Nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን።እየተጠቀሙበት ያለው የአሳሽ ስሪት የተወሰነ የሲኤስኤስ ድጋፍ አለው።ለበለጠ ልምድ፣ የዘመነ አሳሽ እንድትጠቀም እንመክርሃለን (ወይም የተኳኋኝነት ሁነታን በኢንተርኔት ኤክስፕሎረር አሰናክል)።እስከዚያው ድረስ ቀጣይ ድጋፍን ለማረጋገጥ ጣቢያውን ያለ ቅጦች እና ጃቫስክሪፕት እናቀርባለን።
ፈሳሽ ባዮፕሲ (LB) በባዮሜዲካል መስክ በፍጥነት ተወዳጅነት እያገኘ ያለ ጽንሰ-ሀሳብ ነው።ፅንሰ-ሀሳቡ በዋነኝነት የተመሰረተው በተለያዩ ቲሹዎች ውስጥ ሴል ከሞተ በኋላ እንደ ትናንሽ ቁርጥራጮች የሚለቀቁት ከሴሉላር ውጭ ያሉ ዲ ኤን ኤ (ሲሲኤፍኤንኤ) ቁርጥራጮችን በማወቅ ላይ ነው።የእነዚህ ቁርጥራጮች ትንሽ ክፍል የሚመጡት ከውጭ (የውጭ) ቲሹዎች ወይም ፍጥረታት ነው።አሁን ባለው ሥራ፣ ይህን ጽንሰ ሐሳብ በከፍተኛ የባሕር ውኃ የማጣራት አቅማቸው በሚታወቀው ሙስሉስ ላይ ተግባራዊ አድርገናል።ስለ ባህር ዳርቻ ስነ-ምህዳሮች ብዝሃ ህይወት መረጃ ለመስጠት ከተለያዩ ምንጮች የአካባቢን የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮችን ለመያዝ እንደ ተፈጥሯዊ ማጣሪያዎች ለመስራት እንጉዳዮችን እንጠቀማለን።ውጤታችን እንደሚያሳየው የ mussel hemolymph ከ 1 እስከ 5 ኪ.ባ. መጠናቸው በጣም የተለያየ የሆኑ የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮችን ይዟል.የተኩስ ቅደም ተከተል እንደሚያሳየው ብዙ ቁጥር ያላቸው የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች የውጭ ተህዋሲያን መነሻዎች ናቸው።ከነሱ መካከል በተለምዶ በባህር ዳርቻ የባህር ውስጥ ስነ-ምህዳሮች ውስጥ የሚገኙትን የተለያዩ አስተናጋጆችን የሚበክሉ ቫይረሶችን ጨምሮ ከባክቴሪያ፣ ከአርኬያ እና ከቫይረሶች የተውጣጡ የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች አግኝተናል።በማጠቃለያው፣ ጥናታችን እንደሚያሳየው የኤልቢ ፅንሰ-ሀሳብ በሞሴል ላይ የተተገበረው በባህር ዳርቻ ስነ-ምህዳሮች ውስጥ ስላለው ረቂቅ ተህዋሲያን ብዝሃነት የበለፀገ ግን ገና ያልተጠና የእውቀት ምንጭ ነው።
የአየር ንብረት ለውጥ (ሲ.ሲ.ሲ) በባህር ውስጥ ስነ-ምህዳር ብዝሃ ህይወት ላይ የሚያሳድረው ተጽዕኖ በፍጥነት እያደገ ያለ የምርምር መስክ ነው።የአለም ሙቀት መጨመር አስፈላጊ የፊዚዮሎጂ ጭንቀቶችን ብቻ ሳይሆን የባህር ውስጥ ፍጥረታትን የሙቀት መረጋጋት የዝግመተ ለውጥ ገደቦችን በመግፋት የበርካታ ዝርያዎችን መኖሪያ ይነካል ፣ ይህም የበለጠ ምቹ ሁኔታዎችን እንዲፈልጉ ያነሳሳቸዋል [1, 2].የሜታዞአን ብዝሃ ህይወት ላይ ተጽእኖ ከማድረግ በተጨማሪ፣ ሲሲሲ የአስተናጋጅ-ተህዋሲያን መስተጋብር ሚዛኑን ያበላሻል።ይህ ረቂቅ ተሕዋስያን dysbacteriosis የባህር ውስጥ ፍጥረታትን ለተላላፊ በሽታ አምጪ ተህዋስያን የበለጠ እንዲጋለጡ ስለሚያደርግ በባህር ውስጥ ስነ-ምህዳር ላይ ከፍተኛ ስጋት ይፈጥራል [3, 4].በጅምላ ሞት ውስጥ ኤስኤስ ትልቅ ሚና ይጫወታል ተብሎ ይታመናል፣ ይህም ለአለም አቀፍ የባህር ውስጥ ስነ-ምህዳሮች አስተዳደር ከባድ ችግር ነው [5, 6].የበርካታ የባህር ውስጥ ዝርያዎች ኢኮኖሚያዊ, ሥነ-ምህዳራዊ እና የአመጋገብ ተጽእኖዎች ግምት ውስጥ በማስገባት ይህ አስፈላጊ ጉዳይ ነው.ይህ በተለይ በዋልታ ክልሎች ውስጥ ለሚኖሩ ቢቫልቭስ እውነት ነው፣ የ CK ውጤቶች የበለጠ ፈጣን እና ከባድ ናቸው [6, 7]።እንደ እውነቱ ከሆነ, እንደ Mytilus spp ያሉ bivalves.በባህር ውስጥ ስነ-ምህዳሮች ላይ የሲሲሲ ተጽእኖን ለመቆጣጠር በሰፊው ጥቅም ላይ ይውላሉ.ኢንዛይም እንቅስቃሴን ወይም ሴሉላር ተግባራትን እንደ ሴል አዋጭነት እና ፋጎሲቲክ እንቅስቃሴ [8] ላይ ተመስርተው ተግባራዊ ባዮማርከርን የሚያካትቱ ሁለት-ደረጃ አቀራረብ በመጠቀም ጤንነታቸውን ለመቆጣጠር በአንፃራዊነት ብዙ ቁጥር ያላቸው ባዮማርከር መፈጠሩ የሚያስገርም አይደለም።እነዚህ ዘዴዎች ከፍተኛ መጠን ያለው የባህር ውሃ ከወሰዱ በኋላ ለስላሳ ቲሹዎች የሚከማቸውን ልዩ የግፊት ጠቋሚዎች ትኩረትን መለካትንም ያጠቃልላል።ይሁን እንጂ የቢቫልቭስ ከፍተኛ የማጣራት አቅም እና ከፊል-ክፍት የደም ዝውውር ሥርዓት ፈሳሽ ባዮፕሲ (LB) ጽንሰ-ሐሳብን በመጠቀም አዲስ የሂሞሊምፍ ባዮማርከርን ለማዘጋጀት እድል ይሰጣል, ለታካሚ አስተዳደር ቀላል እና አነስተኛ ወራሪ አቀራረብ.የደም ናሙናዎች [9, 10].ምንም እንኳን ብዙ አይነት ሞለኪውሎች በሰው ልጅ LB ውስጥ ሊገኙ ቢችሉም ይህ ጽንሰ-ሀሳብ በዋናነት በዲኤንኤ ቅደም ተከተል በፕላዝማ ውስጥ በሚዘዋወሩ ውጫዊ የዲ ኤን ኤ (CCfDNA) ቁርጥራጮች ላይ የተመሰረተ ነው።እንደ እውነቱ ከሆነ, በሰው ፕላዝማ ውስጥ የሚዘዋወረው ዲ ኤን ኤ ከ 20 ኛው ክፍለ ዘመን አጋማሽ ጀምሮ ይታወቃል, ነገር ግን በቅርብ ዓመታት ውስጥ ከፍተኛ-ቅደም ተከተል ዘዴዎች መምጣት በ ccfDNA ላይ ክሊኒካዊ ምርመራ እንዲደረግ ምክንያት ሆኗል.የእነዚህ የደም ዝውውር ዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች መገኘት በከፊል የጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ (ኑክሌር እና ማይቶኮንድሪያል) ከሴል ሞት በኋላ በመለቀቁ ምክንያት ነው. በጤናማ ሰዎች ውስጥ የ ccfDNA ትኩረት በመደበኛነት ዝቅተኛ ነው (<10 ng/mL) ነገር ግን በተለያዩ የፓቶሎጂ በሚሰቃዩ ወይም ለጭንቀት በተጋለጡ ታካሚዎች ላይ በ5-10 ጊዜ ሊጨምር ይችላል ይህም የሕብረ ሕዋሳትን ይጎዳል። በጤናማ ሰዎች ውስጥ የ ccfDNA ትኩረት በመደበኛነት ዝቅተኛ ነው (<10 ng/mL) ነገር ግን በተለያዩ የፓቶሎጂ በሚሰቃዩ ወይም ለጭንቀት በተጋለጡ ታካሚዎች ላይ በ5-10 ጊዜ ሊጨምር ይችላል ይህም የሕብረ ሕዋሳትን ይጎዳል። У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 разил ологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. በጤናማ ሰዎች ውስጥ የሲሲሲዲኤንኤ መጠን በመደበኛነት ዝቅተኛ ነው (<10 ng/mL) ነገር ግን የተለያዩ የፓቶሎጂ ባለባቸው ወይም በጭንቀት ውስጥ ባሉ ታካሚዎች ላይ በ5-10 ጊዜ ሊጨምር ይችላል ይህም ወደ ቲሹ መጎዳት ይመራል።在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL）。从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 , ccfdna 的 浓度较 低 （<10 ng/ml） 5-10 从而组织。 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) тологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. የ ccfDNA ክምችት በጤናማ ሰዎች ላይ ብዙውን ጊዜ ዝቅተኛ (<10 ng/ml) ነው፣ ነገር ግን የተለያዩ የፓቶሎጂ ወይም ውጥረት ባለባቸው ታካሚዎች ላይ ከ5-10 እጥፍ ሊጨምር ይችላል፣ ይህም የቲሹ ጉዳት ያስከትላል።የ ccfDNA ቁርጥራጮች መጠን በስፋት ይለያያል፣ ነገር ግን አብዛኛውን ጊዜ ከ150 እስከ 200 ቢፒኤ ይደርሳል።[12]በራስ የተገኘ ሲሲኤፍኤንኤ፣ ማለትም፣ ሲሲኤፍኤንኤን ከመደበኛው ወይም ከተለወጡ አስተናጋጅ ሴሎች ትንተና፣ በኒውክሌር እና/ወይም ማይቶኮንድሪያል ጂኖም ውስጥ የሚገኙትን የጄኔቲክ እና ኤፒጄኔቲክ ለውጦችን ለመለየት ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል፣በዚህም ክሊኒኮች ልዩ ሞለኪውላር ያነጣጠሩ ሕክምናዎችን [13] እንዲመርጡ ይረዳቸዋል።ነገር ግን ሲሲኤፍኤንኤ በእርግዝና ወቅት ወይም ከተተከሉ አካላት [14,15,16,17].ሲሲኤፍኤንኤ በተጨማሪም የኢንፌክሽን ወኪል (የውጭ) ኑክሊክ አሲዶች መኖርን ለመለየት የሚያስችል ጠቃሚ የመረጃ ምንጭ ነው ፣ ይህም በደም ባህል የማይታወቁ የተስፋፉ ኢንፌክሽኖችን ያለ ወራሪ ለመለየት ያስችላል ፣ የተበከለውን ቲሹ ወራሪ ባዮፕሲ ያስወግዳል [18]።በቅርብ ጊዜ የተደረጉ ጥናቶች እንደሚያሳዩት የሰው ደም የቫይራል እና የባክቴሪያ በሽታ አምጪ ተህዋስያንን ለመለየት የሚያስችል የበለጸገ የመረጃ ምንጭ እንደያዘ እና በሰው ፕላዝማ ውስጥ ከሚገኘው የሲሲኤፍኤንኤ ውስጥ 1% የሚሆነው የውጭ ምንጭ ነው [19]።እነዚህ ጥናቶች እንደሚያሳዩት የአንድ ኦርጋኒክ ዝውውር ማይክሮባዮም ብዝሃ ህይወት ሲሲኤፍኤንኤ ትንታኔን በመጠቀም ሊገመገም ይችላል።ሆኖም፣ እስከ ቅርብ ጊዜ ድረስ፣ ይህ ጽንሰ-ሐሳብ በሰዎች ላይ ብቻ ጥቅም ላይ ይውላል እና በመጠኑም ቢሆን በሌሎች አከርካሪ አጥንቶች [20፣21]።
በዚህ ጽሑፍ ውስጥ፣ ከ35 ሚሊዮን ዓመታት በፊት የተቋቋመው በትልቅ አምባ ላይ ያሉ የደሴቶች ቡድን የሆነው Aulacomya atra፣ በተለምዶ በንዑስንታርክቲክ የከርጌለን ደሴቶች ውስጥ የሚገኘውን የደቡባዊ ዝርያ የሆነውን Aulacomya atra ሲሲኤፍኤን ለመተንተን የLB አቅምን እንጠቀማለን።የእሳተ ገሞራ ፍንዳታ.በብልቃጥ የሙከራ ስርዓት በመጠቀም በባህር ውሃ ውስጥ ያሉ የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች በፍጥነት በሜሶል ተወስደው ወደ ሂሞሊምፍ ክፍል ውስጥ እንደሚገቡ ደርሰንበታል።የሾት ሽጉጥ ቅደም ተከተል እንደሚያሳየው mussel hemolymph ccfDNA የራሱ የሆነ እና የራሱ ያልሆነ የዲኤንኤ ቁርጥራጭ፣ የሲምባዮቲክ ባክቴሪያ እና የዲኤንኤ ቁርጥራጭ የቀዝቃዛ እሳተ ገሞራ የባህር ዳርቻ ስነ-ምህዳሮችን ጨምሮ።Hemolymph ccfDNA በተጨማሪም የተለያዩ አስተናጋጅ ክልሎች ካላቸው ቫይረሶች የተገኙ የቫይረስ ቅደም ተከተሎችን ይዟል።እንደ አጥንት አሳ፣ የባህር አኒሞኖች፣ አልጌ እና ነፍሳት ካሉ ከብዙ ሴሉላር እንስሳት የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን አግኝተናል።በማጠቃለያው ጥናታችን እንደሚያሳየው የ LB ጽንሰ-ሀሳብ በባህር ውስጥ ስነ-ምህዳሮች ውስጥ የበለፀገ የጂኖሚክ ሪፐርቶርን ለማመንጨት በተሳካ ሁኔታ በባህር ኢንቬቴብራቶች ላይ ሊተገበር ይችላል.
ጎልማሶች (55-70 ሚሜ ርዝመት) Mytilus platensis (M. platensis) እና Aulacomya atra (A. atra) የተሰበሰቡት ከፖርት ኦ-ፈረንሳይ (049 ° 21.235 S, 070 ° 13.490 E.) መካከል ከሚገኙት ቋጥኝ የባሕር ዳርቻዎች ነው።የከርጌለን ደሴቶች በዲሴምበር 2018 ሌሎች ጎልማሳ ሰማያዊ እንጉዳዮች (Mytilus spp.) ከንግድ አቅራቢ (PEI Mussel King Inc.፣ Prince Edward Island, Canada) የተገኙ እና በሙቀት ቁጥጥር (4°C) አየር የተሞላ ታንክ ውስጥ ከ10–20 L ከ32‰ አርቲፊሻል ብሬን ያዙ።(ሰው ሰራሽ የባህር ጨው ሪፍ ክሪስታል ፣ ፈጣን ውቅያኖስ ፣ ቨርጂኒያ ፣ አሜሪካ)።ለእያንዳንዱ ሙከራ የነጠላ ዛጎሎች ርዝመት እና ክብደት ይለካሉ.
ለዚህ ፕሮግራም ነፃ የመግቢያ ፕሮቶኮል በመስመር ላይ ይገኛል (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1)።ባጭሩ፣ LB hemolymph እንደተገለጸው ከጠለፋ ጡንቻዎች ተሰብስቧል [22]።ሄሞሊምፍ በ 1200 × g ለ 3 ደቂቃዎች በሴንትሪፍግግግ ተብራርቷል ፣ ጥቅም ላይ እስኪውል ድረስ ከፍተኛው በረዶ (-20 ° ሴ) ተደረገ።ለ cfDNA መነጠል እና ማጽዳት ናሙናዎች (1.5-2.0 ml) ይቀልጡ እና በአምራቹ መመሪያ መሰረት NucleoSnap cfDNA ኪት (ማቸሬይ-ናጌል፣ ቤተልሄን፣ ፒኤ) በመጠቀም ተዘጋጅተዋል።ተጨማሪ ትንታኔ እስኪሰጥ ድረስ ccfDNA በ -80°C ተከማችቷል።በአንዳንድ ሙከራዎች የQIAamp DNA መርማሪ ኪት (QIAGEN፣ ቶሮንቶ፣ ኦንታሪዮ፣ ካናዳ) በመጠቀም ሲሲኤፍኤንኤ ተለይቷል እና ጸድቷል።የተጣራ ዲ ኤን ኤ የተለካው መደበኛውን የ PicoGreen አሴይ በመጠቀም ነው።የገለልተኛ ሲሲኤፍኤን ቁርጭምጭሚት ስርጭት በከፍተኛ ሴንሲቲቭ ዲ ኤን ኤ ኪት በመጠቀም Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc.፣ Santa Clara, CA) በመጠቀም በካፒላሪ ኤሌክትሮፊዮርስስ ተተነተነ።ምርመራው የተካሄደው በአምራቹ መመሪያ መሰረት 1µl የሲሲኤፍኤንኤ ናሙና በመጠቀም ነው።
የሂሞሊምፍ CCfDNA ቁርጥራጮችን በቅደም ተከተል ለማስያዝ ጂኖም ኩቤክ (ሞንትሪያል፣ ኩቤክ፣ ካናዳ) የኢሉሚና ሚሴቅ PE75 ኪት ኢሉሚና ዲኤንኤ ድብልቅ ኪት በመጠቀም የተኩስ ቤተ-መጻሕፍት አዘጋጅቷል።መደበኛ አስማሚ (ባዮኦ) ጥቅም ላይ ውሏል።ጥሬ ውሂብ ፋይሎች ከNCBI ቅደም ተከተል ማንበብ መዝገብ (SRR8924808 እና SRR8924809) ይገኛሉ።FastQC [23] በመጠቀም መሰረታዊ የንባብ ጥራት ተገምግሟል።ትሪሞማቲክ [24] አስማሚዎችን ለመቁረጥ እና ለደካማ ጥራት ያለው ንባብ ጥቅም ላይ ውሏል።የተኩስ ንባብ ከተጣመሩ ጫፎች ጋር FLASH ወደ ረዣዥም ነጠላ ንባቦች በትንሹ 20 bp መደራረብ ጋር ተቀላቅለዋል [25]። የተዋሃዱ ንባቦች በቢቫልቭ NCBI Taxonomy ዳታቤዝ (e value <1e-3 እና 90% homology) በመጠቀም ከBLASTN ጋር ተብራርተዋል፣ እና ዝቅተኛ ውስብስብነት ያላቸውን ቅደም ተከተሎች መደበቅ የተከናወነው DUST [26] በመጠቀም ነው። የተዋሃዱ ንባቦች በቢቫልቭ NCBI Taxonomy ዳታቤዝ (e value <1e-3 እና 90% homology) በመጠቀም ከBLASTN ጋር ተብራርተዋል፣ እና ዝቅተኛ ውስብስብነት ያላቸውን ቅደም ተከተሎች መደበቅ የተከናወነው DUST [26] በመጠቀም ነው። Объединеные чтения были анотированы спомощью BLASTN с начение e < 1e-3 እና 90% гомологии), амаскирование последовательностей የ NCBI bivalve taxonomy ዳታቤዝ (e value <1e-3 እና 90% homology) በመጠቀም በBLASTN የተነበቡ ንባቦች ተብራርተዋል፣ እና ዝቅተኛ ውስብስብነት ቅደም ተከተል ማስክ DUST [26] በመጠቀም ተከናውኗል።使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90%复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（<1e-3 和 90% 同源）复杂度 序列 的。。。。。。。。。。蔽Объединеные чтения были анотированы спомощью BLASTN с NCBI (значение e <1e-3 እና 90% гомологии), амаскирование последовательностей низкой сложности было выпольнено . የ NCBI bivalve taxonomic ዳታቤዝ (ኢ እሴት <1e-3 እና 90% ሆሞሎጂ) በመጠቀም በBLASTN የተነበቡ ንባቦች ተብራርተዋል፣ እና ዝቅተኛ ውስብስብነት ቅደም ተከተል ማስክ DUST [26] በመጠቀም ተከናውኗል።ንባቦች በሁለት ቡድን ተከፍለዋል፡- ከቢቫልቭ ቅደም ተከተሎች ጋር የተያያዙ (እዚህ ራስን ማንበብ ተብሎ የሚጠራው) እና ያልተዛመደ (ራስ-ማንበብ ያልሆነ)።contigs ለማምረት ሁለት ቡድኖች MEGAHIT ን በመጠቀም ለየብቻ ተሰብስበዋል [27]።ይህ በእንዲህ እንዳለ፣ የታክሶኖሚክ የባዕድ ማይክሮባዮም ንባቦች ስርጭት ክራከን2 [28]ን በመጠቀም እና በጋላክሲ ላይ በክሮና አምባሻ ገበታ በግራፊክ ተወክሏል [29, 30]።ከቅድመ ሙከራዎቻችን ምርጡ ኪሜሮች ኪሜር-59 እንዲሆኑ ተወስኗል። ለመጨረሻ ማብራሪያ ከBLASTN (bivalve NCBI database፣ e value< 1e-10 እና 60% homology) ጋር በማጣጣም የራስ ቅናሾች ተለይተዋል። ለመጨረሻ ማብራሪያ ከBLASTN (bivalve NCBI database፣ e value< 1e-10 እና 60% homology) ጋር በማጣጣም የራስ ቅናሾች ተለይተዋል። Затем собственые контиги были идентифированы путем сопоставления с BLASTN 1e-10 እና гомология 60%) для окончательной аннотации. ለመጨረሻ ማብራሪያ ከBLASTN (NCBI bivalve database፣ e value <1e-10 እና 60% homology) ጋር በማዛመድ የራስ-ኮንቲግሮች ተለይተዋል።ፍንዳታ（双壳贝类NCBI 数据库， e 值< 1e-10 和60%终注释.ፍንዳታ（双壳贝类NCBI 数据库， e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифированы собственные контиги ዳይ вустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 እና гомология 60%). ከBLASTN (NCBI bivalve database፣ e value <1e-10 እና 60% homology) ጋር በማጣመር ለመጨረሻ ማብራሪያ የራስ-ኮንቲግ ተለይቷል። በትይዩ፣ የራስ ያልሆኑ ቡድኖች በBLASTN (nt NCBI database፣ e value <1e-10 እና 60% homology) ተብራርተዋል። በትይዩ፣ የራስ ያልሆኑ ቡድኖች በBLASTN (nt NCBI database፣ e value <1e-10 እና 60% homology) ተብራርተዋል። Параллельно чужеродные групповые контиги были анотированы с помощью BLASTN (база данных NT NCBI, значe%). . በትይዩ፣ የውጪ ቡድን contigs በBLASTN (NT NCBI ጎታ፣ e እሴት <1e-10 እና 60% homology) ተብራርቷል።平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственой группе, были аннотированы с помощью BLASTN 0 እና гомология 60%)። በትይዩ፣ የራስ ያልሆኑ ቡድኖች በBLASTN (nt NCBI database፣ e value <1e-10 እና 60% homology) ተብራርተዋል። BLASTX እንዲሁ የተካሄደው nr እና RefSeq ፕሮቲን NCBI የውሂብ ጎታዎችን (ሠ እሴት <1e-10 እና 60% homology) በመጠቀም ራስን ባልሆኑ ኮንቲግዎች ላይ ነው። BLASTX እንዲሁ የተካሄደው nr እና RefSeq ፕሮቲን NCBI የውሂብ ጎታዎችን (ሠ እሴት <1e-10 እና 60% homology) በመጠቀም ራስን ባልሆኑ ኮንቲግዎች ላይ ነው። BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах сиспользованием баз данных белка nr እና RefSeq NCBI0 60%) BLASTX እንዲሁ የ nr እና RefSeq NCBI ፕሮቲን ዳታቤዝ (ኢ እሴት <1e-10 እና 60% homology) በመጠቀም ራስን ባልሆኑ ኮንቲግዎች ላይ ተከናውኗል።还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 吧还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 吧 BLASTX скачать видео - . BLASTX እንዲሁ የ nr እና RefSeq NCBI ፕሮቲን ዳታቤዝ (ኢ እሴት <1e-10 እና 60% homology) በመጠቀም ራስን ባልሆኑ ኮንቲግዎች ላይ ተከናውኗል።የBLASTN እና BLASTX ገንዳዎች የራስ-ያልሆኑ ኮንቲግሮች የመጨረሻውን ኮንቲግ ይወክላሉ (ተጨማሪ ፋይልን ይመልከቱ)።
ለ PCR ጥቅም ላይ የዋሉ ፕሪመርሮች በሰንጠረዥ S1 ውስጥ ተዘርዝረዋል.Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada፣ Markham፣ On) የሲሲኤፍኤን ኢላማ ጂኖችን ለማጉላት ስራ ላይ ውሏል።የሚከተሉት የምላሽ ሁኔታዎች ጥቅም ላይ ውለዋል፡ denaturation በ 95°C ለ 3 ደቂቃ፣ 95°C ለ 1ደቂቃ፣ 95°C ለ 1ደቂቃ፣የማስወገድ ሙቀት ለ1 ደቂቃ፣ 72°C ለ 1 ደቂቃ ማራዘም፣ 35 ዑደቶች፣ እና በመጨረሻም 72°C በ10 ደቂቃ ውስጥ።.የ PCR ምርቶች በ 95 V በ SYBRTM ደህንነቱ የተጠበቀ ዲ ኤን ኤ ጄል ስታይን (ኢንቪትሮጅን ፣ በርሊንግተን ፣ ኦን ፣ ካናዳ) በያዙ አጋሮዝ ጄል (1.5%) በኤሌክትሮፊዮሬሲስ ተለያይተዋል።
ሙስሎች (Mytilus spp.) በ 500 ሚሊር ኦክሲጅን የባህር ውሃ (32 PSU) ውስጥ ለ 24 ሰአታት በ 4 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ተከማችተዋል.የሰው ጋላክቲን-7 ሲዲኤንኤ ቅደም ተከተል (NCBI accession number L07769) በኮድ የሚይዝ ፕላስሚድ ዲ ኤን ኤ በመጨረሻው 190 μg/μl ወደ ጠርሙሱ ውስጥ ተጨምሯል።ዲ ኤን ኤ ሳይጨምር በተመሳሳይ ሁኔታ የተከተቡ እንጉዳዮች ቁጥጥር ነበሩ።ሦስተኛው የመቆጣጠሪያ ታንኳ ያለ ሙሴሎች ዲ ኤን ኤ ይዟል.በባህር ውሃ ውስጥ ያለውን የዲ ኤን ኤ ጥራት ለመቆጣጠር የባህር ውሃ ናሙናዎች (20 μl; ሶስት ድግግሞሽ) ከእያንዳንዱ ማጠራቀሚያ በተጠቀሰው ጊዜ ተወስደዋል.ለፕላዝሚድ ዲኤንኤ መከታተያ፣ LB mussels በተጠቀሰው ጊዜ ተሰብስቦ በqPCR እና ddPCR ተተነተነ።በባህር ውሃ ውስጥ ባለው ከፍተኛ የጨው ይዘት ምክንያት, ሁሉም PCR ምርመራዎች ከመደረጉ በፊት, aliquots በ PCR ጥራት ባለው ውሃ (1:10) ውስጥ ተጨምረዋል.
ዲጂታል ነጠብጣብ PCR (ddPCR) የተከናወነው የባዮራድ QX200 ፕሮቶኮል (ሚሲሳውጋ፣ ኦንታሪዮ፣ ካናዳ) በመጠቀም ነው።ከፍተኛውን የሙቀት መጠን (ሠንጠረዥ S1) ለመወሰን የሙቀት መገለጫውን ይጠቀሙ።ጠብታዎች በQX200 ጠብታ ጀነሬተር (ባዮራድ) ተጠቅመዋል።ddPCR በሚከተለው መልኩ ተካሂዷል፡ 95°C ለ 5 ደቂቃ፣ 50 ዑደቶች 95°C ለ 30 ሰከንድ እና የተሰጠ የማስታወሻ ሙቀት ለ 1 ደቂቃ እና 72°C ለ 30 ሰ፣ 4°C ለ 5 ደቂቃ እና 90°C በ5 ደቂቃ ውስጥ።ጠብታዎች እና አወንታዊ ምላሾች (የቅጂዎች ብዛት/µl) የሚለካው በQX200 ጠብታ አንባቢ (ባዮራድ) ነው።ከ10,000 ያነሰ ጠብታዎች ያላቸው ናሙናዎች ውድቅ ተደረገ።ddPCR በተሰራ ቁጥር የስርዓተ-ጥለት ቁጥጥር አይደረግም።
qPCR የተከናወነው በRotor-Gene® 3000 (Corbett Research፣ Sydney፣ Australia) እና LGALS7 የተወሰኑ ፕሪመርሮችን በመጠቀም ነው።ሁሉም የቁጥር PCRዎች በ20 μl የ QuantiFast SYBR አረንጓዴ PCR ኪት (QIAGEN) በመጠቀም ተካሂደዋል።qPCR በ15 ደቂቃ መክተፊያ በ95°ሴ ከዚያም 40 ዑደቶች በ95°ሴ ለ10 ሰከንድ እና በ60°C ለ 60 ሰከንድ በአንድ መረጃ መሰብሰብ ተጀምሯል።የማቅለጥ ኩርባዎች በ 95 ° ሴ ለ 5 ሰከንድ, 65 ° ሴ ለ 60 ሰከንድ እና 97 ° ሴ በ qPCR መጨረሻ ላይ ተከታታይ መለኪያዎችን በመጠቀም ተፈጥረዋል.ከቁጥጥር ናሙናዎች በስተቀር እያንዳንዱ qPCR በሶስት እጥፍ ተካሂዷል።
እንጉዳዮች በከፍተኛ የማጣሪያ ፍጥነታቸው ስለሚታወቁ በመጀመሪያ በባህር ውሃ ውስጥ የሚገኙትን የዲኤንኤ ቁርጥራጮች አጣርተው ማቆየት ይችሉ እንደሆነ መርምረናል።በተጨማሪም እነዚህ ቁርጥራጮች በከፊል ክፍት በሆነው የሊንፋቲክ ስርዓታቸው ውስጥ ይከማቹ እንደሆነ ለማወቅ ፍላጎት ነበረን።በሰማያዊ የሙሰል ታንኮች ላይ የተጨመሩትን የሚሟሟ የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮችን እጣ ፈንታ በመፈለግ ይህንን ችግር በሙከራ ፈታነው።የዲኤንኤ ቁራጮችን ለመከታተል ለማመቻቸት የሰው ጋላክቲን-7 ጂንን የያዘ የውጭ (የራስ ያልሆነ) ፕላዝማዲ ዲ ኤን ኤ ተጠቀምን።ddPCR በባህር ውሃ እና ሙሴሎች ውስጥ ያሉ የፕላዝማ ዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮችን ይከታተላል።ውጤታችን እንደሚያሳየው በባህር ውሃ ውስጥ ያለው የዲኤንኤ ቁርጥራጭ መጠን በጊዜ ሂደት (እስከ 7 ቀናት) እንጉዳዮች በማይኖሩበት ጊዜ በአንፃራዊነት ከቀጠለ ፣በእንጉዳዮች ፊት ይህ ደረጃ በ 8 ሰዓታት ውስጥ ከሞላ ጎደል ሙሉ በሙሉ ጠፋ (ምስል 1 ሀ ፣ ለ)።ውጫዊ የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች በቀላሉ በ 15 ደቂቃ ውስጥ በውስጣዊ ፈሳሽ እና በሂሞሊምፍ (ምስል 1 ሐ) ውስጥ ተገኝተዋል.እነዚህ ቁርጥራጮች ከተጋለጡ ከ 4 ሰዓታት በኋላ አሁንም ሊገኙ ይችላሉ.ይህ የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን በተመለከተ የማጣራት ስራ ከባክቴሪያ እና አልጌዎች የማጣራት ስራ ጋር ተመጣጣኝ ነው።እነዚህ ውጤቶች እንደሚጠቁሙት ሙሴሎች በፈሳሽ ክፍሎቻቸው ውስጥ የውጭ ዲ ኤን ኤ በማጣራት እና በማጠራቀም.
አንጻራዊ የፕላዝሚድ ዲ ኤን ኤ በባሕር ውሀ ውስጥ (A) ወይም መቅረት (B) ሙስሎች ሲኖሩ፣ በddPCR የሚለካ።በ A, ውጤቶቹ እንደ መቶኛ ይገለፃሉ, የሳጥኖቹ ድንበሮች 75 ኛ እና 25 ኛ መቶኛን ይወክላሉ.የተገጠመው የሎጋሪዝም ኩርባ በቀይ ይታያል፣ እና በግራጫው ጥላ የተሸፈነው ቦታ 95% በራስ የመተማመንን ልዩነት ያሳያል።በ B ውስጥ፣ ቀይ መስመር አማካኙን ይወክላል እና ሰማያዊው መስመር 95% የመተማመን ክፍተትን ይወክላል።C የፕላስሚድ ዲ ኤን ኤ ከተጨመረ በኋላ በተለያዩ ጊዜያት በሂሞሊምፍ እና በ ቫልቭ ሙስሎች ውስጥ የፕላስሚድ ዲ ኤን ኤ ማከማቸት.ውጤቶቹ እንደ ፍፁም ቅጂዎች ቀርበዋል/ml (± SE)።
በመቀጠል፣ በኬርጌለን ደሴቶች ላይ ከሚገኙት ሙዝል አልጋዎች በተሰበሰቡ እንጉዳዮች ውስጥ የ ccfDNA አመጣጥን መርምረናል፣ የርቀት ደሴቶች ቡድን ውስን የሆነ በሰዎች ላይ ተጽዕኖ ያሳድራል።ለዚሁ ዓላማ፣ ከ mussel hemolymphs ሲሲዲኤንኤ ተነጥሎ እና በተለምዶ የሰውን ሲሲዲኤንኤ [32፣ 33] ለማጣራት በሚጠቀሙባቸው ዘዴዎች ተጠርጓል።በጡንቻዎች ውስጥ ያለው አማካይ የሂሞሊምፍ CCfDNA ውህዶች ዝቅተኛ ማይክሮግራም በአንድ ሚሊር የሂሞሊምፍ ክልል ውስጥ እንዳሉ አግኝተናል (ሠንጠረዥ S2፣ ተጨማሪ መረጃ ይመልከቱ)።ይህ የስብስብ መጠን ከጤናማ ሰዎች (ዝቅተኛ ናኖግራም በአንድ ሚሊ ሊትር) በጣም ትልቅ ነው፣ ነገር ግን አልፎ አልፎ፣ በካንሰር በሽተኞች ውስጥ፣ የሲሲኤፍኤንኤ መጠን በአንድ ሚሊር ብዙ ማይክሮግራም ሊደርስ ይችላል [34, 35].የ hemolymph ccfDNA መጠን ስርጭት ትንተና እንደሚያሳየው እነዚህ ቁርጥራጮች በመጠን መጠናቸው ከ 1000 bp እስከ 1000 bp ይለያያል።እስከ 5000 ቢፒፒ (ምስል 2).ተመሳሳይ ውጤቶች የተገኙት በሲሊካ ላይ የተመሰረተ QIAamp መርማሪ ኪት በመጠቀም ነው፣ይህም በተለምዶ በፎረንሲክ ሳይንስ የጂኖሚክ ዲኤንኤን ከዝቅተኛ ትኩረት የዲኤንኤ ናሙናዎች በፍጥነት ለመለየት እና ለማጽዳት፣ሲሲኤፍዲኤንኤን [36] ጨምሮ።
የሙስል ሄሞሊምፍ ተወካይ ሲሲኤፍኤንኤ ኤሌክትሮፎረግራም።በNucleoSnap Plasma Kit (ከላይ) እና በQIAamp DNA መርማሪ ኪት የወጣ።የቢ ቫዮሊን ሴራ የሂሞሊምፍ ccfDNA ክምችት (± SE) በሙስሎች ውስጥ መሰራጨቱን ያሳያል።ጥቁር እና ቀይ መስመሮች እንደ ቅደም ተከተላቸው መካከለኛውን እና የመጀመሪያዎቹን እና ሦስተኛውን አራተኛውን ይወክላሉ.
በግምት 1% የሚሆነው የሲሲኤፍኤንኤ በሰዎች እና በፕሪምቶች ውስጥ የውጭ ምንጭ አለው [21, 37].ከፊል ክፍት የሆነው የቢቫልቭ የደም ዝውውር ሥርዓት፣ በማይክሮቢያል የበለጸገ የባህር ውሃ እና የሙሰል ሲሲኤፍኤንኤ መጠን ስርጭትን ስንመለከት፣ የ mussel hemolymph ccfDNA የበለፀገ እና የተለያየ የማይክሮቢያል ዲ ኤን ኤ ገንዳ ሊይዝ እንደሚችል ገምተናል።ይህንን መላምት ለመፈተሽ ከኬርጌለን ደሴቶች ከተሰበሰቡት Aulacomya atra ናሙናዎች ሄሞሊምፍ ሲሲኤፍዲኤንኤ በቅደም ተከተል አቅርበን ከ10 ሚሊዮን በላይ ንባቦችን አፍርተናል፣ 97.6% ያህሉ የጥራት ቁጥጥር አልፈዋል።ከዚያም የBLASTN እና NCBI bivalve ዳታቤዝ (ምስል S1፣ ተጨማሪ መረጃ) በመጠቀም ንባቦቹ በራስ እና በራስ ባልሆኑ ምንጮች ተከፋፈሉ።
በሰዎች ውስጥ ሁለቱም የኒውክሌር እና ሚቶኮንድሪያል ዲ ኤን ኤ ወደ ደም ውስጥ ሊለቀቁ ይችላሉ [38].ነገር ግን፣ አሁን ባለው ጥናት፣ የ A. atra ጂኖም ቅደም ተከተል ወይም ገለጻ ባለመሆኑ፣ የሙሴሎች የኑክሌር ጂኖሚክ ዲኤንኤ በዝርዝር መግለጽ አልተቻለም።ነገር ግን የቢቫልቭ ቤተ መፃህፍትን (ምስል ኤስ 2፣ ተጨማሪ መረጃ) በመጠቀም የራሳችንን ምንጭ የሆኑ በርካታ የሲሲኤፍኤንኤን ቁርጥራጮች መለየት ችለናል።እንዲሁም በቅደም ተከተላቸው የነበሩትን የኤ.አትራ ጂኖችን በማጉላት የራሳችን የዲኤንኤ ቁርጥራጮች መኖራቸውን አረጋግጠናል (ምስል 3)።በተመሳሳይ፣ የ A. atra ሚቶኮንድሪያል ጂኖም በሕዝብ የውሂብ ጎታዎች ውስጥ ስለሚገኝ፣ አንድ ሰው የ A. atra hemolymph ውስጥ ሚቶኮንድሪያል ሲሲኤፍኤንኤ ቁርጥራጮች መኖራቸውን የሚያሳይ ማስረጃ ማግኘት ይችላል።የ mitochondrial DNA ቁርጥራጮች መኖራቸው በ PCR ማጉያ (ምስል 3) ተረጋግጧል.
የተለያዩ ሚቶኮንድሪያል ጂኖች በ A. atra (ቀይ ነጥቦች - የአክሲዮን ቁጥር: SRX5705969) እና M. platensis (ሰማያዊ ነጥቦች - የአክሲዮን ቁጥር: SRX5705968) በ PCR የተጨመረው በሂሞሊምፍ ውስጥ ይገኛሉ.ምስል ከ Breton et al.፣ 2011 B የሂሞሊምፍ ሱፐርናታንት ከኤ.ኤትራ በኤፍቲኤ ወረቀት ላይ ተከማችቷል።የ PCR ድብልቅን ወደያዘው PCR ቱቦ በቀጥታ ለመጨመር የ3 ሚሜ ጡጫ ይጠቀሙ።
በባህር ውሃ ውስጥ የተትረፈረፈ ረቂቅ ተሕዋስያን ይዘትን ከግምት ውስጥ በማስገባት መጀመሪያ ላይ በሂሞሊምፍ ውስጥ የሚገኙትን ረቂቅ ተሕዋስያን የዲ ኤን ኤ ቅደም ተከተሎችን በመለየት ላይ አተኩረን ነበር.ይህንን ለማድረግ ሁለት የተለያዩ ስልቶችን እንጠቀማለን.የመጀመሪያው ስልት ክራከን 2ን ተጠቅሟል፣ በአልጎሪዝም ላይ የተመሰረተ ተከታታይ ምደባ ፕሮግራም ከBLAST እና ከሌሎች መሳሪያዎች ጋር ሊወዳደር የሚችል ጥቃቅን ቅደም ተከተሎችን መለየት ይችላል።ከ 6719 በላይ ንባቦች የባክቴሪያ ምንጭ እንደሆኑ ተወስነዋል, 124 እና 64 ደግሞ ከአርኬያ እና ቫይረሶች እንደቅደም ተከተላቸው (ምስል 4).በጣም የበለፀጉ የባክቴሪያ ዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች Firmicutes (46%) ፣ ፕሮቲዮባክቴሪያ (27%) እና ባክቴሮይድስ (17%) (ምስል 4 ሀ) ናቸው።ይህ ስርጭቱ ከቀደምት ጥናቶች ጋር የተጣጣመ ነው የባህር ሰማያዊ ሙስሉ ማይክሮባዮም [39, 40].Gammaproteobacteria ብዙ Vibrionales (ምስል 4 ለ) ጨምሮ የፕሮቲዮባክቴሪያ ዋና ክፍል (44%) ነበሩ።የ ddPCR ዘዴ በሲሲኤፍዲኤንኤ የ A. atra hemolymph (ምስል 4c) [41] ውስጥ የ Vibrio DNA ቁርጥራጮች መኖራቸውን አረጋግጧል።ስለ ccfDNA ባክቴሪያ አመጣጥ የበለጠ መረጃ ለማግኘት ተጨማሪ አቀራረብ ተወሰደ (ምስል S2፣ ተጨማሪ መረጃ)። በዚህ አጋጣሚ፣ የተደራረቡ አንባቢዎች እንደ ተጣማጅ-መጨረሻ ንባብ ተሰብስበው ከራስ (ቢቫልቭስ) ወይም ከራስ-ነክ ያልሆኑ መነሻዎች BLASTN እና ኢ እሴት 1e−3 እና በ>90% ሆሞሎጂ ተቆርጠዋል። በዚህ አጋጣሚ፣ የተደራረቡ አንባቢዎች እንደ ተጣማጅ-መጨረሻ ንባብ ተሰብስበው ከራስ (ቢቫልቭስ) ወይም ከራስ-ነክ ያልሆኑ መነሻዎች BLASTN እና ኢ እሴት 1e−3 እና በ>90% ሆሞሎጂ ተቆርጠዋል። В этом слайче прекрывися чтиния ቢሊ ሶብራንይ ካክ ቺቴንስ ворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения соги9. በዚህ አጋጣሚ፣ ተደራራቢ ንባቦች እንደ ተጣማጅ-መጨረሻ ንባቦች ተሰብስበው እንደ ቤተኛ (ቢቫልቭ) ወይም ኦሪጅናል ያልሆኑ BLASTN እና e ዋጋ 1e-3 በመጠቀም ተመድበዋል እና በ>90% ሆሞሎጂ ተቆርጧል።在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3的e 值和>90%为自身（双壳类）或非自身来源。在 Facebook 上。 如要連結 使用 使用 使用 blastn 倌用 9% 的 展开源性 的 分类 自身（双 壳类） 非 自身。 В этом слайчай прекрывися чтениya ቢሊ ሶብራንይ ካንቺ ቺቺንያ тые моллюски) или несобственные по происхождению በዚህ አጋጣሚ፣ ተደራራቢ ንባቦች እንደ ተጣመሩ-የተጠናቀቁ ንባቦች ተሰብስበው እንደራሳቸው (ቢቫልቭስ) ወይም ኦሪጅናል ያልሆኑ e BLASTN እና 1e-3 እሴቶችን እና የግብረ-ሰዶማዊነት ደረጃ>90% ተመድበዋል።የ A. atra ጂኖም ገና ተከታታይ ስላልሆነ፣ የMEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) ሰብሳቢውን የዴ ኖቮ የመሰብሰቢያ ስልት ተጠቀምን።በድምሩ 147,188 contigs እንደ ጥገኛ (ቢቫልቭስ) አመጣጥ ተለይቷል።እነዚህ ውቅረቶች BLASTN እና BLASTXን በመጠቀም በ1e-10 ኢ-እሴቶች ፈንድተዋል።ይህ ስልት በ A. atra ccfDNA ውስጥ የሚገኙትን 482 ቢቫልቭ ያልሆኑ ቁርጥራጮችን እንድንለይ አስችሎናል።ከእነዚህ ውስጥ ከግማሽ በላይ (57%) የሚሆኑት የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች የተገኙት በባክቴሪያ ነው፣ በዋናነት ከጊል ሲምቢዮንስ፣ ከሰልፎትሮፊክ ሲምቢዮንስ፣ እና ከጊል ሲምቢዮኖች Solemya velum (ምስል 5)።
በአይነት ደረጃ አንጻራዊ የተትረፈረፈ.B የሁለት ዋና ዋና ፊላዎች (Firmicutes እና Proteobacteria) የማይክሮባዮል ልዩነት።የ ddPCR C Vibrio spp ተወካይ ማጉላት.ሀ. የ16S አር ኤን ኤ ጂን (ሰማያዊ) ቁርጥራጮች በሶስት አትራ ሄሞሊምፍ።
በአጠቃላይ 482 የተሰበሰቡ ኮንቴይተሮች ተተነተኑ።የሜታጂኖሚክ ኮንቲግ ማብራሪያዎች የታክሶኖሚክ ስርጭት አጠቃላይ መገለጫ (ፕሮካርዮት እና ዩካርዮት)።B በBLASTN እና BLASTX ተለይተው የታወቁ የባክቴሪያ ዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች ዝርዝር ስርጭት።
የ Kraken2 ትንታኔ እንደሚያሳየው mussel ccfDNA ጥንታዊ የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮችን እንደያዘ፣ እነዚህም የዩርያርካዮታ (65%) የዲኤንኤ ቁርጥራጮች፣ Crenarchaeota (24%) እና Thaurmarcheota (11%) (ምስል 6a) ጨምሮ።ቀደም ሲል በካሊፎርኒያ ሙስሉስ ማይክሮቢያል ማህበረሰብ ውስጥ ከዩርያርቻኦታ እና ክሬናርቻኦታ የተገኙ የዲኤንኤ ቁርጥራጮች መኖራቸው ሊያስደንቅ አይገባም [42]።ምንም እንኳን Euryarchaeota ብዙውን ጊዜ ከአስከፊ ሁኔታዎች ጋር የተቆራኘ ቢሆንም አሁን ግን ሁለቱም Euryarchaeota እና Crenarcheota በባህር ውስጥ ክሪዮጂኒካዊ አከባቢ ውስጥ በጣም ከተለመዱት ፕሮካርዮቶች መካከል እንደሆኑ ተረድቷል [43, 44].በቅርብ ጊዜ በከርጌለን ፕላቱ ላይ ከፍተኛ የሆነ የሚቴን ፍንጣቂዎች [45] እና በኬርጌለን ደሴቶች የባህር ዳርቻ ላይ ሊታዩ የሚችሉ ማይክሮቢያል ሚቴን መመረቶችን በተመለከተ ከቅርብ ጊዜ ሪፖርቶች አንጻር የሜታኖጅኒክ ረቂቅ ተሕዋስያን በጡንቻዎች ውስጥ መኖራቸው የሚያስደንቅ አይደለም።
ትኩረታችን ከዲኤንኤ ቫይረሶች ወደ ንባቦች ተለወጠ።እስከምናውቀው ድረስ፣ ይህ ከዒላማ ውጭ የሆነው የሜሴል ቫይረስ ይዘት የመጀመሪያው ጥናት ነው።እንደተጠበቀው, የባክቴሪዮፋጅስ (Caudovirales) የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች አግኝተናል (ምስል 6 ለ).ይሁን እንጂ በጣም የተለመደው የቫይረስ ዲ ኤን ኤ የሚመጣው ከማንኛውም ቫይረስ ትልቁ ጂኖም ካለው የኑክሌር ሳይቶፕላስሚክ ትልቅ ዲ ኤን ኤ ቫይረስ (ኤን.ሲ.ኤል.ዲ.ቪ) በመባል ከሚታወቀው የኑክሊዮሳይቶ ቫይረስ ፋይለም ነው።በዚህ ፋይለም ውስጥ፣ አብዛኛዎቹ የዲኤንኤ ቅደም ተከተሎች ሚሚሚዶቪሪዳ (58%) እና ፖክስቪሪዳኢ (21%)፣ የተፈጥሮ አስተናጋጆቻቸው አከርካሪዎችን እና አርትሮፖዶችን ያጠቃልላሉ፣ ከእነዚህ የዲኤንኤ ቅደም ተከተሎች መካከል ጥቂቱ ክፍል የታወቁት የቫይሮሎጂ አልጌዎች ናቸው።የባሕር eukaryotic algae ይጎዳል።ቅደም ተከተሎቹም የተገኙት ከፓንዶራ ቫይረስ፣ ከማንኛውም የታወቀ የቫይረስ ዝርያ ትልቁ የጂኖም መጠን ካለው ግዙፉ ቫይረስ ነው።የሚገርመው፣ በሄሞሊምፍ ccfDNA ቅደም ተከተል የሚወሰነው በቫይረሱ ​​የተለከፉ የአስተናጋጆች ክልል በአንጻራዊነት ትልቅ ነበር (ምስል S3፣ ተጨማሪ መረጃ)።እንደ Baculoviridae እና Iridoviridae ያሉ ነፍሳትን የሚያጠቁ ቫይረሶችን እንዲሁም አሜባ፣ አልጌ እና አከርካሪ አጥንቶችን የሚያጠቁ ቫይረሶችን ያጠቃልላል።እንዲሁም ከ Pithovirus sibericum ጂኖም ጋር የሚዛመዱ ቅደም ተከተሎችን አግኝተናል።Pitoviruses (እንዲሁም “ዞምቢ ቫይረሶች” በመባልም የሚታወቁት) ከ 30,000 ዓመት ዕድሜ ያለው በሳይቤሪያ [47] ከፐርማፍሮስት ተለይተዋል።ስለዚህ ውጤታችን ከቀደምት ሪፖርቶች ጋር የሚስማማ ነው እነዚህ ቫይረሶች ሁሉም ዘመናዊ ዝርያዎች አልጠፉም [48] እና እነዚህ ቫይረሶች በሩቅ የከርሰ ምድር ባህር ውስጥ ሊገኙ ይችላሉ.
በመጨረሻም፣ ከሌሎች ባለ ብዙ ሴሉላር እንስሳት የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን ማግኘት እንችል እንደሆነ ለማየት ሞከርን።በ BLASTN እና BLASTX በጠቅላላ 482 የውጭ ኮንቴይች በኤንቲ፣ nr እና RefSeq ቤተ-መጻሕፍት (ጂኖሚክ እና ፕሮቲን) ተለይተዋል።ውጤታችን እንደሚያሳየው ከሲ.ሲ.ኤፍ.ኤን.ኤ ዲኤንኤ የባለብዙ ሴሉላር እንስሳት ዲ ኤን ኤ የአጥንት አጥንቶች የበላይ መሆኑን ያሳያል (ምስል 5)።ከነፍሳት እና ከሌሎች ዝርያዎች የተገኙ የዲኤንኤ ቁርጥራጮችም ተገኝተዋል.በአንፃራዊነት ትልቅ የዲኤንኤ ክፍልፋዮች አልታወቁም፣ ምናልባትም በጂኖሚክ ዳታቤዝ ውስጥ ብዙ ቁጥር ያላቸው የባህር ላይ ዝርያዎች ከመሬት ላይ ካሉ ዝርያዎች ጋር ሲነፃፀሩ [49]።
በዚህ ጽሑፍ ውስጥ፣ የ LB ጽንሰ-ሐሳብን በሙሴሎች ላይ እንተገብራለን፣ የሂሞሊምፍ ሲሲኤፍኤንኤ ሾት ቅደም ተከተል ስለ ባህር ዳርቻ ሥነ-ምህዳሮች ስብጥር ግንዛቤን ይሰጣል።በተለይም 1) የ mussel hemolymph በአንጻራዊነት ከፍተኛ መጠን ያለው (~ 1-5 ኪ.ቢ.) የሚዘዋወሩ የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮችን (ማይክሮግራም ደረጃዎችን) እንደያዘ አስተውለናል;2) እነዚህ የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች እራሳቸውን የቻሉ እና ገለልተኛ ያልሆኑ ናቸው 3) ከእነዚህ የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች የውጭ ምንጮች መካከል ባክቴሪያ ፣ አርኪዮል እና ቫይራል ዲ ኤን ኤ እንዲሁም የሌሎች ብዙ ሴሉላር እንስሳት ዲ ኤን ኤ አገኘን ።4) በሄሞሊምፍ ውስጥ የእነዚህ የውጭ ሲሲኤፍኤንኤን ቁርጥራጮች ማከማቸት በፍጥነት ይከሰታል እና ለሙሽሎች ውስጣዊ ማጣሪያ እንቅስቃሴ አስተዋጽኦ ያደርጋል።በማጠቃለያው ጥናታችን እንደሚያሳየው የኤልቢ ጽንሰ-ሀሳብ እስካሁን ድረስ በዋናነት በባዮሜዲኪን መስክ ውስጥ ሲተገበር የበለፀገ ግን ያልተመረመረ የእውቀት ምንጭ በሴቲንነል ዝርያዎች እና በአካባቢያቸው መካከል ያለውን ግንኙነት የበለጠ ለመረዳት ያስችላል።
ከአሳዳጊዎች በተጨማሪ፣ አይጥ፣ ውሾች፣ ድመቶች፣ እና ፈረሶችን ጨምሮ የሲሲኤፍኤንኤን ማግለል በአጥቢ እንስሳት ላይ ሪፖርት ተደርጓል [50፣ 51, 52]።ነገር ግን፣ እንደእኛ እውቀት፣ ክፍት የደም ዝውውር ስርዓት ባላቸው የባህር ዝርያዎች ውስጥ የሲሲኤፍኤንኤ ምርመራ እና ቅደም ተከተል ሪፖርት ለማድረግ ጥናታችን የመጀመሪያው ነው።ይህ የአናቶሚካል ባህሪ እና የእንጉዳይ የማጣራት ችሎታ ከሌሎች ዝርያዎች ጋር ሲወዳደር ቢያንስ በከፊል የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን የሚዘዋወሩ የተለያዩ የመጠን ባህሪያትን ሊያብራራ ይችላል.በሰዎች ውስጥ, በደም ውስጥ የሚዘዋወሩ አብዛኛዎቹ የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች ከ 150 እስከ 200 ቢፒቢ መጠን ያላቸው ትናንሽ ቁርጥራጮች ናቸው.ከፍተኛው 167 ቢፒፒ [34፣53]።ትንሽ ነገር ግን ጉልህ የሆነ የዲኤንኤ ክፍልፋዮች በ 300 እና 500 bp መካከል ሲሆኑ 5% ያህሉ ከ900 ቢፒፒ በላይ ይረዝማሉ።[54]የዚህ መጠን ስርጭት ምክንያት በፕላዝማ ውስጥ ያለው የ ccfDNA ዋና ምንጭ የሚከሰተው በሴል ሞት ምክንያት ነው, በሴል ሞት ወይም በጤናማ ሰዎች ውስጥ በሚዘዋወሩ የሂሞቶፔይቲክ ሴሎች ኒክሮሲስ ወይም በካንሰር በሽተኞች ውስጥ በሚገኙ ዕጢ ሴሎች አፖፕቶሲስ (በ circulating tumor DNA በመባል ይታወቃል).፣ ctDNA)።በሙሰል ውስጥ ያገኘነው የሂሞሊምፍ ሲሲኤፍኤንኤ መጠን ስርጭት ከ1000 እስከ 5000 ቢፒፒ ሲሆን ይህም የሙስል ሲሲኤፍኤንኤ አመጣጥ የተለየ መሆኑን ይጠቁማል።ይህ አመክንዮአዊ መላምት ነው፣ ምክንያቱም እንጉዳዮች ከፊል ክፍት የሆነ የደም ቧንቧ ስርዓት ስላላቸው እና ከፍተኛ መጠን ያለው ማይክሮቢያል ጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ በያዙ በውሃ ውስጥ የሚኖሩ ናቸው።እንደ እውነቱ ከሆነ የውጭ ዲ ኤን ኤ በመጠቀም የላብራቶሪ ሙከራችን እንደሚያሳየው ሙሴሎች የዲ ኤን ኤ ፍርስራሾችን በባህር ውሃ ውስጥ ይሰበስባሉ፣ ቢያንስ ከጥቂት ሰዓታት በኋላ ሴሉላር ከተወሰደ በኋላ ይበላሻሉ እና/ወይም ከተለቀቁ እና/ወይም በተለያዩ ድርጅቶች ውስጥ ይከማቻሉ።የሴሎች (የፕሮካርዮቲክ እና የዩካሪዮቲክ) ውስንነት አንፃር፣ የ intravalvular ክፍሎችን መጠቀም ከራስ ምንጮች እንዲሁም ከውጭ ምንጮች የሚገኘውን የሲሲኤፍኤን መጠን ይቀንሳል።የ bivalve innate immunity አስፈላጊነት እና ብዛት ያላቸውን የደም ዝውውር ፋጎሳይቶች ከግምት ውስጥ በማስገባት፣ የውጭ ሲሲኤፍኤንኤ እንኳን ረቂቅ ህዋሳትን እና/ወይም ሴሉላር ፍርስራሾችን ወደ ውስጥ በሚገቡበት ጊዜ የውጭ ዲ ኤን ኤ የሚከማቸውን ፋጎሳይት በማሰራጨት የበለፀገ መሆኑን ገምተናል።አንድ ላይ ውጤታችን እንደሚያሳየው ቢቫልቭ ሄሞሊምፍ ሲሲኤፍኤንኤ ልዩ የሞለኪውላር መረጃ ማከማቻ እንደሆነ እና እንደ ሴቲንኤል ዝርያ ያላቸውን ደረጃ ያጠናክራል።
የኛ መረጃ እንደሚያመለክተው በባክቴሪያ የተገኘ የሂሞሊምፍ CCfDNA ቁርጥራጭ ቅደም ተከተል እና ትንተና ስለ አስተናጋጅ ባክቴሪያ እፅዋት እና በአካባቢው የባህር ውስጥ ስነ-ምህዳር ውስጥ ስላሉት ባክቴሪያዎች ቁልፍ መረጃ ይሰጣል።የተኩስ ቅደም ተከተል ቴክኒኮች የ commensal ባክቴሪያ A. atra gill ቅደም ተከተሎችን አሳይተዋል፣ ይህም የተለመደው የ16S አር ኤን ኤ መለያ ዘዴዎች ጥቅም ላይ ቢውሉ ያመለጡ ነበር፣ ይህም በከፊል በማጣቀሻ ቤተ-መጽሐፍት አድልዎ ምክንያት።እንደ እውነቱ ከሆነ፣ ከኤም.ፕላንትሲስ የተሰበሰበውን የኤልቢ መረጃ መጠቀማችን በኬርጌለን በሚገኘው የሙሰል ሽፋን ውስጥ የጊል-ተያያዥ የባክቴሪያ ሲምቢዮንስ ስብጥር ለሁለቱም የሙዝል ዝርያዎች አንድ ዓይነት መሆኑን ያሳያል (ምስል S4 ፣ ተጨማሪ መረጃ)።ይህ የሁለት የዘረመል የተለያዩ እንጉዳዮች መመሳሰል በኬርጌለን ቀዝቃዛ፣ ሰልፈር እና እሳተ ገሞራ ክምችት ውስጥ የሚገኙትን የባክቴሪያ ማህበረሰቦች ስብጥር ሊያንፀባርቅ ይችላል።ከፍተኛ መጠን ያለው ሰልፈርን የሚቀንሱ ረቂቅ ተሕዋስያን በባዮተርባይት የባህር ዳርቻ አካባቢዎች እንደ ፖርት-አው-ፈረንሳይ የባህር ዳርቻ ያሉ እንጉዳዮችን በሚሰበስቡበት ጊዜ በደንብ ተብራርተዋል።ሌላው አማራጭ የ commensal mussel flora በአግድመት ስርጭት ሊጎዳ ይችላል [60, 61].በባህር አካባቢ፣ በባሕር ወለል ላይ እና በጡንቻዎች ውስጥ የሚገኙ የሳምባዮቲክ ባክቴሪያ ስብጥር መካከል ያለውን ትስስር ለማወቅ ተጨማሪ ምርምር ያስፈልጋል።እነዚህ ጥናቶች በአሁኑ ጊዜ በመካሄድ ላይ ናቸው.
የሂሞሊምፍ ሲሲኤፍኤንኤ ርዝመት እና ትኩረት፣ የመንጻቱ ቀላልነት እና ፈጣን የተኩስ ቅደም ተከተል ለመፍቀድ ከፍተኛ ጥራት የ mussel ሲሲኤፍኤንኤን በባህር ዳርቻዎች ስነ-ምህዳሮች ውስጥ ያለውን የብዝሃ ህይወት ለመገምገም ከበርካታ ጥቅሞች መካከል ጥቂቶቹ ናቸው።ይህ አካሄድ በተለይ የቫይራል ማህበረሰቦችን (ቫይሮማዎችን) በተሰጠው ስነ-ምህዳር (62, 63) ውስጥ ለመለየት ውጤታማ ነው።እንደ ባክቴሪያ፣ አርኬያ እና ዩካርዮት ሳይሆን፣ የቫይራል ጂኖም እንደ 16S ቅደም ተከተሎች ያሉ በሥርዓተ-ፆታ የተጠበቁ ጂኖች የላቸውም።ውጤታችን እንደሚያመለክተው እንደ ሙዝል ካሉ አመላካች ዝርያዎች ፈሳሽ ባዮፕሲ በአንፃራዊነት ብዙ ቁጥር ያላቸውን የሲሲኤፍኤንኤ ቫይረስ ቁርጥራጮችን ለመለየት በተለምዶ የባህር ዳርቻ የባህር ላይ ስነ-ምህዳሮችን የሚበክሉ አስተናጋጆችን ለመበከል ያስችላል።ይህ ፕሮቶዞአን፣ አርትሮፖድስን፣ ነፍሳትን፣ ተክሎችን እና የባክቴሪያ ቫይረሶችን (ለምሳሌ ባክቴሪዮፋጅስ) በመበከል የሚታወቁ ቫይረሶችን ያጠቃልላል።በ Kerguelen (ሰንጠረዥ S2፣ ተጨማሪ መረጃ) በተመሳሳይ የጡንጥ ሽፋን ውስጥ የተሰበሰበውን የሄሞሊምፍ CCfDNA የሰማያዊ ሙስሎች (M. platensis) ስንመረምር ተመሳሳይ ስርጭት ተገኝቷል።የሲሲኤፍዲኤንኤ የተኩስ አወጣጥ ቅደም ተከተል በእርግጥ በሰዎች ወይም በሌሎች ዝርያዎች ቫይረስ ጥናት ውስጥ አዲስ አቀራረብ ነው [21, 37, 64].ይህ አካሄድ በተለይ በባልቲሞር ውስጥ በጣም የተለያየ እና ሰፊ የሆነ የቫይረስ ክፍልን የሚወክል በሁሉም ባለ ሁለት ገመድ ዲ ኤን ኤ ቫይረሶች መካከል አንድም ዘረ-መል (ጅን) ስለማይጠበቅ ባለ ሁለት ገመድ ዲኤንኤ ቫይረሶችን ለማጥናት ጠቃሚ ነው።ምንም እንኳን አብዛኛዎቹ እነዚህ ቫይረሶች ያልተከፋፈሉ እና ሙሉ በሙሉ ከማይታወቁ የቫይራል አለም ክፍል የሚመጡ ቫይረሶችን ሊያካትቱ ቢችሉም [66]፣ የሙስሎች ኤ.አትራ እና ኤም. ፕላትንስሲስ ቫይረሶች እና አስተናጋጆች በሁለቱ ዝርያዎች መካከል እንደሚወድቁ ተገንዝበናል።በተመሳሳይ (ስእል S3 ይመልከቱ, ተጨማሪ መረጃ).ይህ ተመሳሳይነት ምንም አያስገርምም, ምክንያቱም በአከባቢው ውስጥ ያለውን ዲ ኤን ኤ ለመውሰድ የመምረጥ እጥረትን ሊያንፀባርቅ ይችላል.የአር ኤን ኤ ቫይረስን ለመለየት በአሁኑ ጊዜ የተጣራ አር ኤን ኤ በመጠቀም የወደፊት ጥናቶች ያስፈልጋሉ።
በጥናታችን ውስጥ፣ ከኮዋርስኪ እና ባልደረቦች [37] ስራ የተስተካከለ በጣም ጥብቅ የሆነ የቧንቧ መስመር ተጠቅመን ቤተኛ ሲሲኤፍኤንኤን ከመገጣጠም በፊት እና በኋላ በሁለት ደረጃ የተሰበሰቡ ንባቦችን እና ኮንቲግ ስረዛን በመጠቀም ከፍተኛ መጠን ያለው ካርታ ያልተሰራ ንባቦችን አስገኝቷል።ስለዚህ፣ ከእነዚህ ካርታ የሌላቸው አንዳንድ ተነባቢዎች አሁንም የራሳቸው መነሻ ሊኖራቸው እንደሚችል ማስቀረት አንችልም ምክንያቱም በዋነኝነት ለዚህ የሙሰል ዝርያ ማጣቀሻ ጂኖም ስለሌለን ነው።ይህንን የቧንቧ መስመር የተጠቀምነው በራስ እና ራስ-ያልሆኑ ማንበብ እና በኢሉሚና ሚሴቅ PE75 የተፈጠረው የንባብ ርዝመት ስላሳሰበን ነው።ለአብዛኛዎቹ ላልተነበቡ ንባቦች ሌላው ምክንያት አብዛኛው የባህር ውስጥ ረቂቅ ተሕዋስያን በተለይም እንደ ከርጌለን ባሉ ራቅ ያሉ አካባቢዎች አልተገለጹም ።ከሰው CCfDNA ጋር ተመሳሳይ የሆነ የሲሲኤፍኤንኤን ቁራጭ ርዝመት በማሰብ Illumina MiSeq PE75 ተጠቀምን።ለወደፊት ጥናቶች፣ ውጤታችን እንደሚያሳየው ሄሞሊምፍ ሲሲኤፍኤን ከሰዎች እና/ወይም አጥቢ እንስሳት የበለጠ ረጅም ንባብ አለው፣ለረጅም የሲሲኤፍኤን ቁርጥራጮች ይበልጥ ተስማሚ የሆነ የቅደም ተከተል መድረክ እንዲጠቀሙ እንመክራለን።ይህ ልምምድ ለጥልቅ ትንተና ተጨማሪ ምልክቶችን ለመለየት በጣም ቀላል ያደርገዋል.በአሁኑ ጊዜ የማይገኘውን የተሟላ የ A. atra ኑክሌር ጂኖም ቅደም ተከተል ማግኘት የሲሲኤፍኤንኤን ከራስ እና ከራስ ካልሆኑ ምንጮች አድልዎ በእጅጉ ያመቻቻል።የኛ ጥናት ያተኮረው የፈሳሽ ባዮፕሲ ፅንሰ-ሃሳብን በጡንቻዎች ላይ የመተግበር እድል ላይ በመሆኑ፣ ይህ ጽንሰ-ሀሳብ ወደፊት ለሚደረጉ ምርምሮች ጥቅም ላይ የሚውል በመሆኑ አዳዲስ መሳሪያዎች እና የቧንቧ መስመሮች ተዘጋጅተው የዚህ ዘዴ እምቅ ጥቃቅን ተህዋሲያን የሜሴል ስብጥርን ለማጥናት ያስችላል ብለን ተስፋ እናደርጋለን።የባህር ሥነ ምህዳር.
እንደ ወራሪ ያልሆነ ክሊኒካዊ ባዮማርከር፣ ከፍ ያለ የሰው ልጅ የፕላዝማ መጠን ሲሲኤፍዲኤንኤ ከተለያዩ በሽታዎች፣ የሕብረ ሕዋሳት ጉዳት እና የጭንቀት ሁኔታዎች ጋር የተቆራኘ ነው [67,68,69].ይህ ጭማሪ የሕብረ ሕዋሳት ጉዳት ከደረሰ በኋላ የራሱ አመጣጥ የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች ከመለቀቁ ጋር የተያያዘ ነው.ይህንን ጉዳይ የተመለከትነው ከፍተኛ የሆነ የሙቀት ጭንቀትን በመጠቀም ሲሆን ይህም ሙሴሎች ለ 30 ዲግሪ ሴንቲግሬድ የሙቀት መጠን ለአጭር ጊዜ ተጋልጠዋል.ይህንን ትንታኔ በሶስት የተለያዩ የሙዝል ዓይነቶች ላይ በሶስት ገለልተኛ ሙከራዎች አደረግን.ነገር ግን፣ ከከፍተኛ የሙቀት ጭንቀት በኋላ በ ccfDNA ደረጃዎች ላይ ምንም አይነት ለውጥ አላገኘንም (ስእል S5፣ ተጨማሪ መረጃ ይመልከቱ)።ይህ ግኝት ቢያንስ በከፊል፣ ሙሴሎች ከፊል ክፍት የሆነ የደም ዝውውር ሥርዓት ስላላቸው እና ከፍተኛ የማጣራት እንቅስቃሴ ስላላቸው ብዙ የውጭ ዲ ኤን ኤ መከማቸታቸውን ሊያብራራ ይችላል።በሌላ በኩል፣ እንጉዳዮች፣ ልክ እንደ ብዙዎቹ ኢንቬቴቴራቶች፣ በውጥረት ምክንያት ለሚመጣ የሕብረ ሕዋስ ጉዳት የበለጠ የሚቋቋሙ ሊሆኑ ይችላሉ፣ በዚህም በሂሞሊምፋቸው ውስጥ የሲሲኤፍኤንኤን ልቀትን ይገድባሉ [70, 71].
እስካሁን ድረስ፣ በውሃ ውስጥ ያሉ ስነ-ምህዳሮች ላይ ያለው የዲኤንኤ ብዝሃ ህይወት ትንተና በዋናነት በአካባቢ ዲኤንኤ (ኢዲኤንኤ) ሜታባርኮዲንግ ላይ ያተኮረ ነው።ይሁን እንጂ ይህ ዘዴ ፕሪመር በሚጠቀሙበት ጊዜ በብዝሃ ሕይወት ትንተና ውስጥ አብዛኛውን ጊዜ የተገደበ ነው.የሽጉጥ ቅደም ተከተል አጠቃቀም የ PCR ውስንነቶችን እና የፕሪመር ስብስቦችን ምርጫን ያዛባል።ስለዚህም የእኛ ዘዴ በቅርብ ጊዜ ጥቅም ላይ ከዋለ ከፍተኛ-throughput eDNA Shotgun sequencing ዘዴ ጋር የቀረበ ሲሆን ይህም የተበታተነውን ዲ ኤን ኤ በቀጥታ በመደርደር ሁሉንም ፍጥረታት ማለት ይቻላል [72, 73] መተንተን ይችላል።ሆኖም፣ LB ከመደበኛ የኢዲኤንኤ ዘዴዎች የሚለዩ በርካታ መሠረታዊ ጉዳዮች አሉ።እርግጥ ነው, በ eDNA እና LB መካከል ያለው ዋነኛው ልዩነት የተፈጥሮ ማጣሪያ አስተናጋጆችን መጠቀም ነው.እንደ ስፖንጅ እና ቢቫልቭስ (Dresseina spp.) የመሳሰሉ የባህር ዝርያዎች ኢዲኤንኤን ለማጥናት እንደ ተፈጥሯዊ ማጣሪያ መጠቀማቸው ሪፖርት ተደርጓል [74, 75].ሆኖም የድሬሴና ጥናት ዲ ኤን ኤ የወጣበትን የቲሹ ባዮፕሲ ተጠቅሟል።የሲሲኤፍኤንኤ ትንተና ከኤልቢ የቲሹ ባዮፕሲ፣ ልዩ እና አንዳንድ ጊዜ ውድ የሆኑ መሳሪያዎችን እና ከኢዲኤንኤ ወይም ከቲሹ ባዮፕሲ ጋር የተያያዘ ሎጂስቲክስ አያስፈልገውም።በእርግጥ፣ ከኤልቢ ሲሲኤፍኤንኤ ቀዝቃዛ ሰንሰለት ሳይጠበቅ በኤፍቲኤ ድጋፍ ሊከማች እና ሊተነተን እንደሚችል በቅርቡ ዘግበናል፣ ይህም በርቀት አካባቢዎች ለሚደረገው ምርምር ትልቅ ፈተና ነው [76]።የሲሲኤፍኤንኤን ከፈሳሽ ባዮፕሲ ማውጣት ቀላል እና ከፍተኛ ጥራት ያለው ዲኤንኤ ለተኩስ ቅደም ተከተል እና ለ PCR ትንተና ያቀርባል።ከኢዲኤንኤ ትንተና ጋር በተያያዙ አንዳንድ ቴክኒካዊ ውሱንነቶች ይህ ትልቅ ጥቅም ነው [77]።የናሙና ዘዴው ቀላልነት እና ዝቅተኛ ዋጋ በተለይ ለረጅም ጊዜ የክትትል ፕሮግራሞች ተስማሚ ነው.ከከፍተኛ የማጣራት አቅማቸው በተጨማሪ ሌላው የታወቀው የቢቫልቭ ባህሪ ቫይረሶችን መሳብን የሚያበረታታ የሙኩሶቻቸው ኬሚካላዊ mucopolysaccharide ቅንብር ነው [78, 79].ይህ ቢቫልቭስ የብዝሃ ህይወትን እና የአየር ንብረት ለውጥን በአንድ የውሃ ውስጥ ስነ-ምህዳር ውስጥ ያለውን ተፅእኖ ለመለየት ተስማሚ የተፈጥሮ ማጣሪያ ያደርገዋል።ምንም እንኳን በአስተናጋጅ የተገኙ የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች መኖራቸው ከኢዲኤንኤ ጋር ሲነፃፀር እንደ ዘዴው ውስንነት ሊታይ ቢችልም ከኢዲኤንኤ ጋር ሲነፃፀር እንዲህ ያለ ቤተኛ ሲሲኤፍዲኤንኤ እንዲኖር የሚጠይቀው ወጪ ለጤና ጥናቶች ከፍተኛ መጠን ያለው መረጃ በአንድ ጊዜ ሊረዳ የሚችል ነው።ማካካሻ አስተናጋጅ.ይህ በአስተናጋጁ ጂኖም ውስጥ የተዋሃዱ የቫይረስ ቅደም ተከተሎች መኖራቸውን ያካትታል.በቢቫልቭስ ውስጥ በአግድም የሚተላለፉ የሉኪሚክ ሪትሮቫይረስ ቫይረሶች በመኖራቸው ይህ በተለይ ለሙሽሎች በጣም አስፈላጊ ነው [80, 81].ሌላው የኤልቢ ጥቅም ከኢዲኤንኤ ይልቅ ረቂቅ ተሕዋስያንን (እና ጂኖም) የሚይዘውን በሂሞሊምፍ ውስጥ የደም ሴሎችን በማሰራጨት phagocytic እንቅስቃሴን መጠቀሙ ነው።Phagocytosis በ bivalves ውስጥ የደም ሴሎች ዋና ተግባር ነው [82].በመጨረሻም ዘዴው ከፍተኛ የማጣራት አቅም ያለው ሙሴሎች (በአማካኝ 1.5 ሊት / ሰ የባህር ውሃ) እና የሁለት ቀን ዝውውርን ይጠቀማል, ይህም የተለያዩ የባህር ውሃ ድብልቅን ይጨምራል, ይህም ሄትሮሎጂያዊ eDNA ን ለመያዝ ያስችላል.[83, 84]ስለዚህ የሙስል ሲሲኤፍኤንኤ ትንተና የሜሶል አመጋገብን፣ ኢኮኖሚያዊ እና አካባቢያዊ ተፅእኖዎችን ከግምት ውስጥ በማስገባት አስደሳች መንገድ ነው።ከሰዎች ከተሰበሰበው የኤልቢ ትንታኔ ጋር ተመሳሳይነት ያለው ይህ ዘዴ ለውጫዊ ንጥረ ነገሮች ምላሽ በዲ ኤን ኤ ውስጥ የጄኔቲክ እና ኤፒጄኔቲክ ለውጦችን የመለካት እድል ይከፍታል.ለምሳሌ፣ የሶስተኛ ትውልድ ቅደም ተከተል ቴክኖሎጂዎች የናኖፖር ቅደም ተከተልን በመጠቀም በ CCfDNA ውስጥ የጂኖም-ሰፊ ሜቲኤሌሽን ትንታኔን ለማድረግ ሊታሰቡ ይችላሉ።ይህ ሂደት ሊመቻች የሚገባው የሙስሉ ሲሲኤፍዲኤንኤ ቁርጥራጮች ርዝመት ለረጅም ጊዜ ከተነበቡ ተከታታይ መድረኮች ጋር የሚጣጣም በመሆኑ ጂኖም-ሰፊ የዲኤንኤ ሜቲላይዜሽን ትንተና የኬሚካላዊ ለውጦችን ሳያስፈልግ ከአንድ ቅደም ተከተል እንዲሠራ ያስችላል።ስለዚህ ለአየር ንብረት ለውጥ ወይም ብክለት ከተጋለጡ በኋላ ምላሽን የሚቆጣጠሩትን መሠረታዊ ዘዴዎች ጠቃሚ ግንዛቤን ሊሰጥ ይችላል [87].ይሁን እንጂ የኤልቢ አጠቃቀም ያለ ገደብ አይደለም.ይህ በሥርዓተ-ምህዳር ውስጥ ጠቋሚ ዝርያዎች መኖሩን መናገር አያስፈልግም.ከላይ እንደተጠቀሰው፣ LB ን በመጠቀም የአንድን ስነ-ምህዳር ብዝሃ ህይወት ለመገምገም ጥብቅ የሆነ የባዮኢንፎርማቲክስ ቧንቧ መስመር ያስፈልገዋል ይህም ከምንጩ የተገኙ የዲኤንኤ ቁርጥራጮች መኖራቸውን ያገናዘበ ነው።ሌላው ዋነኛ ችግር የባህር ውስጥ ዝርያዎች የማጣቀሻ ጂኖም መገኘት ነው.እንደ የባህር አጥቢ እንስሳ ጂኖም ፕሮጀክት እና በቅርቡ የተቋቋመው የFish10k ፕሮጀክት [88] ያሉ ተነሳሽነቶች ለወደፊቱ እንዲህ ያለውን ትንታኔ እንደሚያመቻቹ ተስፋ ተጥሎበታል።የኤልቢ ፅንሰ-ሀሳብ በባህር ማጣሪያ-ምግብ ፍጥረታት ላይ መተግበሩ ከዘመናዊ ቴክኖሎጂዎች እድገት ጋር ተኳሃኝ ነው ፣ ይህም ለአካባቢያዊ ጭንቀት ምላሽ ለመስጠት ለባለብዙ-ኦም ባዮማርከር ልማት በጣም ተስማሚ ያደርገዋል ።
የጂኖም ቅደም ተከተል መረጃ በ NCBI ቅደም ተከተል ንባብ ማህደር https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 በባዮፕሮጀክት SRR8924808 ተቀምጧል።
Brierley AS፣ Kingsford MJ የአየር ንብረት ለውጥ በባህር ህይወት እና ስነ-ምህዳር ላይ የሚያሳድረው ተጽእኖ።ኮል ባዮሎጂ.2009;19፡ P602–P614።
Gissi E፣ Manea E፣ Mazaris AD፣ Fraschetti S፣ Almpanidou V፣ Bevilacqua S፣ et al.የአየር ንብረት ለውጥ እና ሌሎች የአካባቢ ውጥረቶችን በባህር አካባቢ ላይ የሚያደርሱትን ጥምር ተጽእኖ ግምት ውስጥ ያስገቡ።አጠቃላይ ሳይንሳዊ አካባቢ.2021፤755፡142564።
ካሬላ ኤፍ፣ አንቱኦፈርሞ ኢ፣ ፋሪና ኤስ፣ ሳላቲ ኤፍ፣ ማንዳስ ዲ፣ ፕራዶ ፒ፣ እና ሌሎችም።).የመጋቢት መጀመሪያ ሳይንስ.2020፤7፡48።
ሴሮንት ኤል፣ ኒካስትሮ ሲአር፣ ዛርዲ ጂአይ፣ ጎበርቪል ኢ. የሙቀት መቻቻልን መቀነስ በተደጋጋሚ የሙቀት ጭንቀት ሁኔታዎች የሰማያዊ እንጉዳዮችን ከፍተኛ የበጋ ሞት ያብራራል።ሳይንሳዊ ሪፖርት 2019;9፡17498።
Fey SB፣ Siepielski AM፣ Nussle S፣ Cervantes-Yoshida K፣ Hwan JL፣ Huber ER፣ et al.በእንስሳት ሞት ድግግሞሽ፣ መንስኤ እና መጠን ላይ የቅርብ ጊዜ ለውጦች።Proc Natl Acad Sci አሜሪካ.2015፤112፡1083-8።
Scarpa F፣ Sanna D፣ Azzena I፣ Mughetti D፣ Cerruti F፣ Hosseini S፣ et al.ብዙ ዓይነት ያልሆኑ ልዩ በሽታ አምጪ ተህዋሲያን የፒና ኖቢሊስን የጅምላ ሞት አስከትለዋል።ህይወት።2020፤10፡238።
Bradley M፣ Coutts SJ፣ Jenkins E፣ O'Hara TMየአየር ንብረት ለውጥ በአርክቲክ ዞኖቲክ በሽታዎች ላይ ሊከሰት የሚችል ተጽእኖ.Int J Circumpolar ጤና.2005;64፡468–77።
ቤየር ጄ.፣ ግሪን NW፣ ብሩክስ ኤስ.፣ አላን አይጄ፣ ሩስ ኤ.፣ ጎሜዝ ቲ. እና ሌሎች።ሰማያዊ ሙስሎች (Mytilus edulis spp.) በባህር ዳርቻ ብክለት ክትትል ውስጥ እንደ ምልክት ፍጥረታት: ግምገማ.Mar Environ Res 2017;130፡338-65።
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. በካንሰር ህክምና ውስጥ ፈሳሽ ባዮፕሲ ውህደት.Nat Rev Clean Oncol.2017;14፡531–48።
ዋን JCM፣ Massie C፣ Garcia-Corbacho J፣ Mouliere F፣ Brenton JD፣ Caldas C እና ሌሎችፈሳሽ ባዮፕሲ ብስለት፡- ዕጢው ዲ ኤን ኤ እንዲሰራጭ ያስችላል።Nat Rev ካንሰር.2017፤17፡223–38።
Mandel P., Metais P. ኑክሊክ አሲዶች በሰው ፕላዝማ ውስጥ.የሶክ ባዮ ቅርንጫፍ አካላት የስብሰባ ደቂቃዎች።1948;142፡241-3።
Bronkhorst AJ፣ Ungerer W፣ Holdenrieder S. አዲስ ሚና ለሴል-ነጻ ዲ ኤን ኤ እንደ ሞለኪውላዊ ምልክት ለካንሰር ሕክምና።የባዮሞላር ትንተና መጠን.2019፤17፡100087።
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS ፈሳሽ ባዮፕሲ ወደ ክሊኒኩ ውስጥ ይገባል - የትግበራ ጉዳዮች እና የወደፊት ፈተናዎች.Nat Rev Clin Oncol.2021;18፡297–312።
Lo YM፣ Corbetta N.፣ Chamberlain PF፣ Rai W.፣ Sargent IL፣ Redman CW እና ሌሎችም።የፅንስ ዲ ኤን ኤ በእናቶች ፕላዝማ እና ሴረም ውስጥ ይገኛል.ላንሴት1997;350፡485-7።
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR በእርግዝና ወቅት በሴቶች ደም ውስጥ የሚዘዋወረው extracellular RNA በመጠቀም የእርግዝና ሂደትን እና ውስብስቦቹን ጥናት.ዶፔዲያትሪክስ.2020፤8፡605219።
Ollerich M፣ Sherwood K፣ Keown P፣ Schütz E፣ Beck J፣ Stegbauer J፣ et al.ፈሳሽ ባዮፕሲ፡ ከለጋሽ ሴል-ነጻ ዲ ኤን ኤ በኩላሊት ግርዶሽ ውስጥ ያሉ አልጄኔቲክ ጉዳቶችን ለመለየት ይጠቅማል።Nat Rev Nefrol.2021;17፡591–603።
ሁዋን ኤፍሲ፣ ሎ YM በቅድመ ወሊድ ምርመራዎች ውስጥ ፈጠራዎች፡ የእናቶች ፕላዝማ ጂኖም ቅደም ተከተል።አና ኤም.ዲ.2016፤67፡419-32።
Gu W፣ Deng X፣ Lee M፣ Sucu YD፣ Arevalo S፣ Stryke D፣ እና ሌሎችም።ፈጣን በሽታ አምጪ ተህዋስያንን ከሚቀጥለው ትውልድ ሜታጂኖሚክ የተበከሉ የሰውነት ፈሳሾች ቅደም ተከተል ጋር።ናት መድሃኒት.2021፤27፡115-24።