Nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን።እየተጠቀሙበት ያለው የአሳሽ ስሪት የተወሰነ የሲኤስኤስ ድጋፍ አለው።ለበለጠ ልምድ፣ የዘመነ አሳሽ እንድትጠቀም እንመክርሃለን (ወይም የተኳኋኝነት ሁነታን በኢንተርኔት ኤክስፕሎረር አሰናክል)።እስከዚያው ድረስ ቀጣይ ድጋፍን ለማረጋገጥ ጣቢያውን ያለ ቅጦች እና ጃቫስክሪፕት እናቀርባለን።
ለመድኃኒት ምርመራ የልብን የፊዚዮሎጂ አካባቢ በትክክል ማባዛት የሚችል አስተማማኝ የ in vitro ሥርዓት ያስፈልጋል።የሰዎች የልብ ቲሹ ባህል ስርዓቶች ውሱን አቅርቦት የልብ መድሐኒት ተፅእኖዎች ትክክለኛ ያልሆነ ትርጓሜ እንዲፈጠር ምክንያት ሆኗል.እዚህ ላይ፣ በኤሌክትሮ መካኒካል የልብ ቁርጥራጭን የሚያነቃቃ እና የልብ ዑደት በሲስቶሊክ እና ዲያስቶሊክ ደረጃዎች ውስጥ ፊዚዮሎጂካል ዝርጋታ የሚያልፍ የልብ ቲሹ ባህል ሞዴል (ሲቲኤም) አዘጋጅተናል።ከ 12 ቀናት ባህል በኋላ, ይህ አቀራረብ የልብ ክፍሎችን በከፊል አሻሽሏል, ነገር ግን መዋቅራዊ አቋማቸውን ሙሉ በሙሉ አላስጠበቀም.ስለዚህ ከትንሽ ሞለኪውል ማጣሪያ በኋላ 100 nM triiodothyronine (T3) እና 1 μM dexamethasone (Dex) ወደ ሚዲያችን ሲጨመሩ የክፍሎቹን ጥቃቅን መዋቅር ለ12 ቀናት እንደያዙ ደርሰንበታል።ከT3/Dex ህክምና ጋር በማጣመር፣ የሲቲሲኤም ስርዓት ግልባጭ መገለጫዎችን፣ አዋጭነትን፣ የሜታቦሊክ እንቅስቃሴን እና መዋቅራዊ ታማኝነትን እንደ ትኩስ የልብ ቲሹ ደረጃ ለ12 ቀናት ጠብቆ ቆይቷል።በተጨማሪም ፣ በባህል ውስጥ ያለው የልብ ሕብረ ሕዋሳት ከመጠን በላይ መወጠር hypertrophic የልብ ምልክትን ያስከትላል ፣ ይህም ሲቲሲኤም በልብ መወጠር ምክንያት የሚመጡ የደም ግፊት ሁኔታዎችን ለመኮረጅ የሚያስችል ማስረጃ ይሰጣል ።በማጠቃለያው ፣ ሲቲሲኤም በባህል ውስጥ ለረጅም ጊዜ የሚቆይ የፊዚዮሎጂ እና የፓቶፊዚዮሎጂን ሞዴል ሞዴል ማድረግ ይችላል ፣ ይህም አስተማማኝ የመድኃኒት ምርመራን ያስችላል።
ክሊኒካዊ ምርምር ከመደረጉ በፊት, የሰውን ልብ ፊዚዮሎጂያዊ አከባቢን በትክክል ማባዛት የሚችሉ አስተማማኝ የ in vitro ስርዓቶች ያስፈልጋሉ.እንደነዚህ ያሉ ስርዓቶች የተለወጠውን የሜካኒካዊ ዝርጋታ, የልብ ምት እና ኤሌክትሮፊዚዮሎጂ ባህሪያትን መኮረጅ አለባቸው.የእንስሳት ሞዴሎች በተለምዶ ለልብ ፊዚዮሎጂ የማጣሪያ መድረክ ሆነው ያገለግላሉ ፣ ይህም በሰው ልብ ውስጥ የመድኃኒቶችን ተፅእኖ ለማንፀባረቅ ውስን አስተማማኝነት ፣1፣2።በመጨረሻም፣ ሃሳቡ የልብ ቲሹ ባህል የሙከራ ሞዴል (CTCM) በጣም ስሜታዊ እና ለተለያዩ ቴራፒዩቲካል እና ፋርማኮሎጂካል ጣልቃገብነቶች ልዩ የሆነ ሞዴል ሲሆን የሰውን ልብ ፊዚዮሎጂ እና ፓቶፊዚዮሎጂን በትክክል ማራባት።የዚህ አይነት ስርዓት አለመኖሩ የልብ ድካም 4,5 አዳዲስ ህክምናዎችን ማግኘትን የሚገድብ እና ከገበያ ለመውጣት እንደ ዋና ምክንያት የመድሃኒት ካርዲዮቶክሲክሽን እንዲፈጠር ምክንያት ሆኗል6.
ባለፉት አስርት አመታት ውስጥ፣ ስምንት የልብና የደም ህክምና ያልሆኑ መድሃኒቶች ከክሊኒካዊ አገልግሎት ተወግደዋል ምክንያቱም የQT የጊዜ ክፍተት ማራዘም ወደ ventricular arrhythmias እና ድንገተኛ ሞት7.ስለዚህ የልብና የደም ህክምና ውጤታማነትን እና መርዛማነትን ለመገምገም አስተማማኝ ቅድመ-ክሊኒካዊ የማጣሪያ ስልቶች ፍላጎት እየጨመረ ነው።በቅርብ ጊዜ በሰው-የተፈጠሩ ፕሉሪፖተንት ስቴም ሴል-የተገኘ ካርዲዮሚዮይተስ (hiPS-CM) በመድኃኒት ምርመራ እና የመርዛማነት ምርመራ ላይ መጠቀሙ ለዚህ ችግር ከፊል መፍትሄ ይሰጣል።ይሁን እንጂ የ hiPS-CMs ያልበሰለ ተፈጥሮ እና የባለብዙ ሴሉላር ውስብስብነት የልብ ህብረ ህዋሳት አለመኖር የዚህ ዘዴ ዋነኛ ገደቦች ናቸው.በቅርብ ጊዜ የተደረጉ ጥናቶች እንደሚያሳዩት ይህ ውስንነት በከፊል ሊወገድ የሚችለው ቀደምት hiPS-CM በመጠቀም ድንገተኛ መኮማተር ከጀመረ በኋላ ብዙም ሳይቆይ የልብ ህዋሳትን በመፍጠር እና ቀስ በቀስ የኤሌክትሪክ መነቃቃትን በመጨመር ነው።ሆኖም፣ እነዚህ የ hiPS-CM ማይክሮቲሰሶች የጎልማሳ myocardium የበሰሉ ኤሌክትሮፊዚዮሎጂያዊ እና ኮንትራት ባህሪያት የላቸውም።በተጨማሪም፣ የሰው ልጅ የልብ ህብረ ህዋሳት ውስብስብ የሆነ መዋቅር አለው፣ እሱም የተለያዩ የሴል አይነቶችን ያካተተ፣ endothelial cells፣ neurons እና stromal fibroblastsን ጨምሮ፣ ከተወሰኑ የሴሉላር ማትሪክስ ፕሮቲኖች ስብስብ ጋር የተሳሰሩ የተለያዩ የሕዋሳት ድብልቅ ናቸው።በአዋቂ አጥቢ አጥቢ ልብ ውስጥ ያለው ይህ የካርዲዮዮሳይት ያልሆኑ ሰዎች 11,12,13 ልዩነት የግለሰብ የሕዋስ ዓይነቶችን በመጠቀም የልብ ሕብረ ሕዋሳትን ለመቅረጽ ትልቅ እንቅፋት ነው።እነዚህ ዋና ዋና ገደቦች በፊዚዮሎጂ እና በስነ-ሕመም ሁኔታዎች ውስጥ ያልተነካ የ myocardial ቲሹን ለማዳበር ዘዴዎችን ማዘጋጀት አስፈላጊ መሆኑን ያጎላሉ.
የሰለጠኑ ቀጫጭን (300 µm) የሰው ልብ ክፍሎች ያልተነካ የሰው myocardium ተስፋ ሰጪ ሞዴል መሆናቸውን አረጋግጠዋል።ይህ ዘዴ ከሰው የልብ ቲሹ ጋር ተመሳሳይ የሆነ የተሟላ የ 3D መልቲሴሉላር ሲስተም መዳረሻ ይሰጣል።ሆኖም፣ እስከ 2019 ድረስ፣ የሰለጠኑ የልብ ክፍሎችን መጠቀም በአጭር (24 ሰ) ባህል መትረፍ የተገደበ ነበር።ይህ የሆነበት ምክንያት የአካል-ሜካኒካል ዝርጋታ እጥረት ፣ የአየር-ፈሳሽ በይነገጽ እና የልብ ሕብረ ሕዋሳትን ፍላጎት የማይደግፉ ቀላል ሚዲያዎችን በመጠቀም በብዙ ምክንያቶች የተነሳ ነው።እ.ኤ.አ. በ2019፣ በርካታ የምርምር ቡድኖች ሜካኒካል ሁኔታዎችን በልብ ቲሹ ባህል ስርዓቶች ውስጥ ማካተት የባህል ህይወትን እንደሚያራዝም፣ የልብ አገላለፅን እንደሚያሻሽል እና የልብ ፓቶሎጂን መኮረጅ እንደሚችል አሳይተዋል።ሁለት የሚያምር ጥናቶች 17 እና 18 እንደሚያሳዩት uniaxial ሜካኒካል ጭነት በባህል ወቅት በልብ ፍኖታይፕ ላይ በጎ ተጽእኖ ይኖረዋል.ይሁን እንጂ እነዚህ ጥናቶች የልብ ዑደት ተለዋዋጭ ባለ ሶስት አቅጣጫዊ ፊዚኮ-ሜካኒካል ጭነት አልተጠቀሙም, ምክንያቱም የልብ ክፍሎች በ isometric tensile Forces 17 ወይም በመስመራዊ auxotonic ጭነት 18 ተጭነዋል.እነዚህ የሕብረ ሕዋሳትን የመለጠጥ ዘዴዎች ብዙ የልብ ጂኖችን መጨፍለቅ ወይም ከተለመደው የመለጠጥ ምላሾች ጋር የተዛመዱ ጂኖች ከመጠን በላይ መጨናነቅን አስከትለዋል.በተለይም ፒቱሊስ እና ሌሎች.19 የሃይል ትራንስድራክተር ግብረመልስ እና የጭንቀት መንቀሳቀሻዎችን በመጠቀም ለልብ ዑደት መልሶ ግንባታ ተለዋዋጭ የልብ ቁራጭ ባህል መታጠቢያ አዳብሯል።ምንም እንኳን ይህ ስርዓት በብልቃጥ የልብ ዑደት ውስጥ የበለጠ ትክክለኛ እንዲሆን ቢፈቅድም ፣ የስልቱ ውስብስብነት እና ዝቅተኛ ፍሰት የዚህን ስርዓት አተገባበር ይገድባል።የእኛ ላቦራቶሪ በቅርብ ጊዜ የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ እና የተመቻቸ መካከለኛ በመጠቀም የአሳማ ሥጋ እና የሰው የልብ ቲሹ ክፍሎችን እስከ 6 ቀናት ድረስ አዋጭነት ለመጠበቅ ቀለል ያለ የባህል ስርዓት አዘጋጅቷል20,21.
አሁን ባለው የእጅ ጽሁፍ ውስጥ ባለ ሶስት አቅጣጫዊ የልብ ፊዚዮሎጂ እና የልብ ዑደት ውስጥ የፓቶፊዚዮሎጂ ልዩነትን ለማደስ አስቂኝ ምልክቶችን የሚያካትቱ የአሳማ ልብ ክፍሎችን በመጠቀም የልብ ቲሹ ባህል ሞዴል (ሲቲኤም) እንገልፃለን ።ይህ CTCM ለቅድመ ክሊኒካዊ መድሃኒት ምርመራ የአጥቢ እንስሳት ልብ ፊዚዮሎጂ/ፓቶፊዚዮሎጂን የሚመስል ወጪ ቆጣቢ የሆነ መካከለኛ የልብ የልብ ስርዓት በማቅረብ የቅድመ ክሊኒካዊ መድሀኒት ትንበያ ትክክለኛነት ከዚህ በፊት ወደ ተገኘ ደረጃ ከፍ ሊል ይችላል።
የሂሞዳይናሚክስ ሜካኒካል ምልክቶች በ vitro 22,23,24 ውስጥ የ cardiomyocyte ተግባርን ለመጠበቅ ወሳኝ ሚና ይጫወታሉ.አሁን ባለው የእጅ ጽሁፍ ውስጥ ሁለቱንም የኤሌክትሪክ እና የሜካኒካል ማነቃቂያዎችን በፊዚዮሎጂ ድግግሞሽ (1.2 Hz, 72 ቢት በደቂቃ) በማነሳሳት የጎልማሳውን የልብ አካባቢ መኮረጅ የሚችል ሲቲሲኤም (ስእል 1 ሀ) አዘጋጅተናል.በዲያስቶል ወቅት ከመጠን በላይ የቲሹ መወጠርን ለማስወገድ የ3-ል ማተሚያ መሳሪያ የሕብረ ሕዋሳትን መጠን በ 25% ለመጨመር ጥቅም ላይ ውሏል (ምስል 1 ለ).በC-PACE ስርዓት የተነሳው የኤሌትሪክ ፍጥነት ከሲስቶል በፊት 100 ሚሴን ለመጀመር በመረጃ ማግኛ ስርዓት በመጠቀም የልብ ዑደቱን ሙሉ በሙሉ ለማራባት ተወስኗል።የቲሹ ባህል ሲስተም በላይኛው ክፍል ውስጥ የልብ ቁርጥራጭ መስፋፋትን ለመፍጠር ተለዋዋጭ የሲሊኮን ሽፋንን በብስክሌት ለማስፋፋት በፕሮግራም ሊሰራ የሚችል pneumatic actuator (LB Engineering, Germany) ይጠቀማል።ስርዓቱ ከውጪ አየር መስመር ጋር ተገናኝቷል የግፊት ትራንስፎርመር ይህም ግፊቱን (± 1 mmHg) እና ጊዜ (± 1 ms) በትክክል ማስተካከል አስችሏል (ምስል 1 ሐ).
a በመሳሪያው የባህል ክፍል ውስጥ በሰማያዊ ከሚታየው የ 7 ሚሜ ድጋፍ ቀለበት ጋር የቲሹን ክፍል ያያይዙ።የባህል ክፍሉ ከአየር ክፍሉ በቀጭኑ ተጣጣፊ የሲሊኮን ሽፋን ይለያል.ፍሳሾችን ለመከላከል በእያንዳንዱ ክፍል መካከል ጋኬት ያስቀምጡ።የመሳሪያው ክዳን የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ የሚሰጡ ግራፋይት ኤሌክትሮዶች ይዟል.ለ ትልቅ የቲሹ መሣሪያ ፣ የመመሪያ ቀለበት እና የድጋፍ ቀለበት ንድፍ መግለጫ።የቲሹ ክፍሎች (ቡናማ) በመሳሪያው ውጫዊ ጠርዝ ላይ ባለው ግሩቭ ውስጥ የተቀመጠው የመመሪያው ቀለበት ከመጠን በላይ ባለው መሳሪያ ላይ ተቀምጧል.መመሪያውን በመጠቀም የድጋፍ ቀለበቱን በጥንቃቄ በቲሹ acrylic ማጣበቂያ የተሸፈነውን የልብ ቲሹ ክፍል ላይ ያድርጉት.ሐ የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ ጊዜን የሚያሳየው በፕሮግራም ሊሰራ የሚችል የአየር ግፊት (PPD) የሚቆጣጠረው የአየር ክፍል ግፊት ተግባር ነው.የግፊት ዳሳሾችን በመጠቀም የኤሌክትሪክ ማነቃቂያዎችን ለማመሳሰል የውሂብ ማግኛ መሳሪያ ጥቅም ላይ ውሏል።በባህላዊው ክፍል ውስጥ ያለው ግፊት በተቀመጠው ገደብ ላይ ሲደርስ, የኤሌክትሪክ ማነቃቂያን ለመቀስቀስ የልብ ምት ምልክት ወደ C-PACE-EM ይላካል.d በማቀፊያ መደርደሪያ ላይ የተቀመጠ የአራት ሲቲሲኤም ምስል።በሳንባ ምች ዑደት በኩል አራት መሳሪያዎች ከአንድ ፒፒዲ ጋር የተገናኙ ናቸው, እና የግፊት ዳሳሾች በሄሞስታቲክ ቫልቭ ውስጥ በሳንባ ምች ዑደት ውስጥ ያለውን ግፊት ለመከታተል ይከተላሉ.እያንዳንዱ መሣሪያ ስድስት የቲሹ ክፍሎች አሉት።
ነጠላ የአየር ግፊት (pneumatic actuator) በመጠቀም, 4 CTCM መሳሪያዎችን መቆጣጠር ችለናል, እያንዳንዳቸው 6 የቲሹ ክፍሎችን (ምስል 1 መ) ይይዛሉ.በሲቲሲኤም ውስጥ በአየር ክፍሉ ውስጥ ያለው የአየር ግፊት በፈሳሽ ክፍል ውስጥ ወደ ተመሳሳይ ግፊት ይለወጣል እና የልብ ቁርጥራጭ ፊዚዮሎጂያዊ መስፋፋትን ያስከትላል (ምስል 2 ሀ እና ተጨማሪ ፊልም 1)።በ 80 ሚሜ ኤችጂ የቲሹ ዝርጋታ ግምገማ.ስነ ጥበብ.የቲሹ ክፍሎችን በ 25% መዘርጋት አሳይቷል (ምስል 2 ለ).ይህ የመቶኛ ዝርጋታ ከፊዚዮሎጂያዊ sarcomere ርዝመት 2.2-2.3 μm ለመደበኛ የልብ ክፍል ኮንትራት17,19,25 ጋር እንደሚዛመድ ታይቷል።የሕብረ ሕዋሳት እንቅስቃሴ የተገመገመው ብጁ የካሜራ ቅንብሮችን በመጠቀም ነው (ተጨማሪ ምስል 1)።የቲሹ እንቅስቃሴ ስፋት እና ፍጥነት (ምስል 2 ሐ ፣ መ) በልብ ዑደት ውስጥ እና በ systole እና በዲያስቶል ጊዜ ውስጥ ካለው ጊዜ ጋር ይዛመዳል (ምስል 2 ለ)።በመኮማተር እና በመዝናኛ ጊዜ የልብ ሕብረ ሕዋሳት መዘርጋት እና ፍጥነት በባህል ውስጥ ለ 12 ቀናት ቋሚ ሆኖ ቆይቷል (ምስል 2 ረ)።በባህል ወቅት የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ በኮንትራት ላይ የሚያስከትለውን ውጤት ለመገምገም የሻዲንግ ስልተ-ቀመር (ተጨማሪ ምስል 2 ሀ, ለ) በመጠቀም ንቁ የአካል ጉድለትን ለመለየት የሚያስችል ዘዴ አዘጋጅተናል እና በኤሌክትሪክ ማነቃቂያ እና ያለኤሌክትሪክ ማነቃቂያ የአካል ጉዳተኞችን መለየት ችለናል።ተመሳሳይ የልብ ክፍል (ምስል 2 ረ).በተቆራረጠው ተንቀሳቃሽ ክልል ውስጥ (R6-9) በኤሌክትሪክ ማነቃቂያ ጊዜ ያለው ቮልቴጅ የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ ከሌለ 20% ከፍ ያለ ነው, ይህም የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ ለኮንትራክተሩ ተግባር ያለውን አስተዋፅኦ ያሳያል.
የአየር ክፍል ግፊት፣ የፈሳሽ ክፍል ግፊት እና የቲሹ እንቅስቃሴ መለኪያዎችን የሚወክሉት የክፍሉ ግፊት የፈሳሽ ክፍል ግፊትን እንደሚቀይር ያረጋግጣሉ፣ ይህም የቲሹ ቁርጥራጭ እንቅስቃሴን ያስከትላል።b የመቶኛ ዝርጋታ (ሰማያዊ) የሕብረ ሕዋስ ክፍል ከመቶ መለጠጥ (ብርቱካን) ጋር የሚዛመዱ ዱካዎች።ሐ የልብ ቁርጥራጭ የሚለካው እንቅስቃሴ ከተለካው የእንቅስቃሴ ፍጥነት ጋር ይጣጣማል.(መ) የሳይክል እንቅስቃሴ (ሰማያዊ መስመር) እና ፍጥነት (ብርቱካናማ ነጠብጣብ መስመር) የሚወክሉት የልብ ቁርጥራጭ።ሠ የዑደት ጊዜ መጠን (n = 19 በቡድን ፣ ከተለያዩ አሳማዎች) ፣ የኮንትራት ጊዜ (n = 19 በቡድን በቡድን) ፣ የመዝናኛ ጊዜ (n = 19 ቁርጥራጮች በቡድን ፣ ከተለያዩ አሳማዎች) ፣ የሕብረ ሕዋሳት እንቅስቃሴ (n = 25)።ቁርጥራጭ)/ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች)፣ ከፍተኛ ሲስቶሊክ ፍጥነት (n = 24(D0)፣ 25(D12) ቁርጥራጭ/ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች) እና ከፍተኛ የመዝናናት መጠን (n=24(D0)፣ 25(D12) ከተለያዩ አሳማዎች ቁርጥራጭ/ቡድን)።ባለ ሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ሙከራ በማንኛውም ግቤት ላይ ምንም ጉልህ ልዩነት አላሳየም።ረ ተወካይ ውጥረት ትንተና ቲሹ ክፍሎች (ቀይ) እና ያለ (ሰማያዊ) የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ ጋር ቲሹ ክፍሎች, አሥር ክልላዊ አካባቢዎች ቲሹ ክፍሎች ተመሳሳይ ክፍል.የታችኛው ፓነሎች ከተለያዩ ክፍሎች ውስጥ በአስር አከባቢዎች ውስጥ የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ እና ያለ ኤሌክትሪክ ማነቃቂያ በቲሹ ክፍሎች ውስጥ የጭንቀት መቶኛ ልዩነትን ያሳያል። (n = 8 ቁርጥራጭ/ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች፣ ባለ ሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ፈተና ይከናወናል፤ ****p <0.0001፣ **p <0.01፣ *p <0.05)። (n = 8 ቁርጥራጭ/ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች፣ ባለ ሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ፈተና ይከናወናል፤ ****p <0.0001፣ **p <0.01፣ *p <0.05)። (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, **p<0,01. (n = 8 ክፍሎች/ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች፣ ባለ ሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ፈተና፤ ****p<0.0001፣ **p<0.01፣ *p<0.05)። （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, ** p <0,01, *p <0,05). (n = 8 ክፍሎች/ቡድን፣ ከተለያዩ አሳማዎች፣ ባለ ሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ፈተና፤ ****p<0.0001፣ **p<0.01፣ *p<0.05)።የስህተት አሞሌዎች አማካይ ± መደበኛ መዛባትን ይወክላሉ።
በቀደመው የስታቲክ ባዮሚሜቲክ የልብ ቁርጥራጭ ባህል ስርዓታችን [20፣21]፣ የኤሌክትሪክ ማነቃቂያን በመተግበር እና መካከለኛ ስብጥርን በማመቻቸት የልብ ቁርጥራጮችን አዋጭነት፣ ተግባር እና መዋቅራዊ ታማኝነት ለ6 ቀናት ጠብቀናል።ሆኖም፣ ከ10 ቀናት በኋላ፣ እነዚህ አሃዞች በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሰዋል።በቀደመው የማይንቀሳቀስ ባዮሚሜቲክ ባህል ስርዓታችን 20፣ 21 የቁጥጥር ሁኔታዎች (Ctrl) የሰለጠኑ ክፍሎችን እንጠቅሳለን እና ከዚህ ቀደም የተመቻቸ ሚዲያችንን እንደ MC ሁኔታዎች እና ባህል በአንድ ጊዜ በሜካኒካል እና ኤሌክትሪካል ማነቃቂያ (CTCM) እንጠቀማለን።ተጠርቷል ።በመጀመሪያ, ያለ ኤሌክትሪክ ማነቃቂያ ሜካኒካል ማነቃቂያ ለ 6 ቀናት የሕብረ ሕዋሳትን ህይወት ለመጠበቅ በቂ አለመሆኑን ወስነናል (ተጨማሪ ምስል 3a,b).የሚገርመው ነገር, STCM በመጠቀም ፊዚዮ-ሜካኒካል እና የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ መግቢያ ጋር, 12-ቀን የልብ ክፍሎች አዋጪነት MS ሁኔታዎች ሥር ትኩስ የልብ ክፍሎች ውስጥ ተመሳሳይ ይቆያል, ነገር ግን በ MTT ትንተና (የበለስ. 1) እንደሚታየው Ctrl ሁኔታዎች ውስጥ.3ሀ)።ይህ የሚያሳየው የልብ ዑደት ሜካኒካል ማነቃቂያ እና ማስመሰል የቲሹ ክፍሎችን በቀደመው የስታቲስቲክስ ባህል ስርዓታችን ውስጥ እስከተዘገበው ድረስ ለሁለት ጊዜ ያህል እንዲቆይ ያደርጋል።ነገር ግን የልብ ትሮፖኒን ቲ እና ኮንኔክሲን 43 የበሽታ መከላከያ ምልክት በማድረግ የሕብረ ሕዋሳትን መዋቅራዊ ታማኝነት ግምገማ እንደሚያሳየው connexin 43 አገላለጽ በ MC ቲሹዎች ውስጥ በ 12 ቀን በተመሳሳይ ቀን ከቁጥጥር የበለጠ ከፍ ያለ ነው።ነገር ግን፣ ወጥ የሆነ የኮንኔክሲን 43 አገላለጽ እና የዜድ-ዲስክ አፈጣጠር ሙሉ በሙሉ አልተጠበቁም (ምሥል 3 ለ)።የአርቴፊሻል ኢንተለጀንስ (AI) ማእቀፍ የቲሹ መዋቅራዊ ኢንተግሪቲ26ን ለመለካት እንጠቀማለን።ይህ ዘዴ በማጣቀሻው ላይ እንደተገለጸው የልብ ቲሹን መዋቅራዊ አንድነት በራስ-ሰር እና አድልዎ በሌለው መልኩ ለመለካት Convolutional Neural Network (CNN) እና ጥልቅ የመማሪያ ማእቀፍ ይጠቀማል።26. MC ቲሹ ከስታቲክ ቁጥጥር ክፍሎች ጋር ሲነፃፀር ከቀን 0 ጋር የተሻሻለ መዋቅራዊ ተመሳሳይነት አሳይቷል.በተጨማሪም የሜሶን ትራይክሮም ቀለም በ MS ሁኔታዎች ውስጥ ያለው የፋይብሮሲስ መጠን በባህል ቀን 12 ላይ ካለው ቁጥጥር ሁኔታ ጋር ሲነፃፀር በጣም ያነሰ በመቶኛ አሳይቷል (ምስል 3 ሐ)።ሲቲሲኤም በቀን 12 የልብ ቲሹ ክፍሎችን አዋጭነት ከትኩስ የልብ ቲሹ ጋር ተመሳሳይነት ቢጨምርም፣ የልብ ክፍሎችን መዋቅራዊ ታማኝነት በእጅጉ አላሻሻለውም።
የባር ግራፍ ትኩስ የልብ ቁርጥራጭ (D0) ወይም የልብ ቁርጥራጭ ባሕል ለ12 ቀናት ወይም በስታቲስቲክስ ባህል (D12 Ctrl) ወይም በሲቲኤም (D12 MC) (n = 18 (D0)፣ 15 (D12 Ctrl)፣ 12 (D12 MC) ቁርጥራጭ /ቡድን/የተለየ ፒግስ/አንድ መንገድ/የተሰራ ነው ወደ D0 እና ** p <0.01 ከ D12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)። የባር ግራፍ ትኩስ የልብ ቁርጥራጭ (D0) ወይም የልብ ቁርጥራጭ ባሕል ለ12 ቀናት ወይም በስታቲስቲክስ ባህል (D12 Ctrl) ወይም በሲቲኤም (D12 MC) (n = 18 (D0)፣ 15 (D12 Ctrl)፣ 12 (D12 Ctrl)፣ 12 (D12 MC) ፒግስ/ቡድን በተለያየ መንገድ ተከናውኗል። ከ D0 እና ** p <0.01 ከ D12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)።ሂስቶግራም የ MTT ትኩስ የልብ ክፍሎችን (D0) ወይም የልብ ክፍሎችን ባህል ለ 12 ቀናት በስታቲክ ባህል (D12 ቁጥጥር) ወይም በ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 መቆጣጠሪያ) )), 12 (D12 MC) ክፍሎች, VA በተለየ መንገድ ይከናወናል - ፒግስ####p <0,0001 по сравнению с D0 и **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl)። ####p <0.0001 ከ D0 እና **p <0.01 ጋር ሲነጻጸር ከ D12 Ctrl) ጋር ሲነጻጸር። a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心心切片(D0)天的MT相比፣** p <0.01)። a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切要 (D12 Ctrl) ኤም.ሲ.)ሂስቶግራም በአዲስ የልብ ክፍሎች (D0) ወይም የልብ ክፍሎች ለ12 ቀናት በስታቲስቲክስ ባህል (D12 ቁጥጥር) ወይም CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)) (n = 18 (D0)፣ 15 (D12 መቆጣጠሪያ))፣ 12 (D12 MC) ክፍሎች/ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች (D12)####p <0,0001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 ከ D0፣ **p <0.01 ከ D12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)።b ትሮፖኒን-ቲ (አረንጓዴ) ፣ ኮንኔክሲን 43 (ቀይ) እና ዲኤፒአይ (ሰማያዊ) አዲስ ተለይተው በተለዩ የልብ ክፍሎች (D0) ወይም የልብ ክፍሎች በስታቲክ ሁኔታዎች (Ctrl) ወይም CTCM ሁኔታዎች (ኤምሲ) ለ 12 ቀናት የሰለጠኑ) ተወካይ የበሽታ ፍሎረሰንት ምስሎች (ባዶ ሚዛን = 100 µm)። ሰው ሰራሽ የማሰብ ችሎታ የልብ ቲሹ መዋቅራዊ ትክክለኛነት (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ቁርጥራጭ / ቡድን እያንዳንዳቸው ከተለያዩ አሳማዎች, የአንድ-መንገድ ANOVA ሙከራ ይከናወናል; ####p <0.0001 ከ D0 እና ****p <0.0001 ጋር ሲነጻጸር. ሰው ሰራሽ የማሰብ ችሎታ የልብ ቲሹ መዋቅራዊ ትክክለኛነት (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ቁርጥራጭ / ቡድን እያንዳንዳቸው ከተለያዩ አሳማዎች, የአንድ-መንገድ ANOVA ሙከራ ይከናወናል; ####p <0.0001 ከ D0 እና ****p <0.0001 ጋር ሲነጻጸር. Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0)፣ 7 (D15) ፓ የልብ ቲሹ መዋቅራዊ ትክክለኛነት በሰው ሰራሽ እውቀት (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ክፍሎች / ቡድኖች ከተለያዩ አሳማዎች, የአንድ-መንገድ ANOVA ሙከራ ተከናውኗል; ####p <0.0001 vs. ከ D0 እና ****p <1t ጋር ሲነጻጸር D0 እና ****p <0.01.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0)፣ 7 (D12 Ctrl)፣ 5 (D12 MC) እያንዳንዳቸው የተለያዩ የአሳማ ሥጋ ቁርጥራጮች/ቡድን ፣ ባለአንድ መንገድ ANOVA ሙከራ፣፣#0#0p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0)፣ 7 (D12 Ctrl)፣ 5 (D12 MC) እያንዳንዳቸው የተለያዩ አሳማዎች ቁርጥራጭ/ቡድን ፣አንድ-መንገድ ANOVA ፈተና፣#0#0p 0.0001 与D12 Ctrl 相比） Искусственый интеллект для количественой оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D0), 7 (D0), 7 (D0), 7 (D0) руппу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####ገጽ <0,0001 vs. D0 አርቴፊሻል ኢንተለጀንስ የልብ ቲሹ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ክፍሎች/ቡድን እያንዳንዱን የተለያዩ አሳማዎች, አንድ-መንገድ ANOVA ሙከራ; ####p<0.0001 vs .D0 ለማነጻጸር ****p <1t ከ D0.000. ሐ ውክልና ምስሎች (በግራ) እና መጠናቸው (በቀኝ) በ Masson's trichrome እድፍ ለተቀቡ የልብ ቁርጥራጭ (Scale bare = 500 µm) (n = 10 slices/ቡድን እያንዳንዳቸው ከተለያዩ አሳማዎች፣ የአንድ-መንገድ ANOVA ሙከራ ይካሄዳል፤ ####p <0.0001 ከ D0 እና 02p ***t ጋር ሲነጻጸር D0 እና02p <0.1)። ሐ ውክልና ምስሎች (በግራ) እና መጠናዊ (በቀኝ) በልብ ቁርጥራጭ በ Masson trichrome spot (Scale bare = 500 µm) (n = 10 slices/ቡድን እያንዳንዳቸው ከተለያዩ አሳማዎች, የአንድ-መንገድ ANOVA ሙከራ; #### p <0.0001 ከ D0 እና 0001 ጋር ሲነጻጸር ***t) c Репрезентативные изображения (слева) እና ኮሊኬስትቬንኒያ ኦስተንካ (ስፓራቫ) сштаб без покрытия = 500 ሚሜ с D0 እና *** p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl)። ሐ በሜሶን trichrome እድፍ (ያልተሸፈነ ሚዛን = 500 µm) (n = 10 ክፍሎች/ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች፣ የአንድ መንገድ ANOVA ሙከራ ተከናውኗል፤ #### p <0 .0001) ከD0 እና ***2t ጋር ሲወዳደር D0 እና ***2t ከ 0. ጋር ሲወዳደር ሐ) የልብ ክፍሎችን የሚወክሉ ምስሎች (በግራ) እና መጠናቸው (በቀኝ)። ሐ 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度（右）（裸尺度） 5m = 5片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 C 用 masson 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 心脏 切片500 µm) （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 አኖቫ 测试；1 *** ገጽ <0.001 与D12 Ctrl 相比） c Репрезентативные изображения (слева) እና ኮሊኬስትቬንዪ አናሊዝ (ስፕራቫ) стая шкала = 500 мкм анализа ;### #p <0,0001 по сравнению с D0, ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). ሐ በሜሶን trichrome እድፍ (ባዶ = 500 µm) (ባዶ = 500 µm) (ባዶ = 10 ክፍሎች/ቡድን, እያንዳንዱ የተለየ አሳማ, የልዩነት አንድ-መንገድ ትንተና የተፈተነ) የልብ ክፍሎች መካከል መጠን (በስተቀኝ) ምስሎች (በግራ) እና መጠናቸው (ቀኝ) ከ D0.0.2 ጋር ሲነጻጸር, D0.0.የስህተት አሞሌዎች አማካይ ± መደበኛ መዛባትን ይወክላሉ።
ትንንሽ ሞለኪውሎችን ወደ ባህል ሚዲያ በማከል የካርዲዮሚዮሳይት ትክክለኛነት ሊሻሻል እና በሲቲሲኤም ባህል ወቅት ፋይብሮሲስ እድገት ሊቀንስ እንደሚችል ገምተናል።ስለዚህ አነስተኛ ቁጥር ባላቸው ግራ የሚያጋቡ ሁኔታዎች ምክንያት የማይንቀሳቀስ የቁጥጥር ባህላችንን በመጠቀም ትናንሽ ሞለኪውሎችን አጣርተናል።ለዚህ ስክሪን Dexamethasone (Dex)፣ ትሪዮዶታይሮኒን (T3) እና SB431542 (SB) ተመርጠዋል።እነዚህ ትናንሽ ሞለኪውሎች ቀደም ሲል በ hiPSC-CM ባህሎች ውስጥ የ sarcomere ርዝመትን፣ ቲ-ቱቡሎችን እና የመተላለፊያ ፍጥነትን በመጨመር የካርዲዮሚዮይስቶችን ብስለትን ለማነሳሳት ጥቅም ላይ ውለዋል።በተጨማሪም, ሁለቱም Dex (a glucocorticoid) እና SB እብጠት 29,30 ን ለመግታት ይታወቃሉ.ስለዚህ, የእነዚህ ትናንሽ ሞለኪውሎች አንድ ወይም ጥምረት ማካተት የልብ ክፍሎችን መዋቅራዊ ጥንካሬን እንደሚያሻሽል ሞከርን.ለመጀመሪያው የማጣሪያ ምርመራ የእያንዳንዱ ውህድ መጠን በሴል ባህል ሞዴሎች (1 μM Dex27, 100 nM T327 እና 2.5 μM SB31) በተለምዶ ጥቅም ላይ በሚውሉት ስብስቦች ላይ ተመርኩዞ ተመርጧል.ከ 12 ቀናት ባህል በኋላ የቲ 3 እና ዴክስ ጥምረት በጣም ጥሩ የካርዲዮሚዮሳይት መዋቅራዊ ትክክለኛነት እና አነስተኛ ፋይበር ማሻሻያ አስገኝቷል (ተጨማሪ ምስል 4 እና 5)።በተጨማሪም፣ እነዚህን የT3 እና Dex ድርብ ወይም ድርብ ውህዶችን መጠቀም ከመደበኛ ክምችት (ተጨማሪ ምስል 6a፣b) ጋር ሲወዳደር ጎጂ ውጤት አስገኝቷል።
ከመጀመሪያው የማጣሪያ ምርመራ በኋላ፣ የ4 የባህል ሁኔታዎችን ከራስ ወደ-ራስ ንፅፅር አደረግን (ምስል 4 ሀ)፡ Ctrl: የልብ ክፍሎች ቀደም ሲል በተገለፀው የማይንቀሳቀስ ባህላችን የተመቻቸ ሚዲያን በመጠቀም የሰለጠኑ ናቸው።20.21 TD: T3 እና Ctrl s ታክሏል ዴክስ እሮብ;MC: የልብ ክፍሎች ቀደም ሲል የተመቻቸ ሚዲያችንን በመጠቀም በሲቲሲኤም ውስጥ የሰለጠኑ;እና ኤምቲ፡ CTCM ከ T3 እና Dex ጋር ወደ መካከለኛው ተጨምሯል።ከ12 ቀናት እርባታ በኋላ፣ የኤምኤስ እና የኤምቲ ቲሹዎች አዋጭነት ልክ እንደ ትኩስ ቲሹዎች በኤምቲቲ ምርመራ (ምስል 4ለ) ይቆያሉ።የሚገርመው ነገር፣ የT3 እና Dex ወደ ትራንስዌል ባህሎች (TD) መጨመር ከ Ctrl ሁኔታዎች ጋር ሲነፃፀሩ ከፍተኛ መሻሻል አላሳየም፣ ይህም የልብ ክፍሎችን አዋጭነት ለመጠበቅ የሜካኒካል ማነቃቂያ ጠቃሚ ሚና እንዳለው ያሳያል።
የሜካኒካል ማነቃቂያ እና የቲ 3/ዴክስ ማሟያ ውጤትን ለ12 ቀናት ለመገምገም የሚያገለግሉትን አራት የባህል ሁኔታዎች የሚያሳይ የሙከራ ንድፍ ንድፍ። b ባር ግራፍ በ4ቱም የባህል ሁኔታዎች (Ctrl፣ TD፣ MC እና MT) ከትኩስ የልብ ቁርጥራጭ (D0) (n = 18 (D0)፣ 15 (D12 Ctrl፣ D12 TD እና D12 MT)፣ 12 (D12 TD እና D12 MT)፣ 12 (D12 TD እና D12 MT)፣ 12(D12 MC) pigs/Group-Oneway ተፈፀመ። 01, ###p <0.001 ከ D0 እና ** p <0.01 ጋር ሲነጻጸር ከ D12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር). b ባር ግራፍ በ4ቱም የባህል ሁኔታዎች (Ctrl፣ TD፣ MC እና MT) ከትኩስ የልብ ቁርጥራጭ (D0) (n = 18 (D0)፣ 15 (D12 Ctrl፣ D12 TD እና D12 MT)፣ 12 (D12 TD እና D12 MT)፣ 12 (D12 TD እና D12 MT)፣ 12(D12 MC) pigs/Group-Oneway ተፈፀመ። 01, ###p <0.001 ከ D0 እና ** p <0.01 ጋር ሲነጻጸር ከ D12 ctrl ጋር ሲነጻጸር). b Гистограмма показывает количественую оценку ирования (контроль, TD, MC እና MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0)፣ 15 (D12 Ctrl፣ D12 TD)፣ ኤም.ቲ.ዲ. уппу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0 и **1 сравнению с D0 и ** ). ለ ባር ግራፉ በ 12 ቀናት ድህረ ባህል በሁሉም የ 4 የባህል ሁኔታዎች (ቁጥጥር, TD, MC, እና MT) ከ ትኩስ የልብ ክፍሎች (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, እና D12 MT), 12 (D12 MC) የተለያዩ ክፍሎች / ግሮ 0 (D12 MC) የተለያዩ ክፍሎች / ግሮ 0. 01, ###p <0.001 vs. D0 እና **p <0.01 ከ D12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)። b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (12) ዲአርኤል 18 (D0) 12 ኤምቲ)፣来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA控制)።ለ 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC እና MT) по сравнению (ኤምቲ) 18 (D0)፣ 15 (D12 Ctrl፣ D12 TD እና D12 MT)፣ от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест # ANOVA; ###0#p <0፣#0#p <0፣ ю с D0፣ **p <0,01 по сравнению с контролем D12)። b ሂስቶግራም ሁሉንም የ 4 የባህል ሁኔታዎች (ቁጥጥር, TD, MC እና MT) ከ ትኩስ የልብ ክፍሎች (D0) ጋር ሲነጻጸር (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD እና D12 MT), ከተለያዩ አሳማዎች 12 (D12 MC) ክፍሎች / ቡድን, አንድ-መንገድ ANOVA ፈተና, # 0 # 0 # 1 <0. p<0.01 vs. መቆጣጠሪያ D12). c ባር ግራፍ የግሉኮስ ፍሰት መጠን ከ12 ቀናት በኋላ ባሕል በሁሉም 4 የባህል ሁኔታዎች (Ctrl, TD, MC, እና MT) ከ ትኩስ የልብ ቁርጥራጭ (D0) ጋር ሲነጻጸር (n = 6 ሾጣጣዎች/ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች, የአንድ-መንገድ ANOVA ምርመራ ይካሄዳል; ###p <0.001, ከ D0 እና *** 0t ጋር ሲነጻጸር ከ D0 እና ***2 p <0.) ጋር ሲነጻጸር. c ባር ግራፍ የግሉኮስ ፍሰት መጠን ከ12 ቀናት በኋላ ባሕል በሁሉም 4 የባህል ሁኔታዎች (Ctrl, TD, MC, እና MT) ከ ትኩስ የልብ ቁርጥራጭ (D0) ጋር ሲነጻጸር (n = 6 ሾጣጣዎች/ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች, የአንድ-መንገድ ANOVA ምርመራ ይካሄዳል; ###p <0.001, ከ D0 እና *** 0t ጋር ሲነጻጸር ከ D0 እና ***2 p <0.) ጋር ሲነጻጸር. c Гистограмма показывает количественую ирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению няется тест ANOVA; ###p <0,001 по сравнению с D0 и ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). ሐ ሂስቶግራም የግሉኮስ ፍሰት ከ12 ቀናት በኋላ በሁሉም የ 4 ባህል ሁኔታዎች (ቁጥጥር ፣ ቲዲ ፣ ኤምሲ እና ኤምቲ) ከ ትኩስ የልብ ክፍሎች (D0) ጋር ሲነፃፀር ያሳያል (n = 6 ክፍሎች / ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች ፣ የአንድ-መንገድ ANOVA ሙከራ ፣ ###p <0.001 ከ D0 እና *** p <0.001 ጋር ሲነፃፀር)። c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 玡件（Ctrl、TD、ኤምሲ通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA . ሐ相比). c Гистограмма, показывающая количественную льтивирования (контроль, TD, MC и MT) посравнению Были проведены ቴስት አኖቫ፤ ###p <0,001 по сравнению с D0, ***p <0,001 по сравнению с D12 (контроль)። ሐ ሂስቶግራም የግሉኮስ ፍሰት በ 12 ቀናት ውስጥ ከባህል በኋላ ለ 4 ቱ የባህል ሁኔታዎች (ቁጥጥር ፣ TD ፣ MC እና MT) ከ ትኩስ የልብ ክፍሎች (D0) ጋር ሲነፃፀር (n = 6 ክፍሎች / ቡድን ፣ ከተለያዩ አሳማዎች ፣ ነጠላ የ Were ANOVA ሙከራዎች ተካሂደዋል ፣ ### p <0.001 ከ D0.02 ጋር ሲነፃፀር)d ውጥረት ትንተና ሴራ ትኩስ (ሰማያዊ) ቀን 12 MC (አረንጓዴ) እና ቀን 12 ኤምቲ (ቀይ) ቲሹዎች በአሥር የክልል ቲሹ ክፍል ነጥቦች (n = 4 ቁርጥራጮች / ቡድን, አንድ-መንገድ ANOVA ፈተና, ቡድኖች መካከል ጉልህ ልዩነት አልነበረም).ሠ የእሳተ ገሞራ ሴራ በተለየ ሁኔታ የተገለጡ ጂኖችን በአዲስ የልብ ክፍሎች (D0) በስታቲክ ሁኔታዎች (Ctrl) ወይም በኤምቲ ሁኔታዎች (ኤምቲ) ለ10-12 ቀናት ከሰለጠኑ የልብ ክፍሎች ጋር ሲነፃፀር ያሳያል።በእያንዳንዱ የባህል ሁኔታ ስር የሰለጠኑ የልብ ክፍሎች የሳርኩሜር ጂኖች የሙቀት ካርታ።የስህተት አሞሌዎች አማካይ ± መደበኛ መዛባትን ይወክላሉ።
ከቅባት አሲድ ኦክሳይድ ወደ ግላይኮላይሲስ መቀየር ላይ ያለው የሜታቦሊክ ጥገኝነት የካርዲዮሚዮሳይት ልዩነት መለያ ምልክት ነው።ያልበሰለ ካርዲዮሚዮይስቶች በዋናነት ግሉኮስን ለኤቲፒ ምርት ይጠቀማሉ እና hypoplastic mitochondria ከስንት cristae5,32 ጋር አላቸው።የግሉኮስ አጠቃቀም ትንታኔዎች በ MC እና MT ሁኔታዎች ውስጥ የግሉኮስ አጠቃቀም በቀን 0 ቲሹዎች (ምስል 4 ሐ) ውስጥ ካለው ጋር ተመሳሳይ ነው.ይሁን እንጂ የ Ctrl ናሙናዎች ከ ትኩስ ቲሹ ጋር ሲነጻጸር የግሉኮስ አጠቃቀም ላይ ከፍተኛ ጭማሪ አሳይተዋል.ይህ የሚያመለክተው የሲቲሲኤም እና የቲ 3/ዴክስ ውህደት የሕብረ ሕዋሳትን ህያውነት እንደሚያሳድግ እና የ12-ቀን የሰለጠኑ የልብ ክፍሎችን ሜታቦሊዝምን እንደሚጠብቅ ያሳያል።በተጨማሪም፣ የጭንቀት ትንተና እንደሚያሳየው የውጥረት መጠን ልክ እንደ ትኩስ የልብ ቲሹ ለ12 ቀናት በኤምቲ እና በኤምኤስ ሁኔታዎች (ምስል 4d) ውስጥ እንዳለ ይቆያል።
በልዩ ግላይዜሽን ሕብረ ሕዋሳት በዓለም አቀፍ ደረጃ የ CTCM እና T3 / ዲክስ አጠቃላይ ተፅእኖን ለመተንተን ከሁሉም አራት የተለያዩ የባህል ሁኔታዎች (የተጨማሪ መረጃዎች 1) በዲኒካዊ ቁራጮችን ላይ የ RNASEASEQ ን እናከናውን ነበር.የሚገርመው፣ የኤምቲኤ ክፍሎች ከ13,642 ጂኖች ውስጥ 16 ብቻ በተለየ ሁኔታ የተገለጹት ከአዲስ የልብ ቲሹ ጋር ከፍተኛ የጽሑፍ ግልባጭ ተመሳሳይነት አሳይተዋል።ነገር ግን፣ ቀደም ብለን እንዳሳየነው፣ የCtrl ቁርጥራጭ በባህል ከ10-12 ቀናት በኋላ 1229 በተለየ መልኩ የተገለጹ ጂኖች አሳይተዋል (ምስል 4e)።እነዚህ መረጃዎች የተረጋገጡት በqRT-PCR የልብ እና ፋይብሮብላስት ጂኖች (ተጨማሪ ምስል 7a-c) ነው።የሚገርመው ነገር, የ Ctrl ክፍሎች የልብ እና የሴል ዑደት ጂኖችን መቆጣጠር እና የጂን ፕሮግራሞችን ማግበር አሳይተዋል.እነዚህ መረጃዎች እንደሚያመለክቱት ከረዥም ጊዜ ባህል በኋላ በተለምዶ የሚከሰተው ልዩነት በኤምቲ ሁኔታዎች (ተጨማሪ ምስል 8a,b) ሙሉ በሙሉ ይቀንሳል.ስለ sarcomere ጂኖች በጥንቃቄ የተደረገ ጥናት እንደሚያሳየው በኤምቲ ሁኔታዎች ውስጥ ብቻ sarcomere (ምስል 4f) እና ion channel (ተጨማሪ ምስል 9) ኢንኮዲንግ የሚያደርጉ ጂኖች ተጠብቀው በ Ctrl ፣ TD እና MC ሁኔታዎች ስር ከመጨቆን ይከላከላሉ ።እነዚህ መረጃዎች እንደሚያሳዩት በሜካኒካል እና አስቂኝ ማነቃቂያ (T3/Dex) ጥምረት የልብ ቁርጥራጭ ትራንስክሪፕት በባህል ከ12 ቀናት በኋላ ትኩስ የልብ ቁርጥራጭ ጋር ሊመሳሰል ይችላል።
እነዚህ የጽሑፍ ግኝቶች የሚደገፉት በልብ ክፍሎች ውስጥ ያሉት የካርዲዮሚዮይተስ መዋቅራዊ ጥንካሬ በ MT ሁኔታዎች ውስጥ ለ 12 ቀናት በተሻለ ሁኔታ ተጠብቆ ይቆያል ፣ እንደሚታየው ባልተነካ እና በአከባቢው connexin 43 (ምስል 5 ሀ)።በተጨማሪም, በ MT ሁኔታዎች ውስጥ በልብ ክፍሎች ውስጥ ያለው ፋይብሮሲስ ከ Ctrl ጋር ሲነጻጸር እና ከአዲስ የልብ ክፍሎች ጋር ተመሳሳይ ነው (ምስል 5b).እነዚህ መረጃዎች እንደሚያሳዩት የሜካኒካል ማነቃቂያ እና የቲ 3/ዴክስ ህክምና በባህል ውስጥ በልብ ክፍሎች ውስጥ የልብ መዋቅርን በተሳካ ሁኔታ ይጠብቃል.
የትሮፖኒን-ቲ (አረንጓዴ)፣ ኮንኔክሲን 43 (ቀይ) እና ዲኤፒአይ (ሰማያዊ) አዲስ ተለይተው በተለዩ የልብ ክፍሎች (D0) ወይም ለ12 ቀናት በአራቱም የልብ ክፍል ባህል ሁኔታዎች (ሚዛን ባር = 100 µm) ውስጥ ያሉ የ troponin-T (አረንጓዴ)፣ እና የዲፒአይ (ሰማያዊ) የኢሚውኖፍሎረሰንስ ምስሎች ተወካይ።). አርቲፊሻል ኢንተለጀንስ መጠን የልብ ቲሹ መዋቅራዊ አቋሙን (n = 7 (D0 እና D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC እና D12 MT) ቁርጥራጭ / ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች, አንድ-መንገድ ANOVA ፈተና; ####p <0.0001 <0.0001 ከ D0 እና 0.0 p ጋር ሲነጻጸር <0.0p <0.0. አርኤል) አርቲፊሻል ኢንተለጀንስ መጠን የልብ ቲሹ መዋቅራዊ ታማኝነት (n = 7 (D0 እና D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC እና D12 MT) ቁርጥራጭ / ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች, አንድ-መንገድ ANOVA ፈተና; #### p <0.0001 ከ D0.0.0 p <0.0001 ጋር ሲነጻጸር, 0.05. አርኤል) Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интелллекта (n = 2 2), ኤም = 2, ኤም = 2 (2) እና D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению, 01 по сравнению с D12 Ctrl)። ሰው ሰራሽ የማሰብ ችሎታን በመጠቀም የልብ ሕብረ ሕዋሳት (n = 7 (D0 እና D12 CTRE), 5/01 p <0.05 ወይም * 0.01 p <0.01 P> ከ D12 CTRL ጋር ሲነፃፀር.对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）和D12智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p <0.0001 与D0 和*p <0.05 相比፣或****p < 0.0001 Crl对 不同 猪 的 心脏结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl）量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p <0.0001 )።በተለያዩ አሳማዎች (n = 7 (D0 እና D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC እና D12 MT) ክፍሎች / ቡድን) ውስጥ አርቲፊሻል ኢንተለጀንስ በመጠቀም የልብ ሕብረ መዋቅራዊ አቋማቸውን መጠን በአንድ-መንገድ ANOVA ፈተና;#### p <0,0001 по сравнению с D0 እና *p <0,05 ወይም ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)። #### p <0.0001 ከ D0 እና *p <0.05 ወይም ****p <0.0001 ከ D12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)። b ተወካይ ምስሎች እና የልብ ቁርጥራጭ በ Masson trichrome እድፍ (ስኬል ባር = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, እና D12 MC), 9 (D12 MT) ቁርጥራጭ / ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች, አንድ-መንገድ #D#0 ጋር ሲነጻጸር <1-መንገድ ANOVA ፈተና <0. .001፣ ወይም ****p <0.0001 ከ D12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)። b ተወካይ ምስሎች እና የልብ ቁርጥራጭ በ Masson trichrome እድፍ (ስኬል ባር = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, እና D12 MC), 9 (D12 MT) ቁርጥራጭ / ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች, አንድ-መንገድ #D#0 ጋር ሲነጻጸር <1-መንገድ ANOVA ፈተና <0. .001፣ ወይም ****p <0.0001 ከ D12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)። b Репрезентативные ка = 500 ሚሜ) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD እና D12 MC), 9 (D12 MT) 0001 по сравнению с D0 እና *** p <0,001 ወይም ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b ተወካይ ምስሎች እና የልብ ክፍሎች መጠናቸው Masson trichrome እድፍ (ሚዛን ባር = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD እና D12 MC), 9 (D12 MT) ክፍሎች / ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች ***, አንድ-መንገድ ANOVA . 1 ወይም ****p <0.0001 vs. D12 Ctrl)። b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 100% D12 MC）来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；#*##p < 0.0001 丛或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比） b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；*####p < 0.0001 0.0001或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比） b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Масскот (ሜ ) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD እና D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ, посрас 0, 0, 0, 0 p <1, 0,001 ወይም ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)። በ Masson trichrome (ሚዛን ባር = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD እና D12 MC), 9 (D12 MT) ክፍሎች ከተለያዩ አሳማዎች/ቡድን, አንድ ANOVA ዘዴ, <1> ጋር ሲነጻጸር <0#0.0 ዘዴ; #0#0.0. ****p <0.0001 ከ D12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)።የስህተት አሞሌዎች አማካይ ± መደበኛ መዛባትን ይወክላሉ።
በመጨረሻም፣ የሲቲሲኤም የልብ hypertrophyን የመምሰል ችሎታ የልብ ቲሹ ዝርጋታ በመጨመር ተገምግሟል።በሲቲሲኤም ውስጥ ከፍተኛ የአየር ክፍል ግፊት ከ 80 mmHg ወደ 80 mmHg ጨምሯል.ስነ ጥበብ.(የተለመደ ዝርጋታ) እስከ 140 mmHg Art.(ምስል 6 ሀ)ይህ የ32% የዝርጋታ ጭማሪ (ምስል 6 ለ) ጋር ይዛመዳል፣ ይህም ቀደም ሲል ለልብ ክፍሎች የሚያስፈልገው ተጓዳኝ መቶኛ ዝርጋታ በሃይፐርትሮፊ ውስጥ ከሚታየው የሳርኩሜር ርዝመት ጋር ይመሳሰላል።በመኮማተር እና በመዝናኛ ወቅት የልብ ሕብረ ሕዋሳት መዘርጋት እና ፍጥነት በስድስት ቀናት ባህል ውስጥ ቋሚ ናቸው (ምስል 6 ሐ)።ከኤምቲ ሁኔታዎች የልብ ቲሹ በተለመደው የመለጠጥ (ኤምቲ (መደበኛ)) ወይም ከመጠን በላይ የመለጠጥ ሁኔታዎች (ኤምቲ (ኦኤስ)) ለስድስት ቀናት ተዳርገዋል.ቀድሞውኑ በባህል ውስጥ ከአራት ቀናት በኋላ, hypertrophic biomarker NT-ProBNP በ MT (OS) ሁኔታዎች ውስጥ ከኤምቲ (ከተለመደው) ሁኔታዎች (ምስል 7a) ጋር ሲነፃፀር በከፍተኛ ደረጃ ከፍ ብሏል.በተጨማሪም, ከስድስት ቀናት ባህል በኋላ, በ MT (OS) (ምስል 7b) ውስጥ ያለው የሕዋስ መጠን ከ MT ልብ (መደበኛ) ክፍሎች ጋር ሲነፃፀር በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል.በተጨማሪም NFATC4 የኑክሌር ሽግግር ከመጠን በላይ በተዘረጋ ቲሹዎች ውስጥ በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል (ምስል 7 ሐ)።እነዚህ ውጤቶች ከከፍተኛ የደም ግፊት በኋላ የፓኦሎጂካል ማሻሻያ እድገትን ያሳያሉ እና የ CTCM መሣሪያ በተዘረጋ የልብ hypertrophy ምልክትን ለማጥናት እንደ መድረክ ሊያገለግል ይችላል የሚለውን ጽንሰ-ሀሳብ ይደግፋሉ።
የአየር ክፍል ግፊት፣ የፈሳሽ ክፍል ግፊት እና የቲሹ እንቅስቃሴ መለኪያዎችን የሚወክሉት የክፍሉ ግፊት የፈሳሽ ክፍል ግፊትን እንደሚቀይር ያረጋግጣሉ፣ ይህም የቲሹ ቁርጥራጭ እንቅስቃሴን ያስከትላል።b ተወካይ የመለጠጥ መቶኛ እና የመለጠጥ መጠን ኩርባዎች በመደበኛነት ለተዘረጉ (ብርቱካናማ) እና ለተዘረጋ (ሰማያዊ) የቲሹ ክፍሎች።c ባር ግራፍ የዑደት ጊዜን ያሳያል (n = 19 ቁርጥራጮች በቡድን ፣ ከተለያዩ አሳማዎች) ፣ የመቆንጠጥ ጊዜ (n = 18-19 ቁርጥራጮች በቡድን ፣ ከተለያዩ አሳማዎች) ፣ የእረፍት ጊዜ (n = 19 ቁርጥራጮች በቡድን ፣ ከተለያዩ አሳማዎች)) ፣ የሕብረ ሕዋሳት እንቅስቃሴ ስፋት (n = 14 ቁርጥራጮች / ቡድን ፣ ከተለያዩ አሳማዎች) ፣ ፒክሲቲ systolic group መጠን (n = 14 (D0), 15 (D6) ) ከተለያዩ አሳማዎች ክፍሎች/ቡድኖች), ባለ ሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ፈተና በየትኛውም ግቤት ላይ ምንም ልዩ ልዩነት አላሳየም, ይህም እነዚህ መለኪያዎች በባህል በ 6 ቀናት ውስጥ ከመጠን በላይ ቮልቴጅ ውስጥ ቋሚ ሆነው መቆየታቸውን ያሳያል.የስህተት አሞሌዎች አማካይ ± መደበኛ መዛባትን ይወክላሉ።
በባህላዊ ሚዲያ ውስጥ የ NT-ProBNP ትኩረትን የሚለካው የባር ግራፍ መጠን በኤምቲ መደበኛ ዝርጋታ (ኖርም) ወይም ከመጠን በላይ መወጠር (OS) ሁኔታዎች (n = 4 (D2 MTNorm)) ፣ 3 (D2 MTOS ፣ D4 MTNorm እና D4 MTOS) ቁርጥራጮች/ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች ፣ ባለሁለት መንገድ ANOVA ከመደበኛ ጋር ሲነፃፀር ይከናወናል ። በባህላዊ ሚዲያ ውስጥ የ NT-ProBNP ትኩረትን የሚለካው የባር ግራፍ መጠን በኤምቲ መደበኛ ዝርጋታ (ኖርም) ወይም ከመጠን በላይ መወጠር (OS) ሁኔታዎች (n= 4 (D2 MTNorm)) ፣ 3 (D2 MTOS ፣ D4 MTNorm እና D4 MTOS) ቁርጥራጮች/ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች ፣ ባለሁለት መንገድ ANOVA ከመደበኛ ጋር ሲነፃፀር ይከናወናል ።የ NT-ProBNP መጠናዊ ሂስቶግራም በባህል መካከለኛ ከ የልብ ቁርጥራጭ በመደበኛ ኤምቲ ዝርጋታ (መደበኛ) ወይም ከመጠን በላይ መጨናነቅ (ኦኤስ) (n = 4 (D2 MTNorm)) (n = 4 (D2 MTNorm)) 3 (D2 MTOS ፣ D4 MTNorm እና D4)። MTOS) ከተለያዩ አሳማዎች ቁርጥራጭ / ቡድን ፣ የልዩነት ሁለት-ደረጃ ትንተና ይከናወናል ።** p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением)። ** p <0.01 ከተለመደው ዝርጋታ ጋር ሲነጻጸር). a 在MT 正常拉伸(ኖርም) 或过度拉伸(OS) rm)፣ 3 (D2 MTOS፣D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与手析；**与︎？ . በኤምቲ መደበኛ ዝርጋታ (ኖርም) ወይም ከመጠን በላይ መወጠር (ኦኤስ) ሁኔታዎች (n= 4 (D2 MTNorm))፣ 3 (D2 MTOS፣ D4 MTNorm和D4 MTOS) ከተለያዩ የልብ ቁርጥራጭ ቁርጥራጭ ቁርጥራጭ የ NT-ProBNP ትኩረት መጠን መለኪያ; ed በመደበኛ መወጠር, p <0.01).ሂስቶግራም በመደበኛ ኤምቲ ዝርጋታ (መደበኛ) ወይም ከመጠን በላይ መወጠር (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) እና D4 MTOS) ከተለያዩ አሳማዎች የተቆራረጡ / ቡድን, የልዩነት ትንተና በሁለት መንገድ በተሰራ የልብ ቁርጥራጭ ውስጥ የ NT-ProBNP ክምችት መጠን;** p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением)። ** p <0.01 ከተለመደው ዝርጋታ ጋር ሲነጻጸር). b በtroponin-T እና WGA (በግራ) እና በሴል መጠን መለኪያ (በቀኝ) (n = 330 (D6 MTOS)፣ 369 (D6 MTNorm) ሴሎች/ቡድን ከ10 የተለያዩ ቁርጥራጮች ከተለያዩ አሳማዎች፣ ባለ ሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ፈተና ከመደበኛው ጋር ሲነፃፀር ለ ‹T-T-T እና WGA› (በግራ) ለተቀቡ የልብ ቁርጥራጭ ምስሎች ተወካይ። b በtroponin-T እና WGA (በግራ) ለተቀቡ የልብ ቁርጥራጭ ምስሎች እና የሕዋስ መጠን መጠን (በስተቀኝ) (n = 330 (D6 MTOS)፣ 369 (D6 MTNorm) ሕዋሳት/ቡድን ከ10 የተለያዩ ቁርጥራጮች ከተለያዩ አሳማዎች፣ ባለ ሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ፈተና ይከናወናል፤ 0****p <10. b Репрезентативные изображения срезов сеrdца к (справа) (n = 330 (D6 MTOS)፣ 369 (D6 MTNorm) клеток/групу из 10 разныh срезов от разных свявивяв, два- провоха юдента; ****p <0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b በ troponin-T እና AZP (በግራ) እና የሕዋስ መጠን መጠን (በቀኝ) (n = 330 (D6 MTOS)፣ 369 (D6 MTNorm) ሕዋሳት/ቡድን ከ10 የተለያዩ ክፍሎች ከተለያዩ አሳማዎች፣ ባለ ሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ፈተና ከመደበኛው ጋር ሲነጻጸር ..0.0. b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表切片的代表））来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验：0常检验）与？ )። ለ የልብ ቁርጥራጭ ምስሎች በካልካሪን-ቲ እና በ WGA (በግራ) እና በሴል መጠን (በቀኝ) (n = 330 (D6 MTOS)፣ 369 ከ10 የተለያዩ ቁርጥራጮች (D6 MTNorm)) ሴሎች/组፣两方法有尾学生 ከመደበኛው ጋር የተጣጣመ)። b Репрезентативные изображения срезов сеrdца አ) (n = 330 (D6 MTOS)፣ 369 (D6 MTNorm) ወይም 10 ራዜልሺፕ 01 по сравнению с нормальным растяжением). b በ troponin-T እና AZP (በስተግራ) ቀለም የተቀቡ የልብ ክፍሎችን የሚወክሉ ምስሎች እና የሕዋስ መጠን (በቀኝ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ከ 10 የተለያዩ ክፍሎች ከተለያዩ አሳማዎች) ሴሎች / ቡድን, ባለ ሁለት ጭራ መስፈርት የተማሪ t;****p <0.0001 ከተለመደው ውጥረት ጋር ሲነጻጸር). ሐ ለቀን 0 እና ለቀን 6 MTOS የልብ ቁርጥራጭ የበሽታ መከላከያ ምልክት የተደረገባቸው ለትሮፖኒን-ቲ እና ኤንኤፍኤTC4 እና የ NFATC4ን ወደ ሲኤምኤስ ኒውክሊየስ (n = 4 (D0) ን (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ቁርጥራጭ / ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች, ባለ ሁለት-ጅራት ተማሪ 0 ተከናውኗል; *t. ሐ ለቀን 0 እና ለቀን 6 MTOS የልብ ቁርጥራጭ የበሽታ መከላከያ ምልክት የተደረገባቸው ለ troponin-T እና NFATC4 እና NFATC4 ወደ CMs ኒውክሊየስ (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ቁርጥራጭ / ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች, ባለ ሁለት-ጅራት ተማሪ ነው; - 5. c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS нслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) тьюдента; * p <0,05) ሐ ለልብ ክፍሎች በ0 እና በ6 ቀን MTOS፣ ለ troponin-T እና NFATC4 የበሽታ መከላከያ ምልክት የተደረገባቸው እና የ NFATC4 ሽግግር በዋሻ ሴሎች ኒውክሊየስ (n = 4 (D0) ፣ 3 (D6 MTOS) ከተለያዩ አሳማዎች የተሰበሰቡ ቁርጥራጮች/ቡድን) የሚወክሉ ምስሎች;ገጽ <0.05) c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片。易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；* p) <0. ሐ የካልካኒን-ቲ እና የ NFATC4 የበሽታ መከላከያ ምስሎች 第0天和第6天MTOS የልብ ቁርጥራጭ እና NFATC4 ከተለያዩ NFATC4学生et 电影；*p <0.05)። c Репрезентативные скачать видео - ранслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерид, 5 <0)። ሐ የ MTOS የልብ ቁርጥራጭ ምስሎች በቀን 0 እና 6 ለ troponin-T እና NFATC4 immunolabeling እና የ NFATC4 ሽግግር በሲኤም ኒውክሊየስ ውስጥ ከተለያዩ አሳማዎች (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ቁርጥራጭ / ቡድን, ባለ ሁለት ጭራ t -መስፈርት; 0 .የስህተት አሞሌዎች አማካኝ ± መደበኛ መዛባትን ያመለክታሉ።
የትርጉም የልብና የደም ህክምና ጥናት የልብ አካባቢን በትክክል የሚራቡ ሴሉላር ሞዴሎችን ይፈልጋል.በዚህ ጥናት ውስጥ የአልትራቲን የልብ ክፍሎችን የሚያነቃቃ የሲቲሲኤም መሳሪያ ተዘጋጅቷል።የሲቲኤም ሲስተም ፊዚዮሎጂያዊ የተመሳሰለ ኤሌክትሮሜካኒካል ማነቃቂያ እና T3 እና Dex ፈሳሽ ማበልፀጊያን ያካትታል።የአሳማ ልብ ክፍሎች ለእነዚህ ነገሮች ሲጋለጡ፣ አዋጭነታቸው፣ መዋቅራዊ አቋማቸው፣ የሜታቦሊክ እንቅስቃሴ እና የጽሑፍ አገላለጽ ከ12 ቀን ባህል በኋላ በአዲስ የልብ ቲሹ ውስጥ እንዳለ ተመሳሳይ ናቸው።በተጨማሪም የልብ ህብረ ህዋሳትን ከመጠን በላይ መወጠር በሃይፐር ኤክስቴንሽን ምክንያት የሚከሰት የልብ የደም ግፊት መጨመር ሊያስከትል ይችላል.በአጠቃላይ እነዚህ ውጤቶች መደበኛውን የልብ ህዋሳትን ለመጠበቅ የፊዚዮሎጂ ባህል ሁኔታዎችን ወሳኝ ሚና ይደግፋሉ እና የመድሃኒት ማጣሪያ መድረክን ያቀርባሉ.
ብዙ ምክንያቶች ለ cardiomyocytes አሠራር እና ሕልውና ተስማሚ አካባቢን ለመፍጠር አስተዋፅኦ ያደርጋሉ.ከእነዚህ ምክንያቶች ውስጥ በጣም ግልጽ የሆኑት (1) የኢንተርሴሉላር መስተጋብር፣ (2) ኤሌክትሮሜካኒካል ማነቃቂያ፣ (3) አስቂኝ ሁኔታዎች እና (4) የሜታቦሊክ ንዑሳን አካላት ጋር የተያያዙ ናቸው።የፊዚዮሎጂ ሴል-ሴል መስተጋብር በውጫዊ ማትሪክስ የተደገፉ የበርካታ ሕዋስ ዓይነቶች ውስብስብ ባለ ሶስት አቅጣጫዊ አውታረ መረቦችን ይፈልጋል።እንደነዚህ ያሉት ውስብስብ ሴሉላር ግንኙነቶች በተናጥል የሕዋስ ዓይነቶችን በጋራ ባህል በብልቃጥ ውስጥ እንደገና ለመገንባት አስቸጋሪ ናቸው ፣ ግን የልብ ክፍሎችን የአካል ክፍሎች ተፈጥሮ በመጠቀም በቀላሉ ማግኘት ይችላሉ።
የልብ ፌኖታይፕ 33,34,35 ለማቆየት የሜካኒካል ዝርጋታ እና የ cardiomyocytes የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ ወሳኝ ናቸው.የሜካኒካል ማነቃቂያ ለ hiPSC-CM ኮንዲሽነር እና ብስለት በስፋት ጥቅም ላይ የዋለ ቢሆንም፣ ብዙ የሚያማምሩ ጥናቶች ዩኒያክሲያል ጭነትን በመጠቀም በባህል ውስጥ የልብ ቁርጥራጭ ሜካኒካዊ ማነቃቂያ በቅርቡ ሞክረዋል።እነዚህ ጥናቶች እንደሚያሳዩት የ 2D uniaxial ሜካኒካል ጭነት በባህል ወቅት በልብ ፍኖተ-ነገር ላይ በጎ ተጽእኖ ይኖረዋል.በነዚህ ጥናቶች፣ የልብ ክፍሎች በአይዞሜትሪክ የመሸከም ሃይሎች17፣ ሊኒያር ኦውቶኒክ ሎድንግ18፣ ወይም የልብ ዑደቱ በኃይል ተርጓሚ ግብረመልስ እና የጭንቀት መንቀሳቀሻዎችን በመጠቀም እንደገና ተፈጠረ።ይሁን እንጂ እነዚህ ዘዴዎች የአካባቢ ማመቻቸት ሳይኖር የዩኒያክሲያል ቲሹ ዝርጋታ ይጠቀማሉ, በዚህም ምክንያት ብዙ የልብ ጂኖች መጨናነቅ ወይም ከተለመደው የመለጠጥ ምላሾች ጋር የተዛመዱ ጂኖች ከመጠን በላይ መጨመር ያስከትላሉ.እዚህ ላይ የተገለጸው ሲቲሲኤም በዑደት ጊዜ እና በፊዚዮሎጂካል ዝርጋታ (25% ዝርጋታ፣ 40% systole፣ 60% diastole እና 72 ቢት በደቂቃ) የተፈጥሮ የልብ ዑደትን የሚመስል የ3D ኤሌክትሮሜካኒካል ማነቃቂያ ይሰጣል።ምንም እንኳን ይህ ባለ ሶስት አቅጣጫዊ ሜካኒካል ማበረታቻ ብቻውን የሕብረ ሕዋሳትን ትክክለኛነት ለመጠበቅ በቂ ባይሆንም, ቲ 3/ዴክስን በመጠቀም አስቂኝ እና ሜካኒካል ማነቃቂያ ጥምረት የሕብረ ሕዋሳትን አዋጭነት, ተግባር እና ታማኝነት በበቂ ሁኔታ ለመጠበቅ ያስፈልጋል.
የአስቂኝ ሁኔታዎች የጎልማሳውን የልብ ፍኖታይፕ በማስተካከል ረገድ ትልቅ ሚና ይጫወታሉ።የሕዋስ ብስለትን ለማፋጠን T3 እና Dex ወደ ባህል ሚዲያ በተጨመሩበት በHiPS-CM ጥናቶች ውስጥ ይህ ጎልቶ ታይቷል።T3 በአሚኖ አሲዶች፣ በስኳር እና በካልሲየም በሴል ሽፋኖች ላይ በማጓጓዝ ላይ ተጽእኖ ሊያሳድር ይችላል።በተጨማሪም, T3 በፅንስ CM ውስጥ ቀርፋፋ myofibrils ጋር ሲነጻጸር በበሰለ cardiomyocytes ውስጥ ፈጣን twitch myofibrils ምስረታ በማስተዋወቅ, MHC-α መግለጫ እና MHC-β downregulation ያበረታታል.በሃይፖታይሮይድ ታካሚዎች ውስጥ የቲ 3 እጥረት ማዮፊብሪላር ባንዶችን ማጣት እና የቶን እድገት ፍጥነት ይቀንሳል37.Dex glucocorticoid ተቀባይ ላይ ይሰራል እና በተናጥል ሽቱ ልብ ውስጥ myocardial contractility ለማሳደግ ታይቷል;38 ይህ መሻሻል በካልሲየም ተቀማጭ-ነክ ግቤት (SOCE) 39,40 ላይ ካለው ተጽእኖ ጋር የተያያዘ ነው ተብሎ ይታሰባል.በተጨማሪም ዴክስ ከተቀባዮቹ ጋር በማገናኘት የሰውነትን በሽታ የመከላከል አቅምን እና እብጠትን የሚገታ ሰፊ የሆነ የሴሉላር ምላሽ ይፈጥራል።
ውጤታችን እንደሚያመለክተው አካላዊ ሜካኒካል ማነቃቂያ (ኤምኤስ) አጠቃላይ የባህል አፈጻጸምን ከCtrl ጋር አሻሽሏል፣ ነገር ግን በባህል ውስጥ በ12 ቀናት ውስጥ አዋጭነትን፣ መዋቅራዊ ታማኝነትን እና የልብ ስሜትን ማስቀጠል አልቻለም።ከCtrl ጋር ሲነጻጸር የT3 እና Dex ወደ CTCM (MT) ባህሎች መጨመር አዋጭነትን አሻሽሏል እና ተመሳሳይ የመገለባበጥ መገለጫዎችን፣ መዋቅራዊ ታማኝነትን እና የሜታቦሊዝም እንቅስቃሴን በአዲስ የልብ ቲሹ ለ12 ቀናት ጠብቀዋል።በተጨማሪም የሕብረ ሕዋሳትን የመለጠጥ ደረጃን በመቆጣጠር የ STCM ስርዓትን ሁለገብነት በማሳየት በ STCM በመጠቀም hyperextension-induced የልብ hypertrophy ሞዴል ተፈጠረ።ምንም እንኳን የልብ ማሻሻያ እና ፋይብሮሲስ አብዛኛውን ጊዜ ያልተነካ የአካል ክፍሎችን የሚያካትቱ ቢሆንም የደም ዝውውር ሴሎች ተገቢውን ሳይቶኪኖች እንዲሁም phagocytosis እና ሌሎች የመልሶ ማሻሻያ ምክንያቶችን ሊያቀርቡ ቢችሉም የልብ ክፍሎች አሁንም ለጭንቀት እና ለጉዳት ምላሽ ፋይብሮቲክ ሂደትን ሊመስሉ እንደሚችሉ ልብ ሊባል ይገባል.ወደ myofibroblasts.ይህ ቀደም ሲል በዚህ የልብ ቁራጭ ሞዴል ውስጥ ተገምግሟል።እንደ tachycardia, bradycardia እና ሜካኒካል የደም ዝውውር ድጋፍ (ሜካኒካል ያልተጫነ ልብ) የመሳሰሉ ብዙ ሁኔታዎችን ለማስመሰል የሲቲሲኤም መለኪያዎችን ግፊት/ኤሌክትሪካል ስፋት እና ድግግሞሽን በመቀየር ሊስተካከል እንደሚችል ልብ ሊባል ይገባል።ይህ ስርዓቱን ለመድሃኒት ምርመራ መካከለኛ መጠን ያደርገዋል.የሲቲሲኤም ከመጠን በላይ በመጨናነቅ ምክንያት የሚከሰት የልብ ሃይፐርትሮፊን የመምሰል ችሎታ ይህንን ስርዓት ለግል ብጁ ህክምና ለመፈተሽ መንገድ ይከፍታል።በማጠቃለያው, አሁን ያለው ጥናት እንደሚያሳየው የሜካኒካል ዝርጋታ እና አስቂኝ ማነቃቂያ የልብ ቲሹ ክፍሎች ባህልን ለመጠበቅ ወሳኝ ናቸው.
ምንም እንኳን እዚህ ላይ የቀረበው መረጃ ሲቲኤም ያልተነካ myocardiumን ለመቅረጽ በጣም ተስፋ ሰጪ መድረክ ቢሆንም ይህ የባህል ዘዴ አንዳንድ ገደቦች አሉት።የ CTCM ባህል ዋናው ነገር በዋናነት በእያንዳንዱ ዑደት ወቅት የልብ ምት መሳሪያን የመቆጣጠር ችሎታን የሚያግድ ነው.በተጨማሪም በትንሽ መጠን የልብ ክፍሎች (7 ሚሜ) ምክንያት, ባህላዊ የሃይል ዳሳሾችን በመጠቀም የሲስቶሊክ ተግባርን ከባህል ስርዓቶች ውጭ የመገምገም ችሎታ ውስን ነው.አሁን ባለው የእጅ ጽሁፍ ውስጥ, የኦፕቲካል ቮልቴጅን እንደ የኮንትራት ተግባር አመልካች በመገምገም ይህንን ገደብ በከፊል እናሸንፋለን.ነገር ግን ይህ ገደብ ተጨማሪ ስራን የሚጠይቅ እና በባህላዊ የልብ ቁርጥራጭ ተግባራት ላይ የእይታ ክትትል ዘዴዎችን በማስተዋወቅ እንደ ካልሲየም እና የቮልቴጅ ሴንሲቲቭ ማቅለሚያዎችን በመጠቀም የኦፕቲካል ካርታ ስራን ወደፊት ሊፈታ ይችላል።ሌላው የሲቲሲኤም ገደብ የሥራው ሞዴል የፊዚዮሎጂያዊ ጭንቀትን (ቅድመ ጭነት እና ጭነት) አለመቆጣጠር ነው.በሲቲሲኤም ውስጥ 25% ፊዚዮሎጂካል ዝርጋታ በዲያስቶል (ሙሉ ዝርጋታ) እና systole (በኤሌክትሪክ ማነቃቂያ ጊዜ የሚቆይ የኮንትራት ርዝመት) በጣም ትላልቅ ቲሹዎች ውስጥ እንዲራቡ በተቃራኒ አቅጣጫዎች ግፊት ተፈጠረ።ይህ ገደብ በወደፊት የሲቲሲኤም ዲዛይኖች ከሁለቱም በኩል ባለው የልብ ቲሹ ላይ በቂ ጫና በመፍጠር እና በልብ ክፍሎች ውስጥ የሚከሰተውን ትክክለኛ የግፊት መጠን ግንኙነቶችን በመተግበር መወገድ አለበት።
በዚህ የእጅ ጽሁፍ ላይ የተዘገበው ከመጠን በላይ በመዘርጋት ምክንያት የተደረገው የማሻሻያ ግንባታ ሃይፐርትሮፊክ ሃይፐርስትሪች ምልክቶችን በመኮረጅ የተገደበ ነው።ስለዚህ, ይህ ሞዴል አስቂኝ ወይም የነርቭ ሁኔታዎች ሳያስፈልግ (በዚህ ስርዓት ውስጥ የማይገኙ) በተዘረጋው hypertrophic ምልክት ላይ ጥናት ላይ ሊረዳ ይችላል.የሲቲሲኤምን ብዜት ለመጨመር ተጨማሪ ጥናቶች ያስፈልጋሉ ለምሳሌ ከበሽታ ተከላካይ ሕዋሳት ጋር አብሮ ማሳደግ፣የፕላዝማ አስቂኝ ሁኔታዎችን ማሰራጨት እና ከኒውሮናል ህዋሶች ጋር አብሮ ሲለማመዱ የውስጥ ለውስጥ ከሲቲሲኤም ጋር በሽታ አምሳያ የመሆን እድልን ያሻሽላል።
በዚህ ጥናት ውስጥ 13 አሳማዎች ጥቅም ላይ ውለዋል.ሁሉም የእንስሳት ሂደቶች የተከናወኑት በተቋማዊ መመሪያ መሰረት ሲሆን በሉዊስቪል ዩኒቨርሲቲ ተቋማዊ የእንስሳት እንክብካቤ እና አጠቃቀም ኮሚቴ ጸድቋል።የአኦርቲክ ቅስት ተጣብቆ እና ልብ በ 1 ኤል የማይጸዳ ካርዲዮፕሌጂያ (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml heparin, pH) እስከ 7.4. በበረዶ ላይ ወደ ላቦራቶሪ እስኪጓጓዝ ድረስ ልቦች በበረዶ-ቀዝቃዛ የካርዲዮፕሌጂክ መፍትሄ ተጠብቀው ነበር ይህም ብዙውን ጊዜ <10 ደቂቃ ነው. በበረዶ ላይ ወደ ላቦራቶሪ እስኪጓጓዝ ድረስ ልቦች በበረዶ-ቀዝቃዛ የካርዲዮፕሌጂክ መፍትሄ ተጠብቀው ነበር ይህም ብዙውን ጊዜ <10 ደቂቃ ነው. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обымы. በበረዶ ላይ ወደ ላቦራቶሪ እስኪጓጓዝ ድረስ ልብ በበረዶ-ቀዝቃዛ የካርዲዮፕሌጂክ መፍትሄ ውስጥ ተከማችቷል ፣ ይህም ብዙውን ጊዜ <10 ደቂቃ ይወስዳል።将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировky в лабораторию на льду, обыchно <10 мин. በበረዶ ላይ ወደ ላቦራቶሪ እስኪጓጓዝ ድረስ ልብን በበረዶ ካርዲዮፕሌጂያ ላይ ያቆዩ፣ ብዙውን ጊዜ <10 ደቂቃ።
የሲቲሲኤም መሳሪያው የተሰራው በ SolidWorks ኮምፒውተር የታገዘ ዲዛይን (CAD) ሶፍትዌር ነው።የባህል ክፍሎቹ፣ መከፋፈያዎች እና የአየር ክፍሎች ከሲኤንሲ ግልጽ አሲሪክ ፕላስቲክ የተሰሩ ናቸው።የ 7ሚሜ ዲያሜትር የመጠባበቂያ ቀለበት በመሃል ላይ ካለው ከፍተኛ ጥግግት ፖሊ polyethylene (HDPE) የተሰራ ሲሆን ሚዲያውን ከስር ለመዝጋት የሚያገለግለውን የሲሊኮን ኦ-ሪንግ ለማስተናገድ የ o-ring ግሩቭ አለው።ቀጭን የሲሊካ ሽፋን የባህላዊ ክፍሉን ከመለያው ሳህን ይለያል.የሲሊኮን ሽፋን ሌዘር ከ 0.02 ኢንች ውፍረት ያለው የሲሊኮን ወረቀት የተቆረጠ እና 35A ጥንካሬ አለው.የታችኛው እና የላይኛው የሲሊኮን ጋኬቶች ሌዘር ከ1/16 ኢንች ውፍረት ባለው የሲሊኮን ሉህ የተቆረጡ እና 50A ጥንካሬ አላቸው።316L የማይዝግ ብረት ብሎኖች እና ክንፍ ለውዝ ማገጃ ለመሰካት እና አየር የማያሳልፍ ማኅተም ለመፍጠር ጥቅም ላይ ይውላሉ.
ራሱን የቻለ የታተመ የወረዳ ሰሌዳ (ፒሲቢ) ከC-PACE-EM ስርዓት ጋር እንዲዋሃድ ተዘጋጅቷል።በፒሲቢ ላይ ያለው የስዊስ ማሽን ማገናኛ ሶኬቶች ከግራፋይት ኤሌክትሮዶች ጋር በብር-የተለጠፉ የመዳብ ሽቦዎች እና የነሐስ 0-60 ዊልስ ወደ ኤሌክትሮዶች ተያይዘዋል።የታተመው የሰሌዳ ሰሌዳ በ 3-ል አታሚ ሽፋን ውስጥ ይቀመጣል.
የ CTCM መሳሪያው የሚቆጣጠረው በፕሮግራም ሊሰራ የሚችል የሳንባ ምች (PPD) ሲሆን ይህም እንደ የልብ ዑደት አይነት ቁጥጥር የሚደረግበት የደም ዝውውር ግፊት ይፈጥራል።በአየር ክፍሉ ውስጥ ያለው ግፊት እየጨመረ ሲሄድ, ተጣጣፊው የሲሊኮን ሽፋን ወደ ላይ ይስፋፋል, መካከለኛውን በቲሹ ቦታ ስር ያስገድዳል.ከዚያም በዲያስቶል ወቅት የልብን ፊዚዮሎጂያዊ መስፋፋት በመምሰል የሕብረ ሕዋሳት አካባቢ በዚህ ፈሳሽ ማስወጣት ይለጠጣል.በመዝናኛ ጫፍ ላይ የኤሌትሪክ ማነቃቂያ በግራፍ ኤሌክትሮዶች በኩል ተተግብሯል, ይህም በአየር ክፍሉ ውስጥ ያለውን ግፊት በመቀነስ እና የቲሹ ክፍሎች መኮማተርን አስከትሏል.በቧንቧው ውስጥ በአየር ስርአት ውስጥ ያለውን ግፊት ለመለየት የግፊት ዳሳሽ ያለው ሄሞስታቲክ ቫልቭ አለ።በግፊት ዳሳሽ የሚሰማው ግፊት ከላፕቶፑ ጋር በተገናኘ መረጃ ሰብሳቢ ላይ ይተገበራል።ይህ በጋዝ ክፍል ውስጥ ያለውን ግፊት የማያቋርጥ ክትትል ያደርጋል.ከፍተኛው የቻምበር ግፊት (መደበኛ 80 ሚሜ ኤችጂ፣ 140 ሚሜ ኤችጂ ኦኤስ) ሲደርስ የመረጃ ማግኛ መሳሪያው ለ C-PACE-EM ሲስተም ለ 2 ms የቢፋሲክ ቮልቴጅ ሲግናል ወደ 4 ቮ ተዘጋጅቶ እንዲልክ ታዝዟል።
የልብ ክፍሎች ተገኝተዋል እና በ 6 ጉድጓዶች ውስጥ የባህል ሁኔታዎች እንደሚከተለው ተካሂደዋል-የተሰበሰቡትን ልብዎች ከማስተላለፊያ ዕቃ ወደ ቀዝቃዛ (4 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ) ካርዲዮፕሌጂያ ወደያዘ ትሪ ያስተላልፉ.የግራ ventricle በጸዳ ምላጭ ተለይቷል እና ከ1-2 ሴ.ሜ.3 ቁርጥራጮች ተቆርጧል።እነዚህ የቲሹ ብሎኮች ከቲሹ ማጣበቂያ ጋር በቲሹ ድጋፎች ላይ ተያይዘዋል እና በሚርገበገብ ማይክሮቶሜ ቲሹ መታጠቢያ ውስጥ የታይሮድ መፍትሄ እና ያለማቋረጥ ኦክሲጅን (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g)), 6 mM KCl (0.40se0) (D) ኤስ (2.38 ግ)፣ 1 ሚሜ ኤምጂCl2 (1 ml 1 M መፍትሄ)፣ 1.8 ሚሜ CaCl2 (1.8 ml 1 M መፍትሄ)፣ እስከ 1 L ddH2O)።የሚንቀጠቀጠው ማይክሮቶሜ 300 µm ውፍረት ያላቸውን ቁርጥራጮች በ80 Hz ድግግሞሽ፣ በአግድም የንዝረት ስፋት 2 ሚሜ እና የቅድሚያ ፍጥነቱ 0.03 ሚሜ/ሰ።መፍትሄው እንዲቀዘቅዝ የቲሹ መታጠቢያው በበረዶ የተከበበ ሲሆን የሙቀት መጠኑ በ 4 ° ሴ.ለአንድ የባህል ሳህን በቂ ክፍሎች እስኪገኙ ድረስ የቲሹ ክፍሎችን ከማይክሮቶም መታጠቢያ ገንዳ ወደ ማቀፊያ መታጠቢያ ያስተላልፉ።ለትራንስዌል ባህሎች የቲሹ ክፍሎች ከ 6 ሚሊ ሜትር ስፋት የ polyurethane ድጋፎች ጋር ተያይዘዋል እና በ 6 ሚሊር የተመቻቸ መካከለኛ (199 መካከለኛ ፣ 1x ITS ተጨማሪ ፣ 10% FBS ፣ 5 ng/ml VEGF ፣ 10 ng/ml FGF-alkaline እና 2X አንቲባዮቲክ-ፀረ-ፈንገስ)።የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ (10 ቮ, ድግግሞሽ 1.2 Hz) በቲሹ ክፍሎች ላይ በሲ-ፒስ በኩል ተተግብሯል.ለቲዲ ሁኔታዎች ትኩስ T3 እና Dex በ 100 nM እና 1 μM በእያንዳንዱ መካከለኛ ለውጥ ተጨምረዋል።መካከለኛው በቀን 3 ጊዜ ከመተካት በፊት በኦክስጅን ይሞላል.የሕብረ ሕዋስ ክፍሎች በ 37 ዲግሪ ሴንቲግሬድ እና በ 5% CO2 ውስጥ በማቀፊያ ውስጥ ተሠርተዋል.
ለሲቲሲኤም ባህሎች፣ የተሻሻለ የታይሮድ መፍትሄን በያዘ በፔትሪ ምግብ ውስጥ በብጁ በተሰራ 3D አታሚ ላይ የቲሹ ክፍሎች ተቀምጠዋል።መሣሪያው የተነደፈው የልብ ቁርጥራጭ መጠን ከድጋፍ ቀለበት አካባቢ በ 25% ለመጨመር ነው።ይህ የሚደረገው ከታይሮድ መፍትሄ ወደ መሃከለኛ እና በዲያስቶል ጊዜ ውስጥ ከተዘዋወሩ በኋላ የልብ ክፍሎች እንዳይዘረጉ ነው.ሂስቶአክሪሊክ ሙጫ በመጠቀም 300 µm ውፍረት ያለው ክፍል 7 ሚሜ ዲያሜትር ባለው የድጋፍ ቀለበት ላይ ተስተካክሏል።የቲሹ ክፍሎችን ከድጋፍ ቀለበቱ ጋር ካገናኙ በኋላ, ከመጠን በላይ የሆኑትን የቲሹ ክፍሎችን ይቁረጡ እና የተገጠመውን የቲሹን ክፍል እንደገና ወደ የታይሮድ መፍትሄ መታጠቢያ ገንዳ (4 ° ሴ) ለአንድ መሳሪያ በቂ ክፍሎች እስኪዘጋጁ ድረስ ያስቀምጡ.የሁሉም መሳሪያዎች አጠቃላይ የማስኬጃ ጊዜ ከ 2 ሰዓታት መብለጥ የለበትም።6 የቲሹ ክፍሎች ከድጋፍ ቀለበታቸው ጋር ከተጣበቁ በኋላ የሲቲሲኤም መሳሪያው ተሰብስቧል።የ CTCM ባህል ክፍል በ 21 ሚሊር ቅድመ-ኦክስጅን መካከለኛ መጠን ቀድሞ ተሞልቷል.የቲሹ ክፍሎችን ወደ ባህል ክፍል ያስተላልፉ እና የአየር አረፋዎችን በ pipette በጥንቃቄ ያስወግዱ.ከዚያም የቲሹው ክፍል ወደ ጉድጓዱ ውስጥ ይመራል እና በቀስታ ወደ ቦታው ይጫናል.በመጨረሻም የኤሌክትሮል ሽፋኑን በመሳሪያው ላይ ያስቀምጡት እና መሳሪያውን ወደ ማቀፊያው ያስተላልፉ.ከዚያም CTCM ከአየር ቱቦ እና ከ C-PACE-EM ስርዓት ጋር ያገናኙ.የአየር ግፊት (pneumatic actuator) ይከፈታል እና የአየር ቫልቭ ሲቲኤምኤም ይከፍታል.የC-PACE-EM ስርዓት 4 ቮን በ1.2 ኸርዝ በሁለት ሚሴ ፍጥነት ለማድረስ ተዋቅሯል።መካከለኛው በቀን ሁለት ጊዜ ተቀይሯል እና ኤሌክትሮዶች በኤሌክትሮዶች ላይ የግራፋይት ክምችት እንዳይፈጠር በቀን አንድ ጊዜ ተለውጠዋል.አስፈላጊ ከሆነ የቲሹ ክፍሎች ከባህላቸው ጉድጓድ ውስጥ ሊወገዱ የሚችሉትን የአየር አረፋዎች በእነሱ ስር ሊወድቁ ይችላሉ.ለኤምቲ ሕክምና ሁኔታዎች፣ T3/Dex በእያንዳንዱ መካከለኛ ለውጥ ከ100 nM T3 እና 1 μM Dex ጋር አዲስ ተጨምሯል።የ CTCM መሳሪያዎች በ 37 ° ሴ እና 5% CO2 ውስጥ በማቀፊያ ውስጥ ተክለዋል.
የተዘረጉ የልብ ቁርጥራጮችን ለማግኘት ልዩ የካሜራ ስርዓት ተዘርግቷል።የSLR ካሜራ (ካኖን ሪቤል T7i፣ ካኖን፣ ቶኪዮ፣ ጃፓን) ከናቪታር አጉላ 7000 18-108ሚሜ ማክሮ ሌንስ (Navitar፣ San Francisco፣ CA) ጋር ጥቅም ላይ ውሏል።መካከለኛውን በአዲስ መካከለኛ ከተተካ በኋላ ምስላዊነት በክፍል ሙቀት ውስጥ ተካሂዷል.ካሜራው በ51° አንግል ላይ ተቀምጧል እና ቪዲዮው በሴኮንድ 30 ክፈፎች ይቀዳል።በመጀመሪያ፣ የክፍት ምንጭ ሶፍትዌር (MUSCLEMOTION43) የልብ ቁርጥኖችን እንቅስቃሴ ለመለካት ከImage-J ጋር ጥቅም ላይ ውሏል።ጭምብሉ የተፈጠረው ጫጫታ ለማስወገድ የልብ ቁርጥራጭን ለመምታት ፍላጎት ያላቸውን ክልሎች ለመግለጽ MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) በመጠቀም ነው።በእጅ የተከፋፈሉ ጭምብሎች በሁሉም ምስሎች ላይ በፍሬም ቅደም ተከተል ይተገበራሉ እና ከዚያ ወደ MUSCLEMOTION ተሰኪ ይተላለፋሉ።Muscle Motion ከማጣቀሻው ፍሬም አንጻር ያለውን እንቅስቃሴ ለመለካት በእያንዳንዱ ፍሬም ውስጥ ያሉትን የፒክሴሎች አማካኝ መጠን ይጠቀማል።መረጃው ተመዝግቧል፣ ተጣርቷል እና የዑደት ጊዜን ለመለካት እና በልብ ዑደት ውስጥ የቲሹን ዝርጋታ ለመገምገም ጥቅም ላይ ውሏል።የተቀዳው ቪዲዮ ድህረ-ቅደም ተከተል ዜሮ-ደረጃ ዲጂታል ማጣሪያ በመጠቀም ነው።የቲሹ ዝርጋታ (ከጫፍ-ወደ-ጫፍ) ለመለካት በተመዘገበው ምልክት ውስጥ ከሚገኙት ጫፎች እና ገንዳዎች መካከል ያለውን ልዩነት ለመለየት ከጫፍ እስከ ጫፍ ድረስ ትንተና ተካሂዷል።በተጨማሪም ፣ የምልክት መንቀጥቀጥን ለማስወገድ በ 6 ኛ ቅደም ተከተል ፖሊኖሚል በመጠቀም መፍታት ይከናወናል።የፕሮግራም ኮድ በ MATLAB ውስጥ የተሰራው የአለምአቀፍ የቲሹ እንቅስቃሴን፣ የዑደት ጊዜን፣ የእረፍት ጊዜን እና የመቆንጠጥ ጊዜን ለመወሰን ነው (ተጨማሪ ፕሮግራም ኮድ 44)።
ለጭንቀት ትንተና፣ ለሜካኒካል ዝርጋታ ግምገማ የተፈጠሩትን ተመሳሳይ ቪዲዮዎች በመጠቀም፣ በ MUSCLEMOTION ሶፍትዌር መሰረት በመጀመሪያ የእንቅስቃሴ ጫፎችን (ከፍተኛው (ከፍተኛ) እና ዝቅተኛ (ዝቅተኛ) የእንቅስቃሴ ነጥቦችን የሚወክሉ ሁለት ምስሎችን ፈለግን።ከዚያም የቲሹ ክልሎችን እንከፋፍለን እና የሻዲንግ ስልተ-ቀመር ቅርጽ በተከፋፈለ ቲሹ (ተጨማሪ ምስል 2 ሀ) ላይ እንተገብራለን.ከዚያም የተከፋፈለው ቲሹ ወደ አሥር የከርሰ ምድር ክፍሎች ተከፍሏል እና በእያንዳንዱ ወለል ላይ ያለው ጭንቀት በሚከተለው ቀመር ይሰላል: Strain = (Sup-Sdown) / Sdown, Sup and Sdown ከጨርቁ የላይኛው እና የታችኛው ጥላዎች የቅርጽ ርቀቶች ናቸው (ተጨማሪ ምስል .2 ለ).
የልብ ክፍሎች በ 4% ፓራፎርማልዳይድ ውስጥ ለ 48 ሰዓታት ተስተካክለዋል.ቋሚ ቲሹዎች በ 10% እና 20% sucrose ውስጥ ለ 1 ሰአት, ከዚያም በ 30% sucrose ውስጥ በአንድ ምሽት ውስጥ ይደርቃሉ.ከዚያም ክፍሎቹ በጥሩ መቁረጫ የሙቀት ውህድ (OCT ውህድ) ውስጥ ተጨምረዋል እና ቀስ በቀስ በአይሶፔንታኔ/ደረቅ የበረዶ መታጠቢያ ውስጥ ይቀዘቅዛሉ።እስኪለያዩ ድረስ የ OCT ማቀፊያዎችን በ -80 ° ሴ ያከማቹ።ስላይዶች በ 8 μm ውፍረት ያላቸው ክፍሎች ተዘጋጅተዋል.
OCT ን ከልብ ክፍሎች ለማስወገድ በ 95 ዲግሪ ሴንቲግሬድ የሙቀት መጠን ለ 5 ደቂቃዎች ስላይዶቹን ያሞቁ።በእያንዳንዱ ስላይድ ላይ 1 ml PBS ይጨምሩ እና ለ 30 ደቂቃዎች በክፍል ሙቀት ውስጥ ይጨምሩ እና ከዚያ 0.1% Triton-X በ PBS ውስጥ ለ 15 ደቂቃዎች በክፍል ሙቀት ውስጥ በማዘጋጀት ክፍሎቹን ያጥፉ።ልዩ ያልሆኑ ፀረ እንግዳ አካላት ከናሙናው ጋር እንዳይጣበቁ ለመከላከል 1 ሚሊር 3% BSA መፍትሄ በተንሸራታች ላይ ይጨምሩ እና ለ 1 ሰዓት በክፍል ሙቀት ውስጥ ይጨምሩ።ከዚያ BSA ተወግዷል እና ተንሸራታቾቹ በፒቢኤስ ታጥበዋል.እያንዳንዱን ናሙና በእርሳስ ምልክት ያድርጉበት.የመጀመሪያ ደረጃ ፀረ እንግዳ አካላት (1:200 በ 1% BSA ውስጥ የተቀጨ) (connexin 43 (Abcam; #AB11370)፣ NFATC4 (Abcam; #AB99431) እና ትሮፖኒን-ቲ (ቴርሞ ሳይንቲፊክ፣ #MA5-12960) ከ90 ደቂቃ በላይ፣ ከዚያም ሁለተኛ ደረጃ ፀረ እንግዳ አካላትን በAlexa ላይ ተጨምረዋል። ​​488 ( Thermo Scientific; #A16079)፣ ከጥንቸል አሌክሳ ፍሉር 594 (ቴርሞ ሳይንቲፊክ፣ #T6391) ለተጨማሪ 90 ደቂቃ በፒቢኤስ 3 ጊዜ ታጥበን ከበስተጀርባ ያለውን ኢላማን ለመለየት የሁለተኛ ደረጃ ፀረ እንግዳ አካላትን እንደ መቆጣጠሪያ እንጠቀማለን። nification) እና የ Keyence ማይክሮስኮፕ ከ40x ማጉላት ጋር።
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) በ 5 μg/ml በ PBS ውስጥ ለ WGA ማቅለሚያ ጥቅም ላይ ይውላል እና በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 30 ደቂቃዎች ቋሚ ክፍሎች ላይ ተተግብሯል.ከዚያም ስላይዶቹ በፒቢኤስ ታጥበው የሱዳን ጥቁር በእያንዳንዱ ስላይድ ላይ ተጨምሮ ለ 30 ደቂቃዎች ተጨምሯል።ከዚያም ስላይዶቹ በፒቢኤስ ታጥበው የቬክታሺልድ መክተቻ መካከለኛ ተጨምሯል።ስላይዶች በ Keyence ማይክሮስኮፕ በ40x ማጉላት ታይተዋል።
ኦሲቲ ከላይ እንደተገለፀው ከናሙናዎቹ ተወግዷል።OCT ን ካስወገዱ በኋላ ተንሸራታቹን በአንድ ጀምበር በቡይን መፍትሄ ውስጥ ያስገቡ።ከዚያም ስላይዶቹ ለ 1 ሰአት በንፋስ ውሃ ታጥበው ለ 10 ደቂቃዎች በቢብሪች አልዎ አሲድ ፉቺን መፍትሄ ውስጥ ይቀመጣሉ.ከዚያም ተንሸራታቾች በተጣራ ውሃ ታጥበው በ 5% ፎስፎሞሊብዲነም / 5% ፎስፎቶንግስቲክ አሲድ መፍትሄ ውስጥ ለ 10 ደቂቃዎች ይቀመጣሉ.ሳይታጠቡ, ተንሸራቶቹን በቀጥታ ወደ አኒሊን ሰማያዊ መፍትሄ ለ 15 ደቂቃዎች ያስተላልፉ.ከዚያም ስላይዶቹ በተጣራ ውሃ ታጥበው በ 1% አሴቲክ አሲድ ውስጥ ለ 2 ደቂቃዎች ይቀመጣሉ.ስላይዶች በ 200 N ኤታኖል ውስጥ ደርቀው ወደ xylene ተላልፈዋል.ባለቀለም ስላይዶች የ10x ዓላማ ያለው የ Keyence ማይክሮስኮፕ በመጠቀም ታይተዋል።የፋይብሮሲስ አካባቢ መቶኛ በ Keyence Analyzer ሶፍትዌር ተጠቅሟል።
CyQUANT™ MTT የሕዋስ አዋጭነት አሣይ (Invitrogen፣ Carlsbad፣ CA)፣ ካታሎግ ቁጥር V13154፣ በአምራቹ ፕሮቶኮል ከአንዳንድ ማሻሻያዎች ጋር።በተለይም በኤምቲቲ ትንተና ወቅት አንድ አይነት የቲሹ መጠን ለማረጋገጥ 6 ሚሊ ሜትር የሆነ ዲያሜትር ያለው የቀዶ ጥገና ቡጢ ጥቅም ላይ ውሏል።በአምራቹ ፕሮቶኮል መሰረት ቲሹዎች ለየብቻ ወደ 12-ጉድጓድ ሳህን ውስጥ MTT substrate በያዘው ጉድጓዶች ውስጥ ተጣብቀዋል።ክፍሎቹ በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ለ 3 ሰዓታት ይሞላሉ እና ህያው ቲሹ የኤምቲቲ ንኡስ አካልን በመለወጥ ሐምራዊ ፎርማዛን ውህድ ይፈጥራል.ሐምራዊ ፎርማዛንን ከልብ ክፍሎች ለማውጣት የኤምቲቲ መፍትሄን በ 1 ml ዲኤምኤስኦ ይለውጡ እና በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ለ 15 ደቂቃዎች ይቅቡት ።ናሙናዎች በዲኤምኤስኦ ውስጥ በ1፡10 በ96-ደህና ጥርት ያሉ የታችኛው ሰሌዳዎች እና ሐምራዊ ቀለም በ570 nm በCytation plate reader (BioTek) ይለካሉ።ንባቦች በእያንዳንዱ የልብ ቁርጥራጭ ክብደት ጋር ተስተካክለዋል.
ቀደም ሲል እንደተገለፀው የልብ ቁርጥራጭ ሚዲያ 1 μCi/ml [5-3H] -glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) በያዘ ሚዲያ ተተክቷል።ከ4 ሰአታት ቆይታ በኋላ 100 μl መካከለኛ ወደ ክፍት የማይክሮ ሴንትሪፉጅ ቱቦ 100 μl 0.2 N HCl ይጨምሩ።ከዚያም ቱቦው በ 500 μl dH2O በያዘ scintillation ቱቦ ውስጥ እንዲተን [3H] 2O ለ 72 ሰዓታት በ 37 ° ሴ.ከዚያም ማይክሮ ሴንትሪፉጅ ቱቦን ከስኒው ቱቦ ውስጥ ያስወግዱ እና 10 ሚሊ ሊትር ፈሳሽ ፈሳሽ ይጨምሩ.Scintillation ቆጠራዎች Tri-Carb 2900TR ፈሳሽ scintillation analyzer (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA) በመጠቀም ይከናወናሉ.ከዚያም የግሉኮስ አጠቃቀም በ[5-3H] -የግሉኮስ ልዩ እንቅስቃሴ፣ ያልተሟላ ሚዛናዊነት እና ዳራ፣ ከ[5-3H] - ወደ ላልተሰየመ የግሉኮስ ቅይጥ እና የሳይንቲልሽን ቆጣቢነት ግምት ውስጥ በማስገባት ይሰላል።መረጃው ወደ የልብ ክፍሎች ብዛት መደበኛ ነው።
በትሪዞል ውስጥ የቲሹ ግብረ-ሰዶማዊነት ከተሰራ በኋላ አር ኤን ኤ በአምራቹ ፕሮቶኮል መሠረት Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 በመጠቀም ከልብ ክፍሎች ተለይቷል።የ RNAsec ቤተ መፃህፍት ዝግጅት፣ ቅደም ተከተል እና የመረጃ ትንተና እንደሚከተለው ተካሂዷል።
1 μg አር ኤን ኤ በአንድ ናሙና ለአር ኤን ኤ ቤተ-መጽሐፍት ዝግጅት እንደ መነሻ ጥቅም ላይ ውሏል።የአምራቹ ምክሮችን በመከተል NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit for Illumina (NEB, USA) በመጠቀም ተከታታይ ቤተ-መጻሕፍት ተፈጥረው ነበር እና ለእያንዳንዱ ናሙና የባህሪ ቅደም ተከተሎች ጠቋሚ ኮዶች ተጨምረዋል።ባጭሩ፣ ኤምአርኤን ከፖሊ-ቲ ኦሊጎኑክሊዮታይድ ጋር የተያያዙ መግነጢሳዊ ዶቃዎችን በመጠቀም ከጠቅላላ አር ኤን ኤ ተነጻ።መቆራረጥ የሚከናወነው በከፍተኛ ሙቀት በ NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) ውስጥ ዲቫለንት cations በመጠቀም ነው።የመጀመሪያው ሲዲኤንኤ የተቀናበረው በዘፈቀደ ሄክሳመር ፕሪመርሮች እና M-MuLV በግልባጭ ትራንስክሪፕትሴ (RNase H-) በመጠቀም ነው።ሁለተኛው ሲዲኤንኤ በዲኤንኤ ፖሊሜሬሴስ I እና RNase H በመጠቀም ይዋሃዳል። የተቀሩት overhangs በ exonuclease/polymerase እንቅስቃሴ ወደ ጠፍጣፋ ጫፎች ይቀየራሉ።የ 3′ የዲ ኤን ኤ ፍርስራሹን ከተደመሰሰ በኋላ፣ ለማዳቀል ለማዘጋጀት የNEBNext Adapter ከጸጉር ማያያዣ ጋር ተያይዟል።ለ cDNA ቁርጥራጮች ተመራጭ ርዝመት 150-200 ቢፒ.የቤተ መፃህፍት ፍርስራሾች በAMPure XP ስርዓት (ቤክማን ኩልተር፣ ቤቨርሊ፣ ዩኤስኤ) ተጠቅመዋል።ከዚያም 3 μl USER ኢንዛይም (NEB, USA) በመጠን የተመረጠ ሲዲኤን ከአስማሚ ጋር የተገጠመለት ለ 15 ደቂቃዎች በ 37 ° ሴ ከዚያም ለ 5 ደቂቃዎች በ 95 ° ሴ ከ PCR በፊት ጥቅም ላይ ይውላል.ፒሲአር የተከናወነው በPhusion High-Fidelity DNA polymerase፣ Universal PCR primers እና Index (X) primers በመጠቀም ነው።በመጨረሻም፣ PCR ምርቶች በAgilent Bioanalyzer 2100 ስርዓት ላይ ተጣርተው (AMPure XP system) እና የቤተመፃህፍት ጥራት ተገምግመዋል።ከዚያም የሲዲኤንኤ ቤተ-መጽሐፍት Novaseq ተከታታዮችን በመጠቀም በቅደም ተከተል ተቀምጧል።ከኢሉሚና የመጡ ጥሬ የምስል ፋይሎች CASAVA Base Callingን በመጠቀም ወደ ጥሬ ንባብ ተለውጠዋል።ጥሬ መረጃ በ FASTQ(fq) ቅርጸት ፋይሎች የተነበቡ ቅደም ተከተሎችን እና ተዛማጅ የመሠረት ጥራቶችን ያካተቱ ነው።የተጣራ ቅደም ተከተል ከ Sscrofa11.1 ማጣቀሻ ጂኖም ጋር ለማዛመድ HISAT2 ን ይምረጡ።በአጠቃላይ HISAT2 ከ 4 ቢሊዮን በላይ የሆኑ ጂኖምዎችን ጨምሮ ማንኛውንም መጠን ያላቸውን ጂኖም ይደግፋል እና ነባሪ እሴቶች ለአብዛኛዎቹ መለኪያዎች ተቀምጠዋል።ከ አር ኤን ኤ ሴክ ዳታ ስፕሊንግ ንባቦችን HISAT2ን በመጠቀም በብቃት ሊጣጣም ይችላል፣አሁን ያለውን ፈጣኑ ስርዓት፣ከሌሎች ዘዴዎች ተመሳሳይ ወይም የተሻለ ትክክለኛነት።
የትራንስክሪፕት ብዛት በቀጥታ የጂን አገላለጽ ደረጃን ያሳያል።የጂን አገላለጽ ደረጃዎች የሚገመገሙት ከጂኖም ወይም ኤክሰኖች ጋር በተያያዙ ግልባጮች ብዛት (የተከታታይ ቆጠራ) ነው።የንባብ ብዛት ከጂን አገላለጽ ደረጃዎች፣ ከጂን ርዝመት እና ከተከታታይ ጥልቀት ጋር ተመጣጣኝ ነው።FPKM (ቁርጥራጮች በሺህ የመሠረት ጥንዶች ግልባጭ በቅደም ተከተል በሚሊዮን የመሠረት ጥንዶች) ይሰላሉ እና P-የልዩነት መግለጫ እሴቶች በDESeq2 ጥቅል ተወስነዋል።ከዚያም አብሮ በተሰራው R-function "p.adjust" ላይ በመመስረት የ Benjamini-Hochberg method9 በመጠቀም ለእያንዳንዱ ፒ እሴት የውሸት ግኝት መጠን (FDR) እናሰላለን።
ከልብ ክፍሎች የተነጠለ አር ኤን ኤ በ200 ng/μl የሱፐርስክሪፕት IV ቪሎ ማስተር ድብልቅ ከቴርሞ (ቴርሞ፣ ድመት ቁጥር 11756050) በመጠቀም ወደ ሲዲኤንኤ ተቀይሯል።Quantitative RT-PCR የተተገበረው በApplied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well transparent reaction plate (Thermo, cat. No. 4483319) እና microamp optical adhesive (Thermo, cat. No. 4311971) በመጠቀም ነው።የምላሹ ድብልቅ 5 µl Taqman ፈጣን የላቀ ማስተር ድብልቅ (ቴርሞ፣ ድመት # 4444557)፣ 0.5 µl Taqman Primer እና 3.5µl H2O በአንድ ጉድጓድ የተቀላቀለ ነው።መደበኛ የqPCR ዑደቶች ተካሂደዋል እና የሲቲ እሴቶች የተለኩት Applied Biosystems Quantstudio 5 real-time PCR መሳሪያ (384-well module፤ ምርት # A28135) በመጠቀም ነው።የታክማን ፕሪምሮች የተገዙት ከ Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1)፣ PARP12 (Ss06908795_m1)፣ PKDCC (Ss06903874_m1)፣ CYGB (Ss06900188_m1)፣ RGL1 (Ss03375629_u1)፣ RGL1 (Ss06908795_m1)፣ mH)፣ GATA4 (Ss03383805_u1)፣ GJA1 (Ss03374839_u1)፣ COL1A2 (Ss03375009_u1)፣ COL3A1 (Ss04323794_m1)፣ ACTA2 (Ss0424558CT_m1) ከዘረመል እስከ ዘረመል የተቀመጡ ናቸው።
የ NT-ProBNP ሚዲያ መለቀቅ የተገመገመው በአምራቹ ፕሮቶኮል መሠረት NT-ProBNP ኪት (አሳማ) (የድመት ቁጥር MBS2086979፣ MyBioSource) በመጠቀም ነው።ባጭሩ፣ 250 µl ከእያንዳንዱ ናሙና እና ስታንዳርድ በእያንዳንዱ ጉድጓድ ላይ ብዜት ተጨምሯል።ናሙናውን ካከሉ ​​በኋላ ወዲያውኑ 50 μl Assay Reagent A በእያንዳንዱ ጉድጓድ ላይ ይጨምሩ።ሳህኑን በቀስታ ያናውጡ እና በማሸጊያ ያሽጉ።ከዚያም ጽላቶቹ በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ለ 1 ሰዓት ተወስደዋል.ከዚያም መፍትሄውን በመምጠጥ ጉድጓዶቹን 4 ጊዜ በ 350 μl 1X ማጠቢያ መፍትሄ ይታጠቡ, በእያንዳንዱ ጊዜ የመታጠቢያውን መፍትሄ ለ 1-2 ደቂቃዎች በማፍለቅ.ከዚያ 100 μl Assay Reagent B በአንድ ጉድጓድ ጨምሩ እና በፕላስቲን ማሸጊያ ያሽጉ።ጡባዊው በእርጋታ ተንቀጠቀጠ እና በ 37 ° ሴ ለ 30 ደቂቃዎች ተክሏል.መፍትሄውን በመምጠጥ ጉድጓዶቹን 5 ጊዜ በ 350 μl 1X ማጠቢያ መፍትሄ ይታጠቡ.በእያንዳንዱ ጉድጓድ ውስጥ 90 µl የከርሰ ምድር መፍትሄ ይጨምሩ እና ሳህኑን ይዝጉ።ሳህኑን በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ለ 10-20 ደቂቃዎች ያርቁ.በእያንዳንዱ ጉድጓድ ላይ 50 μl አቁም መፍትሄ ይጨምሩ።ሳህኑ ወዲያውኑ በ 450 nm የተቀመጠውን የሳይቴሽን (ባዮቴክ) ሳህን አንባቢ በመጠቀም ይለካል።
የኃይል ትንተናዎች የተከናወኑት የቡድን መጠኖችን ለመምረጥ> 80% ኃይልን ይሰጣል ይህም በመለኪያው ውስጥ 10% ፍፁም ለውጥ ከ 5% ዓይነት I ስህተት ጋር። የኃይል ትንተናዎች የተከናወኑት የቡድን መጠኖችን ለመምረጥ> 80% ኃይልን ይሰጣል ይህም በመለኪያው ውስጥ 10% ፍፁም ለውጥ ከ 5% ዓይነት I ስህተት ጋር። Анализ мощnost ения параметра с 5% частотой ошибок типа I. በ 5% ዓይነት I የስህተት መጠን 10% ፍፁም የመለኪያ ለውጥን ለመለየት > 80% ኃይል የሚሰጡ የቡድን መጠኖችን ለመምረጥ የኃይል ትንተና ተከናውኗል።进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I廋發得中变化和5％I廋给。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I廋發得中变化和5％I廋给。 Быl проведен анализ мощности для выbor размера групpy, который обеспечил бы > 80% ኤም.ኤስ. менения параметров и 5% частоты ошибок типа I. 10% ፍፁም የመለኪያ ለውጥ እና 5% አይነት I ስህተትን ለመለየት > 80% ሃይል የሚሰጥ የቡድን መጠን ለመምረጥ የሃይል ትንተና ተካሄዷል።ከሙከራው በፊት የቲሹ ክፍሎች በዘፈቀደ ተመርጠዋል።ሁሉም ትንታኔዎች ዓይነ ስውር ነበሩ እና ናሙናዎች የተገለጹት ሁሉም መረጃዎች ከተተነተኑ በኋላ ብቻ ነው።የግራፍፓድ ፕሪዝም ሶፍትዌር (ሳን ዲዬጎ፣ ሲኤ) ሁሉንም ስታቲስቲካዊ ትንታኔዎችን ለማከናወን ስራ ላይ ውሏል። ለሁሉም ስታቲስቲክስ፣ p-እሴቶች በ <0.05 እሴቶች ላይ ጉልህ እንደሆኑ ተደርገው ይወሰዳሉ። ለሁሉም ስታቲስቲክስ ፣ p-እሴቶች በ <0.05 እሴቶች ላይ ጉልህ እንደሆኑ ተደርገው ይወሰዳሉ። Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. ለሁሉም ስታቲስቲክስ ፣ p-እሴቶች በ <0.05 እሴቶች ላይ ጉልህ እንደሆኑ ተደርገው ይወሰዳሉ።对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. ለሁሉም ስታቲስቲክስ ፣ p-እሴቶች በ <0.05 እሴቶች ላይ ጉልህ እንደሆኑ ተደርገው ይወሰዳሉ።ባለ ሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ፈተና በመረጃው ላይ የተደረገው በ2 ንጽጽሮች ብቻ ነው።ባለ አንድ ወይም ባለ ሁለት መንገድ ANOVA በበርካታ ቡድኖች መካከል ያለውን ጠቀሜታ ለመወሰን ጥቅም ላይ ውሏል.የድህረ-hoc ሙከራዎችን በሚያደርጉበት ጊዜ የቱኪ እርማት ለብዙ ንፅፅሮች መለያ ተተግብሯል።የ RNAsec ውሂብ FDR ን ሲያሰሉ ልዩ ስታቲስቲካዊ እሳቤዎች አሉት እና በ ዘዴዎች ክፍል ውስጥ እንደተገለጸው p.adjust።
በጥናት ንድፍ ላይ ተጨማሪ መረጃ ለማግኘት ከዚህ ጽሁፍ ጋር የተገናኘውን የተፈጥሮ ምርምር ዘገባን ይመልከቱ።