Dankie dat jy Nature.com besoek het.Die blaaierweergawe wat jy gebruik het beperkte CSS-ondersteuning.Vir die beste ervaring, beveel ons aan dat jy 'n opgedateerde blaaier gebruik (of versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer).In die tussentyd, om volgehoue ​​ondersteuning te verseker, sal ons die webwerf sonder style en JavaScript weergee.
Angustifolius lupien (NLL, Lupinus angustifolius L.) is 'n peulplant wat vir voedselproduksie en grondverbetering gebruik word.Die wêreldwye uitbreiding van NLL as 'n gewas het baie patogene swamme gelok, insluitend lupienantracnose, wat die verwoestende antraknosesiekte veroorsaak.Twee allele, Lanr1 en AnMan, wat verhoogde weerstand verleen, is in NLL-teling gebruik, maar die onderliggende molekulêre meganismes bly onbekend.In hierdie studie is die Lanr1- en AnMan-merkers gebruik om Europese NLL-monsters te skerm.Toetsing van die entstof in 'n beheerde omgewing het die doeltreffendheid van beide weerstandbiedende skenkers bevestig.Differensiële geenuitdrukking profilering is uitgevoer op verteenwoordigende weerstandbiedende en vatbare lyne.Antraknoseweerstand is geassosieer met ooruitdrukking van die geenontologieterme "GO:0006952 Verdedigingsreaksie", "GO:0055114 Redoksproses" en "GO:0015979 Fotosintese".Boonop het die Lanr1(83A:476)-lyn beduidende transkriptoomherprogrammering vinnig na inenting getoon, terwyl die ander lyne 'n vertraging in hierdie reaksie met ongeveer 42 uur getoon het.Verdedigingsreaksies word geassosieer met die TIR-NBS-, CC-NBS-LRR- en NBS-LRR-gene, 10 proteïene betrokke by patogenese, lipiedoordragproteïene, endoglukaan-1,3-β-glukosidase, glisienryke selwandproteïene en gene van reaktiewe suurstofpad.Vroeë reaksies op 83A:476, insluitend versigtige onderdrukking van gene wat met fotosintese geassosieer word, het saamgeval met suksesvolle beskerming tydens die vegetatiewe groeifase van swambiologie, wat daarop dui dat 'n effektor immuniteit aktiveer.Die Mandeloop-reaksie word vertraag, asook die algehele horisontale sleur.
Die smalblaarlupien (NLL, Lupinus angustifolius L.) is 'n hoëproteïengraan wat in die westelike Middellandse See-streek ontstaan1,2.Dit word tans as 'n voedselgewas vir diere en mense verbou.Dit word ook as groenbemesting in wisselboustelsels beskou as gevolg van stikstofbinding deur simbiotiese stikstofbindende bakterieë en algehele verbetering van grondstruktuur.NLL het die afgelope eeu 'n vinnige proses van makmaak ondergaan en is steeds onder hoë teeldruk3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Met die wydverspreide verbouing van NLL het die opeenvolging van patogeniese swamme nuwe landbounisse ontwikkel en nuwe oesvernietigende siektes veroorsaak. Die merkwaardigste vir lupieneboere en telers was die voorkoms van antraknose, wat veroorsaak word deur die patogene swam, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Die merkwaardigste vir lupieneboere en telers was die voorkoms van antraknose, wat veroorsaak word deur die patogene swam, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогноза, вызванного патогныго патогнебриго патогнобирг , Feiler & Hagedorn13. Die opvallendste vir lupieneboere en telers was die opkoms van antraknose wat veroorsaak word deur die patogene swam Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由県它是由県的是炭疽病的出现，它是由県它是由県, Feiler & Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由眵它是由眵Hare. 1 ( Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогениваемого павляется ) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Die opvallendste vir lupieneboere en telers is die opkoms van antraknose wat veroorsaak word deur die patogene swam Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Die vroegste verslae van die siekte het van Brasilië en die Verenigde State gekom, met tipiese simptome wat onderskeidelik in 1912 en 1929 verskyn het.Na ongeveer 30 jaar is die patogeen egter aangewys as Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf van Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Steenman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in Targeted Morphology. & H. Schrenk,. & H. Schrenk,.en H. Schrenk. & H.施伦克，. & H.施伦克，.en H. Schlenk,.Voorlopige siektefenotipering wat in die middel van die 20ste eeu gedoen is, het 'n mate van weerstand in NLL- en geellupien (L. luteus L.)-toetredings getoon, maar alle witlupien- (L. albus L.)-toenames wat getoets is, was hoogs vatbaar15,16.Studies het getoon dat die ontwikkeling van antraknose geassosieer word met verhoogde neerslag (lugvochtigheid) en temperatuur (in die reeks van 12-28°C), wat lei tot 'n skending van weerstand by hoër temperature17, 18. Trouens, die tyd wat nodig is vir konidia om te ontkiem en die siekte om te begin, was vier keer korter by 24°C (4)°C onder hoë humiditeitstoestande (4 ure).Die voortdurende aardverwarming het dus gelei tot die verspreiding van antraknose.Die siekte is egter in Frankryk (1982) en Oekraïne (1983) waargeneem as 'n voorbode van 'n dreigende bedreiging, maar is blykbaar destyds deur die lupienbedryf geïgnoreer20,21.'n Paar jaar later het hierdie verwoestende siekte oor die hele wêreld versprei en ook groot lupienproduserende lande soos Australië, Pole en Duitsland geraak22,23,24.Na 'n antraknose-uitbraak in die middel-1990's, het uitgebreide sifting gelei tot die identifikasie van verskeie weerstandbiedende skenkers in NLL19-monsters.NLL-weerstand teen antraknose word beheer deur twee afsonderlike dominante allele wat in verskillende kiemplasmabronne gevind word: Lanr1 in kultivar Tanjil en Wonga en AnMan in kultivar.Mandalay 25, 26. Hierdie allele komplementeer die molekulêre merkers wat die seleksie van weerstandbiedende kiemplasma in teelprogramme25,26,27,28,29,30 ondersteun.Die weerstandbiedende teellyn 83A:476 wat die Lanr1-alleel dra, is gekruis met die vatbare wilde lyn P27255 om 'n RIL-populasie te verkry wat vir antraknose-weerstand segregeer, wat dit moontlik gemaak het om die Lanr1-lokus aan chromosoom NLL-1131, 32, 33 toe te ken, van 'n flank-genomiese raamwerk-weerstandsposisie met 'n flank-kartering-weerstandsposisie, 33. LL het die ligging van al drie allele op dieselfde chromosoom (NLL-11) geopenbaar, maar in verskillende posisies29,34,35.As gevolg van die klein aantal RIL's en die groot genetiese afstand tussen merkers en ooreenstemmende allele, kan geen betroubare gevolgtrekkings oor hul onderliggende gene gemaak word nie.Aan die ander kant is die gebruik van omgekeerde genetika by lupiene moeilik weens hul baie lae regenerasiepotensiaal, wat genetiese manipulasie omslagtig maak37.
Die ontwikkeling van mak kiemplasma wat die verlangde alleel in die homosigotiese toestand dra, soos 83A:476 (Lanr1) en Mandelup (AnMan), het die deur oopgemaak om antraknoseweerstand te bestudeer in die lig van die teenwoordigheid van opponerende kombinasies van allele in wilde bevolkings.Moontlikhede van molekulêre meganismes.Vergelyk verdedigingsreaksies gegenereer deur spesifieke genotipes.Hierdie studie het die vroeë transkriptoomreaksie van NLL op C. lupini-inenting geëvalueer.Eerstens is 'n Europese NLL-kiemplasmapaneel wat 215 lyne bevat, gekeur deur gebruik te maak van molekulêre merkers wat die Lanr1- en AnMan-allele merk.Antraknose fenotipering is dan uitgevoer op 50 NLL lyne, voorheen geselekteer vir molekulêre merkers, onder gekontroleerde toestande.Gebaseer op hierdie eksperimente, is vier lyne wat verskil in antraknose-weerstand en Lanr1/AnMan-alleliese samestelling geselekteer vir differensiële verdediging geen-uitdrukking profilering deur gebruik te maak van twee komplementêre benaderings: hoë-deurset RNA volgordebepaling en intydse PCR kwantifisering.
Sifting van 'n stel NLL-kiemplasma (N = 215) met merkers Lanr1 (Anseq3 en Anseq4) en AnMan (Anseq4) en AnMan (AnManM1) het getoon dat slegs een lyn (95726, naby Salamanca-b) die "weerstand"-alleel versterk vir alle merkers van alle merkers' (~sus wat gevind word in die allele merkers' (~) 73,5%) lyne.Dertien lyne het twee "weerstandige" allele van die Lanr1 merker geproduseer, en 8 lyne het "weerstandige" allele van Lanr1 geproduseer.merker.Die "weerstand" alleel van die AnMan merker (Aanvullende Tabel S1).Twee lyne was heterosigoties vir die Anseq3 merker en een heterosigoties vir die AnManM1 merker.42 lyne (19.5%) het teenoorgestelde fases van die Anseq3 en Anseq4 allele gedra, wat 'n hoë frekwensie van rekombinasie tussen hierdie twee lokusse aandui.Antraknose fenotipes onder gekontroleerde toestande (Aanvullende Tabel S2) het veranderlikheid in die weerstand van die getoetste genotipes geopenbaar, wat in die erns van antraknose weerspieël is.Verskille in gemiddelde tellings het gewissel van 1,8 (matig weerstandbiedend) tot 6,9 (vatbaar) en plantgewigsverskille het gewissel van 0,62 (vatbaar) tot 4,45 g (weerstandig). Daar was 'n beduidende korrelasie tussen waardes wat in twee herhalings van die eksperiment waargeneem is (0.51 vir siekte-ernstellings, P = 0.00017 en 0.61 vir plantgewig, P < 0.0001) sowel as tussen hierdie twee parameters (− 0.59 en - 0.77, P < 0.0001). Daar was 'n beduidende korrelasie tussen waardes waargeneem in twee herhalings van die eksperiment (0.51 vir siekte-ernstellings, P = 0.00017 en 0.61 vir plantgewig, P < 0.0001) sowel as tussen hierdie twee parameters (− 0.59 en - 0.77, P < 0.0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми in двух повторностях эксперимента = 0,51 fondse 0,00017 en 0,61 vir массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 en -0,77, 0,00 < 01,01). 'n Beduidende korrelasie is gevind tussen die waardes wat in twee herhalings van die eksperiment waargeneem is (0.51 vir siekte-ernstellings, P = 0.00017 en 0.61 vir plantgewig, P < 0.0001), sowel as tussen hierdie twee parameters (- 0.59 en -0.77, P < 0.000)).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分.0.0.0.7物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P < 0.0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 为丆庈察 5. 1 ， p = 0.00017 ， 植物 为 为 0.61 ， p <0.0001） 以及 两 个 参数 之间 （（-（， 和 （–5.9.和– 0,59 和-0,77，P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценколи тявиях, 0, 0, 0, 0, 0 0017 и масса растения 0,61, P <0,0001), en между этими двумя параметрами (-0,59 en -0,0001) 0,77, P <0,0001. Daar was 'n beduidende korrelasie tussen die waardes wat in duplikaat waargeneem is (siekte-ernstelling 0.51, P = 0.00017 en plantgewig 0.61, P < 0.0001) en tussen hierdie twee parameters (-0.59 en -0 .0001) 0.77, P<0.001. ).Tipiese simptome wat by vatbare plante gesien word, sluit in knik en draai van die stam wat soos 'n "herdersboog"-struktuur lyk, gevolg deur ovaal letsels met oranje/pienk sporozoiete (Aanvullende Fig. 1).Australiese toetredings wat die Lanr1 (83A:476 en Tanjil) en AnMan (Mandelup) gene dra, is matig weerstandbiedend, 0,0331 en 0,0036.Sommige lyne wat ook "weerstandige" Lanr1- en/of AnMan-allele dra, toon simptome van die siekte.
Interessant genoeg, het 'n paar NLL-lyne wat enige "weerstandige" merker-alleel ontbreek, 'n hoë vlak van antraknoseweerstand (vergelykbaar of hoër as vir Lanr1- of AnMan-genotipes) geopenbaar, soos Boregine (P-waarde < 0,0001 vir beide parameters), Bojar (P-waarde < 0,0001 vir telling en 0,0001 vir B-5-gewig) en 0,001 vir B-5-plant-waarde (0,001 vir B-5/0. 1 vir telling en nie-beduidend vir gewig). Interessant genoeg, het 'n paar NLL-lyne wat enige "weerstandige" merker-alleel ontbreek, 'n hoë vlak van antraknoseweerstand (vergelykbaar of hoër as vir Lanr1- of AnMan-genotipes) geopenbaar, soos Boregine (P-waarde < 0,0001 vir beide parameters), Bojar (P-waarde < 0,0001 vir telling en 0,0001 vir B-5-gewig) en 0,001 vir B-5-plant-waarde (0,001 vir B-5/0. 1 vir telling en nie-beduidend vir gewig). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, покасусаливыки антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (gesonde P <0,0001 vir jar), 0,0001 vir maatreëls en 0,001 vir массы растения) en популяции B-549/79b (gesondheid P <0,0001 vir komponente en nuwe fasiliteite). Interessant genoeg het verskeie NLL-lyne wat enige 'weerstandige' merker-alleel ontbreek, 'n hoë vlak van weerstand teen antraknose getoon (vergelykbaar met of hoër as vir Lanr1- of AnMan-genotipes), soos Boregine (P-waarde < 0.0001 vir beide parameters), Bojar (P-waarde < 0.0001 vir evaluasie van 0.0001 vir evaluasie) en B-9b-waarde en B-9b-waarde en B-9b-waarde en B-9b. .0001 vir evaluering en nie betekenisvol vir gewig nie).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的瀅疽1基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值逼高高. 01）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）. Dit is interessant dat sommige NLL-stelsels wat nie enige "antigeniese" merkers het nie, hoë horisontale weerstand toon (gelykstaande aan Lanr1- of AnMan-gene of hoër), soos Boregine (beide parameters P < 0.0001), Bojar (P-waarde < 0.0001, plantgewig 0.001) en stam B-549/0.00 beduidende waarde < 79b, nie gewig nie. Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», покасазалич антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (vir P обоих параметров <0,000, 100,001), а растения 0,001) en популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Interessant genoeg het sommige NLL-lyne wat enige 'weerstand'-merker-allele ontbreek, hoë vlakke van antraknose-weerstand getoon (vergelykbaar met of hoër as Lanr1- of AnMan-genotipes), soos Boregine (P-waarde vir beide parameters <0.0001), Bojar (P-waarde < 0.0001, plantgewig 0.00b <0.00b 9) en populasie B-00b <0.00b. 1, gewig nie betekenisvol nie).Hierdie verskynsel dui op die moontlikheid van 'n nuwe genetiese bron van weerstand, wat die waargenome gebrek aan korrelasie tussen merkergenotipes en siektefenotipes verklaar (P-waardes van ~0.42 tot ~0.98).Die Kolmogorov-Smirnov-toets het dus getoon dat die data oor antraknoseweerstand ongeveer normaal versprei is vir tellings (P-waardes 0.25 en 0.11) en plantmassa (P-waardes 0.47 en 0.55), wat daarop dui dat ek veronderstel dat meer allele as Lanr1 en AnMan betrokke is.
Gebaseer op die resultate van antraknoseweerstandsifting, is 4 lyne geselekteer vir transkriptoomanalise: 83A:476, Boregine, Mandelup en Population 22660. Hierdie lyne is hertoets vir miltsiekteweerstand in inokulasie-eksperimente deur RNA-volgordebepaling, mits dit dieselfde was as in die vorige toets.Die tellingwaardes was soos volg: Boregin (1.71 ± 1.39), 83A: 476 (2.09 ± 1.38), Mandelup (3.82 ± 1.42) en bevolking 22660 (6.11 ± 1.29).
Die Illumina NovaSeq 6000-protokol het 'n gemiddeld van 40.5 Mread-pare per monster behaal (29.7 tot 54.4 Mreads) (Aanvullende Tabel S3).Belyningtellings in die verwysingsvolgorde het gewissel van 75.5% tot 88.6%.Die gemiddelde korrelasie van leestellingdata tussen eksperimentele variante tussen biologiese herhalings het gewissel van 0,812 tot 0,997 (gemiddeld 0,959). Uit die 35 170 gene wat ontleed is, het 2 917 geen uitdrukking geopenbaar nie, en die ander 4 785 gene is op weglaatbare vlak uitgedruk (basisgemiddeld < 5). Uit die 35 170 gene wat ontleed is, het 2 917 geen uitdrukking geopenbaar nie, en die ander 4 785 gene is op weglaatbare vlak uitgedruk (basisgemiddeld < 5). Ongeveer 35 170 maande 2917 geen verbruikers nie, meer as 4785 verbruikers. зовое среднее <5). Van die 35 170 gene wat ontleed is, het 2917 geen uitdrukking getoon nie, en die oorblywende 4 785 gene is op 'n weglaatbare vlak (basisgemiddeld <5) uitgedruk.在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可的表达叟忽值< 5).35 170 Ongeveer 35 170 nommers 2917 is nie beskikbaar nie, en 4785 nommers het nie meer nodig nie (ons нее значение <5). Van die 35 170 gene wat ontleed is, is 2917 nie uitgedruk nie en die oorblywende 4 785 gene het weglaatbare uitdrukking gehad (basisgemiddeld <5).Dus, die aantal gene wat beskou word as uitgedruk (basisgemiddeld ≥ 5) tydens die eksperiment was 27 468 (78.1%) (Aanvullende Tabel S4).
Vanaf die eerste tydstip het alle NLL-lyne gereageer op die inokulasie van C. lupini (stam Col-08) deur die transkripsie te herprogrammeer (Tabel 1), maar betekenisvolle verskille is egter tussen die lyne waargeneem.Dus, die weerstandslyn 83A:476 (wat die Lanr1-geen dra) het beduidende transkriptoomherprogrammering by die eerste tydpunt (6 hpi) getoon met 'n 31-69-voudige toename in die aantal geïsoleerde op- en af-gene in vergelyking met ander tydpunte op hierdie tydstip.Daarbenewens was hierdie piek van korte duur, aangesien die uitdrukking van slegs 'n paar gene aansienlik verander het op die tweede tydpunt (12 hpi).Interessant genoeg, Boregine, wat ook 'n hoë vlak van weerstand in die enttoets getoon het, het nie sulke massiewe transkripsionele herprogrammering tydens die eksperiment ondergaan nie.Die aantal differensieel uitgedrukte gene (DEG) was egter dieselfde vir Boregine en 83A:476 by 12 HPI.Beide Mandelup en bevolking 22660 het DEG-pieke op die laaste tydpunt (48 l/s) getoon, wat 'n relatiewe vertraging in verdedigingsreaksies aandui.
Omdat 83A:476 massiewe transkriptoomherprogrammering ondergaan het in reaksie op C. lupini by 6 HPI in vergelyking met alle ander lyne, was ~91% van die DEG's wat op hierdie tydstip waargeneem is, afstammingsspesifiek (Fig. 1).Daar was egter 'n mate van oorvleueling in vroeë response tussen studielyne, aangesien 68.5%, 50.9% en 52.6% DEG in onderskeidelik Boregine, Mandelup en bevolking 22660 oorvleuel het met dié wat in 83A:476 in sekere tydstip gevind is.Hierdie DEG's het egter slegs 'n klein fraksie (0.97-1.70%) van alle DEG's uitgemaak wat tans met 83A:476 opgespoor word.Boonop was 11 DEG'e van alle lyne op hierdie tydstip koherent (Aanvullende Tabelle S4-S6), insluitend algemene komponente van plantverdedigingsreaksies: lipiedoordragproteïen (TanjilG_32225), endoglukan-1,3-β-glukosiedensiem (TanjilG_23382) (TanjilG_23382) (TanjilG_23382) proteïene soos T2AMJ824 en S2AMJ824, stres-in 5AMJ824 G_31531), basiese latexproteïen (TanjilG_32352), en twee glisienryke strukturele selwandproteïene (TanjilG_19701 en TanjilG_19702).Daar was ook 'n relatief hoë oorvleueling in transkriptoomreaksies tussen 83A:476 en Boregine by 24 HPI (totaal 16-38% DEG) en tussen Mandelup en Populasie 22660 by 48 HPI (totaal 14-20% DEG).
Venn-diagram wat die aantal differensieel uitgedrukte gene (DEG) in smalblaarlupien (NLL)-lyne toon wat met Colletotrichum lupini (stam Col-08 verkry is van lupienvelde in Wierzhenice, Pole, 1999) ingeënt is.Die NLL-lyne wat ontleed is, was: 83A:476 (weerstandig, dra die Lanr1-alleel), Boregine (weerstandig, genetiese agtergrond onbekend), Mandelup (matig weerstandbiedend, dra die AnMan-alleel) en populasie 22660 (baie vatbaar).Die afkorting hpi staan ​​vir ure na inenting.Nulwaardes is verwyder om die grafiek te vereenvoudig.
Die stel ooruitgedrukte gene by 6 hpi is ontleed vir die teenwoordigheid van kanoniese R-geendomeine (Aanvullende Tabel S7).Hierdie studie het transkriptoominduksie van klassieke siekteweerstandsgene met NBS-LRR-domeine slegs by 83A:476 geopenbaar.Hierdie stel het bestaan ​​uit een TIR-NBS-LRR-geen (tanjilg_05042), vyf CC-NBS-LRR-gene (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, en tanjilg_16162), en Vier NBS-LR, 16162, en Njilg_16162) 16162) sowel as Vier NBS-Lrr (tanjilg_16162) en Vier NBS-LRR (TANJILG_16162).Al hierdie gene het kanoniese domeine wat in bewaarde rye gerangskik is.Benewens die NBS-LRR-domeingene, is verskeie RLL-kinases teen 6 hpi geaktiveer, naamlik een in Boregine (TanjilG_19877), twee in Mandelup (TanjilG_07141 en TanjilG_19877) en in populasie 22660 (TanjilG_07A 1 in TanjilG_07G en twee in TanjilG_07G) en twee :476.
Gene met aansienlik veranderde uitdrukking in reaksie op inenting met C. lupini (stam Col-08) is onderwerp aan Gene Ontology (GO) verrykingsanalise (Aanvullende Tabel S8). Die mees oorverteenwoordigde biologiese prosesterm was "GO:0006952 verdedigingsreaksie" wat in 6 uit 16 (tyd × lyn) kombinasies met hoë betekenis (P waarde < 0,001) verskyn het (Fig. 2). Die mees oorverteenwoordigde biologiese prosesterm was "GO:0006952 verdedigingsreaksie" wat in 6 uit 16 (tyd × lyn) kombinasies met hoë betekenis (P waarde < 0,001) verskyn het (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитнетый», 6полятый из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (snaчение P <0,001) (рис. 2). Die mees dikwels oorverteenwoordigde biologiese prosesterm was 'GO:0006952 verdedigingsreaksie', wat in 6 van 16 (tyd × lyn) kombinasies met 'n hoë betekenis (P waarde < 0,001) verskyn het (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现圴圴圴庐庐缄组庐缄绉个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）. Die mees verteenwoordigende biologiese prosesterm is “GO:0006952 verdedigingsreaksie”, wat in 6 van die 16 (时间×线) kombinasies voorkom, met hoë betekenis (P-waarde < 0.001) (图2) . Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Verdedigingsreaksie», колся за 16 van 16 инаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Die mees dikwels oorverteenwoordigde biologiese prosesterm was 'GO:0006952 Verdedigingsreaksie', wat in 6 uit 16 kombinasies (tyd × lyn) met 'n hoë betekenis (P-waarde < 0,001) verskyn het (Fig. 2).Hierdie term was oorverteenwoordig op twee tydpunte in 83A: 476 en Boregine (6 en 24 hpi) en op een tydstip in Mandelup en Population 22660 (12 en 6 hpi, onderskeidelik).Dit is 'n verwagte resultaat, wat die antifungale reaksie van die weerstandbiedende lyne beklemtoon.Daarbenewens het 83A:476 op C. lupini gereageer deur gene wat verband hou met die oksidatiewe uitbarsting wat deur die term "GO:0055114 redoksproses" verteenwoordig word, vinnig te induseer, wat 'n spesifieke verdedigingsreaksie aandui, terwyl Boregine spesifieke verdedigingsreaksies geopenbaar het, wat verband hou met die term 'GO'.:0006950 Stresreaksie”.Bevolking 22660 het die horisontale weerstandsreaksie wat sekondêre metaboliete behels, geaktiveer, en beklemtoon die oormatige aantal terme "GO:0016104 Proses van triterpeenbiosintese" en "GO:0006722 Proses van triterpeenmetabolisme" (albei terme behoort aan dieselfde stel gene), met inagneming van term die resultate van die GO2-verrykings-reaksie, 6-bevolkingsreaksie, 6-bevolking, 0. Daarbenewens sluit vroeë reaksie 83A:476 (6 hpi) en vertraagde reaksie Mandelup en Population 22660 die term GO:0015979 'fotosintese' en ander verwante biologiese prosesse in.
Die bioprosesgeenontologieterme wat geselekteer is in die annotasie van differensieel uitgedrukte gene tydens transkriptoomreaksies van smalblaarlupien (NLL) wat met miltsiekte-lupien (Kol-08-stam verkry van lupienvelde in Wierzhenice, Pole, in 1999) ingeënt is, is grootliks oordryf.Die NLL-lyne wat ontleed is, was: 83A:476 (weerstandig, dra die homosigotiese Lanr1-alleel), Boregine (weerstandige, onbekende genetiese agtergrond), Mandelup (matig weerstandbiedend, dra die homosigotiese AnMan-alleel) en populasie 22660 (vatbaar).
Omdat hierdie studie daarop gemik was om gene te identifiseer wat bydra tot antraknoseweerstand, is die gene wat aan die terme GO “GO: 0006952 Defensive responses” en “GO: 0055114 Redox processes” toegeken is, met afsnypunte ontleed aangesien basislyn ≥ 30 met ten minste een lyn beteken.× tydstip wat statisties beduidende waardes van log2 kombineer (vouverandering).Die aantal gene wat aan hierdie kriteria voldoen, was 65 vir GO:0006952 en 524 vir GO:0055114.
83A:476 het twee DEG-pieke geopenbaar wat met die term GO:0006952 geannoteer is, die eerste by 6 gene per duim (64 gene, op- en afregulering) en die tweede by 24 gene per duim (15 gene, slegs op-regulering).Boregine het ook getoon dat GO:0006952 'n hoogtepunt bereik het op dieselfde tydstip, maar met minder DEG (11 en 8) en voorkeuraktivering.Mandeloop het twee pieke van GO:0006952 by 12 en 48 HPI getoon, beide het 12 gene gedra (die eerste met aktiverende gene, en die tweede met slegs onderdrukkende gene), terwyl die 22660 populasie by 6 HPI (13 gene) 'n groter oorheersing van die toenamepiek gehad het.regulasie.Daar moet kennis geneem word dat 96.4% van GO:0006952 DEG in hierdie pieke dieselfde tipe reaksie (op of af) gehad het, wat 'n beduidende oorvleueling in verdedigingsreaksies aandui ten spyte van verskille in die aantal betrokke gene.Die grootste groep reekse wat met die term GO:0006952 verband hou, kodeer die Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-agtig), wat aan die klas 10 patogenese-geassosieerde proteïen (PR-10) proteïenklade en die kernproteïenlatex behoort.soortgelyke (MLP-agtige) proteïen) proteïen (Fig. 3).Die twee groepe het verskil in die aard van uitdrukking en die rigting van die reaksie.Die gene wat SAM22-agtige proteïene kodeer, het konsekwente en beduidende induksie op vroeë tydpunte (6 of 12 hpi) getoon en was oor die algemeen onreageer aan die einde van die eksperiment (48 hpi), terwyl MLP-agtige proteïene koördinasie by 6 hpi getoon het.hpi.83A:476 en Mandelup teen 48 pk/in, byna alle ander datapunte het nie gereageer nie.Boonop het verskille in uitdrukkingsprofiele van SAM22-agtige proteïengene gevolg op waargenome variasie in antraknoseweerstand, aangesien meer weerstandbiedende lyne meer tydpunte gehad het wat hierdie gene aansienlik induseer as meer vatbare gene.Nog 'n LlR18A/B-agtige PR-10-geen het 'n baie soortgelyke uitdrukkingspatroon as die SAM22-agtige proteïengeen getoon.
Die hoofkomponente van die biologiese prosesterm “GO:0006952 Defence Response” en die uitdrukkingspatrone van kandidaatgene van die Lanr1- en AnMan-allele is geïdentifiseer.Die Log2-skaal verteenwoordig log2-waardes (vou verandering) tussen geïnokuleerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkry vanaf lupienvelde, Wizhenica, Pole, 1999) en kontrole (skyn-geïnte) plante op dieselfde tydstip.Die volgende smalblaarlupienlyne is ontleed: 83A:476 (weerstandig, dra die homosigotiese Lanr1-alleel), Boregine (weerstandig, genetiese agtergrond onbekend), Mandelup (matig weerstandbiedend, dra die homosigotiese AnMan-alleel) en Populasie 22660 (vatbaar).
Daarbenewens is die uitdrukkingsprofiele van RNA-volgende kandidaat-gene Lanr1 (TanjilG_05042) en AnMan (TanjilG_12861) geëvalueer (Fig. 3).Die TanjilG_05042-geen het 'n beduidende reaksie (aktivering) by 83A:476 slegs by die eerste tydpunt (6 hpi) getoon, terwyl TanjilG_12861 slegs op twee tydpunte in Mandeloop betekenisvol was: 6 hpi (afregulering) en 24 hpi (6 hpi).Met.).verstelbaar)).
Die gene wat die meeste ooruitgedruk is in die term GO:0055114 "redoksproses" was gene wat vir sitochroom P450-proteïene en peroksidase kodeer (Fig. 4).Vir monsters geïsoleer vanaf 83A:476 by 6 HPI, is maksimum of minimum log2 (vou verandering) waardes (vir 86.6% van gene) oor die algemeen waargeneem tussen geïnokuleerde en kontrole plante, wat die hoë reaksie van hierdie genotipe op inenting van seks beklemtoon.83A:476 het die mees betekenisvolle GO getoon: 0055114 DEG by 6 hpi (503 gene), terwyl die res van die lyne op 48 hpi (Boregine, 31 gene; Mandelup, 85 gene; en Populasie 22660, 78 gene) getoon het.In die meeste gene van die GO:0055114-familie is twee tipes reaksies op inenting (aktivering en inhibisie) waargeneem.Interessant genoeg is dat tot 97,6% van die DEG's wat vir die term GO geïdentifiseer is: 0055114 in Mandelupe op 48 pk, hierdie waarnemings dui daarop dat, ondanks die aansienlik kleiner skaal (dit wil sê, die aantal gemuteerde redoksgene, 85 teenoor 503), die vertraagde transkriptoom -reaksies van Mandeloup tot Anthracnose is, is die vroeë reaksie van 83A: 476.In Boregine en Population 22660 is hierdie konvergensie laer op 51,6% en 75,6%, onderskeidelik.
Die uitdrukkingspatrone van die hoofkomponente van die term van die biologiese proses "GO:0055114 Redoksproses" is geopenbaar.Die Log2-skaal verteenwoordig log2-waardes (vou verandering) tussen geïnokuleerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkry vanaf lupienvelde, Wizhenica, Pole, 1999) en kontrole (skyn-geïnte) plante op dieselfde tydstip.Die volgende smalblaarlupienlyne is ontleed: 83A:476 (weerstandig, dra die homosigotiese Lanr1-alleel), Boregine (weerstandig, genetiese agtergrond onbekend), Mandelup (matig weerstandbiedend, dra die homosigotiese AnMan-alleel) en Populasie 22660 (vatbaar).
83A:476 Transkriptomiese reaksies op inenting met C. lupini (stam Col-08) het ook gekoördineerde stilmaak van gene ingesluit wat toegeskryf word aan die term GO:0015979 "fotosintese" en ander verwante biologiese prosesse (FIG. 5).Hierdie GO:0015979 DEG-stel het 105 gene bevat wat aansienlik onderdruk is teen 6 hpi by 83A:476.In hierdie subset is 37 gene ook afgereguleer in Mandelup teen 48 HPI en 35 op dieselfde tydstip in die 22660 populasie, insluitend 19 DEG's gemeen aan beide genotipes.Geen DEG's wat verband hou met term GO: 0015979 is beduidend geaktiveer in enige kombinasie (reël x tyd).
Die uitdrukkingspatrone van die hoofkomponente van die term van die biologiese proses "GO: 0015979 Fotosintese" is geopenbaar.Die Log2-skaal verteenwoordig log2-waardes (vou verandering) tussen geïnokuleerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkry vanaf lupienvelde, Wizhenica, Pole, 1999) en kontrole (skyn-geïnte) plante op dieselfde tydstip.Die volgende smalblaarlupienlyne is ontleed: 83A:476 (weerstandig, dra die homosigotiese Lanr1-alleel), Boregine (weerstandig, genetiese agtergrond onbekend), Mandelup (matig weerstandbiedend, dra die homosigotiese AnMan-alleel) en Populasie 22660 (vatbaar).
Gebaseer op die resultate van differensiële uitdrukkingsanalise en vermoedelik betrokke by verdedigingsreaksies teen patogeniese swamme, is hierdie stel van sewe gene gekies vir kwantifisering van uitdrukkingsprofiele deur intydse PCR (Aanvullende Tabel S9).
Die vermeende proteïengeen TanjilG_10657 is betekenisvol geïnduseer in alle bestudeerde lyne en tydpunte in vergelyking met kontrole (nabootsende) plante (Aanvullende Tabelle S10, S11).Daarbenewens het die uitdrukkingsprofiel van TanjilG_10657 'n toenemende neiging in die loop van die eksperiment vir alle lyne getoon.Bevolking 22660 het die hoogste sensitiwiteit van TanjilG_10657 vir inenting getoon met 114-voudige aktivering en die hoogste relatiewe uitdrukkingsvlak (4.4 ± 0.4) by 24 HPI (Fig. 6a).Die PR10 LlR18A proteïen geen TanjilG_27015 het ook aktivering oor alle lyne en tydpunte getoon, met statistiese betekenisvolheid by die meeste datapunte (Fig. 6b).Soortgelyk aan TanjilG_10657, is die hoogste relatiewe uitdrukkingsvlak van TanjilG_27015 waargeneem in die 22660 geïnokuleerde populasie by 24 HPI (19.5 ± 2.4).Die suur-endokitinase-geen TanjilG_04706 was aansienlik opgereguleer in alle lyne en op alle tydpunte behalwe vir Boregine 6 hpi (Fig. 6c).Dit is sterk geïnduseer by die eerste tydpunt (6 HPI) by 83A:476 (met 10.5 keer) en matig verhoog in ander lyne (met 6.6-7.5 keer).Tydens die eksperiment het die uitdrukking van TanjilG_04706 op soortgelyke vlakke in 83A:476 en Boregine gebly, terwyl dit in Mandelup en Population 22660 aansienlik toegeneem het en relatief hoë waardes bereik het (5.9 ± 1.5 en 6.2 ± 1.5, onderskeidelik).Die endoglukaan-1,3-β-glukosidase-agtige geen TanjilG_23384 het hoë aktivering getoon by die eerste twee tydpunte (6 en 12 hpi) in alle lyne behalwe populasie 22660 (Fig. 6d).Die hoogste relatiewe uitdrukkingsvlakke van TanjilG_23384 is by die tweede tydpunt (12 hpi) in Mandelup (2.7 ± 0.3) en 83A:476 (1.5 ± 0.1) waargeneem.By 24 HPI was TanjilG_23384 uitdrukking relatief laag in alle bestudeerde lyne (vanaf 0.04 ± 0.009 tot 0.44 ± 0.12).
Uitdrukkingsprofiele van geselekteerde gene (ag) geopenbaar deur kwantitatiewe PCR.Die getalle 6, 12 en 24 verteenwoordig ure na inenting.Die LanDExH7 en LanTUB6 gene is gebruik vir normalisering en LanTUB6 is gebruik vir inter-reeks kalibrasie.Foutstawe verteenwoordig die standaardafwyking gebaseer op drie biologiese herhalings, wat elk die gemiddeld van drie tegniese herhalings is. Die statistiese betekenisvolheid van verskille in die uitdrukkingsvlakke tussen die geïnokuleerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkry in 1999 van die lupienveld in Wierzenica, Pole) en kontrole (skyn-geïnte) plante word bo datapunte gemerk (*P waarde < 0.05, **P waarde ≤ .0 **P waarde ≤ .0). Die statistiese betekenisvolheid van verskille in die uitdrukkingsvlakke tussen die geïnokuleerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkry in 1999 van die lupienveld in Wierzenica, Pole) en kontrole (skyn-geïnte) plante word bo datapunte gemerk (*P waarde < 0.05, **P waarde ≤ .0 **P waarde ≤ .0). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, 9 пгв 19 пгл. юпина в Верженице, Польша) en контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данными (5, 0, 0, 0 p. ≤ 0,01, ***snaчение P ≤ 0,001). Statisties beduidende verskille in uitdrukkingsvlakke tussen geïnokuleerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkry in 1999 van 'n lupienveld in Wierzhenice, Pole) en kontrole (skyn-geïnte) plante word bo die datapunte (*P-waarde < 0.05, **P-waarde ≤,***0.0.0) aangeteken.接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（騡种缉（騡种缉接水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0.05, **P 值≤ 0.01, ***P 值)≤ 0.0)接种 （colletotrichum lupini ， colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 撌 鯹煤秉 缈平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤。01)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полюсче Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над тонтрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точными (p. начение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Statisties beduidende verskille in uitdrukkingsvlakke tussen geïnokuleerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkry van lupienlande in Verzhenice, Pole, in 1999) en kontrole (skyn-geïnte) plante word bo die datapunte (*P-waarde < 0.05 , **P-waarde ≤.*** 0.1, 0).Die NLL-lyne wat ontleed is, was: 83A:476 (weerstandig, dra die homosigotiese Lanr1-alleel), Mandelup (matig weerstandig, dra die homosigotiese AnMan-alleel), Boregine (weerstandig, onbekende genetiese agtergrond) en populasie 22660 (vatbaar).
Die kandidaat-geen TanjilG_05042 by die Lanr1 lokus het 'n merkbaar verskillende uitdrukkingspatroon getoon van die profiele verkry uit RNA-volgorde studies (Fig. 6e).Beduidende aktivering van hierdie geen is waargeneem in Mandelup en die 22660 populasie (tot 39.7 en 11.7 keer, onderskeidelik), wat tot relatief hoë uitdrukkingsvlakke gelei het (tot 1.4 ± 0.14 en 7.2 ± 1.3, onderskeidelik).83A:476 het ook 'n mate van opregulering van die TanjilG_05042-geen geopenbaar (tot 3.8-voudig), maar die relatiewe uitdrukkingsvlakke wat behaal is (0.044 ± 0.002) was meer as 30-voudig laer as dié wat in Mandelup en die 22660-populasie waargeneem is.ontleed deur qPCR het beduidende verskille in uitdrukkingsvlakke tussen genotipes in skyn-geïnteerde (kontrole) variante getoon, wat 'n 58-voudige verskil bereik het tussen populasies 22660 en 83A:476, sowel as tussen populasies 22660 en 22660. 'n Tweevoudige verskil is bereik tussen Boregine en Mandalup.
Die kandidaatgeen by die AnMan-lokus, TanjilG_12861, is geaktiveer in reaksie op inenting in 83A:476 en Mandelup, was neutraal in die 22660-populasie, en is in Boregine afgereguleer (Fig. 6f).Die relatiewe uitdrukking van die TanjilG_12861 geen was die hoogste in geïnokuleerde 83A: 476 (0.14±0.01).Die 17.4 kDa klas I hitteskok proteïen geen TanjilG_05080 HSP17.4 het laer relatiewe uitdrukkingsvlakke in alle bestudeerde stamme en tydpunte getoon (Fig. 6g).Die hoogste waarde is waargeneem by 24 HPI in die 22660 populasie (0.14 ± 0.02, 'n agtvoudige toename in reaksie op inenting).
Vergelyking van geenuitdrukkingsprofiele (Fig. 7) het 'n hoë korrelasie tussen TanjilG_10657 en vier ander gene aan die lig gebring: TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.6G_0, en TanjilG_05042 (r = 0.6G) (7.80).Sulke resultate kan ko-regulering van hierdie gene tydens verdedigingsreaksies aandui.Die TanjilG_12861- en TanjilG_23384-gene het verskillende uitdrukkingsprofiele getoon met laer Pearson-korrelasiekoëffisiëntwaardes (onderskeidelik van 0.08 tot 0.43 en -0.19 tot 0.28) in vergelyking met ander gene.
Korrelasies tussen geenuitdrukkingsprofiele is opgespoor deur gebruik te maak van kwantitatiewe PCR.Die volgende smalblaarlupienlyne is ontleed: 83A:476 (weerstandig, dra die homosigotiese Lanr1-alleel), Mandelup (matig weerstandbiedend, dra die homosigotiese AnMan-alleel), Boregine (weerstandig, genetiese agtergrond onbekend), en Bevolking 22660 (vatbaar).Drie tydpunte is bereken (6, 12 en 24 uur na inenting), insluitend ingeënte (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkry vanaf lupienlande in Wierzhenice, Pole, in 1999) en kontrole (skyn-geïnte) plante.Die skaal toon die waarde van die Pearson-korrelasiekoëffisiënt.
Gebaseer op data verkry teen 6 perdekrag per duim, is WGCNA uitgevoer op 9981 DEG wat geïdentifiseer is deur geïnokuleerde en beheerplante te vergelyk om op vroeë verdedigingsreaksies te fokus (Aanvullende Tabel S12).Twee-en-twintig geenmodules (klusters) is gevind met gekorreleerde (positiewe of negatiewe) uitdrukkingsprofiele tussen genotipes en eksperimentele variante. Gemiddeld het geenuitdrukkingsvlakke gedaal in volgorde 83A:476 > Mandelup > Boregine > Bevolking 22660 (in beide variante was hierdie neiging egter sterker in kontroleplante). Gemiddeld het geenuitdrukkingsvlakke gedaal in volgorde 83A:476 > Mandelup > Boregine > Bevolking 22660 (in beide variante was hierdie neiging egter sterker in kontroleplante). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Bevolking 22660 (в обоих вариантах, боих вариантах, боих вариантах, ла сильнее у контрольных растений). Gemiddeld het geenuitdrukkingsvlakke in die orde 83A:476 > Mandelup > Boregine > Bevolking 22660 afgeneem (in beide variante was hierdie neiging egter sterker in kontroleplante).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Bevolking 22660在对照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> bevolking 22660 的 顺序 下降 （， 県 圿在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。..... В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Bevolking 22660 (однако в обоиантаэ ильнее у контрольных растений). Gemiddeld het geenuitdrukkingsvlakke in die reeks 83A:476 > Mandelup > Boregine > Bevolking 22660 afgeneem (in beide variante was hierdie neiging egter sterker in kontroleplante).Inenting het gelei tot opregulering van geenuitdrukking, veral in modules 18, 19, 14, 6 en 1 (in dalende volgorde van effek), negatiewe regulering (bv. modules 9 en 20) of met neutrale effekte (bv. modules 11, 22, 8 en 13).GO-termverrykingsanalise (Aanvullende Tabel S13) het "GO: 0006952 Beskermende reaksies" vir die ingeënte module (18) met maksimum aktivering aan die lig gebring, insluitend gene wat deur qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_7165 en die meeste onderdruk is) ontleed, asook baie onderdruk. fotosintese modules (9).Module 18-konsentrator (Fig. 8) is geïdentifiseer as die TanjilG_26536-geen wat vir die PR-10-agtige LlR18B-proteïen kodeer, en module 9-konsentrator is geïdentifiseer as die TanjilG_28955-geen wat vir die fotosisteem II PsbQ-proteïen kodeer.'n Kandidaat antraknoseweerstandsgeen Lanr1, TanjilG_05042, is in module 22 (Fig. 9) gevind en word geassosieer met die terme "GO:0044260 Cellular macromolecular metabolic processes" en "GO:0006355 Transkripsionele regulering, DNA-templating" wat die Tannie212G-hub dra.die geen kodeer hittestres transkripsiefaktor A-4a (HSFA4a).
Geweegde netwerkanalise van geen-ko-uitdrukking van modules met oorverteenwoordigde biologiese prosesterme "GO: 0006952 Verdedigingsreaksies".Ligering is vereenvoudig om die vier gene wat deur qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 en TanjilG_27015) ontleed is, uit te lig.
Geweegde netwerkanalise van geen-ko-uitdrukking van 'n module met 'n oorverteenwoordigde biologiese prosesterm "GO: 0006355: Transkripsieregulering, DNA-templating" en wat 'n kandidaat antraknoseweerstandsgeen dra Lanr1 TanjilG_05042.Ligering is vereenvoudig om die TanjilG_05042-geen en die sentrale TanjilG_01212-geen te isoleer.
Antraknose-weerstandsifting wat in Australië ingesamel is, het getoon dat die meeste van die vroegvrygestelde kultivars vatbaar was;Kalya, Coromup en Mandelup is beskryf as matig weerstandbiedend, terwyl Wonga, Tanjil en 83A:476 as hoogs weerstandig beskryf is26,27,31.het dieselfde weerstandsalleel gehad, aangedui Lanr1, en Coromup en Mandelup het 'n ander alleel gehad, aangewys AnMan10, 26, 39, terwyl Kalya 'n ander alleel oorgedra het., Lanr2.Sifting vir antraknose weerstand in Duitsland het gelei tot die identifikasie van 'n weerstandige lyn Bo7212 met 'n kandidaat alleel anders as Lanr1, aangewys LanrBo36.
Ons studie het 'n baie lae frekwensie (ongeveer 6%) van die Lanr1-alleel in die getoetsde kiemplasma aan die lig gebring.Hierdie waarneming stem ooreen met die resultate van sifting van Oos-Europese kiemplasma deur gebruik te maak van die Anseq3 en Anseq4 merkers, wat getoon het dat die Lanr1 alleel slegs in twee Wit-Russiese lyne voorkom.Dit dui daarop dat die Lanr1-alleel nog nie wyd deur plaaslike teelprogramme gebruik word nie, anders as in Australië, waar dit een van die sleutelallele vir merker-gesteunde teling is.Dit kan wees as gevolg van die laer vlak van weerstand verskaf deur die Lanr1 alleel in Europese veldtoestande in vergelyking met die Australiese verslag.Daarbenewens het studies van antraknose in hoë reënvalgebiede in Australië getoon dat weerstandsreaksies wat deur die Lanr1-alleel bemiddel word nie effektief is in weerstoestande wat groei en vinnige ontwikkeling van die patogeen bevoordeel nie19,42.Trouens, in die huidige studie is sommige simptome van antraknose ook waargeneem in genotipes wat die Lanr1-alleel dra, wat daarop dui dat weerstand kan verdwyn onder optimale toestande vir die ontwikkeling van C. lupini.Daarbenewens is vals positiewe interpretasies van die teenwoordigheid van Anseq3- en Anseq4-merkers, wat ongeveer 1 cm vanaf die Lanr1-lokus is, moontlik 28,30,43.
Ons studie het getoon dat 83A:476, wat die Lanr1-alleel dra, op C. lupini-inokulasie gereageer het met grootskaalse transkriptoomherprogrammering op die eerste geanaliseerde tydpunt (6 hpi), terwyl in Mandelup, wat die AnMan-alleel dra, transkriptomiese response heelwat later waargeneem is.(van 24 tot 48 pk).Hierdie tydelike variasies in verdedigingsreaksies word geassosieer met verskille in siektesimptome, wat die belangrikheid van vroeë patogeenherkenning vir 'n suksesvolle reaksie op weerstand beklemtoon.Om plantweefsel te besmet, moet miltsiektespore deur verskeie ontwikkelingstadia op die gasheeroppervlak gaan, insluitend ontkieming, seldeling en vorming van 'n appressorium.'n Aanhangsel is 'n infektiewe struktuur wat aan die oppervlak van die gasheer heg en penetrasie in die gasheerweefsel vergemaklik.Spore van C. gloeosporioides in ertjie-ekstrak het dus die eerste verdeling van die kern na 75-90 minute se inkubasie, die vorming van 'n kiembuis na 90-120 minute en onderdrukking na 4 uur 45 getoon.Mango C. gloeosporioides het meer as 40% konidiale ontkieming getoon na 3 uur se inkubasie en ongeveer 20% vorming van afdrukkers na 4 uur.Die virulensie-geassosieerde CAP20 geen van C. gloeosporioides het transkripsionele aktiwiteit in epifietvormende konidia getoon na 3.5 uur inkubasie in avokado oppervlak was met hoë konsentrasies van CAP20 proteïen na 4 uur 46 min.Net so is die aktiwiteit van melanien biosintese gene in C. trifolii geïnduseer tydens 'n 2-uur inkubasie gevolg deur die vorming van 'n appressorium na 1 uur.Studies van blaarweefsels het getoon dat aarbeie wat met C. acutatum ingeënt is, eerste onderdrukking het by 8 hpi, terwyl tamaties wat met C. coccodes ingeënt is, eerste onderdrukking het by 4 hpi48,49.grootliks in ooreenstemming met die tydskaal van Colletotrichum spp.aansteeklike proses.Vinnige verdedigingsreaksies op 83A:476 dui op betrokkenheid van plantweerstand en effektor-geaktiveerde immuniteit (ETI) gene in hierdie lyn, terwyl Mandelup se vertraagde response die mikro-geassosieerde molekulêre patroon-geaktiveerde immuniteit (MTI) hipotese ondersteun 50. Vroeë reaksies op 83A: 476 en Mandelup.Die gedeeltelike oorvleueling tussen op- of af-gereguleerde gene in vertraagde reaksie ondersteun ook hierdie konsep, aangesien ETI dikwels beskou word as 'n versnelde en verbeterde MTI-reaksie wat uitloop op geprogrammeerde seldood op die plek van infeksie, bekend as anafilaktiese skok 51,52.
Die meeste van die gene wat toegeskryf word aan die oorverteenwoordigde term Gene Ontology GO:0006952 “Verdedigingsreaksie” is die 11 homoloë van die stresgeïnduseerde vasboodskap 22-proteïen (soortgelyk aan SAM22) en die sewe hooflatexproteïenagtiges (MLP's).-agtige proteïene 31, 34, 43 en 423 het volgorde-ooreenkoms getoon.SAM22-agtige gene het beduidende aktivering getoon wat langer geduur het, wat verhoogde vlakke van antraknose weerstand toon (83A:476 en Boregine).MLP-agtige gene is egter slegs afgereguleer in lyne wat die kandidaat weerstand alleel dra (83A:476/Lanr1 by 6 hpi en Mandelup/AnMan by 24 hpi).Daar moet kennis geneem word dat alle geïdentifiseerde SAM22-agtige homoloë afkomstig is van 'n geengroepering wat oor ongeveer 105 kb strek, terwyl MLP-agtige gene afkomstig is van afsonderlike streke van die genoom.Gekoördineerde aktivering van sulke SAM22-agtige gene is ook gevind in ons vorige studie van NLL weerstand teen Diaporthetoxica inokulasie, wat daarop dui dat hulle betrokke is by die horisontale komponente van die verdedigingsreaksie.Hierdie gevolgtrekking word ook ondersteun deur verslae van 'n positiewe reaksie van SAM22-agtige gene op besering of behandeling met salisielsuur, swam induseerders of waterstofperoksied.
Daar is getoon dat MLP-agtige gene reageer op verskeie abiotiese en biotiese spanning, insluitend bakteriële, virale en patogeniese swaminfeksies in baie plantspesies55.Die rigtings van reaksie op sekere interaksies tussen plante en patogene het gewissel van sterk toenemende (dws tydens besmetting van katoen met Verticillium dahliae) tot aansienlik afnemend (dws na infeksie van appelboom met Alternaria spp.)56,57.Beduidende afregulering van die MLP-agtige 423 geen is waargeneem tydens avokado verdediging teen F. niger infeksie en tydens infeksie van die appelboom Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola en Alternaria alternata is appelpatotipes58,59.Boonop het appelkalli wat die MLP-agtige 423-geen ooruitdruk, laer uitdrukking van weerstand-geassosieerde gene gehad en was meer vatbaar vir swaminfeksie59.Na aanleiding van Fusarium oxysporum f, is die MLP-agtige 423 geen ook onderdruk in weerstandige gewone boonkiemplasma.cn.Boontjie-infeksie 60.
Ander lede van die PR-10-familie wat in ons RNA-seq-studie geïdentifiseer is, was die LlR18A- en LlR18B-gene in reaksie op opregulering, sowel as die opgereguleerde (1 geen) of afgereguleerde (3 gene) geen vir die lipiedoordragproteïen DIR1..Daarbenewens beklemtoon WGCNA die LlR18B-geen as 'n spilpunt in hierdie module, wat hoogs vatbaar is vir inenting en verskeie beskermende reaksiegene dra.Die LlR18A en LlR18B gene is geïnduseer in geel lupien blare in reaksie op patogeniese bakterieë, sowel as in NLL stamme na D. toxica inokulasie, terwyl die rys homoloog van hierdie gene, RSOsPR10, vinnig geïnduseer is deur 'n swam infeksie wat vermoedelik betrokke is by die D. toxic acid geenkode 532,6, 1, 6, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 2, 2, 2011, 2010. id-vervoerproteïene wat benodig word vir die aanvang van sistemiese verworwe weerstand (SAR).Met die ontwikkeling van beskermende reaksies word die DIR1-proteïen vanaf die fokus van infeksie deur die floëem vervoer om SAR in verafgeleë organe te veroorsaak.Interessant genoeg is die TanjilG_02313 DIR1-geen aansienlik geïnduseer by die eerste tydpunt in reëls 84A:476 en Populasie 22660, maar antraknoseweerstand het slegs in reël 84A:476 suksesvol ontwikkel.Dit kan 'n mate van subfunksionalisering van die DIR1-geen in NLL aandui, aangesien die oorblywende drie homoloë slegs in die 83A:476-lyn by 6 hpi op inokulasie gereageer het, en hierdie reaksie was afwaarts gerig.
In ons studie was die mees algemene komponente wat ooreenstem met die biologiese proses genaamd "GO:0055114 Redox proses" sitochroom P450 proteïen, peroksidase, linoleïensuur 9S-/13S-lipoksigenase en 1-aminosiklopropaan-1-karboksielsuuroksidase.Daarbenewens definieer ons WGCNA die HSFA4a homoloog as 'n hub wat modules dra soos die Lanr1 weerstand geen kandidaat TanjilG_05042.HSFA4a is 'n komponent van die redoksafhanklike regulering van kerntranskripsie in plante.
Sitochroom P450-proteïene is oksidoreduktases wat NADPH en/of O2-afhanklike hidroksileringsreaksies in primêre en sekondêre metabolisme kataliseer, insluitend die metabolisme van xenobiotika, asook hormone, vetsure, sterole, selwandkomponente, biopolimere, en die biosintese van beskermende verbindings 69. In ons var4i-60 plantfunksie is die sitochroom-in-69-funksie verminder. 2 (vou verandering) na 5.7 as gevolg van 'n groot aantal veranderde homoloë (37) en verskille in reaksiepatrone tussen spesifieke gene, wat 'n opwaartse hersiening weerspieël..Om slegs RNA-volgorde-data te gebruik om die vermeende biologiese funksie van die NLL-gene in so 'n groot proteïensuperfamilie toe te lig, sal hoogs spekulatief wees.Dit is egter opmerklik dat sommige sitochroom P450-gene geassosieer word met verhoogde weerstand teen patogeniese swamme of bakterieë, insluitend 'n bydrae tot allergiese reaksies69,70,71.
Klas III peroksidases is multifunksionele plantensieme wat betrokke is by 'n wye reeks metaboliese prosesse tydens plantgroei en -ontwikkeling, sowel as in reaksie op omgewingstremmings soos soutgehalte, droogte, hoë ligintensiteit en patogeenaanval72.Peroksidases is betrokke by die interaksie van verskeie plantspesies met Anthracis, insluitend Stylosanthes humilis en C. gloeosporioides, Lens culinaris en C. truncatum, Phaseolus vulgaris en C. lindemuthianum, Cucumis sativus en C. lagenarium73,74,75,76.Die reaksie is baie vinnig, soms selfs by 4 HPI, voordat die swam die plantweefsel binnedring73.Die peroksidase geen het ook gereageer op D. toxica NLL inenting.Benewens hul tipiese funksies om oksidatiewe bars te reguleer of oksidatiewe stres uit te skakel, kan peroksidases inmeng met patogeengroei deur fisiese hindernisse te skep gebaseer op selwandversterking tydens lignifikasie, subeenheid of kruisbinding van spesifieke verbindings.Hierdie funksie kan in silico toegeskryf word aan die TanjilG_03329 geen wat kodeer vir 'n vermeende lignienvormende anioonperoksidase wat aansienlik opgereguleer is in ons studie in die 83A:476-weerstandige lyn by 6 HPI, maar nie in ander stamme en tydpunte wat nie gereageer het nie.
9S-/13S-lipoksigenase van linoleïensuur is die eerste stap in die oksidatiewe weg van lipiedbiosintese78.Die produkte van hierdie pad het veelvuldige funksies in plantverdediging, insluitend selwandversterking deur die vorming van callose- en pektienafsettings, en regulering van oksidatiewe stres deur die produksie van reaktiewe suurstofspesies79,80,81,82,83.In die huidige studie is die uitdrukking van linoleïensuur 9S-/13S-lipoksigenase in alle stamme verander, maar in die vatbare populasie 22660 het opregulering op verskillende tydpunte geheers, terwyl dit in stamme wat weerstandbiedende Lanr1 en die AnMan-alleel dra, die diversifikasie van die oksitilipienlaagse in reaksies tussen hierdie genotipinakse beklemtoon.
Die 1-aminosiklopropaan-1-karboksilaatoksidase (ACO) homoloog was aansienlik opgereguleer (9 gene) of afreguleer (2 gene) wanneer dit met lupien ingeënt is.Met twee uitsonderings het al hierdie response plaasgevind teen 6 pk.by 83A:476.Die ensiematiese reaksie bemiddel deur ACO-proteïene is die tempo-beperkende stap in etileenproduksie en word dus hoogs gereguleer84.Etileen is 'n planthormoon wat 'n verskeidenheid rolle speel in die regulering van plantontwikkeling en reaksie op abiotiese en biotiese strestoestande.Die induksie van ACO-transkripsie en aktivering van die etileenseinweg is betrokke by die verhoging van die weerstand van rys teen die hemibiotrofiese swam oryzae oryzae deur die produksie van reaktiewe suurstofspesies en fitoaleksiene te reguleer.'n Baie soortgelyke blaarinfeksieproses wat gevind is tussen M. oryzae en C. lupini88,89, teen die agtergrond van 'n beduidende opregulering van ACO-homoloë in die 83A:476-lyn wat in hierdie studie gerapporteer is, verskuif die moontlikheid om weerstand teen NLL antraknose-etileen 'n sein sentrale stap in molekulêre weë te verleen.
In die huidige studie is grootskaalse onderdrukking van baie gene wat met fotosintese geassosieer word, waargeneem by 6 hpi in 83A:476 en by 48 hpi in Mandeloop en die 22660 bevolking.Die omvang en vordering van hierdie veranderinge is eweredig aan die vlak.Antracnose weerstand is in hierdie eksperiment waargeneem.Onlangs is sterk en vroeë onderdrukking van fotosintese-verwante transkripsies aangemeld in verskeie modelle van plant-patogeen-interaksies, insluitend patogeniese bakterieë en swamme.Haas (vanaf 2 HPI in sommige interaksies) en globale onderdrukking van gene wat met fotosintese geassosieer word in reaksie op infeksie, kan plantimmuniteit veroorsaak gebaseer op die ontplooiing van reaktiewe suurstofspesies en hul interaksie met die salisielsuurpad om allergiese reaksies te bemiddel 90,94.
Ter afsluiting sluit verdedigingsreaksiemeganismes voorgestel vir die mees weerstandbiedende afstamming (83A:476) vinnige patogeenherkenning deur die R-geen (vermoedelik TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) en allergiese reaksie-gemedieerde salisielsuur- en etileensein in, gevolg deur die vestiging van langafstand-SAR.aksie word ondersteun deur die DIR-1-proteïen.Daar moet kennis geneem word dat die biotrofiese tydperk vir C. lupini infeksie baie kort is (ongeveer 2 dae), gevolg deur nekrotiese groei95.Die oorgang tussen hierdie stadiums kan geassosieer word met nekrose en uitdrukking van etileen-induseerbare proteïene wat dien as snellers vir hipersensitiwiteitsreaksies in gasheerplante.Daarom is die tydvenster vir suksesvolle vang van C. lupini in die biotrofiese stadium baie smal.Die herprogrammering van gene geassosieer met redoks en fotosintese wat in 83A:476 by 6 hpi waargeneem word, stem ooreen met die vordering van swamhifes en lui die ontwikkeling van 'n suksesvolle beskermende reaksie in die biotrofiese stadium aan.Die transkriptomiese response van Mandelup en die 22660 populasie kan te vertraag wees om die swam vas te vang voordat na nekrotiese groei oorgeskakel word, maar Mandelup kan meer effektief wees as die 22660 populasie omdat die relatief vinnige regulering van die PR-10 proteïen horisontale weerstand bevorder.
ETI, aangedryf deur die kanoniese R-geen, blyk 'n algemene meganisme vir boonweerstand teen antraknose te wees.Dus, in die model peulplant Medicago truncatula, word weerstand teen antraknose verleen deur die RCT1 geen, 'n lid van die TIR-NBS-LRR97 plant R geen klas.Hierdie geen verleen ook breëspektrum antraknose weerstand in lusern wanneer dit na vatbare plante oorgedra word.In die gewone boontjie (P. vulgaris) is meer as twee dosyn antraknose-weerstandsgene tot op hede geïdentifiseer.Sommige van hierdie gene word gevind in streke wat geen kanoniese R-gene het nie, maar baie ander is geleë aan die rande van chromosome wat die NBS-LRR-geengroepering dra, insluitend TIR-NBS-LRRs99.Die genoomwye SSR-studie het ook die assosiasie van die NBS-LRR-geen met antraknoseweerstand in die gewone boon bevestig.Die kanoniese R-geen is ook gevind in die genomiese streek wat die hoof antraknose weerstand lokus in wit lupien 101 dra.
Ons werk toon dat 'n onmiddellike weerstandsreaksie, geaktiveer in 'n vroeë stadium van plantinfeksie (verkieslik nie later nie as 12 hpi), smalblaarlupien effektief beskerm teen antraknose wat veroorsaak word deur die patogene swam Collelotrichum lupini.Deur gebruik te maak van hoë deurvloei-volgordebepaling, het ons differensiële uitdrukkingsprofiele van antraknose-weerstandsgene in NLL-plante gedemonstreer wat deur die Lanr1- en AnMan-weerstandsgene bemiddel is.Suksesvolle verdediging behels die sorgvuldig ontwerp van die gene vir proteïene wat betrokke is by redoks, fotosintese en patogenese binne ure na die plant se eerste kontak met 'n patogeen.Soortgelyke beskermende reaksies, maar vertraag in tyd, is baie minder effektief om plante teen siektes te beskerm.Miltsiekteweerstand wat deur die Lanr1-geen bemiddel word, lyk soos die tipiese vinnige reaksie van die R-geen (effektor-geaktiveerde immuniteit), terwyl die AnMan-geen heel waarskynlik 'n horisontale reaksie verskaf (immuniteit veroorsaak deur 'n mikrobe-geassosieerde molekulêre patroon), wat 'n matige vlak van volhoubaarheid verskaf.
Die 215 NLL-lyne wat gebruik is om vir antraknosemerkers te sif, het bestaan ​​uit 74 kultivars, 60 lyne verkry deur kruising of teling, 5 mutante en 76 wilde of oorspronklike kiemplasmas.Die lyne het uit 17 lande gekom, hoofsaaklik uit Pole (58), Spanje (47), Duitsland (27), Australië (26), Rusland (19), Wit-Rusland (7), Italië (5) en ander lyne.uit 10 lande.Die stel bevat ook verwysingsbestande lyne: 83A:476, Tanjil, Wonga wat die Lanr1-alleel dra, en Mandelup wat die AnMan-alleel dra.Die lyne is verkry vanaf die Europese Lupine Genetiese Hulpbrondatabasis wat deur Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Pole, onderhou word (Aanvullende Tabel S1).
Plante is onder gekontroleerde toestande gekweek (fotoperiode 16 uur, temperatuur 25°C gedurende die dag en 18°C ​​snags).Twee biologiese herhalings is ontleed.DNA is geïsoleer van drie weke oue blare met behulp van die DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Duitsland) volgens die protokol.Die kwaliteit en konsentrasie van die geïsoleerde DNA is deur spektrofotometriese metodes beoordeel (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VSA).Die AnManM1 merker wat die antraknose weerstand geen AnMan merk (afgelei van cv. Mandelup) en die merkers Anseq3 en Anseq4 wat die geen Lanr1 flankeer (afgelei van cv. Tanjil) is 11,26,28 ontleed.Homosigote vir die weerstandbiedende alleel is aangeteken as “1″, vatbaar – as “0″, en heterosigote – as 0,5.
Gebaseer op die resultate van sifting vir merkers AnManM1, AnSeq3 en AnSeq4 en die beskikbaarheid van sade vir finale opvolgeksperimente, is 50 NLL-lyne vir antraknoseweerstandfenotipering geselekteer.Die ontleding is in duplikaat uitgevoer in 'n rekenaarbeheerde kweekhuis met 'n 14 uur fotoperiode met 'n temperatuurreeks van 22°C gedurende die dag en 19°C in die nag.Saad word gekrap (sny die saadhuid aan die teenoorgestelde kant van die embrio met 'n skerp lem af) voor saai om saaddormansie te voorkom as gevolg van die saadhuid wat te hard is en om eenvormige ontkieming te verseker.Plante is gekweek in potte (11 × 11 × 21 cm) met steriele grond (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warskou, Pole).Inenting is uitgevoer met die Colletotrichum lupini Col-08-stam, wat in 1999 gekweek is uit die stamme van smalblaarlupienplante wat in 'n veld in Verzhenitsa, Groter Pole (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″) gekweek is.Kry 'n area.Die isolate is gekweek in SNA medium by 20° C. onder swart lig vir 21 dae om sporulering te induseer.Vier weke na saai, toe die plante die 4-6 blaarstadium bereik het, is inenting uitgevoer deur met 'n suspensie van konidia teen 'n konsentrasie van 0,5 x 106 konidia per ml te bespuit.Na inenting is die plante vir 24 uur in die donker gehou teen 'n humiditeit van ongeveer 98% en 'n temperatuur van 25°C om die ontkieming van konidia en die infeksieproses te vergemaklik.Die plante is dan onder 'n 14-uur fotoperiode by 22°C dag/19°C nag en 70% humiditeit gekweek.Die siektetelling is 22 dae na inenting gemaak en het gewissel van 0 (immuun) tot 9 (baie vatbaar) afhangende van die teenwoordigheid of afwesigheid van nekrotiese letsels op stamme en blare.Daarbenewens is die gewig van die plante na die puntetelling gemeet.Verwantskappe tussen merker genotipes en siekte fenotipes is bereken as punt twee-volgorde korrelasies (afwesigheid van heterosigotiese merkers in die stel lyne vir ontleding van die antraknose weerstand fenotipe).