بعض موضوعات استكشاف الأخطاء وإصلاحها LC ليست قديمة أبدًا ، نظرًا لوجود مشكلات في ممارسة LC ، حتى مع تحسن تقنية الأجهزة بمرور الوقت ، وهناك العديد من الطرق التي يمكن أن تظهر بها المشكلات في نظام LC وينتهي بها الأمر في حالة ذروة سيئة ، وعندما تظهر المشكلات المتعلقة بشكل الذروة ، تساعد قائمة مختصرة من الأسباب المحتملة لهذه النتائج على تبسيط تجربة استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
لقد كان من الممتع كتابة عمود "استكشاف الأخطاء وإصلاحها LC" والتفكير في الموضوعات كل شهر ، لأن بعض الموضوعات لا تخرج عن الأسلوب أبدًا. في حين أن بعض الموضوعات أو الأفكار في مجال البحث اللوني أصبحت قديمة حيث تم استبدالها بأفكار أحدث وأفضل ، في مجال استكشاف الأخطاء وإصلاحها ، منذ ظهور أول مقال حول استكشاف الأخطاء وإصلاحها في هذه المجلة (مجلة LC Journal في ذلك الوقت) منذ بعض الموضوعات (لا تزال هناك اتجاهات معاصرة) في عام 1983. التأثير على الكروماتوغرافيا السائلة (LC) (على سبيل المثال ، المقارنة النسبية لفهمنا لتأثير الضغط على الاحتفاظ [2] التطورات الجديدة) تفسيرنا لنتائج LC وكيفية استكشاف الأخطاء وإصلاحها باستخدام أدوات LC الحديثة. في جزء هذا الشهر ، سأواصل سلسلتي (3) ، التي بدأت في ديسمبر 2021 ، والتي ركزت على بعض موضوعات "الحياة والموت" لاستكشاف أخطاء LC وإصلاحها - لا يعد استخدام أي عنصر أساسي في سلسلة حل مشاكل LC أمرًا أساسيًا ، مخطط الجدار الشهير LC Troubleshooting Guide (4) المعلق في العديد من المعامل. بالنسبة للجزء الثالث من هذه السلسلة ، اخترت التركيز على القضايا المتعلقة بشكل الذروة أو خصائص الذروة. وبشكل لا يصدق ، يسرد مخطط الجدار 44 سببًا محتملاً مختلفًا لضعف شكل الذروة!
أجد نفسي أجيب بشكل متزايد على أسئلة تحرّي الخلل وإصلاحه بعبارة "كل شيء ممكن". قد تبدو هذه الاستجابة سهلة عند التفكير في الملاحظات التي يصعب تفسيرها ، لكنني أجدها مناسبة في كثير من الأحيان. مع وجود العديد من الأسباب المحتملة لضعف شكل الذروة ، من المهم أن تكون متفتحًا عند التفكير في ماهية المشكلة ، وأن تكون قادرًا على تحديد أولويات الأسباب المحتملة لبدء جهود استكشاف الأخطاء وإصلاحها ، مع التركيز على تلك الاحتمالات الأكثر شيوعًا ، هذه النقطة مهمة للغاية.
تتمثل إحدى الخطوات الرئيسية في أي تمرين لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها - ولكن أعتقد أنه تم التقليل من شأنها - في إدراك أن هناك مشكلة يجب حلها. كما أن إدراك أن هناك مشكلة يعني أيضًا إدراك أن ما يحدث للأداة يختلف عن توقعاتنا ، والتي تتشكل من خلال النظرية والمعرفة التجريبية والخبرة (5). يشير "شكل الذروة" المشار إليه هنا في الواقع ليس فقط إلى شكل الذيل المتناظر ، المتماثل ، المتناظر ، والحافة المتقلبة ، إلخ. توقعاتنا لشكل الذروة الفعلي بسيطة. تدعم النظرية (6) جيدًا توقع الكتاب المدرسي أنه في معظم الحالات ، يجب أن تكون القمم الكروماتوغرافية متماثلة وتتوافق مع شكل التوزيع الغوسي ، كما هو موضح في الشكل 1 أ. ما نتوقعه من ذروة العرض هو قضية أكثر تعقيدًا ، وسوف نناقش هذا الموضوع في مقال مستقبلي ، ويمكن أن تكون بعض الأشكال الأخرى التي تمت ملاحظتها في الشكل 1 بعض الاحتمالات الخاطئة في التثبيت. سنقضي الوقت في مناقشة بعض الأمثلة المحددة للمواقف التي يمكن أن تؤدي إلى هذه الأنواع من الأشكال.
في بعض الأحيان ، لا يتم ملاحظة القمم على الإطلاق في مخطط الكروماتوجرام حيث من المتوقع أن يتم التخلص منها. يشير مخطط الجدار أعلاه إلى أن عدم وجود ذروة (بافتراض أن العينة تحتوي فعليًا على المادة التحليلية المستهدفة عند التركيز الذي يجب أن تجعل استجابة الكاشف كافية لرؤيتها فوق الضوضاء) يرتبط عادةً ببعض مشكلات الجهاز أو ظروف الطور المتحرك غير الصحيحة (إذا لوحظت على الإطلاق).قمم ، عادة "ضعيفة" للغاية) يمكن العثور على قائمة مختصرة بالمشكلات والحلول المحتملة في هذه الفئة في الجدول الأول.
كما ذكرنا سابقًا ، فإن السؤال عن مقدار توسيع الذروة الذي يجب تحمله قبل الانتباه ومحاولة إصلاحه هو موضوع معقد سأناقشه في مقال مستقبلي. تجربتي هي أن توسيع الذروة الكبير غالبًا ما يكون مصحوبًا بتغيير كبير في شكل الذروة ، والذروة الذروة أكثر شيوعًا من الذروة السابقة أو الانقسام.
تمت مناقشة كل من هذه المشكلات بالتفصيل في الإصدارات السابقة من استكشاف أخطاء LC وإصلاحها ، ويمكن للقراء المهتمين بهذه الموضوعات الرجوع إلى هذه المقالات السابقة للحصول على معلومات حول الأسباب الجذرية والحلول المحتملة لهذه المشكلات.المزيد من التفاصيل.
يمكن أن يكون سبب الذروة والذروة الأمامية والانقسام نتيجة ظواهر كيميائية أو فيزيائية ، وتتنوع قائمة الحلول المحتملة لهذه المشكلات على نطاق واسع ، اعتمادًا على ما إذا كنا نتعامل مع مشكلة كيميائية أو فيزيائية ، وفي كثير من الأحيان ، من خلال مقارنة القمم المختلفة في كروماتوجرام ، يمكنك العثور على أدلة مهمة حول أي الجاني هو الجاني ، إذا كانت كل القمم في كروماتوجرام ليست متشابهة في الغالب ، إذا كانت كل القمم في كروماتوجرام هي الأكثر تأثرًا ، فإن الشكل الأكثر تأثرًا في الكروماتوجرام هو الأكثر تأثرًا. السبب هو على الأرجح مادة كيميائية.
الأسباب الكيميائية لذروة الذروة معقدة للغاية بحيث لا يمكن مناقشتها بإيجاز هنا. تتم إحالة القارئ المهتم إلى الإصدار الأخير من "استكشاف أخطاء LC وإصلاحها" لإجراء مناقشة أكثر تعمقًا (10) ، ومع ذلك ، من السهل محاولة تقليل كتلة التحليل المحقون ومعرفة ما إذا كان شكل الذروة يتحسن ، إذا كان الأمر كذلك ، فهذا دليل جيد على أن المشكلة هي "الكتلة ، يجب أن تكون الكتلة التحليلية صغيرة أو يجب أن تكون الكتلة محدودة في هذه الحالة. تم تغييره بحيث يمكن الحصول على أشكال ذروة جيدة حتى مع حقن كتل أكبر.
هناك أيضًا العديد من الأسباب المادية المحتملة لذروة الذروة. تتم إحالة القراء المهتمين بمناقشة مفصلة للإمكانيات إلى إصدار حديث آخر من "استكشاف أخطاء LC وإصلاحها" (11). أحد الأسباب الفيزيائية الأكثر شيوعًا لذروة الذروة هو ضعف الاتصال عند نقطة بين الحاقن والكاشف. الطويق الذي تم تشكيله على أنبوب شعري من الفولاذ المقاوم للصدأ. بعد بعض التجارب الأولية لتحرّي الخلل وإصلاحه ، أدركنا أن عمق المنفذ في الجزء الثابت لصمام الحقن كان أعمق بكثير مما اعتدنا عليه ، مما أدى إلى حجم كبير ميت في أسفل المنفذ ، ويمكن حل هذه المشكلة بسهولة عن طريق استبدال حلقة الحقن بأنبوب آخر ، ويمكننا ضبط الحلقة إلى الموضع المناسب للتخلص من الحجم الميت في الجزء السفلي من المنفذ.
يمكن أيضًا أن تكون جبهات الذروة مثل تلك الموضحة في الشكل 1 هـ ناتجة عن مشاكل فيزيائية أو كيميائية. أحد الأسباب الفيزيائية الشائعة للحافة الأمامية هو أن طبقة الجسيمات في العمود ليست معبأة جيدًا ، أو أن الجسيمات قد أعيد تنظيمها بمرور الوقت. كما هو الحال مع الذروة الناتجة عن هذه الظاهرة الفيزيائية ، فإن أفضل طريقة لإصلاح هذا هو استبدال العمود والاستمرار. من المادة التحليلية المحتجزة بواسطة المرحلة الثابتة (ومن ثم ، عامل الاحتفاظ) مرتبط خطيًا بتركيز المادة التحليلية في العمود ، ويعني هذا ، من الناحية الكروماتوجرافية ، أنه مع زيادة كتلة المادة التحليلية المحقونة في العمود ، تصبح القمة أطول ، ولكن ليس أوسع ، وتنقطع هذه العلاقة عندما يكون سلوك الاحتفاظ الناتج غير خطي ، والكتلة لا تصبح أكثر ارتفاعًا فحسب ، بل تكون أيضًا أكثر اتساعًا كما هو الحال مع الأشكال المحقونة. الحواف الأمامية أو الخلفية: كما هو الحال مع الحمل الزائد الكتلي الذي يتسبب في ذروة الذروة (10) ، يمكن أيضًا تشخيص ذروة القيادة الناتجة عن الاحتفاظ غير الخطي عن طريق تقليل كتلة التحليل المحقون ، إذا تحسن شكل الذروة ، يجب تعديل الطريقة بحيث لا تتجاوز جودة الحقن التي تسبب الحافة الأمامية ، أو يجب تغيير الظروف الكروماتوغرافية لتقليل هذا السلوك.
في بعض الأحيان ، نلاحظ ما يبدو أنه ذروة "مقسمة" ، كما هو موضح في الشكل 1 و. الخطوة الأولى في حل هذه المشكلة هي تحديد ما إذا كان شكل الذروة ناتجًا عن شطف جزئي مشترك (أي وجود مركبين مختلفين ولكن متقاربين) ، إذا كان هناك في الواقع نوعان من التحليلين المختلفين يتقاربان من بعضهما البعض ، فإن الأمر يتعلق بتحسين الدقة (على سبيل المثال ، عن طريق زيادة "العدد الظاهر" ، أو الاحتفاظ بالأداء ، أو عدم احتواء العمود على نفسه). غالبًا ما يكون أهم دليل على هذا القرار هو ما إذا كانت جميع القمم في الكروماتوجرام تعرض أشكالًا منقسمة ، أو واحدة أو اثنتين فقط ، إذا كانت واحدة أو اثنتين فقط ، فمن المحتمل أنها مشكلة شطف ؛إذا تم تقسيم جميع القمم ، فمن المحتمل أن تكون مشكلة مادية ، على الأرجح مرتبطة بالعمود نفسه.
عادة ما تكون القمم المنقسمة المتعلقة بالخصائص الفيزيائية للعمود نفسه ناتجة عن انسداد جزئي للمدخل أو المخرج ، أو إعادة تنظيم الجسيمات في العمود ، مما يسمح للطور المتحرك بالتدفق بشكل أسرع من الطور المتحرك في مناطق معينة من تكوين قناة العمود.ومع ذلك ، من واقع خبرتي ، فإن هذا عادةً ما يكون حلًا قصير المدى وليس طويل الأجل ، وغالبًا ما يكون هذا حلاً قاتلًا مع الأعمدة الحديثة إذا تمت إعادة تجميع الجسيمات داخل العمود ، وفي هذه المرحلة ، من الأفضل استبدال العمود والمتابعة.
عادةً ما تشير الذروة في الشكل 1g ، من حالة حديثة في مختبري الخاص ، إلى أن الإشارة عالية جدًا لدرجة أنها وصلت إلى الحد الأقصى لنطاق الاستجابة. بالنسبة لكاشفات الامتصاص البصري (UV-vis في هذه الحالة) ، عندما يكون تركيز المادة التحليلية مرتفعًا جدًا ، يمتص التحليلي معظم الضوء الذي يمر عبر خلية تدفق الكاشف ، مما يترك القليل جدًا من الضوء ليتم اكتشافه. الحالي "، مما يجعل الإشارة" مشوشة "للغاية في المظهر ومستقلة عن تركيز المادة التحليلية.عندما يحدث هذا ، يمكن غالبًا حل المشكلة بسهولة عن طريق تقليل حجم الحقن في المادة التحليلية - تقليل حجم الحقن ، أو تخفيف العينة ، أو كليهما.
في مدرسة الكروماتوغرافيا ، نستخدم إشارة الكاشف (أي المحور y في مخطط الكروماتوغرام) كمؤشر لتركيز المادة التحليلية في العينة ، لذلك يبدو من الغريب رؤية مخطط كروماتوغرافي بإشارة أقل من الصفر ، لأن التفسير البسيط هو أن هذا يشير إلى تركيز سلبي للتحليل - وهو بالطبع غير ممكن ماديًا.
في هذه الحالة ، تعني الذروة السلبية ببساطة أن الجزيئات التي يتم فصلها من العمود تمتص ضوءًا أقل من الطور المتحرك نفسه قبل وبعد الذروة مباشرة ، ويمكن أن يحدث هذا ، على سبيل المثال ، عند استخدام أطوال موجية منخفضة نسبيًا للكشف (<230 نانومتر) وإضافات طور متنقلة تمتص معظم الضوء عند هذه الأطوال الموجية ، ويمكن أن تكون هذه الإضافات عبارة عن مكونات مذيب طور متحرك مثل الميثانول أو مكونات عازلة. معلومات كمية دقيقة ، لذلك لا يوجد سبب أساسي لتجنبها في حد ذاتها (يشار إلى هذه الطريقة أحيانًا باسم "الكشف غير المباشر للأشعة فوق البنفسجية") (13). ومع ذلك ، إذا كنا نريد حقًا تجنب القمم السلبية تمامًا ، في حالة اكتشاف الامتصاص ، فإن أفضل حل هو استخدام طول موجة كشف مختلف بحيث يمتص التحليلي أكثر من الطور المتحرك ، أو يغير تركيبة الطور التحليلي أقل من الطور المتحرك.
يمكن أن تظهر القمم السالبة أيضًا عند استخدام كشف معامل الانكسار (RI) عندما يكون معامل الانكسار للمكونات الأخرى بخلاف التحليل في العينة ، مثل مصفوفة المذيب ، مختلفًا عن معامل الانكسار في الطور المتحرك ، ويحدث هذا أيضًا مع الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية ، ولكن هذا التأثير يميل إلى أن يكون ضعيفًا بالنسبة لاكتشاف RI.
في الجزء الثالث حول الموضوع الأساسي لاستكشاف أخطاء LC وإصلاحها ، ناقشت المواقف التي يختلف فيها شكل الذروة الملحوظ عن شكل الذروة المتوقع أو الطبيعي. تبدأ عملية استكشاف الأخطاء وإصلاحها الفعالة لمثل هذه المشكلات بمعرفة أشكال الذروة المتوقعة (استنادًا إلى النظرية أو الخبرة السابقة بالطرق الحالية) ، لذا فإن الانحرافات عن هذه التوقعات واضحة. لا يلتقط كل الاحتمالات. يمكن للقراء المهتمين بقائمة أكثر تعمقًا من الأسباب والحلول الرجوع إلى مخطط LCGC "LC Troubleshooting Guide".
(4) مخطط الجدار LCGC "دليل استكشاف أخطاء LC وإصلاحه". https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) أ. فيلينجر ، تحليل البيانات ومعالجة الإشارات في الكروماتوغرافيا (إلسفير ، نيويورك ، نيويورك ، 1998) ، ص 43-96.
(8) Wahab MF، Dasgupta PK، Kadjo AF and Armstrong DW، Anal.Chim.Journal.Rev.907 ، 31-44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.