Dankie dat u Nature.com besoek het. Die blaaierweergawe wat u gebruik, het beperkte CSS-ondersteuning. Vir die beste ervaring beveel ons aan dat u 'n opgedateerde blaaier gebruik (of Verenigbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer). Intussen, om voortgesette ondersteuning te verseker, sal ons die webwerf sonder style en JavaScript weergee.
Nuwe immunologiese en massaspektrometriese metodes vir komplekse analise van aanhoudende oligosakkariede in mielieplase wat met AFEX voorbehandel is. Lignocellulose biomassa is 'n volhoubare alternatief vir fossielbrandstowwe en word wyd gebruik om biotegnologieë te ontwikkel vir die produksie van produkte soos voedsel, voer, brandstowwe en chemikalieë. Die sleutel tot hierdie tegnologieë is die ontwikkeling van koste-mededingende prosesse vir die omskakeling van komplekse koolhidrate wat in plantselwande voorkom in eenvoudige suikers soos glukose, xylose en arabinose. Omdat lignocellulose biomassa baie hardnekkig is, moet dit onderwerp word aan termochemiese behandelings (bv. ammoniakvesel-afskilfering (AFEX), verdunde sure (DA), ioniese vloeistowwe (IL)) en biologiese behandelings (bv. ensiematiese hidrolise en mikrobiese fermentasie) in kombinasie om die verlangde produk te verkry. Wanneer kommersiële swamensieme egter in die hidroliseproses gebruik word, is slegs 75-85% van die oplosbare suikers wat gevorm word monosakkariede, en die oorblywende 15-25% is oplosbare, hardnekkige oligosakkariede, wat nie altyd vir mikroörganismes beskikbaar is nie. Voorheen het ons oplosbare hardnekkige oligosakkariede suksesvol geïsoleer en gesuiwer deur 'n kombinasie van koolstof- en diatomeeënaarde-skeiding en grootte-uitsluitingschromatografie te gebruik, en ook hul ensieminhiberende eienskappe ondersoek. Ons het gevind dat oligosakkariede wat 'n hoër graad van polimerisasie (DP) gemetileerde uronsuursubstitusies bevat, moeiliker is om met kommersiële ensiemmengsels te verwerk as lae DP en neutrale oligosakkariede. Hier rapporteer ons die gebruik van verskeie bykomende metodes, insluitend glikaanprofilering met behulp van monoklonale teenliggaampies (mAbs) spesifiek vir plantbiomassa-glikane om glikaanbindings in plantselwande en ensiematiese hidrolise te karakteriseer, matriks-geassisteerde laserdesorpsie-ionisasie, tyd-van-vlug massaspektrometrie. . MALDI-TOF-MS) gebruik struktuur-informatiewe diagnostiese pieke verkry deur spektroskopie na sekondêre verval van negatiewe ione, gaschromatografie en massaspektrometrie (GC-MS) om oligosakkariedbindings met en sonder derivatisering te karakteriseer. As gevolg van die klein grootte van oligosakkariede (DP 4-20), is hierdie molekules moeilik om te gebruik vir mAb-binding en karakterisering. Om hierdie probleem te oorkom, het ons 'n nuwe biotien-konjugasie-gebaseerde oligosakkaried-immobilisasiemetode toegepas wat die meerderheid lae DP oplosbare oligosakkariede suksesvol op die mikroplaatoppervlak gemerk het, wat toe in 'n hoë-deurset mAb-stelsel vir spesifieke ligasie-analise gebruik is. Hierdie nuwe metode sal die ontwikkeling van meer gevorderde hoë-deurset glikome-toetse in die toekoms fasiliteer wat gebruik kan word om oligosakkariede wat in biomerkers teenwoordig is, te isoleer en te karakteriseer vir diagnostiese doeleindes.
Lignocellulose-biomassa, saamgestel uit landbou-, bosbou-, gras- en houtagtige materiale, is 'n potensiële grondstof vir die produksie van bio-gebaseerde produkte, insluitend voedsel, voer, brandstof en chemiese voorlopers om produkte met 'n hoër waarde te produseer1. Koolhidrate (soos sellulose en hemisellulose) wat in plantselwande teenwoordig is, word gedepolimeriseer in monosakkariede deur chemiese verwerking en biotransformasie (soos ensiematiese hidrolise en mikrobiese fermentasie). Algemene voorbehandelings sluit in ammoniakvesel-uitbreiding (AFEX), verdunde suur (DA), ioniese vloeistof (IL) en stoomontploffing (SE), wat 'n kombinasie van chemikalieë en hitte gebruik om lignocellulose-produksie te verminder deur plantselwande oop te maak3,4. hardkoppigheid van materie, 5. Ensiematiese hidrolise word uitgevoer teen 'n hoë vastestoflading met behulp van kommersiële aktiewe koolhidraatbevattende ensieme (CAZymes) en mikrobiese fermentasie met behulp van transgeniese giste of bakterieë om bio-gebaseerde brandstowwe en chemikalieë te produseer6.
KAZime in kommersiële ensieme bestaan ​​uit 'n komplekse mengsel van ensieme wat sinergisties komplekse koolhidraat-suikerbindings split om monosakkariede te vorm2,7. Soos ons vroeër berig het, maak die komplekse netwerk van aromatiese polimere van lignien met koolhidrate hulle hoogs hardnekkig, wat lei tot onvolledige suikeromskakeling, wat 15-25% van geslagsoligosakkariede ophoop wat nie tydens ensiematiese hidrolise van die voorbehandelde biomassa geproduseer word nie. Dit is 'n algemene probleem met verskeie biomassa-voorbehandelingsmetodes. Sommige redes vir hierdie knelpunt sluit in ensieminhibisie tydens hidrolise, of die afwesigheid of lae vlakke van noodsaaklike ensieme wat benodig word om suikerbindings in plantbiomassa te breek. Begrip van die samestelling en strukturele eienskappe van suikers, soos die suikerbindings in oligosakkariede, sal ons help om suikeromskakeling tydens hidrolise te verbeter, wat biotegnologiese prosesse koste-mededingend maak met petroleum-afgeleide produkte.
Die bepaling van die struktuur van koolhidrate is uitdagend en vereis 'n kombinasie van metodes soos vloeistofchromatografie (LC)11,12, kernmagnetiese resonansspektroskopie (NMR)13, kapillêre elektroforese (CE)14,15,16 en massaspektrometrie (MS)17. ,agtien. MS-metodes soos tyd-van-vlug-massaspektrometrie met laserdesorpsie en ionisasie met behulp van 'n matriks (MALDI-TOF-MS) is 'n veelsydige metode vir die identifisering van koolhidraatstrukture. Onlangs is Botsingsgeïnduseerde Dissosiasie (CID) tandem MS van natriumioonaddukte die meeste gebruik om vingerafdrukke te identifiseer wat ooreenstem met oligosakkaried-aanhegtingsposisies, anomeriese konfigurasies, rye en vertakkingsposisies 20, 21.
Glikaananalise is 'n uitstekende hulpmiddel vir die diepgaande identifisering van koolhidraatbindings22. Hierdie metode gebruik monoklonale teenliggaampies (mAbs) wat gerig is op plantselwandglikaan as probes om komplekse koolhidraatbindings te verstaan. Meer as 250 mAbs is wêreldwyd beskikbaar, ontwerp teen verskeie lineêre en vertakte oligosakkariede met behulp van verskeie sakkaride24. Verskeie mAbs is wyd gebruik om die struktuur, samestelling en modifikasies van die plantselwand te karakteriseer, aangesien daar beduidende verskille is afhangende van plantseltipe, orgaan, ouderdom, ontwikkelingsfase en groeiomgewing25,26. Meer onlangs is hierdie metode gebruik om vesikelpopulasies in plant- en dierstelsels en hul onderskeie rolle in glikaanvervoer te verstaan ​​soos bepaal deur subsellulêre merkers, ontwikkelingsfases of omgewingstimuli, en om ensiematiese aktiwiteit te bepaal. Van die verskillende strukture van glikane en xilane wat geïdentifiseer is, sluit in pektien (P), xilaan (X), mannaan (M), xiloglukane (XylG), gemengdebindingsglukane (MLG), arabinoksilaan (ArbX), galaktomannan (GalG), glukuronsuur-arabinoksilaan (GArbX) en arabino-galaktaan (ArbG)29.
Ten spyte van al hierdie navorsingspogings, het slegs 'n paar studies gefokus op die aard van oligosakkaried-akkumulasie tydens hidrolise met 'n hoë vastestoflading (HSL), insluitend die vrystelling van oligosakkariede, veranderinge in oligomere kettinglengte tydens hidrolise, verskeie lae DP-polimere en hul kurwes. verspreidings 30,31,32. Intussen, hoewel glikaananalise 'n nuttige instrument vir 'n omvattende analise van glikaanstruktuur bewys het, is dit moeilik om wateroplosbare lae DP-oligosakkariede met behulp van teenliggaammetodes te evalueer. Kleiner DP-oligosakkariede met 'n molekulêre gewig van minder as 5-10 kDa bind nie aan ELISA-plate nie 33, 34 en word weggespoel voor die byvoeging van teenliggaampies.
Hier demonstreer ons vir die eerste keer 'n ELISA-toets op avidien-bedekte plate met behulp van monoklonale teenliggaampies, wat 'n eenstap-biotinileringsprosedure vir oplosbare vuurvaste oligosakkariede met glikomeanalise kombineer. Ons benadering tot glikomeanalise is gevalideer deur MALDI-TOF-MS en GC-MS-gebaseerde analise van komplementêre oligosakkaried-skakels met behulp van trimetielsiliel (TMS)-derivatisering van gehidroliseerde suikersamestellings. Hierdie innoverende benadering kan in die toekoms as 'n hoë-deursetmetode ontwikkel word en wyer toepassing in biomediese navorsing vind35.
Post-translasionele modifikasies van ensieme en teenliggaampies, soos glikosilasie,36 beïnvloed hul biologiese aktiwiteit. Veranderinge in glikosilasie van serumproteïene speel byvoorbeeld 'n belangrike rol in inflammatoriese artritis, en veranderinge in glikosilasie word as diagnostiese merkers gebruik37. Verskeie glikane is in die literatuur gerapporteer om geredelik in 'n verskeidenheid siektes te verskyn, insluitend chroniese inflammatoriese siektes van die spysverteringskanaal en lewer, virusinfeksies, eierstok-, bors- en prostaatkanker38,39,40. Begrip van die struktuur van glikane met behulp van teenliggaam-gebaseerde glikaan-ELISA-metodes sal addisionele vertroue in siektediagnose bied sonder die gebruik van komplekse MS-metodes.
Ons vorige studie het getoon dat hardnekkige oligosakkariede ongehidroliseer gebly het na voorbehandeling en ensiematiese hidrolise (Figuur 1). In ons voorheen gepubliseerde werk het ons 'n geaktiveerde houtskool vastefase-ekstraksiemetode ontwikkel om oligosakkariede te isoleer uit AFEX-voorbehandelde mielie-stoverhidrolisaat (ACSH)8. Na aanvanklike ekstraksie en skeiding is die oligosakkariede verder gefraksioneer deur grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) en versamel in volgorde van molekulêre gewig. Suikermonomere en oligomere wat vrygestel is uit verskeie voorbehandelings is geanaliseer deur suikersamestellingsanalise. Wanneer die inhoud van suikeroligomere wat deur verskeie voorbehandelingsmetodes verkry is, vergelyk word, is die teenwoordigheid van hardnekkige oligosakkariede 'n algemene probleem in die omskakeling van biomassa na monosakkariede en kan dit lei tot 'n vermindering in suikeropbrengs van ten minste 10-15% en selfs tot 18%. VSA. Hierdie metode word gebruik vir verdere grootskaalse produksie van oligosakkariedfraksies. Die gevolglike ACH en die daaropvolgende fraksies met verskillende molekulêre gewigte is as eksperimentele materiaal gebruik vir die karakterisering van oligosakkariede in hierdie werk.
Na voorbehandeling en ensiematiese hidrolise het aanhoudende oligosakkariede ongehidroliseer gebly. Hier is (A) 'n oligosakkaried-skeidingsmetode waarin oligosakkariede geïsoleer word uit AFEX-voorbehandelde mieliestoorhidrolisaat (ACSH) met behulp van 'n gepakte bed van geaktiveerde koolstof en diatomeeënaarde; (B) Metode vir die skeiding van oligosakkariede. Die oligosakkariede is verder geskei deur grootte-uitsluitingschromatografie (SEC); (C) Sakkariedmonomere en oligomere vrygestel uit verskeie voorbehandelings (verdunde suur: DA, ioniese vloeistof: IL en AFEX). Ensiematiese hidrolise-toestande: hoë vastestoflading van 25% (g/g) (ongeveer 8% glukaanlading), 96 uur hidrolise, 20 mg/g kommersiële ensiemlading (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 verhouding) en (D) Suikermonomere en oligomere van glukose, xylose en arabinose vrygestel uit AFEX-voorbehandelde mieliestoor (ACS).
Glikaananalise het bewys dat dit 'n nuttige hulpmiddel is vir 'n omvattende strukturele analise van glikane in uittreksels wat uit vaste biomassa-residue geïsoleer is. Wateroplosbare sakkarides word egter onderverteenwoordig met behulp van hierdie tradisionele metode41 omdat lae molekulêre gewig oligosakkariede moeilik is om op ELISA-plate te immobiliseer en uitgespoel word voor teenliggaambyvoeging. Daarom is 'n eenstap-biotinileringsmetode gebruik om oplosbare, nie-voldoenende oligosakkariede op avidien-bedekte ELISA-plate te bedek vir teenliggaambinding en karakterisering. Hierdie metode is getoets met behulp van ons voorheen vervaardigde ACSH en 'n fraksie gebaseer op die molekulêre gewig (of polimerisasiegraad, DP). Eenstap-biotinilering is gebruik om die oligosakkariedbindingsaffiniteit te verhoog deur biotien-LC-hidrasied by die reduseerpunt van die koolhidraat te voeg (Fig. 2). In oplossing reageer die hemiasetaalgroep aan die reduseerpunt met die hidrasiedgroep van biotien-LC-hidrasied om 'n hidrasonbinding te vorm. In die teenwoordigheid van die reduseermiddel NaCNBH3 word die hidrasonbinding gereduseer tot 'n stabiele gebiotinileerde eindproduk. Met die modifikasie van die suikerreduserende kant het die binding van lae DP oligosakkariede aan ELISA-plate moontlik geword, en in ons studie is dit gedoen op avidien-bedekte plate met behulp van glikaan-geteikende mAbs.
Sifting van monoklonale teenliggaampies gebaseer op ELISA vir gebiotinileerde oligosakkariede. Hier (A) word biotinilering van oligosakkariede en daaropvolgende ELISA-sifting met glikaan-geteikende mAbs op NeutrAvidin-bedekte plate gekombineer en (B) word 'n eenstapprosedure vir biotinilering van reaksieprodukte getoon.
Avidien-bedekte plate met oligosakkaried-gekonjugeerde teenliggaampies is toe by primêre en sekondêre teenliggaampies gevoeg en in 'n lig- en tydsensitiewe medium gewas. Nadat die teenliggaambinding voltooi is, word TMB-substraat bygevoeg om die plaat te inkubeer. Die reaksie is uiteindelik met swaelsuur gestaak. Die geïnkubeerde plate is met behulp van 'n ELISA-leser geanaliseer om die bindingssterkte van elke teenliggaam te bepaal om teenliggaam-spesifieke kruisbinding op te spoor. Vir besonderhede en parameters van die eksperiment, sien die ooreenstemmende afdeling "Materiale en Metodes".
Ons demonstreer die nut van hierdie nuut ontwikkelde metode vir spesifieke toepassings deur die oplosbare oligosakkariede wat in ACSH teenwoordig is, sowel as in ru- en gesuiwerde oligosakkariedfraksies wat uit lignocellulose hidrolise geïsoleer is, te karakteriseer. Soos in Figuur 3 getoon, is die mees algemene epitoop-gesubstitueerde xylane wat in ACSH geïdentifiseer word met behulp van bioasileerde glikome-analismetodes gewoonlik uroniese (U) of metieluroniese (MeU) en pektienarabinogalaktane. Die meeste van hulle is ook gevind in ons vorige studie oor die analise van glikane van nie-gehidroliseerde vaste stowwe (UHS)43.
Opsporing van hardnekkige oligosakkaried-epitope met behulp van 'n monoklonale teenliggaam gerig op die selwandglikaan. Die "neutrale" fraksie is die ACN-fraksie en die "suur" fraksie is die FA-fraksie. Helderder rooi op die hittekaart dui op 'n hoër epitoop-inhoud, en helderder blou dui op 'n leë agtergrond. Kleurwaardes op die skaal is gebaseer op rou OD-waardes vir formulerings N=2. Die hoofepitope wat deur die teenliggaampies herken word, word regs getoon.
Hierdie nie-sellulosestrukture kon nie deur die mees algemene sellulases en hemisellulases in die getoetste kommersiële ensiemmengsel, wat die mees algemeen gebruikte kommersiële ensieme insluit, gesplyt word nie. Daarom is nuwe hulpensieme nodig vir hul hidrolise. Sonder die nodige nie-sellulose-bykomende ensieme, verhoed hierdie nie-sellulosebindings volledige omskakeling na monosakkariede, selfs al word hul ouersuikerpolimere breedvoerig in korter fragmente gehidroliseer en met behulp van kommersiële ensiemmengsels opgelos.
Verdere studie van seinverspreiding en die bindingssterkte daarvan het getoon dat bindingsepitope laer was in hoë DP suikerfraksies (A, B, C, DP tot 20+) as in lae DP fraksies (D, E, F, DP) in dimere) (Fig. 1). Suurfragmente is meer algemeen in nie-sellulose epitope as neutrale fragmente. Hierdie verskynsels stem ooreen met die patroon wat in ons vorige studie waargeneem is, waar hoë DP en suurmolekules meer bestand was teen ensiematiese hidrolise. Daarom kan die teenwoordigheid van nie-sellulose glikaan epitope en U- en MeU-substitusies grootliks bydra tot die stabiliteit van die oligosakkariede. Daar moet kennis geneem word dat bindings- en deteksiedoeltreffendheid problematies kan wees vir lae DP oligosakkariede, veral as die epitoop 'n dimeriese of trimeriese oligosakkaried is. Dit kan getoets word met behulp van kommersiële oligosakkariede van verskillende lengtes, elk met slegs een epitoop wat aan 'n spesifieke mAb bind.
Dus het die gebruik van struktuurspesifieke teenliggaampies sekere tipes hardnekkige bindings aan die lig gebring. Afhangende van die tipe teenliggaam wat gebruik word, die toepaslike ligasiepatroon en die sterkte van die sein wat dit produseer (mees en mins volop), kan nuwe ensieme geïdentifiseer en semi-kwantitatief by die ensiemmengsel gevoeg word vir meer volledige glikoomskakeling. Deur die analise van ACSH-oligosakkariede as voorbeeld te neem, kan ons 'n databasis van glikaanbindings vir elke biomassamateriaal skep. Daar moet hier op gelet word dat die verskillende affiniteit van teenliggaampies in ag geneem moet word, en as hul affiniteit onbekend is, sal dit sekere probleme skep wanneer die seine van verskillende teenliggaampies vergelyk word. Daarbenewens kan vergelyking van glikaanbindings die beste werk tussen monsters vir dieselfde teenliggaam. Hierdie hardnekkige bindings kan dan gekoppel word aan die CAZyme-databasis, waaruit ons ensieme kan identifiseer, kandidaatensieme kan kies en toets vir bindingsbrekende ensieme, of mikrobiese stelsels kan ontwikkel om hierdie ensieme uit te druk vir gebruik in bioraffinaderye44.
Om te evalueer hoe immunologiese metodes alternatiewe metodes vir die karakterisering van lae molekulêre gewig oligosakkariede wat in lignocellulose hidrolise voorkom, komplementeer, het ons MALDI (Fig. 4, S1-S8) en analise van TMS-afgeleide sakkaride gebaseer op GC-MS op dieselfde paneel (Fig. 5) oligosakkariedgedeelte uitgevoer. MALDI word gebruik om te vergelyk of die massaverspreiding van oligosakkariedmolekules ooreenstem met die beoogde struktuur. Fig. 4 toon MS van die neutrale komponente ACN-A en ACN-B. ACN-A-analise het 'n reeks pentose-suikers bevestig wat wissel van DP 4-8 (Fig. 4) tot DP 22 (Fig. S1), waarvan die gewigte ooreenstem met MeU-xylaan-oligosakkariede. ACN-B-analise het die pentose- en glukoksilaanreeks met DP 8-15 bevestig. In aanvullende materiaal soos Figuur S3, toon FA-C suur-deel massaverspreidingskaarte 'n reeks (Me)U-gesubstitueerde pentose-suikers met 'n DP van 8-15 wat ooreenstem met die gesubstitueerde xylane wat in ELISA-gebaseerde mAb-sifting gevind word. Die epitope is konsekwent.
MALDI-MS-spektrum van oplosbare nie-voldoenende oligosakkariede teenwoordig in ACS. Hier, (A) ACN-A lae gewigsreeksfraksies wat gemetileerde uronsuur (DP 4-8) bevat, het glukuroksilaan-oligosakkariede vervang en (B) ACN-B xylaan en gemetileerde uronsuur-oligosakkariede vervang met glukuroksilaan (DP 8-15).
Analise van die samestelling van die glikaanresidu van vuurvaste oligosakkariede. Hier (A) TMS-sakkariedsamestelling van verskeie oligosakkariedfraksies verkry met behulp van GC-MS-analise. (B) Strukture van verskeie TMS-afgeleide suikers teenwoordig in oligosakkariede. ACN – asetonitrielfraksie wat neutrale oligosakkariede bevat en FA – feruliensuurfraksie wat suuroligosakkariede bevat.
Nog 'n interessante gevolgtrekking is gemaak uit die LC-MS-analise van die oligosakkariedfraksie, soos getoon in Figuur S9 (metodes kan gesien word in die elektroniese aanvullende materiaal). Fragmente van heksose- en -OAc-groepe is herhaaldelik waargeneem tydens ligasie van die ACN-B-fraksie. Hierdie bevinding bevestig nie net die fragmentasie wat waargeneem is in glikome- en MALDI-TOF-analise nie, maar verskaf ook nuwe inligting oor potensiële koolhidraatderivate in voorafbehandelde lignocellulose-biomassa.
Ons het ook 'n glikaansamestellingsanalise van oligosakkariedfraksies uitgevoer met behulp van TMS-glikaanderivatisering. Deur gebruik te maak van GC-MS, het ons die samestelling van neurale (nie-afgeleide) en suur suikers (GluA en GalA) in die oligosakkariedfraksie bepaal (Fig. 5). Glukuronsuur word in suurkomponente C en D aangetref, terwyl galakturonsuur in suurkomponente A en B aangetref word, wat albei hoë DP-komponente van suur suikers is. Hierdie resultate bevestig nie net ons ELISA- en MALDI-data nie, maar stem ook ooreen met ons vorige studies van oligosakkaried-akkumulasie. Daarom glo ons dat moderne immunologiese metodes wat biotinilering van oligosakkariede en daaropvolgende ELISA-sifting gebruik, voldoende is om oplosbare hardnekkige oligosakkariede in verskeie biologiese monsters op te spoor.
Aangesien ELISA-gebaseerde mAb-siftingsmetodes deur verskeie verskillende metodes gevalideer is, wou ons die potensiaal van hierdie nuwe kwantitatiewe metode verder ondersoek. Twee kommersiële oligosakkariede, xyloheksasakkaried-oligosakkaried (XHE) en 23-α-L-arabinofuranosiel-xilotriose (A2XX), is aangekoop en getoets met behulp van 'n nuwe mAb-benadering wat op die selwandglikaan gemik is. Figuur 6 toon 'n lineêre korrelasie tussen die gebiotinileerde bindingssein en die logaritmiese konsentrasie van oligosakkariedkonsentrasie, wat 'n moontlike Langmuir-adsorpsiemodel voorstel. Onder die mAbs het CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 en CCRC-M151 gekorreleer met XHE, en CCRC-M108, CCRC-M109 en LM11 gekorreleer met A2XX oor 'n reeks van 1 nm tot 100 nano. As gevolg van die beperkte beskikbaarheid van teenliggaampies tydens die eksperiment, is beperkte eksperimente met elke oligosakkariedkonsentrasie uitgevoer. Daar moet hier kennis geneem word dat sommige teenliggaampies baie verskillend reageer op dieselfde oligosakkaried as 'n substraat, vermoedelik omdat hulle aan effens verskillende epitope bind en baie verskillende bindingsaffiniteite kan hê. Die meganismes en implikasies van akkurate epitoopidentifikasie sal baie meer kompleks wees wanneer die nuwe mAb-benadering op werklike monsters toegepas word.
Twee kommersiële oligosakkariede is gebruik om die deteksiebereik van verskeie glikaan-teikenende mAbs te bepaal. Hier dui lineêre korrelasies met logaritmiese konsentrasie van oligosakkariedkonsentrasie Langmuir-adsorpsiepatrone aan vir (A) XHE met mAb en (B) A2XX met mAb. Die ooreenstemmende epitope dui die strukture van die kommersiële oligosakkariede aan wat as substrate in die toets gebruik is.
Die gebruik van glikaan-geteikende monoklonale teenliggaampies (glikokomiese analise of ELISA-gebaseerde mAb-sifting) is 'n kragtige instrument vir die diepgaande karakterisering van die meeste van die belangrikste selwandglikane wat plantbiomassa uitmaak. Klassieke glikaananalise karakteriseer egter slegs groter selwandglikane, aangesien die meeste oligosakkariede nie doeltreffend op ELISA-plate geïmmobiliseer word nie. In hierdie studie is AFEX-voorbehandelde mieliestokke ensiematies gehidroliseer teen 'n hoë vastestofinhoud. Suikeranalise is gebruik om die samestelling van hardnekkige selwandkoolhidrate in die hidrolise te bepaal. mAb-analise van kleiner oligosakkariede in hidrolise word egter onderskat, en bykomende instrumente is nodig om oligosakkariede effektief op ELISA-plate te immobiliseer.
Ons rapporteer hier 'n nuwe en doeltreffende oligosakkaried-immobilisasiemetode vir mAb-sifting deur oligosakkaried-biotinilering te kombineer gevolg deur ELISA-sifting op NeutrAvidin™-bedekte plate. Die geïmmobiliseerde biotinileerde oligosakkariede het voldoende affiniteit vir die teenliggaam getoon om vinnige en doeltreffende opsporing van hardnekkige oligosakkariede moontlik te maak. Analise van die samestelling van hierdie hardnekkige oligosakkariede gebaseer op massaspektrometrie het die resultate van hierdie nuwe benadering tot immunosifting bevestig. Dus toon hierdie studies dat die kombinasie van oligosakkaried-biotinilering en ELISA-sifting met glikaan-geteikende monoklonale teenliggaampies gebruik kan word om kruisbindings in oligosakkariede op te spoor en wyd toegepas kan word in ander biochemiese studies wat die struktuur van oligosakkariede karakteriseer.
Hierdie biotien-gebaseerde glikaanprofileringsmetode is die eerste verslag wat die hardnekkige koolhidraatbindings van oplosbare oligosakkariede in plantbiomassa kan ondersoek. Dit help om te verstaan ​​waarom sommige dele van biomassa so hardnekkig is wanneer dit kom by biobrandstofproduksie. Hierdie metode vul 'n belangrike gaping in glikoomanalisemetodes en brei die toepassing daarvan uit na 'n wyer reeks substrate buite plant-oligosakkariede. In die toekoms kan ons robotika vir biotinilering gebruik en die metode wat ons ontwikkel het vir hoë-deurset-analise van monsters met behulp van ELISA gebruik.
Mieliestrooi (KS) gekweek van Pioneer 33A14-bastersaad is in 2010 geoes van Kramer Farms in Ray, Colorado. Met die toestemming van die grondeienaar kan hierdie biomassa vir navorsing gebruik word. Die monsters is droog < 6% vog in ritssluitsakke by kamertemperatuur gestoor. Die monsters is droog < 6% vog in ritssluitsakke by kamertemperatuur gestoor. Verwyder die stelsel met 'n algemene stelsel van < 6% in 'n pakket met 'n stelsel van 'n plaaslike stelsel. Monsters is droog by kamertemperatuur teen <6% humiditeit in ritssluitende sakke gestoor.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Optimale temperamente teen verbruik van < 6%. Monsters word in ritssluitersakke by kamertemperatuur met 'n humiditeit van < 6% gestoor.Die studie het aan plaaslike en nasionale riglyne voldoen. Samestellingsanalise is uitgevoer met behulp van die NREL-protokol. Daar is bevind dat die samestelling 31.4% glukaan, 18.7% xylaan, 3.3% arabinaan, 1.2% galaktaan, 2.2% asetiel, 14.3% lignien, 1.7% proteïen en 13.4% as bevat.
Cellic® CTec2 (138 mg proteïen/ml, lot VCNI 0001) is 'n komplekse mengsel van sellulase, β-glukosidase en Cellic® HTec2 (157 mg proteïen/ml, lot VHN00001) van Novozymes (Franklinton, NC, VSA)). Multifect Pectinase® (72 mg proteïen/ml), 'n komplekse mengsel van pektien-afbrekende ensieme, is geskenk deur DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, VSA). Ensiemproteïenkonsentrasies is bepaal deur proteïeninhoud te skat (en die bydrae van nie-proteïenstikstof af te trek) met behulp van Kjeldahl-stikstofanalise (AOAC-metode 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, VSA). Diatomeeënaarde 545 is aangekoop van EMD Millipore (Billerica, MA). Geaktiveerde koolstof (DARCO, 100 maas korrels), Avicel (PH-101), beuk xylaan, en alle ander chemikalieë is aangekoop van Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
AFEX-voorbehandeling is by GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, VSA) uitgevoer. Voorbehandeling is vir 15 minute by 140°C uitgevoer. 46 verblyftyd teen 'n 1:1 verhouding van anhidriese ammoniak tot biomassa teen 60% (g/g) lading in 'n vlekvrye staal-toonbankreaktor (Parr Instruments Company). Dit het 30 minute geneem. Die reaktor is tot 140°C gebring en die ammoniak is vinnig vrygestel, wat die biomassa toegelaat het om vinnig na kamertemperatuur terug te keer. Die samestelling van AFEX-voorbehandelde mieliereste (ACS) was soortgelyk aan dié van onbehandelde mieliereste (UT-CS).
Hoë vastestowwe ACSH 25% (g/g) (ongeveer 8% dekstraanlading) is voorberei as 'n uitgangsmateriaal vir grootskaalse produksie van oligosakkariede. Ensiematiese hidrolise van ACS is uitgevoer met behulp van 'n kommersiële ensiemmengsel wat Cellic® Ctec2 10 mg proteïen/g glukaan (in voorbehandelde biomassa), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteïen/g glukaan, en Multifect Pektinase (Genencor Inc, VSA) insluit. ), 5 mg proteïen/g dekstraan. Ensiematiese hidrolise is uitgevoer in 'n 5-liter bioreaktor met 'n werkvolume van 3 liter, pH 4.8, 50°C en 250 rpm. Na hidrolise vir 96 uur, is die hidrolise versamel deur sentrifugering teen 6000 rpm vir 30 minute en dan teen 14000 rpm vir 30 minute om ongehidroliseerde vastestowwe te verwyder. Die hidrolisaat is toe onderwerp aan steriele filtrasie deur 'n 0.22 mm filterbeker. Die gefiltreerde hidrolisaat is in steriele bottels by 4°C gestoor en toe op koolstof gefraksioneer.
Analise van die samestelling van ekstrak-gebaseerde biomassamonsters volgens NREL-laboratoriumanaliseprosedures: voorbereiding van monsters vir samestellingsanalise (NREL/TP-510-42620) en bepaling van strukturele koolhidrate en lignien in biomassa (NREL/TP-510 – 42618)47.
Oligosakkariedanalise van die hidrolisaatstroom is op 'n 2 ml-skaal uitgevoer met behulp van 'n outoklaaf-gebaseerde suurhidrolisemetode. Meng die hidrolisaatmonster met 69.7 µl 72% swaelsuur in 'n 10 ml-skroefdop-kultuurbuis en inkubeer vir 1 uur op 'n werkbank by 121 °C, laat afkoel op ys en filtreer in 'n hoëprestasievloeistofchromatografie (HPLC)-flessie. Die konsentrasie van oligosakkariede is bepaal deur die konsentrasie van monosakkariede in die nie-gehidroliseerde monster af te trek van die totale suikerkonsentrasie in die suur-gehidroliseerde monster.
Glukose-, xylose- en arabinose-konsentrasies in die suurgehidroliseerde biomassa is geanaliseer met behulp van 'n Shimadzu HPLC-stelsel toegerus met 'n outomatiseerder, kolomverwarmer, isokratiese pomp en brekingsindeksdetektor op 'n Bio-Rad Aminex HPX-87H-kolom. Die kolom is by 50°C gehou en geëlueer met 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 in watervloei.
Die hidrolisaat-supernatant is verdun en geanaliseer vir monomeer- en oligosakkariedinhoud. Monomeriese suikers wat na ensiematiese hidrolise verkry is, is geanaliseer deur HPLC toegerus met 'n Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P-kolom en 'n asbeskermingskolom. Die kolomtemperatuur is op 80°C gehandhaaf, water is as die mobiele fase gebruik met 'n vloeitempo van 0.6 ml/min. Oligosakkariede is bepaal deur hidrolise in verdunde suur by 121°C volgens die metodes wat in verwysings 41, 48, 49 beskryf word.
Sakkaried-analise is uitgevoer op rou, AFEX-voorbehandelde en alle nie-gehidroliseerde biomassa-residue (insluitend die produksie van reeks selwand-ekstrakte en hul mAb-sifting) met behulp van voorheen beskryfde prosedures 27, 43, 50, 51. Vir glikome-analise word alkohol-onoplosbare residue van plantselwandmateriaal voorberei uit biomassa-residue en onderwerp aan reeks-ekstraksie met toenemend aggressiewe reagense soos ammoniumoksalaat (50 mM), natriumkarbonaat (50 mM en 0.5% g/v), CON. (1M en 4M, beide met 1% g/v natriumboorhidried) en suurchloriet soos voorheen beskryf 52,53. Die ekstrakte is toe onderwerp aan ELISA teen 'n komplekse paneel van mAb50's wat op die selwandglikaan gerig is, en die mAb-bindingsreaksies is as 'n hittekaart aangebied. mAbs wat op plantselwandglikaan gemik is, is aangekoop van laboratoriumvoorrade (CCRC-, JIM- en MAC-reekse).
Eenstap-biotinilering van oligosakkariede. Die konjugasie van koolhidrate met biotien-LC-hidrasied is uitgevoer met behulp van die volgende prosedure. Biotien-LC-hidrasied (4.6 mg/12 μmol) is opgelos in dimetielsulfoksied (DMSO, 70 μl) deur kragtige roering en verhitting by 65°C vir 1 minuut. Ysasynsuur (30 μl) is bygevoeg en die mengsel is op natriumsianoboorhidried (6.4 mg/100 μmol) gegooi en volledig opgelos na verhitting by 65°C vir ongeveer 1 minuut. Daarna is 5 tot 8 μl van die reaksiemengsel by die gedroogde oligosakkaried (1-100 nmol) gevoeg om 'n 10-voudige of meer molêre oormaat van die etiket bo die reduseerpunt te verkry. Die reaksie is vir 2 uur by 65°C uitgevoer, waarna die monsters onmiddellik gesuiwer is. Geen natriumsianoboorhidried is in die etiketteringseksperimente sonder reduksie gebruik nie, en die monsters is vir 2.5 uur by 65°C gereageer.
ELISA-bedekking en was van monsters van gebiotinileerde oligosakkariede. 25 μl gebiotinileerde monsters (100 μl van elke gekonsentreerde monster verdun in 5 ml van 0.1 M Tris-bufferoplossing (TBS)) is by elke putjie van die avidien-bedekte plaat gevoeg. Kontroleputjies is bedek met 50 μl biotien teen 'n konsentrasie van 10 μg/ml in 0.1 M TBS. Gedeïoniseerde water is as 'n bedekking vir blanko-metings gebruik. Die tablet is vir 2 uur by kamertemperatuur in die donker geïnkubeer. Was die plaat 3 keer met 0.1% afgeroomde melk in 0.1 M TBS met behulp van program nr. 11 vir Grenier-vlak 3A.
Byvoeging en was van primêre teenliggaampies. Voeg 40 µl primêre teenliggaam by elke putjie. Inkubeer die mikroplaat vir 1 uur by kamertemperatuur in die donker. Die plate is toe 3 keer gewas met 0.1% melk in 0.1M TBS met behulp van wasprogram #11 vir Grenier Flat 3A.
Voeg sekondêre teenliggaam by en was. Voeg 50 µl muis/rot sekondêre teenliggaam (verdun 1:5000 in 0.1% melk in 0.1 M TBS) by elke putjie. Inkubeer die mikroplaat vir 1 uur by kamertemperatuur in die donker. Die mikroplate is toe 5 keer gewas met 0.1% melk in 0.1 M TBS met behulp van Grenier Flat 5A plaatwasprogram #12.
Voeg 'n substraat by. Voeg 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametielbensidien (TMB) by die basissubstraat (deur 2 druppels buffer, 3 druppels TMB, 2 druppels waterstofperoksied by 15 ml gedeïoniseerde water te voeg). Berei die TMB-substraat voor en vortex voor gebruik). Inkubeer die mikroplaat by kamertemperatuur vir 30 minute. In die donker.
Voltooi die stap en lees die tablet. Voeg 50 µl 1 N swaelsuur by elke putjie en registreer die absorbansie van 450 tot 655 nm met behulp van 'n ELISA-leser.
Berei 1 mg/ml oplossings van hierdie analiete in gedeïoniseerde water voor: arabinose, ramnose, fukose, xylose, galakturoonsuur (GalA), glukuronsuur (GlcA), mannose, glukose, galaktose, laktose, N-asetielmannosamien (manNAc), N-asetielglukosamien (glcNAc), N-asetielgalaktosamien (galNAc), inositol (interne standaard). Twee standaarde is voorberei deur die 1 mg/ml suikeroplossings wat in Tabel 1 getoon word, by te voeg. Monsters word gevries en gevriesdroog by -80°C totdat alle water verwyder is (gewoonlik ongeveer 12-18 uur).
Voeg 100–500 µg monster by skroefdopbuise op 'n analitiese balans. Teken die bygevoegde hoeveelheid aan. Dit is die beste om die monster in 'n spesifieke konsentrasie oplosmiddel op te los en dit as 'n vloeibare aliquot by die buis te voeg. Gebruik 20 µl van 1 mg/ml inositol as 'n interne standaard vir elke monsterbuis. Die hoeveelheid interne standaard wat by die monster gevoeg word, moet dieselfde wees as die hoeveelheid interne standaard wat by die standaardbuis gevoeg word.
Voeg 8 ml anhidriese metanol by 'n skroefdopflessie. Dan 4 ml 3 N metanoliese HCl-oplossing, toegemaak en geskud. Hierdie proses gebruik nie water nie.
Voeg 500 µl van 'n 1 M HCl-metanoloplossing by die oligosakkariedmonsters en standaard TMS-buise. Monsters is oornag (168 uur) by 80°C in 'n termiese blok geïnkubeer. Droog die metanoliseproduk by kamertemperatuur met behulp van 'n droogmanifold. Voeg 200 µl MeOH by en droog weer. Hierdie proses word twee keer herhaal. Voeg 200 µl metanol, 100 µl piridien en 100 µl asynsuuranhidried by die monster en meng goed. Inkubeer monsters by kamertemperatuur vir 30 minute en droog. Voeg 200 µl metanol by en droog weer.
Voeg 200 µl Tri-Sil by en verhit die buis met 'n toegemaakte hitte vir 20 minute tot 80°C, en laat dit dan afkoel tot kamertemperatuur. Gebruik 'n droogmanifold om die monster verder te droog tot 'n volume van ongeveer 50 µl. Dit is belangrik om daarop te let dat ons nie die monsters heeltemal laat droog word het nie.
Voeg 2 ml heksaan by en meng goed deur te vortex. Vul die punte van Pasteur-pipette (5-8 mm) met 'n stukkie glaswol deur die glaswol bo-op 'n pipet met 'n deursnee van 5-3/4 duim te plaas. Monsters is vir 2 minute by 3000 g gesentrifugeer. Enige onoplosbare residue word neergeslaan. Droog die monster tot 100-150 µl. 'n Volume van ongeveer 1 μl is in die GC-MS ingespuit by 'n aanvanklike temperatuur van 80 °C en 'n aanvanklike tyd van 2.0 minute (Tabel 2).