شكرًا لك على زيارة Nature.com.إصدار المتصفح الذي تستخدمه لديه دعم محدود لـ CSS.للحصول على أفضل تجربة ، نوصي باستخدام مستعرض محدث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer).في غضون ذلك ، لضمان استمرار الدعم ، سنعرض الموقع بدون أنماط وجافا سكريبت.
الخزعة السائلة (LB) هو مفهوم يكتسب شعبية بسرعة في مجال الطب الحيوي.يعتمد المفهوم بشكل أساسي على اكتشاف أجزاء من الحمض النووي خارج الخلية المنتشر (ccfDNA) ، والتي يتم إطلاقها بشكل أساسي على شكل شظايا صغيرة بعد موت الخلايا في الأنسجة المختلفة.تأتي نسبة صغيرة من هذه الشظايا من أنسجة أو كائنات أجنبية (أجنبية).في العمل الحالي ، طبقنا هذا المفهوم على بلح البحر ، وهو نوع حار معروف بقدرته العالية على تنقية مياه البحر.نحن نستخدم قدرة بلح البحر على العمل كمرشحات طبيعية لالتقاط شظايا الحمض النووي البيئية من مجموعة متنوعة من المصادر لتوفير معلومات حول التنوع البيولوجي للأنظمة البيئية الساحلية البحرية.تظهر نتائجنا أن الدملمف بلح البحر يحتوي على أجزاء من الحمض النووي تختلف اختلافًا كبيرًا في الحجم ، من 1 إلى 5 كيلو بايت.أظهر تسلسل البندقية أن عددًا كبيرًا من شظايا الحمض النووي من أصل جرثومي غريب.من بينها ، وجدنا أجزاء من الحمض النووي من البكتيريا والعتائق والفيروسات ، بما في ذلك الفيروسات المعروفة بأنها تصيب مجموعة متنوعة من العوائل التي توجد عادة في النظم البيئية البحرية الساحلية.في الختام ، توضح دراستنا أن مفهوم LB المطبق على بلح البحر يمثل مصدرًا غنيًا ولكن لم يتم استكشافه بعد من المعرفة حول التنوع الميكروبي في النظم البيئية الساحلية البحرية.
يعد تأثير تغير المناخ (CC) على التنوع البيولوجي للنظم الإيكولوجية البحرية مجال بحث سريع النمو.لا يتسبب الاحترار العالمي في ضغوط فسيولوجية مهمة فحسب ، بل يدفع أيضًا الحدود التطورية للاستقرار الحراري للكائنات البحرية ، مما يؤثر على موطن عدد من الأنواع ، مما يدفعهم إلى البحث عن ظروف أكثر ملاءمة [1 ، 2].بالإضافة إلى التأثير على التنوع البيولوجي للميتازوان ، فإن CC يعطل التوازن الدقيق للتفاعلات الجرثومية بين المضيف.يشكل دسباقتريوز الميكروبي هذا تهديدًا خطيرًا للنظم البيئية البحرية لأنه يجعل الكائنات البحرية أكثر عرضة لمسببات الأمراض المعدية [3 ، 4].من المعتقد أن SS تلعب دورًا مهمًا في الوفيات الجماعية ، وهي مشكلة خطيرة لإدارة النظم البيئية البحرية العالمية [5 ، 6].هذه قضية مهمة بالنظر إلى الآثار الاقتصادية والبيئية والتغذوية للعديد من الأنواع البحرية.هذا ينطبق بشكل خاص على ذوات الصدفتين الذين يعيشون في المناطق القطبية ، حيث تكون تأثيرات CK أكثر فورية وشدة [6 ، 7].في الواقع ، ذوات الصدفتين مثل Mytilus spp.تستخدم على نطاق واسع لرصد تأثيرات CC على النظم البيئية البحرية.ليس من المستغرب ، أنه تم تطوير عدد كبير نسبيًا من المؤشرات الحيوية لمراقبة صحتهم ، غالبًا باستخدام نهج من مستويين يتضمن مؤشرات حيوية وظيفية تعتمد على النشاط الأنزيمي أو الوظائف الخلوية مثل حيوية الخلية ونشاط البلعمة [8].تشمل هذه الطرق أيضًا قياس تركيز مؤشرات ضغط محددة تتراكم في الأنسجة الرخوة بعد امتصاص كميات كبيرة من مياه البحر.ومع ذلك ، فإن قدرة الترشيح العالية ونظام الدورة الدموية شبه المفتوح لذوات الصدفتين يوفران فرصة لتطوير مؤشرات حيوية جديدة للدملمف باستخدام مفهوم الخزعة السائلة (LB) ، وهو نهج بسيط وقليل التوغل لإدارة المريض.عينات الدم [9 ، 10].على الرغم من أنه يمكن العثور على عدة أنواع من الجزيئات المتداولة في LB البشري ، إلا أن هذا المفهوم يعتمد بشكل أساسي على تحليل تسلسل الحمض النووي لشظايا الحمض النووي خارج الخلية (ccfDNA) المنتشرة في البلازما.في الواقع ، كان وجود الحمض النووي المنتشر في البلازما البشرية معروفًا منذ منتصف القرن العشرين [11] ، ولكن في السنوات الأخيرة فقط أدى ظهور طرق التسلسل عالية الإنتاجية إلى التشخيص السريري على أساس ccfDNA.يرجع وجود شظايا الحمض النووي المتداولة جزئيًا إلى الإطلاق السلبي للحمض النووي الجيني (النووي والميتوكوندريا) بعد موت الخلية. في الأفراد الأصحاء ، يكون تركيز ccfDNA منخفضًا عادةً (<10 نانوغرام / مل) ولكن يمكن زيادته بمقدار 5-10 مرات في المرضى الذين يعانون من أمراض مختلفة أو يتعرضون للإجهاد ، مما يؤدي إلى تلف الأنسجة. في الأفراد الأصحاء ، يكون تركيز ccfDNA منخفضًا عادةً (<10 نانوغرام / مل) ولكن يمكن زيادته بمقدار 5-10 مرات في المرضى الذين يعانون من أمراض مختلفة أو يتعرضون للإجهاد ، مما يؤدي إلى تلف الأنسجة. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг / мл) ، но может повышаться в 5–10 рарзкая ей или подвергающихся стрессу، приводящему к повреждению тканей. في الأشخاص الأصحاء ، يكون تركيز cccDNA منخفضًا عادةً (أقل من 10 نانوغرام / مل) ، ولكن يمكن أن يزيد بمقدار 5-10 مرات في المرضى الذين يعانون من أمراض مختلفة أو تحت ضغط يؤدي إلى تلف الأنسجة.在 健康 个体 中 ， ccfDNA 的 浓度 通常 较低 （<10 نانوغرام / مل） ， 但 在 患有 各种 病理 或 承受 压力 的 患者 可增加 5-10 倍 ， 从而 导致 组织 损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 نانوغرام / مل） 但 在 各 种 或 承受 压力 患者 可 5-10 倍 ， 从而 组织 。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤онцентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг / мл) у здоровых людей، но могут быть увеличены в 5-10 рацс уровых ологиями или стрессом، то приводит к повреждению тканей. عادة ما تكون تركيزات ccfDNA منخفضة (أقل من 10 نانوغرام / مل) في الأفراد الأصحاء ، ولكن يمكن زيادتها 5-10 أضعاف في المرضى الذين يعانون من أمراض مختلفة أو إجهاد ، مما يؤدي إلى تلف الأنسجة.يختلف حجم أجزاء ccfDNA على نطاق واسع ، ولكنه يتراوح عادةً من 150 إلى 200 زوج قاعدي.[12].يمكن استخدام تحليل ccfDNA المشتق ذاتيًا ، أي ccfDNA من الخلايا المضيفة الطبيعية أو المحولة ، لاكتشاف التغيرات الجينية والتخلقية الموجودة في الجينوم النووي و / أو الميتوكوندريا ، وبالتالي مساعدة الأطباء على اختيار علاجات محددة تستهدف الجزيئات [13].ومع ذلك ، يمكن الحصول على ccfDNA من مصادر أجنبية مثل ccfDNA من الخلايا الجنينية أثناء الحمل أو من الأعضاء المزروعة [14،15،16،17].يعد ccfDNA أيضًا مصدرًا مهمًا للمعلومات للكشف عن وجود الأحماض النووية لعامل معدي (أجنبي) ، مما يسمح بالكشف غير الغازي عن العدوى المنتشرة التي لم يتم تحديدها بواسطة مزارع الدم ، وتجنب الخزعة الغازية للأنسجة المصابة [18].أظهرت الدراسات الحديثة بالفعل أن دم الإنسان يحتوي على مصدر غني بالمعلومات التي يمكن استخدامها لتحديد مسببات الأمراض الفيروسية والبكتيرية ، وأن حوالي 1 ٪ من ccfDNA الموجود في البلازما البشرية من أصل غريب [19].توضح هذه الدراسات أنه يمكن تقييم التنوع البيولوجي للميكروبيوم المنتشر في الكائن الحي باستخدام تحليل ccfDNA.ومع ذلك ، حتى وقت قريب ، كان هذا المفهوم يستخدم حصريًا في البشر ، وبدرجة أقل في الفقاريات الأخرى [20 ، 21].
في هذا البحث ، نستخدم إمكانات LB لتحليل ccfDNA في Aulacomya atra ، وهو نوع جنوبي شائع في جزر Kerguelen تحت القطب الجنوبي ، وهي مجموعة من الجزر فوق هضبة كبيرة تشكلت منذ 35 مليون سنة.انفجار بركاني.باستخدام نظام تجريبي في المختبر ، وجدنا أن شظايا الحمض النووي في مياه البحر يتم امتصاصها بسرعة بواسطة بلح البحر وتدخل إلى مقصورة الدملمف.أظهر تسلسل البندقية أن بلح البحر الدملمف ccfDNA يحتوي على أجزاء من الحمض النووي من أصل خاص به وغير ذاتي ، بما في ذلك البكتيريا التكافلية وشظايا الحمض النووي من المناطق الأحيائية النموذجية للنظم الإيكولوجية الساحلية البركانية الباردة.يحتوي Hemolymph ccfDNA أيضًا على متواليات فيروسية مشتقة من فيروسات ذات نطاقات مضيفة مختلفة.وجدنا أيضًا أجزاء من الحمض النووي من حيوانات متعددة الخلايا مثل الأسماك العظمية وشقائق النعمان البحرية والطحالب والحشرات.في الختام ، توضح دراستنا أنه يمكن تطبيق مفهوم LB بنجاح على اللافقاريات البحرية لتوليد ذخيرة جينية غنية في النظم البيئية البحرية.
تم جمع الحشرات البالغة (بطول 55-70 مم) Mytilus platensis (M. platensis) و Aulacomya atra (A. atra) من الشواطئ الصخرية المدية في بورت أو فرانس (049 ° 21.235 جنوباً ، 070 ° 13.490 شرقاً).جزر كيرغولين في ديسمبر 2018. تم الحصول على بلح البحر الأزرق البالغ (Mytilus spp.) من مورد تجاري (PEI Mussel King Inc. ، جزيرة الأمير إدوارد ، كندا) وتم وضعها في خزان مهوى يتم التحكم في درجة حرارته (4 درجات مئوية) يحتوي على 10-20 لترًا من محلول ملحي صناعي 32 درجة مئوية.(ملح البحر الاصطناعي ، ريف كريستال ، المحيط الفوري ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).لكل تجربة ، تم قياس طول ووزن الأصداف الفردية.
بروتوكول الوصول المفتوح المجاني لهذا البرنامج متاح عبر الإنترنت (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).باختصار ، تم جمع اللمف الدموي LB من العضلات المبعدة كما هو موصوف [22].تم توضيح الدملمف بالطرد المركزي عند 1200 × جم لمدة 3 دقائق ، وتم تجميد المادة الطافية (-20 درجة مئوية) حتى الاستخدام.لعزل وتنقية cfDNA ، تم إذابة العينات (1.5-2.0 مل) ومعالجتها باستخدام مجموعة NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel ، Bethlehen ، PA) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة.تم تخزين ccfDNA عند -80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.في بعض التجارب ، تم عزل ccfDNA وتنقيته باستخدام QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN ، تورونتو ، أونتاريو ، كندا).تم قياس كمية الحمض النووي المنقى باستخدام مقايسة PicoGreen القياسية.تم تحليل التوزيع الجزئي لـ ccfDNA المعزول عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري باستخدام محلل بيولوجي Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc. ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا) باستخدام مجموعة DNA عالية الحساسية.تم إجراء الفحص باستخدام 1 ميكرولتر من عينة ccfDNA وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة.
لتسلسل شظايا ccfDNA الدملمفي ، أعد Génome Québec (مونتريال ، كيبيك ، كندا) مكتبات بندقية باستخدام مجموعة Illumina DNA Mix لمجموعة Illumina MiSeq PE75.تم استخدام محول قياسي (BioO).تتوفر ملفات البيانات الأولية من أرشيف قراءة تسلسل NCBI (SRR8924808 و SRR8924809).تم تقييم جودة القراءة الأساسية باستخدام FastQC [23].تم استخدام Trimmomatic [24] لمحولات القطع والقراءات ذات الجودة الرديئة.تم دمج قراءات البندقية بنهايات مقترنة FLASH في قراءات فردية أطول مع تداخل بحد أدنى 20 نقطة أساس لتجنب عدم التطابق [25]. تم شرح القراءات المدمجة باستخدام BLASTN باستخدام قاعدة بيانات تصنيف NCBI ذات الصدفتين (القيمة الإلكترونية <1e − 3 و 90 ٪ homology) ، وتم إخفاء التسلسلات منخفضة التعقيد باستخدام DUST [26]. تم شرح القراءات المدمجة باستخدام BLASTN باستخدام قاعدة بيانات تصنيف NCBI ذات الصدفتين (القيمة الإلكترونية <1e − 3 و 90 ٪ homology) ، وتم إخفاء التسلسلات منخفضة التعقيد باستخدام DUST [26]. كلمات البحث ение e <1e-3 и 90٪ гомологии)، а маскирование последовательностей низкой сложности бело выполнено сено слоности. تم شرح القراءات المجمعة باستخدام BLASTN باستخدام قاعدة بيانات تصنيف ذات الصدفتين NCBI (قيمة e <1e-3 و 90٪ homology) ، وتم إجراء إخفاء تسلسل منخفض التعقيد باستخدام DUST [26].使用 双壳类 NCBI 分类 数据库 （e 值 <1e-3 和 90٪ 同源 性） 用 بلاستن 注释 合并 的 读数 ， 并 使用 الغبار [26] 进行 低 复杂 度 序列 的 掩蔽。.бъединенные тения были аннотированы с спомощью BLASTN спользованием таксономической баз данстской значение e <1e-3 и 90٪ гомологии) ، а маскирование последовательностей низкой сложности было вполнености. تم شرح القراءات المجمعة باستخدام BLASTN باستخدام قاعدة البيانات التصنيفية ذات الصدفتين NCBI (قيمة e <1e-3 و 90٪ homology) ، وتم إجراء إخفاء تسلسل منخفض التعقيد باستخدام DUST [26].تم تقسيم القراءات إلى مجموعتين: تتعلق بالتسلسلات ذات الصدفتين (تسمى هنا القراءة الذاتية) وغير ذات الصلة (غير ذاتية القراءة).تم تجميع مجموعتين بشكل منفصل باستخدام MEGAHIT لتوليد contigs [27].وفي الوقت نفسه ، تم تصنيف التوزيع التصنيفي لقراءات الميكروبيوم الفضائي باستخدام Kraken2 [28] وتم تمثيله بيانياً بواسطة مخطط دائري كرونا على المجرة [29 ، 30].تم تحديد الكميات المثلى لتكون kmers-59 من تجاربنا الأولية. تم بعد ذلك تحديد contigs الذاتي من خلال المحاذاة مع BLASTN (قاعدة بيانات NCBI ذات الصدفتين ، قيمة e <1e − 10 و 60 ٪ homology) للحصول على تعليق توضيحي نهائي. تم بعد ذلك تحديد contigs الذاتي من خلال المحاذاة مع BLASTN (قاعدة بيانات NCBI ذات الصدفتين ، قيمة e <1e − 10 و 60 ٪ homology) للحصول على تعليق توضيحي نهائي. атем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двуствозан <1e-10 и гомология 60٪) для окончательной аннотации. تم بعد ذلك تحديد contigs الذاتية من خلال المطابقة مع BLASTN (قاعدة بيانات NCBI ذات الصدفتين ، وقيمة e <1e-10 و 60 ٪ homology) للتعليق التوضيحي النهائي.然后 通过 与 بلاستن （双 壳 贝类 NCBI 数据库 ， e 值 <1e-10 60٪ 同源 性） 对齐 来 识别 自身 重叠 群 以 进行 最终 注释。然后 通过 与 بلاستن （双 壳 贝类 NCBI 数据库 ， e 值 <1e-10 和 60٪ كلمات البحث: двустворчатых моллюсков، значение e <1e-10 и гомология 60٪). تم بعد ذلك تحديد contigs الذاتي للتعليق التوضيحي النهائي عن طريق المطابقة مع BLASTN (قاعدة بيانات NCBI ذات الصدفتين ، قيمة e <1e-10 و 60٪ homology). في موازاة ذلك ، تم شرح contigs المجموعة غير الذاتية باستخدام BLASTN (قاعدة بيانات nt NCBI ، قيمة e <1e − 10 و 60 ٪ homology). في موازاة ذلك ، تم شرح contigs المجموعة غير الذاتية باستخدام BLASTN (قاعدة بيانات nt NCBI ، قيمة e <1e − 10 و 60 ٪ homology). араллельно ужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI، знач. في موازاة ذلك ، تم شرح contigs للمجموعة الأجنبية باستخدام BLASTN (قاعدة بيانات NT NCBI ، وقيمة e <1e-10 و 60 ٪ homology).平行 地 ， 用 بلاستن （nt NCBI 数据库 ， e 值 <1e-10 60٪ 同源 性） 注释 非 自身 组 重叠 群。平行 地 ， 用 بلاستن （nt NCBI 数据库 ， e 值 <1e-10 60٪ 同源 性） 注释 非 自身 组 重叠 群。 араллельно контиги، не относящиеся к собственной группе، были аннотированы с помощью BLASTN (банза и гомология 60٪). في موازاة ذلك ، تم شرح contigs غير الذاتي مع BLASTN (قاعدة بيانات nt NCBI ، قيمة e <1e-10 و 60 ٪ homology). تم إجراء BLASTX أيضًا على contigs غير الذاتي باستخدام قواعد بيانات NCBI للبروتين nr و RefSeq (قيمة e <1e − 10 و 60 ٪ homology). تم إجراء BLASTX أيضًا على contigs غير الذاتي باستخدام قواعد بيانات NCBI للبروتين nr و RefSeq (قيمة e <1e − 10 و 60 ٪ homology). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах спользованием баз данных белка nr и RefSeq <1 NCBI я 60٪). تم إجراء BLASTX أيضًا على contigs غير الذاتي باستخدام قواعد بيانات البروتين nr و RefSeq NCBI (قيمة e <1e-10 و 60 ٪ homology).还 使用 nr 和 RefSeq 蛋白 NCBI 数据库 对 非 自身 重叠 群 进行 了 BLASTX （e 值 <1e-10 和 60٪ 同源 性）。还 使用 nr 和 RefSeq 蛋白 NCBI 数据库 对 非 自身 重叠 群 进行 了 BLASTX （e 值 <1e-10 和 60٪ 同源 性）。 BLASTX также таке выполняли на несамостоятельных контигах спользованием баз даннгых белка nr и RefSeq٪ 1 ). تم إجراء BLASTX أيضًا على contigs غير الذاتي باستخدام قواعد بيانات البروتين nr و RefSeq NCBI (قيمة e <1e-10 و 60 ٪ homology).تمثل مجمعات BLASTN و BLASTX من contigs غير الذاتي contigs النهائي (انظر الملف التكميلي).
يتم سرد المواد الأولية المستخدمة في PCR في الجدول S1.تم استخدام بوليميريز DNA Taq (Bio Basic Canada ، Markham ، ON) لتضخيم الجينات المستهدفة ccfDNA.تم استخدام ظروف التفاعل التالية: التمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، و 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، وتعيين درجة حرارة التلدين لمدة دقيقة واحدة ، والاستطالة عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، و 35 دورة ، وأخيراً 72 درجة مئوية خلال 10 دقائق..تم فصل منتجات PCR عن طريق الرحلان الكهربائي في مواد هلامية agarose (1.5٪) تحتوي على SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen ، Burlington ، ON ، كندا) عند 95 فولت.
تم تأقلم بلح البحر (Mytilus spp.) في 500 مل من ماء البحر المؤكسج (32 PSU) لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية.تمت إضافة DNA البلازميد الذي يحتوي على إدراج يشفر تسلسل galectin-7 البشري (كدنا) (رقم انضمام NCBI L07769) إلى القارورة بتركيز نهائي قدره 190 ميكروغرام / ميكرولتر.تم تحضين بلح البحر تحت نفس الظروف بدون إضافة DNA.خزان التحكم الثالث احتوى على DNA بدون بلح البحر.لمراقبة جودة الحمض النووي في مياه البحر ، تم أخذ عينات من مياه البحر (20 ميكرولتر ، ثلاث تكرارات) من كل خزان في الوقت المحدد.لتتبع الحمض النووي البلازميد ، تم حصاد بلح البحر LB في الأوقات المحددة وتحليلها بواسطة qPCR و ddPCR.نظرًا لارتفاع نسبة الملح في مياه البحر ، تم تخفيف قسامات في مياه جودة PCR (1:10) قبل جميع فحوصات PCR.
تم إجراء PCR الرقمي (ddPCR) باستخدام بروتوكول BioRad QX200 (ميسيسوجا ، أونتاريو ، كندا).استخدم ملف تعريف درجة الحرارة لتحديد درجة الحرارة المثلى (الجدول S1).تم إنشاء القطرات باستخدام مولد قطرة QX200 (BioRad).تم إجراء ddPCR على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، و 50 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ودرجة حرارة التلدين المحددة لمدة دقيقة واحدة و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق و 90 درجة مئوية خلال 5 دقائق.تم قياس عدد القطرات والتفاعلات الإيجابية (عدد النسخ / ميكرولتر) باستخدام قارئ إسقاط QX200 (BioRad).تم رفض العينات التي تحتوي على أقل من 10000 قطرة.لم يتم تنفيذ التحكم في النمط في كل مرة تم فيها تشغيل ddPCR.
تم إجراء qPCR باستخدام Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research ، سيدني ، أستراليا) وأشعال محددة LGALS7.تم إجراء جميع PCRs الكمية في 20 ميكرولتر باستخدام QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).بدأ qPCR بحضانة لمدة 15 دقيقة عند 95 درجة مئوية تليها 40 دورة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوانٍ وعند 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية مع جمع بيانات واحد.تم إنشاء منحنيات الانصهار باستخدام قياسات متتالية عند 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان و 65 درجة مئوية لمدة 60 ثانية و 97 درجة مئوية في نهاية qPCR.تم إجراء كل qPCR في ثلاث نسخ ، باستثناء عينات التحكم.
نظرًا لأن بلح البحر معروف بمعدل الترشيح المرتفع ، فقد درسنا أولاً ما إذا كان بإمكانه ترشيح أجزاء الحمض النووي الموجودة في مياه البحر والاحتفاظ بها.كنا مهتمين أيضًا بما إذا كانت هذه الشظايا تتراكم في نظامها اللمفاوي شبه المفتوح.لقد حللنا هذه المشكلة بشكل تجريبي من خلال تتبع مصير شظايا الحمض النووي القابلة للذوبان المضافة إلى خزانات بلح البحر الأزرق.لتسهيل تتبع شظايا الحمض النووي ، استخدمنا DNA البلازميد الأجنبي (وليس الذاتي) الذي يحتوي على جين galectin-7 البشري.ddPCR يتتبع شظايا DNA البلازميد في مياه البحر وبلح البحر.تظهر نتائجنا أنه إذا ظلت كمية شظايا الحمض النووي في مياه البحر ثابتة نسبيًا بمرور الوقت (حتى 7 أيام) في غياب بلح البحر ، فعند وجود بلح البحر ، اختفى هذا المستوى تمامًا تقريبًا في غضون 8 ساعات (الشكل 1 أ ، ب).تم اكتشاف أجزاء من الحمض النووي الخارجي بسهولة في غضون 15 دقيقة في السائل داخل الصمام والدملمف (الشكل 1 ج).لا يزال من الممكن اكتشاف هذه الشظايا لمدة تصل إلى 4 ساعات بعد التعرض.نشاط الترشيح هذا فيما يتعلق بشظايا الحمض النووي يمكن مقارنته بنشاط الترشيح للبكتيريا والطحالب [31].تشير هذه النتائج إلى أن بلح البحر يمكنه ترشيح وتجميع الحمض النووي الغريب في مقصورات السوائل الخاصة به.
التركيزات النسبية من DNA البلازميد في مياه البحر في وجود (A) أو عدم وجود (B) من بلح البحر ، مقاسة بواسطة ddPCR.في A ، يتم التعبير عن النتائج كنسب مئوية ، حيث تمثل حدود المربعات النسب المئوية 75 و 25.يظهر المنحنى اللوغاريتمي الملائم باللون الأحمر ، وتمثل المنطقة المظللة باللون الرمادي فاصل الثقة 95٪.في B ، يمثل الخط الأحمر المتوسط ​​ويمثل الخط الأزرق فاصل الثقة 95٪ للتركيز.ج ـ تراكم DNA البلازميد في الدملمف والسائل الصمامي لبلح البحر في أوقات مختلفة بعد إضافة DNA البلازميد.يتم عرض النتائج كنسخ مطلقة تم الكشف عنها / مل (± SE).
بعد ذلك ، قمنا بالتحقيق في أصل ccfDNA في بلح البحر الذي تم جمعه من أحواض بلح البحر في جزر Kerguelen ، وهي مجموعة نائية من الجزر ذات تأثير بشري محدود.لهذا الغرض ، تم عزل cccDNA من الدملمف بلح البحر وتنقيته بطرق شائعة الاستخدام لتنقية cccDNA البشري [32 ، 33].وجدنا أن متوسط ​​تركيزات ccfDNA الدملمف في بلح البحر في ميكروغرام منخفضة لكل مجموعة من الدملمف مل (انظر الجدول S2 ، معلومات تكميلية).هذا النطاق من التركيزات أكبر بكثير من الأشخاص الأصحاء (نانوجرام منخفض لكل مليلتر) ، ولكن في حالات نادرة ، في مرضى السرطان ، يمكن أن يصل مستوى ccfDNA إلى عدة ميكروجرام لكل مليلتر [34 ، 35].أظهر تحليل توزيع حجم الدملمف ccfDNA أن هذه الأجزاء تختلف اختلافًا كبيرًا في الحجم ، تتراوح من 1000 زوج قاعدي إلى 1000 زوج قاعدي.حتى 5000 نقطة أساس (الشكل 2).تم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام QIAamp Investigator Kit القائمة على السيليكا ، وهي طريقة شائعة الاستخدام في علم الطب الشرعي لعزل وتنقية الحمض النووي الجيني سريعًا من عينات الحمض النووي منخفضة التركيز ، بما في ذلك ccfDNA [36].
الكهربي التمثيلي ccfDNA من بلح البحر الدملمف.مستخلص باستخدام NucleoSnap Plasma Kit (أعلى) ومجموعة QIAamp DNA Investigator Kit.مخطط ب الكمان يوضح توزيع تركيزات الدملمف ccfDNA (± SE) في بلح البحر.يمثل الخطان الأسود والأحمر الوسيط والربيع الأول والثالث على التوالي.
ما يقرب من 1 ٪ من ccfDNA في البشر والرئيسيات لها مصدر غريب [21 ، 37].بالنظر إلى نظام الدورة الدموية شبه المفتوح لذوات الصدفتين ، ومياه البحر الغنية بالميكروبات ، وتوزيع حجم بلح البحر ccfDNA ، افترضنا أن بلح البحر الدملمف ccfDNA قد يحتوي على مجموعة غنية ومتنوعة من الحمض النووي الميكروبي.لاختبار هذه الفرضية ، قمنا بتسلسل ccfDNA الدملمي من عينات Aulacomya atra التي تم جمعها من جزر Kerguelen ، مما أسفر عن أكثر من 10 ملايين قراءة ، اجتاز 97.6 ٪ منها مراقبة الجودة.ثم تم تصنيف القراءات وفقًا للمصادر الذاتية وغير الذاتية باستخدام قواعد بيانات BLASTN و NCBI ذات الصدفتين (الشكل S1 ، المعلومات التكميلية).
في البشر ، يمكن إطلاق كل من الحمض النووي والميتوكوندريا في مجرى الدم [38].ومع ذلك ، في هذه الدراسة ، لم يكن من الممكن وصف بالتفصيل الحمض النووي الجيني لبلح البحر ، بالنظر إلى أن جينوم A. atra لم يتم تسلسله أو وصفه.ومع ذلك ، تمكنا من تحديد عدد من أجزاء ccfDNA من أصلنا باستخدام مكتبة ذات الصدفتين (الشكل S2 ، معلومات تكميلية).أكدنا أيضًا وجود شظايا DNA من أصلنا عن طريق تضخيم PCR الموجه لجينات A. atra التي تم تسلسلها (الشكل 3).وبالمثل ، نظرًا لأن جينوم الميتوكوندريا لـ A. atra متاح في قواعد البيانات العامة ، يمكن للمرء أن يجد دليلًا على وجود شظايا ccfDNA للميتوكوندريا في الدملمف في A. atra.تم تأكيد وجود شظايا الحمض النووي للميتوكوندريا عن طريق تضخيم PCR (الشكل 3).
كانت جينات الميتوكوندريا المختلفة موجودة في الدملمف في A. atra (النقاط الحمراء - رقم المخزون: SRX5705969) و M. platensis (النقاط الزرقاء - رقم المخزون: SRX5705968) تم تضخيمها بواسطة PCR.الشكل مقتبس من Breton et al. ، 2011 B Amplification of hemolymph supernatant from A. atra المخزنة على ورق FTA.استخدم لكمة 3 مم للإضافة مباشرة إلى أنبوب PCR الذي يحتوي على مزيج PCR.
نظرًا للمحتوى الميكروبي الوفير في مياه البحر ، ركزنا في البداية على توصيف تسلسل الحمض النووي الميكروبي في الدملمف.للقيام بذلك ، نستخدم استراتيجيتين مختلفتين.استخدمت الإستراتيجية الأولى Kraken2 ، وهو برنامج تصنيف تسلسل قائم على الخوارزمية يمكنه تحديد التسلسلات الميكروبية بدقة مماثلة لـ BLAST والأدوات الأخرى [28].تم تحديد أكثر من 6719 قراءة على أنها من أصل بكتيري ، بينما كانت 124 و 64 قراءة من العتائق والفيروسات ، على التوالي (الشكل 4).كانت شظايا الحمض النووي البكتيري الأكثر وفرة هي الثبات (46٪) ، المتقلبات (27٪) ، والبكتيريا (17٪) (الشكل 4 أ).يتوافق هذا التوزيع مع الدراسات السابقة لميكروبيوم بلح البحر الأزرق البحري [39 ، 40].كانت بكتيريا Gammaproteobacteria هي الفئة الرئيسية من Proteobacteria (44٪) ، بما في ذلك العديد من Vibrionales (الشكل 4 ب).أكدت طريقة ddPCR وجود شظايا Vibrio DNA في ccfDNA لـ A. atra hemolymph (الشكل 4 ج) [41].للحصول على مزيد من المعلومات حول الأصل البكتيري لـ ccfDNA ، تم اتباع نهج إضافي (الشكل S2 ، معلومات تكميلية). في هذه الحالة ، تم تجميع القراءات المتداخلة كقراءات ذات نهايات مقترنة وتم تصنيفها على أنها ذاتية (ذات الصدفتين) أو أصل غير ذاتي باستخدام BLASTN وقيمة e 1e − 3 وقطع مع> 90٪ تماثل. في هذه الحالة ، تم تجميع القراءات المتداخلة كقراءات ذات نهايات مقترنة وتم تصنيفها على أنها ذاتية (ذات الصدفتين) أو أصل غير ذاتي باستخدام BLASTN وقيمة e 1e − 3 وقطع مع> 90٪ تماثل. كلمات البحث من نحن؟ في هذه الحالة ، تم جمع القراءات المتداخلة كقراءات ذات نهايات مقترنة وتم تصنيفها على أنها أصلية (ثنائية المصراع) أو غير أصلية باستخدام قيمة BLASTN و e من 1e-3 وقطع مع> 90 ٪ من التماثل.在 这种 情况 下 ， 重叠 的 读数 组装 为 配对 末端 读数 ， 并 使用 بلاستن 和 1e-3 的 e 值 和> 90٪ 同源 性 的 截止 值 分类 为 自身 （双壳类） 或非 自身 来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的 值 和> 90٪ 同源 性 的 分类 自身 （双 壳 类） 非 自身 。。。。。。。。。 كلمات البحث рчатые моллюски) или несобственные по происхождению спользованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога. في هذه الحالة ، تم جمع القراءات المتداخلة كقراءات ذات نهايات مقترنة وتصنيفها على أنها خاصة (ذات الصدفتين) أو غير أصلية باستخدام قيم e BLASTN و 1e-3 وعتبة التماثل> 90٪.نظرًا لأن جينوم A. atra لم يتم تسلسله بعد ، فقد استخدمنا استراتيجية التجميع de novo لمجمع MEGAHIT Next Generation Sequence (NGS).تم تحديد ما مجموعه 147188 contigs على أنها تابعة (ذوات الصدفتين) من الأصل.تم بعد ذلك تفجير هذه contigs باستخدام قيم e 1e-10 باستخدام BLASTN و BLASTX.سمحت لنا هذه الاستراتيجية بتحديد 482 شظية غير ثنائية المصراع موجودة في A. atra ccfDNA.تم الحصول على أكثر من نصف (57٪) شظايا الحمض النووي من البكتيريا ، وبشكل رئيسي من المتعايشات الخيشومية ، بما في ذلك المتعايشات الكبريتية ، ومن المتعايشات الخيشومية Solemya velum (الشكل 5).
الوفرة النسبية على مستوى النوع.ب التنوع الميكروبي لشعبين رئيسيين (الثبات وبكتيريا بروتيوباكتيريا).التضخيم التمثيلي لـ ddPCR C Vibrio spp.شظايا من جين الرنا الريباسي 16S (الأزرق) في ثلاث دملمف أترا.
تم تحليل ما مجموعه 482 contigs تم جمعها.لمحة عامة عن التوزيع التصنيفي للتعليقات التوضيحية المتجاورة (بدائيات النوى وحقيقيات النوى).التوزيع التفصيلي لشظايا الحمض النووي البكتيري التي تم تحديدها بواسطة BLASTN و BLASTX.
أظهر تحليل Kraken2 أيضًا أن بلح البحر يحتوي على أجزاء من الحمض النووي الأصلي ، بما في ذلك شظايا DNA من Euryarchaeota (65 ٪) و Crenarchaeota (24 ٪) و Thaurmarcheota (11 ٪) (الشكل 6 أ).لا ينبغي أن يكون وجود شظايا الحمض النووي المستمدة من Euryarchaeota و Crenarchaeota ، الموجودة سابقًا في المجتمع الميكروبي لبلح البحر في كاليفورنيا ، بمثابة مفاجأة [42].على الرغم من أن Euryarchaeota غالبًا ما ترتبط بالظروف القاسية ، فمن المعترف به الآن أن كل من Euryarchaeota و Crenarcheota هما من بين بدائيات النوى الأكثر شيوعًا في البيئة البحرية المبردة [43 ، 44].إن وجود الكائنات الحية الدقيقة المولدة للميثان في بلح البحر ليس مفاجئًا ، بالنظر إلى التقارير الأخيرة عن تسرب الميثان على نطاق واسع من التسريبات القاعية على هضبة كيرجولين [45] وإمكانية إنتاج الميثان الميكروبي الذي لوحظ قبالة سواحل جزر كيرغولين [46].
ثم تحول انتباهنا إلى قراءات من فيروسات الحمض النووي.على حد علمنا ، هذه هي الدراسة الأولى غير المستهدفة لمحتوى الفيروس في بلح البحر.كما هو متوقع ، وجدنا شظايا DNA من العاثيات (Caudovirales) (الشكل 6 ب).ومع ذلك ، فإن الحمض النووي الفيروسي الأكثر شيوعًا يأتي من شعبة من فيروسات الخلايا النووية ، والمعروفة أيضًا باسم فيروس DNA السيتوبلازم النووي الكبير (NCLDV) ، والذي يحتوي على أكبر جينوم من أي فيروس.ضمن هذه الشعبة ، تنتمي معظم تسلسلات الحمض النووي إلى عائلات Mimimidoviridae (58٪) و Poxviridae (21٪) ، التي تضم عوائلها الطبيعية الفقاريات ومفصليات الأرجل ، بينما تنتمي نسبة صغيرة من تسلسلات الحمض النووي هذه إلى الطحالب الفيروسية المعروفة.يصيب الطحالب البحرية حقيقية النواة.تم الحصول على التسلسلات أيضًا من فيروس Pandora ، وهو الفيروس العملاق الذي يحتوي على أكبر حجم جينوم من أي أجناس فيروسية معروفة.ومن المثير للاهتمام ، أن نطاق العوائل المعروف أنهم مصابون بالفيروس ، كما هو محدد بواسطة تسلسل الدملمف ccfDNA ، كان كبيرًا نسبيًا (الشكل S3 ، المعلومات التكميلية).ويشمل الفيروسات التي تصيب الحشرات مثل Baculoviridae و Iridoviridae ، وكذلك الفيروسات التي تصيب الأميبا والطحالب والفقاريات.وجدنا أيضًا تسلسلات تطابق جينوم Pithovirus sibericum.تم عزل فيروسات بيتوفيروس (المعروفة أيضًا باسم "فيروسات الزومبي") لأول مرة من 30000 سنة من الجليد الدائم في سيبيريا [47].وبالتالي ، تتوافق نتائجنا مع التقارير السابقة التي توضح أنه ليست كل الأنواع الحديثة من هذه الفيروسات منقرضة [48] وأن هذه الفيروسات قد تكون موجودة في النظم البيئية البحرية شبه القطبية النائية.
أخيرًا ، اختبرنا ما إذا كان بإمكاننا العثور على أجزاء من الحمض النووي من حيوانات أخرى متعددة الخلايا.تم تحديد ما مجموعه 482 contigs الأجنبي بواسطة BLASTN و BLASTX مع مكتبات nt و nr و RefSeq (الجينوم والبروتين).تظهر نتائجنا أنه من بين الأجزاء الأجنبية من ccfDNA للحيوانات متعددة الخلايا ، يسود الحمض النووي للعظام العظمية (الشكل 5).كما تم العثور على أجزاء من الحمض النووي من الحشرات وأنواع أخرى.لم يتم تحديد جزء كبير نسبيًا من شظايا الحمض النووي ، ربما بسبب التمثيل الناقص لعدد كبير من الأنواع البحرية في قواعد البيانات الجينية مقارنة بالأنواع الأرضية [49].
في هذه الورقة ، نطبق مفهوم LB على بلح البحر ، بحجة أن تسلسل طلقات الدملمف ccfDNA يمكن أن يوفر نظرة ثاقبة لتكوين النظم الإيكولوجية الساحلية البحرية.على وجه الخصوص ، وجدنا أن 1) بلح البحر الدملمف يحتوي على تركيزات عالية نسبيًا (مستويات ميكروغرام) من شظايا DNA كبيرة نسبيًا (~ 1-5 كيلو بايت).2) شظايا الحمض النووي هذه مستقلة وغير مستقلة. 3) من بين المصادر الأجنبية لشظايا الحمض النووي هذه ، وجدنا الحمض النووي البكتيري والبدئي والفيروسي ، وكذلك الحمض النووي للحيوانات الأخرى متعددة الخلايا ؛4) يحدث تراكم شظايا ccfDNA الأجنبية في الدملمف بسرعة ويساهم في نشاط الترشيح الداخلي لبلح البحر.في الختام ، توضح دراستنا أن مفهوم LB ، الذي تم تطبيقه حتى الآن بشكل رئيسي في مجال الطب الحيوي ، يشفر مصدرًا غنيًا ولكن غير مستكشف للمعرفة يمكن استخدامه لفهم التفاعل بين الأنواع الخافرة وبيئتها بشكل أفضل.
بالإضافة إلى الرئيسيات ، تم الإبلاغ عن عزل ccfDNA في الثدييات ، بما في ذلك الفئران والكلاب والقطط والخيول [50 ، 51 ، 52].ومع ذلك ، على حد علمنا ، فإن دراستنا هي الأولى التي أبلغت عن اكتشاف وتسلسل ccfDNA في الأنواع البحرية بنظام دوران مفتوح.قد تفسر هذه الميزة التشريحية وقدرة الترشيح لبلح البحر ، جزئيًا على الأقل ، الخصائص الحجمية المختلفة لشظايا الحمض النووي المنتشرة مقارنة بالأنواع الأخرى.في البشر ، تكون معظم شظايا الحمض النووي المنتشرة في الدم عبارة عن أجزاء صغيرة يتراوح حجمها من 150 إلى 200 زوج قاعدي.بحد أقصى 167 نقطة أساس [34 ، 53].يتراوح حجم جزء صغير ولكن مهم من شظايا الحمض النووي بين 300 و 500 زوج قاعدي ، وحوالي 5 ٪ أطول من 900 زوج قاعدي.[54].والسبب في هذا التوزيع الحجمي هو أن المصدر الرئيسي لـ ccfDNA في البلازما يحدث نتيجة موت الخلايا ، إما بسبب موت الخلايا أو بسبب نخر الخلايا المكونة للدم المنتشرة في الأفراد الأصحاء أو بسبب موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية في مرضى السرطان (المعروف باسم DNA الورم المنتشر).، ctDNA).تراوح توزيع حجم الدملمف ccfDNA الذي وجدناه في بلح البحر من 1000 إلى 5000 نقطة أساس ، مما يشير إلى أن بلح البحر ccfDNA له أصل مختلف.هذه فرضية منطقية ، لأن بلح البحر لديه نظام وعائي شبه مفتوح ويعيش في بيئات مائية بحرية تحتوي على تركيزات عالية من الحمض النووي الجيني الجرثومي.في الواقع ، أظهرت تجاربنا المعملية باستخدام الحمض النووي الخارجي أن بلح البحر يراكم شظايا الحمض النووي في مياه البحر ، على الأقل بعد بضع ساعات تتحلل بعد امتصاص الخلايا و / أو إطلاقها و / أو تخزينها في منظمات مختلفة.نظرًا لندرة الخلايا (بدائية النواة وحقيقية النواة) ، فإن استخدام المقصورات داخل الصمام سيقلل من كمية ccfDNA من المصادر الذاتية وكذلك من المصادر الأجنبية.بالنظر إلى أهمية المناعة الفطرية ذات الصدفتين والعدد الكبير من البالعات المنتشرة ، افترضنا أيضًا أنه حتى ccfDNA الأجنبية يتم إثرائها في البالعات المنتشرة التي تتراكم الحمض النووي الأجنبي عند ابتلاع الكائنات الحية الدقيقة و / أو الحطام الخلوي.مجتمعة ، تُظهر نتائجنا أن ccfDNA ذو الصدفتين الدموي هو مستودع فريد للمعلومات الجزيئية ويعزز وضعها كأنواع خفر.
تشير بياناتنا إلى أن التسلسل والتحليل لشظايا ccfDNA المشتقة من البكتيريا يمكن أن يوفر معلومات أساسية حول النباتات البكتيرية المضيفة والبكتيريا الموجودة في النظام البيئي البحري المحيط.كشفت تقنيات تسلسل الطلقات عن تسلسل البكتيريا المتعايشة A. atra gill التي كان من الممكن تفويتها إذا تم استخدام طرق التعرف على rRNA التقليدية 16S ، ويرجع ذلك جزئيًا إلى تحيز مكتبة مرجعية.في الواقع ، أظهر استخدامنا لبيانات LB التي تم جمعها من M. platensis في نفس طبقة بلح البحر في Kerguelen أن تكوين المتعايشات البكتيرية المرتبطة بالخياشيم كان هو نفسه لكل من نوعي بلح البحر (الشكل S4 ، معلومات تكميلية).قد يعكس هذا التشابه بين بلح البحر المختلفين وراثيًا تكوين المجتمعات البكتيرية في الرواسب الباردة والكبريتية والبركانية لكيرجولين [55 ، 56 ، 57 ، 58].تم وصف المستويات الأعلى من الكائنات الدقيقة التي تقلل الكبريت بشكل جيد عند حصاد بلح البحر من المناطق الساحلية المضطربة بيولوجيًا [59] ، مثل ساحل بورت أو فرانس.والاحتمال الآخر هو أن نباتات بلح البحر المتعايشة قد تتأثر بالنقل الأفقي [60 ، 61].هناك حاجة إلى مزيد من البحث لتحديد العلاقة بين البيئة البحرية وسطح قاع البحر وتكوين البكتيريا التكافلية في بلح البحر.هذه الدراسات جارية حاليا.
يعد طول وتركيز ccfDNA الدملمفي ، وسهولة تنقيته ، وجودته العالية للسماح بالتسلسل السريع للبنادق من بعض المزايا العديدة لاستخدام بلح البحر ccfDNA لتقييم التنوع البيولوجي في النظم البيئية الساحلية البحرية.هذا النهج فعال بشكل خاص في توصيف المجتمعات الفيروسية (الفيروسات) في نظام بيئي معين [62 ، 63].على عكس البكتيريا والعتائق وحقيقيات النوى ، لا تحتوي الجينومات الفيروسية على جينات محفوظة نسبيًا مثل متواليات 16S.تشير نتائجنا إلى أنه يمكن استخدام الخزعات السائلة من أنواع المؤشرات مثل بلح البحر لتحديد أعداد كبيرة نسبيًا من شظايا فيروس ccfDNA المعروف أنها تصيب العوائل التي تعيش عادةً في النظم الإيكولوجية البحرية الساحلية.وهذا يشمل الفيروسات المعروفة بأنها تصيب الأوليات ، والمفصليات ، والحشرات ، والنباتات ، والفيروسات البكتيرية (مثل العاثيات).تم العثور على توزيع مماثل عندما فحصنا الدملمف ccfDNA virome لبلح البحر الأزرق (M. platensis) التي تم جمعها في نفس طبقة بلح البحر في Kerguelen (الجدول S2 ، المعلومات التكميلية).إن تسلسل البندقية لـ ccfDNA هو بالفعل طريقة جديدة تكتسب زخمًا في دراسة فيروم البشر أو الأنواع الأخرى [21 ، 37 ، 64].هذا النهج مفيد بشكل خاص لدراسة فيروسات الدنا مزدوجة الشريطة ، حيث لا يتم حفظ جين واحد بين جميع فيروسات الدنا مزدوجة الشريطة ، والتي تمثل أكثر فئات الفيروسات تنوعًا واتساعًا في بالتيمور [65].على الرغم من أن معظم هذه الفيروسات لا تزال غير مصنفة وقد تشمل فيروسات من جزء غير معروف تمامًا من العالم الفيروسي [66] ، وجدنا أن الفيروسات ونطاقات العوائل لبلح البحر A. atra و M. platensis تقع بين النوعين.بالمثل (انظر الشكل S3 ، معلومات إضافية).هذا التشابه ليس مفاجئًا ، لأنه قد يعكس نقصًا في الانتقائية في امتصاص الحمض النووي الموجود في البيئة.هناك حاجة حاليًا لدراسات مستقبلية باستخدام الحمض النووي الريبي المنقى لتوصيف فيروم الحمض النووي الريبي.
في دراستنا ، استخدمنا خط أنابيب صارم للغاية تم تكييفه من عمل Kowarski وزملائه [37] ، الذين استخدموا حذفًا من خطوتين للقراءات المجمعة و contigs قبل وبعد تجميع ccfDNA الأصلي ، مما أدى إلى نسبة عالية من القراءات غير المعينة.لذلك ، لا يمكننا استبعاد أن بعض هذه القراءات غير المعينة قد يكون لها أصل خاص بها ، ويرجع ذلك أساسًا إلى عدم وجود جينوم مرجعي لهذا النوع من بلح البحر.استخدمنا أيضًا خط الأنابيب هذا لأننا كنا قلقين بشأن الكيميرات بين القراءات الذاتية وغير الذاتية وأطوال القراءة الناتجة عن Illumina MiSeq PE75.سبب آخر لغالبية القراءات المجهولة هو أن الكثير من الميكروبات البحرية ، خاصة في المناطق النائية مثل Kerguelen ، لم يتم شرحها.استخدمنا Illumina MiSeq PE75 ، بافتراض أن أطوال جزء ccfDNA تشبه ccfDNA البشري.بالنسبة للدراسات المستقبلية ، نظرًا لنتائجنا التي تظهر أن الدملمف ccfDNA لديه قراءة أطول من البشر و / أو الثدييات ، نوصي باستخدام منصة تسلسل أكثر ملاءمة لشظايا ccfDNA الأطول.ستجعل هذه الممارسة من السهل تحديد المزيد من المؤشرات لتحليل أعمق.إن الحصول على تسلسل الجينوم النووي الكامل لـ A. atra غير المتاح حاليًا من شأنه أيضًا تسهيل تمييز ccfDNA من المصادر الذاتية وغير الذاتية.بالنظر إلى أن بحثنا ركز على إمكانية تطبيق مفهوم الخزعة السائلة على بلح البحر ، نأمل أنه نظرًا لاستخدام هذا المفهوم في الأبحاث المستقبلية ، سيتم تطوير أدوات وخطوط أنابيب جديدة لزيادة إمكانات هذه الطريقة لدراسة التنوع الميكروبي لبلح البحر.النظام البيئي البحري.
بصفتها علامة بيولوجية سريرية غير جراحية ، ترتبط مستويات البلازما البشرية المرتفعة من ccfDNA بأمراض مختلفة وتلف الأنسجة وظروف الإجهاد [67،68،69].ترتبط هذه الزيادة بإطلاق أجزاء من الحمض النووي من أصلها بعد تلف الأنسجة.لقد عالجنا هذه المشكلة باستخدام الإجهاد الحراري الحاد ، حيث تعرض بلح البحر لفترة وجيزة لدرجة حرارة 30 درجة مئوية.أجرينا هذا التحليل على ثلاثة أنواع مختلفة من بلح البحر في ثلاث تجارب مستقلة.ومع ذلك ، لم نجد أي تغيير في مستويات ccfDNA بعد الإجهاد الحراري الحاد (انظر الشكل S5 ، معلومات إضافية).قد يفسر هذا الاكتشاف ، على الأقل جزئيًا ، حقيقة أن بلح البحر لديها نظام دوري شبه مفتوح وتراكم كميات كبيرة من الدنا الغريب بسبب نشاط الترشيح العالي.من ناحية أخرى ، قد يكون بلح البحر ، مثل العديد من اللافقاريات ، أكثر مقاومة لتلف الأنسجة الناجم عن الإجهاد ، وبالتالي يحد من إطلاق ccfDNA في الدملمف [70 ، 71].
حتى الآن ، ركز تحليل الحمض النووي للتنوع البيولوجي في النظم الإيكولوجية المائية بشكل أساسي على عملية التمثيل الغذائي للحمض النووي البيئي (eDNA).ومع ذلك ، عادة ما تكون هذه الطريقة محدودة في تحليل التنوع البيولوجي عند استخدام البادئات.يتغلب استخدام تسلسل البندقية على قيود PCR والاختيار المتحيز لمجموعات التمهيدي.وبالتالي ، فإن طريقتنا أقرب إلى طريقة تسلسل بندقية eDNA عالية الإنتاجية المستخدمة مؤخرًا ، والتي يمكنها مباشرة تسلسل الحمض النووي المجزأ وتحليل جميع الكائنات الحية تقريبًا [72 ، 73].ومع ذلك ، هناك عدد من القضايا الأساسية التي تميز LB عن أساليب eDNA القياسية.بالطبع ، يتمثل الاختلاف الرئيسي بين eDNA و LB في استخدام مضيفات المرشح الطبيعي.تم الإبلاغ عن استخدام الأنواع البحرية مثل الإسفنج وذوات الصدفتين (Dresseina spp.) كمرشح طبيعي لدراسة الحمض النووي الريبي النووي [74 ، 75].ومع ذلك ، استخدمت دراسة دريسينا خزعات الأنسجة التي تم استخراج الحمض النووي منها.لا يتطلب تحليل ccfDNA من LB خزعة من الأنسجة ، ومعدات متخصصة وغالية الثمن أحيانًا ولوجستيات مرتبطة بـ eDNA أو خزعة الأنسجة.في الواقع ، أبلغنا مؤخرًا أن ccfDNA من LB يمكن تخزينها وتحليلها بدعم من اتفاقية التجارة الحرة دون الحفاظ على سلسلة التبريد ، وهو ما يمثل تحديًا كبيرًا للبحث في المناطق النائية [76].يعد استخراج ccfDNA من الخزعات السائلة أمرًا بسيطًا أيضًا ويوفر الحمض النووي عالي الجودة لتسلسل البنادق وتحليل PCR.هذه ميزة كبيرة بالنظر إلى بعض القيود الفنية المرتبطة بتحليل eDNA [77].البساطة والتكلفة المنخفضة لطريقة أخذ العينات مناسبة بشكل خاص لبرامج المراقبة طويلة المدى.بالإضافة إلى قدرتها العالية على الترشيح ، فإن السمة المعروفة الأخرى لذوات الصدفتين هي التركيب الكيميائي لعديد السكاريد المخاطي للمخاط ، والذي يعزز امتصاص الفيروسات [78 ، 79].وهذا يجعل المحاريات ذات الصدفتين مرشحًا طبيعيًا مثاليًا لوصف التنوع البيولوجي وتأثير تغير المناخ في نظام بيئي مائي معين.على الرغم من أن وجود شظايا الحمض النووي المشتق من المضيف يمكن اعتباره قيدًا على الطريقة مقارنةً بـ eDNA ، إلا أن التكلفة المرتبطة بالحصول على ccfDNA الأصلي مقارنة بـ eDNA يمكن فهمها في نفس الوقت للكم الهائل من المعلومات المتاحة للدراسات الصحية.مضيف الإزاحة.يتضمن ذلك وجود تسلسلات فيروسية مدمجة في جينوم المضيف المضيف.هذا مهم بشكل خاص لبلح البحر ، نظرًا لوجود فيروسات اللوكيميا القهقرية المنقولة أفقيًا في ذوات الصدفتين [80 ، 81].ميزة أخرى لـ LB على eDNA هي أنها تستغل النشاط البلعمي لخلايا الدم المنتشرة في الدملمف ، والتي تبتلع الكائنات الحية الدقيقة (وجينوماتها).البلعمة هي الوظيفة الرئيسية لخلايا الدم في ذوات الصدفتين [82].أخيرًا ، تستفيد الطريقة من قدرة الترشيح العالية لبلح البحر (متوسط ​​1.5 لتر / ساعة من مياه البحر) والدورة الدموية لمدة يومين ، مما يزيد من اختلاط طبقات مختلفة من مياه البحر ، مما يسمح بالتقاط الحمض النووي الريبي غير المتجانسة.[83 ، 84].وبالتالي ، يعد تحليل ccfDNA بلح البحر وسيلة مثيرة للاهتمام بالنظر إلى التأثيرات الغذائية والاقتصادية والبيئية لبلح البحر.على غرار تحليل LB الذي تم جمعه من البشر ، تفتح هذه الطريقة أيضًا إمكانية قياس التغيرات الجينية والتخلقية في الحمض النووي للمضيف استجابةً للمواد الخارجية.على سبيل المثال ، يمكن تصور تقنيات التسلسل من الجيل الثالث لإجراء تحليل مثيلة على مستوى الجينوم في ccfDNA الأصلي باستخدام تسلسل النانو.يجب تسهيل هذه العملية من خلال حقيقة أن طول شظايا ccfDNA بلح البحر متوافق بشكل مثالي مع منصات التسلسل طويلة القراءة التي تسمح بتحليل مثيلة الحمض النووي على نطاق الجينوم من تسلسل واحد دون الحاجة إلى تحويلات كيميائية.لذلك ، يمكن أن يوفر نظرة ثاقبة حول الآليات الأساسية التي تحكم الاستجابة بعد التعرض لتغير المناخ أو الملوثات [87].ومع ذلك ، فإن استخدام LB لا يخلو من القيود.وغني عن القول أن هذا يتطلب وجود أنواع مؤشر في النظام البيئي.كما ذكر أعلاه ، فإن استخدام LB لتقييم التنوع البيولوجي لنظام بيئي معين يتطلب أيضًا خط أنابيب صارم للمعلومات الحيوية يأخذ في الاعتبار وجود أجزاء من الحمض النووي من المصدر.مشكلة رئيسية أخرى هي توافر الجينوم المرجعي للأنواع البحرية.ومن المأمول أن تسهل مبادرات مثل مشروع جينومات الثدييات البحرية ومشروع Fish10k الذي تم إنشاؤه مؤخرًا [88] مثل هذا التحليل في المستقبل.يتوافق تطبيق مفهوم LB على الكائنات البحرية التي تغذي المرشح أيضًا مع أحدث التطورات في تكنولوجيا التسلسل ، مما يجعلها مناسبة تمامًا لتطوير مؤشرات حيوية متعددة أوم لتوفير معلومات مهمة حول صحة الموائل البحرية استجابة للإجهاد البيئي.
تم إيداع بيانات تسلسل الجينوم في أرشيف قراءة تسلسل NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 ضمن Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS ، Kingsford MJ تأثير تغير المناخ على الحياة البحرية والنظم البيئية.كول بيولوجيا.2009 ؛19: P602-P614.
Gissi E و Manea E و Mazaris AD و Fraschetti S و Almpanidou V و Bevilacqua S et al.ضع في اعتبارك الآثار المجتمعة لتغير المناخ والضغوط المحلية الأخرى على البيئة البحرية.البيئة العلمية العامة.2021 ؛ 755: 142564.
Carella F ، Antuofermo E ، Farina S ، Salati F ، Mandas D ، Prado P ، et al.).علوم الاول من مارس.2020 ؛ 07:48.
Seront L، Nicastro CR، Zardi GI، Goberville E. يفسر انخفاض تحمل الحرارة تحت ظروف الإجهاد الحراري المتكررة معدل النفوق الصيفي المرتفع لبلح البحر الأزرق.التقرير العلمي 2019 ؛9: 17498.
Fey SB و Siepielski AM و Nussle S و Cervantes-Yoshida K و Hwan JL و Huber ER وآخرون.التغييرات الحديثة في تواتر وأسباب ومدى نفوق الحيوانات.Proc Natl Acad Sci USA.2015 ؛ 112: 1083-8.
Scarpa F و Sanna D و Azzena I و Mughetti D و Cerruti F و Hosseini S وآخرون.ربما تسببت العديد من مسببات الأمراض غير الخاصة بالأنواع في حدوث وفيات جماعية لـ Pinna nobilis.حياة.2020 ؛ 10:238.
برادلي إم ، كوتس إس جيه ، جينكينز إي ، أوهارا TM.التأثير المحتمل لتغير المناخ على الأمراض الحيوانية المنشأ في القطب الشمالي.Int ياء الصحة المحيطية.2005 ؛64: 468 - 77.
Beyer J. و Greene NW و Brooks S. و Allan IJ و Ruus A. و Gomez T. et al.بلح البحر الأزرق (Mytilus edulis spp.) ككائنات إشارات في مراقبة التلوث الساحلي: مراجعة.مارس البيئة ريس 2017 ؛130: 338-65.
Siravegna G ، Marsoni S ، Siena S ، Bardelli A. تكامل الخزعة السائلة في علاج السرطان.نات ريف كلين أونكول.2017 ؛14: 531–48.
Wan JCM و Massie C و Garcia-Corbacho J و Mouliere F و Brenton JD و Caldas C et al.نضج الخزعة السائلة: يسمح للحمض النووي للورم بالانتشار.نات ريف السرطان.2017 ؛ 17: 223-38.
ماندل بي ، ميتيس P. الأحماض النووية في بلازما الإنسان.محاضر اجتماعات الشركات التابعة لشركة Soc Biol.1948 ؛142: 241-3.
Bronkhorst AJ، Ungerer W، Holdenrieder S. دور جديد للحمض النووي الخالي من الخلايا كواسم جزيئي لعلاج السرطان.القياس الكمي للتحليل البيومولار.2019 ؛ 17: 100087.
Ignatiadis M. ، Sledge GW ، Jeffrey SS خزعة سائلة تدخل العيادة - قضايا التنفيذ والتحديات المستقبلية.نات ريف كلين أونكول.2021 ؛18: 297-312.
Lo YM و Corbetta N. و Chamberlain PF و Rai W. و Sargent IL و Redman CW وغيرهم.الحمض النووي للجنين موجود في بلازما الأم ومصل الدم.لانسيت.1997 ؛350: 485-7.
Mufarray MN ، Wong RJ ، Shaw GM ، Stevenson DK ، Quake SR دراسة عن مسار الحمل ومضاعفاته باستخدام الحمض النووي الريبي خارج الخلية في دم المرأة أثناء الحمل.طب الأطفال.2020 ؛ 8: 605219.
أوليريش م ، شيروود ك ، كيون ف ، شوتز إي ، بيك J ، ستيجباور ي ، وآخرون.الخزعة السائلة: يستخدم الحمض النووي الخالي من الخلايا للكشف عن الآفات الخيفية في طعم الكلى.نات ريف نفرول.2021 ؛17: 591 - 603.
Juan FC ، Lo YM الابتكارات في التشخيص قبل الولادة: تسلسل جينوم بلازما الأم.آنا دكتوراه في الطب.2016 ؛ 67: 419-32.
Gu W و Deng X و Lee M و Sucu YD و Arevalo S و Stryke D وآخرون.الكشف السريع عن العوامل الممرضة مع الجيل التالي من التسلسل الميتاجينومي لسوائل الجسم المصابة.نات الطب.2021 ؛ 27: 115-24.