شكرًا لك على زيارة Nature.com ، إصدار المتصفح الذي تستخدمه يحتوي على دعم محدود لـ CSS ، وللحصول على أفضل تجربة ، نوصيك باستخدام متصفح محدث (أو إيقاف تشغيل وضع التوافق في Internet Explorer) ، وفي غضون ذلك ، لضمان استمرار الدعم ، سنعرض الموقع بدون أنماط وجافا سكريبت.
يؤسس تكوّن الأمعاء البشرية ميزات الزغابات المشفرة للهندسة المعمارية الدقيقة ثلاثية الأبعاد والتنظيم المكاني ، وهذا الهيكل الفريد مطلوب للحفاظ على توازن القناة الهضمية من خلال حماية مكانة الخلايا الجذعية في القبو القاعدية من المستضدات الميكروبية الخارجية ومستقلباتها ، بالإضافة إلى ذلك ، فإن الزغابات المعوية والمخاط يعيدان التمايز الوظيفي للخلايا الظهارية الواقية ثلاثية الأبعاد على الخلايا الظهارية الواقية. يعتبر أمرًا حاسمًا لبناء نماذج القناة الهضمية في المختبر ، ولا سيما أن القناة الهضمية المحاكية العضوية على شريحة يمكن أن تحفز التشكل العفوي ثلاثي الأبعاد للظهارة المعوية مع وظائف فسيولوجية وميكانيكا حيوية محسّنة هنا ، نقدم بروتوكولًا قابلًا للتكرار للحث بقوة على التكوُّن المعوي في القناة الهضمية على شكل رقاقة موائع جزيئية. aco-2 أو الخلايا الظهارية العضلية المعوية في الإعدادات التقليدية وكذلك على منصة ميكروفلويديك ، قد يتطلب تحريض التشكل ثلاثي الأبعاد وتوصيف الظهارة ثلاثية الأبعاد المنشأة باستخدام طرائق تصوير متعددة يحقق هذا البروتوكول تجديد البنية الدقيقة للأمعاء الوظيفية عن طريق التحكم في تدفق السوائل القاعدية لمدة 5 د. التقنيات الموجودة الأخرى نتصور أن بروتوكولنا المقترح يمكن أن يكون له آثار واسعة على مجتمع البحوث الطبية الحيوية ، مما يوفر طريقة لتجديد طبقات الظهارة المعوية ثلاثية الأبعاد في المختبر للتطبيقات الطبية الحيوية والسريرية والصيدلانية.
أثبتت التجارب أن خلايا Caco-2 الظهارية المعوية المزروعة في القناة الهضمية 1،2،3،4،5 أو أجهزة ميكروفلويديك ثنائية الطبقة 6،7 يمكن أن تخضع لتشكيل تلقائي ثلاثي الأبعاد في المختبر دون فهم واضح للآلية الكامنة. أظهر بواسطة Caco-2 والأشياء العضوية المعوية المشتقة من المريض.تم التحقق من صحة الخلايا الظهارية. في هذه الدراسة ، ركزنا بشكل خاص على إنتاج الخلايا وتوزيع التركيز لمضاد Wnt الفعال ، Dickkopf-1 (DKK-1) ، في الجهاز الهضمي على رقاقة وأجهزة ميكروفلويديك المعدلة التي تحتوي على إدخالات Transwell ، والتي تسمى "Hybrid Chip". وقد أظهرنا أن إضافة مضادات Wntoger ذات الصلة ، 1 ، Wntogy repressed 1 ، -1) على القناة الهضمية على الرقاقة يثبط التشكل أو يعطل الطبقة الظهارية ثلاثية الأبعاد سابقة التركيب ، مما يشير إلى أن الإجهاد المضاد أثناء الثقافة مسؤول عن تكوين الأمعاء في المختبر ، لذلك ، فإن النهج العملي لتحقيق تشكل قوي في الواجهة الظهارية هو إزالة أو الحفاظ على مستويات مضادات Wnt في الحويصلات القاعدية النشطة على سبيل المثال. منصات الرقائق) أو الانتشار.
في هذا البروتوكول ، نقدم طريقة مفصلة لتصنيع الأجهزة الدقيقة في القناة الهضمية والرقائق الهجينة القابلة للإدخال Transwell (الخطوات 1-5) لثقافة الخلايا الظهارية المعوية على الأغشية المسامية المستندة إلى polydimethylsiloxane (PDMS) (الخطوات 6A ، 7A ، 8 ، 9) أو أغشية البوليستر 8 ، 9 ، وإدراج خطوة بخطوة حددنا أيضًا السمات الخلوية والجزيئية التي تدل على تكوين الأنسجة الخاص بالأنسجة والتمايز الخلوي المعتمد على النسب من خلال تطبيق طرائق تصوير متعددة ميكانيكية (الخطوات 11-24). للحث على التكوُّن ثلاثي الأبعاد من الطبقات الأحادية الظهارية ثنائية الأبعاد ، أزلنا مضادات مورفوجين في كلا الشكلين المستنبتين عن طريق تدفق الوسيط إلى الحجرة القاعدية الوحشية للثقافة ، وأخيرًا ، نقدم تمثيلًا لمنفعة الإصابة بطبقة ظهارية ثلاثية الأبعاد قابلة للتجديد يمكن استخدامها لنمذجة نمو الخلايا الظهارية المعتمد على التشكل ، والنمو الظهاري الطولي للعدوى والمضيف الطولي. العلاجات القائمة على البروبيوتيك على سبيل المثال.
قد يكون بروتوكولنا مفيدًا لمجموعة واسعة من العلماء في المجالات الأساسية (على سبيل المثال ، بيولوجيا الغشاء المخاطي المعوي ، وبيولوجيا الخلايا الجذعية ، وعلم الأحياء التطوري) والأبحاث التطبيقية (على سبيل المثال ، اختبار العقاقير قبل السريرية ، ونمذجة المرض ، وهندسة الأنسجة ، وأمراض الجهاز الهضمي) تأثير واسع. أثناء تطور الأمعاء أو تجديدها أو استتبابها ، بالإضافة إلى ذلك ، فإن بروتوكولنا مفيد لاستجواب العدوى تحت عوامل معدية مختلفة مثل نوروفيروس 8 أو فيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) أو المطثية العسيرة أو السالمونيلا التيفية 9 أو الضمة الكوليرية.كما أن جمهور علم الأمراض والتسبب في المرض مفيد أيضًا ، فقد يسمح استخدام نظام فسيولوجيا الأمعاء الدقيقة على الرقاقة بالثقافة المشتركة الطولية 10 والتقييم اللاحق لدفاع المضيف والاستجابات المناعية وإصلاح الإصابات المرتبطة بالمرض في الجهاز الهضمي (GI). يتم تحضير الطبقات الظهارية باستخدام الطبقات الظهارية المعوية ثلاثية الأبعاد للمريض ، وتشمل هذه الأمراض ضمور الزغابات ، أو تقصير القبو ، أو تلف الغشاء المخاطي ، أو ضعف الحاجز الظهاري ، خزعة أو عضويات معوية مشتقة من الخلايا الجذعية. .الخلايا المناعية الخاصة بالأنسجة ، 5.
نظرًا لأنه يمكن إصلاح البنية المجهرية الظهارية ثلاثية الأبعاد وتصورها بدون عملية التقسيم ، فقد يكون المشاهدون الذين يعملون على النسخ المكانية والتصوير عالي الدقة أو فائق الدقة مهتمين برسم خرائط لدينا للديناميات الزمانية المكانية للجينات والبروتينات في المنافذ الظهارية.المهتمين بالتكنولوجيا ، الاستجابة للمحفزات الميكروبية أو المناعية ، علاوة على ذلك ، يمكن إنشاء الحديث المتبادل الطولي للميكروبيوم 10 ، 14 الذي ينسق توازن الأمعاء في الطبقة المخاطية المعوية ثلاثية الأبعاد من خلال الاستزراع المشترك لمختلف الأنواع الميكروبية أو المجتمعات الميكروبية أو الميكروبات البرازية ، خاصة في القناة الهضمية على رقاقة.هذا النهج جذاب بشكل خاص للجماهير التي تدرس علم المناعة المخاطي ، وأمراض الجهاز الهضمي ، والميكروبيوم البشري ، وعلم الأحياء الدقيقة وعلم الأحياء الدقيقة السريرية التي تسعى إلى زراعة مجهريات الأمعاء غير المستزرعة سابقًا في المختبر. أو منصات فحص عالية الإنتاجية أو التحقق من الصحة لصناعة الأغذية. كدليل على المبدأ ، أظهرنا مؤخرًا جدوى نظام التشكل متعدد الإرسال عالي الإنتاجية القابل للتوسيع إلى تنسيق لوحة 24 بئرًا ، بالإضافة إلى ذلك ، تم تسويق العديد من المنتجات العضوية على رقاقة ، وبالتالي ، يمكن تسريع عملية التحقق من صحة طريقة التشكل في المختبر أو اعتمادها من خلال العديد من المختبرات الحكومية في مجال التشكل الخلوي ، ومن المحتمل أن يتم اعتمادها من خلال العديد من المختبرات البحثية التنظيمية. التشكل على المستوى النسخي لاختبار الأدوية أو العلاجات الحيوية تم تقييم امتصاص ونقل الأدوية المرشحة باستخدام بدائل القناة الهضمية ثلاثية الأبعاد أو باستخدام نماذج مخصصة أو تجارية للأعضاء على شريحة لتقييم استنساخ عملية تشكل الأمعاء.
تم استخدام عدد محدود من النماذج التجريبية ذات الصلة بالإنسان لدراسة التشكل الظهاري المعوي ، ويرجع ذلك أساسًا إلى عدم وجود بروتوكولات قابلة للتنفيذ للحث على التشكل ثلاثي الأبعاد في المختبر. هذه النماذج أيضًا محدودة للغاية في قدرتها على الاختبار بطريقة قابلة للتطوير متعددة الطرق ، لذلك ، يمكن لبروتوكولنا لتجديد هياكل الأنسجة ثلاثية الأبعاد في المختبر أن يتفوق في النماذج الحيوانية الحية وكذلك النماذج التقليدية الأخرى لاستزراع الخلايا ثنائية الأبعاد ، كما تم وصفه سابقًا ، سمح لنا استخدام الهياكل الظهارية ثلاثية الأبعاد بفحص التوطين المكاني للخلايا المتمايزة في الاستجابة لمحور الزغابات المجهرية المختلفة. تتنافس الخلايا الإكلينيكية لتشكيل منافذ مكانية وتطور بيئي استجابةً لعوامل المضيف (على سبيل المثال ، طبقات المخاط الداخلية مقابل الخارجية ، وإفراز IgA والببتيدات المضادة للميكروبات) ، علاوة على ذلك ، يمكن أن تسمح لنا التشكل الظهاري ثلاثي الأبعاد بفهم كيف تقوم بكتيريا الأمعاء ببناء مجتمعاتها وتنتج بشكل تآزري المستقلبات الخلوية الدهنية القصيرة (على سبيل المثال). لا يمكن إظهار الميزات إلا عند إنشاء طبقات طلائية ثلاثية الأبعاد في المختبر.
بالإضافة إلى طريقتنا في إنشاء هياكل طلائية معوية ثلاثية الأبعاد ، هناك العديد من الطرق في المختبر ، وبالتالي فإن إدخال الزرع العضوي المعوي هو أحدث تقنيات هندسة الأنسجة القائمة على زراعة الخلايا الجذعية المعوية في ظل ظروف مورفوجين محددة. الخلايا الميكروبية أو المستضدات الخارجية محدودة.يمكن تحسين الوصول إلى لومن عضوي باستخدام حاقن دقيق ، 26،27 ولكن هذه الطريقة غازية وكثيفة العمالة وتتطلب معرفة متخصصة لأداءها. علاوة على ذلك ، لا تعكس المزارع العضوية التقليدية التي يتم الاحتفاظ بها في سقالات هيدروجيل في ظل ظروف ثابتة بدقة الميكانيكا الحيوية النشطة في الجسم الحي.
الأساليب الأخرى المستخدمة من قبل العديد من المجموعات البحثية تستخدم سقالات هيدروجيل ثلاثية الأبعاد مُعدة مسبقًا لتقليد البنية الظهارية للأمعاء عن طريق زراعة خلايا معوية بشرية معزولة على سطح الهلام. الحديث المتبادل عن طريق تضمين الخلايا اللحمية في السقالة ، ومع ذلك ، فإن طبيعة السقالات الهيكلية قد تمنع عرض العملية المورفولوجية العفوية نفسها ، كما أن هذه النماذج لا توفر تدفقًا لامعًا أو خلاليًا ديناميكيًا ، وتفتقر إلى إجهاد القص السائل الذي تحتاجه الخلايا المعوية للخضوع للتكوين واكتساب وظيفة الدراسة الفسيولوجية الحديثة. باستخدام تقنيات النقش بالليزر ، تتبع عضيات الفئران المعوية أنماطًا محفورة لتشكيل هياكل أنبوبية معوية ، ويمكن إعادة تلخيص تدفق السائل داخل اللمعة باستخدام وحدة الموائع الدقيقة ، ومع ذلك ، لا يعرض هذا النموذج عمليات مورفوجينية عفوية ولا يتضمن حركات الأمعاء الميكانيكية. يفتقر أيضًا إلى تدفق السائل اللمعي والتشوه الميكانيكي. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون قابلية تشغيل النموذج محدودة ، خاصة بعد اكتمال عملية الطباعة الحيوية ، أو الظروف التجريبية المقلقة أو التفاعلات من خلية إلى أخرى. لذلك ، قد يوفر بروتوكول التشكل ثلاثي الأبعاد الخاص بنا في المختبر نهجًا تكميليًا للتغلب على تحديات الأساليب الحالية.
يركز بروتوكولنا بالكامل على التشكل الظهاري ثلاثي الأبعاد ، مع وجود الخلايا الظهارية فقط في المزرعة ولا يسمح بأي أنواع أخرى من الخلايا المحيطة مثل الخلايا الوسيطة والخلايا البطانية والخلايا المناعية. علينا إعادة إنشاء الطبقة الظهارية ثلاثية الأبعاد المتموجة ، والتعقيدات البيولوجية الإضافية مثل التفاعلات الظهارية واللحمية المتوسطة ، ودور المصفوفة خارج الخلية (ECM) في التنظيم الأساسي للمصفوفة خارج الخلية (ECM) ، وفي نموذجنا ، تظل ميزات الزغابات المشفرة التي تنقل منافذ الخلايا الجذعية في الخبايا القاعدية بحاجة إلى مزيد من الدراسة. عززت إضافة خلايا اللحمة المتوسطة إلى نموذجنا العملية المورفولوجية وكفاءة ارتباط الخلايا. تلعب الطبقة البطانية (أي الشعيرات الدموية أو اللمفاوية) دورًا مهمًا في تنظيم النقل الجزيئي وتجنيد الخلايا المناعية في البيئة الدقيقة للأمعاء ، علاوة على ذلك ، فإن مكونات الأوعية الدموية التي يمكن توصيلها بين نماذج الأنسجة تكون أساسية عند تضمين نماذج الأنسجة ، ميزات فسيولوجية أكثر دقة مع دقة على مستوى الأعضاء. الخلايا المناعية المشتقة من المريض ضرورية أيضًا لعرض الاستجابات المناعية الفطرية ، وعرض المستضد ، والتداخل المناعي الفطري التكيفي ، والمناعة الخاصة بالأنسجة في سياق محاكاة الأمراض المعوية.
يعد استخدام الرقائق الهجينة أكثر وضوحًا من استخدام القناة الهضمية لأن إعداد الجهاز أبسط واستخدام إدخالات Transwell يسمح بثقافة قابلة للتطوير لظهارة الأمعاء. نادرًا ما تمكن الخصائص في المقصورة القمية من الثقافة المشتركة البكتيرية على المدى الطويل في الرقائق الهجينة. في حين أنه يمكننا بقوة تحفيز التشكل ثلاثي الأبعاد في إدراجات Transwell عند استخدام الرقائق الهجينة ، فإن نقص الميكانيكا الحيوية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية وتدفق السائل القمي قد يحد من جدوى منصات الرقائق الهجينة للتطبيقات المحتملة.
لم يتم إنشاء عمليات إعادة البناء الكاملة لمحور الزغابات البشرية في ثقافات القناة الهضمية والهجينة على رقاقة بشكل كامل ، وبما أن التشكل يبدأ من طبقة أحادية الطبقة الظهارية ، فإن البنى الدقيقة ثلاثية الأبعاد لا توفر بالضرورة تشابهًا مورفولوجيًا للتشفير في الجسم الحي. على الرغم من أننا ميزنا تجمعات الخلايا المتكاثرة بالقرب من مجال التجفير الأساسي بشكل واضح. على الرغم من أن القنوات العلوية العليا على الرقاقة تؤدي إلى زيادة ارتفاع الظهارة المصغرة ، إلا أن الحد الأقصى للارتفاع لا يزال محدودًا بحوالي 300-400 ميكرومتر. العمق الفعلي للخبايا المعوية البشرية في الأمعاء الدقيقة والغليظة هو 135 ميكرومتر و 400 ميكرومتر على التوالي ، ويبلغ ارتفاع الزغابات المعوية الدقيقة 600 ميكرومتر.
من وجهة نظر التصوير ، قد يكون التصوير فائق الدقة في الموقع للبنى الدقيقة ثلاثية الأبعاد مقصورًا على القناة الهضمية على شريحة ، نظرًا لأن مسافة العمل المطلوبة من العدسة الموضوعية إلى الطبقة الظهارية تكون في حدود بضعة ملليمترات ، وللتغلب على هذه المشكلة ، قد يتطلب الأمر هدفًا بعيدًا. التردد بين كل طبقة ، من الصعب للغاية فتح أو إزالة الطبقة العليا لفحص بنية سطح الطبقة الظهارية ، على سبيل المثال ، باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM).
كانت الكراهية للماء لـ PDMS عاملاً مقيدًا في الدراسات المستندة إلى الموائع الدقيقة التي تتعامل مع الجزيئات الصغيرة الكارهة للماء ، نظرًا لأن PDMS يمكن أن يمتص هذه الجزيئات الكارهة للماء بشكل غير محدد ، ويمكن اعتبار بدائل PDMS مع المواد البوليمرية الأخرى ، وبدلاً من ذلك ، يمكن أن يكون تعديل السطح لـ PDMS (على سبيل المثال ، الطلاء بمواد محبة للدهون) 42 أو البوليمر. أولي.
أخيرًا ، لم يتم تمييز طريقتنا جيدًا من حيث توفير فحص عالي الإنتاجية أو منصة تجريبية سهلة الاستخدام "مقاس واحد يناسب الجميع". يتطلب البروتوكول الحالي مضخة حقنة لكل جهاز صغير ، والتي تشغل مساحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون وتمنع التجارب على نطاق واسع.
للحث على التشكل ثلاثي الأبعاد للظهارة المعوية البشرية في المختبر ، استخدمنا جهازًا معويًا لرقاقة موائع جزيئية يحتوي على قناتين متوازيتين وغشاء مسامي مرن بينهما لإنشاء واجهة تجويف شعري ، كما نوضح أيضًا استخدام جهاز ميكروفلويديك أحادي القناة (شريحة هجينة) يوفر تدفقًا قاعديًا متطورًا مستمرًا تحت الاستقطاب. يمكن إثبات الخلايا الظهارية من خلال تطبيق معالجة اتجاهية للتدفق لإزالة مضادات المورفوجين من المقصورة القاعدية. يتكون الإجراء التجريبي بأكمله (الشكل 1) من خمسة أجزاء: (1) التصنيع الدقيق لشريحة الأمعاء أو شريحة هجينة قابلة للإدخال Transwell (الخطوات 1-5 ؛ المربع 1) ​​، (2) إعداد الخلايا الظهارية المعوية (خلايا Caco-2 البشرية) أو الخلايا المعوية المعوية ؛المربعات 2-5) ، (3) استنبات الخلايا الظهارية المعوية على رقائق الأمعاء أو الرقائق الهجينة (الخطوات 6-9) ، (4) تحريض التشكل ثلاثي الأبعاد في المختبر (الخطوة 10) و (5)) لتوصيف البنية المجهرية الظهارية ثلاثية الأبعاد (الخطوات 11-24). أو الضوابط المشروطة أو الإجرائية.
استخدمنا منصتين مختلفتين للثقافة: القناة الهضمية ذات القنوات المستقيمة أو القنوات الملتفة غير الخطية ، أو الرقائق الهجينة التي تحتوي على إدخالات Transwell (TW) في جهاز ميكروفلويديك ، مصنعة كما هو موضح في المربع 1 ، والخطوة 1 -5. يوضح "تصنيع الجهاز" الخطوات الرئيسية في صنع شريحة مفردة أو شريحة هجينة. "يوضح إجراء ثقافة الخلايا البشرية المعوية أو الخلايا الظهارية المستخدمة في الخلايا البشرية". يُظهر "التشكل في المختبر" الخطوات الإجمالية التي يتم فيها استنبات Caco-2 أو الخلايا الظهارية المشتقة من العضويات على شريحة معوية أو على إدراج ترانسويل لشريحة هجينة ، متبوعًا بتحريض التشكل ثلاثي الأبعاد وتشكيل بنية ظهارية مميزة. يتم عرض رقم خطوة البرنامج أو رقم الصندوق أسفل كل مثال. النظم البيئية robiome ، ونمذجة المرض. صور التألق المناعي في "تمايز الخلايا" تظهر النوى ، F-actin و MUC2 المعبر عنها في الطبقة الظهارية ثلاثية الأبعاد Caco-2 التي تم إنشاؤها على شريحة الأمعاء. توجد إشارات MUC2 في الخلايا الكأسية والمخاط الذي يفرز من الأسطح المخاطية. تظهر الصورتان المتداخلتان في "الثقافات المشتركة للميكروب المضيف" ثقافات مشتركة تمثيلية للمضيف الميكروبيوم في القناة الهضمية على شريحة. تُظهر اللوحة اليسرى الثقافة المشتركة للإشريكية القولونية التي تعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) مع الخلايا الظهارية ثلاثية الأبعاد Caco-2 المُصنَّعة بالهندسة الدقيقة. -اكتين (أحمر) ونوى (أزرق). توضح نمذجة المرض الأمعاء الصحية مقابل الأمعاء المتسربة في رقائق التهاب الأمعاء تحت التحدي الفسيولوجي مع المستضدات البكتيرية (على سبيل المثال ، عديد السكاريد الدهني ، LPS) والخلايا المناعية (على سبيل المثال ، PBMC ؛تمت زراعة خلايا كاكو -2 لإنشاء طبقة طلائية ثلاثية الأبعاد ، شريط مقياس ، 50 ميكرومتر ، صور في الصف السفلي: "تمايز الخلايا" تم تكييفها بإذن من المرجع.مطبعة جامعة أكسفورد؛مستنسخة بإذن من المرجع 5.ناس ؛"Host-Microbe Co-Culture" مقتبس بإذن من المرجع 3.ناس ؛"نمذجة المرض" مقتبس بإذن من المرجع 5.ناس.
تم تصنيع كل من القناة الهضمية والرقائق الهجينة باستخدام نسخ PDMS المتماثلة التي تم فكها من قوالب السيليكون بواسطة الطباعة الحجرية الناعمة ونمطها باستخدام SU-8. يتم تحديد تصميم القنوات الدقيقة في كل شريحة من خلال النظر في الديناميكا المائية مثل إجهاد القص والضغط الهيدروديناميكي. في القناة الهضمية المعقدة (شكل البيانات الموسعة 1 ب) التي تتضمن زوجًا من القنوات الدقيقة المنحنية للحث على زيادة وقت بقاء السائل ، وأنماط التدفق غير الخطية ، والتشوه متعدد المحاور للخلايا المستنبتة (الشكل 2 أ-و) 12. الإطار الزمني بدرجة مماثلة من النمو الظهاري مقارنةً بشريحة Gut-Chip الأصلية ، بغض النظر عن نوع الخلية المستزرعة ، لذلك ، للحث على التشكل ثلاثي الأبعاد ، تكون تصاميم القناة الهضمية الخطية والمعقدة قابلة للتبديل.لتصنيع القناة الهضمية على شريحة ، تم ربط طبقة PDMS العلوية المحضرة بالتسلسل بفيلم PDMS مسامي ثم محاذاة مع طبقة PDMS السفلية عن طريق الترابط غير القابل للانعكاس باستخدام معالج الإكليل (الشكل 2 ب - و). يتم تنفيذ عملية ing عن طريق معالجة أسطح نسخة PDMS المتماثلة والزجاج ببلازما الأكسجين أو علاج الإكليل. بعد تعقيم الجهاز المصنوع من الميكروفايبريكس المرفق بأنبوب السيليكون ، كان إعداد الجهاز جاهزًا لأداء التشكل ثلاثي الأبعاد للظهارة المعوية (الشكل 2g).
أ ، رسم توضيحي تخطيطي لإعداد أجزاء PDMS من قوالب السيليكون المزخرفة SU-8. تم سكب محلول PDMS غير المعالج على قالب من السيليكون (يسار) ، ومعالجته عند 60 درجة مئوية (وسط) وفك القالب (يمين). تم تقطيع PDMS منزوع القوالب إلى قطع وتنظيفها لاستخدامها لاحقًا. مكونات PDMS والجهاز المعوي المُجمَّع على الرقاقة e ، رسم تخطيطي لمحاذاة مكونات PDMS العلوية والغشائية والسفلية. يتم ربط كل طبقة بشكل لا رجعة فيه عن طريق معالجة البلازما أو الإكليل. تم وضع المحقنة على ساترة. تم وضع جهاز الرقاقة على غطاء طبق بتري 150 مم للمعالجة ، ويتم استخدام الموثق لإغلاق أنبوب السيليكون. h ، تم إنشاء لقطات بصرية لتصنيع الرقائق الهجينة والتكوين ثلاثي الأبعاد باستخدام رقائق هجينة. إدراج شريط مقياس الترانسويل ، 1 سم ساعة أعيد طبعها بإذن من المرجع 4.إلسفير.
في هذا البروتوكول ، تم استخدام خط الخلية Caco-2 والأشياء العضوية المعوية كمصادر ظهارية (الشكل 3 أ). تم استزراع كلا النوعين من الخلايا بشكل مستقل (المربع 2 والمربع 5) واستخدمت لبذر القنوات الدقيقة المطلية بـ ECM من القناة الهضمية أو ترانسويل. المعلقات الخلوية المرتبطة بسائل التربسين (المربع 2). تمت زراعة العضويات المعوية البشرية من الخزعات المعوية أو الاستئصال الجراحي في قباب سقالة Matrigel في 24 لوحة جيدة لدعم البيئة المكروية الهيكلية. متوسط ​​يحتوي على المورفوجينات الأساسية (مثل Wnt و R-spondin و Noggin) ونمت عوامل النمو كما هو موضح في المربع 3. يتم حصادها وفصلها إلى خلايا مفردة للبذر على الأمعاء أو إدراج ترانسويل على شريحة (المربع 5). كما ذكرنا سابقًا ، يمكن تمييزها وفقًا لنوع المرض (مثل التهاب القولون التقرحي ، ومرض كرون ، وسرطان القولون والمستقيم ، أو المتبرع الطبيعي) ، وموقع الآفة (على سبيل المثال ، الآفة مقابل المنطقة غير المصابة) والجهاز الهضمي ، وموقع القناة الهضمية ، والمعدة المعوية ، والمعدة والأمعاء ، أو المستقيم) .نحن نقدم بروتوكولًا محسنًا في المربع 5 لزراعة عضويات القولون (كولويد) التي تتطلب عادةً تركيزات أعلى من المورفوجينات أكثر من العضيات المعوية الدقيقة.
أ ، سير العمل لتحريض تشكل الأمعاء في شريحة القناة الهضمية. يتم استخدام الظهارة المعوية البشرية Caco-2 والعضوية المعوية في هذا البروتوكول لإثبات التشكل ثلاثي الأبعاد. تم زرع الخلايا الظهارية المعزولة في الجهاز الهضمي المحضر (إعداد الرقاقة). أول يومين (التدفق ، AP ، D0-D2). يتم أيضًا بدء التدفق الأساسي (BL) جنبًا إلى جنب مع حركات التمدد الدورية (التمدد ، والتدفق ، و AP ، و BL) عندما يتم تكوين طبقة أحادية كاملة ثنائية الأبعاد. مخططاتنا التخطيطية توضح الشلالات المقابلة لتشكل القناة الهضمية (أعلى اليمين). تمثل الأسهم المتقطعة في المخطط اتجاه تدفق السوائل. ب ، صورة SEM تُظهر الهيكل السطحي للظهارة ثلاثية الأبعاد Caco-2 (يسار) ، يُظهر الشكل الداخلي الذي يبرز المنطقة المكبرة (المربع الأبيض المتقطع) الميكروفيلي المجدد ، الموجود على اليمين ثلاثي الأبعاد. ZO-1 ، أحمر) وأغشية حدود الفرشاة المستمرة المسمى F-actin (أخضر) ونواة (أزرق) مناعي (أزرق) تصور متحد البؤر للخلايا الظهارية على رقائق الأمعاء. تشير الأسهم التي تشير إلى التخطيط الأوسط إلى موقع المستوى البؤري لكل عرض متحد البؤر. تكبير عالي للصورة المقدمة e ، صورة مجهرية DIC لظهارة عضوية ثلاثية الأبعاد مثبتة في القناة الهضمية على شريحة تم التقاطها في اليوم 7.f ، صور تألق مناعي متراكبة تظهر علامات الخلايا الجذعية (LGR5 ؛أرجواني) ، وخلايا كؤوس (MUC2 ؛ أخضر) ، و F-actin (رمادي) ونوى (سماوي) نمت على رقائق الأمعاء لمدة 3 أيام ، على التوالي (يسار) و 13 يومًا (وسطًا) عضويات على الطبقة الظهارية. عن طريق تلطيخ غشاء البلازما بصبغة CellMask (يمين) في اليوم 13 من الثقافة ، شريط المقياس هو 50 ميكرومتر ما لم ينص على خلاف ذلك. ب أعيد طبعه بإذن من المرجع.مطبعة جامعة أكسفورد؛ج مقتبس بإذن من المرجع 2.مطبعة جامعة أكسفورد؛تم تكييف e و f بإذن من المرجع .12 تحت رخصة المشاع الإبداعي CC BY 4.0.
في القناة الهضمية على رقاقة ، من الضروري تعديل السطح الكارهة للماء للغشاء المسامي PDMS لطلاء ECM الناجح. في هذا البروتوكول ، نطبق طريقتين مختلفتين لتعديل كره الماء لأغشية PDMS. لاستنبات خلايا Caco-2 ، كان التنشيط السطحي عن طريق معالجة الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون وحده كافياً لتقليل تعلق سطح الغشاء المائي لـ PDMS و PDMS. تتطلب الثقافة ic للظهارة العضوية تشغيلًا سطحيًا كيميائيًا لتحقيق ترسيب فعال لبروتينات ECM من خلال تطبيق البولي إيثيلين أمين (PEI) وغلوتارالدهيد بالتتابع على قنوات PDMS الدقيقة. طبقة أحادية كاملة ، بينما تحافظ القناة الصغيرة السفلية على ظروف ثابتة. تتيح هذه الطريقة المثلى لتنشيط السطح وطلاء ECM ربط الظهارة العضوية للحث على التشكل ثلاثي الأبعاد على سطح PDMS.
تتطلب ثقافات Transwell أيضًا طلاء ECM قبل بذر الخلية ؛ومع ذلك ، لا تتطلب ثقافات ترانسويل خطوات معالجة مسبقة معقدة لتنشيط سطح الإضافات المسامية. لزراعة خلايا Caco-2 على إدراجات Transwell ، يعمل طلاء ECM على إدخالات مسامية على تسريع ربط خلايا Caco-2 المنفصلة (أقل من ساعة واحدة) وتشكيل حاجز تقاطع ضيق (<1-2 يوم). تشكل المعرفات طبقة أحادية كاملة مع سلامة الحاجز. يتم إجراء ثقافات ترانسويل في 24 لوحة جيدة دون استخدام رقائق هجينة.
يمكن البدء في التشكل ثلاثي الأبعاد في المختبر عن طريق تطبيق تدفق السوائل على الجانب السفلي الجانبي للطبقة الظهارية الثابتة. في القناة الهضمية على الرقاقة ، بدأ التشكل الظهاري عندما تم ترطيب الوسيط في القنوات الدقيقة العلوية والسفلية (الشكل 3 أ) ، كما هو موضح سابقًا ، من المهم إدخال تدفق السوائل في الحجرة المثبطة للغشاء السفلي (القاعدية) لتوفير الإزالة المستمرة للخلايا المصلية الحدودية (القاعدية). es وتوليد إجهاد القص اللمعي ، نطبق عادةً تدفقًا مزدوجًا في القناة الهضمية على رقاقة. في الرقائق الهجينة ، تم إدخال إدخالات Transwell التي تحتوي على طبقات أحادية ظهارية في الرقائق الهجينة ، ثم تم تطبيق الوسيط تحت الجانب السفلي الجانبي من إدراج Transwell المسامي من خلال القناة الدقيقة.
يمكن تحليل السمات المورفولوجية للطبقات الظهارية ثلاثية الأبعاد ذات الهندسة الدقيقة عن طريق تطبيق طرائق تصوير مختلفة ، بما في ذلك الفحص المجهري لتباين الطور ، والفحص المجهري لتباين التداخل التفاضلي (DIC) ، أو المجهر المتحد البؤر المناعي (الشكلان 3 و 4) ، ويمكن إجراء تباين الطور أو تصوير DIC بسهولة في أي وقت خلال طبقات الثقافة لمراقبة الشكل والنتوء ثلاثي الأبعاد للأفلام الضوئية. يمكن أن توفر منصات الرقائق الهجينة والشريحة في الوقت الفعلي تصويرًا في الموقع في الوقت الفعلي دون الحاجة إلى تقسيم الجهاز أو تفكيكه. عند إجراء التصوير المناعي (الأشكال 1 ، 3 ج ، و 4 ب ، ج) ، عادةً ما يتم إصلاح الخلايا بنسبة 4 ٪ (وزن / حجم) بارافورمالدهيد (PFA) ، تليها تريتون X-100 و 2). يمكن استخدام نوع الخلية ، والمثبتات المختلفة ، والنفاذية ، وعوامل الحجب. تُستخدم الأجسام المضادة الأولية التي تستهدف الخلايا المعتمدة على النسب أو علامات المنطقة لتسليط الضوء على الخلايا الثابتة في الموقع على الرقاقة ، متبوعة بالأجسام المضادة الثانوية جنبًا إلى جنب مع صبغة مضادة تستهدف النواة (على سبيل المثال ، 4 ′ ، 6-Diamidino-2-phenylene) أو indole-pécorly). يمكن أيضًا إجراء التصوير الحي القائم على الموقع للكشف عن إنتاج المخاط (الشكل.1 ، "تمايز الخلايا" و "فسيولوجيا القناة الهضمية") ، الاستعمار العشوائي للخلايا الميكروبية (الشكل 1 ، "الثقافة المشتركة للميكروب المضيف") ، تجنيد الخلايا المناعية (الشكل 1 ، "نمذجة المرض") أو ملامح التشكل الظهاري ثلاثي الأبعاد (الشكل 3 ج ، و 4 ب ، ج). يمكن تصور مورفولوجيا الظهارة وكذلك الميكروفيلي على حدود الفرشاة القمية بواسطة SEM (الشكل 3 ب) ، ويمكن تقييم التعبير عن علامات التمايز عن طريق إجراء تسلسل PCR5 الكمي أو تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.
أ ، سير العمل لتحريض التشكل المعوي في شريحة هجينة. يتم استخدام Caco-2 والعضوية المعوية في هذا البروتوكول لإثبات التشكل ثلاثي الأبعاد في منصة رقاقة هجينة. تم زرع الخلايا الظهارية المنفصلة في إدراجات Transwell المحضرة (TW الإعدادية ؛ انظر الشكل أدناه). ، تم دمج إدراج ترانسويل مفرد يحتوي على طبقة أحادية ثنائية الأبعاد من الخلايا الظهارية في شريحة هجينة لإدخال تدفق قاعدي جانبي (تدفق ، BL) ، مما أدى في النهاية إلى إنشاء طبقة ظهارية ثلاثية الأبعاد (التشكل). يمكن أن تؤدي شرائح اللحم (التخطيطي الأيسر) إلى تكوين ثلاثي الأبعاد للخلايا الظهارية العضية مع مناظر مجهرية متحد البؤر من أعلى إلى أسفل مأخوذة في مواضع Z مختلفة (العلوي والوسطى والسفلي ؛انظر التخطيطي الصحيح والخطوط المنقطة المقابلة).أظهر الخصائص المورفولوجية الواضحة. F-actin (سماوي) ، النواة (رمادي) .c ، صورة مجهرية متحد البؤر مضان (منظر بزاوية ثلاثية الأبعاد) للخلايا الظهارية المشتقة من العضويات المستزرعة في ترانسويل ثابت (TW ؛ داخلي داخل مربع أبيض متقطع) مقابل شريحة هجينة (أكبر لقطة كاملة) مقارنة بمورفولوجيا الزاوية العلوية اليمنى 2D ، على التوالي. ميزات ثلاثية الأبعاد شريط مقياس ، 100 ميكرومتر تمت إعادة طبعه بإذن من المرجع 4.إلسفير.
يمكن تحضير عناصر التحكم عن طريق استنبات نفس الخلايا (Caco-2 أو الخلايا الظهارية المعوية المعوية) في طبقات أحادية ثنائية الأبعاد تحت ظروف الثقافة الساكنة التقليدية ، ولا سيما أن استنفاد المغذيات قد ينتج بسبب السعة المحدودة للحجم للقنوات الدقيقة (أي حوالي 4 ميكرولتر في القناة العلوية على التصميم الأصلي لشريحة الأمعاء).
يجب أن تتم عملية الطباعة الحجرية اللينة في غرفة نظيفة ، ولكل طبقة على الرقاقة (الطبقات والأغشية العلوية والسفلية) والرقائق الهجينة ، تم استخدام وتصنيع كتل ضوئية مختلفة على رقاقات سيليكون منفصلة لأن ارتفاعات القنوات الدقيقة كانت مختلفة ، والارتفاعات المستهدفة للقنوات الدقيقة العلوية والسفلية للأمعاء على الرقاقة هي 500 ميكرومتر وارتفاع 200 ميكرومتر على التوالي.
ضع رقاقة من السيليكون بحجم 3 بوصات في طبق يحتوي على الأسيتون ، وقم بتدوير اللوحة برفق لمدة 30 ثانية ، ثم جفف الرقاقة في الهواء ، ثم انقل الرقاقة إلى طبق مع IPA ، ثم قم بتدوير اللوحة لمدة 30 ثانية لتنظيفها.
يمكن استخدام محلول سمكة البيرانا (خليط من بيروكسيد الهيدروجين وحمض الكبريتيك المركز ، 1: 3 (المجلد / المجلد)) اختياريًا لتعظيم إزالة المخلفات العضوية من سطح رقاقة السيليكون.
يعتبر محلول البيرانا مادة أكالة للغاية وتولد حرارة ، لذا من الضروري اتخاذ احتياطات أمان إضافية للتخلص من النفايات ، اترك المحلول يبرد ونقله إلى حاوية نفايات نظيفة وجافة ، استخدم حاويات ثانوية وقم بتسمية حاويات النفايات بشكل صحيح ، يرجى اتباع إرشادات السلامة الخاصة بالمنشأة لمزيد من الإجراءات التفصيلية.
جفف الرقائق بوضعها على طبق ساخن 200 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، وبعد الجفاف ، رجت الرقاقة خمس مرات في الهواء لتبرد.
صب ~ 10 جم من مقاوم الضوء SU-8 2100 على وسط رقاقة السيليكون النظيف ، استخدم الملقط لنشر مقاوم الضوء بشكل متساوٍ على الرقاقة ، ضع الرقاقة أحيانًا على صفيحة ساخنة 65 درجة مئوية لجعل مقاوم الضوء أقل التصاقًا وأسهل في الانتشار. لا تضع الرقاقة مباشرة على الصفيحة الساخنة.
تم توزيع SU-8 بالتساوي على الرقاقة عن طريق تشغيل طلاء الدوران. قم ببرمجة دورة واردة لـ SU-8 لمدة 5-10 ثوانٍ لتنتشر عند 500 دورة في الدقيقة عند تسارع 100 دورة في الدقيقة / ثانية. اضبط الدوران الرئيسي على نقش بسمك 200 ميكرون عند 1500 دورة في الدقيقة ، أو حقق سماكة 250 ميكرون (مما يجعل ارتفاع 500 ميكرون للطبقة العلوية من الأحشاء). عند 1200 دورة في الدقيقة.
يمكن تعديل سرعة الدوران الرئيسية وفقًا للسمك المستهدف لنمط SU-8 على رقاقة السيليكون.
لتصنيع أنماط SU-8 بارتفاع 500 ميكرومتر للطبقة العليا من القناة الهضمية على الرقاقة ، تم تكرار طلاء الدوران وخطوات الخبز الناعم لهذا الصندوق (الخطوتين 7 و 8) بشكل متتابع (انظر الخطوة 9) لإنتاج طبقتين من 250 ميكرومتر طبقة سميكة من SU-8 ، والتي يمكن وضعها في طبقات وربطها بالتعرض للأشعة فوق البنفسجية في الخطوة 12 من هذا المربع ، مما يجعل طبقة بارتفاع 500 ميكرون.
تُخبز بسكويت الويفر المطلية SU-8 برفق عن طريق وضع الرقائق بعناية على طبق ساخن عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم قم بتبديل الإعداد إلى 95 درجة مئوية واحتضانها لمدة 40 دقيقة إضافية.
لتحقيق ارتفاع 500 ميكرومتر لنمط SU-8 في القناة الدقيقة العلوية ، كرر الخطوتين 7 و 8 لتوليد طبقتين من طراز SU-8 بسماكة 250 ميكرومتر.
باستخدام محاذاة قناع الأشعة فوق البنفسجية ، قم بإجراء اختبار المصباح وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة لحساب وقت التعرض للرقاقة. (وقت التعرض ، مللي ثانية) = (جرعة التعرض ، مللي جول / سم 2) / (طاقة المصباح ، ميغاواط / سم 2).
بعد تحديد وقت التعرض ، ضع القناع الضوئي على حامل القناع الخاص بمحاذاة قناع الأشعة فوق البنفسجية وضع القناع الضوئي على الرقاقة المطلية SU-8.
ضع السطح المطبوع للقناع الضوئي مباشرة على الجانب المطلي SU-8 من رقاقة السيليكون لتقليل تشتت الأشعة فوق البنفسجية.
قم بتعريض الرقاقة المطلية SU-8 والقناع الضوئي عموديًا إلى 260 مللي جول / سم 2 من ضوء الأشعة فوق البنفسجية لوقت التعرض المحدد مسبقًا (انظر الخطوة 10 من هذا المربع).
بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية ، تم خبز رقائق السيليكون المطلية بـ SU-8 عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على كل صفيحة ساخنة لتصنيع أنماط بارتفاع 200 ميكرومتر.
يُسكب المطور في طبق زجاجي ، ويوضع البسكويت المخبوز في الطبق. قد يختلف حجم مطور SU-8 وفقًا لحجم اللوحة الزجاجية ، تأكد من استخدام ما يكفي من مطور SU-8 لإزالة SU-8 غير المكشوف تمامًا ، على سبيل المثال ، عند استخدام طبق زجاجي بقطر 150 مم بسعة 1 لتر ، استخدم 300 مل من مطور SU-8. قم بتطوير القالب لمدة 25 دقيقة من حين لآخر.
اشطف القالب المطور بحوالي 10 مل من المطور الجديد متبوعًا بـ IPA عن طريق رش المحلول باستخدام ماصة.
ضع الرقاقة في منظف البلازما وتعريضها لبلازما الأكسجين (الغاز الجوي ، الضغط المستهدف 1 × 10−5 تور ، الطاقة 125 واط) لمدة 1.5 دقيقة.
ضع الرقاقة في مجفف مفرغ مع شريحة زجاجية بالداخل ، ويمكن وضع الرقائق والشرائح جنبًا إلى جنب ، إذا تم تقسيم مجفف الفراغ إلى عدة طبقات بواسطة لوحة ، ضع الشرائح في الغرفة السفلية والرقائق في الغرفة العلوية ، ثم اسقط 100 ميكرولتر من ثلاثي كلورو (1H ، 1H ، 2H ، 2H- شريحة بيرفلوروكتيل من الزجاج السيلاني).
قم بإذابة قارورة من خلايا Caco-2 المجمدة في حمام مائي 37 درجة مئوية ، ثم انقل الخلايا المذابة إلى قارورة T75 تحتوي على 15 مل من وسط Caco-2 المحمي مسبقًا 37 درجة مئوية.
لتمرير خلايا Caco-2 عند التقاء 90 ٪ تقريبًا ، أول وسط Caco-2 دافئ و PBS و 0.25 ٪ التربسين / 1 مم EDTA في حمام مائي 37 درجة مئوية.
نضح الوسيط عن طريق الشفط بالفراغ. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 5 مل من برنامج تلفزيوني دافئ عن طريق تكرار الشفط الفراغي وإضافة برنامج تلفزيوني جديد.