بعض مواضيع استكشاف أخطاء LC وإصلاحها لا تصبح قديمة أبدًا، حيث توجد مشكلات في ممارسة LC، حتى مع تحسن تكنولوجيا الأجهزة بمرور الوقت. هناك العديد من الطرق التي يمكن أن تنشأ بها المشكلات في نظام LC وتنتهي في شكل ذروة سيئ. عندما تظهر مشكلات تتعلق بشكل الذروة، تساعد القائمة القصيرة للأسباب المحتملة لهذه النتائج في تبسيط تجربة استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
لقد كان من الممتع كتابة عمود "استكشاف أخطاء الكروماتوغرافيا السائلة وإصلاحها" والتفكير في الموضوعات كل شهر، لأن بعض الموضوعات لا تخرج أبدًا عن الموضة. بينما في مجال البحث في الكروماتوغرافيا، تصبح بعض الموضوعات أو الأفكار قديمة حيث تحل محلها أفكار أحدث وأفضل، في مجال استكشاف الأخطاء وإصلاحها، منذ ظهور أول مقال لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها في هذه المجلة (مجلة الكروماتوغرافيا السائلة في ذلك الوقت) منذ أن لا تزال بعض الموضوعات ذات صلة) في عام 1983(1). على مدار السنوات القليلة الماضية، ركزت العديد من أقسام استكشاف أخطاء الكروماتوغرافيا السائلة وإصلاحها على الاتجاهات المعاصرة التي تؤثر على الكروماتوغرافيا السائلة (LC) (على سبيل المثال، المقارنة النسبية لفهمنا لتأثير الضغط على الاحتفاظ [2] التطورات الجديدة) تفسيرنا لنتائج الكروماتوغرافيا السائلة وكيفية استكشاف الأخطاء وإصلاحها باستخدام أجهزة الكروماتوغرافيا السائلة الحديثة. في حلقة هذا الشهر، أواصل سلسلتي (3)، التي بدأت في ديسمبر 2021، والتي ركزت على بعض موضوعات "الحياة والموت" لاستكشاف أخطاء الكروماتوغرافيا السائلة وإصلاحها - العناصر الرائعة لأي مستكشف أخطاء وإصلاحها ضرورية، بغض النظر عن عمر النظام الذي نستخدمه. الموضوع الأساسي لهذه السلسلة وثيق الصلة بمخطط الحائط الشهير "دليل استكشاف أخطاء LC وإصلاحها" (4) التابع لـ LCGC والمعلق في العديد من المختبرات. بالنسبة للجزء الثالث من هذه السلسلة، اخترت التركيز على القضايا المتعلقة بشكل الذروة أو خصائص الذروة. والمثير للدهشة أن مخطط الحائط يسرد 44 سببًا محتملاً مختلفًا لشكل الذروة السيئ! لا يمكننا النظر في كل هذه المشكلات بالتفصيل في مقال واحد، لذلك في هذه الدفعة الأولى حول هذا الموضوع، سأركز على بعض المشكلات التي أراها كثيرًا. آمل أن يجد مستخدمو LC صغارًا وكبارًا بعض النصائح والتذكيرات المفيدة حول هذا الموضوع المهم.
أجد نفسي أجيب بشكل متزايد على أسئلة استكشاف الأخطاء وإصلاحها بـ "كل شيء ممكن". قد تبدو هذه الإجابة سهلة عند النظر في الملاحظات التي يصعب تفسيرها، لكنني أجدها مناسبة في كثير من الأحيان. مع وجود العديد من الأسباب المحتملة لشكل الذروة السيئ، من المهم أن نحافظ على عقل منفتح عند التفكير في ماهية المشكلة، وأن نكون قادرين على تحديد أولويات الأسباب المحتملة لبدء جهود استكشاف الأخطاء وإصلاحها، مع التركيز على الاحتمالات الأكثر شيوعًا، هذه النقطة مهمة جدًا.
إن الخطوة الأساسية في أي تمرين لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها - ولكن أعتقد أنها خطوة غير مقدرة حق قدرها - هي إدراك وجود مشكلة تحتاج إلى حل. إن إدراك وجود مشكلة يعني غالبًا إدراك أن ما يحدث للأداة يختلف عن توقعاتنا، والتي تتشكل من خلال النظرية والمعرفة التجريبية والخبرة (5). يشير "شكل الذروة" المشار إليه هنا في الواقع ليس فقط إلى شكل الذروة (متماثل، غير متماثل، أملس، رقيق، حافة أمامية، ذيل، إلخ)، ولكن أيضًا إلى العرض. توقعاتنا لشكل الذروة الفعلي بسيطة. تدعم النظرية (6) جيدًا توقع الكتب المدرسية بأنه في معظم الحالات، يجب أن تكون القمم الكروماتوغرافية متناظرة وتتوافق مع شكل التوزيع الغاوسي، كما هو موضح في الشكل 1أ. ما نتوقعه من عرض الذروة هو قضية أكثر تعقيدًا، وسنناقش هذا الموضوع في مقال مستقبلي. تُظهر أشكال الذروة الأخرى في الشكل 1 بعض الاحتمالات الأخرى التي يمكن ملاحظتها - بعبارة أخرى، بعض الطرق التي يمكن أن تسوء بها الأمور. في في بقية هذه الدفعة، سنقضي وقتًا في مناقشة بعض الأمثلة المحددة للمواقف التي يمكن أن تؤدي إلى هذه الأنواع من الأشكال.
في بعض الأحيان لا يتم ملاحظة القمم على الإطلاق في الكروماتوغرام حيث من المتوقع أن يتم إخراجها. يشير الرسم البياني أعلاه إلى أن غياب الذروة (على افتراض أن العينة تحتوي بالفعل على المحلل المستهدف بتركيز يجب أن يجعل استجابة الكاشف كافية لرؤيته فوق الضوضاء) يرتبط عادةً ببعض مشكلات الجهاز أو ظروف الطور المتحرك غير الصحيحة (إذا لوحظت على الإطلاق). يمكن العثور على قائمة قصيرة بالمشكلات والحلول المحتملة في هذه الفئة في الجدول الأول.
كما ذكر أعلاه، فإن مسألة مقدار اتساع الذروة الذي يجب تحمله قبل الاهتمام به ومحاولة إصلاحه هو موضوع معقد سأناقشه في مقال مستقبلي. تجربتي هي أن اتساع الذروة الكبير غالبًا ما يكون مصحوبًا بتغيير كبير في شكل الذروة، وأن ذيل الذروة أكثر شيوعًا من ما قبل الذروة أو الانقسام. ومع ذلك، فإن القمم المتماثلة اسميًا تتسع أيضًا، والذي يمكن أن يكون ناتجًا عن عدة أسباب مختلفة:
نوقشت كلٌّ من هذه المشكلات بالتفصيل في أعداد سابقة من "استكشاف أخطاء LC وإصلاحها"، ويمكن للقراء المهتمين بهذه المواضيع الرجوع إلى هذه المقالات السابقة للحصول على معلومات حول الأسباب الجذرية والحلول الممكنة لهذه المشكلات. لمزيد من التفاصيل.
يمكن أن يكون سبب ذروة الذيل، وذروة المقدمة، والانقسام جميعًا ظواهر كيميائية أو فيزيائية، وتختلف قائمة الحلول المحتملة لهذه المشكلات على نطاق واسع، اعتمادًا على ما إذا كنا نتعامل مع مشكلة كيميائية أو فيزيائية. في كثير من الأحيان، من خلال مقارنة القمم المختلفة في مخطط كروماتوغرام، يمكنك العثور على أدلة مهمة حول أيها هو الجاني. إذا أظهرت جميع القمم في مخطط كروماتوغرام أشكالًا متشابهة، فمن المرجح أن السبب ليس فيزيائيًا. إذا تأثرت قمة واحدة أو عدد قليل منها، ولكن الباقي يبدو جيدًا، فمن المرجح أن يكون السبب كيميائيًا.
الأسباب الكيميائية لذروة الذيل معقدة للغاية بحيث لا يمكن مناقشتها بإيجاز هنا. يُشار إلى القارئ المهتم بالإصدار الأخير من "استكشاف أخطاء LC وإصلاحها" لمناقشة أكثر تعمقًا (10). ومع ذلك، فإن أحد الأشياء السهلة التي يمكن تجربتها هي تقليل كتلة المحلل المحقون ومعرفة ما إذا كان شكل الذروة يتحسن. إذا كان الأمر كذلك، فهذه إشارة جيدة إلى أن المشكلة هي "زيادة كتلة". في هذه الحالة، يجب أن تقتصر الطريقة على حقن كتل محلل صغيرة، أو يجب تغيير الظروف الكروماتوغرافية بحيث يمكن الحصول على أشكال ذروة جيدة حتى مع حقن كتل أكبر.
هناك أيضًا العديد من الأسباب الفيزيائية المحتملة للذيل الذروة. يُحال القراء المهتمون بمناقشة مفصلة للإمكانيات إلى إصدار حديث آخر من "استكشاف أخطاء LC وإصلاحها" (11). أحد الأسباب الفيزيائية الأكثر شيوعًا للذيل الذروة هو ضعف الاتصال عند نقطة بين الحاقن والكاشف (12). يظهر مثال متطرف في الشكل 1د، الذي تم الحصول عليه في مختبري قبل بضعة أسابيع. في هذه الحالة، قمنا ببناء نظام بصمام حقن جديد لم نستخدمه من قبل، وقمنا بتثبيت حلقة حقن صغيرة الحجم مع حلقة تم صبها على أنبوب شعري من الفولاذ المقاوم للصدأ. بعد بعض تجارب استكشاف الأخطاء وإصلاحها الأولية، أدركنا أن عمق المنفذ في الجزء الثابت لصمام الحقن كان أعمق بكثير مما اعتدنا عليه، مما أدى إلى حجم ميت كبير في الجزء السفلي من المنفذ. يمكن حل هذه المشكلة بسهولة عن طريق استبدال حلقة الحقن بأنبوب آخر، ويمكننا ضبط الحلقة إلى الوضع المناسب للقضاء على الحجم الميت في الجزء السفلي من المنفذ.
يمكن أن تحدث جبهات الذروة، مثل تلك الموضحة في الشكل 1هـ، أيضًا بسبب مشاكل فيزيائية أو كيميائية. ومن الأسباب الفيزيائية الشائعة للحافة الأمامية أن طبقة الجسيمات في العمود غير مُركّبة جيدًا، أو أن الجسيمات قد أُعيد تنظيمها بمرور الوقت. وكما هو الحال مع ذيل الذروة الناتج عن هذه الظاهرة الفيزيائية، فإن أفضل طريقة لإصلاح ذلك هي استبدال العمود والاستمرار. وبشكل أساسي، غالبًا ما تنشأ أشكال ذروة الحافة الأمامية ذات الأصل الكيميائي مما نسميه ظروف الاحتفاظ "غير الخطية". وفي ظل الظروف المثالية (الخطية)، فإن كمية المُحلل التي يحتفظ بها الطور الثابت (ومن ثم، عامل الاحتفاظ) ترتبط ارتباطًا خطيًا بتركيز المُحلل في العمود. ويعني هذا كروماتوغرافيًا أنه مع زيادة كتلة المُحلل المحقون في العمود، تصبح الذروة أطول، ولكن ليس أوسع. وتنكسر هذه العلاقة عندما يكون سلوك الاحتفاظ غير خطي، ولا تصبح القمم أطول فحسب، بل أيضًا أوسع مع حقن المزيد من الكتلة. بالإضافة إلى ذلك، تحدد الأشكال غير الخطية شكل القمم الكروماتوغرافية، مما ينتج عنه الحواف الأمامية أو الخلفية. كما هو الحال مع التحميل الزائد للكتلة الذي يسبب ذيل الذروة (10)، يمكن أيضًا تشخيص ذروة السبق الناجم عن الاحتفاظ غير الخطي عن طريق تقليل كتلة المحلل المحقون. إذا تحسن شكل الذروة، فيجب تعديل الطريقة بحيث لا تتجاوز جودة الحقن التي تسبب الحافة الأمامية، أو يجب تغيير الظروف الكروماتوغرافية لتقليل هذا السلوك.
في بعض الأحيان نلاحظ ما يبدو أنه ذروة "منقسمة"، كما هو موضح في الشكل 1f. الخطوة الأولى في حل هذه المشكلة هي تحديد ما إذا كان شكل الذروة يرجع إلى التحلل المشترك الجزئي (أي وجود مركبين متميزين ولكنهما يتحللان عن كثب). إذا كان هناك بالفعل محللان مختلفان يتحللان عن قرب، فإن الأمر يتعلق بتحسين دقتهما (على سبيل المثال، عن طريق زيادة الانتقائية أو الاحتفاظ أو عدد الألواح)، وترتبط القمم "المنقسمة" الظاهرة بالأداء الفيزيائي لا علاقة للأداء بالعمود نفسه. غالبًا ما يكون أهم دليل على هذا القرار هو ما إذا كانت جميع القمم في الكروماتوغرام تُظهر أشكالًا منقسمة، أو واحدة أو اثنتين فقط. إذا كانت واحدة أو اثنتين فقط، فمن المحتمل أن تكون مشكلة تحلل مشترك؛ إذا كانت جميع القمم منقسمة، فمن المحتمل أن تكون مشكلة فيزيائية، وعلى الأرجح مرتبطة بالعمود نفسه.
عادةً ما تكون القمم المنقسمة المتعلقة بالخصائص الفيزيائية للعمود نفسه بسبب الفريتات المدخلة أو المخرجة المسدودة جزئيًا، أو إعادة تنظيم الجسيمات في العمود، مما يسمح للطور المتحرك بالتدفق بشكل أسرع من الطور المتحرك في مناطق معينة من تكوين قناة العمود. في مناطق أخرى (11). يمكن أحيانًا إزالة الفريت المسدود جزئيًا عن طريق عكس التدفق عبر العمود؛ ومع ذلك، في تجربتي، عادةً ما يكون هذا حلاً قصير المدى وليس حلاً طويل الأمد. غالبًا ما يكون هذا قاتلاً مع الأعمدة الحديثة إذا أعادت الجسيمات تجميعها داخل العمود. في هذه المرحلة، من الأفضل استبدال العمود والاستمرار.
عادةً ما يشير الذروة في الشكل 1ز، وهو أيضًا من حالة حديثة في مختبري، إلى أن الإشارة عالية جدًا لدرجة أنها وصلت إلى الحد الأعلى لنطاق الاستجابة. بالنسبة لكاشفات الامتصاص الضوئي (UV-vis في هذه الحالة)، عندما يكون تركيز المُحلل مرتفعًا جدًا، يمتص المُحلل معظم الضوء المار عبر خلية تدفق الكاشف، مما يترك القليل جدًا من الضوء ليتم اكتشافه. في ظل هذه الظروف، تتأثر الإشارة الكهربائية من الكاشف الضوئي بشدة بمصادر مختلفة للضوضاء، مثل الضوء الشارد و"التيار المظلم"، مما يجعل الإشارة "ضبابية" للغاية في المظهر ومستقلة عن تركيز المُحلل. عند حدوث ذلك، غالبًا ما يمكن حل المشكلة بسهولة عن طريق تقليل حجم حقن المُحلل - تقليل حجم الحقن أو تخفيف العينة أو كليهما.
في مدرسة الكروماتوغرافيا، نستخدم إشارة الكاشف (أي المحور y في الكروماتوغرام) كمؤشر على تركيز المحلل في العينة. لذا يبدو من الغريب رؤية كروماتوغرافيا بإشارة أقل من الصفر، حيث أن التفسير البسيط هو أن هذا يشير إلى تركيز سلبي للمحلل - وهو بالطبع غير ممكن جسديًا. في تجربتي، غالبًا ما يتم ملاحظة القمم السلبية عند استخدام أجهزة الكشف عن الامتصاص البصري (على سبيل المثال، الأشعة فوق البنفسجية المرئية).
في هذه الحالة، تعني الذروة السلبية ببساطة أن الجزيئات التي تخرج من العمود تمتص ضوءًا أقل من الطور المتحرك نفسه مباشرة قبل الذروة وبعدها. يمكن أن يحدث هذا، على سبيل المثال، عند استخدام أطوال موجية منخفضة نسبيًا للكشف (<230 نانومتر) وإضافات الطور المتحرك التي تمتص معظم الضوء عند هذه الأطوال الموجية. يمكن أن تكون هذه الإضافات مكونات مذيبات الطور المتحرك مثل الميثانول أو مكونات العازلة مثل الأسيتات أو الفورمات. يمكن للمرء في الواقع استخدام القمم السلبية لإعداد منحنى معايرة والحصول على معلومات كمية دقيقة، لذلك لا يوجد سبب جوهري لتجنبها في حد ذاتها (يشار إلى هذه الطريقة أحيانًا باسم "الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية غير المباشرة") (13). ومع ذلك، إذا أردنا حقًا تجنب القمم السلبية تمامًا، ففي حالة الكشف عن الامتصاص، فإن أفضل حل هو استخدام طول موجي مختلف للكشف بحيث يمتص المحلل أكثر من الطور المتحرك، أو تغيير تكوين الطور المتحرك بحيث يمتص ضوءًا أقل من المحللات.
يمكن أن تظهر القمم السلبية أيضًا عند استخدام الكشف عن معامل الانكسار (RI) عندما يكون معامل الانكسار للمكونات الأخرى غير المحلل في العينة، مثل مصفوفة المذيب، مختلفًا عن معامل الانكسار للطور المتحرك. يحدث هذا أيضًا مع الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية المرئية، ولكن هذا التأثير يميل إلى التخفيف بالنسبة للكشف عن RI. في كلتا الحالتين، يمكن تقليل القمم السلبية عن طريق مطابقة تكوين مصفوفة العينة بشكل أوثق مع تكوين الطور المتحرك.
في الجزء الثالث حول الموضوع الأساسي لاستكشاف أخطاء LC وإصلاحها، ناقشت المواقف التي يختلف فيها شكل الذروة المرصود عن شكل الذروة المتوقع أو الطبيعي. يبدأ استكشاف الأخطاء وإصلاحها الفعال لمثل هذه المشكلات بمعرفة أشكال الذروة المتوقعة (بناءً على النظرية أو الخبرة السابقة بالطرق الحالية)، لذا فإن الانحرافات عن هذه التوقعات واضحة. لمشاكل شكل الذروة العديد من الأسباب المحتملة المختلفة (عريض جدًا، ذيل، حافة أمامية، إلخ). في هذه الدفعة، أناقش بالتفصيل بعض الأسباب التي أراها كثيرًا. توفر معرفة هذه التفاصيل مكانًا جيدًا لبدء استكشاف الأخطاء وإصلاحها، ولكنها لا تلتقط جميع الاحتمالات. يمكن للقراء المهتمين بقائمة أكثر تعمقًا للأسباب والحلول الرجوع إلى مخطط الحائط "دليل استكشاف أخطاء LC وإصلاحها" من LCGC.
(4) مخطط حائط "دليل استكشاف أخطاء LC وإصلاحها" LCGC.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) أ. فيلينجر، تحليل البيانات ومعالجة الإشارات في الكروماتوغرافيا (إلسفير، نيويورك، نيويورك، 1998)، ص 43-96.
(8) Wahab MF، Dasgupta PK، Kadjo AF و Armstrong DW، Anal.Chim.Journal.Rev. 907، 31-44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.