Nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን፡ እየተጠቀሙበት ያለው የአሳሽ ስሪት ለሲኤስኤስ የተገደበ ድጋፍ አለው። ለምርጥ ተሞክሮ የተሻሻለ አሳሽ (ወይም የተኳኋኝነት ሁነታን በInternet Explorer ውስጥ እንዲያጠፉት እንመክራለን) እስከዚያው ድረስ ቀጣይ ድጋፍን ለማረጋገጥ ጣቢያውን ያለ ቅጦች እና ጃቫስክሪፕት እናሳያለን።
የሰው አንጀት morphogenesis የ 3D epithelial microarchitecture እና የቦታ አደረጃጀት ክሪፕት-ቪለስ ባህሪያትን ያቋቁማል።ይህ ልዩ መዋቅር በባሳል ክሪፕት ውስጥ የሚገኘውን የስቴም ሴል ኒሼን ከውጪ ተህዋሲያን አንቲጂኖች እና ሜታቦሊተኖቻቸው ​​በመጠበቅ አንጀት homeostasisን ለመጠበቅ ይህ ልዩ መዋቅር ያስፈልጋል። mucosal surface.ስለዚህ የ 3D ኤፒተልየል መዋቅሮችን እንደገና መፍጠር በብልቃጥ አንጀት ውስጥ ሞዴሎችን ለመገንባት ወሳኝ ነው ።በተለይ ፣ ኦርጋኒክ ሚሚቲክ አንጀት-አ-ቺፕ የአንጀት ኤፒተልየም ድንገተኛ የ 3D ሞርጀኔሲስ በተሻሻሉ የፊዚዮሎጂ ተግባራት እና ባዮሜካኒክስ እንዲፈጠር እናደርጋለን። በማይክሮ ፍሉይዲክ ቺፕ ላይ እንዲሁም በትራንስዌል የተከተተ ድብልቅ ቺፕ ላይ በአንጀት ውስጥ ያለው ሞሮጀኔሲስ ለመሳሪያው አፈጣጠር ፣የካኮ-2 ወይም የአንጀት ኦርጋኖይድ ኤፒተልየል ሴሎችን እንደገና ለማዳበር በተለመዱ መቼቶች እንዲሁም በማይክሮፍሉይዲክ መድረክ ላይ ፣ የ 3 ዲ ሞርሞጅጄኔሽን መነሳሳት እና የ 3D ኢፒቲኦጄኔሽን ፈጠራን በመጠቀም የተቋቋሙትን ባህሪዎች እንገልፃለን ። የተግባር ጉት ማይክሮአርክቴክቸር የባሶላተራል ፈሳሽ ፍሰትን ለ 5 ዲ በመቆጣጠር የኛን በብልቃጥ ሞርፊጀኒዝስ ዘዴ ፊዚዮሎጂያዊ ተያያዥነት ያለው የቫይታሚክ ውጥረት እና ሜካኒካል እንቅስቃሴን ይጠቀማል እና ውስብስብ የሕዋስ ምህንድስና ወይም ማጭበርበርን አይጠይቅም ይህም ከሌሎች ቴክኒኮች የላቀ ሊሆን ይችላል። ለባዮሜዲካል, ክሊኒካዊ እና ፋርማሲዩቲካል አፕሊኬሽኖች.
ሙከራዎች እንደሚያሳዩት የአንጀት epithelial Caco-2 ሕዋሳት በ gut-on-a-chip1,2,3,4,5 ወይም bilayer microfluidic devices6,7 ውስጥ የተፈጠረ ድንገተኛ የ3D ሞርጅጀንስ በብልቃጥ ውስጥ ሊታከሙ ይችላሉ። በካኮ-2 እና በትዕግስት የተገኘ የአንጀት ኦርጋኖይድ የታየበት 3D ኤፒተልየል ሞርጀኔሲስ በብልቃጥ ውስጥ። ኤፒተልያል ህዋሶች ተረጋግጠዋል።በዚህ ጥናት በተለይ ሃይለኛው የWnt ባላጋራ ዲክኮፕፍ-1 (DKK-1) በ gut-on-a-chip ውስጥ እና ትራንስዌል ማስገባቶችን የያዙ ማይክሮፍሉይዲክ መሳሪያዎችን በማዘጋጀት ላይ ያተኮረ ሲሆን ይህም “ድብልቅ ቺፕ” የሚል ስያሜ ተሰጥቶታል። ፍርፋሪ-የተያያዘ ፕሮቲን 1 ወይም ሶጊ-1) ወደ ቺፕ አንጀት ሞርሞጅንን ይከለክላል ወይም አስቀድሞ የተዋቀረውን የ3-ል ኤፒተልያል ሽፋን ይረብሸዋል፣ ይህም በባህል ወቅት ተቃራኒ ውጥረት ለአንጀት ሞርጅጀንስ በብልቃጥ ውስጥ ተጠያቂ እንደሆነ ይጠቁማል። ክፍልን በንቃት በማጠብ (ለምሳሌ በአንጀት-ላይ-ቺፕ ወይም ድቅል-ላይ-ቺፕ መድረኮች) ወይም ስርጭት .Basolateral media (ለምሳሌ ከTranswell ወደ ትላልቅ የባሶላተራል ማጠራቀሚያ ጉድጓዶች ውስጥ ማስገባት)።
በዚህ ፕሮቶኮል ውስጥ አንጀት-ላይ-ቺፕ ማይክሮዲቪስ እና Transwell-insertable hybrid chips (ደረጃ 1-5) በ polydimethylsiloxane (PDMS) ላይ የተመሰረቱ ባለ ቀዳዳ ሽፋኖች (ደረጃ 6A፣ 7A፣ 8፣ 9) ወይም ትራንስዌልስተር ሜምፕላስ 7 8, 9) እና የ 3D morphogenesis በብልቃጥ (እርምጃ 10) ተነሳሱ.እንዲሁም በቲሹ-ተኮር ሂስቶጄኔሲስ እና በዘር ላይ የተመሰረተ የሴሉላር ልዩነትን የሚያመለክቱ ሴሉላር እና ሞለኪውላዊ ባህሪያትን ለይተናል ብዙ የምስል ዘዴዎችን (እርምጃ 11-24) በመተግበር የሰው አንጀትን በመጠቀም ሞርሞጅንን እናነሳሳለን, ካስቲን-ኢፒተልያል ኦርጋን ውስጥ ያሉ ሁለት ህዋሶች ወይም ኦርጋን ውስጥ ያሉ ሁለት ህዋሶች ያሉት. ቴክኒካል ዝርዝሮች ባለ ቀዳዳ ሽፋን ላይ ላዩን ማሻሻል፣ 2D monolayers መፍጠር፣ እና የአንጀት ባዮኬሚካል እና የባዮሜካኒካል ማይክሮ ኤንቪሮን መራባትን ጨምሮ። የሚታደስ 3D ኤፒተልየል ሽፋን በሞርሞጅን ላይ የተመሰረተ የኤፒተልየል እድገትን፣ የረጅም ጊዜ አስተናጋጅ-ማይክሮባዮም አብሮ ባህሎችን፣ በሽታ አምጪ ተህዋስያንን ኢንፌክሽን፣ የቁስል መጎዳትን፣ የ epithelial barrier dysfunction እና ፕሮባዮቲክ-ተኮር ሕክምናዎችን ምሳሌ።ተፅዕኖዎች።
የእኛ ፕሮቶኮል በመሠረታዊ ደረጃ (ለምሳሌ ፣ የአንጀት mucosal ባዮሎጂ ፣ ስቴም ሴል ባዮሎጂ እና የእድገት ባዮሎጂ) እና ተግባራዊ ምርምር (ለምሳሌ ፣ ቅድመ ክሊኒካዊ የመድኃኒት ምርመራ ፣ የበሽታ አምሳያ ፣ የቲሹ ኢንጂነሪንግ እና የጨጓራ ​​​​ኢንጂነሪንግ) ሰፊ ተፅእኖ ውስጥ ለብዙ ሳይንቲስቶች ጠቃሚ ሊሆን ይችላል ። ቴክኒካል ስትራተጂያችን በአንጀት እድገት፣በዳግም መወለድ ወይም ሆሞስታሲስ ወቅት የሕዋስ ምልክቶችን ተለዋዋጭነት ለሚማሩ ተመልካቾች ሊሰራጭ እንደሚችል አስብ።በተጨማሪ የኛ ፕሮቶኮል በተለያዩ ተላላፊ ወኪሎች እንደ ኖሮቫይረስ 8፣ ከባድ አጣዳፊ የመተንፈሻ አካላት ሲንድሮም 2 (SARS-Costridium) ወይም ሳልብሪሪየም ዳይሪየም ዳይሪየም ኮሌራ. የበሽታ ፓቶሎጂ እና በሽታ አምጪ ተህዋሲያን ታዳሚዎችም ጠቃሚ ናቸው በቺፕ አንጀት ማይክሮ ፊዚዮሎጂ ስርዓት መጠቀም ቁመታዊ የጋራ ባህል 10 እና ተከታይ የአስተናጋጅ መከላከያ ግምገማ, የበሽታ መከላከያ ምላሾች እና በሽታ አምጪ ተህዋስያን በጨጓራና ትራክት (GI) ትራክት ውስጥ በሽታ አምጪ ተህዋስያንን ለመጠገን ያስችላል የታካሚውን 3D አንጀት ኤፒተልየል ሽፋኖችን በመጠቀም የ 3D የአንጀት epithelial ሽፋኖች በሚዘጋጁበት ጊዜ የሚመስሉ በሽታዎች እነዚህ በሽታዎች ቪሊየስ እየመነመኑ ፣ ክሪፕት ማሳጠር ፣ የ mucosal ብልሽት ወይም የተዳከመ የኢፒተልያል እንቅፋት ያካትታሉ። ባዮፕሲ ወይም ስቴም ሴል የሚመነጨው የአንጀት በሽታ አምጪ ተህዋሲያንን የበለጠ ውስብስብ የሆኑትን ህዋሶች የበለጠ ሞዴል ለማድረግ ይረዳል። እንደ ታካሚ የደም ሞኖኑክሌር ህዋሶች (PBMCs) ያሉ የ3D የአንጀት ቪለስ-ክሪፕት ማይክሮአርክቴክቸር የያዙ ሞዴሎች። ቲሹ-ተኮር የበሽታ ተከላካይ ሕዋሳት ፣ 5.
3D epithelial microstructure ያለ ክፍፍሉ ሂደት ሊስተካከል እና ሊታይ ስለሚችል፣በቦታ ትራንስክሪፕቶሚክስ ላይ የሚሰሩ ተመልካቾች እና ከፍተኛ ጥራት ያለው ወይም እጅግ በጣም ጥራት ያለው ኢሜጂንግ ላይ የሚሰሩ ተመልካቾች የጂኖች እና ፕሮቲኖች የስፔዮቴምፖራል ዳይናሚክስ ኤፒተልያል ኒችስ ላይ የእኛን ካርታ ሊፈልጉ ይችላሉ። ለቴክኖሎጂ ፍላጎት ያለው።ለማይክሮባዮል ወይም ለበሽታ መከላከያ ማነቃቂያዎች የተሰጠ ምላሽ።ከዚህም በተጨማሪ አንጀት ሆሞስታሲስን የሚያስተባብር የረጅም ጊዜ አስተናጋጅ-ማይክሮባዮም 10፣ 14 ​​በ 3D የአንጀት mucosal ሽፋን ውስጥ የተለያዩ የማይክሮቢያል ዝርያዎችን፣ ማይክሮቢያል ማህበረሰቦችን ወይም ፌካል ማይክሮባዮታ- በተለይም ጉትቻኦታ- ውስጥ በማልማት ሊቋቋም ይችላል። በመድረኩ ላይ ይህ አቀራረብ በተለይ የ mucosal immunology ፣gastroenterology ፣ Human microbiome ፣ culturomics እና ክሊኒካል ማይክሮባዮሎጂን በላብራቶሪ ውስጥ ለማዳበር ለሚፈልጉ ታዳሚዎች ማራኪ ነው። ባሶላተራል ክፍሎች፣ ፕሮቶኮሉ ፋርማሲዩቲካል፣ ባዮሜዲካል ወይም ከፍተኛ የፍተሻ ወይም የማረጋገጫ መድረኮች ለምግብ ኢንደስትሪ በማደግ ላይ ላሉት ሊሰራጭ ይችላል።እንደመርህ-መሠረታዊነት፣በቅርቡ የ multiplex ከፍተኛ-throughput morphogenesis ሥርዓት ወደ 24-በተጨማሪ-የፕላትchion ምርቶች አካል ቅርፀት ሊመጣጠን እንደሚችል አሳይተናል። ማስታወቂያ የኦርጋን ኦን-ቺፕ ሞዴሎች የአንጀትን ሞርሞጅጄኔሽን ሂደት እንደገና መራባትን ለመገምገም.
የተወሰኑ የሰው አግባብነት ያላቸው የሙከራ ሞዴሎች የአንጀትን ኤፒተልያል ሞርጅጄኔሽን ለማጥናት ጥቅም ላይ ውለዋል፣ በተለይም የ 3D morphogenesis በብልቃጥ ውስጥ ለማነሳሳት ሊተገበሩ የሚችሉ ፕሮቶኮሎች ባለመኖራቸው።በእውነቱ፣ ስለ አንጀት ሞርሞጅጄኔሲስ ያለው አብዛኛው እውቀት በእንስሳት ጥናቶች ላይ የተመሰረተ ነው (ለምሳሌ ዚብራፊሽ20፣ አይጥ 21 ወይም ዶሮ 22) እና ምን ያህል ወጪ የሚጠይቁ ናቸው እና ምን ያህል ዋጋ ያስከፍላሉ። በአስፈላጊ ሁኔታ የሰውን ልጅ የእድገት ሂደቶች በትክክል አይወስኑ.እነዚህ ሞዴሎችም በብዙ መንገድ ሊሰፋ በሚችል መልኩ የመሞከር ችሎታቸው በጣም የተገደበ ነው.ስለዚህ የ 3D ቲሹ አወቃቀሮችን በብልቃጥ ውስጥ ለማደስ ፕሮቶኮላችን በ Vivo የእንስሳት ሞዴሎች እና ሌሎች ባህላዊ የማይንቀሳቀስ የ 2D ሕዋስ ባህል ሞዴሎች ቀደም ሲል እንደተገለፀው የ 3D ህዋሳትን በተለያዩ ኤፒቲየላይዜሽን እንድንመረምር ተፈቅዶልናል ። የ crypt-villus axis ለተለያዩ የ mucosal ወይም ተከላካይ ማነቃቂያዎች ምላሽ ለመስጠት.3D epithelial layers ማይክሮቢያል ሴሎች እንዴት እንደሚወዳደሩ ለማጥናት ክፍተት ሊሰጡ ይችላሉ የቦታ ኒች እና የስነምህዳር ዝግመተ ለውጥ ለአስተናጋጅ ምክንያቶች ምላሽ (ለምሳሌ ከውስጥ ጋር በተቃራኒው የውጨኛው ንፋጭ ሽፋን፣ የ IgA ሚስጥር እና ፀረ-ተህዋሲያን peptides) ዲ በተጨማሪ ጉጉት 3 ን እንዴት ሊረዳ ይችላል ። ማይክሮባዮታ ማህበረሰቦቹን ያዋቅራል እና በተቀናጀ መልኩ ሴሉላር አደረጃጀትን እና ስቴም ሴል ኒችዎችን በመሠረታዊ ክሪፕቶች ውስጥ የሚቀርጹ ረቂቅ ተሕዋስያን ሜታቦላይቶችን (ለምሳሌ አጭር ሰንሰለት ፋቲ አሲድ) ያመነጫል።እነዚህ ባህሪያት ሊታዩ የሚችሉት 3D epithelial layers በብልቃጥ ውስጥ ሲመሰረቱ ብቻ ነው።
የ 3D የአንጀት epithelial አወቃቀሮችን ከመፍጠር ዘዴያችን በተጨማሪ በብልቃጥ ውስጥ በርካታ ዘዴዎች አሉ የአንጀት ኦርጋኖይድ ባህል በተወሰኑ ሞርሞጅን ሁኔታዎች ውስጥ የአንጀት ሴል ሴሎችን በማልማት ላይ የተመሰረተ ዘመናዊ የቲሹ ምህንድስና ቴክኒክ ነው23,24,25. ነገር ግን የ 3D ኦርጋኖይድ አስተናጋጅ-ሞዴሎችን ለትራንስፖርት ትንተና ብዙውን ጊዜ ጥቅም ላይ ይውላል. የአንጀት ብርሃን በኦርጋኖይድ ውስጥ ተዘግቷል, እና ስለዚህ, እንደ ማይክሮቢያል ሴሎች ወይም ውጫዊ አንቲጂኖች ያሉ የብርሃን ክፍሎችን ማስተዋወቅ ውስን ነው. ወደ ኦርጋኖይድ lumens መድረስ በማይክሮኢንጀክተር በመጠቀም ሊሻሻል ይችላል,26,27 ነገር ግን ይህ ዘዴ ወራሪ እና ጉልበት የሚጠይቅ እና ለማከናወን ልዩ እውቀት ያስፈልገዋል.ከዚህም በተጨማሪ በሃይሮጄል ስካፎልዶች ውስጥ በስታቲስቲክስ ሁኔታዎች ውስጥ የተቀመጡት ባህላዊ የኦርጋኖይድ ባህሎች በቪቮ ባዮሜካኒክስ ውስጥ ያለውን ንቁ እንቅስቃሴ በትክክል አያሳዩም.
በበርካታ የምርምር ቡድኖች የተቀጠሩ ሌሎች አካሄዶች አንጀት ኤፒተልያል መዋቅርን ለመምሰል ቀድሞ የተዋቀሩ የ3D ሀይድሮጅል ስካፎልዶችን በመጠቀም የተለዩ የሰው አንጀት ህዋሶችን በጄል ወለል ላይ በማዳበር በ3D የታተሙ ፣በማይክሮ-ወፍጮ ወይም በሊታግራፊያዊ ቅርፅ የተሰሩ ቅርጾችን በመጠቀም የሃይድሮጂናል ስካፎልዶችን ያመርቱ። አግባብነት ያላቸው ሞርሞጅን ግሬዲየቶች፣ ከፍተኛ ገጽታ ያለው የኤፒተልያል መዋቅር እና የስትሮማ-ኤፒተልያል መስቀለኛ መንገድን በማቋቋም በስካፎልድ ውስጥ ያሉ የስትሮማል ህዋሶችን በማካተት።ነገር ግን አስቀድሞ የተዋቀሩ ቅርፊቶች ተፈጥሮ በራሱ ድንገተኛ የሆነ የሞሮጅን ሂደት እንዳይታይ ሊያደርግ ይችላል። ሌላ የቅርብ ጊዜ ጥናት ደግሞ የሃይድሮጅል ስካፎልዶችን በማይክሮ ፍሎይዲክ መድረክ እና በሌዘር ማሳከክ ቴክኒኮችን በመጠቀም አንጀትን ኤፒተልያል መዋቅሮችን ተጠቅሟል።የአይጥ አንጀት ኦርጋኖይድስ የተቀረጹ ቅርጾችን በመከተል የአንጀት ቱቦዎችን አወቃቀሮችን ለመመስረት እና የ intraluminal ፈሳሽ ፍሰት በማይክሮፍሉይዲክ ፕላትፎርም ውስጥ እንደገና እንዲሰራ ማድረግ አይቻልም። የአንጀት ሜካኖባዮሎጂካል እንቅስቃሴዎችን ያጠቃልላል።በተመሳሳይ ቡድን ውስጥ ያሉ የ3ዲ ማተሚያ ቴክኒኮች ትንንሽ የአንጀት ቱቦዎችን በራስ-ሰር morphogenetic ሂደቶች መፍጠር ችለዋል።በቧንቧው ውስጥ የተለያዩ የአንጀት ክፍሎች ውስብስብ ቢፈጠሩም ​​ይህ ሞዴል የብርሃን ፈሳሽ ፍሰት እና የሜካኒካል መበላሸት የለውም።በተጨማሪም የሞዴል ኦፕሬሽን ብቃቱ ሊገደብ ይችላል፣በተለይም ባዮፕሪንግ-ሙከራ ሂደት ከተጠናቀቀ በኋላ። interactions.ይልቁንስ የእኛ ፕሮቶኮል ድንገተኛ አንጀት morphogenesis ያቀርባል, ፊዚዮሎጂ ተዛማጅ ሸለተ ውጥረት, የአንጀት እንቅስቃሴ የሚመስል ባዮሜካኒክስ, ነጻ apical እና basolateral ክፍሎች ተደራሽነት, እና ሞጁላርነት ውስብስብ ባዮሎጂያዊ ማይክሮ ኤንቬንሽን እንደገና መፍጠር.ስለዚህ የእኛ በብልቃጥ 3D ነባራዊ ሞርሞርጂ ነባሩን ፕሮጄኔሲስ ሊፈታተን ይችላል.
የእኛ ፕሮቶኮል ሙሉ በሙሉ በ 3D epithelial morphogenesis ላይ ያተኮረ ነው ፣ በባህል ውስጥ ያሉ ኤፒተልየል ሴሎች ብቻ እና እንደ ሜሴንቺማል ሴሎች ፣ endothelial ሕዋሳት እና የበሽታ ተከላካይ ሕዋሳት ያሉ ሌሎች ምንም አይነት በዙሪያቸው ያሉ ህዋሶች የሉም። ቀደም ሲል እንደተገለፀው የፕሮቶኮላችን ዋና ከባሶላተራል ሞጁል ውስጥ የተደበቁትን ሞርሞጂን አጋቾችን በማስወገድ ኤፒተልያል ሞርሞጅን ማነሳሳት ነው። አንጀት-ላይ-ቺፕ እና ድቅል-ላይ-ቺፕ የማይበረዝ የ3-ል ኤፒተልያል ንብርብርን እንደገና እንድንፈጥር ያስችለናል፣ ተጨማሪ ባዮሎጂያዊ ውስብስብ ነገሮች እንደ ኤፒተልያል-ሜሴንቺማል መስተጋብር33፣34፣ extracellular Matrix (ECM) ማስቀመጫ 35 እና፣ በእኛ ሞዴል ውስጥ፣ crypt-villus በሴሎች ውስጥ ያሉ ስቴም ኒችዎችን የሚያስተላልፍ ተጨማሪ ነገር ሆኖ ይቆያሉ። ፋይብሮብላስትስ) በሜሴንቺም ውስጥ የኢሲኤም ፕሮቲኖችን በማምረት እና በ vivo35,37,38 ውስጥ የአንጀት ሞርሞጅጀንስን በመቆጣጠር ረገድ ቁልፍ ሚና ይጫወታሉ።የሜሴንቺማል ሴሎች ወደ ሞዴላችን መጨመራቸው የmorphogenetic ሂደትን እና የሕዋስ ተያያዥነት ውጤታማነትን ከፍ አድርጓል። በአንጀት ማይክሮ ኤንቬንሽን ውስጥ.ከዚህም በተጨማሪ የቲሹ ሞዴሎች የባለብዙ አካል መስተጋብርን ለማሳየት ሲዘጋጁ በቲሹ ሞዴሎች መካከል ሊገናኙ የሚችሉ የቫስኩላር ክፍሎች ቅድመ ሁኔታ ናቸው.ስለዚህ የኢንዶቴልየም ሴሎች ተጨማሪ ትክክለኛ የፊዚዮሎጂ ባህሪያትን በኦርጋን-ደረጃ ጥራት ለመቅረጽ ሊጨመሩ ይችላሉ.ከታካሚ የመነጩ የበሽታ ተከላካይ ሕዋሳት በተጨማሪም በፀረ-ተህዋሲያን ውስጥ, የበሽታ መከላከያዎችን እና ፀረ-ተሕዋስያንን ለማሳየት አስፈላጊ ናቸው. የአንጀት በሽታን በመኮረጅ ሁኔታ ውስጥ ቲሹ-ተኮር መከላከያ.
የተዳቀሉ ቺፖችን መጠቀም ከጉት-ላይ-ቺፕ የበለጠ ቀላል ነው ምክንያቱም መሳሪያው ማዋቀር ቀላል ስለሆነ እና ትራንስዌል ማስገባቶች መጠቀም ለአንጀት ኤፒተልየም ሊሰፋ የሚችል ባህል እንዲኖር ያስችላል።ነገር ግን ለንግድ የሚቀርቡት ትራንስዌል ማስገባቶች ከፖሊስተር ሽፋን ጋር የላስቲክ አይደሉም እና እንደ ፔሬስትልቲክ የሚመስሉ እንቅስቃሴዎችን ማስመሰል አይችሉም። በጎን በኩል ሸለተ ውጥረት። በግልጽ ለማየት እንደሚቻለው በአፕቲካል ክፍል ውስጥ ያሉት የማይለዋወጥ ባህሪያት በሃይብሪድ ቺፕስ ውስጥ ለረጅም ጊዜ የሚቆይ የባክቴሪያ ባህልን እምብዛም አያስችሉም ። ዲቃላ ቺፕስ በሚጠቀሙበት ጊዜ 3D ሞርሞጅጀንስን በትራንስዌል ማስገባቶች ውስጥ ማነሳሳት ብንችልም ፣ የፊዚዮሎጂ አግባብነት ያላቸው ባዮሜካኒኮች እጥረት እና የአፕቲካል ፈሳሾች የመድረክ ፍሰት አቅምን ሊገድብ ይችላል።
በሰው ልጅ ክሪፕት-ቪለስ ዘንግ ላይ ያለው ሙሉ መጠን መልሶ ግንባታ በጉት-ላይ-ቺፕ እና ድቅል-ላይ-ቺፕ ባህሎች ሙሉ በሙሉ አልተመሰረቱም።ሞርፎጀጀኔሲስ ከኤፒተልያል ሞኖላይየር ጀምሮ ስለጀመረ፣ 3D ማይክሮ አርክቴክቸርስ የግድ ከክሪፕትስ ውስጥ ከስክሪፕት ጋር ተመሳሳይነት አያሳዩም። 3D ኤፒተልየም፣ ክሪፕት እና ቪሊየስ ክልሎች በግልጽ አልተከፋፈሉም። ምንም እንኳን ከፍ ያለ የላይኛው ቻናሎች ወደ ማይክሮኢንጂነሪድ ኤፒተልየም ቁመት ቢመሩም ከፍተኛው ቁመት አሁንም በ ~ 300-400 µm የተገደበ ነው። በትናንሽ እና በትልቁ አንጀት ውስጥ ያለው ትክክለኛ የሰው አንጀት ክሪፕት ጥልቀት የክብደቱ መጠን ~ 135 እና 4 ነው። ትንሹ አንጀት ቪሊ ~ 600 µm41 ነው።
ከኢሜጂንግ እይታ አንጻር የ3D ማይክሮ አርክቴክቸሮች ከፍተኛ ጥራት ያለው ምስል በቺፕ ላይ ባለው አንጀት ላይ ብቻ ሊገደብ ይችላል ምክንያቱም ከዓላማው ሌንስ እስከ ኤፒተልያል ንብርብር የሚፈለገው የስራ ርቀት በጥቂት ሚሊሜትር ነው ። ይህንን ችግር ለመቅረፍ የሩቅ አላማ ሊያስፈልግ ይችላል። ፒዲኤምኤስ.ከዚህም በላይ በቺፕ ላይ ያለው አንጀት በንብርብር ላይ ያለው ማይክሮ ፋብሪካ በእያንዳንዱ ንብርብር መካከል ቋሚ መጣበቅን ስለሚያካትት የኤፒተልየል ንብርብሩን ገጽታ ለመመርመር የላይኛውን ሽፋን ለመክፈት ወይም ለማስወገድ በጣም ፈታኝ ነው።
የፒዲኤምኤስ ሃይድሮፎቢሲቲ ከሃይድሮፎቢክ ትናንሽ ሞለኪውሎች ጋር በተያያዙ በማይክሮ ፍሎይዲክ ላይ የተመሰረቱ ጥናቶች ገዳቢ ነው ፣ምክንያቱም PDMS እንደዚህ ያሉ የሃይድሮፎቢክ ሞለኪውሎችን በተለየ ሁኔታ ሊያስተላልፍ ስለሚችል።ለ PDMS አማራጭ ከሌሎች ፖሊሜሪክ ቁሶች ጋር ሊታሰብ ይችላል።በአማራጭ የፒዲኤምኤስ ንጣፍ ማስተካከያ (ለምሳሌ ፣ በ 4 ሊፕሊን ፖሊፊል 3 ግላይኮል ቁሶች) የሃይድሮፎቢክ ሞለኪውሎችን ማስተዋወቅን ለመቀነስ ይታሰብ።
በመጨረሻም, የእኛ ዘዴ ከፍተኛ ጥራት ያለው የማጣሪያ ወይም "አንድ-መጠን-ለሁሉም" ለተጠቃሚ ምቹ የሆነ የሙከራ መድረክ በማቅረብ ረገድ በደንብ አልተገለጸም. አሁን ያለው ፕሮቶኮል በእያንዳንዱ ማይክሮሶፍት ውስጥ የሲሪንጅ ፓምፕ ያስፈልገዋል, ይህም በ CO2 ኢንኩቤተር ውስጥ ቦታን የሚይዝ እና ትልቅ ሙከራዎችን ይከላከላል.ይህ ገደብ በከፍተኛ ሁኔታ ሊሻሻል ይችላል, በ scalel24 ለምሳሌ, በ novative culture24 ለምሳሌ-9. ወይም 384-በደንብ የተቦረቦረ ማስገቢያዎች ቀጣይነት ያለው መሙላት እና የባሶላተራል ሚዲያን ማስወገድ)።
በሰው አንጀት ውስጥ ያለው ኤፒተልየም በብልቃጥ ውስጥ 3D morphogenesis ለማነሳሳት ሁለት ትይዩ ማይክሮ ቻነሎችን እና በመካከላቸው ያለው ተጣጣፊ ባለ ቀዳዳ ሽፋን ያለው የማይክሮ ፍሉይዲክ ቺፕ አንጀት መሳሪያ ተጠቅመን የሉሚን-ካፒታል በይነገጽ ለመፍጠር እንጠቀማለን። ያስገባዋል.በሁለቱም መድረኮች ውስጥ, የተለያዩ የሰው አንጀት epithelial ሕዋሳት morphogenesis በባሶላተራል ክፍል ውስጥ morphogen ተቃዋሚዎች ለማስወገድ ፍሰት አቅጣጫ ማባበያ በመተግበር ማሳየት ይቻላል መላውን የሙከራ ሂደት (ስእል 1) አምስት ክፍሎች ያካተተ ነው: (i) የአንጀት ቺፕ ወይም transwell የሚያስገባ ድቅል), (ስቴፕስ 1) ቦክስ 1-5. ኤፒተልየል ሴሎች (Caco-2 ሕዋሳት) ወይም የሰው አንጀት ኦርጋኖይድ; ሳጥኖች 2-5)፣ (iii) የአንጀት ቺፕስ ወይም ዲቃላ ቺፕስ ላይ የአንጀት epithelial ሕዋሳት ባህል (ደረጃ 6-9) (ደረጃ 6-9)፣ (iv) በብልቃጥ ውስጥ 3D morphogenesis induction (ደረጃ 10) እና (v) ) የ 3D epithelial microstructure (ደረጃዎች 11-24 አግባብነት ያለው ቡድን) ለመለየት (ደረጃዎች 11-24 አግባብነት ያለው ቡድን) እንዲታይ ለማድረግ. የ in vitro morphogenesis ኤፒተልየል ሞርሞጅን ከቦታ, ጊዜያዊ, ሁኔታዊ ወይም የሂደት መቆጣጠሪያዎች ጋር በማነፃፀር.
ሁለት የተለያዩ የባህል መድረኮችን እንጠቀማለን፡- gut-on-a-chip with straight channels or unonlinear convoluted channels፣ወይም ትራንስዌል (TW) ማስገቢያ በማይክሮፍሉይዲክ መሳሪያ ውስጥ፣በሣጥን 1 ላይ እንደተገለፀው እና ደረጃ 1-5 የያዙ ድቅል ቺፖችን እና ደረጃ 1-5።”የመሣሪያ ማምረቻ”አንድ ቺፕ ወይም ድብልቅ ቺፕያል ኢንስቲትዩር የሂውማን ሴልታል ምንጭን ያብራራል። (ካኮ-2 ወይም የሰው አንጀት ኦርጋኖይድ) እና በዚህ ፕሮቶኮል ውስጥ ጥቅም ላይ የሚውለው የባህል ሂደት "In vitro morphogenesis" Caco-2 ወይም ኦርጋኖይድ-የመነጩ ኤፒተልየል ሴሎች በአንጀት ቺፕ ላይ ወይም በትራንስዌል የድቅል ቺፕ ላይ የሰለጠኑበትን አጠቃላይ ደረጃዎች ያሳያል ፣ በመቀጠልም የ 3D ሞርሞጅጀንስን ማስተዋወቅ እና የእያንዳንዱ የፕሮግራም አወቃቀሮች ቁጥር ተለይቶ ይታወቃል። ቀስት. አፕሊኬሽኑ የተቋቋመው የአንጀት ኤፒተልየል ንብርብሮች እንዴት ጥቅም ላይ እንደሚውሉ ምሳሌዎችን ያቀርባል, ለምሳሌ በሴል ልዩነት ባህሪ, የአንጀት ፊዚዮሎጂ ጥናቶች, የአስተናጋጅ-ማይክሮባዮም ሥነ-ምህዳሮች መመስረት እና በሽታ አምሳያ. በ "ሴል ልዩነት" ውስጥ የኒውክሊየስ, F-actin እና MUC2 በቺፕ-2D epitheal ንብርብር ውስጥ በተገለፀው ቺፕ-2D ውስጥ የተገለጸው ኢሚውኖፍሎረሰንስ ምስሎች በጉበት ፊዚዮሎጂ ውስጥ ያሉት የፍሎረሰንት ምስሎች ለሲአሊክ አሲድ እና ለ N-acetylglucosamine ቅሪቶች በፍሎረሰንት የስንዴ ጀርም አግግሉቲኒን በመጠቀም የሚመረተውን ንፋጭ ያሳያሉ።በ"አስተናጋጅ-ማይክሮብ ኮ-ባህሎች" ውስጥ ያሉት ሁለቱ ተደራራቢ ምስሎች በቺፕ-ማይክሮብ ኮ-ባህሎች የግራ ፓነል ላይ ያለውን ተወካይ ያሳያል። አረንጓዴ ፍሎረሰንት ፕሮቲን (ጂኤፍፒ) በማይክሮ ኢንጂነሪድ 3D Caco-2 epithelial ሕዋሳት የሚገልጽ የኢ.ኮሊ አብሮ ባህል።የቀኝ ፓነል የጂኤፍፒ ኢ. ቺፖችን የፊዚዮሎጂ ፈተና በባክቴሪያ አንቲጂኖች (ለምሳሌ፣ ሊፖፖሊሳካካርዴ፣ LPS) እና የበሽታ ተከላካይ ሕዋሳት (ለምሳሌ፣ ፒቢኤምሲ፣ አረንጓዴ)። Caco-2 ህዋሶች የ3D ኤፒተልየል ንብርብር ለመመስረት ባህላቸው ተደርገዋል።ስኬል ባር፣ 50 µm። ምስሎች ከታች ረድፍ፡ “የሴሎች ልዩነት” 2 ከማጣቀሻ ፈቃድ ጋር የተስተካከለ። ኦክስፎርድ ዩኒቨርሲቲ ፕሬስ; ከማጣቀሻ.5 ፈቃድ ጋር እንደገና ተባዝቷል. NAS; "አስተናጋጅ-ማይክሮብ የጋራ ባህል" ከማጣቀሻ 3 ፈቃድ ጋር የተስተካከለ። NAS; ከማጣቀሻ ፈቃድ ጋር የተስተካከለ "በሽታ አምሳያ" 5. NAS.
ሁለቱም አንጀት-ቺፕ እና ዲቃላ ቺፕስ የተሰሩት የፒዲኤምኤስ ቅጂዎችን በመጠቀም ከሲሊኮን ሻጋታዎች በለስላሳ ሊቶግራፊ1,44 እና በ SU-8 ንድፍ ተቀርፀዋል.በእያንዳንዱ ቺፕ ውስጥ ያለው የማይክሮ ቻነሎች ንድፍ የሚወሰነው እንደ ሸለተ ውጥረት እና ሀይድሮዳይናሚክ ግፊት1,4,12.የመጀመሪያው አንጀት-ላይ-ቺፕ ዲታ ዲዛይን ያለው ሃይድሮዳይናሚክስን ግምት ውስጥ በማስገባት ነው። የተገጣጠሙ ትይዩ ቀጥ ያሉ ማይክሮ ቻነሎች፣ ወደ ውስብስብ አንጀት-አ-ቺፕ (የተራዘመ ውሂብ ምስል 1 ለ) ተለውጧል ይህም ጥንድ ጥምዝ ማይክሮ ቻነሎችን ይጨምራል ፈሳሽ የመኖሪያ ጊዜን ለመጨመር፣ ቀጥተኛ ያልሆነ ፍሰት ዘይቤዎች እና የባህላዊ ሴሎች መልቲአክሲያል መበላሸት (ምስል 2a–f) ሊመረጥ ይችላል.የተጣመረው ጉት-ቺፕ እንዲሁ የ 3D ሞርሞጅንን በተመሳሳይ የጊዜ ገደብ ውስጥ ከዋናው ጉት-ቺፕ ጋር ሲነፃፀር ተመሳሳይ የሆነ የኢፒተልያል እድገትን እንደሚያመጣ አሳይተናል ፣ ምንም እንኳን የሰለጠኑ የሕዋስ ዓይነት ምንም ይሁን ምን። መፍረስ (ምስል 2 ሀ) አንጀትን በቺፕ ላይ ለማምረት ፣ የተዘጋጀው የላይኛው የፒዲኤምኤስ ንብርብር በቅደም ተከተል ከተቦረቦረ የፒዲኤምኤስ ፊልም ጋር ተጣብቋል እና ከታችኛው የ PDMS ንብርብር ጋር በማያያዝ ኮሮና ቴራፒን በመጠቀም የማይቀለበስ ትስስር (ምስል 2b-f) ። ድብልቅ ቺፕስ ለማምረት ፣ የተዳቀሉ የ PDMS ቅጂዎች ከመስታወት ጋር ተጣምረው ከአንድ ማይክሮ ቻናል ጋር ተያይዘዋል ። ትራንስዌል ማስገቢያዎች (ምስል 2 ሰ እና የተራዘመ መረጃ ምስል 2) የማገናኘት ሂደት የሚከናወነው የፒዲኤምኤስ ቅጂ እና የመስታወት ገጽታዎችን በኦክስጅን ፕላዝማ ወይም ኮሮና ህክምና በማከም ነው.በሲሊኮን ቱቦ ላይ የተጣበቀውን ማይክሮፋብሊክ መሳሪያ ማምከን ከጀመረ በኋላ የመሳሪያው አቀማመጥ የአንጀት ኤፒተልየም 3D morphogenesis ለመስራት ዝግጁ ነበር (ምስል 2).
ሀ, የፒዲኤምኤስ ክፍሎችን ዝግጅት ከ SU-8 ስርዓተ-ጥለት የተሰሩ የሲሊኮን ሻጋታዎችን የማዘጋጀት ስዕላዊ መግለጫ ያልታከመው የፒዲኤምኤስ መፍትሄ በሲሊኮን ሻጋታ (በግራ) ላይ ፈሰሰ, በ 60 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ (መሃል) እና ወድቋል (በስተቀኝ). the PDMS porous membrane.d, የላይ እና የታችኛው የፒዲኤምኤስ ክፍሎች ተከታታይ ፎቶግራፎች እና በቺፕ ላይ የተገጣጠሙ የአንጀት እቃዎች.e, የላይኛው, ሽፋን እና የታችኛው የ PDMS ክፍሎች አሰላለፍ እቅድ.እያንዳንዱ ሽፋን በፕላዝማ ወይም በኮሮና ህክምና ሊቀለበስ በማይችል መልኩ የተሳሰረ ነው. chambers.g, Gut-on-a-chip ለማይክሮ ፍሉይዲክ ሴል ባህል ማዋቀር።የተሰራው አንጀት በቺፕ ላይ ከሲሊኮን ቱቦ እና ሲሪንጅ ጋር በተገጣጠመው ሽፋን ላይ ተቀምጧል።የቺፕ መሳሪያው ለማቀነባበር በ 150 ሚ.ሜ የፔትሪ ዲሽ ክዳን ላይ ተቀምጧል። ቺፕስ።ትራንስዌል ለብቻው ለባህል የተዘጋጀ 2D ሞኖላይየሮች የአንጀት epithelial ሴሎች ወደ ድቅል ቺፕ ውስጥ ገብተው የአንጀት 3D morphogenesis እንዲፈጠር መካከለኛው በትራንስዌል ማስገቢያ ላይ በተቋቋመው የሴል ሽፋን ስር ባለው የሴል ሽፋን ስር በማይክሮ ቻነሎች ይረጫል።ስኬል ባር፣ 1 ሴ.ሜ.ህ ከማጣቀሻ ፈቃድ ጋር እንደገና ታትሟል።4. ሌላ።
በዚህ ፕሮቶኮል ውስጥ የ Caco-2 ሕዋስ መስመር እና የአንጀት ኦርጋኖይድ እንደ ኤፒተልየል ምንጮች ጥቅም ላይ ውለዋል (ስዕል 3 ሀ) ሁለቱም የሴሎች ዓይነቶች በተናጥል ተሠርተው ነበር (ሣጥን 2 እና ሣጥን 5) እና በቺፕ አንጀት ወይም ትራንስዌል ማስገቢያዎች ውስጥ በኤሲኤም-የተሸፈኑ ማይክሮ ቻነሎችን ለመዝራት ያገለግላሉ። 10 እና 50) በቲ-flasks ውስጥ የተከፋፈሉ የሕዋስ እገዳዎችን በ trypsinization ፈሳሽ ለማዘጋጀት (ሣጥን 2) ይሰበሰባሉ የሰው አንጀት ኦርጋኖይድ ከአንጀት ባዮፕሲ ወይም የቀዶ ጥገና ሕክምናዎች በ Matrigel scaffold domes ውስጥ በ 24-well plates ውስጥ መዋቅራዊ ማይክሮ ኤንቬንሲንግ አስፈላጊ ንጥረ ነገሮችን ለመደገፍ (Wintestinal Organoids) R-spondin, and Noggin) እና በሣጥን 3 ላይ እንደተገለጸው የሚዘጋጁት የእድገት ምክንያቶች ኦርጋኖይድ እስከ ~ 500 µm ዲያሜትር እስኪያድግ ድረስ በየሁለት ቀኑ ይሞላሉ ። ሙሉ በሙሉ ያደጉ ኦርጋኖይድ ተሰብስበው ወደ አንድ ሴል ተከፋፍለው ወደ አንጀት ወይም ትራንስዌል በቺፕ (Box 5) ላይ ለመዝራት። ቀደም ብለን እንደገለጽነው በ 3 ዓይነት በሽታ ፣ ክሮኒቲስ 1 ሊለያይ ይችላል ። በሽታ፣ ኮሎሬክታል ካንሰር፣ ወይም መደበኛ ለጋሽ)፣ የቁስል ቦታ (ለምሳሌ፣ ቁስሉ ካልተጎዳው አካባቢ ጋር) እና በትራክቱ ውስጥ ያለው የጨጓራና ትራክት ቦታ (ለምሳሌ፣ duodenum፣ jejunum፣ ileum፣ cecum፣ colon፣ or rectum)።በሣጥን 5 ውስጥ ኮሎኒክ ኦርጋኖይድ (coloids) ከፍተኛ መጠን ያለው ኦርጋኖጂናል ይዘትን የሚጠይቁትን ለማዳበር የተመቻቸ ፕሮቶኮል እናቀርባለን።
a, Workflow for gut morphogenesis induction in the gut chip.Caco-2 የሰው አንጀት ኤፒተልየም እና አንጀት ኦርጋኖይድ በዚህ ፕሮቶኮል ውስጥ 3D morphogenesisን ለማሳየት ጥቅም ላይ ይውላሉ።የተለዩት ኤፒተልየል ሴሎች በተዘጋጀው የአንጀት-በቺፕ መሳሪያ (ቺፕ ዝግጅት) ውስጥ ተዘርግተዋል።በአንድ ጊዜ ህዋሶች የተዘሩ እና የተቀነጨፉ ህዋሶች ተዘርግተዋል (የታሸገው ቀንድ)። 0 (D0) ፣ የ apical (AP) ፍሰት ተጀምሯል እና ለመጀመሪያዎቹ 2 ቀናት ይቆያል (ፍሰት ፣ AP ፣ D0-D2) የባሶላተራል (BL) ፍሰት እንዲሁ የሚጀምረው ከሳይክል የመለጠጥ እንቅስቃሴዎች (ዘርጋ ፣ ፍሰት ፣ AP እና BL) ጋር የተሟላ የ 2D monolayer ሲፈጠር ነው ። የአንጀት 3D ሞርሞርጂኔሲስ ከ 5 ቀናት በኋላ ባህል ተፈጠረ። D5)።የደረጃ ንፅፅር ምስሎች በእያንዳንዱ የሙከራ ደረጃ ወይም የጊዜ ነጥብ የካኮ-2 ህዋሶችን ወካይ ሞርፎሎጂ ያሳያሉ(ባር ግራፍ፣ 100 µm)።አራት ሼማቲክ ንድፎች አንጀት ሞርሞጅጄኔሽን (ከላይ በስተ ቀኝ) ያሉትን ተዛማጅ ካስኬዶች የሚያሳዩ ናቸው።በመርሃግብሩ ውስጥ ያሉት የተሰነጠቁ ቀስቶች የፈሳሽ ፍሰት አቅጣጫን ያመለክታሉ።b፣ SEM ምስል የተመሰረተው የገጽ 3 የገጽታ የላይኛው ክፍል ነው። የተስፋፋውን ቦታ በማድመቅ (ነጭ ሰረዝ) በ 3D Caco-2 ንብርብር (በስተቀኝ) ላይ እንደገና የተሻሻለውን ማይክሮቪሊ ያሳያል.c, የተመሰረተው Caco-2 3D, claudin (ZO-1, red) እና ቀጣይነት ያለው የብሩሽ የድንበር ሽፋን F-actin (አረንጓዴ) እና ኒውክሊየስ (ሰማያዊ) የኢሚውኖፎስቲን ሴል ሴል ሴል ሴል ማዛባትን ያስከትላል. ቺፕስ። ወደ መካከለኛው ንድፍ የሚያመለክቱ ቀስቶች የፎካል አውሮፕላኑን መገኛ ለእያንዳንዱ ኮንፎካል እይታ ያመለክታሉ። መ ፣ በ 3 ፣ 7 ፣ 9 ፣ 11 እና 13 ላይ በክፍል ንፅፅር ማይክሮስኮፒ በተገኘ ቺፕ ላይ የሰለጠኑ የኦርጋኖይድ morphological ለውጦች የጊዜ ሂደት። ቁራጭ በቀን 7.f ፣ ተደራራቢ immunofluorescence ምስሎች ለስቴም ሴሎች (LGR5 ፣ magenta) ፣ የጎብልት ሴሎች (MUC2 ፣ አረንጓዴ) ፣ ኤፍ-አክቲን (ግራጫ) እና ኒዩክሊይ (ሳይያን) በአንጀት ቺፕስ ላይ ለ3 ቀናት የበቀለ ፣ እና የ13 ቀን (መካከለኛ) ኦርጋኖይድ ማድመቂያ ምስሎችን ያሳያል። ምልክት ማድረግ ያለ MUC2 ምልክት።በባህል 13 ቀን የፕላዝማ ሽፋንን በሴልማስክ ቀለም (በስተቀኝ) በመቀባት በቺፕ ላይ የተቋቋመው የ3D ኦርጋኖይድ ኤፒተልየም ኤፒተልያል ማይክሮስትራክቸር (በስተቀኝ) የሚያሳይ የፍሎረሰንት ምስሎች በባህል 13 ቀን። ሚዛን ባር 50 μm ካልሆነ በስተቀር። ኦክስፎርድ ዩኒቨርሲቲ ፕሬስ; ሐ ከማጣቀሻ ፈቃድ ጋር የተስተካከለ.2. ኦክስፎርድ ዩኒቨርሲቲ ፕሬስ; e እና f በማጣቀሻ ፈቃድ ተስተካክለዋል.12 በ Creative Commons ፍቃድ CC BY 4.0.
በቺፕ ላይ ባለው አንጀት ውስጥ የፒዲኤምኤስ ባለ ቀዳዳ ሽፋን የሃይድሮፎቢክ ገጽን በተሳካ ሁኔታ ለኤሲኤም ሽፋን መለወጥ አስፈላጊ ነው ። በዚህ ፕሮቶኮል ውስጥ የ PDMS ሽፋኖችን hydrophobicity ለመቀየር ሁለት የተለያዩ ዘዴዎችን እንጠቀማለን ። Caco-2 ሕዋሳትን ለማልማት በ UV / Ozone ሕክምና ላይ ላዩን ማንቃት ብቻ በቂ ነበር ። የ PDMS membrane.ነገር ግን, ኦርጋኖይድ ኤፒተልየም የማይክሮፍሉይዲክ ባህል የ ECM ፕሮቲኖችን ውጤታማ በሆነ መንገድ ለማስቀመጥ በኬሚካላዊ ላይ የተመሰረተ የገጽታ ተግባርን ይጠይቃል። ሴሎች ተያይዘዋል፣ የማይክሮፍሉይዲክ ሴል ባህል ሴሎቹ ሙሉ ሞኖላይየር እስኪሰሩ ድረስ መካከለኛውን ብቻ ወደ ላይኛው ማይክሮ ቻናል በመቀባት ይጀምራል፣ የታችኛው ማይክሮቻናል ደግሞ የማይለዋወጥ ሁኔታዎችን ይጠብቃል ይህ የተመቻቸ የወለል ንቃት እና የኢሲኤም ሽፋን ዘዴ የኦርጋኖይድ ኤፒተልየምን በማያያዝ በፒዲኤምኤስ ወለል ላይ የ 3D ሞርጂኔሽን እንዲፈጠር ያስችለዋል።
ትራንስዌል ባህሎች ከሴል ዘር በፊት የ ECM ሽፋን ያስፈልጋቸዋል; ይሁን እንጂ የትራንስዌል ባህሎች የተቦረቦረ ማስገቢያዎች ላይ ለማንቃት ውስብስብ የቅድመ-ህክምና እርምጃዎች አያስፈልጋቸውም.በ ትራንስዌል ማስገቢያዎች ላይ Caco-2 ህዋሶችን ለማደግ, በባለ ቀዳዳ ማስገቢያዎች ላይ የ ECM ሽፋን የተበታተኑ Caco-2 ሴሎችን (<1 ሰዓት) እና ጥብቅ የመገናኛ ማገጃ መፈጠርን ያፋጥናል (<1-2 ቀናት) . የገለባው ገጽ (<3 ሰ) እና ኦርጋኖይድስ ሙሉ ለሙሉ ሞኖላይየር እስኪያቋቋም ድረስ ተጠብቆ ይቆያል።
In vitro 3D morphogenesis በተቋቋመው ኤፒተልየል ንብርብር ወደ ባሶላተራል ገጽታ የፈሳሽ ፍሰትን በመተግበር ሊጀመር ይችላል።በቺፕ ላይ ባለው አንጀት ውስጥ ኤፒተልያል ሞርሞጅጄኔሽን መካከለኛው የላይኛው እና የታችኛው ማይክሮ ቻነሎች ውስጥ ሲገባ (ምስል 3 ሀ) ተጀመረ። ቀደም ሲል እንደተገለፀው በታችኛው ክፍል ውስጥ የፈሳሽ ፍሰትን ማስተዋወቅ አስፈላጊ ነው (በሚስጥራዊ ክፍል ውስጥ ቀጣይነት ያለው መወገድ)። በቂ ንጥረ ነገሮችን እና የሴረም ሽፋን በተቦረቦረ ሽፋን ላይ ለታሰሩ ህዋሶች መስጠት እና የብርሃን ሸለቆ ጭንቀትን ያመነጫል ፣በተለምዶ በቺፕ ላይ በአንጀት ውስጥ ድርብ ፍሰትን እንጠቀማለን ።በተዳቀለ ቺፕስ ውስጥ ፣ ትራንስዌል ማስገቢያዎች ኤፒተልያል ሞኖላይተሮችን የያዙ ወደ ድቅል ቺፕስ ውስጥ ገብተዋል ።ከዚያም መካከለኛው በማይክሮ ቻናል 5 ቀናት ውስጥ ከተፈጠረው ባለ ቀዳዳ ትራንስዌል ማስገባቱ ባሶላተራል በኩል ተተግብሯል። በሁለቱም የባህል መድረኮች ውስጥ ፍሰት.
የማይክሮኢንጂነሪድ 3 ዲ ኤፒተልያል ንብርብሮችን ሞርሞሎጂያዊ ገፅታዎች የተለያዩ የምስል ዘዴዎችን በመተግበር ሊተነተን ይችላል ፣ ይህም የክፍል ንፅፅር ማይክሮስኮፒ ፣ ልዩነት ጣልቃ-ገብ ንፅፅር (DIC) ማይክሮስኮፒ ፣ ሴኤም ፣ ወይም immunofluorescence confocal microscopy (ምስል 3 እና 4) ። የደረጃ ንፅፅር ወይም የዲአይሲ ምስል በማንኛውም ጊዜ የቅርጽ ንፅፅርን እና የፕሮቲሊዲ ምስልን በቀላሉ ማከናወን ይቻላል ። layers.በፒዲኤምኤስ እና ፖሊስተር ፊልሞች የጨረር ግልጽነት ምክንያት ሁለቱም የ gut-on-a-chip እና hybrid chip platforms የመሳሪያውን ክፍል ወይም መበታተን ሳያስፈልግ በእውነተኛ ጊዜ በቦታው ላይ ምስልን ሊሰጡ ይችላሉ. (PFA)፣ በመቀጠል ትሪቶን X-100 እና 2% (wt/vol)) ቦቪን ሴረም አልቡሚን (BSA) በቅደም ተከተል። እንደ ሴል አይነት፣ የተለያዩ መጠገኛዎች፣ ፐርሜኤቢሊዘር እና የማገጃ ኤጀንቶች ጥቅም ላይ ሊውሉ ይችላሉ። በዘር-ጥገኛ ሴል ወይም የክልል ማርከሮች ላይ ያነጣጠሩ ዋና ፀረ እንግዳ አካላትን ለማድመቅ ጥቅም ላይ ይውላሉ። (ለምሳሌ, 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) ወይም F-actin (ለምሳሌ, fluorescently labeled phalloidin) .Fluorescence-based live imaging በተጨማሪም የንፋጭ ምርትን ለመለየት በቦታው ሊከናወን ይችላል (ምስል 1, "የሴል ልዩነት" እና "Gut ፊዚዮሎጂ"), የዘፈቀደ ሴሎች ቅኝ ግዛት (ማይክሮ ባዮሎጂያዊ ምስል). አብሮ ባህል”)፣ የበሽታ ተከላካይ ሕዋሳትን መመልመል (ምስል 1 ፣ “በሽታ አምሳያ”) ወይም የ 3 ዲ ኤፒተልያል ሞርፎሎጂ ቅርጾች (ምስል 3c ፣ f እና 4b ፣c) . በቺፑ ላይ ያለውን አንጀት ሲቀይሩ የላይኛውን ሽፋን ከታችኛው ማይክሮ ቻናል ንብርብር ለመለየት ፣ በማመሳከሪያው ላይ እንደተገለጸው ፣ በምስል 2 ላይ እንደሚታየው በጥሩ ምስል 3 ማይክሮ ሞርፍ. በአፕቲካል ብሩሽ ድንበር ላይ በ SEM (ምስል 3 ለ) ሊታዩ ይችላሉ.የልዩነት ጠቋሚዎች አገላለጽ በቁጥር PCR5 ወይም ባለ አንድ-ሴል አር ኤን ኤ ቅደም ተከተል በመተግበር ሊገመገም ይችላል.በዚህ ሁኔታ, በ gut chips ወይም hybrid chips ውስጥ የሚበቅሉ የ 3D ንጣፎች ኤፒተልየል ሴሎች በ trypsinization ይሰበሰባሉ ከዚያም ለጄኔቲክ ወይም ለመተንተን ጥቅም ላይ ይውላሉ.
a, የስራ ፍሰት በዲቃላ ቺፕ ውስጥ የአንጀት ሞርሞጅንን ለማነሳሳት.Caco-2 እና intestinal organoids በዚህ ፕሮቶኮል ውስጥ የ 3D morphogenesis በ hybrid chip platform ውስጥ ለማሳየት ጥቅም ላይ ይውላሉ.የተከፋፈሉ ኤፒተልየል ሴሎች በተዘጋጁ ትራንስዌል ማስገቢያዎች (TW prep; ከዚህ በታች ያለውን ምስል ይመልከቱ) በአንድ ጊዜ ሴሎች ተዘርተዋል እና በ polyeeded ሴሎች ውስጥ ተያይዘዋል. በስታቲስቲክስ ሁኔታዎች (TW cultured) .ከ 7 ቀናት በኋላ የ 2D monolayer epithelial ሴሎችን የያዘ አንድ ነጠላ ትራንስዌል አስገባ ወደ ባሶላተራል ፍሰት (ፍሰት ፣ BL) ለማስተዋወቅ ወደ ድቅል ቺፕ ውስጥ ገባ ይህም በመጨረሻ የ 3D epithelial Layer (morphogenesis) እንዲፈጠር ምክንያት ሆኗል ። የደረጃ ንፅፅር ማይክሮግራፍ የዶን ሴል ሴል 3 መደበኛ ንፅፅር ማይክሮግራፎች ከዶን ሴል ኤፒሪዲዲንግ 1 የሰው አካል morphological ባህሪያትን ያሳያል ። ኮሎን በእያንዳንዱ የሙከራ ደረጃ ወይም የጊዜ ነጥብ ላይ።በላይኛው ንብርብሩ ውስጥ ያሉት ቀመሮች ለእያንዳንዱ እርምጃ የሙከራ ውቅርን ያሳያሉ።b, Hybrid chips (የግራ ንድፍ) የኦርጋኖይድ ኤፒተልየል ሴሎችን ወደ 3D morphogenesis ሊያመራ ይችላል ከላይ ወደ ታች ኮንፎካል ማይክሮስኮፒ እይታዎች በተለያዩ የ Z አቀማመጥ (የላይኛው፣ መካከለኛ እና ዝቅተኛ፣ የቀኝ የተደረደሩ መስመሮችን እና ተዛማጅ ንድፎችን ይመልከቱ)። ግልጽ የሞርሞሎጂ ባህሪያትን አሳይቷል.F-actin (ሳይያን), ኒውክሊየስ (ግራጫ)).c, Fluorescence confocal micrographs (3D angled view) ከኦርጋኖይድ የተገኙ ኤፒተልየል ሴሎች በስታቲክ ትራንስዌል (TW; inset in white dashed box) versus hybrid chip (ትልቅ ሙሉ ሾት) በአክብሮት 2D 2D ቨርሰስን በማወዳደር የተቆራረጡ እይታዎች (ከላይኛው ቀኝ ጥግ ላይ የተጫነ፣ “XZ”) እንዲሁም 2D እና 3D ባህሪያትን ያሳያሉ።መጠን ባር፣ 100 µm.c በማጣቀሻ ፈቃድ እንደገና ታትሟል።4. ሌላ።
ተመሳሳይ ሴሎችን (Caco-2 ወይም intestinal organoid epithelial cells) ወደ ባለ ሁለት ገጽታ ሞኖላይየሮች በባህላዊ የማይንቀሳቀስ ባህል በማዳበር ቁጥጥር ሊደረግ ይችላል።በተለይ፣ የንጥረ-ምግብ መሟጠጥ በማይክሮ ቻነሎች የመጠን አቅም ውስንነት (ማለትም ~ 4 µL በዋናው ቻናል ከዋናው አንጀት-ቺፕ ፋየር ፎረም ዲዛይን በፊት)። ፍሰት እንዲሁ ሊወዳደር ይችላል።
ለስላሳ የሊቶግራፊ ሂደት በንፁህ ክፍል ውስጥ መከናወን አለበት ። በቺፕ (የላይኛው እና የታችኛው ሽፋን እና ሽፋን) እና ዲቃላ ቺፕስ ላይ ላለው እያንዳንዱ ሽፋን ፣ የማይክሮ ቻነሎች ቁመት የተለየ ስለነበረ የተለያዩ የፎቶ ጭምብሎች ጥቅም ላይ ውለው እና በተለዩ የሲሊኮን ዋይፎች ላይ ተሠርተው ነበር። ድብልቅ ቺፕ 200 µm ነው።
ባለ 3-ኢንች የሲሊኮን ዋይፋር በድስት ውስጥ ከአሴቶን ጋር ያስቀምጡ። ሳህኑን ለ 30 ሰከንድ በቀስታ አዙረው፣ ከዚያም ቫፈርን አየር ያድርቁት።
የፒራንሃ መፍትሄ (የሃይድሮጂን ፓርሞክሳይድ ድብልቅ እና የተከማቸ ሰልፈሪክ አሲድ፣ 1፡3 (ቮል/ቮል)) እንደ አማራጭ የኦርጋኒክ ቅሪቶችን ከሲሊኮን ዋፈር ወለል ላይ ለማስወገድ ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል።
የፒራንሃ መፍትሄ እጅግ በጣም የሚበላሽ እና ሙቀትን ያመነጫል.ተጨማሪ የደህንነት ጥንቃቄዎች አስፈላጊ ናቸው.ለቆሻሻ አወጋገድ, መፍትሄው እንዲቀዘቅዝ እና ወደ ንጹህና ደረቅ ቆሻሻ ማጠራቀሚያ እንዲሸጋገር ይፍቀዱ. ሁለተኛ ደረጃ መያዣዎችን ይጠቀሙ እና የቆሻሻ ማጠራቀሚያዎችን በትክክል ይለጥፉ.እባክዎ ለተጨማሪ ዝርዝር ሂደቶች የተቋሙን የደህንነት መመሪያዎች ይከተሉ.
በ 200 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ለ 10 ደቂቃዎች በጋለ ምድጃ ላይ በማስቀመጥ ቫፈርን ያድርቁ.ከድርቀት በኋላ, ቫውሩ ለማቀዝቀዝ አምስት ጊዜ በአየር ውስጥ ይንቀጠቀጣል.
~ 10 ግራም የፎቶሪስቲስት SU-8 2100 በተጸዳው የሲሊኮን ዋፈር መሃከል ላይ አፍስሱ። ፎቶሪሲስቱን በቫፈር ላይ በደንብ ለማሰራጨት ሹራብ ይጠቀሙ።አልፎ አልፎ ቫፈርን በ65 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ በሙቀት ሰሃን ላይ በማድረግ ፎተሪሲስቱ እንዳይጣበቅ እና በቀላሉ እንዲሰራጭ ያድርጉ። ዋፋውን በቀጥታ በጋለ ሳህን ላይ አያስቀምጡ።
SU-8 የስፒን ሽፋንን በማስኬድ በዋፈር ላይ በእኩል መጠን ተሰራጭቷል።ፕሮግራም የ SU-8 መጪ ሽክርክር ለ5-10 ሰከንድ በ500 ደቂቃ በሰከንድ ፍጥነት። በቺፑ ላይ ላለው የአንጀት የላይኛው ሽፋን µm ቁመት፤ከዚህ በታች ያለውን “ወሳኝ እርምጃዎችን” ተመልከት) በ300 ሩብ ደቂቃ 30 ሰከንድ በ1,200 ደቂቃ ፍጥነት።
ዋናው የማሽከርከር ፍጥነት በሲሊኮን ዋፈር ላይ ባለው የ SU-8 ንድፍ በታለመው ውፍረት መሰረት ሊስተካከል ይችላል.
በቺፑ ላይ ላለው አንጀት የላይኛው ሽፋን 500µm ቁመት ያለው የ SU-8 ንድፎችን ለመሥራት የስፒን ሽፋን እና ለስላሳ የመጋገሪያ ደረጃዎች (ደረጃ 7 እና 8) በቅደም ተከተል ተደጋግመዋል (ደረጃ 9 ይመልከቱ) 250 µm ውፍረት ያለው SU-8 250 µm ውፍረት ያለው የ SU-8 ንብርብር፣ ይህም በደረጃ 10 0 ሜትር መጋለጥ በደረጃ UV ከፍተኛ.
ለስላሳ በ SU-8 የተሸፈኑ ቫፈርዎችን በሙቀት ላይ በ 65 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ለ 5 ደቂቃዎች በጥንቃቄ በመጋገር, ከዚያም ቅንብሩን ወደ 95 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ይቀይሩ እና ለ 40 ደቂቃዎች ይጨምሩ.
በላይኛው ማይክሮ ቻናል ውስጥ ያለውን የ SU-8 ንድፍ 500 μm ቁመት ለማግኘት፣ ደረጃ 7 እና 8ን በመድገም ሁለት 250 μm ውፍረት SU-8 ንብርብሮችን ለመፍጠር።
የ UV Mask Aligner ን በመጠቀም የዋፋውን የተጋላጭነት ጊዜ ለማስላት በአምራቹ መመሪያ መሰረት የመብራት ሙከራ ያካሂዱ።
የተጋላጭነት ጊዜን ከወሰኑ በኋላ, የፎቶ ጭምብል በ UV ጭንብል aligner ጭምብል መያዣ ላይ ያስቀምጡ እና የፎቶ ጭምብሉን በ SU-8 የተሸፈነ ቫፈር ላይ ያስቀምጡት.
የ UV ስርጭትን ለመቀነስ የፎቶ ጭምብልን በቀጥታ በ SU-8 በተሸፈነው የሲሊኮን ዋፈር ጎን ላይ ያድርጉት።
SU-8 የተሸፈነውን ዋፈር እና የፎቶ ጭምብል በአቀባዊ ወደ 260 ሜጄ/ሴሜ 2 UV ብርሃን ለተወሰነው የተጋላጭነት ጊዜ ያቅርቡ (የዚህን ሳጥን ደረጃ 10 ይመልከቱ)።
ከአልትራቫዮሌት ተጋላጭነት በኋላ SU-8-የተሸፈኑ የሲሊኮን ማሰሪያዎች በ 65 ° ሴ ለ 5 ደቂቃ እና በ 95 ° ሴ ለ 15 ደቂቃዎች በእያንዳንዱ ሙቅ ሳህን ላይ በ 200 μm ከፍታ ያላቸው ንድፎችን ለመሥራት ይጋገራሉ.ከመጋገሪያው ጊዜ በኋላ በ 95 ° ሴ እስከ 30 ደቂቃዎች በ 500 ሴ.ሜ ከፍታ ያላቸው ንድፎችን ለመሥራት.
ገንቢው ወደ መስታወት ሳህን ውስጥ ይፈስሳል፣ እና የተጋገረውን ዋይፋር ወደ ሳህኑ ውስጥ ይቀመጣል።የ SU-8 ገንቢው መጠን እንደ መስታወት ሳህን መጠን ሊለያይ ይችላል።ያልታወቀ SU-8ን ሙሉ በሙሉ ለማስወገድ በቂ SU-8 ገንቢ መጠቀሙን ያረጋግጡ።ለምሳሌ በ 1 ኤል አቅም ያለው 150 ሚሜ ዲያሜትር ያለው የመስታወት ሳህን ሲጠቀሙ ~ 300 ሚሊ ሊትር SUlop 2 ገንቢውን አልፎ አልፎ ይጠቀሙ።
የተፈጠረውን ሻጋታ በ ~ 10 ሚሊር ትኩስ ገንቢ ከዚያም አይፒኤ በመቀጠል መፍትሄውን በ pipette በመርጨት ያጠቡ።
ቫፈርን በፕላዝማ ማጽጃ ውስጥ ያስቀምጡ እና ለኦክሲጅን ፕላዝማ (የከባቢ አየር ጋዝ, የታለመ ግፊት 1 × 10-5 ቶር, ኃይል 125 ዋ) ለ 1.5 ደቂቃዎች ያጋልጡ.
ቫክዩም ማድረቂያውን በቫኪዩም ማድረቂያ ውስጥ ያስቀምጡት ከመስታወት ስላይድ ጋር ዋይፋዎች እና ስላይዶች ጎን ለጎን ሊቀመጡ ይችላሉ.የቫኩም ማድረቂያው በበርካታ ንጣፎች በፕላስቲን ከተከፈለ, ተንሸራቶቹን ወደ ታችኛው ክፍል ውስጥ እና ቫፈርን በላይኛው ክፍል ውስጥ ያስቀምጡ.100 μL trichloro (1H, 1H, 2Hroo)Hrooctane glass 2H,Slidely solution , ለ silanization vacuum.
የቀዘቀዙ የካኮ-2 ህዋሶችን ብልቃጥ በ37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ የውሃ መታጠቢያ ውስጥ ይቀልጡ ፣ ከዚያ የቀለጠጡትን ህዋሶች ወደ T75 ብልቃጥ 15 ሚሊ ሊት 37°ሴ ቀድሞ የሞቀ Caco-2 መካከለኛ ያስተላልፉ።
Caco-2 ህዋሶችን በ ~90% ውዥንብር ለማለፍ በመጀመሪያ ሙቅ Caco-2 መካከለኛ፣ PBS እና 0.25% trypsin/1 mM EDTA በ 37°C የውሃ መታጠቢያ።
መካከለኛውን በቫኩም ምኞት ይመኙ።የቫክዩም ምኞትን በመድገም እና አዲስ ፒቢኤስን በመጨመር ሴሎችን በ 5 ሚሊር ሙቅ PBS ሁለት ጊዜ ያጠቡ።