.
Aan die ander kant het Matsuzaki en Sasanami 21 voorgestel dat voëlspermatosoë beweeglikheidsveranderinge ondergaan van dormansie tot beweeglikheid in die manlike en vroulike voortplantingskanale.Inhibisie van inwonende spermmotiliteit in die SST is voorgestel om die lang bergingstyd van sperm te verduidelik en dan verjonging nadat dit die SST verlaat het.Onder hipoksiese toestande het Matsuzaki et al.1 het hoë produksie en vrystelling van laktaat in die SST gerapporteer, wat kan lei tot inhibisie van inwonende spermmotiliteit.In hierdie geval word die belangrikheid van spermreologie weerspieël in die seleksie en absorpsie van spermatozoa, en nie in hul berging nie.
Die spermaagglutinasiepatroon word beskou as 'n aanneemlike verklaring vir die lang bergingsperiode van sperm in die SST, aangesien dit 'n algemene patroon van spermretensie in pluimvee is2,22,23.Bakst et al.2 het waargeneem dat die meeste spermatosoa aan mekaar vasgeheg het, en fascikulêre aggregate vorm, en enkele spermatosoa is selde in kwartel CCM gevind.Aan die ander kant, Wen et al.24 het meer verstrooide spermatozoa en minder spermatozoa-bossies in die SST-lumen by hoenders waargeneem.Op grond van hierdie waarnemings kan aanvaar word dat die geneigdheid tot spermaagglutinasie tussen voëls en tussen spermatosoa in dieselfde ejakulasie verskil.Daarbenewens het Van Krey et al.9 het voorgestel dat ewekansige dissosiasie van geagglutineerde spermatozoa verantwoordelik is vir die geleidelike penetrasie van spermatosoa in die lumen van die fallopiese buis.Volgens hierdie hipotese moet spermatozoa met laer agglutinasievermoë eers uit die SST geskors word.In hierdie konteks kan die vermoë van spermatozoa om te agglutineer 'n faktor wees wat die uitkoms van spermkompetisie by vuil voëls beïnvloed.Daarbenewens, hoe langer die geagglutineerde sperm dissosieer, hoe langer word vrugbaarheid gehandhaaf.
Alhoewel spermatozoa-aggregasie en -aggregasie in bundels in verskeie studies waargeneem is2,22,24, is hulle nie in detail beskryf nie as gevolg van die kompleksiteit van hul kinematiese waarneming binne die SST.Verskeie pogings is aangewend om spermaagglutinasie in vitro te bestudeer.Uitgebreide maar verbygaande aggregasie is waargeneem toe die dun draad van die hangende saaddruppel verwyder is.Dit lei tot die feit dat 'n langwerpige borrel by die druppel uitsteek, wat die seminale klier naboots.Weens 3D-beperkings en kort drupdroogtye het die hele blok vinnig verval9.In die huidige studie, met Sharkashi-hoenders en mikrovloeistofskyfies, kon ons beskryf hoe hierdie klossies vorm en hoe hulle beweeg.Spermbundels het onmiddellik na semenversameling gevorm en daar is gevind dat hulle in 'n spiraal beweeg, wat positiewe reologie toon wanneer dit in die vloei teenwoordig is.Verder, wanneer makroskopies bekyk, is waargeneem dat spermbundels die lineariteit van beweeglikheid verhoog in vergelyking met geïsoleerde spermatozoa.Dit dui daarop dat spermaagglutinasie kan voorkom voor SST-penetrasie en dat spermproduksie nie beperk is tot 'n klein area as gevolg van stres soos voorheen voorgestel nie (Tingari en Lake12).Tydens klossievorming swem die spermatosoë sinchronies totdat hulle 'n aansluiting vorm, dan vou hul sterte om mekaar en die kop van die spermatosoa bly vry, maar die stert en distale deel van die spermatozoon kleef saam met 'n taai stof.Daarom is die vrye kop van die ligament verantwoordelik vir die beweging, wat die res van die ligament sleep.Skandeerelektronmikroskopie van die spermbundels het aangehegte spermkoppe getoon wat met baie taai materiaal bedek was, wat daarop dui dat die spermkoppe in rustende bondels geheg is, wat moontlik plaasgevind het nadat hulle die stoorplek (SST) bereik het.
Wanneer 'n spermsmeer met akridien oranje gekleur word, kan ekstrasellulêre kleefmateriaal rondom die spermselle onder 'n fluoresserende mikroskoop gesien word.Hierdie stof laat spermbundels aan enige omliggende oppervlaktes of deeltjies kleef en vasklou sodat hulle nie saam met die omliggende vloei wegdryf nie.Dus, ons waarnemings toon die rol van spermatozoa adhesie in die vorm van mobiele bondels.Hul vermoë om teen die stroom te swem en aan nabygeleë oppervlaktes te hou, laat sperm toe om langer in die SST te bly.
Rothschild25 het 'n hemositometriekamera gebruik om die drywende verspreiding van beessemen in 'n druppel suspensie te bestudeer, deur mikrofoto's deur 'n kamera met beide vertikale en horisontale optiese as van die mikroskoop te neem.Die resultate het getoon dat die spermatozoa na die oppervlak van die kamer aangetrek is.Die skrywers stel voor dat daar hidrodinamiese interaksies tussen die sperm en die oppervlak kan wees.As dit in ag geneem word, tesame met die vermoë van Sharkashi-kuiken-semen om taai pluisies te vorm, kan dit die waarskynlikheid verhoog dat semen aan die SST-wand sal kleef en vir lang tydperke gestoor word.
Bccetti en Afzeliu26 het berig dat die spermglikokaliks nodig is vir gameetherkenning en agglutinasie.Forman10 het waargeneem dat hidrolise van α-glikosidiese bindings in glikoproteïen-glikolipiedbedekkings deur voëlsemen met neuraminidase te behandel, verminderde vrugbaarheid tot gevolg gehad het sonder om spermmotiliteit te beïnvloed.Die skrywers stel voor dat die effek van neuraminidase op die glikokaliks spermsekwestrasie by die utero-vaginale aansluiting belemmer, en sodoende vrugbaarheid verminder.Hul waarnemings kan nie die moontlikheid ignoreer dat neuraminidase-behandeling sperm- en oösietherkenning kan verminder nie.Forman en Engel10 het bevind dat vrugbaarheid verminder is wanneer henne intravaginaal geïnsemineer is met semen wat met neuraminidase behandel is.IVF met neuraminidase-behandelde sperm het egter nie vrugbaarheid beïnvloed in vergelyking met kontrole hoenders nie.Die skrywers het tot die gevolgtrekking gekom dat veranderinge in die glikoproteïen-glikolipiedbedekking rondom die spermmembraan die vermoë van sperm om te bevrug verminder deur die sekwestrasie van sperm by die utero-vaginale aansluiting te benadeel, wat op sy beurt spermverlies verhoog het as gevolg van die spoed van die utero-vaginale aansluiting, maar nie sperm- en eierherkenning beïnvloed nie.
By kalkoene het Bakst en Bauchan 11 klein vesikels en membraanfragmente in die lumen van die SST gevind en waargeneem dat sommige van hierdie korrels met die spermmembraan saamgesmelt het.Die skrywers stel voor dat hierdie verhoudings kan bydra tot die langtermynberging van spermatosoa in SST.Die navorsers het egter nie die bron van hierdie deeltjies gespesifiseer nie, of hulle deur CCT-epiteelselle afgeskei word, deur die manlike voortplantingstelsel geproduseer en afgeskei word, of deur die sperm self.Hierdie deeltjies is ook verantwoordelik vir agglutinasie.Grützner et al27 het gerapporteer dat epididimale epiteelselle 'n spesifieke proteïen produseer en afskei wat nodig is vir die vorming van enkel-porie seminale bane.Die skrywers rapporteer ook dat die verspreiding van hierdie bondels afhang van die interaksie van epididimale proteïene.Nixon et al28 het bevind dat die adnexa 'n proteïen afskei, die suur sisteïenryke osteonektien;SPARC is betrokke by die vorming van spermbossies in kortbek-eggidnas en platypusse.Die verstrooiing van hierdie strale word geassosieer met die verlies van hierdie proteïen.
In die huidige studie het ultrastrukturele analise met behulp van elektronmikroskopie getoon dat die spermatozoa aan 'n groot hoeveelheid digte materiaal kleef.Daar word vermoed dat hierdie stowwe verantwoordelik is vir die agglutinasie wat kondenseer tussen en om die aaneenlopende koppe, maar by laer konsentrasies in die stertgebied.Ons neem aan dat hierdie agglutinerende stof saam met semen uit die manlike voortplantingstelsel (epididimis of vas deferens) uitgeskei word, aangesien ons dikwels sien dat semen van limf en seminale plasma skei tydens ejakulasie.Daar is gerapporteer dat namate voëlspermatozoa deur die epididimis en vas deferens beweeg, hulle rypwordingsverwante veranderinge ondergaan wat hul vermoë ondersteun om proteïene te bind en plasmalemma-geassosieerde glikoproteïene te verkry.Die volharding van hierdie proteïene op inwonende spermmembrane in die SST dui daarop dat hierdie proteïene die verkryging van spermmembraanstabiliteit 30 kan beïnvloed en hul vrugbaarheid 31 kan bepaal.Ahammad et al32 het gerapporteer dat spermatozoa verkry vanaf verskeie dele van die manlike voortplantingstelsel (van die testes tot die distale vas deferens) 'n progressiewe toename in lewensvatbaarheid onder vloeistofbergingstoestande getoon het, ongeag bergingstemperatuur, en lewensvatbaarheid by hoenders neem ook toe in die fallopiese buise na kunsmatige inseminasie.
Sharkashi hoenderspermbossies het verskillende eienskappe en funksies as ander spesies soos echidnas, platypuses, bosmuise, takbokrotte en marmotte.By sharkasi-hoenders het die vorming van spermatozoa-bundels hul swemspoed verminder in vergelyking met enkele spermatozoa.Hierdie bondels het egter die persentasie reologies positiewe spermatosoa verhoog en die vermoë van spermatosoa verhoog om hulself in 'n dinamiese omgewing te stabiliseer.Ons resultate bevestig dus die vorige voorstel dat spermaagglutinasie in SST geassosieer word met langtermyn spermberging.Ons veronderstel ook dat die geneigdheid van sperm om klossies te vorm die tempo van spermverlies in SST kan beheer, wat die uitkoms van spermkompetisie kan verander.Volgens hierdie aanname stel spermatosoa met lae agglutinasiekapasiteit SST eerste vry, terwyl spermatosoa met hoë agglutinasievermoë die meeste van die nageslag produseer.Die vorming van enkelporieë spermbundels is voordelig en beïnvloed die ouer-kind-verhouding, maar gebruik 'n ander meganisme.By echidnas en platypuses is die spermatosoa parallel aan mekaar gerangskik om die voorwaartse spoed van die balk te verhoog.Bundels echidnas beweeg ongeveer drie keer vinniger as enkele spermatosoa.Daar word geglo dat die vorming van sulke spermklossies in echidnas 'n evolusionêre aanpassing is om dominansie te handhaaf, aangesien wyfies promisku is en gewoonlik met verskeie mannetjies paar.Daarom ding spermatozoa van verskillende ejakulate fel mee om die bevrugting van die eiersel.
Geagglutineerde spermatozoa van sharkasi-hoenders is maklik om te visualiseer met behulp van fasekontrasmikroskopie, wat as voordelig beskou word omdat dit maklike studie van die gedrag van spermatosoa in vitro moontlik maak.Die meganisme waardeur spermbolvorming voortplanting by sharkasi-hoenders bevorder, verskil ook van dié wat gesien word in sommige plasentale soogdiere wat samewerkende spermgedrag verteenwoordig, soos houtmuise, waar sommige spermatozoa die eiers bereik, wat ander verwante individue help om hul eiers te bereik en te beskadig.om jouself te bewys.altruïstiese gedrag.Selfbevrugting 34. Nog 'n voorbeeld van samewerkende gedrag in spermatozoa is gevind in takbokmuise, waar spermatosoë in staat was om te identifiseer en te kombineer met die mees geneties verwante spermatozoa en samewerkende groepe te vorm om hul spoed te verhoog in vergelyking met onverwante spermatosoa35.
Die resultate wat in hierdie studie verkry is, weerspreek nie Foman se teorie van langtermynberging van spermatozoa in SWS nie.Die navorsers rapporteer dat spermselle voortgaan om te beweeg in die vloei van epiteelselle wat die SST beklee vir 'n lang tydperk, en na 'n sekere tydperk is die energievoorrade van die spermselle uitgeput, wat lei tot 'n afname in spoed, wat die uitdryf van stowwe met klein molekulêre gewig moontlik maak.energie van spermatozoa met die vloei van vloeistof uit die lumen van die SST Die holte van die fallopiese buis.In die huidige studie het ons opgemerk dat die helfte van die enkele sperm die vermoë getoon het om teen vloeiende vloeistowwe te swem, en hul adhesie in die bondel het hul vermoë om positiewe reologie te toon verhoog.Verder is ons data in ooreenstemming met dié van Matsuzaki et al.1 wat gerapporteer het dat verhoogde laktaatafskeiding in SST inwonende spermmotiliteit kan inhibeer.Ons resultate beskryf egter die vorming van spermbewegingsligamente en hul reologiese gedrag in die teenwoordigheid van 'n dinamiese omgewing binne 'n mikrokanaal in 'n poging om hul gedrag in SST toe te lig.Toekomstige navorsing kan daarop fokus om die chemiese samestelling en oorsprong van die agglutinerende middel te bepaal, wat navorsers ongetwyfeld sal help om nuwe maniere te ontwikkel om vloeibare semen te berg en die duur van vrugbaarheid te verleng.
Vyftien 30 weke oue kaalnek manlike sharkasi (homosigotiese dominant; Na Na) is as spermskenkers in die studie gekies.Die voëls is grootgemaak by die Navorsingspluimveeplaas van die Fakulteit Landbou, Ashit Universiteit, Ashit Goewerneur, Egipte.Voëls is in individuele hokke (30 x 40 x 40 cm) gehuisves, aan 'n ligprogram (16 uur lig en 8 uur donkerte) onderwerp en 'n dieet gevoer wat 160 g ruproteïen, 2800 kcal metaboliseerbare energie, 35 g kalsium elk bevat het.5 gram beskikbare fosfor per kilogram dieet.
Volgens data 36, ​​37 is semen van mans versamel deur abdominale massering.Altesaam 45 semenmonsters is van 15 mans oor 3 dae versamel.Semen (n = 15/dag) is dadelik 1:1 (v:v) verdun met Belsville Poultry Semen Verdunningsmiddel, wat kaliumdifosfaat (1,27 g), mononatriumglutamaatmonohidraat (0,867 g), fruktose (0,5 d) watervrye natrium bevat.asetaat (0,43 g), tris(hidroksimetiel)aminometaan (0,195 g), kaliumsitraatmonohidraat (0,064 g), kaliummonofosfaat (0,065 g), magnesiumchloried (0,034 g) en H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolariteit 3 ​​kg/m30m3kg.Verdunde semenmonsters is eers onder 'n ligmikroskoop ondersoek om goeie semenkwaliteit (vog) te verseker en daarna in 'n waterbad by 37°C gestoor tot gebruik binne 'n halfuur na versameling.
Die kinematika en reologie van spermatosoa word beskryf met behulp van 'n stelsel van mikrofluïdiese toestelle.Semenmonsters is verder verdun tot 1:40 in Beltsville Avian Semen Diluent, gelaai in 'n mikrofluïdiese toestel (sien hieronder), en kinetiese parameters is bepaal deur gebruik te maak van 'n Computerized Semen Analysis (CASA) stelsel wat voorheen ontwikkel is vir mikrofluïdiese karakterisering.oor die mobiliteit van spermatozoa in vloeibare media (Departement Meganiese Ingenieurswese, Fakulteit Ingenieurswese, Assiut Universiteit, Egipte).Die inprop kan afgelaai word by: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Krommesnelheid (VCL, μm/s), lineêre snelheid (VSL, μm/s) en gemiddelde trajeksnelheid (VAP, μm/s) is gemeet.Video's van spermatozoa is geneem met behulp van 'n omgekeerde Optika XDS-3 fase kontrasmikroskoop (met 40x objektief) gekoppel aan 'n Tucson ISH1000 kamera teen 30 fps vir 3 s.Gebruik die CASA-sagteware om ten minste drie areas en 500 spermtrajekte per monster te bestudeer.Die opgeneemde video is verwerk met 'n tuisgemaakte CASA.Die definisie van beweeglikheid in die CASA-inprop is gebaseer op die swemspoed van die sperm in vergelyking met die vloeitempo, en sluit nie ander parameters soos kant-tot-kant beweging in nie, aangesien gevind is dat dit meer betroubaar is in vloeistofvloei.Reologiese beweging word beskryf as die beweging van spermselle teen die rigting van vloeistofvloei.Spermatozoa met reologiese eienskappe is gedeel deur die aantal beweeglike spermatozoa;spermatozoa wat in rus was en konvektief bewegende spermatosoa is uitgesluit van die telling.
Alle chemikalieë wat gebruik is, is verkry van Elgomhoria Pharmaceuticals (Kaïro, Egipte), tensy anders vermeld.Die toestel is vervaardig soos beskryf deur El-sherry et al.40 met enkele wysigings.Die materiaal wat gebruik is om die mikrokanale te vervaardig, sluit in glasplate (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negatiewe weerstand (MicroChem, Newton, CA), diasetoonalkohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Duitsland) en poliasetoon.-184, Dow Corning, Midland, Michigan).Mikrokanale word vervaardig met behulp van sagte litografie.Eerstens is 'n duidelike beskermende gesigmasker met die gewenste mikrokanaalontwerp op 'n hoë resolusie drukker gedruk (Prismatic, Cairo, Egypt and Pacific Arts and Design, Markham, ON).Die meesters is gemaak met behulp van glasplate as substrate.Die plate is skoongemaak in asetoon, isopropanol en gedeïoniseerde water en dan bedek met 'n 20 µm laag SU8-25 deur spinbedekking (3000 rpm, 1 min).Die SU-8 lae is dan saggies gedroog (65°C, 2 min en 95°C, 10 min) en vir 50 s aan UV-bestraling blootgestel.Na-blootstelling bak by 65°C en 95°C vir 1 min en 4 min om blootgestelde SU-8 lae te kruisbind, gevolg deur ontwikkeling in diacetoon alkohol vir 6.5 min.Bak die wafels hard (200°C vir 15 min) om die SU-8-laag verder te stol.
PDMS is voorberei deur die monomeer en verharder te meng in 'n gewigsverhouding van 10:1, dan ontgas in 'n vakuumverdroër en op die SU-8 hoofraam gegooi.Die PDMS is in 'n oond gehard (120°C, 30 min), dan is die kanale uitgesny, van die meester geskei en geperforeer sodat buise by die inlaat en uitlaat van die mikrokanaal geheg kan word.Laastens is PDMS-mikrokanale permanent aan mikroskoopskyfies geheg met behulp van 'n draagbare koronaverwerker (Electro-Technic Products, Chicago, IL) soos elders beskryf.Die mikrokanaal wat in hierdie studie gebruik word, meet 200 µm × 20 µm (B × H) en is 3.6 cm lank.
Die vloeistofvloei wat deur hidrostatiese druk binne die mikrokanaal geïnduseer word, word bereik deur die vloeistofvlak in die inlaatreservoir bo die hoogteverskil Δh39 in die uitlaatreservoir te handhaaf (Fig. 1).
waar f die wrywingskoëffisiënt is, gedefinieer as f = C/Re vir laminêre vloei in 'n reghoekige kanaal, waar C 'n konstante is afhangende van die aspekverhouding van die kanaal, L is die lengte van die mikrokanaal, Vav is die gemiddelde snelheid binne die mikrokanaal, Dh is die hidrouliese deursnee van die kanaal, g – versnelling van swaartekrag.Deur hierdie vergelyking te gebruik, kan die gemiddelde kanaalsnelheid bereken word deur die volgende vergelyking te gebruik: