Dankie dat u Nature.com besoek het. U gebruik 'n blaaierweergawe met beperkte CSS-ondersteuning. Vir die beste ervaring beveel ons aan dat u 'n opgedateerde blaaier gebruik (of Verenigbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer). Boonop, om voortgesette ondersteuning te verseker, wys ons die webwerf sonder style en JavaScript.
Wys 'n karrousel van drie skyfies gelyktydig. Gebruik die Vorige en Volgende knoppies om deur drie skyfies op 'n slag te beweeg, of gebruik die skuifknoppies aan die einde om deur drie skyfies op 'n slag te beweeg.
Poreuse silikadeeltjies is voorberei deur die sol-gel-metode met 'n paar wysigings om wye-porie deeltjies te verkry. Hierdie deeltjies is gederivatiseer met N-fenielmaleïmied-metielvinielisosianaat (PMI) en stireen via omgekeerde kettingoordrag-fragmentasie (RAFT) polimerisasie om N-fenielmaleïmied-interkaleerde poliamiede te produseer. Stireen (PMP) stasionêre fase. Smalboor vlekvrye staalkolomme (100 × 1.8 mm binnediameter) is gepak met 'n slurrypakking. Die chromatografiese werkverrigting van die PMP-kolom is geëvalueer om 'n mengsel van sintetiese peptiede te skei wat bestaan ​​uit vyf peptiede (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu-aminosuur-enkefalien) en triptiese hidrolisaat van menslike serumalbumien (HAS). Onder optimale elueringstoestande het die teoretiese aantal plate met 'n mengsel van peptiede 280 000 plate/vk.m. bereik. Deur die skeidingsprestasie van die ontwikkelde kolom met die kommersiële Ascentis Express RP-Amied-kolom te vergelyk, is waargeneem dat die skeidingsdoeltreffendheid van die PMP-kolom beter was as die kommersiële kolom in terme van skeidingsdoeltreffendheid en resolusie.
Die biofarmaseutiese industrie het 'n groeiende globale mark geword met 'n beduidende toename in markaandeel in onlangse jare. Met die plofbare groei van die biofarmaseutiese industrie1,2,3 is daar 'n groot behoefte aan peptied- en proteïenanalise. Benewens die teikenpeptied word verskeie onsuiwerhede tydens peptiedsintese gevorm, dus is chromatografiese suiwering nodig om die verlangde suiwerheid van die peptied te verkry. Die analise en karakterisering van proteïene in liggaamsvloeistowwe, weefsels en selle is 'n uiters uitdagende taak as gevolg van die groot aantal potensieel opspoorbare spesies wat in 'n enkele monster teenwoordig is. Alhoewel massaspektrometrie 'n effektiewe instrument is vir die volgordebepaling van peptiede en proteïene, sal die skeiding onbevredigend wees as sulke monsters direk in die massaspektrometer ingebring word. Hierdie probleem kan opgelos word deur vloeistofchromatografie (LC) uit te voer voor MS-analise, wat die hoeveelheid analiete wat die massaspektrometer op 'n gegewe tydstip binnedring, sal verminder4,5,6. Daarbenewens kan analiete tydens vloeistoffaseskeiding in 'n nou gebied konsentreer, waardeur hierdie analiete gekonsentreer word en die sensitiwiteit van MS-opsporing verhoog word. Vloeistofchromatografie (LC) het die afgelope dekade aansienlik gevorder en het 'n wyd gebruikte metode vir proteomiese analise geword7,8,9,10.
Omgekeerde-fase vloeistofchromatografie (RP-LC) word wyd gebruik om mengsels van peptiede te suiwer en te skei deur oktadecyl-gemodifiseerde silika (ODS) as die stasionêre fase te gebruik11,12,13. As gevolg van hul komplekse struktuur en amfoteriese aard,14,15 kan RP stasionêre fases egter nie 'n bevredigende skeiding van peptiede en proteïene bied nie. Daarom vereis die analise van peptiede en proteïene met polêre en nie-polêre fragmente spesiaal ontwerpte stasionêre fases om met hierdie analiete te kommunikeer en te behou16. Gemengde chromatografie, wat multimodale interaksies bied, kan 'n alternatief vir RP-LC wees vir die skeiding van peptiede, proteïene en ander komplekse mengsels. Verskeie gemengde-tipe stasionêre fases is voorberei en kolomme gevul met hierdie stasionêre fases is gebruik om peptiede en proteïene te skei17,18,19,20,21. As gevolg van die teenwoordigheid van polêre en nie-polêre groepe, is gemengde modus stasionêre fases (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polêre interkalasie/RPLC) geskik vir die skeiding van peptiede en proteïene22,23,24,25,26,27,28. , Polêre geïnterkaleerde stasionêre fases met kovalent gebonde polêre groepe toon goeie skeidingsvermoëns en unieke selektiwiteit vir polêre en nie-polêre analiete, omdat skeiding afhang van die interaksie tussen die analiet en die stasionêre fase. Multimodale interaksies29,30,31,32. Onlangs het Zhang et al.30 beheniel-geëindigde stasionêre fases van poliamiene verkry en koolwaterstowwe, antidepressante, flavonoïede, nukleosiede, estrogenen en sommige ander analiete suksesvol geskei. Die polêr ingebedde stasionêre materiaal het beide polêre en nie-polêre groepe, dus kan dit gebruik word om peptiede en proteïene in hidrofobiese en hidrofiliese dele te skei. Polêre inlynkolomme (bv. C18-kolomme met amied inlyn) is beskikbaar onder die handelsnaam Ascentis Express RP-Amied-kolomme, maar hierdie kolomme is slegs gebruik vir die analise van amien 33.
In die huidige studie is 'n polêre inbedding stasionêre fase (N-fenielmaleïmied, inbedding polistireen) voorberei en geëvalueer vir peptiedskeiding en triptiese HSA-splitsing. Die volgende strategie is gebruik om die stasionêre fase voor te berei. Poreuse silikadeeltjies is voorberei volgens die prosedures wat in ons vorige publikasies beskryf is, met 'n paar veranderinge in voorbereidingskemas 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Die verhoudings van ureum, poliëtileenglikol (PEG), TMOS en waterige asynsuur is aangepas om silikadeeltjies met groot poriegroottes te verkry. Tweedens is 'n nuwe fenielmaleïmied-metielvinielisosianaatligand gesintetiseer en die gederivatiseerde silikadeeltjies daarvan is gebruik om polêre ingebedde stasionêre fases voor te berei. Die verkrygde stasionêre fase is in 'n vlekvrye staalkolom (binnediameter 100 × 1.8 mm) gepak volgens 'n geoptimaliseerde pakskema. Die pak van die kolom word gehelp deur meganiese vibrasie om 'n eenvormige laag binne die kolom te verseker. Die gepakte kolom is geëvalueer vir die skeiding van 'n mengsel van peptiede bestaande uit vyf peptiede (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leusien-enkefalienpeptied) en triptiese hidrolise van menslike serumalbumien (HSA). Daar is waargeneem dat die peptiedmengsel en die HSA-triptiese verteer met goeie resolusie en doeltreffendheid geskei het. Die skeidingsdoeltreffendheid van die PMP-kolom is vergelyk met dié van die Ascentis Express RP-Amied-kolom. Daar is waargeneem dat peptiede en proteïene goeie resolusie en hoë skeidingsdoeltreffendheid op die PMP-kolom het, en die skeidingsdoeltreffendheid van die PMP-kolom is hoër as dié van die Ascentis Express RP-Amied-kolom.
PEG (poliëtileenglikol), ureum, asynsuur, trimetoksiortosilikaat (TMOS), trimetielchlorosilaan (TMCS), tripsin, menslike serumalbumien (HSA), ammoniumchloried, ureum, heksametilmetakriloïldisilasaan (HMDS), metakriloïelchloried (MC), stireen, 4-hidroksi-TEMPO, bensoïelperoksied (BPO), asetonitriel (ACN) vir HPLC, metanol, 2-propanol en asetoon. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, VSA).
'n Mengsel van ureum (8 g), poliëtileenglikol (8 g) en 8 ml 0.01 N asynsuur is vir 10 minute geroer, en 24 ml TMOS is onder yskoeling daarby gevoeg. Die reaksiemengsel is vir 6 uur by 40°C verhit en daarna vir 8 uur by 120°C in 'n vlekvrye staal-outoklaaf. Die water is gedekanteer en die residu is vir 12 uur by 70°C gedroog. Die gedroogde sagte blokke is glad gemaal en vir 12 uur in 'n oond by 550°C gekalsineer. Drie bondels is voorberei en gekarakteriseer om die reproduceerbaarheid van deeltjiegroottes, poriegrootte en oppervlakarea te toets.
Polêre groep en stasionêre fase vir polistireenkettings. Die voorbereidingsprosedure word hieronder beskryf.
N-fenielmaleïmied (200 mg) en metielvinielisosianaat (100 mg) is in anhidriese tolueen opgelos, en toe is 0.1 ml 2,2'-azoisobutyronitriel (AIBN) by die reaksiefles gevoeg om 'n kopolimeer van fenielmaleïmied en metielvinielisosianaat (PMCP) te verkry. Die mengsel is vir 3 uur by 60°C verhit, gefiltreer en vir 3 uur in 'n oond by 40°C gedroog.
Gedroogde silikadeeltjies (2 g) is in droë tolueen (100 ml) versprei, geroer en vir 10 minute in 'n 500 ml rondebodemfles gesonikeer. PMCP (10 mg) is in tolueen opgelos en drupsgewys via 'n toevoegtregter by die reaksiefles gevoeg. Die mengsel is vir 8 uur by 100°C onder terugvloei verhit, gefiltreer, met asetoon gewas en vir 3 uur by 60°C gedroog. Daarna is die silikadeeltjies wat met PMCP (100 g) geassosieer is, in tolueen (200 ml) opgelos, en 4-hidroksi-TEMPO (2 ml) is daarby gevoeg in die teenwoordigheid van 100 μl dibutieltindilauraat as 'n katalisator. Die mengsel is vir 8 uur by 50°C geroer, gefiltreer en vir 3 uur by 50°C gedroog.
Stireen (1 ml), bensoïelperoksied BPO (0.5 ml) en silikadeeltjies wat aan TEMPO-PMCP (1.5 g) geheg is, is in tolueen gedispergeer en met stikstof gesuiwer. Die polimerisasie van stireen is vir 12 uur by 100°C uitgevoer. Die gevolglike produk is met metanol gewas en oornag by 60°C gedroog. Die algemene reaksieskema word in fig. een getoon.
Die monsters is vir 1 uur by 393 K ontgas totdat 'n residuele druk van minder as 10–3 Torr verkry is. Die hoeveelheid N2 wat by relatiewe druk P/P0 = 0.99 geadsorbeer is, is gebruik om die totale porievolume te bepaal. Die morfologie van suiwer en ligandgebonde silikadeeltjies is ondersoek met behulp van 'n skandeerelektronmikroskoop (Hitachi High Technologies, Tokio, Japan). Droë monsters (suiwer silika en ligandgebonde silikadeeltjies) is met behulp van koolstofband op aluminiumstawe geplaas. Goud is op die monster neergelê met behulp van 'n Q150T-sputtertoestel, en 'n 5 nm dik Au-laag is op die monster neergelê. Dit verbeter die doeltreffendheid van die laespanningsproses en bied fyn koue bespuiting. Elementanalise is uitgevoer met behulp van 'n Thermo Electron (Waltham, MA, VSA) Flash EA1112 elementsamestellingsanaliseerder. 'n Malvern-deeltjiegrootte-analiseerder (Worcestershire, VK) Mastersizer 2000 is gebruik om die deeltjiegrootteverspreiding te verkry. Ongebedekte silikadeeltjies en ligandgebonde silikadeeltjies (5 mg elk) is in 5 ml isopropanol versprei, vir 10 minute gesonikeer, vir 5 minute geroer en op 'n Mastersizer optiese bank geplaas. Termogravimetriese analise word uitgevoer teen 'n tempo van 5 °C per minuut in die temperatuurreeks van 30 tot 800 °C.
Glasveselgevoerde, smalloop vlekvrye staalkolomme met afmetings (ID 100 × 1.8 mm) is gepak met die slurryvulmetode volgens dieselfde prosedure as in verwysing 31. Vlekvrye staalkolom (glasgevoerd, ID 100 × 1.8 mm) en 'n uitlaat wat 'n 1 µm frit bevat, is aan 'n slurryverpakkingsmasjien (Alltech Deerfield, IL, VSA) gekoppel. Berei 'n suspensie van die stasionêre fase voor deur 150 mg van die stasionêre fase in 1.2 ml metanol te suspendeer en dit in 'n reservoirkolom te voer. Metanol is as die slurryoplosmiddel en kontrole-oplosmiddel gebruik. Pak die kolom deur 'n drukvolgorde van 100 MP vir 10 min, 80 MP vir 15 min en 60 MP vir 30 min toe te pas. Die verpakkingsproses het twee gaschromatografiekolomvibrators (Alltech, Deerfield, IL, VSA) vir meganiese vibrasie gebruik om eenvormige kolompakking te verseker. Maak die slurrypakker toe en laat die druk stadig vry om skade aan die tou te voorkom. Die kolom is van die slykspuitstuk ontkoppel en 'n ander toebehore is aan die inlaat geheg en aan die LC-stelsel gekoppel om die werking daarvan te toets.
'n Pasgemaakte MLC is gebou met behulp van 'n LC-pomp (10AD Shimadzu, Japan), 'n monsternemer met 'n 50 nL inspuitlus (Valco (VSA) C14 W.05), 'n membraanontgasser (Shimadzu DGU-14A), en 'n UV-VIS kapillêre venster. Detektortoestel (UV-2075) en geëmailleerde mikrokolom. Gebruik baie nou en kort verbindingsbuise om die effek van addisionele kolomuitbreiding te verminder. Nadat die kolom gevul is, installeer 'n kapillêr (50 µm id 365) by die uitlaat van die 1/16″ reduseervoeging en installeer 'n kapillêr (50 µm) van die reduseervoeging. Data-insameling en chromatogramverwerking word uitgevoer met behulp van die Multichro 2000 sagteware. By 254 nm is die UV-absorbansie van die proefpersone se analiete by 0 gemonitor. Chromatografiese data is geanaliseer met behulp van OriginPro8 (Northampton, MA).
Menslike serumalbumien, gevriesdroogde poeier, ≥ 96% (agarosegelelektroforese) 3 mg gemeng met tripsin (1.5 mg), 4.0 M ureum (1 ml) en 0.2 M ammoniumbikarbonaat (1 ml). Die oplossing is vir 10 minute geroer en vir 6 uur in 'n waterbad by 37°C gehou, en toe geblus met 1 ml 0.1% TFA. Filtreer die oplossing en bêre onder 4°C.
Skeiding van 'n mengsel van peptiede en triptiese verteerde HSA op 'n PMP-kolom is afsonderlik geëvalueer. Kontroleer die triptiese hidrolise van 'n mengsel van peptiede en HSA geskei deur 'n PMP-kolom en vergelyk die resultate met 'n Ascentis Express RP-Amied-kolom. Die aantal teoretiese plate word bereken met behulp van die volgende vergelyking:
SEM-beelde van suiwer silikadeeltjies en ligandgebonde silikadeeltjies word in Figuur 2 getoon. SEM-beelde van suiwer silikadeeltjies (A, B) toon 'n sferiese vorm waarin die deeltjies verleng is of onreëlmatige simmetrie het in vergelyking met ons vorige studies. Die oppervlak van die silikadeeltjies wat deur die ligand (C, D) gebind word, is gladder as dié van suiwer silikadeeltjies, wat moontlik te wyte is aan die polistireenkettings wat die oppervlak van die silikadeeltjies bedek.
Skandeerelektronmikrograwe van suiwer silikadeeltjies (A, B) en ligandgebonde silikadeeltjies (C, D).
Die deeltjiegrootteverspreiding van suiwer silikadeeltjies en ligandgebonde silikadeeltjies word in Fig. 2.3(A) getoon. Volumetriese deeltjiegrootteverspreidingskurwes het getoon dat die silikadeeltjiegrootte toegeneem het na chemiese modifikasie (Fig. 3A). Die silikadeeltjiegrootteverspreidingsdata van die huidige studie en die vorige studie word in Tabel 1(A) vergelyk. Die volumetriese deeltjiegrootte d(0.5) van PMP was 3.36 µm, in vergelyking met die ad(0.5)-waarde van 3.05 µm in ons vorige studie (polistireengebonde silikadeeltjies)34. As gevolg van die verandering in die verhouding van PEG, ureum, TMOS en asynsuur in die reaksiemengsel, was die deeltjiegrootteverspreiding van hierdie bondel nouer in vergelyking met ons vorige studie. Die deeltjiegrootte van die PMP-fase is effens groter as dié van die polistireengebonde silikadeeltjiefase wat ons vroeër bestudeer het. Dit beteken dat die oppervlakfunksionalisering van silikadeeltjies met stireen slegs 'n polistireenlaag (0.97 µm) op die silika-oppervlak neergelê het, terwyl die laagdikte in die PMP-fase 1.38 µm was.
Deeltjiegrootteverspreiding (A) en poriegrootteverspreiding (B) van suiwer silikadeeltjies en ligandgebonde silikadeeltjies.
Die poriegrootte, porievolume en oppervlakarea van die silikadeeltjies wat in hierdie studie gebruik is, word in Tabel 1 (B) getoon. Die PSD-profiele van suiwer silikadeeltjies en ligandgebonde silikadeeltjies word in Fig. 3 (B) getoon. Die resultate was vergelykbaar met ons vorige studie34. Die poriegroottes van suiwer en ligandgebonde silikadeeltjies was onderskeidelik 310 Å en 241 Å, wat aandui dat die poriegrootte na chemiese modifikasie met 69 Å afgeneem het, soos in Tabel 1 (B) getoon, en die verskuiwingskurwe word in Fig. getoon. Die spesifieke oppervlakarea van silikadeeltjies in die huidige studie is 116 m2/g, wat vergelykbaar is met ons vorige studie (124 m2/g). Soos in Tabel 1 (B) getoon, het die oppervlakarea (m2/g) van silikadeeltjies na chemiese modifikasie ook afgeneem van 116 m2/g tot 105 m2/g.
Die resultate van elementanalise van die stasionêre fase word in Tabel 2 aangebied. Die koolstofinhoud van die huidige stasionêre fase is 6.35%, wat laer is as in ons vorige studie (silikadeeltjies geassosieer met polistireen, onderskeidelik 7.93%35 en 10.21%)42. Die koolstofinhoud van die huidige stasionêre fase hieronder, aangesien sommige polêre ligande soos fenielmaleïmiedmetielvinielisosianaat (PCMP) en 4-hidroksi-TEMPO benewens stireen in die voorbereiding van SP gebruik is. Die gewigspersentasie stikstof in die huidige stasionêre fase is 2.21% in vergelyking met 0.1735 en 0.85% in vorige studies42. Dit beteken dat die huidige stasionêre fase 'n hoë gewigspersentasie stikstof het as gevolg van die fenielmaleïmied. Net so het produkte (4) en (5) 'n koolstofinhoud van onderskeidelik 2.7% en 2.9%, terwyl die finale produk (6) 'n koolstofinhoud van 6.35% het, soos getoon in Tabel 2. Termogravimetriese analise (TGA) is op die stasionêre fase van PMP gebruik om gewigsverlies te toets, en die TGA-kromme word in Figuur 4 getoon. Die TGA-kromme toon 'n gewigsverlies van 8.6%, wat in goeie ooreenstemming is met die koolstofinhoud (6.35%), aangesien die ligande nie net C bevat nie, maar ook N, O en H.
Die ligand fenielmaleïmied-metielvinielisosianaat is gekies om die oppervlak van die silikadeeltjies te modifiseer as gevolg van sy polêre fenielmaleïmied- en vinielisosianaatgroepe. Vinielisosianaatgroepe kan verder met stireen reageer deur lewende radikaalpolimerisasie. Die tweede rede is om 'n groep in te voeg wat matige interaksies met die analiet het en geen sterk elektrostatiese interaksies tussen die analiet en die stasionêre fase nie, aangesien die fenielmaleïmieddeel geen virtuele lading by normale pH het nie. Die polariteit van die stasionêre fase kan beheer word deur die optimale hoeveelheid stireen en die reaksietyd van die vrye radikaalpolimerisasie. Die laaste stap van die reaksie (vrye radikaalpolimerisasie) is krities aangesien dit die polariteit van die stasionêre fase verander. Elementêre analise is uitgevoer om die koolstofinhoud in hierdie stasionêre fases na te gaan. Daar is waargeneem dat die verhoging van die hoeveelheid stireen en die reaksietyd die koolstofinhoud van die stasionêre fase verhoog en andersom. SP's wat met verskillende konsentrasies stireen voorberei word, het verskillende koolstofladings. Net so is hierdie stasionêre fases op vlekvrye staalkolomme geplaas en hul chromatografiese eienskappe (selektiwiteit, resolusie, N-waarde, ens.) is nagegaan. Gebaseer op hierdie eksperimente is 'n geoptimaliseerde samestelling vir die voorbereiding van die PMP stasionêre fase gekies om beheerde polariteit en goeie retensie van die analiet te verskaf.
Die PMP-kolom is ook geëvalueer vir die analise van vyf mengsels van peptiede (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leusien-enkefalien) met behulp van die kapasiteit van die mobiele fase. 60/40 (v/v) ACN/water (0.1% TFA) teen 'n vloeitempo van 80 µl/min. Onder optimale elueringstoestande (200 000 plate/m²) is die aantal teoretiese plate (N) per kolom (100 × 1.8 mm) 20 000 ± 100. Die N-waardes vir die drie PMP-kolomme word in Tabel 3 getoon en die chromatogramme word in Figuur 5A getoon. Vinnige analise teen hoë vloeitempo (700 µl/min) op 'n PMP-kolom, vyf peptiede binne een minuut geëlueer, uitstekende N-waarde van 13 500 ± 330 per kolom (100 x 1,8 mm deursnee), gelykstaande aan 135 000 plate/m² (Fig. 5B). Drie kolomme van dieselfde grootte (binnediameter 100 x 1,8 mm) is gevul met drie verskillende bondels PMP stasionêre fase om die reproduceerbaarheid te toets. Analiete is vir elke kolom aangeteken deur dieselfde toetsmengsel op elke kolom te skei met behulp van optimale elueringskondisies, aantal teoretiese plate N en retensietyd. Die reproduceerbaarheidsdata vir die PMP-kolomme word in Tabel 4 getoon. Die reproduceerbaarheid van die PMP-kolom het goed gekorreleer met baie lae %RSD-waardes soos in Tabel 3 getoon.
Skeiding van peptiedmengsels op 'n PMP-kolom (B) en 'n Ascentis Express RP-Amied-kolom (A), mobiele fase 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), PMP-kolomdimensies (100 x 1.8 mm id), analise Elueringsvolgorde van verbindings: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) en 5 (leusiensuur-enkefalien).
'n PMP-kolom (binnediameter 100 x 1.8 mm) is geëvalueer vir die skeiding van die triptiese hidrolisaat van menslike serumalbumien deur HPLC. Die chromatogram in Figuur 6 toon dat die monsters goed geskei is met baie goeie resolusie. HSA-oplossings is geanaliseer met behulp van 'n vloeitempo van 100 μl/min, 'n mobiele fase van 70/30 asetonitriel/water en 0.1% TFA. Die splitsing van HSA is verdeel in 17 pieke, soos getoon in die chromatogram (Fig. 6), wat ooreenstem met 17 peptiede. Die skeidingsdoeltreffendhede van individuele pieke van die HSA-hidrolisaat is bereken en die waardes word in Tabel 5 getoon.
HSA-triptiese hidrolise is geskei op 'n PMP-kolom (binnediameter 100 x 1.8 mm), vloeitempo (100 μl/min), mobiele fase 60/40 asetonitriel/water, en 0.1% TFA.
waar L die kolomlengte is, η die viskositeit van die mobiele fase is, ΔP die teendruk van die kolom is, en u die lineêre snelheid van die mobiele fase is. Die deurlaatbaarheid van die PMP-kolom was 2.5 × 10–14 m2, die vloeitempo was 25 µl/min, 60/40 v/v is gebruik. ACN/water. Die deurlaatbaarheid van die PMP-kolom (ID 100 × 1.8 mm) was soortgelyk aan dié van ons vorige Ref.34-studie. Die deurlaatbaarheid van 'n kolom gevul met oppervlakkig poreuse deeltjies is 1.7×10.6 µm, 2.5×10-14 m2 vir 5 µm deeltjies43. Daarom is die deurlaatbaarheid van die PMP-fase soortgelyk aan die deurlaatbaarheid van kern-dop deeltjies met 'n grootte van 5 μm.
waar Wx die massa van die kolom gevul met chloroform is, Wy die massa van die kolom gevul met metanol is, en ρ die digtheid van die oplosmiddel is. Digtheid van metanol (ρ = 0.7866) en chloroform (ρ = 1.484). Die totale porositeit van die silika-C18-deeltjiekolom (100 × 1.8 mm ID)34 en ons voorheen bestudeerde C18-ureum31-kolom was onderskeidelik 0.63 en 0.55. Dit beteken dat die teenwoordigheid van ureumligande die deurlaatbaarheid van die stasionêre fase verminder. Aan die ander kant is die totale porositeit van die PMP-kolom (binnediameter 100 × 1.8 mm) 0.60. PMP-kolomme is minder deurlaatbaar as kolomme gepak met C18-gebonde silikadeeltjies omdat die C18-ligande in C18-tipe stasionêre fases in lineêre kettings aan die silikadeeltjies geheg is, terwyl 'n relatief dik polimeer in polistireen-tipe stasionêre fases rondom die deeltjies gevorm word. laag A. In 'n tipiese eksperiment word kolomporositeit soos volg bereken:
Op fig. 7A, B toon Van Deemter-grafieke vir 'n PMP-kolom (id 100 x 1.8 mm) en 'n Ascentis Express RP-Amied-kolom (id 100 x 1.8 mm) onder dieselfde elueringskondisies, 60/40 ACN/H2O en 0.1% TFA 20 µl/min tot 800 µl/min op beide kolomme. Die minimum HETP-waardes teen die optimale vloeitempo (80 µl/min) was onderskeidelik 2.6 µm en 3.9 µm vir die PMP-kolom en die Ascentis Express RP-Amied-kolom. Die HETP-waardes toon dat die skeidingsdoeltreffendheid van die PMP-kolom (100 x 1.8 mm id) baie hoër is as dié van die kommersieel beskikbare Ascentis Express RP-Amied-kolom (100 x 1.8 mm id). Die van Deemter-grafiek in Fig. 7(A) toon dat die afname in N-waarde nie beduidend hoër is met toenemende vloei in vergelyking met ons vorige studie nie. Die hoër skeidingsdoeltreffendheid van die PMP-kolom (id 100 × 1.8 mm) in vergelyking met die Ascentis Express RP-Amied-kolom is gebaseer op die verbeterde deeltjievorm en -grootte en die gesofistikeerde kolompakkingsprosedure wat in huidige werk gebruik word34.
(A) Van Deemter-grafiek (HETP teenoor mobiele fase lineêre snelheid) verkry op 'n PMP-kolom (id 100 x 1.8 mm) in 60/40 ACN/H2O met 0.1% TFA. (B) Van Deemter-grafiek (HETP teenoor mobiele fase lineêre snelheid) verkry op 'n Ascentis Express RP-Amied-kolom (id 100 x 1.8 mm) in 60/40 ACN/H2O met 0.1% TFA.
'n Polêre stasionêre fase van geïnterkaleerde polistireen is voorberei en geëvalueer vir die skeiding van 'n mengsel van sintetiese peptiede en triptiese hidrolisaat van menslike serumalbumien (HSA) in hoëprestasievloeistofchromatografie. Die chromatografiese werkverrigting van PMP-kolomme vir peptiedmengsels is uitstekend in terme van skeidingsdoeltreffendheid en resolusie. Die verbeterde skeidingsdoeltreffendheid van PMP-kolomme is te wyte aan verskeie redes soos silika-deeltjiegrootte en poriegrootte, beheerde sintese van stasionêre fases en komplekse kolompakkingsmateriaal. Benewens die hoë skeidingsdoeltreffendheid, is 'n ander voordeel van hierdie stasionêre fase die lae kolom-teendruk teen hoë vloeitempo's. PMP-kolomme is hoogs reproduceerbaar en kan gebruik word om mengsels van peptiede en triptiese vertering van verskeie proteïene te analiseer. Ons beoog om hierdie kolom te gebruik vir die skeiding van bioaktiewe verbindings van natuurlike produkte, uittreksels van medisinale plante en sampioene in vloeistofchromatografie. In die toekoms sal PMP-kolomme ook geëvalueer word vir die skeiding van proteïene en monoklonale teenliggaampies.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Ondersoek na omgekeerde fasechromatografie peptiedskeidingstelsels deel I: Ontwikkeling van 'n protokol vir kolomkarakterisering. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Ondersoek na omgekeerde fasechromatografie peptiedskeidingstelsels deel I: Ontwikkeling van 'n protokol vir kolomkarakterisering.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., en Petersson, P. Ondersoek van peptiedskeidingstelsels deur omgekeerde-fase-chromatografie, Deel I: Ontwikkeling van 'n protokol vir kolomkarakterisering. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Ondersoek na omgekeerde fasechromatografie peptiedskeidingstelsels deel I: Ontwikkeling van 'n protokol vir kolomkenmerke. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Ondersoek na omgekeerde fasechromatografie peptiedskeidingstelsels deel I: Ontwikkeling van 'n protokol vir kolomkenmerke.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., en Petersson, P. Ondersoek van peptiedskeidingstelsels deur omgekeerde-fase-chromatografie, Deel I: Ontwikkeling van 'n protokol vir kolomkarakterisering.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. et al. Metodes vir die skep van verbeterde aktiewe peptiede vir die behandeling van aansteeklike siektes. Biotegnologie. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintetiese terapeutiese peptiede: Wetenskap en mark. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintetiese terapeutiese peptiede: Wetenskap en mark.Vliege P, Lisowski V, Martinez J en Chreschatyski M. Sintetiese terapeutiese peptiede: wetenskap en mark.Vliege P, Lisowski V, Martinez J en Khreschatsky M. Sintetiese terapeutiese peptiede: wetenskap en mark. geneesmiddelontdekking. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Gevorderde proteomiese vloeistofchromatografie. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Gevorderde proteomiese vloeistofchromatografie.Sien F., Smith RD en Shen Yu. Gevorderde proteomiese vloeistofchromatografie. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Gevorderde proteïensamestelling 液相色谱。Sien F., Smith RD en Shen Yu. Gevorderde proteomiese vloeistofchromatografie.J. Chromatografie. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Gevorderde vloeistofchromatografie-massaspektrometrie is in staat om breëbasis-metabolomika en proteomika te kombineer. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Die rol van UHPLC in farmaseutiese ontwikkeling. Chesnut, SM & Salisbury, JJ Die rol van UHPLC in farmaseutiese ontwikkeling.Chesnut, SM en Salisbury, JJ Die rol van UHPLC in farmaseutiese ontwikkeling.Chesnut, SM en Salisbury, JJ Die rol van UHPLC in geneesmiddelontwikkeling. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Fundamentele en praktiese aspekte van ultrahoëdrukvloeistofchromatografie vir vinnige skeidings. Wu, N. & Clausen, AM Fundamentele en praktiese aspekte van ultrahoëdrukvloeistofchromatografie vir vinnige skeidings.Wu, N. en Clausen, AM Fundamentele en praktiese aspekte van hoëdrukvloeistofchromatografie vir vinnige skeiding. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Basiese en praktiese aspekte van ultrahoëdrukvloeistofchromatografie vir vinnige skeiding.Wu, N. en Clausen, AM Fundamentele en praktiese aspekte van hoëdrukvloeistofchromatografie vir vinnige skeiding.J. Sept. Wetenskap. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Gebruik van ultra-prestasie vloeistofchromatografie in farmaseutiese ontwikkeling. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Gebruik van ultra-prestasie vloeistofchromatografie in farmaseutiese ontwikkeling.Ren, SA en Chelischeff, P. Die gebruik van ultrahoëprestasievloeistofchromatografie in farmaseutiese ontwikkeling. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA & Tchelitcheff, P.Ren, SA en Chelischeff, P. Toepassing van ultra-prestasie vloeistofchromatografie in geneesmiddelontwikkeling.J. Chromatografie. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. 'n Monolitiese makroporeuse hidrogel afgelei van 'n olie-in-water emulsie met 'n hoë interne fase vir doeltreffende suiwering van enterovirus 71. Chemiese projek. Joernaal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Die rol van vloeistofchromatografie in proteomika. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Die rol van vloeistofchromatografie in proteomika.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. en Wilkins, JA Die rol van vloeistofchromatografie in proteomika. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. en Wilkins, JA Die rol van vloeistofchromatografie in proteomika.J. Chromatografie. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Nuwe tendense in omgekeerde-fase vloeistofchromatografiese skeidings van terapeutiese peptiede en proteïene: Teorie en toepassings. & Guillarme, D. Nuwe tendense in omgekeerde-fase vloeistofchromatografiese skeidings van terapeutiese peptiede en proteïene: Teorie en toepassings. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хромитогной хроматог фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Nuwe tendense in die skeiding van terapeutiese peptiede en proteïene deur omgekeerde fase vloeistofchromatografie: teorie en toepassings. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.en Guillarmé, D. Nuwe tendense in die skeiding van terapeutiese peptiede en proteïene deur omgekeerde fase vloeistofchromatografie: teorie en toepassings.J. Pharm. Biomediese Wetenskap. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Tweedimensionele skeiding van peptiede met behulp van die RP-RP-HPLC-stelsel met verskillende pH in eerste en tweede skeidingsdimensies. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Tweedimensionele skeiding van peptiede met behulp van die RP-RP-HPLC-stelsel met verskillende pH in eerste en tweede skeidingsdimensies.Gilar M., Olivova P., Dali AE en Gebler JK Tweedimensionele skeiding van peptiede met behulp van die RP-RP-HPLC-stelsel met verskillende pH in die eerste en tweede skeidingsdimensies.Gilar M., Olivova P., Dali AE en Gebler JK Tweedimensionele skeiding van peptiede met behulp van verskillende pH-waardes in die eerste en tweede skeidingsdimensies met behulp van die RP-RP-HPLC-stelsel. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Ondersoek na die massa-oordrag en kinetiese eienskappe van hoëprestasie-chromatografiekolomme gepak met volledig poreuse en oppervlakkig poreuse C18-deeltjies kleiner as 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Onlangse tendense en analitiese uitdagings in die isolasie, identifikasie en validering van plant bioaktiewe peptiede. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Proteomiese landskap van die koninkryk van die lewe. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Nabehandeling van terapeutiese peptiede deur middel van preparatiewe vloeistofchromatografie. Molecules (Basel, Switserland) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Gemengde-modus chromatografie en die toepassings daarvan op biopolimere. Yang, Y. & Geng, X. Gemengde-modus chromatografie en die toepassings daarvan op biopolimere.Yang, Yu. en Geng, X. Gemengde modus chromatografie en die toepassing daarvan op biopolimere. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Gemengde modus chromatografie en die toepassing daarvan in biopolimere.Yang, Yu. en Gene, X. Gemengde modus chromatografie en die toepassing daarvan op biopolimere.J. Chromatografie. A 1218(49), 8813–8825 (2011).