شكرًا لك على زيارة Nature.com.أنت تستخدم إصدار متصفح مع دعم محدود لـ CSS.للحصول على أفضل تجربة ، نوصي باستخدام مستعرض محدث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer).بالإضافة إلى ذلك ، لضمان الدعم المستمر ، نعرض الموقع بدون أنماط وجافا سكريبت.
يعرض دائرة مكونة من ثلاث شرائح في وقت واحد.استخدم الزرين السابق والتالي للتنقل عبر ثلاث شرائح في وقت واحد ، أو استخدم أزرار شريط التمرير في النهاية للتنقل عبر ثلاث شرائح في المرة الواحدة.
يمنع الحاجز الدموي الدماغي والحاجز الدموي الدماغي العوامل العلاجية الحيوية من الوصول إلى أهدافها في الجهاز العصبي المركزي ، مما يعيق العلاج الفعال للأمراض العصبية.لاكتشاف ناقلات دماغية جديدة في الجسم الحي ، قدمنا ​​مكتبة الببتيد T7 العاثية وقمنا بجمع الدم والسائل النخاعي (CSF) بشكل متسلسل باستخدام نموذج تجمع كبير واعٍ من الفئران.تم إثراء استنساخ الملتهمة النوعية بدرجة عالية في السائل الدماغي الشوكي بعد أربع جولات من الاختيار.كشف اختبار الببتيدات المرشحة الفردية عن إثراء أكثر من 1000 ضعف في السائل الدماغي الشوكي.تم تأكيد النشاط الحيوي للتسليم بوساطة الببتيد إلى الدماغ من خلال انخفاض بنسبة 40 ٪ في مستوى الأميلويد في السائل النخاعي باستخدام مثبط الببتيد BACE1 المرتبط بببتيد العبور الجديد المحدد.تشير هذه النتائج إلى أن الببتيدات التي تم تحديدها بواسطة طرق اختيار العاثيات في الجسم الحي قد تكون وسائل مفيدة للتوصيل الجهازي للجزيئات الكبيرة إلى الدماغ بتأثير علاجي.
ركزت أبحاث العلاج الموجه للجهاز العصبي المركزي (CNS) بشكل كبير على تحديد الأدوية والعوامل المحسنة التي تظهر خصائص استهداف الجهاز العصبي المركزي ، مع بذل جهد أقل لاكتشاف الآليات التي تدفع توصيل الدواء الفعال إلى الدماغ.بدأ هذا يتغير الآن حيث أن توصيل الأدوية ، وخاصة الجزيئات الكبيرة ، هو جزء لا يتجزأ من تطوير الأدوية الحديثة في علم الأعصاب.بيئة الجهاز العصبي المركزي محمية بشكل جيد من خلال نظام الحاجز الوعائي الدماغي ، والذي يتكون من الحاجز الدموي الدماغي (BBB) ​​والحاجز الدموي الدماغي (BCBB) 1 ، مما يجعل توصيل الأدوية إلى الدماغ صعبًا.تشير التقديرات إلى أن جميع أدوية الجزيئات الكبيرة تقريبًا وأكثر من 98٪ من الأدوية الجزيئية الصغيرة يتم التخلص منها من الدماغ 3.هذا هو السبب في أنه من المهم للغاية تحديد أنظمة نقل الدماغ الجديدة التي توفر توصيلًا فعالًا ومحددًا للأدوية العلاجية للجهاز العصبي المركزي 4،5.ومع ذلك ، فإن BBB و BCSFB يقدمان أيضًا فرصة ممتازة لتوصيل الأدوية لأنها تخترق وتدخل جميع هياكل الدماغ من خلال الأوعية الدموية الواسعة.وبالتالي ، فإن الجهود الحالية لاستخدام طرق غير جراحية للتسليم إلى الدماغ تعتمد إلى حد كبير على آلية النقل بوساطة المستقبل (PMT) باستخدام مستقبلات BBB6 الذاتية.على الرغم من التطورات الرئيسية الحديثة في استخدام مسار مستقبلات الترانسفيرين ، هناك حاجة إلى مزيد من التطوير لأنظمة توصيل جديدة بخصائص محسنة.تحقيقا لهذه الغاية ، كان هدفنا هو تحديد الببتيدات القادرة على التوسط في نقل السائل النخاعي ، حيث يمكن من حيث المبدأ استخدامها لتوصيل الجزيئات الكبيرة إلى الجهاز العصبي المركزي أو لفتح مسارات مستقبلات جديدة.على وجه الخصوص ، يمكن أن تكون المستقبلات والناقلات الخاصة بالجهاز الدماغي الوعائي (BBB و BSCFB) بمثابة أهداف محتملة للتوصيل الفعال والمحدّد لأدوية العلاج الحيوي.السائل الدماغي النخاعي (CSF) هو نتاج إفرازي للضفيرة المشيمية (CS) وهو على اتصال مباشر بالسائل الخلالي للدماغ من خلال الفضاء تحت العنكبوتية والفضاء البطيني.لقد ثبت مؤخرًا أن السائل الدماغي النخاعي تحت العنكبوتية ينتشر بشكل مفرط في النسيج الخلالي للدماغ 9.نأمل في الوصول إلى الفضاء المتني باستخدام مسار التدفق تحت العنكبوتية هذا أو مباشرة من خلال BBB.لتحقيق ذلك ، قمنا بتنفيذ إستراتيجية قوية لاختيار العاثيات في الجسم الحي والتي تحدد بشكل مثالي الببتيدات المنقولة بواسطة أي من هذين المسارين المتميزين.
نحن الآن نصف طريقة عرض متسلسلة في عرض الملتهمة في الجسم الحي مع أخذ عينات السائل الدماغي الشوكي إلى جانب تسلسل الإنتاجية العالية (HTS) لمراقبة جولات الاختيار الأولية مع أعلى تنوع في المكتبات.تم إجراء الفحص على الفئران الواعية بقنية كبيرة مزروعة بشكل دائم لتجنب تلوث الدم.الأهم من ذلك ، أن هذا النهج يختار كلاً من استهداف الدماغ والببتيدات مع نشاط النقل عبر الحاجز الوعائي الدماغي.استخدمنا لاقمات T7 نظرًا لصغر حجمها (حوالي 60 نانومتر) 10 واقترحنا أنها مناسبة لنقل الحويصلات التي تسمح بالعبور عبر الخلايا للحاجز البطاني و / أو حاجز النخاع الظهاري.بعد أربع جولات من التنظيف ، تم عزل مجموعات العاثيات التي أظهرت إثراءًا قويًا في الجسم الحي للسائل الدماغي النخاعي وترابط الأوعية الدقيقة الدماغي.الأهم من ذلك ، تمكنا من تأكيد النتائج التي توصلنا إليها من خلال إثبات أن أفضل الببتيدات المرشحة المفضلة والمُصنّعة كيميائيًا قادرة على نقل شحنة البروتين إلى السائل النخاعي.أولاً ، تم تحديد التأثيرات الديناميكية الدوائية للجهاز العصبي المركزي من خلال الجمع بين الببتيد العابر الرائد ومثبط الببتيد BACE1.بالإضافة إلى إثبات أن استراتيجيات الفحص الوظيفي في الجسم الحي يمكن أن تحدد ببتيدات نقل الدماغ الجديدة كناقلات شحن بروتين فعالة ، نتوقع أن تصبح أساليب الاختيار الوظيفي المماثلة مهمة أيضًا في تحديد مسارات نقل الدماغ الجديدة.
بناءً على وحدات تشكيل البلاك (PFU) ، بعد خطوة تعبئة العاثيات ، تم تصميم وإنشاء مكتبة من الببتيدات الخطية T7 12-Mer الخطية بتنوع حوالي 109 (انظر المواد والطرق).من المهم أن نلاحظ أننا قمنا بتحليل هذه المكتبة بعناية قبل التحليل في الجسم الحي.تم إنشاء تضخيم PCR لعينات مكتبة الملتهمة باستخدام الاشعال المعدلة أمبليكون التي كانت قابلة للتطبيق مباشرة على HTS (الشكل التكميلي 1 أ).بسبب أ) أخطاء تسلسل HTS11 ، ب) التأثير على جودة الاشعال (NNK) 1-12 ، و ج) وجود فاج من النوع البري (بالوزن) (إدراجات هيكلية) في مكتبة الاستعداد ، تم تنفيذ إجراء ترشيح تسلسلي لاستخراج معلومات التسلسل التي تم التحقق منها فقط (الشكل التكميلي 1 ب).تنطبق خطوات التصفية هذه على جميع مكتبات تسلسل HTS.بالنسبة للمكتبة القياسية ، تم الحصول على ما مجموعه 233،868 قراءة ، اجتاز 39 ٪ منها معايير التصفية واستخدمت لتحليل المكتبة والاختيار للجولات اللاحقة (الشكل التكميلي 1 ج-هـ).كانت القراءات في الغالب مضاعفات لثلاثة أزواج أساسية في الطول مع ذروة عند 36 نيوكليوتيد (الشكل التكميلي 1 ج) ، مما يؤكد تصميم المكتبة (NNK) 1-12.والجدير بالذكر أن ما يقرب من 11 ٪ من أعضاء المكتبة احتوىوا على 12 بعدًا من النوع البري (wt) إدراج العمود الفقري PAGISRELVDKL ، وما يقرب من نصف التسلسلات (49 ٪) احتوت على عمليات الإدراج أو الحذف.أكدت مكتبة مكتبة HTS التنوع الكبير في الببتيدات في المكتبة: تم العثور على أكثر من 81 ٪ من متواليات الببتيد مرة واحدة فقط و 1.5 ٪ فقط حدثت في 4 نسخ (الشكل التكميلي 2 أ).ترتبط ترددات الأحماض الأمينية (aa) في جميع المواضع الـ 12 في المرجع ارتباطًا جيدًا بالترددات المتوقعة لعدد الكودونات الناتجة عن ذخيرة NKK المتدهورة (الشكل التكميلي 2 ب).يرتبط التردد المرصود للمخلفات aa المشفرة بواسطة هذه الإدخالات جيدًا بالتردد المحسوب (r = 0.893) (الشكل التكميلي 2 ج).يتضمن إعداد مكتبات الملتهمة للحقن خطوات تضخيم وإزالة الذيفان الداخلي.سبق أن ثبت أن هذا يقلل بشكل محتمل من تنوع مكتبات فج.لذلك ، قمنا بتسلسل مكتبة الملتهمة المضخمة للوحة التي خضعت لإزالة السموم الداخلية ومقارنتها بالمكتبة الأصلية لتقدير تواتر AA.لوحظ وجود علاقة قوية (r = 0.995) بين البركة الأصلية والمجمع المضخم والمنقى (الشكل التكميلي 2 د) ، مما يشير إلى أن المنافسة بين الحيوانات المستنسخة التي تم تضخيمها على الألواح باستخدام الملتهمة T7 لم تسبب تحيزًا كبيرًا.تستند هذه المقارنة إلى تواتر الأشكال ثلاثية الببتيد في كل مكتبة ، نظرًا لأن تنوع المكتبات (~ 109) لا يمكن التقاطه بالكامل حتى باستخدام HTS.كشف تحليل التردد لـ aa في كل موضع عن تحيز صغير يعتمد على الموضع في المواضع الثلاثة الأخيرة من المرجع الذي تم إدخاله (الشكل التكميلي 2 هـ).في الختام ، خلصنا إلى أن جودة المكتبة وتنوعها كانت مقبولة ، ولم تتم ملاحظة سوى تغييرات طفيفة في التنوع بسبب تضخيم وإعداد مكتبات الملتهمة بين عدة جولات من الاختيار.
يمكن إجراء أخذ عينات السائل النخاعي التسلسلي عن طريق زرع قنية جراحيًا في CM للفئران الواعية لتسهيل التعرف على الملتهمة T7 المحقونة عن طريق الوريد (4) عبر BBB و / أو BCSFB (الشكل 1 أ-ب).استخدمنا ذراعي اختيار مستقلين (الذراعين A و B) في الجولات الثلاث الأولى من الانتقاء في الجسم الحي (الشكل 1 ج).قمنا تدريجياً بزيادة صرامة الاختيار عن طريق تقليل المبلغ الإجمالي للعاثية التي تم إدخالها في الجولات الثلاث الأولى من الاختيار.بالنسبة للجولة الرابعة من التحريك ، قمنا بدمج عينات من الفرعين A و B وقمنا بإجراء ثلاثة اختيارات مستقلة إضافية.لدراسة الخصائص في الجسم الحي لجزيئات الملتهمة T7 في هذا النموذج ، تم حقن الملتهمة من النوع البري (إدراج PAGISRELVDKL الرئيسي) في الفئران عبر الوريد الذيل.أظهر استرداد العاثيات من السائل النخاعي والدم في نقاط زمنية مختلفة أن لاقمات T7 عشرونية الوجوه الصغيرة نسبيًا لديها مرحلة خلوص أولية سريعة من حجرة الدم (الشكل التكميلي 3).بناءً على التتر المُعطى وحجم دم الفئران ، حسبنا ذلك تقريبًا 1٪ بالوزن.تم الكشف عن الملتهمة من الجرعة المعطاة في الدم بعد 10 دقائق من الحقن في الوريد.بعد هذا الانخفاض السريع الأولي ، تم قياس تخليص أولي أبطأ بنصف عمر يبلغ 27.7 دقيقة.الأهم من ذلك ، أنه تم استرداد عدد قليل جدًا من العاثيات من مقصورة السائل الدماغي الشوكي ، مما يشير إلى خلفية منخفضة لترحيل الملتهمة من النوع البري إلى حجرة السائل الدماغي النخاعي (الشكل التكميلي 3).في المتوسط ​​، تم اكتشاف حوالي 1 × 10-3 ٪ فقط من لاقمات T7 في الدم و 4 × 10-8 ٪ من العاثيات التي تم ضخها في البداية في السائل النخاعي خلال فترة أخذ العينات بأكملها (0-250 دقيقة).والجدير بالذكر أن نصف العمر (25.7 دقيقة) للعاثية البرية في السائل النخاعي كانت مماثلة لتلك التي لوحظت في الدم.توضح هذه البيانات أن الحاجز الذي يفصل حجرة السائل الدماغي النخاعي عن الدم سليم في الفئران المُقنية بالـ CM ، مما يسمح باختيار مكتبات الملتهمة في الجسم الحي لتحديد الحيوانات المستنسخة التي يتم نقلها بسهولة من الدم إلى حجرة السائل الدماغي النخاعي.
(أ) إعداد طريقة لإعادة أخذ عينات من السائل النخاعي (CSF) من تجمع كبير.(ب) رسم تخطيطي يوضح الموقع الخلوي لحاجز الجهاز العصبي المركزي (CNS) واستراتيجية الاختيار المستخدمة لتحديد الببتيدات التي تعبر الحاجز الدموي الدماغي (BBB) ​​والحاجز الدموي الدماغي.(ج) مخطط انسيابي لفحص عرض الملتهمة في الجسم الحي.في كل جولة انتقاء ، تم حقن العاثيات (معرفات الحيوانات داخل الأسهم) عن طريق الوريد.يتم الاحتفاظ بفرعين بديلين مستقلين (أ ، ب) بشكل منفصل حتى الجولة الرابعة من الاختيار.بالنسبة لجولتي الاختيار 3 و 4 ، تم تسلسل كل نسخة من الملتهمة المستخرجة من السائل الدماغي الشوكي يدويًا.(د) حركية الملتهمة المعزولة من الدم (الدوائر الحمراء) والسائل النخاعي (مثلثات خضراء) خلال الجولة الأولى من الاختيار في اثنين من الجرذان المقنَّبة بعد الحقن في الوريد لمكتبة الببتيد T7 (2 × 1012 لاقمات / حيوان).تشير المربعات الزرقاء إلى متوسط ​​التركيز الأولي للعاثية في الدم ، محسوبة من كمية الملتهمة المحقونة ، مع مراعاة الحجم الكلي للدم.تشير المربعات السوداء إلى نقطة تقاطع الخط y المستقرء من تركيزات لاقمات الدم.(هـ ، و) قدم التكرار النسبي والتوزيع لجميع الأشكال ثلاثية الببتيد المتداخلة الممكنة الموجودة في الببتيد.يظهر عدد الأشكال الموجودة في 1000 قراءة.تم تمييز الأشكال المخصبة بشكل كبير (P <0.001) بنقاط حمراء.(هـ) مخطط تشتت الارتباط الذي يقارن التردد النسبي لعنصر ثلاثي الببتيد للمكتبة المحقونة بالعاثية المشتقة من الدم من الحيوانات # 1.1 و # 1.2.(و) مخطط مبعثر الارتباط الذي يقارن الترددات النسبية للزخارف ثلاثية الببتيد العاثية الحيوانية # 1.1 و # 1.2 المعزولة في الدم والسائل النخاعي.(ز ، ح) تمثيل معرف التسلسل للعاثية المخصب بالدم (ز) مقابل المكتبات المحقونة والعاثية المخصب في CSF (ح) مقابل الدم بعد جولة من الانتقاء في الجسم الحي في كلا الحيوانين.يشير حجم الرمز المكون من حرف واحد إلى عدد مرات حدوث هذا الحمض الأميني في هذا الموضع.أخضر = قطبي ، أرجواني = محايد ، أزرق = قاعدي ، أحمر = حمضي وأسود = أحماض أمينية كارهة للماء.تم تصميم وإنتاج الشكل 1 أ ، ب بواسطة Eduard Urich.
قمنا بحقن مكتبة الببتيد الملتهمة في اثنين من الفئران بأداة CM (كلادين A و B) وعزلنا الملتهمة من السائل النخاعي والدم (الشكل 1 د).كان التخليص السريع الأولي للمكتبة أقل وضوحًا مقارنة بالعاثية من النوع البري.كان متوسط ​​عمر النصف للمكتبة المحقونة في كلا الحيوانين 24.8 دقيقة في الدم ، على غرار لاقمات من النوع البري ، و 38.5 دقيقة في السائل الدماغي النخاعي.تم إخضاع عينات الدم والسائل الدماغي الشوكي من كل حيوان لـ HTS وتم تحليل جميع الببتيدات المحددة لوجود عزر ثلاثي الببتيد قصير.تم اختيار أشكال ثلاثي الببتيد لأنها توفر الحد الأدنى من الأساس لتشكيل الهيكل وتفاعلات البروتين الببتيد.وجدنا علاقة جيدة في توزيع الزخارف بين مكتبة الملتهمة المحقونة والمستنسخات المستخرجة من دم كلا الحيوانين (الشكل 1 هـ).تشير البيانات إلى أن تكوين المكتبة يتم إثراؤه بشكل هامشي فقط في مقصورة الدم.تم تحليل ترددات الأحماض الأمينية وتسلسلات الإجماع في كل موضع باستخدام تكيف برنامج Weblogo16.ومن المثير للاهتمام أننا وجدنا إثراء قويًا في بقايا الجلايسين في الدم (الشكل 1 جم).عند مقارنة الدم مع الحيوانات المستنسخة المختارة من السائل الدماغي النخاعي ، لوحظ اختيار قوي وبعض إلغاء اختيار الأشكال (الشكل 1 و) ، وكانت بعض الأحماض الأمينية موجودة بشكل تفضيلي في مواقع محددة مسبقًا في 12 عضوًا (الشكل 1 ح).والجدير بالذكر أن الحيوانات الفردية اختلفت اختلافًا كبيرًا في السائل النخاعي ، بينما لوحظ تخصيب جلايسين الدم في كلا الحيوانين (الشكل التكميلي 4 أ-ي).بعد التصفية الصارمة لبيانات التسلسل في السائل الدماغي الشوكي للحيوانات # 1.1 و # 1.2 ، تم الحصول على ما مجموعه 964 و 420 ببتيدات 12 مير (الشكل التكميلي 1 د - هـ).تم تضخيم استنساخ الملتهمة المعزولة وإخضاعها لجولة ثانية من الاختيار في الجسم الحي.تعرضت الملتهمة المستخرجة من الجولة الثانية من الاختيار لـ HTS في كل حيوان واستخدمت جميع الببتيدات المحددة كمدخلات لبرنامج التعرف على الحافز لتحليل حدوث أشكال ثلاثية الببتيد (الشكل 2 أ ، ب ، إيف).مقارنة بالدورة الأولى للعاثية المستردة من السائل الدماغي النخاعي ، لاحظنا المزيد من الاختيار وإلغاء التحديد للعديد من الأشكال في السائل الدماغي النخاعي في الفرعين A و B (الشكل 2).تم تطبيق خوارزمية تعريف الشبكة لتحديد ما إذا كانت تمثل أنماطًا مختلفة من التسلسل المتسق.لوحظ تشابه واضح بين التسلسلات ذات 12 بعدًا التي استعادها السائل الدماغي النخاعي في الفرع البديل أ (الشكل 2 ج ، د) والكليد ب (الشكل 2 ز ، ح).كشف التحليل المجمع في كل فرع عن ملفات تعريف مختلفة للاختيار لـ 12-mer الببتيدات (الشكل التكميلي 5 ج ، د) وزيادة في نسبة عيار CSF / الدم بمرور الوقت للنسخ المجمعة بعد الجولة الثانية من الاختيار مقارنة بالجولة الأولى من الاختيار (الشكل التكميلي 5 هـ).).
إثراء الزخارف والببتيدات في السائل النخاعي بجولتين متتاليتين من اختيار عرض الملتهمة الوظيفية في الجسم الحي.
تم تجميع جميع عاثيات السائل النخاعي المستردة من الجولة الأولى لكل حيوان (الحيوانات # 1.1 و # 1.2) ، وتضخيمها ، وتسلسلها باستخدام HT وإعادة حقنها معًا (2 × 1010 لاقمات / حيوان) 2 SM جرذان مقنية (# 1.1 → #).2.1 و 2.2 و 1.2 → 2.3 و 2.4).(أ ، ب ، هـ ، و) مخططات تشتت الارتباط التي تقارن التردد النسبي للزخارف ثلاثية الببتيد لجميع العاثيات المشتقة من السائل الدماغي النخاعي في جولتي الاختيار الأولى والثانية.التكرار النسبي وتوزيع الأشكال التي تمثل جميع الببتيدات الثلاثية المتداخلة الممكنة الموجودة في الببتيدات في كلا الاتجاهين.يظهر عدد الأشكال الموجودة في 1000 قراءة.يتم تمييز الزخارف التي تم اختيارها أو استبعادها بشكل كبير (p <0.001) في إحدى المكتبات المقارنة بنقاط حمراء.(ج ، د ، ز ، ح) تمثيل شعار التسلسل لجميع سلاسل الأحماض الأمينية الطويلة الغنية بـ 12 CSF بناءً على الجولتين 2 و 1 من الاختيار في الجسم الحي.يشير حجم الرمز المكون من حرف واحد إلى عدد مرات حدوث هذا الحمض الأميني في هذا الموضع.لتمثيل الشعار ، تتم مقارنة تكرار تسلسلات CSF المستخرجة من الحيوانات الفردية بين جولتي اختيار ويتم عرض التسلسلات المخصبة في الجولة الثانية: (ج) # 1.1 - # 2.1 (د) # 1.1 - # 2.2 (ز) # 1.2 - # 2.3 و (ح) # 1.2 - # 2.4.أكثر الأحماض الأمينية تخصيبًا في موضع معين في (ج ، د) الحيوانات لا.2.1 ولا.2.2 أو (ز ، ح) في الحيوانات لا.2.3 ولا.2.4 تظهر بالألوان.أخضر = قطبي ، أرجواني = محايد ، أزرق = قاعدي ، أحمر = حمضي وأسود = أحماض أمينية كارهة للماء.
بعد الجولة الثالثة من الاختيار ، حددنا 124 تسلسلًا فريدًا من الببتيد (# 3.1 و # 3.2) من 332 من استنساخ الملتهمة المعاد تشكيلها CSF المعزولة من حيوانين (الشكل التكميلي 6 أ).تسلسل LGSVS (18.7٪) كان له أعلى نسبة نسبية ، يليه إدراج من النوع البري PAGISRELVDKL (8.2٪) ، MRWFFSHASQGR (3٪) ، DVAKVS (3٪) ، TWLFSLG (2.2٪) ، و SARGSWREIVSLS (2.2٪).في الجولة الرابعة الأخيرة ، قمنا بتجميع فرعين مختارين بشكل مستقل من ثلاثة حيوانات منفصلة (الشكل 1 ج).من بين 925 استنساخ فاج متسلسل تم استرداده من السائل الدماغي النخاعي ، وجدنا في الجولة الرابعة 64 تسلسلًا فريدًا من الببتيد (الشكل التكميلي 6 ب) ، من بينها انخفضت النسبة النسبية للعاثية من النوع البري إلى 0.8 ٪.أكثر استنساخ CSF شيوعًا في الجولة الرابعة كانت LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18٪) ، LGSVS (17٪) ، GFVRFRLSNTR (14٪) ، KVAWRVFSLFWK (7٪) ، SVHGV (5٪) ، GRPQKINGARVC (3.6٪) ، 2 RLSSVC (3.6٪) و 2 RLSSVC.٪)).يرجع مدى طول الببتيدات المحددة إلى عمليات إدخال / حذف النوكليوتيدات أو أكواد الإيقاف المبكرة في بادئات المكتبة عند استخدام الأكواد المتدهورة لتصميم مكتبة NNK.تولد أكواد الإيقاف المبكرة ببتيدات أقصر ويتم اختيارها لأنها تحتوي على فكرة aa المفضلة.قد تنتج الببتيدات الأطول عن عمليات الإدخال / الحذف في بادئات المكتبات التركيبية.هذا يضع كود الإيقاف المصمم خارج الإطار ويقرأه حتى يظهر كودون توقف جديد في اتجاه مجرى النهر.بشكل عام ، قمنا بحساب عوامل الإثراء لجميع جولات الاختيار الأربع من خلال مقارنة بيانات الإدخال مع بيانات إخراج العينة.في الجولة الأولى من الفحص ، استخدمنا عيار الملتهمة من النوع البري كمرجع خلفية غير محدد.ومن المثير للاهتمام ، أن اختيار العاثيات السالبة كان قويًا جدًا في دورة السائل الدماغي الشوكي الأول ، ولكن ليس في الدم (الشكل 3 أ) ، والذي قد يكون بسبب انخفاض احتمال الانتشار السلبي لمعظم أعضاء مكتبة الببتيد في حجرة السائل الدماغي الشوكي أو تميل العاثيات النسبية إلى الاحتفاظ بها أو إزالتها من مجرى الدم بشكل أكثر كفاءة من العاثيات.ومع ذلك ، في الجولة الثانية من التحريك ، لوحظ اختيار قوي للعاثيات في السائل الدماغي النخاعي في كلا الفئتين ، مما يشير إلى أن الجولة السابقة قد تم إثرائها في العاثيات التي تعرض الببتيدات التي تعزز امتصاص السائل الدماغي الشوكي (الشكل 3 أ).مرة أخرى ، بدون تخصيب كبير للدم.أيضًا في الجولتين الثالثة والرابعة ، تم إثراء استنساخ العاثيات بشكل كبير في السائل الدماغي الشوكي.بمقارنة التردد النسبي لكل تسلسل ببتيد فريد بين جولتي الاختيار الأخيرتين ، وجدنا أن التسلسلات كانت أكثر إثراءً في الجولة الرابعة من الاختيار (الشكل 3 ب).تم استخراج ما مجموعه 931 شكل ثلاثي الببتيد من جميع سلاسل الببتيد الفريدة البالغ عددها 64 باستخدام كلا الاتجاهين الببتيد.تم فحص الأشكال الأكثر إثراءً في الجولة الرابعة عن كثب لملفات تخصيبها عبر جميع الجولات مقارنة بالمكتبة المحقونة (القطع: 10٪ إثراء) (الشكل التكميلي 6 ج).أظهرت أنماط الانتقاء العامة أن معظم الدوافع المدروسة تم إثرائها في جميع الجولات السابقة لفرعي الانتخاب.ومع ذلك ، فإن بعض الأشكال (مثل SGL و VSG و LGS GSV) كانت في الغالب من الكليد البديل A ، بينما تم إثراء البعض الآخر (مثل FGW و RTN و WGF و NTR) في الكليد البديل B.
التحقق من صحة نقل السائل الدماغي النخاعي للببتيدات المخصبة بالعاثية المخصبة للسائل الدماغي النخاعي والببتيدات الببتيدات القائمة على البيبتينات المترافقة مع حمولات الستربتافيدين.
(أ) نسب التخصيب المحسوبة في جميع الجولات الأربع (R1-R4) بناءً على التتر المحقون (الإدخال = I) العاثيات (PFU) وتتر الملتهمة CSF المحددة (الإخراج = O).تم حساب عوامل الإثراء للجولات الثلاث الأخيرة (R2-R4) بالمقارنة مع الجولة السابقة والجولة الأولى (R1) مع بيانات الوزن.القضبان المفتوحة عبارة عن سائل دماغي شوكي ، أما القضبان المظللة فهي بلازما.(*** p <0.001 ، بناءً على اختبار الطالب).(ب) قائمة ببتيدات الملتهمة الأكثر وفرة ، مرتبة وفقًا لنسبتها النسبية لجميع العاثيات التي تم جمعها في السائل الدماغي الشوكي بعد الجولة 4 من الاختيار.يتم تمييز استنساخ العاثيات الست الأكثر شيوعًا باللون وترقيمها وعوامل الإثراء الخاصة بها بين الجولتين 3 و 4 من الاختيار (الأشكال الداخلية).(ج ، د) تم تحليل ستة نسخ من الملتهمة الأكثر إثراءً ، ومكتبات العاثيات الفارغة ، ومكتبات الببتيد العاثية الوالدية من الجولة 4 بشكل فردي في نموذج أخذ عينات السائل الدماغي الشوكي.تم جمع عينات السائل النخاعي وعينات الدم في النقاط الزمنية المحددة.(ج) كميات متساوية من 6 مستنسخات فاجية مرشحة (2 × 1010 عاثيات / حيوانات) ، ولاقمات فارغة (# 1779) (2 × 1010 عاثيات / حيوانات) ومكتبات الببتيد الملتهمة (2 × 1012 فاجيات / حيوانات) يتم حقن 3 سم على الأقل للحيوان المقنَّع بشكل منفصل عبر الوريد الذيل.يتم عرض الحرائك الدوائية للسائل الدماغي النخاعي لكل مكتبة استنساخ فج المحقونة ومكتبة ببتيد فج مع مرور الوقت.(د) يوضح متوسط ​​نسبة السائل الدماغي الشوكي / الدم لجميع العاثيات المستعادة / مل خلال وقت أخذ العينات.(هـ) ارتبطت أربعة ببتيدات زعيم اصطناعي وضبط مخلوط واحد بالبيوتين إلى الستربتافيدين من خلال نهايتها N (عرض رباعي الحركة) متبوعة بالحقن (الوريد الذيل الرابع ، 10 مجم ستربتافيدين / كجم).ما لا يقل عن ثلاثة فئران مُنَبَّبة (العدد = 3).).تم جمع عينات CSF في النقاط الزمنية المحددة وتم قياس تركيزات الستربتافيدين بواسطة CSF anti-streptavidin ELISA (nd = غير مكتشف).(* p <0.05 ، ** p <0.01 ، *** p <0.001 ، بناءً على اختبار ANOVA).(و) مقارنة تسلسل الأحماض الأمينية لأكثر استنساخ الببتيد العاثية إثراءًا رقم 2002 (أرجواني) مع استنساخ الببتيد الملتهب الآخر المختار من الجولة الرابعة من الاختيار.يتم ترميز شظايا الأحماض الأمينية المتطابقة والمتشابهة.
من بين جميع العاثيات المخصبة في الجولة الرابعة (الشكل 3 ب) ، تم اختيار ستة نسخ مرشحة لمزيد من التحليل الفردي في نموذج أخذ عينات السائل الدماغي الشوكي.تم حقن كميات متساوية من ستة فاجيات مرشحة ، فجوة فارغة (بدون إدراج) ومكتبات ببتيد بروفاجي في ثلاثة حيوانات CM مُقنية ، وتم تحديد الحرائك الدوائية في فحوصات CSF (الشكل 3 ج) والدم (الشكل التكميلي 7).استهدفت جميع نسخ الملتهمة التي تم اختبارها حجرة السائل الدماغي النخاعي بمستوى أعلى بمقدار 10-1000 مرة من مستوى فجوة التحكم الفارغة (# 1779).على سبيل المثال ، كان للنسختين # 2020 و # 2077 حوالي 1000 مرة من التتر CSF أعلى من فجوة التحكم.تختلف الحرائك الدوائية لكل ببتيد محدد ، لكن جميعها تتمتع بقدرة عالية على توجيه السائل الدماغي النخاعي.لاحظنا انخفاضًا مستمرًا بمرور الوقت في المستنسخات # 1903 و # 2011 ، بينما بالنسبة للنسخ # 2077 و # 2002 و # 2009 قد تشير الزيادة خلال الدقائق العشر الأولى إلى النقل النشط ولكن يلزم التحقق منها.استقرت النسخ # 2020 و # 2002 و # 2077 عند مستويات عالية ، بينما انخفض تركيز السائل الدماغي الشوكي للنسخة # 2009 ببطء بعد الزيادة الأولية.ثم قمنا بمقارنة التردد النسبي لكل مرشح CSF مع تركيز الدم (الشكل ثلاثي الأبعاد).أظهر الارتباط بين متوسط ​​العيار لكل مرشح CSF مع عيار الدم في جميع أوقات أخذ العينات أن ثلاثة من المرشحين الستة تم إثرائهم بشكل كبير في CSF في الدم.ومن المثير للاهتمام أن الاستنساخ # 2077 أظهر استقرارًا أعلى للدم (الشكل التكميلي 7).لتأكيد أن الببتيدات نفسها قادرة على نقل البضائع بشكل فعال بخلاف جزيئات الملتهمة إلى حجرة السائل الدماغي النخاعي ، قمنا بتصنيع أربعة ببتيدات رائدة مشتقة من البيوتين عند الطرف N حيث ترتبط الببتيدات بجسيم الملتهمة.تم ربط الببتيدات المعالجة بالبيوتين (أرقام 2002 و 2009 و 2020 و 2077) مع الستربتافيدين (SA) للحصول على أشكال متعددة القراءات تحاكي إلى حد ما هندسة الملتهمة.سمح لنا هذا التنسيق أيضًا بقياس تعرض SA في الدم والسائل النخاعي كببتيدات بروتينية لنقل البضائع.الأهم من ذلك ، يمكن غالبًا إعادة إنتاج بيانات الملتهمة عند إعطاء الببتيدات الاصطناعية في هذا التنسيق المترافق مع SA (الشكل 3 هـ).كان تعرض الببتيدات المخفوقة أقل تعرضًا أوليًا وتطهير أسرع للسائل الدماغي النخاعي بمستويات لا يمكن اكتشافها في غضون 48 ساعة.لاكتساب نظرة ثاقبة على مسارات تسليم هذه الحيوانات المستنسخة من فج الببتيد في مساحة CSF ، قمنا بتحليل توطين ضربات الببتيد الملتهمة الفردية باستخدام الكيمياء المناعية (IHC) للكشف المباشر عن جزيئات الملتهمة بعد ساعة واحدة من الحقن في الوريد في الجسم الحي.بشكل ملحوظ ، يمكن الكشف عن الحيوانات المستنسخة # 2002 و # 2077 و # 2009 من خلال تلطيخ قوي في الشعيرات الدموية في الدماغ ، بينما لم يتم اكتشاف فجوة التحكم (# 1779) والاستنساخ # 2020 (الشكل التكميلي 8).يشير هذا إلى أن هذه الببتيدات تساهم في التأثير على الدماغ على وجه التحديد من خلال عبور BBB.مطلوب مزيد من التحليل التفصيلي لاختبار هذه الفرضية ، حيث قد يكون مسار BSCFB متضمنًا أيضًا.عند مقارنة تسلسل الأحماض الأمينية للنسخة الأكثر تخصيبًا (# 2002) مع الببتيدات الأخرى المختارة ، لوحظ أن بعضها يحتوي على امتدادات مماثلة للأحماض الأمينية ، والتي قد تشير إلى آلية نقل مماثلة (الشكل 3f).
نظرًا لملفها الفريد للبلازما والزيادة الكبيرة في السائل الدماغي الشوكي مع مرور الوقت ، تم استكشاف استنساخ عرض الملتهمة رقم 2077 بشكل أكبر على مدار فترة أطول من 48 ساعة وتمكنت من إعادة إنتاج الزيادة السريعة في السائل الدماغي الشوكي الملحوظ بالاقتران مع مستويات SA المستمرة (الشكل 4 أ).فيما يتعلق باستنساخ العاثيات الأخرى التي تم تحديدها ، # 2077 ملطخة بشدة لشعيرات الدماغ وأظهرت تلطيخًا كبيرًا مع علامة الشعيرات الدموية عند عرضها بدقة أعلى وربما بعض تلطيخ في الفضاء المتني (الشكل 4 ب).لاستكشاف ما إذا كان يمكن الحصول على تأثيرات دوائية بوساطة الببتيد في الجهاز العصبي المركزي ، أجرينا تجربة تم فيها خلط الإصدارات المعالجة بالبيوتين من 1) الببتيد العابر # 2077 و 2) الببتيد المثبط BACE1 مع SA بنسبتين مختلفتين.بالنسبة لمزيج واحد ، استخدمنا فقط مثبط الببتيد BACE1 وبالنسبة للآخر استخدمنا نسبة 1: 3 من مثبط الببتيد BACE1 إلى # 2077 الببتيد.تم إعطاء كلتا العينتين عن طريق الوريد وتم قياس مستويات الدم والسائل النخاعي من بيتا اميلويد 40 (Abeta40) بمرور الوقت.تم قياس Abeta40 في CSF لأنه يعكس تثبيط BACE1 في حمة الدماغ.كما هو متوقع ، قلل كلا المركبين بشكل كبير من مستويات الدم في Abeta40 (الشكل 4 ج ، د).ومع ذلك ، فقط العينات التي تحتوي على خليط من الببتيد لا.2077 ومثبط الببتيد BACE1 المترافق مع SA تسبب في انخفاض كبير في Abeta40 في السائل النخاعي (الشكل 4 ج).تظهر البيانات أن الببتيد لا.2077 قادر على نقل بروتين 60 كيلو دالتون SA إلى الجهاز العصبي المركزي وأيضًا إحداث تأثيرات دوائية مع مثبطات SA المترافقة لببتيد BACE1.
(أ) الحقن النسيلي (2 × 10 فجوات / حيوان) من الملتهمة T7 التي تظهر ملامح حركية دوائية طويلة المدى لببتيد CSF # 2077 (RLSSVDSDLSGC) وعاثرة تحكم غير محقونة (# 1779) في ثلاثة فئران على الأقل تنبب بالـ CM.(ب) صورة مجهرية متحد البؤر للأوعيه الدقيقة القشرية التمثيلية في الفئران المحقونة بالعاثيات (2 × 10 10 فاجيات / حيوان) تظهر مقاومة الببتيد رقم 2077 والأوعية (يكتين).تم إعطاء هذه الحيوانات المستنسخة للعاثية إلى 3 فئران وتم السماح لها بالانتشار لمدة ساعة قبل التروية.تم تقسيم الأدمغة وتلطيخها بأجسام مضادة متعددة النسيلة تحمل علامة FITC ضد قفيصة الملتهمة T7.قبل عشر دقائق من التروية والتثبيت اللاحق ، تم إعطاء ليكتين المسمى DyLight594 عن طريق الوريد.تظهر الصور الفلورية تلطيخ الليكتين (أحمر) من الجانب اللمعي من الأوعية الدقيقة والعاثيات (الخضراء) في تجويف الشعيرات الدموية وأنسجة المخ المحيطة بالأوعية.يتوافق شريط المقياس مع 10 ميكرومتر.(ج ، د) تم ربط الببتيد المثبط بيوتينلاتيد BACE1 بمفرده أو بالاشتراك مع الببتيد العابر بيوتينيلتيد رقم 2077 بالستربتافيدين متبوعًا بالحقن في الوريد لما لا يقل عن ثلاثة فئران CM مقننة (10 مجم ستربتافيدين / كجم).تم قياس التخفيض بوساطة مثبطات الببتيد BACE1 في Aβ40 بواسطة Aβ1-40 ELISA في الدم (الأحمر) والسائل النخاعي (البرتقالي) في النقاط الزمنية المحددة.لمزيد من الوضوح ، يتم رسم خط منقط على الرسم البياني بمقياس 100٪.(ج) انخفاض النسبة المئوية في Aβ40 في الدم (مثلثات حمراء) والسائل النخاعي (مثلثات برتقالية) في الفئران المعالجة بالستربتافيدين المقترن بالببتيد العابر # 2077 والببتيد المثبط BACE1 بنسبة 3: 1.(د) انخفاض النسبة المئوية في الدم Aβ40 (الدوائر الحمراء) والسائل النخاعي (الدوائر البرتقالية) للفئران المعالجة بالستربتافيدين إلى جانب الببتيد المثبط لـ BACE1 فقط.كان تركيز Aβ في التحكم 420 بيكوغرام / مل (الانحراف المعياري = 101 بيكوغرام / مل).
تم تطبيق عرض Phage بنجاح في العديد من مجالات البحوث الطبية الحيوية 17.تم استخدام هذه الطريقة في دراسات التنوع الوعائي في الجسم الحي وكذلك الدراسات التي تستهدف الأوعية الدماغية.في هذه الدراسة ، قمنا بتوسيع تطبيق طريقة الاختيار هذه ليس فقط للتعرف المباشر على الببتيدات التي تستهدف الأوعية الدماغية ، ولكن أيضًا لاكتشاف المرشحين الذين يتمتعون بخصائص نقل نشطة لعبور الحاجز الدموي الدماغي.نحن الآن نصف تطوير إجراء اختيار في الجسم الحي في الفئران المنبثقة CM وإظهار قدرتها على تحديد الببتيدات بخصائص توجيه CSF.باستخدام الملتهمة T7 التي تعرض مكتبة من 12 ميكرون من الببتيدات العشوائية ، تمكنا من إثبات أن فجوة T7 صغيرة بما يكفي (قطرها حوالي 60 نانومتر) 10 لتتكيف مع الحاجز الدموي الدماغي ، وبالتالي تعبر مباشرة حاجز الدم في الدماغ أو الضفيرة المشيمية.لاحظنا أن حصاد السائل الدماغي النخاعي من فئران CM المُقنية كان طريقة فحص وظيفية خاضعة للتحكم جيدًا في الجسم الحي ، وأن العاثية المستخرجة لا ترتبط فقط بالأوعية الدموية ولكنها تعمل أيضًا كناقل عبر الحاجز الدموي الدماغي.علاوة على ذلك ، من خلال جمع الدم في وقت واحد وتطبيق HTS على السائل الدماغي النخاعي والعاثيات المشتقة من الدم ، أكدنا أن اختيارنا للسائل النخاعي لم يتأثر بإثراء الدم أو ملاءمته للتوسع بين جولات الاختيار.ومع ذلك ، فإن حجرة الدم هي جزء من إجراء الاختيار ، حيث يجب أن تعيش العاثيات القادرة على الوصول إلى حجرة السائل الدماغي النخاعي وتدور في مجرى الدم لفترة كافية لإثراء نفسها في الدماغ.من أجل استخراج معلومات التسلسل الموثوقة من بيانات HTS الخام ، قمنا بتنفيذ عوامل تصفية تتكيف مع أخطاء التسلسل الخاصة بالمنصة في سير عمل التحليل.من خلال دمج المعلمات الحركية في طريقة الفحص ، أكدنا الحرائك الدوائية السريعة لعاثيات T7 من النوع البري (t½ ~ 28 دقيقة) في الدم ، وكذلك حددنا نصف عمرها في السائل النخاعي (t½ ~ 26 دقيقة) في الدقيقة).على الرغم من خصائص الحرائك الدوائية المتشابهة في الدم والسائل الدماغي النخاعي ، يمكن اكتشاف 0.001٪ فقط من تركيز العاثية في الدم في السائل الدماغي النخاعي ، مما يشير إلى انخفاض الحركة الخلفية للعاثية من النوع T7 البرية عبر الحاجز الدموي الدماغي.يسلط هذا العمل الضوء على أهمية الجولة الأولى من الاختيار عند استخدام استراتيجيات التحريك في الجسم الحي ، خاصة بالنسبة لأنظمة الملتهمة التي يتم تطهيرها بسرعة من الدورة الدموية ، حيث يمكن لعدد قليل من الحيوانات المستنسخة الوصول إلى حجرة الجهاز العصبي المركزي.وهكذا ، في الجولة الأولى ، كان الانخفاض في تنوع المكتبات كبيرًا جدًا ، حيث تم جمع عدد محدود فقط من الحيوانات المستنسخة في نهاية المطاف في نموذج CSF الصارم للغاية.تضمنت استراتيجية الغسل في الجسم الحي عدة خطوات اختيار مثل التراكم النشط في حجرة السائل الدماغي الشوكي ، وبقاء الاستنساخ في حجرة الدم ، والإزالة السريعة لاستنساخ الملتهمة T7 من الدم خلال الدقائق العشر الأولى (الشكل 1 د والشكل التكميلي 4 م).).وهكذا ، بعد الجولة الأولى ، تم تحديد نسخ مختلفة من الملتهمة في السائل الدماغي النخاعي ، على الرغم من استخدام نفس المجموعة الأولية للحيوانات الفردية.يشير هذا إلى أن خطوات الاختيار المتعددة الصارمة لمكتبات المصدر التي تضم أعدادًا كبيرة من أعضاء المكتبات تؤدي إلى انخفاض كبير في التنوع.لذلك ، ستصبح الأحداث العشوائية جزءًا لا يتجزأ من عملية الاختيار الأولية ، مما يؤثر بشكل كبير على النتيجة.من المحتمل أن العديد من الحيوانات المستنسخة في المكتبة الأصلية كان لها ميل مماثل لإثراء السائل الدماغي الشوكي.ومع ذلك ، حتى في ظل نفس الظروف التجريبية ، قد تختلف نتائج الاختيار بسبب العدد الصغير لكل نسخة معينة في المجموعة الأولية.
تختلف الأشكال المخصبة في السائل الدماغي النخاعي عن تلك الموجودة في الدم.ومن المثير للاهتمام ، أننا لاحظنا التحول الأول نحو الببتيدات الغنية بالجليسين في دم الحيوانات الفردية.(الشكل 1 ز ، الأشكال التكميلية. 4 هـ ، 4 و).قد تكون العاثيات المحتوية على ببتيدات الجلايسين أكثر استقرارًا وأقل عرضة للخروج من الدورة الدموية.ومع ذلك ، لم يتم اكتشاف هذه الببتيدات الغنية بالجليسين في عينات السائل النخاعي ، مما يشير إلى أن المكتبات المنسقة خضعت لخطوتين اختيار مختلفتين: واحدة في الدم والأخرى يسمح لها بالتراكم في السائل النخاعي.تم اختبار الحيوانات المستنسخة المخصبة CSF الناتجة عن الجولة الرابعة من الاختيار على نطاق واسع.تم تأكيد ما يقرب من جميع الحيوانات المستنسخة التي تم اختبارها بشكل فردي لتخصيبها في السائل الدماغي الشوكي مقارنة بالعاثية الفارغة.تم فحص ضربة ببتيد واحدة (# 2077) بمزيد من التفصيل.لقد أظهر عمرًا نصفيًا أطول للبلازما مقارنةً بالضربات الأخرى (الشكل ثلاثي الأبعاد والشكل التكميلي 7) ، ومن المثير للاهتمام أن هذا الببتيد يحتوي على بقايا سيستين في الطرف C.لقد ثبت مؤخرًا أن إضافة السيستين إلى الببتيدات يمكن أن يحسن خصائص الحرائك الدوائية من خلال الارتباط بالألبومين 29.هذا غير معروف حاليًا للببتيد # 2077 ويتطلب مزيدًا من الدراسة.أظهرت بعض الببتيدات اعتماد التكافؤ في تخصيب السائل الدماغي الشوكي (البيانات غير معروضة) ، والتي قد تكون مرتبطة بهندسة السطح المعروضة لقفيصة T7.أظهر نظام T7 الذي استخدمناه 5-15 نسخة من كل ببتيد لكل جسيم فج.تم إجراء IHC على استنساخ ملتهمة الرصاص المرشحة التي تم حقنها عن طريق الوريد في القشرة الدماغية للفئران (الشكل التكميلي 8).أظهرت البيانات أن ثلاثة مستنسخات على الأقل (رقم 2002 ورقم 2009 ورقم 2077) تفاعلت مع BBB.يبقى أن نحدد ما إذا كان تفاعل BBB ينتج عنه تراكم CSF أو حركة هذه الحيوانات المستنسخة مباشرة إلى BCSFB.الأهم من ذلك ، نظهر أن الببتيدات المختارة تحتفظ بقدرة نقل CSF الخاصة بها عند تصنيعها وربطها بشحنة البروتين.يكرر ربط الببتيدات N- الطرفية بيوتينيلاتيد إلى SA النتائج التي تم الحصول عليها باستنساخ العاثيات الخاصة بكل منها في الدم والسائل النخاعي (الشكل 3 هـ).أخيرًا ، نظهر أن ببتيد الرصاص # 2077 قادر على تعزيز عمل الدماغ لمثبط الببتيد الحيوي من BACE1 المترافق مع SA ، مما يتسبب في تأثيرات ديناميكية دوائية واضحة في الجهاز العصبي المركزي عن طريق تقليل مستويات Abeta40 في CSF (الشكل 4).لم نتمكن من تحديد أي متماثلات في قاعدة البيانات عن طريق إجراء بحث متماثل تسلسل الببتيد لجميع الزيارات.من المهم أن نلاحظ أن حجم مكتبة T7 هو 109 تقريبًا ، في حين أن حجم المكتبة النظري لـ 12 mers هو 4 × 1015. لذلك ، اخترنا جزءًا صغيرًا فقط من مساحة التنوع في مكتبة الببتيد 12 مير ، مما قد يعني أنه يمكن تحديد المزيد من الببتيدات المحسّنة من خلال تقييم مساحة التسلسل المجاورة لهذه الزيارات المحددة.افتراضيًا ، قد يكون أحد أسباب عدم العثور على أي متماثلات طبيعية لهذه الببتيدات هو إلغاء الاختيار أثناء التطور لمنع الدخول غير المنضبط لبعض أشكال الببتيد إلى الدماغ.
مجتمعة ، توفر نتائجنا أساسًا للعمل المستقبلي لتحديد وتوصيف أنظمة النقل للحاجز الوعائي الدماغي في الجسم الحي بمزيد من التفصيل.يعتمد الإعداد الأساسي لهذه الطريقة على استراتيجية اختيار وظيفية لا تحدد الحيوانات المستنسخة ذات خصائص الارتباط الوعائي الدماغي فحسب ، بل تتضمن أيضًا خطوة حاسمة يكون فيها للنسخ الناجحة نشاطًا جوهريًا لعبور الحواجز البيولوجية في الجسم الحي إلى حجرة الجهاز العصبي المركزي.هو توضيح آلية نقل هذه الببتيدات وتفضيلها للارتباط بالأوعية الدموية الدقيقة الخاصة بمنطقة الدماغ.قد يؤدي هذا إلى اكتشاف مسارات جديدة لنقل BBB والمستقبلات.نتوقع أن الببتيدات التي تم تحديدها يمكن أن ترتبط مباشرة بمستقبلات الأوعية الدموية الدماغية أو الروابط المتداولة المنقولة عبر BBB أو BCSFB.سيتم إجراء مزيد من التحقيق في نواقل الببتيد مع نشاط نقل السائل الدماغي النخاعي المكتشفة في هذا العمل.نحن نحقق حاليًا في خصوصية الدماغ لهذه الببتيدات لقدرتها على عبور BBB و / أو BCSFB.ستكون هذه الببتيدات الجديدة أدوات قيمة للغاية لاكتشاف محتمل لمستقبلات أو مسارات جديدة ولتطوير منصات جديدة عالية الكفاءة لتوصيل الجزيئات الكبيرة ، مثل البيولوجيا ، إلى الدماغ.
يقني ؛ يدخل القنية الصهريج الكبير (CM) باستخدام تعديل للطريقة الموصوفة سابقًا.تم وضع فئران Wistar المخدرة (200-350 جم) على جهاز التوضيع التجسيمي وتم إجراء شق متوسط ​​على فروة الرأس المحلوقة والمعقمة لتعقيم الجمجمة.حفر فتحتين في منطقة الوشاح العلوي وربط مسامير التثبيت في الثقوب.تم حفر ثقب إضافي في القمة القذالية الجانبية للتوجيه التجسيمي لقنية الفولاذ المقاوم للصدأ في CM.ضع الأسمنت السني حول القنية وثبته بمسامير.بعد المعالجة الضوئية وتصلب الأسمنت ، تم إغلاق الجرح الجلدي بخياطة 4/0 فائقة.يتم تأكيد الوضع المناسب للقنية عن طريق التسرب التلقائي للسائل النخاعي (CSF).قم بإزالة الجرذ من جهاز التوضيع التجسيمي ، وتلقي الرعاية المناسبة بعد الجراحة وإدارة الألم ، والسماح له بالتعافي لمدة أسبوع على الأقل حتى يتم ملاحظة علامات الدم في السائل النخاعي.تم الحصول على فئران ويستار (Crl: WI / Han) من نهر تشارلز (فرنسا).تم الاحتفاظ بجميع الفئران في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض.تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل المكتب البيطري لمدينة بازل ، سويسرا ، وتم إجراؤها وفقًا لترخيص الحيوان رقم 2474 (تقييم نقل الدماغ النشط عن طريق قياس مستويات المرشحين العلاجيين في السائل النخاعي ودماغ الجرذ).
إبقاء الفئران واعية بلطف مع قنية CM في متناول اليد.قم بإزالة الداتورة من القنية وجمع 10 ميكرولتر من السائل الدماغي الشوكي المتدفق تلقائيًا.نظرًا لأن سالكية القنية تم اختراقها في النهاية ، تم تضمين عينات السائل النخاعي الصافية فقط مع عدم وجود دليل على تلوث الدم أو تغير اللون في هذه الدراسة.في موازاة ذلك ، تم أخذ ما يقرب من 10-20 ميكرولتر من الدم من شق صغير في طرف الذيل إلى أنابيب مع الهيبارين (Sigma-Aldrich).تم جمع السائل النخاعي والدم في نقاط زمنية مختلفة بعد الحقن في الوريد من ملتهمة T7.تم التخلص من حوالي 5-10 ميكرولتر من السائل قبل جمع كل عينة من السائل الدماغي النخاعي ، وهو ما يتوافق مع الحجم الميت للقسطرة.
تم إنشاء المكتبات باستخدام ناقل T7Select 10-3b كما هو موضح في دليل نظام T7Select (Novagen، Rosenberg et al.، InNovations 6، 1-6، 1996).باختصار ، تم تصنيع إدراج عشوائي من الحمض النووي 12 مير بالتنسيق التالي:
تم استخدام كودون NNK لتجنب أكواد الإيقاف المزدوج والإفراط في التعبير عن الأحماض الأمينية في الملحق.N هي نسبة متساوية المولي مختلطة يدويًا لكل نيوكليوتيد ، و K هي نسبة متساوية المولي مختلطة يدويًا من نيوكليوتيدات الأدينين والسيتوزين.تم تحويل المناطق المنفردة التي تقطعت بهم السبل إلى DNA مزدوج تقطعت بهم السبل عن طريق مزيد من الحضانة باستخدام dNTP (Novagen) وإنزيم Klenow (New England Biolabs) في منطقة Klenow العازلة (New England Biolabs) لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية.بعد التفاعل ، تمت استعادة DNA مزدوج الشريطة بواسطة ترسيب EtOH.تم هضم الحمض النووي الناتج باستخدام إنزيمات التقييد EcoRI و HindIII (كلاهما من Roche).تم بعد ذلك ربط إدراج (QIAquick ، ​​Qiagen) المشقوق والمنقى (T4 ligase ، New England Biolabs) في الإطار في ناقل T7 مشقوق مسبقًا بعد الحمض الأميني 348 من جين 10B كابسيد.تم تحضين تفاعلات الربط عند 16 درجة مئوية لمدة 18 ساعة قبل التعبئة في المختبر.تم إجراء عبوة Phage في المختبر وفقًا للتعليمات المرفقة مع مجموعة استنساخ T7Select 10-3b (Novagen) وتم تضخيم محلول التغليف مرة واحدة للتحلل باستخدام Escherichia coli (BLT5615 ، Novagen).تم طرد المحللات ومعايرتها وتجميدها عند -80 درجة مئوية كمحلول مخزون من الجلسرين.
تضخيم PCR المباشر للمناطق المتغيرة للعاثية تضخيمه في مرق أو صفيحة باستخدام مواد أولية اندماج 454 / Roche-amplicon.يحتوي التمهيدي الانصهار الأمامي على متواليات تحيط بالمنطقة المتغيرة (NNK) 12 (خاص بالقالب) ، ومحول التيتانيوم GS FLX A ، وتسلسل مفاتيح مكتبة من أربع قواعد (TCAG) (الشكل التكميلي 1 أ):
يحتوي التمهيدي الانصهار العكسي أيضًا على البيوتين المتصل بخرز الالتقاط ومحول GS FLX Titanium B المطلوب للتضخيم النسيلي أثناء مستحلب PCR:
ثم تم تعريض الأمبليكون إلى 454 / Roche pyrosequencing وفقًا لبروتوكول 454 GS-FLX Titanium.لتسلسل Sanger اليدوي (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) ، تم تضخيم T7 phage DNA بواسطة PCR وتسلسلها باستخدام أزواج التمهيدي التالية:
تم تعريض المدخلات من اللوحات الفردية لتضخيم PCR باستخدام مجموعة Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة).قم بإجراء بداية ساخنة (10 دقائق عند 95 درجة مئوية) و 35 دورة تعزيز (50 ثانية عند 95 درجة مئوية ، ودقيقة واحدة عند 50 درجة مئوية ، ودقيقة واحدة عند 72 درجة مئوية).
تم تضخيم Phage من المكتبات ، والعاثية من النوع البري ، والعاثية التي تم إنقاذها من CSF والدم ، أو المستنسخات الفردية في Escherichia coli BL5615 في مرق السل (Sigma Aldrich) أو في أطباق 500 سم 2 (Thermo Scientific) لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.تم استخراج Phage من الألواح عن طريق شطف الألواح باستخدام محلول Tris-EDTA (Fluka Analytical) أو عن طريق جمع اللويحات بنصائح ماصة معقمة.تم عزل Phage من المستنبت الطافي أو المخزن المؤقت للاستخراج بجولة واحدة من ترسيب البولي إيثيلين جلايكول (PEG 8000) (Promega) وأعيد تعليقه في محلول Tris-EDTA.
تعرضت البكتيريا المضخمة إلى 2-3 جولات من إزالة السموم الداخلية باستخدام خرز إزالة السموم الداخلية (Miltenyi Biotec) قبل الحقن في الوريد (IV) (500 ميكرولتر / حيوان).في الجولة الأولى ، تم إدخال لاقمات 2 × 1012 ؛في الثانية ، 2 × 1010 لاقمات ؛في جولات الاختيار الثالثة والرابعة ، 2 × 109 لاقمات لكل حيوان.تم تحديد محتوى الملتهمة في السائل الدماغي النخاعي وعينات الدم التي تم جمعها في النقاط الزمنية المحددة من خلال حساب البلاك وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة (دليل نظام T7Select).تم إجراء اختيار الملتهمة عن طريق الحقن في الوريد للمكتبات المنقاة في وريد الذيل أو عن طريق إعادة حقن الملتهمة المستخرجة من السائل الدماغي الشوكي من جولة الاختيار السابقة ، وتم إجراء الحصاد اللاحق في 10 دقائق و 30 دقيقة و 60 دقيقة و 90 دقيقة و 120 دقيقة و 180 دقيقة و 240 دقيقة على التوالي من السائل الدماغي النخاعي وعينات الدم.تم إجراء ما مجموعه أربع جولات من الغسل في الجسم الحي حيث تم تخزين الفرعين المختارين بشكل منفصل وتحليلهما خلال جولات الاختيار الثلاث الأولى.خضعت جميع إدخالات الملتهمة المستخرجة من CSF من أول جولتين من الاختيار إلى 454 / Roche pyrosequencing ، بينما تم تسلسل جميع الحيوانات المستنسخة من CSF من جولتي الاختيار الأخيرتين يدويًا.كما تم إخضاع جميع لاقمات الدم من الجولة الأولى للاختيار لـ 454 / Roche pyrosequencing.لحقن استنساخ الملتهمة ، تم تضخيم العاثيات المختارة في E. coli (BL5615) على ألواح بحجم 500 سم عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.تم نشر الحيوانات المستنسخة المختارة بشكل فردي والمتسلسلة يدويًا في وسط السل.بعد استخراج الملتهمة وتنقية وإزالة الذيفان الداخلي (كما هو موصوف أعلاه) ، تم حقن 2 × 1010 لاقمات / حيوان في 300 ميكرولتر عن طريق الوريد في وريد ذيل واحد.
المعالجة المسبقة والتصفية النوعية لبيانات التسلسل.تم تحويل بيانات Raw 454 / Roche من تنسيق خريطة التدفق القياسي الثنائي (sff) إلى تنسيق Pearson القابل للقراءة البشرية (fasta) باستخدام برنامج البائع.تم إجراء مزيد من المعالجة لتسلسل النوكليوتيدات باستخدام البرامج والبرامج النصية الخاصة بـ C (حزمة البرامج التي لم يتم إصدارها) كما هو موضح أدناه.يتضمن تحليل البيانات الأولية إجراءات تصفية صارمة متعددة المراحل.لتصفية القراءات التي لا تحتوي على تسلسل DNA صالح لإدراج 12mer ، تمت محاذاة القراءات بالتسلسل لبدء التسمية (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT) ، وإيقاف التسمية (TAAGCTTGCGCCGCACTCGAGTA) وإدخال الخلفية (CCCTGCAGGGATATCCCGGAGCTCGTC NeedGAC- اختبار عالمي.تسمح المحاذاة بحد أقصى 2 من حالات عدم الاتساق لكل محاذاة 31.لذلك ، تمت إزالة علامات القراءة بدون علامات البدء والإيقاف والقراءات التي تحتوي على إدخالات الخلفية ، أي المحاذاة التي تتجاوز العدد المسموح به من حالات عدم التطابق ، من المكتبة.بالنسبة للقراءات المتبقية ، فإن تسلسل N-mer DNA الممتد من علامة البداية وينتهي قبل إزالة علامة التوقف من تسلسل القراءة الأصلي ومعالجته (يشار إليه فيما بعد باسم "إدراج").بعد ترجمة الإدخال ، تتم إزالة الجزء الموجود بعد كود الإيقاف الأول في نهاية 5 من التمهيدي من الإدخال.بالإضافة إلى ذلك ، تم أيضًا إزالة النيوكليوتيدات التي تؤدي إلى أكواد غير مكتملة في نهاية 3 من التمهيدي.لاستبعاد الإدخالات التي تحتوي على تسلسلات الخلفية فقط ، تمت أيضًا إزالة الإدخالات المترجمة التي تبدأ بنمط الأحماض الأمينية "PAG".تمت إزالة الببتيدات التي يبلغ طولها بعد الترجمة أقل من 3 أحماض أمينية من المكتبة.أخيرًا ، قم بإزالة التكرار في مجموعة الإدراج وحدد تكرار كل إدخال فريد.تضمنت نتائج هذا التحليل قائمة متواليات النوكليوتيدات (إدراج) وتردداتها (قراءة) (الشكلان التكميليان 1 ج و 2).
تُدرج مجموعة N-mer DNA حسب التشابه التسلسلي: للقضاء على أخطاء التسلسل الخاصة بـ 454 / Roche (مثل مشاكل تسلسل ملحقات البوليمر المتجانس) وإزالة التكرار الأقل أهمية ، يتم فرز تسلسل N-mer DNA الذي تمت تصفيته مسبقًا (إدراجات) حسب التشابه.عمليات الإدراج (يُسمح بما يصل إلى قاعدتين غير متطابقتين) باستخدام خوارزمية تكرارية محددة على النحو التالي: يتم فرز الإدخالات أولاً حسب تواترها (من الأعلى إلى الأدنى) ، وإذا كانت متشابهة ، حسب الترتيب الثانوي حسب الطول (من الأطول إلى الأقصر)).وبالتالي ، فإن عمليات الإدراج الأكثر تكرارًا والأطول تحدد "المجموعة" الأولى.يتم ضبط تردد المجموعة على تردد المفتاح.بعد ذلك ، تمت محاولة إضافة كل إدخال متبقي في القائمة التي تم فرزها إلى المجموعة عن طريق محاذاة Needleman-Wunsch الزوجية.إذا كان عدد حالات عدم التطابق أو الإدخالات أو عمليات الحذف في المحاذاة لا يتجاوز عتبة 2 ، تتم إضافة إدراج إلى المجموعة ، ويزداد تكرار المجموعة الإجمالي بعدد مرات إضافة الإدراج.يتم تمييز الإدخالات المضافة إلى مجموعة على أنها مستخدمة ومستثناة من المعالجة الإضافية.إذا تعذر إضافة تسلسل الإدراج إلى مجموعة موجودة بالفعل ، فسيتم استخدام تسلسل الإدراج لإنشاء مجموعة جديدة بتردد الإدخال المناسب وتمييزها على أنها مستخدمة.ينتهي التكرار عندما يتم استخدام كل تسلسل إدراج لتشكيل مجموعة جديدة أو يمكن تضمينه في مجموعة موجودة بالفعل.بعد كل شيء ، يتم في النهاية ترجمة الإدخالات المجمعة المكونة من النيوكليوتيدات إلى متواليات الببتيد (مكتبات الببتيد).نتيجة هذا التحليل هي مجموعة من الإدخالات والترددات المقابلة لها والتي تشكل عدد القراءات المتتالية (الشكل التكميلي 2).
توليد الحافز: بناءً على قائمة الببتيدات الفريدة ، تم إنشاء مكتبة تحتوي على جميع أنماط الأحماض الأمينية الممكنة (aa) كما هو موضح أدناه.تم استخلاص كل نمط محتمل بطول 3 من الببتيد وأضيف نمطه العكسي مع مكتبة نماذج مشتركة تحتوي على جميع الأنماط (الببتيدات الثلاثية).تم ترتيب مكتبات الزخارف المتكررة للغاية وإزالة التكرار.بعد ذلك ، بالنسبة لكل ثلاثي ببتيد في مكتبة النماذج ، تحققنا من وجوده في المكتبة باستخدام أدوات حسابية.في هذه الحالة ، يتم إضافة تردد الببتيد المحتوي على ثلاثي الببتيد الذي تم العثور عليه وتخصيصه إلى الشكل الموجود في مكتبة النماذج ("عدد الأشكال").نتيجة توليد الحافز عبارة عن مصفوفة ثنائية الأبعاد تحتوي على جميع تكرارات ثلاثية الببتيدات (الزخارف) والقيم الخاصة بكل منها ، وهي عدد قراءات التسلسل التي تؤدي إلى الشكل المقابل عند تصفية القراءات وتجميعها وترجمتها.المقاييس كما هو موضح بالتفصيل أعلاه.
تطبيع عدد الأشكال والمخططات المبعثرة المقابلة: تم تطبيع عدد الأشكال لكل عينة باستخدام
حيث ni هو عدد القراءات التي تحتوي على الموضوع i.وهكذا ، يمثل vi النسبة المئوية لتكرار القراءات (أو الببتيدات) التي تحتوي على الفكرة i في العينة.تم حساب قيم P لعدد الأشكال غير الطبيعية باستخدام اختبار فيشر الدقيق.فيما يتعلق بالترابطات الخاصة بعدد الدوافع ، تم حساب ارتباطات سبيرمان باستخدام العدد الطبيعي للدوافع مع R.
لتصور محتوى الأحماض الأمينية في كل موضع في مكتبة الببتيد ، تم إنشاء مخططات الويب 32 ، 33 (http://weblogo.threeplusone.com).أولاً ، يتم تخزين محتوى الأحماض الأمينية في كل موضع من الببتيد 12 مير في مصفوفة 20 × 12.بعد ذلك ، يتم إنشاء مجموعة من 1000 ببتيدات تحتوي على نفس محتوى الأحماض الأمينية النسبية في كل موضع بتنسيق Fasta-Sequence ويتم توفيرها كمدخلات لشعار الويب 3 ، مما يولد تمثيلًا رسوميًا لمحتوى الأحماض الأمينية النسبية في كل موضع.لمكتبة ببتيد معينة.لتصور مجموعات البيانات متعددة الأبعاد ، تم إنشاء خرائط الحرارة باستخدام أداة مطورة داخليًا في R (biosHeatmap ، حزمة R لم يتم إصدارها بعد).تم حساب مخططات الشجرة المعروضة في الخرائط الحرارية باستخدام طريقة التجميع الهرمي لـ Ward مع مقياس المسافة الإقليدية.من أجل التحليل الإحصائي لبيانات تسجيل الحافز ، تم حساب قيم P للتسجيل غير الطبيعي باستخدام اختبار فيشر الدقيق.تم حساب قيم P لمجموعات البيانات الأخرى في R باستخدام اختبار الطالب أو ANOVA.
تم حقن استنساخ الملتهمة والعاثيات المختارة بدون إدخالات عن طريق الوريد عبر وريد الذيل (2 × 1010 لاقمات / حيوان في 300 ميكرولتر PBS).قبل عشر دقائق من التروية والتثبيت اللاحق ، تم حقن نفس الحيوانات عن طريق الوريد بـ 100 ميكرولتر من ليكتين المسمى DyLight594 (Vector Laboratories Inc. ، DL-1177).بعد 60 دقيقة من حقن الملتهمة ، تم ترطيب الفئران من خلال القلب بـ 50 مل من برنامج تلفزيوني يليه 50 مل 4٪ PFA / PBS.تم إصلاح عينات الدماغ بالإضافة إلى ذلك بين عشية وضحاها في 4 ٪ PFA / PBS ونقع في سكروز 30 ٪ بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.يتم تجميد العينات في خليط OCT.تم إجراء تحليل كيميائي مناعي للعينات المجمدة في درجة حرارة الغرفة على 30 ميكرون تجميد محجوب بنسبة 1 ٪ من مساحة سطح الجسم وحضنت بأجسام مضادة متعددة النسيلة تحمل علامة FITC ضد T7 فج (Novus NB 600-376A) عند 4 درجات مئوية.احتضان بين عشية وضحاها.أخيرًا ، تم غسل المقاطع 3 مرات باستخدام PBS وفحصها باستخدام مجهر ليزر متحد البؤر (Leica TCS SP5).
تم تصنيع جميع الببتيدات مع حد أدنى من النقاوة 98 ٪ بواسطة GenScript USA ، وتم تخليقها بالبيوتين وتجفيفها بالتجميد.يرتبط البيوتين عبر فاصل جليكاين ثلاثي إضافي عند الطرف N.تحقق من جميع الببتيدات باستخدام مطياف الكتلة.
تم خلط Streptavidin (Sigma S0677) مع فائض متساوي 5 أضعاف من الببتيد الحيوي ، الببتيد المثبط بيوتينيل BACE1 ، أو مزيج (نسبة 3: 1) من الببتيد المثبط بيوتينيل BACE1 والببتيد المثبط BACE1 في 5-10 ٪ من DMSO / المحتضن.1 ساعة في درجة حرارة الغرفة قبل الحقن.تم حقن الببتيدات المقترنة بالستربتافيدين عن طريق الوريد بجرعة 10 مجم / كجم في أحد عروق الذيل للفئران ذات التجويف الدماغي.
تم تقييم تركيز مجمعات الستربتافيدين الببتيد بواسطة ELISA.تم طلاء لوحات Nunc Maxisorp microtiter (Sigma) طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع 1.5 ميكروغرام / مل من الجسم المضاد للفأر المضاد للستربتافيدين (Thermo ، MA1-20011).بعد الحجب (منع المخزن المؤقت: 140 نانومتر كلوريد الصوديوم ، 5 مم EDTA ، 0.05٪ NP40 ، 0.25٪ الجيلاتين ، 1٪ BSA) عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ، اغسل اللوحة باستخدام 0.05٪ Tween-20 / PBS (محلول الغسيل) لمدة 3 ثوانٍ ، تمت إضافة عينات السائل الدماغي الشوكي وعينات البلازما إلى الآبار المخففة بمحلول مانع للتسرب (البلازما 1: 115) ، CSF.تم تحضين اللوح طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الكشف عن الأجسام المضادة (1 ميكروغرام / مل ، مضاد الستربتافيدين- HRP ، نوفوس NB120-7239).بعد ثلاث خطوات للغسيل ، تم اكتشاف الستربتافيدين عن طريق الحضانة في محلول الركيزة TMB (Roche) لمدة تصل إلى 20 دقيقة.بعد إيقاف تطور اللون باستخدام 1M H2SO4 ، قم بقياس الامتصاصية عند 450 نانومتر.
تم تقييم وظيفة مركب مثبط الستربتافيدين - الببتيد - BACE1 بواسطة Aβ (1-40) ELISA وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة (Wako ، 294-64701).باختصار ، تم تخفيف عينات السائل الدماغي الشوكي في مادة مخففة قياسية (1:23) واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية في 96 طبقًا جيدًا مغلفة بجسم مضاد لالتقاط BNT77.بعد خمس خطوات للغسيل ، تمت إضافة الجسم المضاد BA27 المترافق مع HRP واحتضانه لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية ، متبوعة بخمس خطوات للغسيل.تم الكشف عن Aβ (1–40) عن طريق الحضانة في محلول TMB لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة.بعد توقف تطور اللون بمحلول التوقف ، قم بقياس الامتصاصية عند 450 نانومتر.تم إخضاع عينات البلازما لاستخلاص الطور الصلب قبل Aβ (1-40) ELISA.تمت إضافة البلازما إلى 0.2٪ DEA (Sigma) في 96 طبقًا جيدًا وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.بعد غسل ألواح SPE على التوالي (Oasis ، 186000679) بالماء و 100٪ ميثانول ، تمت إضافة عينات البلازما إلى ألواح SPE وتمت إزالة كل السوائل.تم غسل العينات (أولاً باستخدام 5٪ ميثانول ثم 30٪ ميثانول) وتمت التصفية التتابعية باستخدام 2٪ NH4OH / 90٪ ميثانول.بعد تجفيف الشطف عند 55 درجة مئوية لمدة 99 دقيقة عند تيار N2 ثابت ، تم تقليل العينات في مواد مخففة قياسية وتم قياس Aβ (1-40) كما هو موصوف أعلاه.
كيفية الاستشهاد بهذا المقال: Urich، E. et al.تسليم البضائع إلى الدماغ باستخدام الببتيدات العابرة المحددة في الجسم الحي.العلم.5 ، 14104 ؛دوى: 10.1038 / srep14104 (2015).
Likhota J. و Skjorringe T. و Thomsen LB و Moos T. توصيل الأدوية الجزيئية إلى الدماغ باستخدام العلاج الموجه.مجلة الكيمياء العصبية 113، 1-13، 10.1111 / j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic، I.، Steinbusch، HW، Schmitz، C.، and Martinez-Martinez، P. إيصال الأدوية الببتيدية والبروتينية عبر الحاجز الدموي الدماغي.Prog Neurobiol 87، 212-251، 10.1016 / j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge ، WM الحاجز الدموي الدماغي: عنق الزجاجة في تطوير عقار الدماغ.NeuroRx 2، 3–14، 10.1602 / نيوروركس 2.1.3 (2005).
Johanson، KE، Duncan، JA، Stopa، EG، and Byrd، A. احتمالات تحسين توصيل الدواء واستهداف الدماغ عبر مسار الضفيرة المشيمية-CSF.البحوث الصيدلانية 22 ، 1011-1037 ، 10.1007 / s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge ، WM تحديث المستحضرات الصيدلانية الحيوية باستخدام أحصنة طروادة الجزيئية لتوصيل الدماغ.Bioconjug Chem 19 ، 1327-1338 ، 10.1021 / bc800148t (2008).
Pardridge ، نقل الببتيد بوساطة مستقبلات WM عبر الحاجز الدموي الدماغي.Endocr Rev.7 ، 314-330 (1986).
Niewoehner ، J. et al.زيادة اختراق الدماغ وفعالية الأجسام المضادة العلاجية باستخدام المكوكات الجزيئية أحادية التكافؤ.Neuron 81، 49-60، 10.1016 / j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee، N. et al.يحدد نقل مستقبلات الترانسفيرين (TfR) امتصاص الدماغ لمتغيرات تقارب الأجسام المضادة لـ TfR.J Exp Med 211، 233–244، 10.1084 / jem.20131660 (2014).