شكرًا لزيارتكم موقع Nature.com. إصدار المتصفح الذي تستخدمونه يدعم CSS بشكل محدود. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح مُحدّث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). في هذه الأثناء، ولضمان استمرار الدعم، سنُقدّم الموقع بدون أنماط أو JavaScript.
الخزعة السائلة (LB) مفهومٌ يكتسب شعبيةً متزايدة في مجال الطب الحيوي. يعتمد هذا المفهوم بشكلٍ رئيسي على الكشف عن شظايا الحمض النووي خارج الخلية (ccfDNA)، والتي تُطلق بشكلٍ رئيسي كشظايا صغيرة بعد موت الخلايا في أنسجةٍ مختلفة. نسبةٌ ضئيلةٌ من هذه الشظايا تأتي من أنسجةٍ أو كائناتٍ حيةٍ غريبة. في عملنا الحالي، طبّقنا هذا المفهوم على بلح البحر، وهو نوعٌ من الكائنات الدقيقة يُعرف بقدرته العالية على ترشيح مياه البحر. نستخدم قدرة بلح البحر على العمل كمرشحاتٍ طبيعيةٍ لالتقاط شظايا الحمض النووي البيئي من مصادرَ متنوعةٍ لتوفير معلوماتٍ حول التنوع البيولوجي للنظم البيئية الساحلية البحرية. تُظهر نتائجنا أن دم بلح البحر يحتوي على شظايا حمض نووي تتفاوت أحجامها بشكلٍ كبير، من 1 إلى 5 كيلو قاعدة. أظهر تسلسل البندقية أن عددًا كبيرًا من شظايا الحمض النووي من أصلٍ ميكروبيٍّ أجنبي. من بينها، وجدنا شظايا حمض نووي من البكتيريا والعتائق والفيروسات، بما في ذلك الفيروسات المعروفة بإصابة مجموعةٍ متنوعةٍ من العوائل الشائعة في النظم البيئية البحرية الساحلية. وفي الختام، أظهرت دراستنا أن مفهوم التنوع الميكروبي في النظم البيئية الساحلية البحرية المطبق على بلح البحر يمثل مصدرًا غنيًا ولكن لم يتم استكشافه بعد للمعرفة حول التنوع الميكروبي في النظم البيئية الساحلية البحرية.
يُعد تأثير تغير المناخ (CC) على التنوع البيولوجي للنظم البيئية البحرية مجالًا بحثيًا سريع النمو. لا يتسبب الاحتباس الحراري العالمي في ضغوط فسيولوجية مهمة فحسب، بل يدفع أيضًا الحدود التطورية للاستقرار الحراري للكائنات البحرية، مما يؤثر على موطن عدد من الأنواع، مما يدفعها إلى البحث عن ظروف أكثر ملاءمة [1، 2]. بالإضافة إلى التأثير على التنوع البيولوجي للحيوانات متعددة الخلايا، يُخل تغير المناخ بالتوازن الدقيق للتفاعلات بين العائل والميكروبات. يُشكل خلل التوازن الميكروبي هذا تهديدًا خطيرًا للنظم البيئية البحرية لأنه يجعل الكائنات البحرية أكثر عرضة لمسببات الأمراض المعدية [3، 4]. يُعتقد أن SS يلعب دورًا مهمًا في الوفيات الجماعية، وهي مشكلة خطيرة لإدارة النظم البيئية البحرية العالمية [5، 6]. هذه قضية مهمة بالنظر إلى التأثيرات الاقتصادية والبيئية والتغذوية للعديد من الأنواع البحرية. وهذا ينطبق بشكل خاص على ذوات الصدفتين التي تعيش في المناطق القطبية، حيث تكون آثار CK أكثر إلحاحًا وشدةً [6، 7]. في الواقع، ذوات الصدفتين مثل Mytilus spp. تُستخدم على نطاق واسع لمراقبة آثار CC على النظم البيئية البحرية. وليس من المستغرب أن يتم تطوير عدد كبير نسبيًا من المؤشرات الحيوية لمراقبة صحتهم، وغالبًا ما تستخدم نهجًا من مستويين يتضمن مؤشرات حيوية وظيفية تعتمد على النشاط الأنزيمي أو الوظائف الخلوية مثل قابلية الخلية للبقاء والنشاط البلعمي [8]. تتضمن هذه الطرق أيضًا قياس تركيز مؤشرات الضغط المحددة التي تتراكم في الأنسجة الرخوة بعد امتصاص كميات كبيرة من مياه البحر. ومع ذلك، فإن قدرة الترشيح العالية والجهاز الدوري شبه المفتوح للثنائيات الصدفة توفر فرصة لتطوير مؤشرات حيوية جديدة للهيموليمف باستخدام مفهوم خزعة السائل (LB)، وهو نهج بسيط وغير جراحي لإدارة المرضى. عينات الدم [9، 10]. على الرغم من أنه يمكن العثور على عدة أنواع من الجزيئات الدائرية في LB البشرية، إلا أن هذا المفهوم يعتمد في المقام الأول على تحليل تسلسل الحمض النووي لشظايا الحمض النووي خارج الخلية (ccfDNA) الدائرية في البلازما. في الواقع، عُرف وجود الحمض النووي الدائر في بلازما الإنسان منذ منتصف القرن العشرين [11]، إلا أن ظهور أساليب التسلسل عالية الإنتاجية لم يُفضِ إلى التشخيص السريري القائم على الحمض النووي المُكتَسَب (ccfDNA) إلا في السنوات الأخيرة. ويعود وجود هذه الشظايا الدائر في الحمض النووي جزئيًا إلى الإطلاق السلبي للحمض النووي الجينومي (النواة والميتوكوندريا) بعد موت الخلية. في الأفراد الأصحاء، يكون تركيز ccfDNA منخفضًا بشكل طبيعي (<10 نانوجرام/مل) ولكن يمكن أن يزيد بمقدار 5 إلى 10 مرات في المرضى الذين يعانون من أمراض مختلفة أو يتعرضون للإجهاد، مما يؤدي إلى تلف الأنسجة. في الأفراد الأصحاء، يكون تركيز ccfDNA منخفضًا بشكل طبيعي (<10 نانوجرام/مل) ولكن يمكن أن يزيد بمقدار 5 إلى 10 مرات في المرضى الذين يعانون من أمراض مختلفة أو يتعرضون للإجهاد، مما يؤدي إلى تلف الأنسجة. مع تركيز جيد جدًا من الناس في الحد الأدنى (<10 نانوغرام/مل)، ولكن يمكن زيادة تركيزه في 5-10 مرات في أجسام مختلفة الباثولوجيا أو الإجهاد المعزز، يخفف من التوتر. في الأشخاص الأصحاء، يكون تركيز cccDNA منخفضًا بشكل طبيعي (<10 نانوجرام/مل)، ولكنه يمكن أن يزيد بمقدار 5 إلى 10 مرات في المرضى الذين يعانون من أمراض مختلفة أو تحت ضغط يؤدي إلى تلف الأنسجة.أفضل ما في الأمر هو أن ccfDNA هو أفضل ما يمكن (<10) نانوغرام / مل)، يجب أن يكون حجم الجزيئات في حدود 5-10 ميكروغرام، وهو ما يعادل 5-10 ميكروغرامات.يمكن أن يكون مخففًا , ccfdna 的 浓度 较 低 (<10 نانوغرام / مل) 但 在 各 种 病理 或 承受 患者 中 可من 5 إلى 10 أيام، قم بذلك.تركيز ccfDNA جيد جدًا (<10 نانوغرام/مل) في الأشخاص الآخرين، ولكن يمكن أن يكون أفضل في 5-10 مرات في المرضى بمختلف أنواعهم الباثولوجيا أو التوتر الذي يؤدي إلى الإرهاق. تكون تركيزات ccfDNA منخفضة عادة (<10 نانوجرام/مل) لدى الأفراد الأصحاء، ولكن يمكن أن تزيد بمقدار 5-10 أضعاف لدى المرضى الذين يعانون من أمراض أو ضغوط مختلفة، مما يؤدي إلى تلف الأنسجة.يختلف حجم شظايا ccfDNA بشكل كبير، ولكنه يتراوح عادةً من 150 إلى 200 زوج قاعدي. [12]. يمكن استخدام تحليل ccfDNA المشتق ذاتيًا، أي ccfDNA من الخلايا المضيفة الطبيعية أو المتحولة، للكشف عن التغيرات الجينية والوراثية الموجودة في الجينوم النووي و/أو الجينوم الميتوكوندريا، مما يساعد الأطباء السريريين على اختيار علاجات محددة تستهدف الجزيئات [13]. ومع ذلك، يمكن الحصول على ccfDNA من مصادر خارجية مثل ccfDNA من الخلايا الجنينية أثناء الحمل أو من الأعضاء المزروعة [14،15،16،17]. يُعد ccfDNA أيضًا مصدرًا مهمًا للمعلومات للكشف عن وجود الأحماض النووية لعامل مُعدٍ (أجنبي)، مما يسمح بالكشف غير الجراحي عن العدوى واسعة النطاق التي لم يتم تحديدها من خلال مزارع الدم، وتجنب الخزعة الجراحية للأنسجة المصابة [18]. أظهرت دراسات حديثة أن دم الإنسان يحتوي على مصدر غني بالمعلومات التي يمكن استخدامها لتحديد مسببات الأمراض الفيروسية والبكتيرية، وأن حوالي 1% من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين الموجود في بلازما الإنسان من أصل أجنبي [19]. تُظهر هذه الدراسات أنه يمكن تقييم التنوع البيولوجي للميكروبيوم المنتشر في الكائن الحي باستخدام تحليل الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين. ومع ذلك، وحتى وقت قريب، كان هذا المفهوم يُستخدم حصريًا لدى البشر، وبدرجة أقل لدى الفقاريات الأخرى [20، 21].
في هذه الورقة البحثية، نستخدم إمكانات LB لتحليل الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (ccfDNA) لأولاكوميا أترا، وهو نوع جنوبي شائع الوجود في جزر كيرغولين شبه القطبية، وهي مجموعة جزر تقع فوق هضبة كبيرة تشكلت قبل 35 مليون سنة. باستخدام نظام تجريبي في المختبر، وجدنا أن بلح البحر يمتص بسرعة شظايا الحمض النووي الموجودة في مياه البحر وتدخل حيز الدم اللمفاوي. أظهر تسلسل البندقية أن الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (ccfDNA) في بلح البحر يحتوي على شظايا حمض نووي من أصله الخاص وغير الذاتي، بما في ذلك البكتيريا التكافلية وشظايا الحمض النووي من المناطق الأحيائية النموذجية للنظم البيئية الساحلية البحرية البركانية الباردة. يحتوي الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (ccfDNA) أيضًا على تسلسلات فيروسية مشتقة من فيروسات ذات نطاقات عوائل مختلفة. كما وجدنا شظايا حمض نووي من حيوانات متعددة الخلايا مثل الأسماك العظمية وشقائق النعمان البحرية والطحالب والحشرات. وفي الختام، أظهرت دراستنا أن مفهوم LB يمكن تطبيقه بنجاح على اللافقاريات البحرية لتوليد ذخيرة جينومية غنية في النظم البيئية البحرية.
جُمعت بلح البحر الأزرق البالغ (Mytilus platensis) (M. platensis) وبلح البحر الأولاكوميا أترا (A. atra) (بطول 55-70 مم) من الشواطئ الصخرية بين المد والجزر في بورت أو فرانس (049°21.235 جنوبًا، 070°13.490 شرقًا). جزر كيرغولين في ديسمبر 2018. كما جُمعت بلح البحر الأزرق البالغ (Mytilus spp.) من مورد تجاري (PEI Mussel King Inc.، جزيرة الأمير إدوارد، كندا)، ووُضع في خزان مُهوى مُتحكم بدرجة حرارته (4 درجات مئوية) يحتوي على 10-20 لترًا من محلول ملحي صناعي بتركيز 32‰ (ملح البحر الصناعي من شركة Reef Crystal، Instant Ocean، فرجينيا، الولايات المتحدة الأمريكية). في كل تجربة، تم قياس طول ووزن كل صدفة على حدة.
يتوفر بروتوكول مجاني مفتوح المصدر لهذا البرنامج على الإنترنت (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). باختصار، جُمعت عينة الدم اللمفاوي من عضلات الخاطفة كما هو موضح [22]. تم تنقية عينة الدم اللمفاوي بالطرد المركزي بسرعة 1200×g لمدة 3 دقائق، وجُمّد السائل العلوي (-20 درجة مئوية) حتى الاستخدام. لعزل وتنقية الحمض النووي الخالي من الصفائح الدموية، أُذيبت عينات (1.5-2.0 مل) وعُولجت باستخدام مجموعة NucleoSnap cfDNA (ماشيري-ناجل، بيثلهين، بنسلفانيا) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. حُفظت عينة ccfDNA عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى إجراء تحليل إضافي. في بعض التجارب، عُزل الحمض النووي الخالي من الصفائح الدموية ونقّي باستخدام مجموعة QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN، تورنتو، أونتاريو، كندا). تم تحديد كمية الحمض النووي المُنقّى باستخدام اختبار PicoGreen القياسي. حُلّلت توزيع شظايا الحمض النووي ccfDNA المعزول بالرحلان الكهربائي الشعري باستخدام جهاز التحليل الحيوي Agilent 2100 (شركة Agilent Technologies Inc.، سانتا كلارا، كاليفورنيا) باستخدام طقم الحمض النووي عالي الحساسية. أُجري الاختبار باستخدام ميكرولتر واحد من عينة الحمض النووي ccfDNA وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.
لتسلسل شظايا الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (ccfDNA) في الدملمف، أعدّت شركة جينوم كيبيك (مونتريال، كيبيك، كندا) مكتبات شوتجن باستخدام مجموعة Illumina DNA Mix ضمن مجموعة Illumina MiSeq PE75. استُخدم محول قياسي (BioO). تتوفر ملفات البيانات الخام من أرشيف قراءة التسلسلات التابع للمركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) (SRR8924808 وSRR8924809). تم تقييم جودة القراءة الأساسية باستخدام FastQC [23]. استُخدمت أداة Trimmomatic [24] لقص المحولات والقراءات رديئة الجودة. دُمجت قراءات شوتجن ذات النهايات المزدوجة بتقنية FLASH في قراءات مفردة أطول مع تداخل لا يقل عن 20 زوجًا قاعديًا لتجنب عدم التطابق [25]. تم شرح القراءات المدمجة باستخدام BLASTN باستخدام قاعدة بيانات تصنيف NCBI ثنائية الصدفة (قيمة e < 1e−3 وتشابه 90٪)، وتم إخفاء التسلسلات منخفضة التعقيد باستخدام DUST [26]. تم شرح القراءات المدمجة باستخدام BLASTN باستخدام قاعدة بيانات تصنيف NCBI ثنائية الصدفة (قيمة e < 1e−3 وتشابه 90٪)، وتم إخفاء التسلسلات منخفضة التعقيد باستخدام DUST [26]. تم إعداد التعليقات التوضيحية اللازمة باستخدام BLASTN باستخدام أسس تصنيفات الرخويات الصناعية NCBI (الملاحظة e < 1e-3 و 90% من العمليات)، ولم يتم استخدام أي صعوبة في التنظيف بعد ذلك. استخدام الغبار [26]. تم شرح القراءات المجمعة باستخدام BLASTN باستخدام قاعدة بيانات تصنيف المحارات NCBI (القيمة e < 1e-3 و90% تشابه)، وتم إجراء إخفاء تسلسل التعقيد المنخفض باستخدام DUST [26].NCBI NCBI 分类数据库(e 值< 1e-3 和90% 同源性) BLASTN 注释合并的读数، 并使用DUST [26] لا داعي للقلق بشأن هذا الأمر.使用 双 壳类 NCBI 分类 （((<1e-3 و 90% 同源) 用 用 用 注释 合并 读数 , 并 使用 Dust [26] 进行. 掩蔽 掩蔽 掩蔽تم إعداد التعليقات التوضيحية اللازمة باستخدام BLASTN باستخدام الأساس التصنيفي لهذه الرخويات الصناعية NCBI (المعنى e <1e-3 و 90% من العمليات)، ولم يكن هناك أي صعوبة في إخفاء العيوب يتم تشغيله باستخدام الغبار [26]. تم شرح القراءات المجمعة باستخدام BLASTN باستخدام قاعدة بيانات تصنيف المحارات NCBI (القيمة e <1e-3 و90% تشابه)، وتم إجراء إخفاء تسلسل التعقيد المنخفض باستخدام DUST [26].قُسِّمت القراءات إلى مجموعتين: مرتبطة بتسلسلات ثنائيات الصدفة (تُسمى هنا القراءات الذاتية) وغير مرتبطة (قراءات غير ذاتية). جُمعت المجموعتان بشكل منفصل باستخدام برنامج MEGAHIT لتوليد قراءات متجاورة [27]. في الوقت نفسه، صُنِّف التوزيع التصنيفي لقراءات الميكروبيوم الغريب باستخدام برنامج Kraken2 [28]، ومثل بيانيًا بمخطط كرونا الدائري على برنامج Galaxy [29، 30]. حُدِّدت kmers المثالية بأنها kmers-59 من تجاربنا الأولية. تم بعد ذلك التعرف على المتجاورة الذاتية عن طريق المحاذاة مع BLASTN (قاعدة بيانات NCBI ثنائية الصدفة، قيمة e < 1e−10 و60% تشابه) للتعليق النهائي. تم بعد ذلك التعرف على المتجاورة الذاتية عن طريق المحاذاة مع BLASTN (قاعدة بيانات NCBI ثنائية الصدفة، قيمة e < 1e−10 و60% تشابه) للتعليق النهائي. تم تحديد هذه العناصر من خلال توافرها مع BLASTN (على أساس بيانات الرخويات الصناعية NCBI، بادئ ذي بدء <1e-10 و 60%) للتعليقات التوضيحية. تم بعد ذلك التعرف على الكائنات المتجاورة ذاتيا من خلال مطابقتها مع BLASTN (قاعدة بيانات NCBI للقشريات، قيمة e <1e-10 و60% تشابه) للتوضيح النهائي.BLASTN (الحصول على NCBI من NCBI، e < 1e-10 و 60٪) (مرحبًا بك) لا تقلق بشأن هذا الأمر.BLASTN (الحصول على NCBI من NCBI، e < 1e-10 و 60٪) تم بعد ذلك تحديد التفاصيل الشخصية للتعليقات التوضيحية النهائية للدعم مع BLASTN (قاعدة بيانات NCBI لـ BLASTN) двустволчатый моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). تم بعد ذلك التعرف على المتجاورة الذاتية للتعليق النهائي عن طريق مطابقتها مع BLASTN (قاعدة بيانات NCBI ثنائية المصراع، قيمة e <1e-10 و 60٪ تشابه). وبالتوازي مع ذلك، تم شرح مجموعات متجاورة غير ذاتية باستخدام BLASTN (قاعدة بيانات NCBI، قيمة e < 1e−10 وتماثل 60%). وبالتوازي مع ذلك، تم شرح مجموعات متجاورة غير ذاتية باستخدام BLASTN (قاعدة بيانات NCBI، قيمة e < 1e−10 وتماثل 60%). تم إضافة تعليقات على مجموعات الاتصال المتوازية باستخدام BLASTN (أساس بيانات NCBI، والتمييز e <1e-10 والتصنيف) 60%). وبالتوازي مع ذلك، تم شرح مجموعات متجاورة أجنبية باستخدام BLASTN (قاعدة بيانات NT NCBI، قيمة e <1e-10 و60% تشابه).تم اختباره بواسطة BLASTN (nt NCBI، e <1e-10 و60% من الـ NCBI).تم اختباره بواسطة BLASTN (nt NCBI، e <1e-10 و60% من الـ NCBI). العناصر المتوازية، التي لا ترتبط بالمجموعة الخاصة، والتي تم تعليقاتها باستخدام BLASTN (على أساس بيانات NCBI، بدءًا من <1e-10) والتصنيع 60٪). وبالتوازي مع ذلك، تم شرح مجموعات غير ذاتية متجاورة باستخدام BLASTN (قاعدة بيانات NCBI، قيمة e <1e-10 وتماثل 60٪). تم إجراء BLASTX أيضًا على contigs غير ذاتية باستخدام قواعد بيانات NCBI الخاصة بالبروتين nr وRefSeq (قيمة e < 1e−10 وتماثل 60٪). تم إجراء BLASTX أيضًا على contigs غير ذاتية باستخدام قواعد بيانات NCBI الخاصة بالبروتين nr وRefSeq (قيمة e < 1e−10 وتماثل 60٪). تم اختبار BLASTX أيضًا على مستندات غير متجانسة باستخدام أساس البيانات المرجعية رقم وRefSeq NCBI (الملاحظة e <1e-10 و تجانس 60٪). تم إجراء BLASTX أيضًا على contigs غير ذاتية باستخدام قواعد بيانات البروتين nr وRefSeq NCBI (قيمة e < 1e-10 و 60٪ تشابه).تم التحقق من ذلك من خلال RefSeq وNCBI من خلال اختبار BLASTX (e 1e-10 و60% ).تم التحقق من ذلك من خلال RefSeq وNCBI من خلال اختبار BLASTX (e 1e-10 و60% ). تم أيضًا استخدام BLASTX للمحتوى غير المتوافق مع الاستخدام على أساس البيانات الواردة رقم وRefSeq NCBI (الملاحظة e <1e-10 والتصنيع) 60%). تم إجراء BLASTX أيضًا على contigs غير ذاتية باستخدام قواعد بيانات البروتين nr وRefSeq NCBI (قيمة e <1e-10 و 60٪ تشابه).تمثل مجموعات BLASTN وBLASTX من الخلايا غير المتجاورة ذاتيًا الخلايا المتجاورة النهائية (انظر الملف التكميلي).
البادئات المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل مُدرجة في الجدول S1. استُخدم بوليميراز Taq DNA (Bio Basic Canada، ماركهام، أونتاريو) لتضخيم جينات ccfDNA المستهدفة. استُخدمت ظروف التفاعل التالية: تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، ثم 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، ثم درجة حرارة التلدين المُحددة لمدة دقيقة واحدة، ثم استطالة عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، ثم 35 دورة، وأخيراً 72 درجة مئوية خلال 10 دقائق. فُصلت نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل بالرحلان الكهربائي في هلام الأجاروز (1.5%) الذي يحتوي على صبغة جل الحمض النووي الآمن SYBRTM (Invitrogen، برلنغتون، أونتاريو، كندا) عند 95 فولت.
تم تأقلم بلح البحر (Mytilus spp.) في 500 مل من مياه البحر المؤكسجة (32 PSU) لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية. تمت إضافة DNA البلازميدي الذي يحتوي على ملحق يشفر تسلسل cDNA البشري galectin-7 (رقم وصول NCBI L07769) إلى القارورة بتركيز نهائي قدره 190 ميكروغرام/ميكرولتر. كانت بلح البحر التي تم تحضينها في نفس الظروف دون إضافة DNA هي المجموعة الضابطة. احتوى خزان التحكم الثالث على DNA بدون بلح البحر. لمراقبة جودة الحمض النووي في مياه البحر، تم أخذ عينات من مياه البحر (20 ميكرولتر؛ ثلاث تكرارات) من كل خزان في الوقت المحدد. لتتبع DNA البلازميدي، تم حصاد بلح البحر LB في الأوقات المحددة وتحليلها بواسطة qPCR وddPCR. نظرًا لارتفاع نسبة الملح في مياه البحر، تم تخفيف الأجزاء في مياه ذات جودة PCR (1:10) قبل جميع اختبارات PCR.
أُجري تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي للقطيرات (ddPCR) باستخدام بروتوكول BioRad QX200 (ميسيسوجا، أونتاريو، كندا). استُخدم ملف تعريف درجة الحرارة لتحديد درجة الحرارة المثلى (الجدول S1). وُلدّت القطرات باستخدام مُولّد قطرات QX200 (BioRad). أُجري تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي للقطيرات (ddPCR) على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، و50 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، ودرجة حرارة تلدين مُحددة لمدة دقيقة واحدة، و72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق، و90 درجة مئوية خلال 5 دقائق. قُيس عدد القطرات والتفاعلات الإيجابية (عدد النسخ/ميكرولتر) باستخدام قارئ قطرات QX200 (BioRad). رُفضت العينات التي تحتوي على أقل من 10,000 قطرة. لم يُجرَ التحكم في النمط في كل مرة أُجري فيها تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي.
أُجري تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) باستخدام Rotor-Gene® 3000 (شركة كوربيت للأبحاث، سيدني، أستراليا) وبادئات خاصة بـ LGALS7. أُجريت جميع تفاعلات البوليميراز المتسلسل الكمي في 20 ميكرولتر باستخدام مجموعة QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN). بدأ تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) بفترة حضانة لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 95 درجة مئوية، تلتها 40 دورة عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوانٍ، وعند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية، مع جمع بيانات واحد. وُجدت منحنيات الانصهار باستخدام قياسات متتالية عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوانٍ، وعند درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 60 ثانية، وعند درجة حرارة 97 درجة مئوية في نهاية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. أُجريت كل تفاعل بوليميراز متسلسل كمي (qPCR) في ثلاث نسخ، باستثناء عينات الضبط.
بما أن بلح البحر معروف بمعدل ترشيحه العالي، فقد بحثنا أولاً في قدرته على ترشيح وحفظ شظايا الحمض النووي الموجودة في مياه البحر. كما كنا مهتمين بمعرفة ما إذا كانت هذه الشظايا تتراكم في جهازه اللمفاوي شبه المفتوح. وقد حللنا هذه المسألة تجريبياً من خلال تتبع مصير شظايا الحمض النووي القابلة للذوبان المضافة إلى أحواض بلح البحر الأزرق. لتسهيل تتبع شظايا الحمض النووي، استخدمنا بلازميداً خارجياً (غير ذاتي) يحتوي على جين الجالكتين-7 البشري. يتتبع تفاعل البوليميراز المتسلسل الجزيئي (ddPCR) شظايا الحمض النووي البلازميدي في مياه البحر وبلح البحر. تُظهر نتائجنا أنه إذا ظلت كمية شظايا الحمض النووي في مياه البحر ثابتة نسبياً بمرور الوقت (حتى 7 أيام) في غياب بلح البحر، فإن هذا المستوى يختفي تماماً تقريباً في وجود بلح البحر خلال 8 ساعات (الشكل 1أ، ب). تم الكشف بسهولة عن شظايا الحمض النووي الخارجي خلال 15 دقيقة في السائل داخل الصمام واللمف الدموي (الشكل 1ج). ولا يزال من الممكن الكشف عن هذه الشظايا لمدة تصل إلى 4 ساعات بعد التعرض. يُضاهي نشاط الترشيح هذا فيما يتعلق بشظايا الحمض النووي نشاط الترشيح لدى البكتيريا والطحالب [31]. وتشير هذه النتائج إلى أن بلح البحر قادر على ترشيح الحمض النووي الغريب وتجميعه في حجراته السائلة.
التركيزات النسبية للحمض النووي البلازميدي في مياه البحر في وجود (أ) أو غياب (ب) بلح البحر، مُقاسة بتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل التكراري (ddPCR). في الحالة (أ)، تُعبّر النتائج عن النسب المئوية، حيث تُمثّل حدود المربعات النسبتين المئويتين 75 و25. يظهر المنحنى اللوغاريتمي المُطابق باللون الأحمر، وتُمثّل المنطقة المُظللة باللون الرمادي فاصل الثقة 95%. في الحالة (ب)، يُمثّل الخط الأحمر المتوسط، ويُمثّل الخط الأزرق فاصل الثقة 95% للتركيز. ج: تراكم الحمض النووي البلازميدي في السائل الدموي والصمامي لبلح البحر في أوقات مختلفة بعد إضافة الحمض النووي البلازميدي. تُعرض النتائج كعدد النسخ المُكتشفة/مل (±SE).
بعد ذلك، قمنا بالتحقيق في أصل ccfDNA في بلح البحر الذي تم جمعه من أحواض بلح البحر في جزر كيرغولين، وهي مجموعة جزر نائية ذات تأثير بشري محدود. ولهذا الغرض، تم عزل cccDNA من دملمف بلح البحر وتنقيته بالطرق المستخدمة عادة لتنقية cccDNA البشري [32، 33]. وجدنا أن متوسط ​​تركيزات ccfDNA في الدملمف في بلح البحر تقع في نطاق منخفض من الميكروجرام لكل مل من الدملمف (انظر الجدول S2، المعلومات التكميلية). هذا النطاق من التركيزات أكبر بكثير مما هو موجود في الأشخاص الأصحاء (نانوجرام منخفض لكل مليلتر)، ولكن في حالات نادرة، في مرضى السرطان، يمكن أن يصل مستوى ccfDNA إلى عدة ميكروجرامات لكل مليلتر [34، 35]. أظهر تحليل توزيع حجم ccfDNA في الدملمف أن هذه الشظايا تختلف اختلافًا كبيرًا في الحجم، حيث تتراوح من 1000 زوج قاعدي إلى 1000 زوج قاعدي. حتى 5000 زوج قاعدي (الشكل 2). تم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام مجموعة QIAamp Investigator Kit القائمة على السيليكا، وهي طريقة شائعة الاستخدام في الطب الشرعي لعزل وتنقية الحمض النووي الجينومي بسرعة من عينات الحمض النووي منخفضة التركيز، بما في ذلك ccfDNA [36].
مخطط كهربائي تمثيلي لـ ccfDNA في الدملمف في بلح البحر. استُخرج باستخدام طقم NucleoSnap Plasma Kit (أعلى) وطقم QIAamp DNA Investigator Kit. رسم بياني على شكل كمان يُظهر توزيع تركيزات ccfDNA في الدملمف (±SE) في بلح البحر. يُمثل الخطان الأسود والأحمر المتوسط ​​والربعين الأول والثالث على التوالي.
حوالي 1% من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (ccfDNA) لدى البشر والرئيسيات له مصدر خارجي [21، 37]. ونظرًا للجهاز الدوري شبه المفتوح لدى ذوات الصدفتين، ومياه البحر الغنية بالميكروبات، والتوزيع الحجمي للحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (ccfDNA) في بلح البحر، افترضنا أن الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (ccfDNA) في دم بلح البحر قد يحتوي على مجموعة غنية ومتنوعة من الحمض النووي الميكروبي. لاختبار هذه الفرضية، قمنا بتسلسل الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (ccfDNA) في دم بلح البحر من عينات من فطر أولاكوميا أترا جُمعت من جزر كيرغولين، وحصلنا على أكثر من 10 ملايين قراءة، اجتاز 97.6% منها اختبار مراقبة الجودة. ثم صُنفت القراءات وفقًا للمصادر الذاتية وغير الذاتية باستخدام قاعدتي بيانات BLASTN وNCBI للذوات الصدفتين (الشكل S1، معلومات تكميلية).
في البشر، يمكن إطلاق كل من الحمض النووي النووي والميتوكوندري في مجرى الدم [38]. ومع ذلك، في الدراسة الحالية، لم يكن من الممكن وصف الحمض النووي الجينومي النووي لبلح البحر بالتفصيل، نظرًا لعدم تسلسل جينوم A. atra أو وصفه. ومع ذلك، تمكنا من تحديد عدد من شظايا ccfDNA من أصلنا باستخدام مكتبة ثنائيات الصدفة (الشكل S2، معلومات تكميلية). كما أكدنا وجود شظايا الحمض النووي من أصلنا عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الموجه لجينات A. atra التي تم تسلسلها (الشكل 3). وبالمثل، نظرًا لأن جينوم الميتوكوندريا لـ A. atra متاح في قواعد البيانات العامة، يمكن للمرء أن يجد دليلاً على وجود شظايا ccfDNA للميتوكوندريا في الدملمف لـ A. atra. تم تأكيد وجود شظايا الحمض النووي للميتوكوندريا عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (الشكل 3).
وُجدت جينات ميتوكوندريا مختلفة في السائل اللمفاوي لـ A. atra (النقاط الحمراء - رقم المخزون: SRX5705969) وM. platensis (النقاط الزرقاء - رقم المخزون: SRX5705968) بعد تضخيمه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). الشكل مُقتبس من Breton et al., 2011 B. تضخيم السائل اللمفاوي العلوي من A. atra. مُخزّن على ورق FTA. استخدم مثقابًا بقطر 3 مم لإضافته مباشرةً إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يحتوي على خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل.
نظرًا لوفرة المحتوى الميكروبي في مياه البحر، ركزنا في البداية على توصيف تسلسلات الحمض النووي الميكروبية في الدملمف. وللقيام بذلك، استخدمنا استراتيجيتين مختلفتين. استخدمت الاستراتيجية الأولى Kraken2، وهو برنامج تصنيف تسلسل قائم على الخوارزمية يمكنه تحديد التسلسلات الميكروبية بدقة تضاهي BLAST وأدوات أخرى [28]. تم تحديد أكثر من 6719 قراءة على أنها من أصل بكتيري، بينما كانت 124 و64 من العتائق والفيروسات، على التوالي (الشكل 4). كانت أكثر شظايا الحمض النووي البكتيري وفرة هي Firmicutes (46٪) و Proteobacteria (27٪) و Bacteroidetes (17٪) (الشكل 4 أ). يتوافق هذا التوزيع مع الدراسات السابقة لميكروبيوم بلح البحر الأزرق البحري [39، 40]. كانت Gammaproteobacteria هي الفئة الرئيسية من Proteobacteria (44٪)، بما في ذلك العديد من Vibrionales (الشكل 4 ب). أكدت طريقة ddPCR وجود شظايا من الحمض النووي لبكتيريا الضمة في الحمض النووي ccfDNA لدم لمف A. atra (الشكل 4ج) [41]. وللحصول على مزيد من المعلومات حول أصل البكتيريا في الحمض النووي ccfDNA، اتُخذ نهج إضافي (الشكل S2، معلومات تكميلية). في هذه الحالة، تم تجميع القراءات المتداخلة كقراءات ذات نهايتين مقترنتين وتم تصنيفها على أنها من أصل ذاتي (ذوات الصدفتين) أو غير ذاتي باستخدام BLASTN وقيمة e 1e−3 ونقطة قطع مع تشابه >90%. في هذه الحالة، تم تجميع القراءات المتداخلة كقراءات ذات نهايتين مقترنتين وتم تصنيفها على أنها من أصل ذاتي (ذوات الصدفتين) أو غير ذاتي باستخدام BLASTN وقيمة e 1e−3 ونقطة قطع مع تشابه >90%. في هذه الحالة، تم تحسين المعلومات كمعلومات عن خلاصات الشراكة وتم تصنيفها كأشياء (الرخويات الصناعية) أو حشوة السمك باستخدام BLASTN و значения e 1e-3 و отсечения с гомологией> 90%. في هذه الحالة، تم جمع القراءات المتداخلة كقراءات ذات نهايات مزدوجة وتم تصنيفها على أنها أصلية (ثنائية المصراع) أو غير أصلية باستخدام BLASTN وقيمة e 1e-3 والقطع مع تشابه >90%.قد يكون من الصعب الحصول على أفضل النتائج، بما في ذلك BLASTN و1e-3 的e و>90% يمكن أن تكون هذه هي المرة الأولى التي يحدث فيها هذا الأمر.يمكن أن تكون هذه هي المرة الأولى التي يتم فيها استخدام هذه التقنية، حيث يتم تشغيلها من قبل شركة Blastn و 1e-3 的 的 值و> 90% من نسبة النجاح في التخفيضات (النسبة المئوية) هي 12. في هذه الحالة، تم تحسين المعرفة كتعلم من خلال ملخصات المحادثات والتصنيفات مثل الأشياء (الرخويات الصناعية) أو غير الضرورية للتكاثر مع استخدام الصنف e BLASTN و 1e-3 و порога гомологии> 90%. في هذه الحالة، تم جمع القراءات المتداخلة كقراءات ذات نهايات مزدوجة وتصنيفها على أنها خاصة (ذوات الصدفتين) أو غير أصلية باستخدام قيم e BLASTN و1e-3 وعتبة التماثل >90%.بما أن جينوم A. atra لم يُسلسل بعد، فقد استخدمنا استراتيجية التجميع الجديدة لبرنامج تجميع تسلسل الجيل التالي (NGS) من شركة MEGAHIT. تم تحديد ما مجموعه 147,188 وحدة متجاورة على أنها تابعة (ثنائيات المصراع) من حيث الأصل. ثم فُجّرت هذه الوحدات المتجاورة بقيم e-1e-10 باستخدام BLASTN وBLASTX. أتاحت لنا هذه الاستراتيجية تحديد 482 قطعة غير ثنائية المصراع موجودة في الحمض النووي ccfDNA لـ A. atra. تم الحصول على أكثر من نصف (57%) قطع الحمض النووي هذه من البكتيريا، وخاصةً من الكائنات المتكافلة الخيشومية، بما في ذلك الكائنات المتكافلة الكبريتية، ومن الكائنات المتكافلة الخيشومية Solemya velum (الشكل 5).
الوفرة النسبية على مستوى النوع. ب. التنوع الميكروبي لشعبتين رئيسيتين (Firmicutes وProteobacteria). تضخيم تمثيلي لـ ddPCR. ج. Vibrio spp. أ. شظايا من جين 16S rRNA (أزرق) في ثلاثة لمفات دموية أترا.
تم تحليل ما مجموعه 482 من عينات الجينوم المتجاورة. لمحة عامة عن التوزيع التصنيفي لتعليقات الجينوم المتجاورة (بدائيات النوى وحقيقيات النوى). ب. التوزيع التفصيلي لشظايا الحمض النووي البكتيري التي تم تحديدها بواسطة BLASTN وBLASTX.
أظهر تحليل Kraken2 أيضًا أن الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين الموجود في بلح البحر يحتوي على شظايا الحمض النووي القديمة، بما في ذلك شظايا الحمض النووي من Euryarchaeota (65٪) و Crenarchaeota (24٪) و Thaurmarcheota (11٪) (الشكل 6أ). لا ينبغي أن يكون وجود شظايا الحمض النووي المشتقة من Euryarchaeota و Crenarchaeota، والتي تم العثور عليها سابقًا في المجتمع الميكروبي لبلح البحر الكاليفورني، مفاجئًا [42]. على الرغم من أن Euryarchaeota غالبًا ما ترتبط بالظروف القاسية، إلا أنه من المعترف به الآن أن كلاً من Euryarchaeota و Crenarcheota من بين أكثر بدائيات النوى شيوعًا في البيئة البحرية المبردة [43، 44]. إن وجود الكائنات الحية الدقيقة المولدة للميثان في بلح البحر ليس مفاجئًا، نظرًا للتقارير الأخيرة عن تسربات الميثان واسعة النطاق من التسربات القاعية على هضبة كيرغولين [45] والإنتاج الميكروبي المحتمل للميثان الذي لوحظ قبالة ساحل جزر كيرغولين [46].
انتقل اهتمامنا بعد ذلك إلى قراءات من فيروسات الحمض النووي. وعلى حد علمنا، تُعد هذه أول دراسة خارج الهدف لمحتوى الفيروس في بلح البحر. وكما هو متوقع، وجدنا شظايا من الحمض النووي للعاثيات (Caudovirales) (الشكل 6ب). ومع ذلك، فإن الحمض النووي الفيروسي الأكثر شيوعًا يأتي من شعبة من الفيروسات النووية، والمعروفة أيضًا باسم فيروس الحمض النووي السيتوبلازمي الكبير (NCLDV)، والتي تحتوي على أكبر جينوم من أي فيروس. تنتمي معظم تسلسلات الحمض النووي داخل هذه الشعبة إلى عائلات Mimimidoviridae (58٪) و Poxviridae (21٪)، والتي تشمل عوائلها الطبيعية الفقاريات والمفصليات، بينما تنتمي نسبة صغيرة من تسلسلات الحمض النووي هذه إلى الطحالب الفيروسية المعروفة. يصيب الطحالب البحرية حقيقية النواة. تم الحصول على التسلسلات أيضًا من فيروس باندورا، وهو الفيروس العملاق ذو أكبر حجم جينوم من أي جنس فيروسي معروف. من المثير للاهتمام أن نطاق العوائل المعروف إصابتها بالفيروس، كما تم تحديده من خلال تسلسل الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين للهيموليمف، كان واسعًا نسبيًا (الشكل S3، معلومات تكميلية). ويشمل ذلك فيروسات تصيب الحشرات مثل فيروسات العصوية (Baculoviridae) وفيروسات القزحية (Iridoviridae)، بالإضافة إلى فيروسات تصيب الأميبا والطحالب والفقاريات. كما وجدنا تسلسلات مطابقة لجينوم فيروس بيثوفيروس سيبيريكوم (Pithovirus sibericum). عُزلت فيروسات بيثو (المعروفة أيضًا باسم "فيروسات الزومبي") لأول مرة من التربة الصقيعية التي يبلغ عمرها 30,000 عام في سيبيريا [47]. وبالتالي، تتوافق نتائجنا مع التقارير السابقة التي تُظهر أن ليست جميع الأنواع الحديثة من هذه الفيروسات منقرضة [48]، وأن هذه الفيروسات قد تكون موجودة في النظم البيئية البحرية شبه القطبية النائية.
أخيرًا، أجرينا اختبارًا لمعرفة ما إذا كان بإمكاننا العثور على شظايا الحمض النووي من حيوانات متعددة الخلايا أخرى. تم التعرف على ما مجموعه 482 وحدة متجاورة غريبة بواسطة BLASTN وBLASTX باستخدام مكتبات nt وnr وRefSeq (الجينوم والبروتين). تُظهر نتائجنا أن الحمض النووي العظمي هو السائد بين الشظايا الغريبة من ccfDNA للحيوانات متعددة الخلايا (الشكل 5). كما عُثر على شظايا الحمض النووي من الحشرات وأنواع أخرى. لم يتم التعرف على جزء كبير نسبيًا من شظايا الحمض النووي، ربما بسبب نقص تمثيل عدد كبير من الأنواع البحرية في قواعد البيانات الجينومية مقارنةً بالأنواع البرية [49].
في هذه الورقة البحثية، نُطبّق مفهوم اللمف الدموي (LB) على بلح البحر، مُجادلين بأنّ تسلسل طلقات ccfDNA في الدملمف يُمكن أن يُوفر فهمًا أعمق لتركيب النظم البيئية الساحلية البحرية. على وجه الخصوص، وجدنا أن: 1) اللمف الدموي في بلح البحر يحتوي على تركيزات عالية نسبيًا (بمستويات ميكروغرام) من شظايا الحمض النووي الكبيرة نسبيًا (~1-5 كيلو قاعدة) المنتشرة؛ 2) هذه الشظايا مستقلة وغير مستقلة. 3) من بين المصادر الخارجية لهذه الشظايا، وجدنا الحمض النووي البكتيري والعتيق والفيروسي، بالإضافة إلى الحمض النووي لحيوانات متعددة الخلايا أخرى؛ 4) يحدث تراكم شظايا ccfDNA الغريبة هذه في الدملمف بسرعة، ويُساهم في نشاط الترشيح الداخلي لبلح البحر. في الختام، تُبيّن دراستنا أن مفهوم اللمف الدموي، الذي طُبّق حتى الآن بشكل رئيسي في مجال الطب الحيوي، يُشفّر مصدرًا غنيًا، وإن كان غير مُستكشف، للمعرفة يُمكن استخدامه لفهم التفاعل بين الأنواع الحارسة وبيئتها بشكل أفضل.
بالإضافة إلى الرئيسيات، تم الإبلاغ عن عزل ccfDNA في الثدييات، بما في ذلك الفئران والكلاب والقطط والخيول [50، 51، 52]. ومع ذلك، وعلى حد علمنا، فإن دراستنا هي الأولى التي تبلغ عن اكتشاف وتسلسل ccfDNA في الأنواع البحرية ذات نظام الدورة الدموية المفتوح. قد تفسر هذه السمة التشريحية وقدرتها على الترشيح لدى بلح البحر، جزئيًا على الأقل، اختلاف خصائص حجم شظايا الحمض النووي المتداولة مقارنةً بالأنواع الأخرى. في البشر، تكون معظم شظايا الحمض النووي المتداولة في الدم شظايا صغيرة تتراوح في الحجم من 150 إلى 200 زوج قاعدي، ويبلغ أقصى ذروة لها 167 زوج قاعدي [34، 53]. يتراوح حجم جزء صغير ولكنه مهم من شظايا الحمض النووي بين 300 و500 زوج قاعدي، وحوالي 5% منها أطول من 900 زوج قاعدي. [54]. السبب وراء هذا التوزيع الحجمي هو أن المصدر الرئيسي لـ ccfDNA في البلازما يحدث نتيجة لموت الخلايا، إما بسبب موت الخلايا أو بسبب نخر الخلايا المكونة للدم المنتشرة في الأفراد الأصحاء أو بسبب موت الخلايا السرطانية في مرضى السرطان (المعروف باسم الحمض النووي للورم المتداول). ، ctDNA). تراوح توزيع حجم ccfDNA الدموي الذي وجدناه في بلح البحر من 1000 إلى 5000 زوج قاعدي، مما يشير إلى أن ccfDNA في بلح البحر له أصل مختلف. هذه فرضية منطقية، لأن بلح البحر لديه نظام وعائي شبه مفتوح ويعيش في بيئات مائية بحرية تحتوي على تركيزات عالية من الحمض النووي الجينومي الميكروبي. في الواقع، أظهرت تجاربنا المعملية باستخدام الحمض النووي الخارجي أن بلح البحر يجمع شظايا الحمض النووي في مياه البحر، على الأقل بعد بضع ساعات تتحلل بعد الامتصاص الخلوي و/أو يتم إطلاقها و/أو تخزينها في منظمات مختلفة. نظرًا لندرة الخلايا (سواءً بدائية أو حقيقية النواة)، فإن استخدام الحجيرات داخل الصمامات سيقلل من كمية الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (ccfDNA) من مصادر ذاتية، وكذلك من مصادر خارجية. ونظرًا لأهمية المناعة الفطرية لدى ثنائيات الصدفة والعدد الكبير من الخلايا البلعمية الدائرية، افترضنا أيضًا أن الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (ccfDNA) الغريب غنيٌّ أيضًا بالخلايا البلعمية الدائرية التي تُراكم الحمض النووي الغريب عند ابتلاع الكائنات الدقيقة و/أو المخلفات الخلوية. وتُظهر نتائجنا مجتمعةً أن الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (ccfDNA) في الدم اللمفي ثنائيات الصدفة يُمثل مخزنًا فريدًا للمعلومات الجزيئية، ويعزز مكانتها كنوعٍ مراقب.
تشير بياناتنا إلى أن تسلسل وتحليل شظايا الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (ccfDNA) المشتقة من الدملمف البكتيري يمكن أن يوفر معلومات أساسية عن النباتات البكتيرية المضيفة والبكتيريا الموجودة في النظام البيئي البحري المحيط. وقد كشفت تقنيات تسلسل اللقطة عن تسلسلات للبكتيريا المتعايشة A. atra gill التي كان من الممكن إغفالها لو استُخدمت طرق تحديد الحمض النووي الريبوزي الريبوزي 16S التقليدية، ويعزى ذلك جزئيًا إلى تحيز مكتبة المراجع. في الواقع، أظهر استخدامنا لبيانات LB التي جُمعت من M. platensis في نفس طبقة بلح البحر في كيرغولين أن تكوين المتعايشات البكتيرية المرتبطة بالخياشيم كان هو نفسه لكلا نوعي بلح البحر (الشكل S4، معلومات تكميلية). قد يعكس هذا التشابه بين نوعين مختلفين وراثيًا من بلح البحر تكوين المجتمعات البكتيرية في الرواسب الباردة والكبريتية والبركانية في كيرغولين [55، 56، 57، 58]. وُصفت مستويات أعلى من الكائنات الدقيقة المختزلة للكبريت بشكل جيد عند حصاد بلح البحر من المناطق الساحلية المضطربة بيولوجيًا [59]، مثل ساحل بورت أو فرانس. ومن الاحتمالات الأخرى تأثر نباتات بلح البحر المتعايشة بالانتقال الأفقي [60، 61]. هناك حاجة إلى مزيد من البحث لتحديد العلاقة بين البيئة البحرية وسطح قاع البحر وتركيب البكتيريا التكافلية في بلح البحر. وهذه الدراسات جارية حاليًا.
يُعد طول وتركيز الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (ccfDNA) للهيموليمف، وسهولة تنقيته، وجودته العالية التي تسمح بالتسلسل السريع للجينومات، من بين المزايا العديدة لاستخدام الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (ccfDNA) في بلح البحر لتقييم التنوع البيولوجي في النظم البيئية الساحلية البحرية. يُعد هذا النهج فعالاً بشكل خاص في توصيف المجتمعات الفيروسية (الفيروسات) في نظام بيئي معين [62، 63]. على عكس البكتيريا والعتائق وحقيقيات النوى، لا تحتوي الجينومات الفيروسية على جينات محفوظة وراثيًا مثل تسلسلات 16S. تشير نتائجنا إلى أنه يمكن استخدام الخزعات السائلة من الأنواع الدالة، مثل بلح البحر، لتحديد أعداد كبيرة نسبيًا من شظايا فيروس ccfDNA المعروفة بإصابة العوائل التي تعيش عادةً في النظم البيئية البحرية الساحلية. ويشمل ذلك الفيروسات المعروفة بإصابة الأوليات والمفصليات والحشرات والنباتات والفيروسات البكتيرية (مثل العاثيات). تم العثور على توزيع مماثل عندما فحصنا فيروم ccfDNA الدموي لبلح البحر الأزرق (M. platensis) الذي تم جمعه في نفس طبقة بلح البحر في Kerguelen (الجدول S2، معلومات تكميلية). إن تسلسل Shotgun لـ ccfDNA هو بالفعل نهج جديد يكتسب زخمًا في دراسة فيروم البشر أو الأنواع الأخرى [21، 37، 64]. هذا النهج مفيد بشكل خاص لدراسة فيروسات الحمض النووي مزدوج السلسلة، حيث لا يوجد جين واحد محفوظ بين جميع فيروسات الحمض النووي مزدوج السلسلة، والتي تمثل الفئة الأكثر تنوعًا واتساعًا من الفيروسات في بالتيمور [65]. على الرغم من أن معظم هذه الفيروسات لا تزال غير مصنفة وقد تشمل فيروسات من جزء غير معروف تمامًا من عالم الفيروسات [66]، فقد وجدنا أن الفيروسات ونطاقات العوائل لبلح البحر A. atra وM. platensis تقع بين النوعين. على نحو مماثل (انظر الشكل S3، معلومات إضافية). هذا التشابه ليس مفاجئًا، لأنه قد يعكس نقصًا في الانتقائية في امتصاص الحمض النووي الموجود في البيئة. هناك حاجة حاليًا إلى دراسات مستقبلية باستخدام الحمض النووي الريبي المنقى لتوصيف فيروم الحمض النووي الريبي.
في دراستنا، استخدمنا خط أنابيب دقيقًا للغاية مقتبسًا من عمل Kowarski وزملائه [37]، الذين استخدموا حذفًا من خطوتين للقراءات المجمعة والكونتيج قبل وبعد تجميع ccfDNA الأصلي، مما أدى إلى نسبة عالية من القراءات غير المرسومة. لذلك، لا يمكننا استبعاد أن بعض هذه القراءات غير المرسومة قد يكون لها أصلها الخاص، وذلك في المقام الأول لأننا لا نملك جينومًا مرجعيًا لهذا النوع من بلح البحر. كما استخدمنا خط الأنابيب هذا لأننا كنا قلقين بشأن الكيميرا بين القراءات الذاتية وغير الذاتية وأطوال القراءات التي تولدها Illumina MiSeq PE75. سبب آخر لغالبية القراءات غير المرسومة هو أن الكثير من الميكروبات البحرية، وخاصة في المناطق النائية مثل Kerguelen، لم يتم شرحها. استخدمنا Illumina MiSeq PE75، بافتراض أن أطوال شظايا ccfDNA مماثلة لأطوال ccfDNA البشرية. بالنسبة للدراسات المستقبلية، ونظرًا لنتائجنا التي تُظهر أن قراءات الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (ccfDNA) في الدملمف أطول من تلك الموجودة لدى البشر و/أو الثدييات، نوصي باستخدام منصة تسلسل أكثر ملاءمة لشظايا الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين الأطول. ستُسهّل هذه الممارسة تحديد المزيد من المؤشرات لإجراء تحليلات أعمق. كما أن الحصول على تسلسل الجينوم النووي الكامل غير المتوفر حاليًا لـ A. atra سيُسهّل بشكل كبير تمييز الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (ccfDNA) من المصادر الذاتية وغير الذاتية. ونظرًا لتركيز بحثنا على إمكانية تطبيق مفهوم الخزعة السائلة على بلح البحر، نأمل أنه مع استخدام هذا المفهوم في الأبحاث المستقبلية، سيتم تطوير أدوات وخطوط أنابيب جديدة لزيادة إمكانات هذه الطريقة لدراسة التنوع الميكروبي في النظام البيئي البحري لبلح البحر.
كمؤشر حيوي سريري غير جراحي، ترتبط مستويات بلازما الدم البشرية المرتفعة من ccfDNA بأمراض مختلفة، وتلف الأنسجة، وحالات الإجهاد [67، 68، 69]. يرتبط هذا الارتفاع بإطلاق شظايا الحمض النووي من أصلها بعد تلف الأنسجة. تناولنا هذه المشكلة باستخدام الإجهاد الحراري الحاد، حيث تعرض بلح البحر لفترة وجيزة لدرجة حرارة 30 درجة مئوية. أجرينا هذا التحليل على ثلاثة أنواع مختلفة من بلح البحر في ثلاث تجارب مستقلة. ومع ذلك، لم نجد أي تغيير في مستويات ccfDNA بعد الإجهاد الحراري الحاد (انظر الشكل S5، معلومات إضافية). قد يفسر هذا الاكتشاف، جزئيًا على الأقل، حقيقة أن بلح البحر لديه جهاز دوري شبه مفتوح ويتراكم فيه كميات كبيرة من الحمض النووي الغريب بسبب نشاطه الترشيحي العالي. من ناحية أخرى، قد يكون بلح البحر، مثل العديد من اللافقاريات، أكثر مقاومة لتلف الأنسجة الناجم عن الإجهاد، مما يحد من إطلاق ccfDNA في الدم اللمفاوي [70، 71].
حتى الآن، ركز تحليل الحمض النووي للتنوع البيولوجي في النظم البيئية المائية بشكل أساسي على الترميز الميتابولي للحمض النووي البيئي (eDNA). ومع ذلك، عادةً ما تكون هذه الطريقة محدودة في تحليل التنوع البيولوجي عند استخدام البادئات. يتغلب استخدام تسلسل البندقية على قيود تفاعل البوليميراز المتسلسل والاختيار المتحيز لمجموعات البادئات. وبالتالي، فإن طريقتنا أقرب إلى طريقة تسلسل البندقية عالية الإنتاجية المستخدمة مؤخرًا، والتي يمكنها تسلسل الحمض النووي المجزأ مباشرةً وتحليل جميع الكائنات الحية تقريبًا [72، 73]. ومع ذلك، هناك عدد من القضايا الأساسية التي تميز LB عن طرق eDNA القياسية. بالطبع، يتمثل الاختلاف الرئيسي بين eDNA و LB في استخدام عوائل الترشيح الطبيعية. وقد تم الإبلاغ عن استخدام الأنواع البحرية مثل الإسفنج والرخويات (Dresseina spp.) كمرشح طبيعي لدراسة eDNA [74، 75]. ومع ذلك، استخدمت دراسة دريسينا خزعات الأنسجة التي تم استخراج الحمض النووي منها. لا يتطلب تحليل ccfDNA من LB خزعة نسيجية، أو معدات متخصصة، بل باهظة الثمن أحيانًا، أو إجراءات لوجستية مرتبطة بـ eDNA أو خزعة الأنسجة. في الواقع، أفدنا مؤخرًا بإمكانية تخزين ccfDNA من LB وتحليله بدعم من FTA دون الحاجة إلى سلسلة تبريد، وهو ما يمثل تحديًا كبيرًا للأبحاث في المناطق النائية [76]. كما أن استخراج ccfDNA من الخزعات السائلة بسيط، ويوفر حمضًا نوويًا عالي الجودة لتسلسل البندقية وتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تُعد هذه ميزة كبيرة بالنظر إلى بعض القيود التقنية المرتبطة بتحليل eDNA [77]. كما أن بساطة وانخفاض تكلفة طريقة أخذ العينات مناسبان بشكل خاص لبرامج المراقبة طويلة المدى. بالإضافة إلى قدرتها العالية على الترشيح، فإن من السمات المعروفة الأخرى للرخويات ثنائية المصراع تركيبها الكيميائي متعدد السكاريد المخاطي في مخاطها، مما يعزز امتصاص الفيروسات [78، 79]. وهذا يجعل الرخويات ثنائية المصراع مرشحًا طبيعيًا مثاليًا لتوصيف التنوع البيولوجي وتأثير تغير المناخ في نظام بيئي مائي معين. على الرغم من أن وجود شظايا الحمض النووي المشتقة من العائل يمكن اعتباره قيدًا على الطريقة مقارنةً بالحمض النووي البيئي، فإن التكلفة المرتبطة بوجود مثل هذا الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين الأصلي مقارنةً بالحمض النووي البيئي مفهومة في الوقت نفسه نظرًا للكم الهائل من المعلومات المتاحة للدراسات الصحية. مضيف مُزاح. يتضمن ذلك وجود تسلسلات فيروسية مدمجة في جينوم العائل. وهذا مهم بشكل خاص بالنسبة لبلح البحر، نظرًا لوجود فيروسات رجعية لسرطان الدم تنتقل أفقيًا في ذوات الصدفتين [80، 81]. ومن مزايا LB الأخرى على الحمض النووي البيئي أنها تستغل النشاط البلعمي لخلايا الدم المتداولة في الدملمف، الذي يلتهم الكائنات الحية الدقيقة (وجينوماتها). البلعمة هي الوظيفة الرئيسية لخلايا الدم في ذوات الصدفتين [82]. أخيرًا، تستفيد هذه الطريقة من قدرة الترشيح العالية لبلح البحر (بمعدل 1.5 لتر/ساعة من مياه البحر) ودورانها لمدة يومين، مما يزيد من اختلاط طبقات مياه البحر المختلفة، مما يسمح بالتقاط الحمض النووي البيئي غير المتجانس. [83، 84]. وبالتالي، يُعد تحليل الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (ccfDNA) لبلح البحر وسيلةً مثيرةً للاهتمام نظرًا للتأثيرات الغذائية والاقتصادية والبيئية لبلح البحر. وعلى غرار تحليل LB المُجمع من البشر، تفتح هذه الطريقة أيضًا إمكانية قياس التغيرات الجينية والوراثية في الحمض النووي للمضيف استجابةً لمواد خارجية. على سبيل المثال، يمكن تصور تقنيات التسلسل من الجيل الثالث لإجراء تحليل مثيلة على مستوى الجينوم في الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين الأصلي باستخدام تسلسل النانوبور. يجب تسهيل هذه العملية من خلال حقيقة أن طول شظايا ccfDNA الخاصة ببلح البحر متوافق بشكل مثالي مع منصات التسلسل طويلة القراءة التي تسمح بتحليل مثيلة الحمض النووي على مستوى الجينوم من عملية تسلسل واحدة دون الحاجة إلى التحولات الكيميائية.85،86] وهذا احتمال مثير للاهتمام، حيث ثبت أن أنماط مثيلة الحمض النووي تعكس استجابة للإجهاد البيئي وتستمر لأجيال عديدة. لذلك، يمكن أن توفر نظرة ثاقبة قيمة في الآليات الأساسية التي تحكم الاستجابة بعد التعرض لتغير المناخ أو الملوثات [87]. ومع ذلك، فإن استخدام LB ليس بدون قيود. وغني عن القول أن هذا يتطلب وجود أنواع مؤشرة في النظام البيئي. وكما ذكر أعلاه، فإن استخدام LB لتقييم التنوع البيولوجي لنظام بيئي معين يتطلب أيضًا خط أنابيب معلوماتية حيوية صارم يأخذ في الاعتبار وجود شظايا الحمض النووي من المصدر. وهناك مشكلة رئيسية أخرى تتمثل في توافر الجينومات المرجعية للأنواع البحرية. من المأمول أن تُسهّل مبادرات مثل مشروع جينومات الثدييات البحرية ومشروع Fish10k المُنشأ حديثًا [88] إجراء مثل هذا التحليل في المستقبل. كما أن تطبيق مفهوم LB على الكائنات البحرية التي تتغذى بالترشيح يتوافق مع أحدث التطورات في تقنية التسلسل، مما يجعله مناسبًا تمامًا لتطوير المؤشرات الحيوية متعددة الأوم لتوفير معلومات مهمة حول صحة الموائل البحرية استجابةً للإجهاد البيئي.
تم إيداع بيانات تسلسل الجينوم في أرشيف قراءة التسلسل التابع للمركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 ضمن Bioprojects SRR8924808.
برييرلي أ.س، كينغسفورد م.ج. تأثير تغير المناخ على الحياة البحرية والنظم البيئية. كول بيولوجي. 2009؛ 19: ص.602-ص.614.
جيسي إي، مانيا إي، مازاريس إيه دي، فراشتي إس، ألمبانيدو ف، بيفيلاكوا إس، وآخرون. دراسة التأثيرات المشتركة لتغير المناخ والضغوطات المحلية الأخرى على البيئة البحرية. البيئة العلمية العامة. ٢٠٢١؛ ٧٥٥: ١٤٢-٥٦٤.
كاريلا إف، أنتوفيرمو إي، فارينا إس، سالاتي إف، مانداس د، برادو بي، وآخرون. ). علوم الأول من مارس. 2020;7:48.
سيرونت ل، نيكاسترو س.ر، زاردي ج.ي، جوبيرفيل إي. انخفاض تحمل الحرارة في ظل ظروف الإجهاد الحراري المتكررة يُفسر ارتفاع معدل نفوق بلح البحر الأزرق في الصيف. تقرير علمي 2019؛ 9:17498.
فاي إس بي، سيبيلسكي إيه إم، نوسل إس، سيرفانتس-يوشيدا كيه، هوان جيه إل، هوبر إي آر، وآخرون. التغيرات الحديثة في وتيرة وأسباب ومدى نفوق الحيوانات. وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم، الولايات المتحدة الأمريكية. 2015؛ 112: 1083-8.
سكاربا إف، سانا د، أزينا الأول، موغيتي د، شيروتي إف، حسيني إس، وآخرون. ربما تسببت مسببات الأمراض المتعددة غير الخاصة بالأنواع في حدوث وفيات جماعية لطيور Pinna nobilis. حياة. 2020;10:238.
برادلي م، كوتس س.ج، جينكينز إي، أوهارا ت.م. التأثير المحتمل لتغير المناخ على الأمراض الحيوانية المنشأ في القطب الشمالي. المجلة الدولية للصحة القطبية. 2005؛ 64: 468-77.
باير جيه، غرين إن دبليو، بروكس إس، آلان آي جيه، روس إيه، جوميز تي وآخرون. بلح البحر الأزرق (Mytilus edulis spp.) ككائنات حية مؤشرة في رصد التلوث الساحلي: مراجعة. مجلة بحوث البيئة مارس ٢٠١٧؛ ١٣٠: ٣٣٨-٦٥.
سيرافينيا ج، مارسوني س، سيينا س، بارديلي أ. دمج الخزعة السائلة في علاج السرطان. مجلة نات ريف كلين أونكولوجي. 2017؛ 14: 531-48.
وان جيه سي إم، ماسي سي، جارسيا-كورباتشو جيه، موليير إف، برينتون جيه دي، كالداس سي، وآخرون. نضج الخزعة السائلة: يسمح لدورة الحمض النووي للورم. المجلة الوطنية للسرطان. ٢٠١٧؛ ١٧: ٢٢٣-٣٨.
ماندل ب.، ميتايس ب.، الأحماض النووية في بلازما الإنسان. محاضر اجتماعات الشركات التابعة لشركة سوسي بيول. ١٩٤٨؛ ١٤٢: ٢٤١-٣.
برونكهورست إيه جيه، أنغيرر دبليو، هولدنريدر إس. دور جديد للحمض النووي الخالي من الخلايا كعلامة جزيئية لعلاج السرطان. تحديد كمية التحليل البيومولاري. ٢٠١٩؛ ١٧:١٠٠٠٨٧.
إغناتياديس م.، سليدج ج. و.، جيفري س. س. خزعة السوائل تدخل العيادة - مشاكل التنفيذ والتحديات المستقبلية. المجلة الوطنية لأمراض الأورام السريرية. 2021؛ 18: 297-312.
لو واي إم، كوربيتا ن، تشامبرلين بي إف، راي دبليو، سارجنت آي إل، ريدمان سي دبليو وآخرون. الحمض النووي للجنين موجود في بلازما ومصل الأم. لانسيت. ١٩٩٧؛ ٣٥٠: ٤٨٥-٧.
موفاراي إم إن، وونغ آر جيه، شو جي إم، ستيفنسون دي كيه، كويك إس آر: دراسة مسار الحمل ومضاعفاته باستخدام الحمض النووي الريبوزي خارج الخلية المتداول في دم النساء أثناء الحمل. دوبيدياتريكس. ٢٠٢٠؛٨:٦٠٥-٢١٩.
أولريش م، شيروود ك، كيون ب، شوتز إي، بيك ج، ستيجباور ج، وآخرون. خزعة سائلة: استخدام الحمض النووي الخالي من الخلايا المانحة للكشف عن الآفات الخيفية في طُعم الكلى. نات ريف نيفرول. 2021؛ 17: 591-603.
خوان ف.ك، ​​لو واي.إم. ابتكارات في التشخيص قبل الولادة: تسلسل جينوم بلازما الأم. آنا م.د. 2016؛67:419-32.
جو و، دينج إكس، لي م، سوكو واي دي، أريفالو س، سترايك د، وآخرون. الكشف السريع عن مسببات الأمراض باستخدام تسلسل ميتاجينومي من الجيل التالي لسوائل الجسم المصابة. الطب الطبيعي. ٢٠٢١؛ ٢٧: ١١٥-٢٤.