Nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን፡ እየተጠቀሙበት ያለው የአሳሽ ስሪት ለሲኤስኤስ የተገደበ ድጋፍ አለው። ለምርጥ ተሞክሮ የተሻሻለ አሳሽ (ወይም የተኳኋኝነት ሁነታን በInternet Explorer ውስጥ እንዲያጠፉት እንመክራለን) እስከዚያው ድረስ ቀጣይ ድጋፍን ለማረጋገጥ ጣቢያውን ያለ ቅጦች እና ጃቫስክሪፕት እናሳያለን።
የሰው አንጀት morphogenesis የ 3D epithelial microarchitecture እና የቦታ አደረጃጀት ክሪፕት-ቪለስ ባህሪያትን ያቋቁማል።ይህ ልዩ መዋቅር በባሳል ክሪፕት ውስጥ የሚገኘውን የስቴም ሴል ኒቼን በባሳል ክሪፕት ውስጥ የሚገኘውን ስቴም ሴል ኒሼን ከውጭ ከሚገኙ ረቂቅ ተህዋሲያን አንቲጂኖች እና ሜታቦሊተኖቻቸው ​​በመጠበቅ አንጀት homeostasisን ለመጠበቅ ይህ ልዩ መዋቅር ያስፈልጋል። ስለዚህ የ3-ል ኤፒተልየል አወቃቀሮችን እንደገና መፍጠር በብልቃጥ አንጀት ውስጥ ያሉ ሞዴሎችን ለመገንባት ወሳኝ ነው።በተለይ፣ ኦርጋኒክ ሚሚቲክ ጉት-ላይ-ቺፕ ድንገተኛ 3D morphogenesis የአንጀት ኤፒተልየም በተሻሻሉ የፊዚዮሎጂ ተግባራት እና ባዮሜካኒክስ ላይ እንዲፈጠር ያደርጋል።እዚህ ላይ ሮስትቦልሞርፊይልን በሮስትፍላትላይትላይትስ ብልትን በሮስትፍላትል ጅረት ጅረት ጅረት እንዲፈጠር ያደርጋል። ዲክ ቺፕ እንዲሁም በትራንስዌል የተከተተ ድብልቅ ቺፕ ላይ በዝርዝር እንገልፃለን መሳሪያን ለማምረት ፣ Caco-2 ወይም Intestinal Organoid epithelial ሴሎችን በባህላዊ መቼቶች እንዲሁም በማይክሮፍሉይዲክ መድረክ ላይ ፣ የ 3 ዲ ሞርጀኔሲስን ማነሳሳት እና የ 3D ኤፒተሊያን መመስረት እና የ 3D ኤፒተሊያንን በርካታ የምስል ዘዴዎችን በመጠቀም የድጋሚ ሂደትን በመጠቀም የፈሳሽ መቆጣጠሪያ ዘዴዎችን ያሳያል ። ፍሰት ለ 5 d.የእኛ ኢን ቪትሮ ሞርጅጀንስ ዘዴ ፊዚዮሎጂያዊ ተዛማጅ ሸለተ ውጥረትን እና ሜካኒካል እንቅስቃሴን ይጠቀማል እና ውስብስብ የሕዋስ ኢንጂነሪንግ ወይም መጠቀሚያ አያስፈልገውም ይህም ከሌሎች ነባር ቴክኒኮች የላቀ ሊሆን ይችላል።የእኛ የታቀደው ፕሮቶኮል ለባዮሜዲካል ምርምር ማህበረሰብ ሰፊ አንድምታ ሊኖረው እንደሚችል እናስባለን ፣ይህም 3D አንጀትን ለማደስ የሚያስችል ዘዴን ይሰጣል ፣በቪትሮማ ክሊኒካዊ ክሊኒካዊ ሽፋን ላይ።
ሙከራዎች እንደሚያሳዩት የአንጀት epithelial Caco-2 ሕዋሳት በ Gut-on-a-chip1,2,3,4,5 ወይም bilayer microfluidic devices6,7 ድንገተኛ የ 3D ሞርሞጅጀንስ በብልቃጥ ውስጥ ሊታከሙ ይችላሉ። በካኮ-2 እና በትዕግስት የተገኘ አንጀት ኦርጋኖይድ የታየውን በብልቃጥ ውስጥ morphogenesis.ኤፒተልያል ህዋሶች ተረጋግጠዋል።በዚህ ጥናት በተለይ ሃይለኛው የWnt ባላጋራ ዲክኮፕፍ-1 (DKK-1) በ gut-on-a-chip ውስጥ እና ትራንስዌል ማስገባቶችን የያዙ የተሻሻሉ ማይክሮፍሉይዲክ መሳሪያዎች፣ “ድብልቅ ቺፕ” በመባል የሚታወቁትን የWnt ተቃዋሚዎች፣ ከ Wnt ተቃዋሚዎች ጋር የተዛመዱ KKs. , ወይም Soggy-1) ወደ ላይ-ቺፕ አንጀት morphogenesisን ይከለክላል ወይም አስቀድሞ የተዋቀረውን የ 3 ዲ ኤፒተልያል ንብርብር ይረብሸዋል ፣ ይህም በባህል ወቅት ተቃራኒ ውጥረት በብልቃጥ ውስጥ ለአንጀት ሞርሞጅጄኔስ ተጠያቂ እንደሆነ ይጠቁማል። -ኦን-ቺፕ ወይም ድቅል-ላይ-ቺፕ መድረኮች) ወይም ስርጭት .Basolateral media (ለምሳሌ ከTranswell ወደ ትላልቅ የባሶላተራል ማጠራቀሚያ ጉድጓዶች ውስጥ ማስገባት)።
በዚህ ፕሮቶኮል ውስጥ አንጀት-ላይ-ቺፕ ማይክሮዲቪስ እና ትራንስዌል-ማስገባት ድቅል ቺፕስ (ደረጃ 1-5) ወደ ባህል የአንጀት epithelial ሕዋሳት በ polydimethylsiloxane (PDMS) -የተመሰረቱ ባለ ቀዳዳ ሽፋኖች (ደረጃዎች 6A ፣ 7A ፣ 8 ፣ 9) ወይም ትራንስዌል እና ሜምፕላስ 8 ቢቢ 7 3D morphogenesis in vitro (ደረጃ 10) አነሳስተናል።እንዲሁም በቲሹ-ተኮር ሂስቶጄኔሲስ እና የዘር-ጥገኛ ሴሉላር ልዩነትን የሚያሳዩ ሴሉላር እና ሞለኪውላዊ ባህሪያትን ለይተናል ብዙ የምስል ዘዴዎችን (ደረጃ 11-24) በመተግበር የሰው አንጀት ኤፒተልየል ሴሎችን በመጠቀም ሞርሞጅንን እናነሳሳለን፣ እንደ ካኮ-2 ሜምብራል ፎርማት ኦርጋን ውስጥ ያሉ ቴክኒካዊ የገጽታ አካላትን ጨምሮ። የ 2D monolayers ፣ እና የአንጀት ባዮኬሚካላዊ እና የባዮሜካኒካል ማይክሮ ኤንቪሮን መባዛት በብልቃጥ ውስጥ ። 3D ሞርፎጅን ከ 2D epithelial monolayers ለማነሳሳት ፣ መካከለኛውን ወደ ባህሉ የታችኛው ክፍል በማፍሰስ በሁለቱም የባህላዊ ቅርጾች ውስጥ የሞርሞጅን ባላጋራዎችን እናስወግዳለን ። morphogen-dependent epithelial growth, longitudinal host-microbiome co-cultures, pathogen infections, inflammatory ጉዳት, epithelial barrier dysfunction, እና probiotic-based therapies Example.influences.
የእኛ ፕሮቶኮል በመሠረታዊ ደረጃ (ለምሳሌ ፣ የአንጀት mucosal ባዮሎጂ ፣ ስቴም ሴል ባዮሎጂ እና የእድገት ባዮሎጂ) እና ተግባራዊ ምርምር (ለምሳሌ ፣ ቅድመ ክሊኒካል መድሐኒት ምርመራ ፣ የበሽታ አምሳያ ፣ የቲሹ ኢንጂነሪንግ እና የጨጓራ ​​​​ኢንጂነሪንግ) ሰፊ ተፅእኖ ውስጥ ለብዙ ሳይንቲስቶች ጠቃሚ ሊሆን ይችላል ። ስትራቴጂ በአንጀት እድገት ፣ በተሃድሶ ወይም በሆምስታሲስ ወቅት የሕዋስ ምልክቶችን ተለዋዋጭነት ለሚማሩ ታዳሚዎች ማሰራጨት ይቻላል ። በተጨማሪም የእኛ ፕሮቶኮል በተለያዩ ተላላፊ ወኪሎች እንደ ኖሮቫይረስ 8 ፣ ከባድ አጣዳፊ የመተንፈሻ አካላት ሲንድሮም ኮሮናቫይረስ 2 (SARS-CoV-2) ፣ ክሎስትሪየም ዲፊፊሊየም ታይሮይድየበሽታ ፓቶሎጂ እና በሽታ አምጪ ተህዋሲያን ታዳሚዎችም ጠቃሚ ናቸው በቺፕ ጉት ማይክሮ ፊዚዮሎጂ ሥርዓት መጠቀም ቁመታዊ አብሮ ባህል 10 እና ተከታይ የአስተናጋጅ መከላከያ ግምገማ, የበሽታ መከላከያ ምላሾች እና በሽታ አምጪ ተህዋስያን በጨጓራና ትራክት (GI) ትራክት ውስጥ በሽታ አምጪ ተህዋስያንን ለመጠገን መፍቀድ ይችላል 3D የአንጀት epithelial ንብርብሮች የታካሚውን 3D የአንጀት epithelial ሽፋኖችን በመጠቀም ይዘጋጃሉ ፣ እነዚህ በሽታዎች ቫይሊየስ እየመነመኑ ፣ ክሪፕት ማሳጠር ፣ የ mucosal ጉዳት ፣ ወይም የተዳከመ ኤፒተልያል መሰናክል ያካትታሉ። ባዮፕሲ ወይም ከስቴም ሴል የተገኘ የአንጀት ኦርጋኖይድ የኑክሌር ሴሎች (PBMCs)፣ 3D intestinal villus-crypt microarchitectures ለያዙ ሞዴሎች።ቲሹ-ተኮር የበሽታ ተከላካይ ሕዋሳት ፣ 5.
3D epithelial microstructure ያለ ክፍፍሉ ሂደት ሊስተካከል እና ሊታየው ስለሚችል፣በቦታ ትራንስክሪፕቶሚክስ ላይ የሚሰሩ ተመልካቾች እና ከፍተኛ ጥራት ያለው ወይም እጅግ በጣም ጥራት ያለው ኢሜጂንግ ላይ የሚሰሩ ተመልካቾች የጂኖች እና ፕሮቲኖች የስፔዮቴምፖራል ዳይናሚክስ ኤፒተልያል ጉድጓዶች ላይ የእኛን ካርታ ሊፈልጉ ይችላሉ።ለቴክኖሎጂ ፍላጎት ያለው።ለማይክሮባዮል ወይም ለበሽታ መከላከያ ማነቃቂያዎች የተሰጠ ምላሽ።ከዚህም በተጨማሪ አንጀት ሆሞስታሲስን የሚያስተባብር የረጅም ጊዜ አስተናጋጅ-ማይክሮባዮም 10፣ 14 ​​በ 3D የአንጀት mucosal ሽፋን ውስጥ የተለያዩ የማይክሮቢያል ዝርያዎችን፣ ማይክሮቢያል ማህበረሰቦችን ወይም ፌካል ማይክሮባዮታ- በተለይም ጉትቻኦታ- ውስጥ በማልማት ሊቋቋም ይችላል።በመድረኩ ላይ ይህ አቀራረብ በተለይ የ mucosal immunology ፣gastroenterology ፣ Human microbiome ፣ culturomics እና ክሊኒካል ማይክሮባዮሎጂ በላብራቶሪ ውስጥ ለማዳበር ለሚፈልጉ ተመልካቾች ማራኪ ነው። ፕሮቶኮሉ ለምግብ ኢንዱስትሪ ፋርማሲዩቲካል፣ ባዮሜዲካል ወይም ከፍተኛ የፍተሻ ወይም የማረጋገጫ መድረኮችን በማደግ ላይ ላሉት ሊሰራጭ ይችላል።እንደ ማረጋገጫ-መርህ፣በቅርቡ የባለብዙክስ ከፍተኛ-የሞርሞጅጀንሲስ ሲስተም ወደ 24-በደንብ ፕላስቲን ሊሰፋ የሚችል፣16 የተደራጁ ምርቶች፣1-በተጨማሪ የንግድ ሥራ ተዘጋጅተዋል። የኛን የ in vitro morphogenesis ዘዴ ማፋጠን ይቻላል እና በብዙ የምርምር ላቦራቶሪዎች ፣ኢንዱስትሪ ወይም የመንግስት እና የቁጥጥር ኤጀንሲዎች የተንቀሳቃሽ ስልክ ድጋሚ መርሃ ግብር በብልቃጥ አንጀት ሞርሞጅጀንስን በፅሁፍ ደረጃ ለመረዳት መድሀኒቶችን ወይም ባዮቴራፒቲኮችን ለመምጠጥ እና ለማጓጓዝ የተገመገመው በ 3D ጓት ተተኪዎች ወይም ኦርጋኒክ ወይም ብጁ ፕሮጄኔሽን በመጠቀም ነው። ሂደት.
የተወሰኑ የሰው አግባብነት ያላቸው የሙከራ ሞዴሎች የአንጀትን ኤፒተልያል ሞርጅጄኔሽን ለማጥናት ጥቅም ላይ ውለዋል፣ በተለይም የ 3D morphogenesis በብልቃጥ ውስጥ ለማነሳሳት ሊተገበሩ የሚችሉ ፕሮቶኮሎች ባለመኖራቸው።በእርግጥ ስለ አንጀት ሞርሞጅጄኔስ አብዛኛው እውቀት በእንስሳት ጥናት ላይ የተመሰረተ ነው (ለምሳሌ ዚብራፊሽ20፣ አይጥ 21 ወይም ዶሮ 22) ምን ያህል ዋጋ ቢያስከፍሉም ይችላሉ ፣ እና ምን ያህል ዋጋ ቢስ ሊሆን ይችላል ። የሰውን ልጅ እድገት ሂደት በትክክል ይወስኑ።እነዚህ ሞዴሎችም በብዙ መንገድ ሊሰፋ በሚችል መልኩ ለመፈተሽ አቅማቸው በጣም የተገደበ ነው።ስለዚህ የ3D ቲሹ አወቃቀሮችን በብልቃጥ ውስጥ የማደስ ፕሮቶኮላችን ከ vivo የእንስሳት ሞዴሎች እንዲሁም ከሌሎች ባህላዊ የማይንቀሳቀስ 2D ሴል ባህል ሞዴሎች ቀደም ሲል እንደተገለፀው 3D epithelial ን በመጠቀም የተለያዩ ህዋሶችን እንድንመረምር ተፈቅዶልናል። የተለያዩ የ mucosal ወይም immunostimuli.3D epithelial layers ለማጥናት ክፍተት ሊሰጡ ይችላሉ ማይክሮቢያል ህዋሶች እንዴት እንደሚወዳደሩ ለማጥናት የስፔሻል ኒቸስ እና የስነምህዳር ዝግመተ ለውጥ ለአስተናጋጅ ሁኔታዎች ምላሽ ለመስጠት (ለምሳሌ ከውስጥ ከውጨኛው ንፋጭ ሽፋን፣ የ IgA ሚስጥር እና ፀረ-ተህዋሲያን peptides)። በተጨማሪም፣ 3D epithelial morphology እንዴት ማይክሮባዮሎጂ ማህበረሰቦችን እንድንረዳ እና ማይክሮባዮሎጂ እንዲኖረን ያደርጋል። በ basal crypts ውስጥ ሴሉላር አደረጃጀትን እና የስቴም ሴል ኒቼን የሚቀርፁ ሜታቦላይቶች (ለምሳሌ አጭር ሰንሰለት ፋቲ አሲድ) እነዚህ ባህሪያት ሊታዩ የሚችሉት 3D epithelial layers በብልቃጥ ውስጥ ሲመሰረቱ ብቻ ነው።
የ 3D የአንጀት epithelial አወቃቀሮችን ከመፍጠር ዘዴያችን በተጨማሪ በብልቃጥ ውስጥ በርካታ ዘዴዎች አሉ የአንጀት ኦርጋኖይድ ባህል በጣም ዘመናዊ የሆነ የቲሹ ምህንድስና ዘዴ ነው የአንጀት ግንድ ሴሎችን በማልማት ላይ የተመሰረተ ልዩ ሞርፎጅን ሁኔታዎች23,24,25. ነገር ግን የ 3D ኦርጋኖይድ አስተናጋጅ-ሞዴሎችን ለትራንስፖርት ትንታኔዎች ወይም ለመጓጓዣዎች ብዙውን ጊዜ የሉቲሞሚክ ሞዴሎችን መጠቀም ነው. በኦርጋኖይድ ውስጥ ተዘግቷል, እና ስለዚህ, እንደ ማይክሮቢያል ሴሎች ወይም ውጫዊ አንቲጂኖች ያሉ የብርሃን ክፍሎችን ማስተዋወቅ ውስን ነው.ወደ ኦርጋኖይድ lumens መድረስ በማይክሮኢንጀክተር በመጠቀም ሊሻሻል ይችላል,26,27 ነገር ግን ይህ ዘዴ ወራሪ እና ጉልበት የሚጠይቅ እና ለማከናወን ልዩ እውቀትን ይጠይቃል.ከዚህም በተጨማሪ በሃይሮጅል ስካፎልዶች ውስጥ በስታቲስቲክስ ሁኔታዎች ውስጥ የተጠበቁ ባህላዊ የኦርጋኖይድ ባህሎች በቪቮ ባዮሜካኒክስ ውስጥ በትክክል አይንጸባረቁም.
በበርካታ የምርምር ቡድኖች የተቀጠሩ ሌሎች አካሄዶች አንጀት ኤፒተልያል መዋቅርን ለመምሰል ቀድሞ የተዋቀሩ የ3D ሀይድሮጅል ስካፎልዶችን በመጠቀም የተለዩ የሰው አንጀት ሴሎችን በጄል ወለል ላይ በማልማት። ቅልጥፍናዎች፣ ከፍተኛ ገጽታ ያለው ሬሾ ኤፒተልያል መዋቅር እና የስትሮማ-ኤፒተልያል መስቀል ንግግርን በማቋቋም በስካፎልድ ውስጥ የስትሮማል ሴሎችን በማካተት።ነገር ግን አስቀድሞ የተዋቀሩ ቅርፊቶች ተፈጥሮ ድንገተኛ ሞሮፊኔቲክ ሂደት እንዳይታይ ሊከለክል ይችላል።እነዚህ ሞዴሎች እንዲሁ ተለዋዋጭ የሆነ የብርሃን ወይም የመሃል መሀል ሼሜርጂኔሽን ሴልፊዚዮሎጂያዊ እንቅስቃሴን እንዲፈጥሩ እና የሰውነት እንቅስቃሴን እንዲቀንሱ ያደርጋል። ሌላ የቅርብ ጊዜ ጥናት የሃይድሮጄል ስካፎልዶችን በማይክሮፍሉይድ መድረክ እና በሌዘር ማሳከክ ቴክኒኮችን በመጠቀም አንጀት ኤፒተልየል አወቃቀሮችን ተጠቅሟል።Mouse intestinal organoids የተቀረጹ ንድፎችን በመከተል የአንጀት ቱቦዎች አወቃቀሮችን ለመመስረት እና የውስጥ ፈሳሽ ፍሰት በማይክሮፍሎይድ ሞጁል በመጠቀም ሊስተካከል ይችላል። ከተመሳሳይ ቡድን ውስጥ ትንንሽ የሆድ ቱቦዎችን በራስ-ሰር morphogenetic ሂደቶች መፍጠር ችለዋል ። ምንም እንኳን በቧንቧው ውስጥ የተለያዩ የአንጀት ክፍሎች ውስብስብ ቢፈጠሩም ​​፣ ይህ ሞዴል የብርሃን ፍሰት ፍሰት እና የሜካኒካዊ ብልሽት የለውም። , ከፊዚዮሎጂ ጋር ተዛማጅነት ያለው የመሸርሸር ውጥረት, የአንጀት እንቅስቃሴን የሚመስሉ ባዮሜካኒኮች, ገለልተኛ የአፕቲካል እና የባሶላተራል ክፍሎች ተደራሽነት እና ውስብስብ ባዮሎጂያዊ ማይክሮ ሆሎራዎችን እንደገና መፍጠር.በመሆኑም የእኛ ኢን ቪትሮ 3D morphogenesis ፕሮቶኮል ያሉትን ዘዴዎች ተግዳሮቶችን ለማሸነፍ ተጨማሪ አቀራረብን ሊሰጥ ይችላል.
የእኛ ፕሮቶኮል ሙሉ በሙሉ በ 3D epithelial morphogenesis ላይ ያተኮረ ነው ፣ በባህል ውስጥ ያሉ ኤፒተልየል ሴሎች ብቻ እና እንደ ሜሴንቺማል ሴሎች ፣ endothelial ሕዋሳት እና የበሽታ ተከላካይ ሕዋሳት ያሉ ሌሎች ምንም አይነት በዙሪያቸው ያሉ ህዋሶች የሉም። ቀደም ሲል እንደተገለፀው የፕሮቶኮላችን ዋና ከባሶስተን-ጎን-አማካይ-ጎን-አማካይ የሚስጢር ሞርሞጅን አጋቾችን በማስወገድ ነው። -ቺፕ እና ዲቃላ-በቺፕ የማይበረዝ የ3-ዲ ኤፒተልያል ንብርብርን እንደገና እንድንፈጥር ያስችለናል፣ ተጨማሪ ባዮሎጂካል ውስብስብ ነገሮች እንደ ኤፒተልያል-ሜሴንቺማል መስተጋብር33፣34፣ extracellular Matrix (ECM) ማስቀመጫ 35 እና፣ በእኛ ሞዴል፣ crypt-villus ባህሪያት በ basal crypts ውስጥ ያሉ ግንድ ኒችዎችን የሚያስተላልፉ የ crypt-villus ባህሪዎች የኢሲኤም ፕሮቲኖችን በማምረት እና በ vivo35,37,38 ውስጥ የአንጀት ሞርጅጀንስን መቆጣጠር.የሜሴንቺማል ሴሎች ወደ ሞዴላችን መጨመራቸው የmorphogenetic ሂደትን እና የሕዋስ ትስስርን ውጤታማነት አሻሽሏል.የኢንዶቴልየም ሽፋን (ማለትም ካፊላሪስ ወይም ሊምፋቲክስ) ሞለኪውላር ትራንስፖርትን በመቆጣጠር ረገድ ትልቅ ሚና ይጫወታል። በቲሹ ሞዴሎች መካከል ሊገናኙ የሚችሉት የቲሹ ሞዴሎች የባለብዙ አካል መስተጋብርን ለማሳየት ሲዘጋጁ ቅድመ ሁኔታ ነው.ስለዚህ የኢንዶቴልየም ሴሎች የበለጠ ትክክለኛ የፊዚዮሎጂ ባህሪያትን በኦርጋን ደረጃ መፍታት ውስጥ ማካተት ሊያስፈልግ ይችላል.ከታካሚ የተገኙ የበሽታ ተከላካይ ሕዋሳትም ተፈጥሯዊ የመከላከያ ምላሾችን ለማሳየት, አንቲጂን አቀራረብ, በተፈጥሯቸው የሚለምደዉ የበሽታ መከላከያ ንግግር, በቲሹ-ፊዚስቲን በሽታዎች ውስጥ.
የጅብሪድ ቺፖችን መጠቀም ከጉት-ላይ-ቺፕ የበለጠ ቀላል ነው ምክንያቱም መሳሪያው ማዋቀር ቀላል ስለሆነ እና ትራንስዌል ማስገባቶችን መጠቀም ለአንጀት ኤፒተልየም ሊሰፋ የሚችል ባህል እንዲኖር ያስችላል።ነገር ግን ለንግድ የሚቀርቡት ትራንስዌል ማስገባቶች ከፖሊስተር ሽፋን ጋር የመለጠጥ አይደሉም እና እንደ ፔሪስታልቲክ መሰል እንቅስቃሴዎችን መምሰል አይችሉም። apical side.በግልጽ ፣ በአፕቲካል ክፍል ውስጥ ያሉት የማይለዋወጥ ባህሪዎች በድብልቅ ቺፕስ ውስጥ ለረጅም ጊዜ የሚቆይ የባክቴሪያ ባህልን እምብዛም አያስችሉም ። ዲቃላ ቺፕስ በሚጠቀሙበት ጊዜ 3D ሞርሞጅጀንስን በ Transwell ማስገቢያ ውስጥ በብርቱ ማነሳሳት ብንችልም ፣ የፊዚዮሎጂ አግባብነት ያላቸው ባዮሜካኒኮች እጥረት እና የአፕቲካል ፈሳሽ ፍሰት የዝግመተ ለውጥ መድረክን ሊገድብ ይችላል።
በሰው ልጅ ክሪፕት-ቪለስ ዘንግ ውስጥ ያለው ሙሉ መጠን እንደገና መገንባት በአንጀት-ላይ-ቺፕ እና ድቅል-ላይ-ቺፕ ባህሎች ሙሉ በሙሉ አልተመሰረቱም።ሞርፎጀኔሲስ ከኤፒተልያል ሞኖላይየር ጀምሮ ስለጀመረ፣ 3D ማይክሮ አርክቴክቸርስ የግድ ከክሪፕትስ ውስጥ ከክሪፕትስ ጋር የሞርሞሎጂ ተመሳሳይነት አያሳዩም። ሊየም ፣ ክሪፕት እና ቪሊየስ ክልሎች በግልፅ አልተከፋፈሉም ። ምንም እንኳን ከፍ ያለ የላይኛው ቻናሎች ወደ ማይክሮኢንጂነሪድ ኤፒተልየም ቁመት ቢጨምሩም ፣ ከፍተኛው ቁመት አሁንም በ ~ 300-400 µm የተገደበ ነው ። በትልቁ እና በትልቁ አንጀት ውስጥ ያለው የሰው አንጀት ጥልቀት የክብደቱ ~ 135 µm ነው ፣ እና ~ 40 ነው ። 600 µm41.
ከኢሜጂንግ እይታ አንጻር የ3D ማይክሮ አርክቴክቸሮች ከፍተኛ ጥራት ያለው ምስል በቺፕ ላይ ባለው አንጀት ላይ ብቻ ሊገደብ ይችላል፣ ምክንያቱም ከተጨባጭ ሌንስ እስከ ኤፒተልያል ንብርብር የሚፈለገው የስራ ርቀት በጥቂት ሚሊሜትር ነው።ይህንን ችግር ለመቅረፍ የሩቅ አላማ ሊያስፈልግ ይችላል።ከዚህም በላይ ኤምኤስን ለመቅረጽ ቀጭን ክፍሎችን መስራት ከፍተኛ ችግርን ይፈጥራል። , በንብርብር-በ-ንብርብር አንጀት በቺፕ ላይ ያለው ማይክሮ ፋብሪካ በእያንዳንዱ ንብርብር መካከል ቋሚ መጣበቅን ስለሚያካትት የኤፒተልየል ንብርብሩን የገጽታ መዋቅር ለመመርመር የላይኛውን ክፍል ለመክፈት ወይም ለማውጣት እጅግ በጣም ፈታኝ ነው።
የፒዲኤምኤስ ሃይድሮፎቢሲቲ ከሃይድሮፎቢክ ጥቃቅን ሞለኪውሎች ጋር በተያያዙ በማይክሮ ፍሎይዲክ ላይ የተመሰረቱ ጥናቶች ውሱን ነገር ሆኖ ቆይቷል። የሃይድሮፎቢክ ሞለኪውሎች adsorption.
በመጨረሻም, የእኛ ዘዴ ከፍተኛ ጥራት ያለው የማጣሪያ ወይም "አንድ-መጠን-ለሁሉም" ለተጠቃሚ ምቹ የሆነ የሙከራ መድረክ በማቅረብ ረገድ በደንብ አልተገለጸም. አሁን ያለው ፕሮቶኮል በእያንዳንዱ ማይክሮሶፍት ውስጥ የሲሪንጅ ፓምፕ ያስፈልገዋል, ይህም በ CO2 ኢንኩቤተር ውስጥ ቦታን የሚይዝ እና ትላልቅ ሙከራዎችን ይከላከላል.ይህ ገደብ በከፍተኛ ደረጃ ሊሻሻል ይችላል, በ scalability, well-well 4 ለምሳሌ, 4) ቀጣይነት ያለው መሙላት እና የ basolateral media መወገድን የሚፈቅዱ በደንብ ባለ ቀዳዳ ማስገቢያዎች)።
በሰው አንጀት ውስጥ ያለው ኤፒተልየም በብልቃጥ ውስጥ 3D morphogenesis ለማነሳሳት ሁለት ትይዩ ማይክሮ ቻነሎችን እና በመካከላቸው ያለው ተጣጣፊ ባለ ቀዳዳ ሽፋን ያለው የማይክሮ ፍሉይዲክ ቺፕ አንጀት መሳሪያ ተጠቅመን የሉሚን-ካፒታል በይነገጽ ለመፍጠር እንጠቀማለን። የተለያዩ የሰው አንጀት ኤፒተልየል ሴሎች ሞሮጅጀኔሲስ ከባሶላተራል ክፍል ውስጥ የሞርሞጅን ባላጋራዎችን ለማስወገድ የፍሰት አቅጣጫን በመተግበር ማሳየት ይቻላል ። አጠቃላይ የሙከራ ሂደት (ምስል 1) አምስት ክፍሎችን ያቀፈ ነው- (i) ማይክሮፋብሪኬሽን አንጀት ቺፕ ወይም ትራንስዌል ሊገባ የሚችል ድብልቅ ቺፕ (ደረጃ 1-5 ወይም 2) ሣጥን ውስጥ። ስቲናል ኦርጋኖይድ;ሳጥኖች 2-5) ፣ (iii) የአንጀት ቺፕስ ወይም ዲቃላ ቺፕስ ላይ የአንጀት epithelial ሕዋሳት ባህል (ደረጃ 6-9) (ደረጃ 6-9) (ደረጃ 6-9) (iv) 3D morphogenesis በብልቃጥ ውስጥ ማነሳሳት (ደረጃ 10) እና (v) ) የ 3D epithelial microstructure ለመለየት (ደረጃዎች 11-24 አግባብነት ያለው ቡድን ውስጥ ውጤታማ እንዲሆን የተቀየሰ) ኤፒተልየል ሞርጅጄኔሽን ከቦታ፣ ጊዜያዊ፣ ሁኔታዊ ወይም የሥርዓት መቆጣጠሪያዎች ጋር በማነፃፀር ሞርጅጀንስ።
ሁለት የተለያዩ የባህል መድረኮችን እንጠቀማለን፡- gut-on-a-chip with straight channels or unonlinear convoluted channels፣ወይም ትራንስዌል (TW) ማስገቢያ በማይክሮፍሉይዲክ መሳሪያ ውስጥ፣በቦክስ 1 ላይ እንደተገለፀው እና ደረጃ 1-5 የያዙ ድቅል ቺፖችን እና ደረጃ 1-5።” መሳሪያ ማምረቻ” አንድ ቺፕ ወይም ድብልቅ ቺፕያል ኢንስቲን ሴል 2 ምንጭን ለማብራራት ዋና ዋና እርምጃዎችን ያሳያል። በዚህ ፕሮቶኮል ውስጥ ጥቅም ላይ የዋለ የባህል ሂደት "In vitro morphogenesis" Caco-2 ወይም ኦርጋኖይድ-የመነጩ ኤፒተልየል ሴሎች በአንጀት ቺፕ ላይ ወይም በትራንስዌል ድብልቅ ቺፕ ላይ የሰለጠኑበትን አጠቃላይ ደረጃዎች ያሳያል ፣ በመቀጠልም የ 3D ሞርሞጅጀንስን በማስተዋወቅ እና የሥርዓተ-ሥርዓት ቁጥር በሣጥን ውስጥ የተፈጠረ ነው ። stinal epithelial layers ጥቅም ላይ ሊውሉ ይችላሉ, ለምሳሌ, በሴል ልዩነት ባህሪ, የአንጀት ፊዚዮሎጂ ጥናቶች, የአስተናጋጅ-ማይክሮባዮም ስነ-ምህዳሮች መመስረት እና የበሽታ አምሳያ. Immunofluorescence ምስሎች በ "ሴል ልዩነት" ውስጥ የሚገኙትን ኒውክሊይ, F-actin እና MUC2 የሚያሳዩ በ 3D Caco-2 epithelial epithelial mucosal mucosal mucosal cells ውስጥ የተፈጠረ ነው. በጉት ፊዚዮሎጂ ውስጥ ያሉ የፍሎረሰንት ምስሎች የፍሎረሰንት የስንዴ ጀርም አግግሉቲኒንን በመጠቀም ለሳይሊክ አሲድ እና ለኤን-አሲቲልግሉኮሳሚን ቅሪቶች በመቀባት የሚመረተውን ንፋጭ ያሳያሉ።በ"አስተናጋጅ-ማይክሮብ ኮ-ባህሎች" ውስጥ ያሉት ሁለቱ ተደራራቢ ምስሎች በአንጀት ውስጥ ተወካይ አስተናጋጅ-ማይክሮባዮም የጋራ ባህሎች በቺፕ ላይ አረንጓዴ ፕሮቲን ያሳያል። gineered 3D Caco-2 epithelial cells.የቀኝ ፓነል የጂኤፍፒ ኢ. ኮላይን ከ3D Caco-2 epithelial ሴሎች ጋር አብሮ መሰራቱን ያሳያል፣ከዚህም በኤፍ-አክቲን (ቀይ) እና በኒውክሊየስ (ሰማያዊ) የበሽታ መከላከያ ቀለም መቀባት። እና የበሽታ ተከላካይ ሕዋሳት (ለምሳሌ, PBMC;አረንጓዴ)።Caco-2 ህዋሶች የ3ዲ ኤፒተልየል ንብርብር ለመመስረት ተሰርተዋል።ስኬል ባር፣ 50 µm። ምስሎች በታችኛው ረድፍ፡ “የሴሎች ልዩነት” ከማጣቀሻ ፈቃድ ጋር የተስተካከለ።2.ኦክስፎርድ ዩኒቨርሲቲ ፕሬስ;ከማጣቀሻ.5 ፈቃድ ጋር እንደገና ተባዝቷል.NAS;"አስተናጋጅ-ማይክሮብ የጋራ ባህል" ከማጣቀሻ 3 ፈቃድ ጋር የተስተካከለ።NAS;ከማጣቀሻ ፈቃድ ጋር የተስተካከለ "በሽታ አምሳያ" 5.NAS.
ሁለቱም አንጀት-ቺፕ እና ዲቃላ ቺፕስ የተሰሩት የፒዲኤምኤስ ቅጂዎችን በመጠቀም ከሲሊኮን ሻጋታዎች የተፈረሱ በሶፍት ሊቶግራፊ1,44 እና በ SU-8 ንድፍ የተቀረጹ ናቸው. በእያንዳንዱ ቺፕ ውስጥ ያለው የማይክሮ ቻነሎች ንድፍ የሚወሰነው እንደ ሸለተ ውጥረት እና ሀይድሮዳይናሚክ ግፊት1,4,12.የመጀመሪያው አንጀት-ላይ-ቺፕ ዲታ የተሰራው ቀጥተኛ ምስል ነው። ማይክሮቻነሎች፣ ወደ ውስብስብ አንጀት-አ-ቺፕ (የተራዘመ ዳታ ምስል 1 ለ) ተለውጦ የፈሳሽ መኖሪያ ጊዜ መጨመርን፣ የመስመር ላይ ፍሰት ዘይቤዎችን እና የባህላዊ ሴሎችን መልቲአክሲያል መበላሸት (ምስል 2a-f) 12. ይበልጥ ውስብስብ የአንጀት ባዮሜካኒክስን መምረጥ አስፈላጊ በሚሆንበት ጊዜ ጉትቺሉ ኮንስትራክሽን እንደገና መታየት ይኖርበታል። ቴድ ጉት-ቺፕ የ 3D ሞርሞጅንን በተመሳሳይ የጊዜ ገደብ ውስጥ ከዋናው ጉት-ቺፕ ጋር ሲወዳደር ተመሳሳይ የሆነ የኤፒተልያል እድገትን ያነሳሳል, ምንም እንኳን የሰለጠኑ የሕዋስ ዓይነት ምንም ይሁን ምን.ስለዚህ የ 3D ሞርጀኔሲስን ለማነሳሳት, መስመራዊ እና ውስብስብ በቺፕ ጉት ዲዛይኖች ይለዋወጣሉ. የPDMS ቅጂዎች በሲሊኮን ቅርጽ 8 ቅርጽ ከተቀረጹ በኋላ አሉታዊ ገፅታዎች ከ SUU.2 ሀ) አንጀትን በቺፕ ላይ ለማምረት የተዘጋጀው የላይኛው የፒዲኤምኤስ ንብርብር በቅደም ተከተል ከተቦረቦረ የፒዲኤምኤስ ፊልም ጋር ተጣብቆ ከታችኛው ፒዲኤምኤስ ንብርብር ጋር በማያያዝ ኮሮና ማከሚያን በመጠቀም (ምስል 2b–f)። ድቅል ቺፖችን ለመሥራት የተዳቀሉ የፒዲኤምኤስ ቅጂዎች ከመስታወት ስላይዶች ጋር ተያይዘው ትራንስዌል ቻናል መፍጠር የሚችል ማይክሮ ቻናል መፍጠር ይችላሉ። የተራዘመ መረጃ ምስል 2) የማገናኘት ሂደቱ የሚከናወነው የፒዲኤምኤስ ብዜት እና የመስታወት ንጣፎችን በኦክስጅን ፕላዝማ ወይም ኮሮና ህክምና በማከም ነው.በሲሊኮን ቱቦ ላይ የተጣበቀውን ማይክሮፋብሊክ መሳሪያ ማምከን ከጀመረ በኋላ የመሳሪያው ዝግጅት የ 3D morphogenesis የአንጀት epithelium (ምስል 2g) ለማከናወን ዝግጁ ነበር.
a, የ PDMS ክፍሎች ዝግጅት ከ SU-8 ንድፍ የሲሊኮን ሻጋታዎች የመርሃግብር ገለጻ ያልተፈወሰው የፒዲኤምኤስ መፍትሄ በሲሊኮን ሻጋታ (በግራ) ላይ ፈሰሰ, በ 60 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ (መሃል) እና ወድቋል (በስተቀኝ). rous membrane.d፣ የላይ እና የታችኛው የፒዲኤምኤስ ክፍሎች እና የተገጣጠመው በቺፕ አንጀት ውስጥ ያሉ ተከታታይ ፎቶግራፍ። ለማይክሮ ፍሉይዲክ ሴል ባህል በቺፕ ላይ የተሰራው አንጀት ከሲሊኮን ቱቦ እና ሲሪንጅ ጋር በተገጣጠመው መሸፈኛ ላይ ተቀምጧል።የቺፕ መሳሪያው በ150 ሚ.ሜ የፔትሪ ዲሽ ክዳን ላይ ለሂደት ተዘጋጅቷል። አንጀት 3D morphogenesis ለማነሳሳት ወደ hybrid ቺፑድ ውስጥ የገቡት አንጀት ያላቸው ኤፒተልየል ህዋሶች በትራንስዌል ማስገቢያ ላይ በተመሰረተው የሴል ሽፋን ስር በሚገኙ ማይክሮ ቻነሎች አማካኝነት ነው ሚድያው የተቀባው።ስኬል ባር፣ 1 ሴ.ሜ.ህ ከማጣቀሻ ፈቃድ ጋር እንደገና ታትሟል።4.ሌላ።
በዚህ ፕሮቶኮል ውስጥ የ Caco-2 ሕዋስ መስመር እና የአንጀት ኦርጋኖይድ እንደ ኤፒተልየል ምንጮች ጥቅም ላይ ውለዋል (ስዕል 3 ሀ) ሁለቱም የሴሎች ዓይነቶች በተናጥል ተሠርተው ነበር (ሣጥን 2 እና ሣጥን 5) እና በቺፕ አንጀት ወይም ትራንስዌል ማስገቢያዎች ውስጥ በኤሲኤም-የተሸፈኑ ማይክሮ ቻናሎች ለመዝራት ያገለግላሉ። 50) በቲ-flasks ውስጥ የተከፋፈሉ የሕዋስ እገዳዎችን በ trypsinization ፈሳሽ ለማዘጋጀት (ሣጥን 2) ይሰበሰባሉ.የሰው አንጀት ኦርጋኖይድ ከአንጀት ባዮፕሲዎች ወይም የቀዶ ጥገና ሕክምናዎች በ Matrigel scaffold domes ውስጥ በ 24-well plates ውስጥ መዋቅራዊ ማይክሮ ኤንቬንሽን ለመደገፍ, አስፈላጊ የሆኑ የማይክሮ ከባቢ አየር, መካከለኛ እና አስፈላጊ ያልሆኑ እድገቶች. በቦክስ 3 ላይ እንደተገለፀው ኦርጋኖይድ እስከ ~ 500 µm ዲያሜትር እስኪያድግ ድረስ በየቀኑ ይሟላል ። ሙሉ በሙሉ ያደጉ ኦርጋኖይድ ተቆርጦ ወደ ነጠላ ሴሎች ተከፋፍሎ ወደ አንጀት ወይም ትራንስዌል በቺፕ (ሳጥን 5) ላይ እንዲገባ ይደረጋል። ቀደም ብለን እንደገለጽነው በበሽታ ዓይነት12,13 ፣ ኮሎሬክታል ካንሰር፣ ኮሎሬክታል ቁስለት ወይም የዶንታል ቁስለት በሽታ (ለምሳሌ የዶንታል ቁስለት በሽታ)። ጉዳት ከሌለበት አካባቢ) እና በትራክቱ ውስጥ ያሉ የጨጓራና ትራክት መገኛ (ለምሳሌ፡ duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, or rectum)፡ በቦክስ 5 ውስጥ የአንጀት ኦርጋኖይድ (coloid) ለማልማት የተመቻቸ ፕሮቶኮል እናቀርባለን።
a, Workflow for gut morphogenesis induction of gut chip.Caco-2 የሰው አንጀት ኤፒተልየም እና አንጀት ኦርጋኖይድ በዚህ ፕሮቶኮል ውስጥ የ 3D morphogenesisን ለማሳየት ጥቅም ላይ ይውላሉ።የተለዩት ኤፒተልየል ሴሎች በተዘጋጀው አንጀት-በቺፕ መሳሪያ (ቺፕ ዝግጅት) ውስጥ ተዘርግተው ነበር (ቺፕ ዝግጅት) አንድ ጊዜ ህዋሶች የተዘሩ እና የተዘሩ ናቸው (ዲዲ 0) በቀን ህዋሶች የተዘሩ እና የተዘሩ ናቸው። የ apical (AP) ፍሰት ተጀምሯል እና ለመጀመሪያዎቹ 2 ቀናት ይቆያል (ፍሰት ፣ AP ፣ D0-D2) የባሶላተራል (BL) ፍሰት እንዲሁ የሚጀምረው ከሳይክል የመለጠጥ እንቅስቃሴዎች (ዘርጋ ፣ ፍሰት ፣ AP እና BL) ጋር የተሟላ የ 2D monolayer ሲፈጠር ነው ። የአንጀት 3D ሞርሞርጂኔስ በድንገት ተከሰተ ፣ የ 5 ቀናት ንፅፅር ባህል ምስል 5 ቀናት። co-2 ሕዋሳት በእያንዳንዱ የሙከራ ደረጃ ወይም የጊዜ ነጥብ (ባር ግራፍ፣ 100 µm)።4 schematic ንድፎችን አንጀት morphogenesis ያለውን ተዛማጅ cascades የሚያሳዩ (ከላይ በስተቀኝ) schematic ውስጥ የተሰረዙ ቀስቶች ፈሳሽ ፍሰት አቅጣጫ ይወክላሉ.b, SEM ምስል የተቋቋመው 3D Caco-2 epithelift ውስጥ ላዩን ቶፖሎጂ ያሳያል (Whiteshed ሳጥን) ያደምቃል. villi በ 3D Caco-2 ንብርብር ላይ (በስተቀኝ)።c፣ የተቋቋመው Caco-2 3D አግድም የፊት እይታ፣ ክሎዲን (ZO-1፣ቀይ) እና ቀጣይነት ያለው ብሩሽ የድንበር ሽፋን F-actin (አረንጓዴ) እና ኒውክላይ (ሰማያዊ) የተሰየሙ ኢሚውኖፍሎረሰንስ የኤፒተልየል ህዋሶች ወደ መካከለኛው የፕላኔቱ ግርዶሽ እይታ እይታ። .መ፣በቀን 3፣ 7፣ 9፣ 11 እና 13 ላይ በክፍል ንፅፅር ማይክሮስኮፒ በተገኘ ቺፕ ላይ የሰለጠኑ የኦርጋኖይድ ሞርፎሎጂ ለውጦች የጊዜ ሂደት። ውስጠቱ (ከላይ በስተቀኝ) የቀረበውን ምስል ከፍተኛ ማጉላት ያሳያል።ማጌንታ)፣ ጎብል ሴሎች (MUC2፣ አረንጓዴ)፣ ኤፍ-አክቲን (ግራጫ) እና ኒውክላይ (ሳይያን) በአንጀት ቺፕስ ላይ ለ3 ቀናት፣ በቅደም ተከተል (ግራ) እና ለ13-ቀን (መካከለኛ) ኦርጋኖይድ በኤፒተልያል ንብርብር ላይ ይበቅላሉ። የ LGR5 ምልክትን ያለ MUC2 ቀኝ ምልክት የሚያሳይ ምስል ይመልከቱ። በባህል 13 ቀን የፕላዝማውን ሽፋን በሴልማስክ ቀለም (በስተቀኝ) በመቀባት በቺፕ ላይ በአንጀት ውስጥ የተቋቋመው ኦርጋኖይድ ኤፒተልየም።ስኬል ባር 50 μm ካልሆነ በስተቀር።ኦክስፎርድ ዩኒቨርሲቲ ፕሬስ;ሐ ከማጣቀሻ ፈቃድ ጋር የተስተካከለ.2.ኦክስፎርድ ዩኒቨርሲቲ ፕሬስ;e እና f በማጣቀሻ ፈቃድ ተስተካክለዋል።12 በCreative Commons License CC BY 4.0.
በቺፕ ላይ ባለው አንጀት ውስጥ የፒዲኤምኤስ ባለ ቀዳዳ ሽፋን የሃይድሮፎቢክ ገጽን በተሳካ ሁኔታ ለኤሲኤም ሽፋን መለወጥ አስፈላጊ ነው ። በዚህ ፕሮቶኮል ውስጥ የ PDMS ሽፋኖችን ሃይድሮፎቢሲቲ ለመቀየር ሁለት የተለያዩ ዘዴዎችን እንጠቀማለን ። Caco-2 ሕዋሳትን ለማዳበር በ UV / Ozone ሕክምና ላይ ላዩን ማንቃት ብቻ በቂ ነበር ። የኦርጋኖይድ ኤፒተልየም የማይክሮ ፍሎይዲክ ባህል በኬሚካላዊ ላይ የተመሠረተ የወለል ንፅፅርን ይፈልጋል ፣ የ ECM ፕሮቲኖችን ውጤታማ በሆነ መንገድ ለማስቀመጥ ፖሊ polyethyleneimine (PEI) እና glutaraldehydeን ወደ ፒዲኤምኤስ ማይክሮ ቻነሎች በመተግበር የገጽታ ለውጥ ከተደረገ በኋላ የኢሲኤም ፕሮቲኖች የፔዲኤምኤስ ንጣፍ ሽፋን እንዲሸፍኑ ተደርገዋል ። ሴሎቹ ሙሉ ሞኖላይየር እስኪሰሩ ድረስ መካከለኛውን ብቻ ወደ ላይኛው ማይክሮ ቻነል በመቀባት ፣ የታችኛው ማይክሮ ቻናል ደግሞ የማይለዋወጥ ሁኔታዎችን ይጠብቃል ። ይህ የተመቻቸ ዘዴ የወለል ንቃት እና የኢ.ሲ.ኤም ሽፋን የኦርጋኖይድ ኤፒተልየምን በማያያዝ በፒዲኤምኤስ ወለል ላይ የ 3D ሞርጂኔሽን እንዲፈጠር ያስችለዋል።
ትራንስዌል ባህሎች ከሴል ዘር በፊት የ ECM ሽፋን ያስፈልጋቸዋል;ይሁን እንጂ የትራንስዌል ባህሎች የተቦረቦረ ማስገቢያዎች ላይ ለማንቃት ውስብስብ የቅድመ-ህክምና እርምጃዎች አያስፈልጋቸውም.በ ትራንስዌል ማስገቢያዎች ላይ Caco-2 ሴሎችን ለማደግ ECM ሽፋን የተከፋፈሉ Caco-2 ሕዋሶችን (<1 ሰዓት) እና ጥብቅ የመገናኛ ማገጃ መፈጠርን ያፋጥናል (<1-2 ቀናት). 3 ሰ) እና ኦርጋኖይድ ሙሉ ለሙሉ ሞኖላይየር እስኪፈጠር ድረስ ተጠብቆ ይቆያል.
In vitro 3D morphogenesis በተቋቋመው ኤፒተልየል ንብርብር ወደ ባሶላተራል ገጽታ የፈሳሽ ፍሰትን በመተግበር ሊጀመር ይችላል።በቺፕ ላይ ባለው አንጀት ውስጥ ኤፒተልያል ሞርጀኔሲስ መካከለኛው የላይኛው እና የታችኛው ማይክሮ ቻነሎች ውስጥ ሲገባ (ምስል 3 ሀ) ይጀምራል። ቀደም ሲል እንደተገለፀው በታችኛው ክፍል ውስጥ የፈሳሽ ፍሰትን ማስተዋወቅ አስፈላጊ ነው (ለቀጣይ ሚስጥራዊ እና ቀጣይነት ያለው ምስጢራዊ ማስወገጃ)። በተቦረቦረ ሽፋን ላይ ወደታሰሩ ሴሎች ሴረም እና የብርሃን ሸለተ ጭንቀትን ይፈጥራል፣በተለምዶ በአንጀት ውስጥ ድርብ ፍሰትን በቺፕ ላይ እንተገብራለን።በዲቃላ ቺፕስ ውስጥ ትራንስዌል ማስገባቶች ኤፒተልያል ሞኖላይየሮችን የያዙ ድቅል ቺፕስ ውስጥ ገብተዋል።ከዚያም መካከለኛው በባለ ቀዳዳው ትራንስዌል ማስገባቱ በማይክሮ ቻነል ጅረት ውስጥ ከገባ በኋላ 3 ቀናት ውስጥ ተፈጠረ።
የማይክሮኢንጂነሪድ 3 ዲ ኤፒተልያል ንብርብሮችን ሞርሞሎጂያዊ ገፅታዎች የተለያዩ የምስል ዘዴዎችን በመተግበር ሊተነተን ይችላል ፣ ይህም የክፍል ንፅፅር ማይክሮስኮፒ ፣ ልዩነት የጣልቃ ገብነት ንፅፅር (DIC) ማይክሮስኮፒ ፣ ሴኤም ፣ ወይም immunofluorescence confocal microscopy (ምስል 3 እና 4) ። የደረጃ ንፅፅር ወይም የዲአይሲ ምስል በማንኛውም ጊዜ የእይታ ንፅፅርን እና የእይታ ንፅፅርን ለመከታተል በቀላሉ ሊከናወን ይችላል ። የፒዲኤምኤስ እና የፖሊስተር ፊልሞች ትክክለኛ ግልፅነት ፣ ሁለቱም የ gut-on-a-chip እና hybrid chip መድረኮች የመሳሪያውን ክፍል ወይም መበታተን ሳያስፈልጋቸው በእውነተኛ ጊዜ በቦታው ላይ ምስሎችን ሊሰጡ ይችላሉ ። immunofluorescence imaging (ምስል 1 ፣ 3c ፣ f እና 4b ፣ c) ሲሰሩ ፣ ህዋሶች በተለምዶ በ ‹XNUMX%› እና በ ‹volde 0› ተስተካክለዋል ። 2% (wt/vol) ) የቦቪን ሴረም አልቡሚን (BSA)፣ በቅደም ተከተል። እንደ ሴል ዓይነት፣ የተለያዩ መጠገኛዎች፣ ፐርሜኤቢሊዘር እና ማገጃ ወኪሎች ጥቅም ላይ ሊውሉ ይችላሉ። በዘር-ጥገኛ ሕዋስ ወይም የክልል ማርከሮች ላይ ያነጣጠሩ ዋና ፀረ እንግዳ አካላት በቺፑ ላይ የማይንቀሳቀሱ ህዋሶችን ለማድመቅ ይጠቅማሉ፣ በመቀጠልም ሁለተኛ ፀረ እንግዳ አካላትን ከቆጣሪ-ኢግኒየኒኖይ 2 indole፣ DAPI) ወይም F-actin (ለምሳሌ፣ በፍሎረሰንት የሚል ስያሜ የተሰጠው ፋሎይድ)። በፍሎረሰንት ላይ የተመሰረተ የቀጥታ ምስል እንዲሁ የንፋጭ ምርትን ለመለየት በቦታው ሊከናወን ይችላል (ምስል.1, "የህዋስ ልዩነት" እና "ጉት ፊዚዮሎጂ"), የማይክሮባዮል ሴሎች በዘፈቀደ ቅኝ ግዛት (ምስል 1, "አስተናጋጅ-ማይክሮብ የጋራ ባህል"), የበሽታ ተከላካይ ሕዋሳት ምልመላ (ምስል 1, 'በሽታ አምሳያ') ወይም የ 3D ኤፒተልያል ሞርፎሎጂ ቅርጾች (ምስል 4 ቺፑን ሲቀያየር, ዝቅተኛውን ግርዶሽ, ማይክሮ ቻን ሲቀይር). nel Layer, ref ላይ እንደተገለጸው. በስእል 2 ላይ እንደሚታየው, 3D epithelial ሞርፎሎጂ እንዲሁም apical ብሩሽ ድንበር ላይ ያለውን microvilli በ SEM (የበለስ. 3 ለ) በ ሊታይ ይችላል. የልዩነት ማርከሮች አገላለጽ መጠናዊ PCR5 ወይም ነጠላ-ሴል አር ኤን ኤ ቅደም ተከተል በማከናወን መገምገም ይቻላል. በዚህ ሁኔታ ቺፕስ ውስጥ ቺፕስ 3 epithelial ንብርብር እያደገ ነው. trypsinization እና ከዚያም ለሞለኪውላር ወይም ለጄኔቲክ ትንተና ጥቅም ላይ ይውላል.
a, የስራ ፍሰት በዲቃላ ቺፕ ውስጥ የአንጀት ሞርጀኔሲስን ለማነሳሳት.Caco-2 እና intestinal organoids በዚህ ፕሮቶኮል ውስጥ የ 3D morphogenesis በ hybrid chip platform ውስጥ ለማሳየት ጥቅም ላይ ይውላሉ.የተከፋፈሉ ኤፒተልየል ሴሎች በተዘጋጁ ትራንስዌል ማስገቢያዎች (TW prep; ከዚህ በታች ያለውን ምስል ይመልከቱ) በአንድ ጊዜ ሴሎች ተዘርተዋል እና በ polyeeded ባሕል ውስጥ ተያይዘዋል. (TW ባህል) .ከ 7 ቀናት በኋላ, አንድ ነጠላ ትራንስዌል ማስገቢያ ኤፒተልየል ሴሎች 2D monolayer የያዘ አንድ ዲቃላ ቺፕ ውስጥ የተቀናጀ ወደ basolateral ፍሰት (Flow, BL) ለማስተዋወቅ በመጨረሻም 3D epithelial ንብርብር (morphogenesis) እንዲፈጠር አድርጓል, ደረጃ ንፅፅር micrographs የሰው አካል epithelial ለጋሽ ሕዋሳት ከ morphological ባህሪያት የሚያሳዩ እያንዳንዱ መደበኛ ነጥብ 1 ከመደበኛው ስቴፕ ሴል . በላይኛው ንብርብሮች ውስጥ ያሉ ሼማቲክስ ለእያንዳንዱ እርምጃ የሙከራ ውቅርን ያሳያል።b, Hybrid chips (ግራ ሼማቲክ) ወደ 3D morphogenesis የኦርጋኖይድ ኤፒተልየል ሴሎችን ወደላይ ወደ ታች የሚያዩት የማይክሮስኮፒ እይታዎችን በተለያዩ የ Z አቀማመጥ (ከላይ፣ መካከለኛ እና ዝቅተኛ) ሊያመራ ይችላል።ትክክለኛውን ንድፍ እና ተጓዳኝ ነጠብጣብ መስመሮችን ይመልከቱ).ግልጽ የሞርፎሎጂ ባህሪያትን አሳይቷል.F-actin (ሳይያን), ኒውክሊየስ (ግራጫ)).c, Fluorescence confocal micrographs (3D angled view) ከኦርጋኖይድ የተገኙ ኤፒተልየል ሴሎች በስታቲክ ትራንስዌል (TW; inset in white dashed box) versus hybrid chip (ትልቅ ሙሉ ሾት) በአክብሮት 2D 2D ቨርሰስ እይታዎችን በማወዳደር። በላይኛው ቀኝ ጥግ ላይ የተቀመጠ፣ “XZ”) እንዲሁም 2D እና 3D ባህሪያትን ያሳያል።መጠን ባር፣ 100 μm.c በማጣቀሻ ፈቃድ እንደገና ታትሟል።4.ሌላ።
ተመሳሳይ ሴሎችን (Caco-2 ወይም intestinal organoid epithelial cells) ወደ ባለ ሁለት ገጽታ ሞኖላይየሮች በባህላዊ የስታቲክ ባህል ሁኔታዎች በማዳበር ቁጥጥር ሊደረግ ይችላል።በተለይ፣ የንጥረ-ምግብ መሟጠጥ በማይክሮ ቻነሎች የመጠን አቅም ውስንነት ምክንያት (ማለትም ~ 4 µL በዋናው ቻናል ከዋናው አንጀት-ቺፕ ኤፒተልያል ኤፒተልየል ዲዛይን በፊት) ጋር ሲነፃፀሩ። .
ለስላሳ የሊቶግራፊ ሂደት በንፁህ ክፍል ውስጥ መከናወን አለበት ። ለእያንዳንዱ ንብርብር በቺፕ (የላይ እና የታችኛው ሽፋኖች እና ሽፋኖች) እና ድቅል ቺፖች ፣ የማይክሮ ቻነሎች ቁመት የተለየ ስለነበረ የተለያዩ የፎቶ ጭምብሎች ጥቅም ላይ ውለዋል እና በተለየ የሲሊኮን ዋፍሎች ተሠርተው ነበር። 200 ሚ.ሜ.
ባለ 3-ኢንች የሲሊኮን ዋይፋር በድስት ውስጥ ከአሴቶን ጋር ያስቀምጡ። ሳህኑን ለ 30 ሰከንድ በቀስታ አዙረው፣ ከዚያም ቫፈርን አየር ያድርቁት።
የፒራንሃ መፍትሄ (የሃይድሮጂን ፓርሞክሳይድ ድብልቅ እና የተከማቸ ሰልፈሪክ አሲድ፣ 1፡3 (ቮል/ቮል)) እንደ አማራጭ የኦርጋኒክ ቅሪቶችን ከሲሊኮን ዋፈር ወለል ላይ ለማስወገድ ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል።
የፒራንሃ መፍትሄ እጅግ በጣም የሚበላሽ እና ሙቀትን ያመነጫል.ተጨማሪ የደህንነት ጥንቃቄዎች አስፈላጊ ናቸው.ለቆሻሻ አወጋገድ, መፍትሄው እንዲቀዘቅዝ እና ወደ ንጹህና ደረቅ ቆሻሻ ማጠራቀሚያ እንዲሸጋገር ይፍቀዱ. ሁለተኛ ደረጃ መያዣዎችን ይጠቀሙ እና የቆሻሻ ማጠራቀሚያዎችን በትክክል ይለጥፉ.እባክዎ ለተጨማሪ ዝርዝር ሂደቶች የተቋሙን የደህንነት መመሪያዎች ይከተሉ.
በ 200 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ለ 10 ደቂቃዎች በጋለ ምድጃ ላይ በማስቀመጥ ቫፈርን ያድርቁ.ከድርቀት በኋላ, ቫውሩ ለማቀዝቀዝ አምስት ጊዜ በአየር ውስጥ ይንቀጠቀጣል.
~ 10 ግራም የፎቶሪስቲስት SU-8 2100 በተጸዳው የሲሊኮን ዋፈር መሃከል ላይ አፍስሱ። ፎቶሪሲስቱን በቫፈር ላይ በደንብ ለማሰራጨት ሹራብ ይጠቀሙ።አልፎ አልፎ ቫፈርን በ65 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ በሙቀት ሰሃን ላይ በማድረግ ፎተሪሲስቱ እንዳይጣበቅ እና በቀላሉ እንዲሰራጭ ያድርጉ። ዋፋውን በቀጥታ በጋለ ሳህን ላይ አያስቀምጡ።
SU-8 የስፒን ሽፋንን በማስኬድ በዋፈር ላይ በእኩል መጠን ተሰራጭቷል። የ SU-8 መጪ ሽክርክር ለ5-10 ሰከንድ በ500 ደቂቃ ፍጥነት በ100 ደቂቃ/ሰከንድ እንዲሰራጭ ፕሮግራም ያድርጉ። ዋናውን ስፒን ለ 200 µm ውፍረት ጥለት በ1,500 rpm ወይም 0µµm ቁመቱ እንዲደርስ ያድርጉ። በቺፑ ላይ ያለው የአንጀት የላይኛው ሽፋን፤ ከታች ያለውን “ወሳኝ እርምጃዎችን” ይመልከቱ) በ300 ሩብ/ሰከንድ ፍጥነት በ30 ሰከንድ በ1,200 ሩብ ደቂቃ።
ዋናው የማሽከርከር ፍጥነት በሲሊኮን ዋፈር ላይ ባለው የ SU-8 ንድፍ በታለመው ውፍረት መሰረት ሊስተካከል ይችላል.
በቺፑ ላይ ላለው አንጀት የላይኛው ሽፋን 500µm ቁመት ያለው የ SU-8 ንድፎችን ለመሥራት የስፒን ሽፋን እና ለስላሳ የመጋገሪያ ደረጃዎች (ደረጃ 7 እና 8) በቅደም ተከተል ተደጋግመዋል (ደረጃ 9 ይመልከቱ) 250 µm ሁለት የ SU-8 ንብርቦችን ለማምረት 250 µm ውፍረት ያለው SU-8 ፣ ይህም በደረጃ 12 0 መጋለጥ በደረጃ UV 0 ይቀላቀላል።
ለስላሳ በ SU-8 የተሸፈኑ ቫፈርዎችን በሙቀት ላይ በ 65 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ለ 5 ደቂቃዎች በጥንቃቄ በመጋገር, ከዚያም ቅንብሩን ወደ 95 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ይቀይሩ እና ለ 40 ደቂቃዎች ይጨምሩ.
በላይኛው ማይክሮ ቻናል ውስጥ ያለውን የ SU-8 ንድፍ 500 μm ቁመት ለማግኘት፣ ደረጃ 7 እና 8ን በመድገም ሁለት 250 μm ውፍረት SU-8 ንብርብሮችን ለመፍጠር።
የ UV Mask Aligner ን በመጠቀም የዋፋውን የተጋላጭነት ጊዜ ለማስላት በአምራቹ መመሪያ መሰረት የመብራት ሙከራ ያካሂዱ።
የተጋላጭነት ጊዜን ከወሰኑ በኋላ, የፎቶ ጭምብል በ UV ጭንብል aligner ጭምብል መያዣ ላይ ያስቀምጡ እና የፎቶ ጭምብሉን በ SU-8 የተሸፈነ ቫፈር ላይ ያስቀምጡት.
የ UV ስርጭትን ለመቀነስ የፎቶ ጭምብልን በቀጥታ በ SU-8 በተሸፈነው የሲሊኮን ዋፈር ጎን ላይ ያድርጉት።
SU-8 የተሸፈነውን ዋፈር እና የፎቶ ጭምብል በአቀባዊ ወደ 260 ሜጄ/ሴሜ 2 የ UV መብራት ለተወሰነው የተጋላጭነት ጊዜ ያቅርቡ (የዚህን ሳጥን ደረጃ 10 ይመልከቱ)።
ከአልትራቫዮሌት ተጋላጭነት በኋላ SU-8-የተሸፈኑ የሲሊኮን ማሰሪያዎች በ 65 ° ሴ ለ 5 ደቂቃ እና በ 95 ° ሴ ለ 15 ደቂቃዎች በእያንዳንዱ ሙቅ ሳህን ላይ በ 200 μm ከፍታ ያላቸው ንድፎችን ለመሥራት ይጋገራሉ.ከመጋገሪያው ጊዜ በኋላ በ 95 ° ሴ እስከ 30 ደቂቃዎች በ 500 ሴ.ሜ ከፍታ ያላቸው ንድፎችን ለመሥራት.
ገንቢው ወደ መስታወት ሳህን ውስጥ ይፈስሳል፣ እና የተጋገረውን ዋይፋር ወደ ሳህኑ ውስጥ ይቀመጣል።የ SU-8 ገንቢው መጠን እንደ መስታወት ሳህን መጠን ሊለያይ ይችላል።ያልታወቀ SU-8ን ሙሉ በሙሉ ለማስወገድ በቂ SU-8 ገንቢ መጠቀሙን ያረጋግጡ።ለምሳሌ በ 1 ኤል አቅም ያለው 150 ሚሜ ዲያሜትር ያለው የመስታወት ሳህን ሲጠቀሙ ~ 300 ሚሊ ሊትር SUlop 2 ገንቢውን አልፎ አልፎ ይጠቀሙ።
የተፈጠረውን ሻጋታ በ ~ 10 ሚሊር ትኩስ ገንቢ ከዚያም አይፒኤ በመቀጠል መፍትሄውን በ pipette በመርጨት ያጠቡ።
ቫፈርን በፕላዝማ ማጽጃ ውስጥ ያስቀምጡ እና ለኦክሲጅን ፕላዝማ (የከባቢ አየር ጋዝ, የታለመ ግፊት 1 × 10-5 ቶር, ኃይል 125 ዋ) ለ 1.5 ደቂቃዎች ያጋልጡ.
ቫክዩም ማድረቂያውን በቫኪዩም ማድረቂያ ውስጥ ያስቀምጡት ከውስጥ የመስታወት ስላይድ ጋር ዋይፋሮች እና ስላይዶች ጎን ለጎን ሊቀመጡ ይችላሉ የቫኩም ማድረቂያው በበርካታ እርከኖች በጠፍጣፋ ከተከፋፈለ ተንሸራቶቹን ወደ ታችኛው ክፍል እና ቫፈርን በላይኛው ክፍል ውስጥ ያስቀምጡ። 100 μL trichloro (1H, 1H, 2H, 2H) መስታወት ላይ 100 μL trichloro (1H, 1H, 2H, 2H) የሲሊይድ ፍሉ መፍትሄን ይተግብሩ። ማወዛወዝ.
የቀዘቀዙ የካኮ-2 ህዋሶችን ብልቃጥ በ37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ የውሃ መታጠቢያ ውስጥ ይቀልጡ ፣ ከዚያ የቀለጠጡትን ህዋሶች ወደ T75 ብልቃጥ 15 ሚሊ ሊት 37°ሴ ቀድሞ የሞቀ Caco-2 መካከለኛ ያስተላልፉ።
Caco-2 ህዋሶችን በ ~90% ውዥንብር ለማለፍ በመጀመሪያ ሙቅ Caco-2 መካከለኛ፣ PBS እና 0.25% trypsin/1 mM EDTA በ 37°C የውሃ መታጠቢያ።
መካከለኛውን በቫኩም ምኞት ይመኙ።የቫክዩም ምኞትን በመድገም እና አዲስ ፒቢኤስን በመጨመር ሴሎችን በ 5 ሚሊር ሙቅ PBS ሁለት ጊዜ ያጠቡ።