نشكرك على زيارة Nature.com. إصدار المتصفح الذي تستخدمه يدعم CSS بشكل محدود. للحصول على أفضل تجربة، نوصيك باستخدام متصفح محدث (أو إيقاف تشغيل وضع التوافق في Internet Explorer). في غضون ذلك، لضمان استمرار الدعم، سنعرض الموقع بدون أنماط وJavaScript.
يُرسي التخلق المعوي البشري سمات الزغابات المعوية للبنية الدقيقة الظهارية ثلاثية الأبعاد والتنظيم المكاني. هذا الهيكل الفريد مطلوب للحفاظ على توازن الأمعاء من خلال حماية مكانة الخلايا الجذعية في الزغابات القاعدية من المستضدات الميكروبية الخارجية ومستقلباتها. بالإضافة إلى ذلك، تُقدم الزغابات المعوية والمخاط المفرز خلايا ظهارية متمايزة وظيفيًا مع حاجز وقائي على سطح الغشاء المخاطي المعوي. لذلك، فإن إعادة إنشاء الهياكل الظهارية ثلاثية الأبعاد أمر بالغ الأهمية لبناء نماذج الأمعاء في المختبر. والجدير بالذكر أن الأمعاء المحاكية العضوية على رقاقة يمكن أن تحفز التخلق المعوي التلقائي ثلاثي الأبعاد مع وظائف فسيولوجية وميكانيكا حيوية محسنة. هنا، نقدم بروتوكولًا قابلاً للتكرار لتحفيز التخلق المعوي بقوة في الأمعاء على رقاقة ميكروفلويدية وكذلك في رقاقة هجينة مدمجة في ترانسويل. نصف طرقًا مفصلة لتصنيع الجهاز وزراعة Caco-2 أو الخلايا الظهارية العضوية المعوية في الإعدادات التقليدية وكذلك على منصة ميكروفلويدية، وتحريض التخلق ثلاثي الأبعاد، وتوصيف الظهارة ثلاثية الأبعاد الراسخة باستخدام طرق تصوير متعددة. يحقق هذا البروتوكول تجديد البنية الدقيقة للأمعاء الوظيفية من خلال التحكم في تدفق السوائل القاعدية الجانبية لمدة 5 أيام. تستخدم طريقة التخلق في المختبر لدينا إجهاد القص ذي الصلة فسيولوجيًا والحركة الميكانيكية ولا تتطلب هندسة خلوية معقدة أو تلاعبًا، مما قد يتفوق على التقنيات الأخرى الموجودة. نتصور أن بروتوكولنا المقترح يمكن أن يكون له آثار واسعة النطاق على مجتمع البحث الطبي الحيوي، مما يوفر طريقة لتجديد طبقات الظهارة المعوية ثلاثية الأبعاد في المختبر للتطبيقات الطبية الحيوية والسريرية والصيدلانية.
تظهر التجارب أن خلايا Caco-2 الظهارية المعوية المزروعة في أجهزة ميكروفلويدية ثنائية الطبقات 6،7 يمكن أن تخضع لتكوين ثلاثي الأبعاد تلقائيًا في المختبر دون فهم واضح للآلية الأساسية. في دراستنا الأخيرة، وجدنا أن إزالة مضادات التكوين المفرزة من الجانب القاعدي من أجهزة الثقافة ضرورية وكافية لتحفيز تكوين الظهارة ثلاثي الأبعاد في المختبر، وهو ما تم إثباته من خلال Caco-2 والعضيات المعوية المشتقة من المريض. تم التحقق من صحة الخلايا الظهارية. في هذه الدراسة، ركزنا بشكل خاص على إنتاج الخلايا وتوزيع تركيز مضاد قوي لـ Wnt، Dickkopf-1 (DKK-1)، في الأمعاء على رقاقة والأجهزة الميكروفلويدية المعدلة التي تحتوي على إدخالات Transwell، والتي تسمى "الشريحة الهجينة". نوضح أن إضافة مضادات Wnt الخارجية (مثل DKK-1، أو مثبط Wnt 1، أو البروتين المرتبط بالتجعيد المفرز 1، أو Soggy-1) إلى الأمعاء على الرقاقة تمنع التخلق أو تعطل الطبقة الظهارية ثلاثية الأبعاد المهيكلة مسبقًا، مما يشير إلى أن الإجهاد المضاد أثناء الثقافة مسؤول عن التخلق المعوي في المختبر. لذلك، فإن النهج العملي لتحقيق التخلق القوي عند الواجهة الظهارية هو إزالة أو الحفاظ بشكل ضئيل على مستويات مضادات Wnt في الحجرة القاعدية الجانبية عن طريق التنظيف النشط (على سبيل المثال، في الأمعاء على رقاقة أو المنصات الهجينة على الشريحة) أو الانتشار. الوسائط القاعدية الجانبية (على سبيل المثال، من إدخالات ترانسويل في خزانات قاعدية جانبية كبيرة في الآبار).
في هذا البروتوكول، نقدم طريقة مفصلة لتصنيع أجهزة دقيقة معوية على رقاقة ورقائق هجينة قابلة للإدخال من خلال Transwell (الخطوات 1-5) لزراعة الخلايا الظهارية المعوية على أغشية مسامية تعتمد على بولي دايميثيل السيلوكسان (PDMS) (الخطوات 6A، 7A، 8، 9) أو أغشية البوليستر من إدخالات Transwell (الخطوات 6B، 7B، 8، 9) وتحفيز التخلق ثلاثي الأبعاد في المختبر (الخطوة 10). كما حددنا أيضًا السمات الخلوية والجزيئية التي تشير إلى التخلق النسيجي النوعي والتمايز الخلوي المعتمد على السلالة من خلال تطبيق طرق تصوير متعددة (الخطوات 11-24). نحن نحفز التخلق باستخدام الخلايا الظهارية المعوية البشرية، مثل Caco-2 أو العضويات المعوية، في شكلين للزراعة مع تفاصيل تقنية بما في ذلك تعديل سطح الأغشية المسامية وإنشاء طبقات أحادية ثنائية الأبعاد والكيمياء الحيوية المعوية وإعادة إنتاج الميكانيكا الحيوية. لتحفيز التخلق ثلاثي الأبعاد من الطبقات الأحادية الظهارية ثنائية الأبعاد، قمنا بإزالة مضادات المورفين في كلا الشكلين المزروعين عن طريق تدفق الوسط إلى الحجرة القاعدية الجانبية للثقافة. أخيرًا، نقدم تمثيلًا لفائدة الطبقة الظهارية ثلاثية الأبعاد القابلة للتجديد والتي يمكن استخدامها لنمذجة نمو الظهارة المعتمد على المورفين، وثقافات العائل والميكروبيوم الطولية المشتركة، والعدوى المسببة للأمراض، والإصابة الالتهابية، وخلل الحاجز الظهاري، والعلاجات القائمة على البروبيوتيك. مثال.
قد يكون بروتوكولنا مفيدًا لمجموعة واسعة من العلماء في الأبحاث الأساسية (مثل علم الأحياء المخاطي المعوي، وعلم الأحياء الخلوية الجذعية، وعلم الأحياء التنموي) والبحث التطبيقي (مثل اختبار الأدوية قبل السريرية، ونمذجة الأمراض، وهندسة الأنسجة، وأمراض الجهاز الهضمي) ذات التأثير الواسع. ونظرًا لإمكانية إعادة إنتاج ومتانة بروتوكولنا لتحفيز التخلق ثلاثي الأبعاد للظهارة المعوية في المختبر، فإننا نتخيل أنه يمكن نشر استراتيجيتنا التقنية على الجماهير التي تدرس ديناميكيات إشارات الخلايا أثناء نمو الأمعاء أو تجديدها أو التوازن الداخلي. بالإضافة إلى ذلك، فإن بروتوكولنا مفيد لاستجواب العدوى تحت عوامل معدية مختلفة مثل فيروس نوروفيروس 8، ومتلازمة الجهاز التنفسي الحادة الوخيمة فيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2)، وكلوستريديوم ديفيسيل، وسالمونيلا تيفيموريوم 9، أو ضمة الكوليرا. جمهور علم الأمراض وعلم الأمراض مفيد أيضًا. قد يسمح استخدام نظام ميكروفيزيولوجيا الأمعاء على الشريحة بالزراعة المشتركة الطولية 10 والتقييم اللاحق للدفاع المضيف والاستجابات المناعية وإصلاح الإصابات المرتبطة بالممرض في الجهاز الهضمي 11. يمكن محاكاة اضطرابات الجهاز الهضمي الأخرى المرتبطة بمتلازمة الأمعاء المتسربة ومرض الاضطرابات الهضمية ومرض كرون والتهاب القولون التقرحي والتهاب الجراب أو متلازمة القولون العصبي عند تحضير طبقات الظهارة المعوية ثلاثية الأبعاد باستخدام طبقات الظهارة المعوية ثلاثية الأبعاد للمريض، وتشمل هذه الأمراض ضمور الزغابات وتقصير الخانة وتلف الغشاء المخاطي أو ضعف الحاجز الظهاري. خزعة أو عضيات معوية مشتقة من الخلايا الجذعية 12،13. لنمذجة التعقيد الأعلى لبيئة المرض بشكل أفضل، قد يفكر القراء في إضافة أنواع الخلايا ذات الصلة بالمرض، مثل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة للمريض (PBMCs)، إلى النماذج التي تحتوي على زغابة معوية ثلاثية الأبعاد الهندسة المعمارية الدقيقة. الخلايا المناعية الخاصة بالأنسجة، 5.
بما أن البنية المجهرية الظهارية ثلاثية الأبعاد يمكن تثبيتها وتصويرها دون الحاجة إلى عملية التقطيع، فقد يهتم الباحثون العاملون في مجال النسخ المكاني والتصوير عالي الدقة أو فائق الدقة برسمنا لديناميكيات الجينات والبروتينات المكانية والزمانية على المنافذ الظهارية. مهتمون بالتكنولوجيا. الاستجابة للمحفزات الميكروبية أو المناعية. علاوة على ذلك، يمكن تحديد التفاعل الطولي بين المضيف والميكروبيوم 10 و14، الذي يُنسّق توازن الأمعاء، في الطبقة المخاطية المعوية ثلاثية الأبعاد عن طريق زراعة أنواع ميكروبية مختلفة، أو مجتمعات ميكروبية، أو ميكروبات برازية، وخاصةً في الأمعاء على رقاقة. في المنصة. يُعد هذا النهج جذابًا بشكل خاص للجماهير التي تدرس علم المناعة المخاطي، وأمراض الجهاز الهضمي، والميكروبيوم البشري، وعلم الأحياء الدقيقة السريرية، والساعين إلى زراعة ميكروبات الأمعاء غير المزروعة سابقًا في المختبر. إذا أمكن تكييف بروتوكولنا للتكوين الشكلي المختبري مع تنسيقات زراعة قابلة للتطوير، مثل إدخالات متعددة الآبار في صفائح ذات 24 أو 96 أو 384 بئرًا تعمل على تجديد المقصورات القاعدية الجانبية باستمرار، فيمكن أيضًا نشر البروتوكول على أولئك الذين يطورون منصات الفحص أو التحقق من الصحة الصيدلانية أو الطبية الحيوية أو عالية الإنتاجية لصناعة الأغذية. كإثبات للمبدأ، أثبتنا مؤخرًا جدوى نظام تكوين شكلي متعدد الإرسال عالي الإنتاجية قابل للتطوير إلى تنسيق صفيحة ذات 24 بئرًا. بالإضافة إلى ذلك، تم تسويق العديد من منتجات الأعضاء على رقاقة16،17،18. لذلك، يمكن تسريع التحقق من صحة أسلوبنا للتكوين الشكلي المختبري واعتماده من قبل العديد من الأبحاث. تم تقييم امتصاص ونقل مرشحي الأدوية باستخدام بدائل الأمعاء ثلاثية الأبعاد أو باستخدام نماذج الأعضاء التجارية أو المخصصة على رقاقة لتقييم إمكانية إعادة إنتاج عملية تكوين الأمعاء.
استُخدم عدد محدود من النماذج التجريبية ذات الصلة بالإنسان لدراسة تكوّن الظهارة المعوية، ويعزى ذلك أساسًا إلى نقص البروتوكولات القابلة للتنفيذ لتحفيز التكوّن ثلاثي الأبعاد في المختبر. في الواقع، يعتمد جزء كبير من المعرفة الحالية حول تكوّن الأمعاء على دراسات أجريت على الحيوانات (مثل سمك الزرد20، والفئران21، والدجاج22). ومع ذلك، فهي تتطلب جهدًا وتكلفة كبيرين، وقد تكون موضع تساؤل أخلاقي، والأهم من ذلك، أنها لا تحدد بدقة عمليات النمو البشري. كما أن هذه النماذج محدودة للغاية في قدرتها على الاختبار بطريقة قابلة للتطوير متعددة الاتجاهات. لذلك، يتفوق بروتوكولنا لتجديد هياكل الأنسجة ثلاثية الأبعاد في المختبر على نماذج الحيوانات الحية، وكذلك نماذج زراعة الخلايا الثابتة ثنائية الأبعاد التقليدية الأخرى. وكما هو موضح سابقًا، سمح لنا استخدام الهياكل الظهارية ثلاثية الأبعاد بفحص التموضع المكاني للخلايا المتمايزة في محور الزغابات المشيمية استجابةً لمختلف الأغشية المخاطية أو المناعية. يمكن أن توفر الطبقات الظهارية ثلاثية الأبعاد مساحة لدراسة كيفية تنافس الخلايا الميكروبية لتشكيل منافذ مكانية والتطور البيئي استجابة لعوامل المضيف (على سبيل المثال، طبقات المخاط الداخلية مقابل الخارجية، إفراز IgA والببتيدات المضادة للميكروبات). علاوة على ذلك، يمكن أن تسمح لنا مورفولوجيا الظهارة ثلاثية الأبعاد بفهم كيفية بناء ميكروبات الأمعاء لمجتمعاتها وإنتاج المستقلبات الميكروبية بشكل تآزري (على سبيل المثال، الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة) التي تشكل التنظيم الخلوي ومنافذ الخلايا الجذعية في الخلايا القاعدية. لا يمكن إثبات هذه الميزات إلا عندما يتم إنشاء الطبقات الظهارية ثلاثية الأبعاد في المختبر.
بالإضافة إلى طريقتنا في إنشاء هياكل ظهارية معوية ثلاثية الأبعاد، تتوفر العديد من الطرق المختبرية. تُعد زراعة الأعضاء المعوية تقنية هندسية نسيجية متطورة تعتمد على زراعة الخلايا الجذعية المعوية في ظل ظروف مورفوجينية محددة23،24،25. ومع ذلك، غالبًا ما يُمثل استخدام نماذج الأعضاء ثلاثية الأبعاد لتحليل النقل أو الزراعة المشتركة بين العائل والميكروبيوم تحديًا، نظرًا لأن تجويف الأمعاء مُحاط بالعضو، وبالتالي، فإن إدخال مكونات التجويف، مثل الخلايا الميكروبية أو المستضدات الخارجية، محدود. يمكن تحسين الوصول إلى تجاويف الأعضاء باستخدام حاقن دقيق26،27، إلا أن هذه الطريقة جراحية وتتطلب جهدًا مكثفًا ومعرفة متخصصة لإجرائها. علاوة على ذلك، فإن زراعة الأعضاء التقليدية المحفوظة في هياكل هلامية مائية في ظل ظروف ثابتة لا تعكس بدقة الميكانيكا الحيوية النشطة في الجسم الحي.
تستخدم العديد من مجموعات البحث مناهج أخرى تعتمد على هياكل هلامية ثلاثية الأبعاد مُصممة مسبقًا لمحاكاة بنية الظهارة المعوية من خلال زراعة خلايا معوية بشرية معزولة على سطح الهلام. يتم تصنيع هياكل هلامية باستخدام قوالب مطبوعة ثلاثية الأبعاد، أو مطحونة بدقة، أو مصنوعة بتقنية الطباعة الحجرية. تُظهر هذه الطريقة الترتيب المنظم ذاتيًا للخلايا الظهارية المعزولة في المختبر مع تدرجات مورفوجينية ذات صلة فسيولوجية، مما يؤدي إلى إنشاء بنية ظهارية عالية الارتفاع وتداخل بين الخلايا السدوية والظهارية من خلال تضمين الخلايا السدوية في الهيكل. ومع ذلك، قد تمنع طبيعة الهياكل المُصممة مسبقًا عرض عملية التخلق العفوي نفسها. كما لا توفر هذه النماذج تدفقًا ديناميكيًا داخل الخلايا أو بين الخلايا، وتفتقر إلى إجهاد القص السائل الذي تحتاجه الخلايا المعوية للخضوع للتخلق واكتساب الوظيفة الفسيولوجية. استخدمت دراسة حديثة أخرى هياكل هلامية في منصة ميكروفلويدية وأنماط معوية. هياكل ظهارية باستخدام تقنيات الحفر بالليزر. تتبع العضويات المعوية للفئران أنماطًا محفورة لتشكيل هياكل أنبوبية معوية، ويمكن إعادة إنتاج تدفق السوائل داخل التجويف باستخدام وحدة ميكروفلويديك. ومع ذلك، لا يُظهر هذا النموذج عمليات مورفولوجية تلقائية ولا يتضمن حركات ميكانيكية حيوية للأمعاء. تمكنت تقنيات الطباعة ثلاثية الأبعاد من نفس المجموعة من إنشاء أنابيب معوية مصغرة بعمليات مورفولوجية تلقائية. على الرغم من التصنيع المعقد لأجزاء معوية مختلفة داخل الأنبوب، إلا أن هذا النموذج يفتقر أيضًا إلى تدفق السوائل اللمعية والتشوه الميكانيكي. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون قابلية تشغيل النموذج محدودة، خاصة بعد اكتمال عملية الطباعة الحيوية، مما يُعيق الظروف التجريبية أو التفاعلات بين الخلايا. بدلاً من ذلك، يوفر بروتوكولنا المقترح مورفولوجية معوية تلقائية، وإجهاد قص ذي صلة فسيولوجيًا، وميكانيكا حيوية تحاكي حركة الأمعاء، وإمكانية الوصول إلى حجرات قمية وقاعدية جانبية مستقلة، وإعادة إنشاء بيولوجية معقدة. لذلك، قد يوفر بروتوكولنا للتكوين ثلاثي الأبعاد في المختبر نهجًا تكميليًا للتغلب على تحديات الطرق الحالية.
يركز بروتوكولنا بالكامل على التخلق الظهاري ثلاثي الأبعاد، مع وجود الخلايا الظهارية فقط في المزرعة ولا توجد أنواع أخرى من الخلايا المحيطة مثل الخلايا المتوسطة والخلايا البطانية والخلايا المناعية. وكما هو موضح سابقًا، فإن جوهر بروتوكولنا هو تحريض التخلق الظهاري عن طريق إزالة مثبطات المورفوجين التي تفرز في الجانب القاعدي الجانبي للوسط المُدخل. في حين أن الوحدات النمطية القوية لأمعائنا على رقاقة والهجين على رقاقة تسمح لنا بإعادة إنشاء الطبقة الظهارية ثلاثية الأبعاد المتموجة، إلا أن التعقيدات البيولوجية الإضافية مثل التفاعلات الظهارية المتوسطة33،34، وترسيب المصفوفة خارج الخلية (ECM)35، وفي نموذجنا، لا تزال ميزات الكريبت-الزغابات التي تنقل منافذ الخلايا الجذعية في الكريبتات القاعدية بحاجة إلى مزيد من الدراسة. تلعب الخلايا الجذعية (مثل الخلايا الليفية) في الكريبت دورًا رئيسيًا في إنتاج بروتينات ECM وتنظيم الأمعاء التكوّن الشكلي في الجسم الحي35،37،38. عززت إضافة الخلايا المتوسطة إلى نموذجنا عملية التكوّن الشكلي وكفاءة ارتباط الخلايا. تلعب الطبقة البطانية (أي الشعيرات الدموية أو الأوعية اللمفاوية) دورًا مهمًا في تنظيم النقل الجزيئي39 وتجنيد الخلايا المناعية40 في البيئة الدقيقة للأمعاء. علاوة على ذلك، تُعد مكونات الأوعية الدموية التي يمكن ربطها بين نماذج الأنسجة شرطًا أساسيًا عند تصميم نماذج الأنسجة لإظهار التفاعلات بين الأعضاء المتعددة. لذلك، قد يلزم تضمين الخلايا البطانية لنمذجة السمات الفسيولوجية الأكثر دقة بدقة على مستوى العضو. تُعد الخلايا المناعية المشتقة من المريض ضرورية أيضًا لعرض الاستجابات المناعية الفطرية، وعرض المستضد، والتفاعل المناعي التكيفي الفطري، والمناعة الخاصة بالأنسجة في سياق محاكاة أمراض الأمعاء.
إن استخدام الرقائق الهجينة أسهل من الأمعاء على رقاقة لأن إعداد الجهاز أبسط واستخدام إدخالات Transwell يسمح بثقافة قابلة للتطوير لظهارة الأمعاء. ومع ذلك، فإن إدخالات Transwell المتوفرة تجاريًا مع أغشية البوليستر ليست مرنة ولا يمكنها محاكاة الحركات التمعجية. علاوة على ذلك، ظلت الحجرة القمية لإدخال Transwell الموضوعة في الشريحة الهجينة ثابتة دون أي إجهاد قص على الجانب القمي. من الواضح أن الخصائص الثابتة في الحجرة القمية نادرًا ما تمكن من الثقافة المشتركة للبكتيريا على المدى الطويل في الرقائق الهجينة. في حين أنه يمكننا تحفيز التخلق ثلاثي الأبعاد بقوة في إدخالات Transwell عند استخدام الرقائق الهجينة، فإن نقص الميكانيكا الحيوية ذات الصلة فسيولوجيًا وتدفق السوائل القمي قد يحد من جدوى منصات الرقائق الهجينة للتطبيقات المحتملة.
لم يتم تأسيس إعادة بناء كاملة النطاق لمحور الكرية-الزغابات البشرية في ثقافات الأمعاء على الشريحة والهجينة على الشريحة. نظرًا لأن التكوين يبدأ من طبقة أحادية ظهارية، فإن البنيات الدقيقة ثلاثية الأبعاد لا توفر بالضرورة تشابهًا مورفولوجيًا مع الكريات في الجسم الحي. وعلى الرغم من أننا وصفنا مجموعة الخلايا المتكاثرة بالقرب من نطاق الكرية القاعدية في الظهارة ثلاثية الأبعاد المصممة هندسيًا، إلا أن مناطق الكرية والزغابات لم يتم تحديدها بوضوح. وعلى الرغم من أن القنوات العلوية الأعلى على الشريحة تؤدي إلى زيادة ارتفاع الظهارة المصممة هندسيًا، إلا أن الارتفاع الأقصى لا يزال محدودًا بحوالي 300-400 ميكرومتر. ويبلغ العمق الفعلي للكريات المعوية البشرية في الأمعاء الدقيقة والغليظة حوالي 135 ميكرومتر وحوالي 400 ميكرومتر على التوالي، ويبلغ ارتفاع الزغابات المعوية الدقيقة حوالي 600 ميكرومتر41.
من وجهة نظر التصوير، قد يقتصر التصوير الفائق الدقة في الموقع للهياكل الدقيقة ثلاثية الأبعاد على الأمعاء على الشريحة، نظرًا لأن مسافة العمل المطلوبة من العدسة الموضوعية إلى الطبقة الظهارية هي في حدود بضعة ملليمترات. للتغلب على هذه المشكلة، قد يلزم وجود هدف بعيد. علاوة على ذلك، فإن صنع أقسام رقيقة لإعداد عينة التصوير أمر صعب بسبب المرونة العالية لـ PDMS. علاوة على ذلك، نظرًا لأن التصنيع الدقيق طبقة تلو الأخرى للأمعاء على الشريحة ينطوي على التصاق دائم بين كل طبقة، فمن الصعب للغاية فتح الطبقة العليا أو إزالتها لفحص البنية السطحية للطبقة الظهارية. على سبيل المثال، باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM).
كانت كراهية PDMS للماء عاملاً مقيدًا في الدراسات القائمة على الميكروفلويديك التي تتعامل مع الجزيئات الصغيرة الكارهة للماء، حيث يمكن لـ PDMS أن يمتص مثل هذه الجزيئات الكارهة للماء بشكل غير محدد. يمكن النظر في بدائل لـ PDMS مع مواد بوليمرية أخرى. بدلاً من ذلك، يمكن النظر في تعديل سطح PDMS (على سبيل المثال، الطلاء بمواد محبة للدهون 42 أو بولي (إيثيلين جليكول) 43) لتقليل امتصاص الجزيئات الكارهة للماء.
أخيرًا، لم يتم وصف طريقتنا جيدًا من حيث توفير فحص عالي الإنتاجية أو منصة تجريبية سهلة الاستخدام "مقاس واحد يناسب الجميع". يتطلب البروتوكول الحالي مضخة حقنة لكل جهاز صغير، مما يشغل مساحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون ويمنع إجراء تجارب واسعة النطاق. يمكن تحسين هذا القيد بشكل كبير من خلال إمكانية التوسع في تنسيقات الثقافة المبتكرة (على سبيل المثال، إدخالات مسامية ذات 24 بئرًا أو 96 بئرًا أو 384 بئرًا تسمح بالتجديد المستمر وإزالة الوسائط القاعدية الجانبية).
لتحفيز التكون ثلاثي الأبعاد للظهارة المعوية البشرية في المختبر، استخدمنا جهازًا معويًا بشريحة ميكروفلويدية يحتوي على قناتين ميكرويتين متوازيتين وغشاء مسامي مرن بينهما لإنشاء واجهة بين التجويف والشعيرات الدموية. كما نوضح استخدام جهاز ميكروفلويدي أحادي القناة (شريحة هجينة) يوفر تدفقًا مستمرًا على الجانب القاعدي أسفل الطبقات الظهارية المستقطبة المزروعة على إدخالات Transwell. في كلتا المنصتين، يمكن إثبات التكون المتعدد للخلايا الظهارية المعوية البشرية من خلال تطبيق التلاعب الاتجاهي بالتدفق لإزالة مضادات المورفين من الحجرة القاعدية الجانبية. يتكون الإجراء التجريبي بالكامل (الشكل 1) من خمسة أجزاء: (أ) التصنيع الدقيق لشريحة الأمعاء أو الشريحة الهجينة القابلة للإدخال من Transwell (الخطوات من 1 إلى 5؛ المربع 1)، (ب) تحضير الخلايا الظهارية المعوية (خلايا Caco-2) أو العضويات المعوية البشرية؛ (ثالثًا) زراعة الخلايا الظهارية المعوية على رقائق معوية أو رقائق هجينة (الخطوات من 6 إلى 9)، (رابعًا) تحريض التخلق ثلاثي الأبعاد في المختبر (الخطوة 10) و(خامسًا) ) لتوصيف البنية الدقيقة للظهارة ثلاثية الأبعاد (الخطوات من 11 إلى 24). وأخيرًا، تم تصميم مجموعة تحكم مناسبة (مناقشتها بمزيد من التفصيل أدناه) للتحقق من فعالية التخلق الظهاري في المختبر من خلال مقارنة التخلق الظهاري بالضوابط المكانية أو الزمنية أو الشرطية أو الإجرائية.
استخدمنا منصتين مختلفتين للثقافة: أمعاء على رقاقة ذات قنوات مستقيمة أو قنوات ملتوية غير خطية، أو رقائق هجينة تحتوي على إدخالات Transwell (TW) في جهاز ميكروفلويدي، تم تصنيعها كما هو موضح في المربع 1، والخطوة 1-5. يوضح "تصنيع الجهاز" الخطوات الرئيسية في صنع رقاقة واحدة أو رقاقة هجينة. يوضح "زراعة الخلايا الظهارية المعوية البشرية" مصدر الخلية (Caco-2 أو العضويات المعوية البشرية) وإجراء الثقافة المستخدمة في هذا البروتوكول. يوضح "التكوين الشكلي في المختبر" الخطوات الإجمالية التي يتم بها زراعة الخلايا الظهارية المشتقة من Caco-2 أو العضوي على رقاقة معوية أو على إدخالات Transwell لرقاقة هجينة، متبوعة بتحفيز التكوين الشكلي ثلاثي الأبعاد وتكوين بنية ظهارية مميزة. يتم عرض رقم خطوة البرنامج أو رقم المربع أسفل كل سهم. يوفر التطبيق أمثلة على كيفية استخدام طبقات الظهارة المعوية الراسخة، على سبيل المثال، في توصيف تمايز الخلايا، ودراسات فسيولوجيا الأمعاء، إنشاء أنظمة بيئية للميكروبيوم المضيف، ونمذجة الأمراض. تُظهر صور المناعة الفلورية في "التمايز الخلوي" النوى، وبروتين F-actin، وMUC2 المُعبَّر عنها في الطبقة الظهارية ثلاثية الأبعاد Caco-2 المُولَّدة على شريحة الأمعاء. توجد إشارات MUC2 في الخلايا الكأسية والمخاط المُفرز من الأسطح المخاطية. تُظهر الصور الفلورية في "فسيولوجيا الأمعاء" المخاط المُنتَج عن طريق تلطيخ بقايا حمض السياليك وN-acetylglucosamine باستخدام أغلوتينين جرثومة القمح المُلوَّن. تُظهر الصورتان المتداخلتان في "المزارع المشتركة للميكروب المضيف" مزارع مشتركة تمثيلية للميكروب المضيف في الأمعاء على شريحة. تُظهر اللوحة اليسرى الزراعة المشتركة لبروتين الفلوري الأخضر المُعبِّر عن الإشريكية القولونية (GFP) مع خلايا ظهارية ثلاثية الأبعاد Caco-2 مُصمَّمة هندسيًا بدقة. تُظهر اللوحة اليمنى موقع بروتين الفلوري الأخضر المُعبِّر عن الإشريكية القولونية المُزروع مع بروتين Caco-2 ثلاثي الأبعاد. الخلايا الظهارية، متبوعة بتلوين مناعي فلوري باستخدام F-actin (أحمر) ونوى (أزرق). توضح نمذجة الأمراض الأمعاء السليمة مقابل الأمعاء المتسربة في رقائق التهاب الأمعاء تحت تأثير فسيولوجي لمستضدات بكتيرية (مثل عديد السكاريد الدهني، LPS) وخلايا مناعية (مثل PBMC؛ أخضر). زُرعت خلايا Caco-2 لتكوين طبقة ظهارية ثلاثية الأبعاد. شريط المقياس، 50 ميكرومتر. الصور في الصف السفلي: "تمايز الخلايا" مُعدّلة بإذن من المرجع.2. مطبعة جامعة أكسفورد؛ أُعيد إنتاجها بإذن من المرجع.5. NAS؛ "الزراعة المشتركة للميكروب والمضيف" مُعدّلة بإذن من المرجع.3. NAS؛ "نمذجة الأمراض" مُعدّلة بإذن من المرجع.5. NAS.
تم تصنيع كل من رقائق الأمعاء على الشريحة والرقائق الهجينة باستخدام نسخ طبق الأصل من PDMS تم إخراجها من قوالب السيليكون باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة1،44 وتم تصميمها باستخدام SU-8. يتم تحديد تصميم القنوات الدقيقة في كل شريحة من خلال مراعاة الديناميكا المائية مثل إجهاد القص والضغط الهيدروديناميكي1،4،12. تطور تصميم الأمعاء على الشريحة الأصلي (بيانات موسعة الشكل 1أ)، والذي يتكون من قناتين دقيقتين مستقيمتين متوازيتين متجاورتين، إلى أمعاء معقدة على شريحة (بيانات موسعة الشكل 1ب) تتضمن زوجًا من القنوات الدقيقة المنحنية لتحفيز زيادة وقت إقامة السوائل وأنماط التدفق غير الخطية والتشوه متعدد المحاور للخلايا المزروعة (الشكل 2أ-و)12. عندما تكون هناك حاجة إلى إعادة إنشاء ميكانيكا حيوية أكثر تعقيدًا للأمعاء، يمكن اختيار أمعاء معقدة على شرائح. لقد أثبتنا أن رقاقة الأمعاء الملتوية تحفز أيضًا بقوة ثلاثية الأبعاد التخلق في إطار زمني مماثل مع درجة مماثلة من نمو الظهارة مقارنةً بشريحة الأمعاء الأصلية، بغض النظر عن نوع الخلية المزروعة. لذلك، لتحفيز التخلق ثلاثي الأبعاد، تكون تصميمات الأمعاء الخطية والمعقدة على الشريحة قابلة للتبادل. قدمت نسخ PDMS المعالجة على قوالب السيليكون بأنماط SU-8 سمات سلبية بعد إزالة القالب (الشكل 2أ). لتصنيع الأمعاء على الشريحة، تم ربط طبقة PDMS العلوية المحضرة بشكل متسلسل بفيلم PDMS مسامي ثم تم محاذاتها مع طبقة PDMS السفلية عن طريق الترابط غير القابل للعكس باستخدام معالج كورونا (الشكل 2ب-و). لتصنيع رقائق هجينة، تم ربط نسخ PDMS المعالجة بشرائح زجاجية لإنشاء أجهزة ميكروفلويدية أحادية القناة يمكنها استيعاب إدخالات Transwell (الشكل 2ح والبيانات الممتدة الشكل 2). تتم عملية الترابط عن طريق معالجة أسطح نسخة PDMS والزجاج ببلازما الأكسجين أو معالجة كورونا. بعد تعقيم تم تركيب جهاز مصنوع بدقة متناهية على أنبوب السيليكون، وكان إعداد الجهاز جاهزًا لإجراء تَشَكُّل ثلاثي الأبعاد للظهارة المعوية (الشكل 2ج).
أ، رسم تخطيطي لتحضير أجزاء PDMS من قوالب السيليكون المنقوشة SU-8. تم سكب محلول PDMS غير المعالج على قالب سيليكون (يسار)، ومعالجته عند 60 درجة مئوية (وسط) وإخراجه من القالب (يمين). تم تقطيع PDMS المستخرج من القالب إلى قطع وتنظيفه للاستخدام اللاحق. ب، صورة لقالب السيليكون المستخدم لتحضير الطبقة العلوية من PDMS. ج، صورة لقالب السيليكون المستخدم لتصنيع غشاء PDMS المسامي. د، سلسلة من الصور لمكونات PDMS العلوية والسفلية والجهاز المعوي المُجمّع على الشريحة. هـ، رسم تخطيطي لمحاذاة مكونات PDMS العلوية والغشاء والسفلية. كل طبقة مرتبطة بشكل لا رجعة فيه عن طريق معالجة البلازما أو الهالة. و، رسم تخطيطي لجهاز الأمعاء على الشريحة المُصنّع مع قنوات دقيقة ملتوية متراكبة وغرف تفريغ. ز، إعداد الأمعاء على الشريحة لزراعة الخلايا الدقيقة. الأمعاء المُصنّعة على الشريحة مُجمّعة مع وُضع أنبوب السيليكون والمحقنة على غطاء زجاجي. ووُضع جهاز الشريحة على غطاء طبق بتري بقطر 150 مم للمعالجة. واستُخدمت المادة الرابطة لإغلاق أنبوب السيليكون. لقطات مرئية لتصنيع الشريحة الهجينة والتكوين ثلاثي الأبعاد باستخدام الشرائح الهجينة. أُدخلت حشوات ترانسويل المُجهزة بشكل مستقل لزراعة طبقات أحادية ثنائية الأبعاد من الخلايا الظهارية المعوية في الشريحة الهجينة لتحفيز التكوين ثلاثي الأبعاد للأمعاء. يُروى الوسط من خلال قنوات دقيقة أسفل طبقة الخلايا المُثبتة على حشوة ترانسويل. مقياس الشريط، 1 سم. ساعة. أُعيد طبعه بإذن من المرجع. 4. إلسفير.
في هذا البروتوكول، تم استخدام خط خلايا Caco-2 والعضيات المعوية كمصدر للظهارة (الشكل 3أ). تمت زراعة كلا النوعين من الخلايا بشكل مستقل (الصندوق 2 والصندوق 5) واستخدامهما لزرع القنوات الدقيقة المغلفة بـ ECM للأمعاء الموجودة على الشريحة أو إدخالات Transwell. عندما تكون الخلايا متلاقية (تغطية> 95٪ في القوارير)، يتم حصاد خلايا Caco-2 المزروعة بشكل روتيني (بين الممرات 10 و 50) في قوارير T لإعداد معلقات الخلايا المنفصلة عن طريق سائل التربسين (الصندوق 2). تمت زراعة العضيات المعوية البشرية من خزعات الأمعاء أو الاستئصال الجراحي في قباب سقالة Matrigel في صفائح ذات 24 بئرًا لدعم البيئة الدقيقة الهيكلية. تم استكمال الوسط الذي يحتوي على مورفوجينات أساسية (مثل Wnt و R-spondin و Noggin) وعوامل النمو المحضرة كما هو موضح في الصندوق 3 كل يومين حتى نمت العضيات إلى حوالي 500 يتم حصاد العضويات الناضجة بالكامل وتفكيكها إلى خلايا مفردة لزرعها على الأمعاء أو إدخالات Transwell على شريحة (الصندوق 5). وكما ذكرنا سابقًا، يمكن التمييز بينها وفقًا لنوع المرض12،13 (مثل التهاب القولون التقرحي، ومرض كرون، وسرطان القولون والمستقيم، أو المتبرع الطبيعي)، وموقع الآفة (مثل الآفة مقابل المنطقة غير المصابة) وموقع الجهاز الهضمي في القناة (مثل الاثني عشر، والصائم، واللفائفي، والأعور، والقولون، أو المستقيم). نقدم بروتوكولًا محسنًا في الصندوق 5 لزراعة العضويات القولونية (الغرويات) التي تتطلب عادةً تركيزات أعلى من المورفوجينات من العضويات المعوية الدقيقة.
أ، سير العمل لتحريض تكوين الأمعاء في شريحة الأمعاء. تُستخدم ظهارة الأمعاء البشرية Caco-2 والعضيات المعوية في هذا البروتوكول لإظهار تكوين ثلاثي الأبعاد. تم زرع الخلايا الظهارية المعزولة في جهاز الأمعاء على الشريحة المُجهز (تحضير الشريحة). بمجرد زرع الخلايا (زرعها) وربطها (ربطها) بغشاء PDMS المسامي في اليوم 0 (D0)، يبدأ التدفق القمي (AP) ويحافظ عليه خلال اليومين الأولين (التدفق، AP، D0-D2). يبدأ التدفق القاعدي الجانبي (BL) أيضًا جنبًا إلى جنب مع حركات التمدد الدورية (التمدد، التدفق، AP وBL) عند تكوين طبقة أحادية ثنائية الأبعاد كاملة. حدث تكوين الأمعاء ثلاثي الأبعاد تلقائيًا بعد 5 أيام من الثقافة الدقيقة (تكوين، D5). تُظهر صور تباين الطور مورفولوجيا تمثيلية لخلايا Caco-2 في كل خطوة تجريبية أو نقطة زمنية. (رسم بياني شريطي، 100 ميكرومتر). أربعة مخططات تخطيطية توضح التسلسلات المقابلة لتكوين الأمعاء (أعلى اليمين). تمثل الأسهم المتقطعة في الرسم التخطيطي اتجاه تدفق السوائل. ب، صورة مجهر إلكتروني مسحي تُظهر طوبولوجيا سطح ظهارة Caco-2 ثلاثية الأبعاد المُثبتة (يسار). يُظهر المُلحق الذي يُسلط الضوء على المنطقة المُكبرة (المربع الأبيض المتقطع) الزغيبات المُتجددة على طبقة Caco-2 ثلاثية الأبعاد (يمين). ج، منظر أمامي أفقي لأغشية Caco-2 ثلاثية الأبعاد المُثبتة، كلودين (ZO-1، أحمر) وحواف فرشاة مُستمرة مُسمّاة بـ F-actin (أخضر) ونوى (أزرق). تصور مُناعي مُتقاس بالفلورسنت للخلايا الظهارية على شرائح معوية. تُشير الأسهم التي تُشير إلى الرسم التخطيطي الأوسط إلى موقع المستوى البؤري لكل منظر مُتقاس بالضوء. د، المسار الزمني للتغيرات المورفولوجية في العضويات المُزروعة على شريحة تم الحصول عليها بواسطة مجهر تباين الطور في أيام 3، 7، 9، 11، و13. يُظهر الملحق (أعلى اليمين) التكبير العالي للصورة المقدمة. هـ، صورة مجهرية DIC لظهارة عضوية ثلاثية الأبعاد تم إنشاؤها في الأمعاء على شريحة تم التقاطها في اليوم 7.f، صور مناعية فلورية متراكبة تُظهر علامات للخلايا الجذعية (LGR5؛ أرجواني)، وخلايا الكأس (MUC2؛ أخضر)، وF-actin (رمادي) والنوى (سماوي) المزروعة على شرائح الأمعاء لمدة 3 أيام، على التوالي (يسار) و13 يومًا (وسط) من العضويات على الطبقة الظهارية. انظر أيضًا الشكل 3 للبيانات الممتدة، والذي يسلط الضوء على إشارات LGR5 دون إشارات MUC2. صور فلورية تُظهر البنية الدقيقة الظهارية (يمين) لظهارة عضوية ثلاثية الأبعاد تم إنشاؤها في الأمعاء على شريحة عن طريق صبغ الغشاء البلازمي بصبغة CellMask (يمين) في اليوم 13 من الثقافة. شريط المقياس هو 50 ميكرومتر ما لم يُذكر خلاف ذلك.b أعيد طبعه بإذن من المرجع.2. مطبعة جامعة أكسفورد؛ ج. مُعدّل بإذن من المرجع.2. مطبعة جامعة أكسفورد؛ هـ و و مُعدّل بإذن من المرجع.12 بموجب رخصة المشاع الإبداعي CC BY 4.0.
في الأمعاء على رقاقة، من الضروري تعديل السطح الكاره للماء لغشاء PDMS المسامي لطلاء ECM الناجح. في هذا البروتوكول، نطبق طريقتين مختلفتين لتعديل كراهية أغشية PDMS للماء. بالنسبة لزراعة خلايا Caco-2، كان تنشيط السطح عن طريق العلاج بالأشعة فوق البنفسجية/الأوزون وحده كافيًا لتقليل كراهية سطح PDMS للماء، وطلاء ECM وربط خلايا Caco-2 بغشاء PDMS. ومع ذلك، تتطلب الثقافة الدقيقة للظهارة العضوية وظيفة سطحية قائمة على المواد الكيميائية لتحقيق ترسيب فعال لبروتينات ECM عن طريق تطبيق البولي إيثيلين إيمين (PEI) والغلوتارالدهيد بشكل متسلسل على القنوات الدقيقة PDMS. بعد تعديل السطح، تم ترسيب بروتينات ECM لتغطية سطح PDMS الوظيفي ثم إدخالها في الظهارة العضوية المعزولة. بعد ربط الخلايا، تبدأ ثقافة الخلايا الدقيقة بتروية الوسط فقط في القناة الدقيقة العلوية حتى تشكل الخلايا طبقة أحادية كاملة، بينما تحافظ القناة الدقيقة السفلية على الظروف الثابتة. تتيح هذه الطريقة المُحسّنة لتنشيط السطح وطلاء ECM ربط الظهارة العضوية لتحفيز التكوّن ثلاثي الأبعاد على سطح PDMS.
تتطلب ثقافات Transwell أيضًا طلاء ECM قبل زرع الخلايا؛ ومع ذلك، لا تتطلب ثقافات Transwell خطوات معالجة مسبقة معقدة لتنشيط سطح الإدخالات المسامية. بالنسبة لزراعة خلايا Caco-2 على إدخالات Transwell، يعمل طلاء ECM على الإدخالات المسامية على تسريع ربط خلايا Caco-2 المنفصلة (<1 ساعة) وتكوين حاجز الوصلات الضيقة (<1-2 يوم). لزراعة العضويات على إدخالات Transwell، يتم زرع العضويات المعزولة على إدخالات مغلفة بـ ECM، وربطها بسطح الغشاء (<3 ساعات) والحفاظ عليها حتى تشكل العضويات طبقة أحادية كاملة مع سلامة الحاجز. يتم إجراء ثقافات Transwell في صفائح ذات 24 بئرًا دون استخدام رقائق هجينة.
يمكن البدء في التخلق ثلاثي الأبعاد في المختبر عن طريق تطبيق تدفق السوائل على الجانب القاعدي الجانبي لطبقة ظهارية ثابتة. في الأمعاء على رقاقة، بدأ التخلق الظهاري عندما تم ضخ الوسط في القنوات الدقيقة العلوية والسفلية (الشكل 3أ). كما هو موضح سابقًا، من الضروري إدخال تدفق السوائل في الحجرة السفلية (القاعدية الجانبية) للإزالة المستمرة لمثبطات المورفوجين المفرزة اتجاهيًا. لتوفير العناصر الغذائية الكافية والمصل للخلايا المرتبطة بالأغشية المسامية وتوليد إجهاد القص اللمعي، فإننا نطبق عادةً تدفقًا مزدوجًا في الأمعاء على رقاقة. في الرقائق الهجينة، تم إدخال إدخالات Transwell التي تحتوي على طبقات أحادية ظهارية في الرقائق الهجينة. ثم تم تطبيق الوسط تحت الجانب القاعدي الجانبي لإدخال Transwell المسامي من خلال القناة الدقيقة. حدث التخلق المعوي بعد 3-5 أيام من بدء التدفق القاعدي الجانبي في كل من منصات الثقافة.
يمكن تحليل السمات المورفولوجية للطبقات الظهارية ثلاثية الأبعاد المصممة هندسيًا من خلال تطبيق طرق تصوير مختلفة، بما في ذلك مجهر التباين الطوري، ومجهر التباين التداخلي التفاضلي (DIC)، والمجهر الإلكتروني الماسح، أو مجهر المناعة الفلورية (الشكلان 3 و4). يمكن إجراء تصوير التباين الطوري أو تصوير DIC بسهولة في أي وقت أثناء الثقافة لمراقبة شكل وبروز الطبقات الظهارية ثلاثية الأبعاد. ونظرًا للشفافية البصرية لأغشية PDMS والبوليستر، يمكن لكل من منصات الأمعاء على الشريحة والرقاقة الهجينة توفير تصوير موضعي في الوقت الفعلي دون الحاجة إلى تقطيع الجهاز أو تفكيكه. عند إجراء التصوير المناعي الفلوري (الأشكال 1، 3 ج، و و4 ب، ج)، يتم تثبيت الخلايا عادةً باستخدام 4٪ (وزن / حجم) بارافورمالدهيد (PFA)، يليه Triton X-100 و 2٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل البقر (BSA)، بالترتيب. اعتمادًا على يمكن استخدام نوع الخلية، والمثبتات المختلفة، والنفاذات، وعوامل الحجب. تُستخدم الأجسام المضادة الأولية التي تستهدف علامات الخلايا أو المناطق المعتمدة على السلالة لتسليط الضوء على الخلايا المثبتة في موقعها على الشريحة، تليها الأجسام المضادة الثانوية جنبًا إلى جنب مع صبغة مضادة للصبغ تستهدف إما النواة (على سبيل المثال، 4'، 6-diamidino-2-phenylene) إندول، DAPI) أو F-actin (على سبيل المثال، phalloidin المسمى بالفلورسنت). يمكن أيضًا إجراء التصوير الحي القائم على الفلورسنت في الموقع للكشف عن إنتاج المخاط (الشكل 1، "التمايز الخلوي" و"فسيولوجيا الأمعاء")، والاستعمار العشوائي للخلايا الميكروبية (الشكل 1، "الثقافة المشتركة بين المضيف والميكروب")، وتجنيد الخلايا المناعية (الشكل 1، "نمذجة المرض") أو ملامح مورفولوجيا الظهارة ثلاثية الأبعاد (الشكل 3 ج، و و4 ب، ج). عند تعديل الأمعاء على الشريحة لفصل الطبقة العليا من طبقة القناة الدقيقة السفلية، كما هو موضح في المرجع. كما هو موضح في الشكل 2، يمكن تصور مورفولوجيا الخلايا الظهارية ثلاثية الأبعاد وكذلك الزغيبات على حافة الفرشاة القمية بواسطة المجهر الإلكتروني الماسح (الشكل 3ب). يمكن تقييم التعبير عن علامات التمايز عن طريق إجراء تسلسل PCR5 الكمي أو تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. في هذه الحالة، يتم حصاد الطبقات ثلاثية الأبعاد من الخلايا الظهارية المزروعة في رقائق الأمعاء أو الرقائق الهجينة عن طريق التربسين ثم استخدامها للتحليل الجزيئي أو الجيني.
أ، سير عمل لتحفيز التخلق المعوي في شريحة هجينة. يُستخدم بروتين Caco-2 والعضيات المعوية في هذا البروتوكول لإظهار التخلق ثلاثي الأبعاد في منصة شريحة هجينة. تم زرع الخلايا الظهارية المنفصلة في إدخالات Transwell المُجهزة (تحضير TW؛ انظر الشكل أدناه). بمجرد زرع الخلايا (زرعها) وربطها بأغشية البوليستر في إدخالات Transwell، تمت زراعة جميع الخلايا في ظروف ثابتة (زراعة TW). بعد 7 أيام، تم دمج إدخال Transwell واحد يحتوي على طبقة أحادية ثنائية الأبعاد من الخلايا الظهارية في شريحة هجينة لإدخال تدفق قاعدي جانبي (Flow، BL)، مما أدى في النهاية إلى تكوين طبقة ظهارية ثلاثية الأبعاد (التخلق). صور مجهرية ذات تباين طوري تُظهر السمات المورفولوجية للخلايا الظهارية للأعضاء البشرية المستمدة من القولون الصاعد الطبيعي للمتبرع (خط C103) في كل خطوة تجريبية أو نقطة زمنية. توضح المخططات في الطبقات العليا التكوين التجريبي لكل خطوة. ب، يمكن أن تؤدي الرقائق الهجينة (الرسم التخطيطي الأيسر) إلى تكوين مورفولوجيا ثلاثي الأبعاد للخلايا الظهارية العضوية، وذلك من خلال صور مجهرية متحدة البؤر من أعلى إلى أسفل، مأخوذة من مواقع Z مختلفة (العلوي، الأوسط، والسفلي؛ انظر الرسم التخطيطي الأيمن والخطوط المنقطة المقابلة). أظهرت خصائص مورفولوجية واضحة. أكتين-F (سماوي)، النواة (رمادي). ج، صور مجهرية متحدة البؤر فلورية (عرض بزاوية ثلاثية الأبعاد) للخلايا الظهارية المشتقة من العضوية المزروعة في ترانسويل ثابت (TW؛ مُدرج داخل مربع أبيض متقطع) مقابل رقاقة هجينة (أكبر لقطة كاملة) تُقارن بين مورفولوجيا ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد، على التوالي. يُظهر زوج من الصور المقطعية الرأسية ثنائية الأبعاد (مُدرج في الزاوية اليمنى العليا؛ "XZ") أيضًا سمات ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد. شريط المقياس، 100 ميكرومتر. ج. أعيد طبعه بإذن من المرجع. 4. إلسفير.
يمكن تحضير الضوابط عن طريق زراعة نفس الخلايا (Caco-2 أو الخلايا الظهارية العضوية المعوية) في طبقات أحادية ثنائية الأبعاد في ظل ظروف الثقافة الثابتة التقليدية. والجدير بالذكر أن استنزاف العناصر الغذائية قد يحدث بسبب السعة المحدودة لحجم القنوات الدقيقة (أي حوالي 4 ميكرولتر في القناة العلوية في تصميم شريحة الأمعاء الأصلية). لذلك، يمكن أيضًا مقارنة مورفولوجيا الخلايا الظهارية قبل وبعد تطبيق التدفق القاعدي الجانبي.
يجب أن يتم إجراء عملية الطباعة الحجرية الناعمة في غرفة نظيفة. بالنسبة لكل طبقة على الشريحة (الطبقات العلوية والسفلية والأغشية) والرقائق الهجينة، تم استخدام أقنعة ضوئية مختلفة وتصنيعها على رقائق سيليكون منفصلة لأن ارتفاعات القنوات الدقيقة كانت مختلفة. ارتفاعات الهدف للقنوات الدقيقة العلوية والسفلية للأمعاء على الشريحة هي 500 ميكرومتر و200 ميكرومتر على التوالي. ارتفاع هدف القناة للرقاقة الهجينة هو 200 ميكرومتر.
ضع رقاقة السيليكون مقاس 3 بوصات في طبق مع الأسيتون. قم بتحريك الطبق بلطف لمدة 30 ثانية، ثم جفف الرقاقة في الهواء. انقل الرقاقة إلى طبق به IPA، ثم قم بتدوير الطبق لمدة 30 ثانية لتنظيفه.
يمكن استخدام محلول البيرانا (خليط من بيروكسيد الهيدروجين وحمض الكبريتيك المركز بنسبة 1:3 (حجم/حجم)) بشكل اختياري لتعظيم إزالة البقايا العضوية من سطح رقاقة السيليكون.
محلول البيرانا مادة تآكلية للغاية وتولد حرارة. هناك حاجة إلى احتياطات أمان إضافية. للتخلص من النفايات، اترك المحلول يبرد ثم انقله إلى حاوية نفايات نظيفة وجافة. استخدم حاويات ثانوية وقم بتسمية حاويات النفايات بشكل صحيح. يرجى اتباع إرشادات السلامة الخاصة بالمنشأة للحصول على إجراءات أكثر تفصيلاً.
قم بتجفيف الرقاقات عن طريق وضعها على صفيحة ساخنة بدرجة حرارة 200 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد التجفيف، يتم رج الرقاقة خمس مرات في الهواء لتبرد.
صب حوالي 10 جرام من مادة مقاومة الضوء SU-8 2100 على مركز رقاقة السيليكون المنظفة. استخدم الملقط لنشر مادة مقاومة الضوء بالتساوي على الرقاقة. ضع الرقاقة من حين لآخر على صفيحة ساخنة بدرجة حرارة 65 درجة مئوية لجعل مادة مقاومة الضوء أقل لزوجة وأسهل في الانتشار. لا تضع الرقاقة مباشرة على الصفيحة الساخنة.
تم توزيع SU-8 بالتساوي على الرقاقة عن طريق تشغيل طلاء الدوران. قم ببرمجة دوران وارد لـ SU-8 لمدة 5-10 ثوانٍ للانتشار بسرعة 500 دورة في الدقيقة بتسارع 100 دورة في الدقيقة / ثانية. اضبط الدوران الرئيسي لنمط سمك 200 ميكرومتر عند 1500 دورة في الدقيقة، أو حقق سمكًا 250 ميكرومتر (مما يجعل ارتفاع 500 ميكرومتر للطبقة العليا من الأمعاء على الشريحة؛ راجع "الخطوات الحرجة" أدناه) مضبوطًا على تسارع 300 دورة في الدقيقة / ثانية لمدة 30 ثانية عند 1200 دورة في الدقيقة.
يمكن تعديل سرعة الدوران الرئيسية وفقًا للسمك المستهدف لنمط SU-8 على رقاقة السيليكون.
ولتصنيع أنماط SU-8 بارتفاع 500 ميكرومتر للطبقة العليا من الأمعاء على الشريحة، تم تكرار خطوات طلاء الدوران والخبز الناعم لهذا الصندوق (الخطوتين 7 و8) بالتتابع (انظر الخطوة 9) لإنتاج طبقتين من SU-8 بسمك 250 ميكرومتر، والتي يمكن وضعها في طبقات وضمها عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية في الخطوة 12 من هذا الصندوق، مما يجعل الطبقة بارتفاع 500 ميكرومتر.
قم بخبز رقائق SU-8 بشكل ناعم عن طريق وضع الرقائق بعناية على صفيحة ساخنة عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم قم بتبديل الإعداد إلى 95 درجة مئوية واحتضنها لمدة 40 دقيقة إضافية.
لتحقيق ارتفاع 500 ميكرومتر لنمط SU-8 في القناة الدقيقة العلوية، كرر الخطوتين 7 و8 لتوليد طبقتين SU-8 بسمك 250 ميكرومتر.
باستخدام محاذاة قناع الأشعة فوق البنفسجية، قم بإجراء اختبار المصباح وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة لحساب وقت تعرض الرقاقة. (وقت التعرض، مللي ثانية) = (جرعة التعرض، مللي جول/سم2) / (طاقة المصباح، مللي واط/سم2).
بعد تحديد وقت التعرض، ضع قناع الصورة على حامل القناع الخاص بمحاذي قناع الأشعة فوق البنفسجية ثم ضع قناع الصورة على رقاقة SU-8 المطلية.
ضع السطح المطبوع لقناع الصورة مباشرة على الجانب المغطى بطبقة SU-8 من رقاقة السيليكون لتقليل تشتت الأشعة فوق البنفسجية.
قم بتعريض رقاقة SU-8 المطلية وقناع الضوء عموديا لـ 260 mJ/cm2 من ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة التعرض المحددة مسبقًا (انظر الخطوة 10 من هذا المربع).
بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية، تم خبز رقائق السيليكون المطلية بـ SU-8 عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على كل لوحة ساخنة لصنع أنماط بارتفاع 200 ميكرومتر. قم بتمديد وقت ما بعد الخبز عند 95 درجة مئوية إلى 30 دقيقة لصنع أنماط بارتفاع 500 ميكرومتر.
يتم سكب المطور في طبق زجاجي، ويتم وضع الرقاقة المخبوزة في الطبق. قد يختلف حجم مطور SU-8 حسب حجم اللوحة الزجاجية. تأكد من استخدام كمية كافية من مطور SU-8 لإزالة SU-8 غير المكشوف تمامًا. على سبيل المثال، عند استخدام طبق زجاجي بقطر 150 مم بسعة 1 لتر، استخدم حوالي 300 مل من مطور SU-8. قم بتطوير القالب لمدة 25 دقيقة مع الدوران اللطيف من حين لآخر.
اشطف القالب المتطور بحوالي 10 مل من المطور الطازج متبوعًا برش IPA عن طريق رش المحلول باستخدام ماصة.
ضع الرقاقة في منظف البلازما وعرضها لبلازما الأكسجين (غاز جوي، ضغط مستهدف 1 × 10−5 تور، قوة 125 وات) لمدة 1.5 دقيقة.
ضع الرقاقة في مجفف التفريغ مع شريحة زجاجية بالداخل. يمكن وضع الرقاقات والشرائح جنبًا إلى جنب. إذا تم تقسيم مجفف التفريغ إلى عدة طبقات بواسطة لوحة، ضع الشرائح في الحجرة السفلية والرقاقات في الحجرة العلوية. قم بإسقاط 100 ميكرولتر من محلول السيلان ثلاثي كلورو (1H، 1H، 2H، 2H-بيرفلوروكتيل) على شريحة زجاجية وطبق الفراغ للسيليكون.
قم بإذابة قارورة من خلايا Caco-2 المجمدة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية، ثم انقل الخلايا المذابة إلى قارورة T75 تحتوي على 15 مل من وسط Caco-2 المسخن مسبقًا بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
لتمرير خلايا Caco-2 عند نسبة التقاء تبلغ حوالي 90%، قم أولاً بتدفئة وسط Caco-2، وPBS، و0.25% تريبسين/1 مليمول EDTA في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
قم بسحب الوسط عن طريق الشفط بالتفريغ. اغسل الخلايا مرتين بـ 5 مل من PBS الدافئ عن طريق تكرار الشفط بالتفريغ وإضافة PBS جديد.