شكرًا لك على زيارة Nature.com ، إصدار المتصفح الذي تستخدمه يحتوي على دعم محدود لـ CSS ، وللحصول على أفضل تجربة ، نوصيك باستخدام متصفح محدث (أو إيقاف تشغيل وضع التوافق في Internet Explorer) ، وفي غضون ذلك ، لضمان استمرار الدعم ، سنعرض الموقع بدون أنماط وجافا سكريبت.
تم تحضير جزيئات السيليكا المسامية باستخدام طريقة sol-gel مع بعض التعديلات للحصول على جزيئات كبيرة المسام. تم اشتقاق هذه الجسيمات عن طريق بلمرة نقل سلسلة تجزئة الإضافة القابلة للانعكاس (RAFT) باستخدام N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) والستايرين لتحضير إقحام N-phenylmaleimide المعبأ من البوليسترين (PMP). التعبئة ry. فصل العمود PMP المقيَّم لمزيج الببتيد المكون من خمسة ببتيدات (Gly-Tyr ، Gly-Leu-Tyr ، Gly-Gly-Tyr-Arg ، Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg ، leucine enkephalin) الأداء الكروماتوغرافي) وهضم التربسين لظروف المصل البشري. 280.000 لوح / م² مقارنة أداء الفصل للعمود المطور مع عمود Ascentis Express RP-Amide التجاري ، لوحظ أن أداء الفصل لعمود PMP كان متفوقًا على العمود التجاري من حيث كفاءة الفصل والدقة.
في السنوات الأخيرة ، أصبحت صناعة المستحضرات الصيدلانية الحيوية سوقًا عالميًا متوسعًا مع زيادة كبيرة في حصتها في السوق ، ومع النمو الهائل لصناعة المستحضرات الصيدلانية الحيوية 1،2،3 ، فإن تحليل الببتيدات والبروتينات أمر مطلوب للغاية ، بالإضافة إلى الببتيد المستهدف ، يتم إنشاء العديد من الشوائب أثناء تخليق الببتيد ، مما يتطلب تنقية كروماتوجرافي للحصول على ببتيدات كبيرة ونقاوة للأنسجة. عدد الأنواع التي يمكن اكتشافها في عينة واحدة ، على الرغم من أن قياس الطيف الكتلي هو أداة فعالة لتسلسل الببتيد والبروتين ، وبالتالي إذا تم حقن هذه العينات في مطياف الكتلة في مسار واحد ، فلن يكون الفصل مثاليًا ، ويمكن تخفيف هذه المشكلة عن طريق تنفيذ عمليات الفصل الكروماتوجرافي السائلة (LC) قبل تحليل MS ، مما يقلل من عدد التحليلات التي تدخل إلى مناطق التحليل الطيفي للكتلة ، في مرحلة التركيز الضيقة 4 ، 5 ، في مرحلة الفصل. تصنيف هذه التحليلات وتحسين حساسية الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد. تقدم الكروماتوغرافيا السائلة (LC) بشكل ملحوظ خلال العقد الماضي وأصبح تقنية شائعة في التحليل البروتيني.
يستخدم كروماتوغرافيا السائل ذات الطور العكسي (RP-LC) على نطاق واسع لتنقية وفصل مخاليط الببتيد باستخدام السيليكا المعدلة بأوكتاديسيل (ODS) كمرحلة ثابتة 11 ، 12 ، 13 ومع ذلك ، لا توفر مراحل RP الثابتة فصلًا مرضيًا للببتيدات والبروتينات نظرًا لتركيبها المعقد وطبيعة المحطة البرمائية غير المصممة خصيصًا. - شقوق قطبية للتفاعل مع هذه التحليلات والاحتفاظ بها .16- يمكن أن تكون كروماتوغرافيا الوضع المختلط ، التي توفر تفاعلات متعددة الوسائط ، بديلاً لـ RP-LC لفصل الببتيدات والبروتينات والخلائط المعقدة الأخرى. IC / RPLC ، الإقحام القطبي / RPLC) مناسبة لفصل الببتيد والبروتين بسبب وجود كل من المجموعات القطبية وغير القطبية.التفاعلات متعددة الوسائط 29 ، 30 ، 31 ، 32. مؤخرًا ، زانغ وآخرون.أعد 30 طورًا ثابتًا من البوليامين منتهيًا بالدوديسيل وفصل بنجاح الهيدروكربونات ومضادات الاكتئاب والفلافونويد والنيوكليوسيدات والإستروجينات والعديد من التحليلات الأخرى. الاسم التجاري Ascentis Express RP-Amide أعمدة ، ولكن هذه الأعمدة تستخدم لتحليل أمين 33 فقط.
في الدراسة الحالية ، تم تحضير مرحلة ثابتة قطبية (بوليسترين مضمن بـ N-phenylmaleimide) وتقييمها لفصل الببتيدات وهضم التربسين لـ HSA ، وتم تحضير المرحلة الثابتة باستخدام الإستراتيجية التالية ، وتم تحضير جزيئات السيليكا المسامية وفقًا للإجراء الوارد في منشورنا السابق مع بعض التعديلات على بروتوكول التحضير. الحجم الثاني ، يجند جديد ، فينيل مالاليميد - ميثيل فينيل أيزوسيانات ، تم تصنيعه واستخدامه في اشتقاق جزيئات السيليكا لتحضير مرحلة ثابتة قطبية مدمجة ، وتم تعبئة المرحلة الثابتة الناتجة في عمود فولاذي مقاوم للصدأ (100 × 1.8 مم معرف) باستخدام مخطط التعبئة الأمثل. يتم مساعدة تعبئة العمود بالاهتزاز الميكانيكي الذي يتكون من ببتة بعمود فصل متجانس.(Gly-Tyr و Gly-Leu-Tyr و Gly-Gly-Tyr-Arg و Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg و Leucine Enkephalin) وهضم التربسين لألبومين المصل البشري (HAS) ولوحظ أن خليط الببتيد وهضم التربسين من HSA ينفصلان بدقة وكفاءة جيدة. لوحظ أنه تم حله بشكل جيد وكفاءة في عمود PMP ، والذي كان أكثر كفاءة من عمود Ascentis Express RP-Amide.
PEG (بولي إيثيلين جلايكول) ، يوريا ، حمض الأسيتيك ، ثلاثي ميثوكسي أورثوسيليكات (TMOS) ، ثلاثي ميثيل كلورو سيلان (TMCS) ، التربسين ، مصل الألبومين البشري (HSA) ، كلوريد الأمونيوم ، اليوريا ، هيكسان ميثيل ديسيلازان (HMDS) ، ميثاكريلول (هيدروكسيد) PO) ، HPLC Grade Acetonitrile (ACN) ، Methanol ، 2-Propanol ، و Acetone تم شراؤها من Sigma-Aldrich (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية).
تم تقليب خليط من اليوريا (8 جم) ، بولي إيثيلين جلايكول (8 جم) ، و 8 مل من 0.01 نيتروجين من حمض الأسيتيك لمدة 10 دقائق ، ثم تمت إضافة 24 مل من TMOS إليها تحت ظروف باردة بالثلج. تم تسخين خليط التفاعل عند 40 درجة مئوية لمدة 6 ساعات ثم عند 120 درجة مئوية لمدة 8 ساعات في الأوتوكلاف الصلب غير القابل للصدأ. درجة مئوية لمدة 12 ساعة تم تحضير ثلاث دفعات وتمييزها لفحص قابلية التكاثر في حجم الجسيمات وحجم المسام ومساحة السطح.
تم تحضير مركب يحتوي على مجموعة قطبية من خلال تعديل سطح جسيمات السيليكا باستخدام يجند مركب مسبقًا فينيل ماليميد - ميثيل فينيل أيزوسيانات (PCMP) متبوعًا بلمرة شعاعية مع ستيرين.المرحلة الثابتة للركام وسلاسل البوليسترين ، وعملية التحضير موضحة أدناه.
تمت إذابة N-phenylmaleimide (200 مجم) و methyl vinyl isocyanate (100 مجم) في التولوين الجاف ، ويضاف 0.1 مل من 2،2-azoisobutyronitrile (AIBN) إلى قارورة التفاعل لتحضير بوليمر مشترك فينيل الماليميد-ميثيل فينيل إيزوسيانات (PMCP). يسخن الخليط عند 60 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ويجفف في الفرن لمدة 3 ساعات.
تم تشتيت جزيئات السيليكا المجففة (2 جم) في التولوين الجاف (100 مل) ، وتم تقليبها وصوتها في دورق مستدير سعة 500 مل لمدة 10 دقائق. تمت إذابة PMCP (10 مجم) في التولوين وإضافتها بالتنقيط إلى دورق التفاعل عن طريق قمع تنقيط. تمت إعادة تدفق الخليط عند 100 درجة مئوية لمدة 8 ساعات ، ثم ترشيحها وتجفيفها باستخدام الأسيتون. يذوب في تولوين (200 مل) ويضاف 4-هيدروكسي- TEMPO (2 مل) في وجود 100 ميكرولتر من مادة dibutyltin كمادة حفازة. يقلب الخليط عند 50 درجة مئوية لمدة 8 ساعات ، ويرشح ويجفف عند 50 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
تم تفريق الستايرين (1 مل) ، وبنزويل بيروكسيد BPO (0.5 مل) ، وجزيئات السيليكا المتصلة بـ TEMPO-PMCP (1.5 جم) في التولوين وتطهيرها بالنيتروجين. تم تنفيذ بلمرة الستايرين عند 100 درجة مئوية لمدة 12 ساعة ، وتم غسل المنتج الناتج بالميثانول وتجفيفه عند 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
تم تفريغ العينات عند 393 كلفن لمدة ساعة واحدة للحصول على ضغط متبقي أقل من 10-3 تور ، تم استخدام كمية N2 الممتصة عند ضغط نسبي من P / P0 = 0.99 لتحديد حجم المسام الكلي ، وتم فحص مورفولوجيا جزيئات السيليكا العارية والمترابطة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (Hitachi High Technologies ، طوكيو ، اليابان) تم وضع جزيئات السليكا اللاصقة المجففة بشريط من الكربون (Hitachi High Technologies ، طوكيو ، اليابان). تم طلاء الذهب على العينات باستخدام مغطي رشاش Q150T ، وتم ترسيب طبقة 5 نانومتر Au على العينات ، مما يحسن كفاءة العملية باستخدام الفولتية المنخفضة ويوفر حبيبات دقيقة ورذاذ بارد. تم تشتيت جزيئات السيليكا المترابطة (5 مجم لكل منهما) في 5 مل من الأيزوبروبانول ، صوتنة لمدة 10 دقائق ، دوامة لمدة 5 دقائق ، ووضعها على المنضدة الضوئية لـ Mastersizer. تم إجراء التحليل الوزني الحراري بمعدل 5 درجات مئوية في الدقيقة على مدى درجة حرارة من 30 إلى 800 درجة مئوية.
تم تعبئة أعمدة ذات أبعاد ضيقة من الفولاذ المقاوم للصدأ مبطنة بالزجاج (100 × 1.8 مم معرف) باستخدام طريقة تعبئة الملاط ، مع تطبيق نفس الإجراء المستخدم في المرجع.31- تم توصيل عمود من الصلب غير القابل للصدأ (مبطن بالزجاج ، 100 × 1.8 مم معرف) مع تركيب مخرج يحتوي على فريت 1 ميكرومتر مع وحدة تعبئة ملاط ​​(Alltech Deerfield ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكية). قم بإعداد ملاط ​​طور ثابت عن طريق تعليق 150 مجم من الطور الثابت في 1.2 مل من الميثانول وإرساله إلى عمود التخزين. ضغوط 100 ميجابكسل لمدة 10 دقائق و 80 ميجابكسل لمدة 15 دقيقة و 60 ميجابكسل لمدة 30 دقيقة. أثناء التعبئة ، تم تطبيق اهتزاز ميكانيكي باستخدام هزازات عمود GC (Alltech ، Deerfield ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكية) لضمان تعبئة موحدة للعمود ، أغلق عبوة الملاط وحرر الضغط ببطء لمنع أي ضرر داخل العمود ، افصل العمود عن وحدة الملاط الخاصة به في نظام التعبئة وقم بتوصيل العمود من وحدة الملاط الخاصة به في نظام التعبئة.
مضخة LC (10AD Shimadzu ، اليابان) ، حاقن (Valco (الولايات المتحدة الأمريكية) C14 W.05) مع حلقة حقن 50nL ، مزيل الغازات الغشائية (Shimadzu DGU-14A) ، تم إنشاء نافذة شعرية UV-VIS كاشف خاص لجهاز µLC (UV-2075) وأعمدة دقيقة مبطنة بالزجاج. تم تركيب 365 وشعيرات نقابية مختزلة (50 ميكرومتر) في منفذ 1/16 من الاتحاد المختزل.تم جمع البيانات والمعالجة الكروماتوجرافية باستخدام برنامج Multichro 2000. تم اختبار تحليلات 254 نانومتر لامتصاص الأشعة فوق البنفسجية. تم تحليل البيانات الكروماتوجرافية بواسطة OriginPro8 (نورثامبتون ، ماساتشوستس).
الألبومين من مصل بشري ، مسحوق مجفد بالتجميد ، ≥ 96٪ (رحلان آغاروز الكهربي) 3 مجم مخلوط مع التربسين (1.5 مجم) ، 4.0 م يوريا (1 مل) ، و 0.2 م من بيكربونات الأمونيوم (1 مل) ، تم تقليب المحلول لمدة 10 دقائق وحفظه في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات ، ثم يخمد مع محلول TFA بنسبة 0.1٪.
تم تقييم فصل مخاليط الببتيد وهضم التربسين HSA بشكل منفصل على أعمدة PMP. تحقق من فصل خليط الببتيد وهضم التربسين لـ HSA بواسطة عمود PMP وقارن النتائج مع عمود Ascentis Express RP-Amide ، ويحسب رقم اللوحة النظرية على النحو التالي:
يتم عرض صور SEM لجزيئات السيليكا العارية وجزيئات السيليكا المترابطة في الشكل.2. توضح صور SEM لجزيئات السيليكا العارية (A ، B) أنه على عكس دراساتنا السابقة ، فإن هذه الجسيمات تكون كروية حيث تكون الجسيمات ممدودة أو لها تناظر غير منتظم ، وسطح جزيئات السيليكا المترابطة (C ، D) أكثر نعومة من جزيئات السيليكا العارية ، والتي قد تكون بسبب طلاء جسيمات البوليسترين على سلاسل السيليكا.
مسح صور المجهر الإلكتروني لجزيئات السيليكا العارية (A ، B) وجزيئات السيليكا المترابطة (C ، D).
يوضح الشكل 3 (أ) توزيعات حجم الجسيمات لجزيئات السيليكا العارية وجزيئات السيليكا المرتبطة بالرابط ، وأظهرت منحنيات توزيع حجم الجسيمات المعتمدة على الحجم أن حجم جزيئات السيليكا زاد بعد التعديل الكيميائي (الشكل 3 أ) ، وتمت مقارنة بيانات توزيع حجم الجسيمات لجزيئات السيليكا من الدراسة الحالية والدراسة السابقة في الجدول 1 (أ) ، وحجم الجسيمات المعتمد على الحجم μP (حجم الجسيمات). 0.5) بقيمة 3.05 ميكرومتر (جزيئات السيليكا المرتبطة بالبوليسترين) 34 ، كان لهذه الدفعة توزيع أضيق لحجم الجسيمات مقارنة بدراستنا السابقة بسبب النسب المتغيرة لـ PEG واليوريا و TMOS وحمض الأسيتيك في خليط التفاعل. سطح السيليكا ، بينما في طور PMP كان سمك الطبقة 1.38 ميكرومتر.
توزيع حجم الجسيمات (أ) وتوزيع حجم المسام (ب) لجزيئات السيليكا العارية وجزيئات السيليكا المرتبطة بالليغاند.
يوضح الجدول 1 (ب) حجم المسام وحجم المسام ومساحة السطح لجزيئات السيليكا للدراسة الحالية ، وتظهر في الشكل 3 (ب) لمحات PSD لجزيئات السيليكا العارية وجزيئات السيليكا المرتبطة بالرباط (B) ، والنتائج قابلة للمقارنة مع دراستنا السابقة. تم عرض ve في الشكل 3 (ب) وبالمثل ، انخفض حجم المسام لجزيئات السيليكا من 0.67 إلى 0.58 سم 3 / جم بعد التعديل الكيميائي ، وتبلغ مساحة السطح المحددة لجزيئات السيليكا المدروسة حاليًا 116 م 2 / جم ، وهو ما يمكن مقارنته بدراستنا السابقة (124 م 2 / جم) كما هو مبين في الجدول 1 (ب) ، انخفضت أيضًا مساحة السطح (م 2 / جم) من تعديل جزيئات السيليكا الكيميائية.
نتائج التحليل الأولي للمرحلة الثابتة موضحة في الجدول 2 ، تحميل الكربون للمرحلة الثابتة الحالية هو 6.35٪ ، وهو أقل من تحميل الكربون في دراستنا السابقة (جزيئات السيليكا المرتبطة بالبوليسترين ، 7.93٪ 35 و 10.21٪ ، على التوالي) 42. إن تحميل الكربون للمرحلة الثابتة الحالية منخفض ، لأنه في تحضير SP الحالي ، بالإضافة إلى الستايغرين ، مثل بعض البولي فينيل البولي فينيل. تم استخدام 4-hydroxy-TEMPO. النسبة المئوية لوزن النيتروجين من المرحلة الثابتة الحالية هي 2.21٪ ، مقارنة بـ 0.1735 و 0.85٪ بالوزن من النيتروجين في الدراسات السابقة ، على التوالي ، وهذا يعني أن نسبة وزن النيتروجين أعلى في المرحلة الثابتة الحالية بسبب فينيل ماليميد ، وبالمثل ، كان تحميل الكربون للمنتجات (4) و (5٪) ، على التوالي ، 2.7٪ ، و (5) ، على التوالي. تم التحقق من فقدان الوزن مع المرحلة الثابتة PMP ، ويظهر منحنى TGA في الشكل 4 ، ويظهر منحنى TGA فقدان الوزن بنسبة 8.6٪ ، وهو ما يتوافق جيدًا مع تحميل الكربون (6.35٪) لأن الروابط لا تحتوي فقط على C ولكن أيضًا على N و O و H.
تم اختيار يجند فينيل ماليميد - ميثيل فينيل أيزوسيانات لتعديل سطح جزيئات السيليكا لأنه يحتوي على مجموعات فينيل ماليميد ومجموعات فينيل أيزوسيانات ، ويمكن لمجموعات فينيل أيزوسيانات أن تتفاعل أكثر مع الستايرين عن طريق البلمرة الجذرية الحية ، والسبب الثاني هو إدخال مجموعة لها تفاعل معتدل مع المادة التحليلية ولا يوجد لها تفاعل إلكتروستاتيكي قوي بين الطور التحليلي. الرقم الهيدروجيني: يمكن التحكم في قطبية المرحلة الثابتة من خلال الكمية المثلى من الستايرين ووقت تفاعل بلمرة الجذور الحرة ، وتعد الخطوة الأخيرة من التفاعل (بلمرة الجذور الحرة) حاسمة ويمكن أن تغير قطبية المرحلة الثابتة ، وقد تم إجراء تحليل إضافي للتحقق من تحميل الكربون لهذه الأطوار الثابتة ، وقد لوحظ أن زيادة كمية الستايرين وزمن التفاعل المختلفة أدت إلى زيادة تركيز الكربون وتحميل الطور مع تركيز الكربون المختلف. ain ، قم بتحميل هذه المراحل الثابتة في أعمدة فولاذية مقاومة للصدأ وتحقق من أدائها الكروماتوغرافي (الانتقائية ، الدقة ، قيمة N ، إلخ.) بناءً على هذه التجارب ، تم اختيار صيغة محسنة لإعداد المرحلة الثابتة PMP لضمان قطبية مضبوطة والاحتفاظ الجيد بالتحليل.
تم أيضًا تقييم خمسة مخاليط من الببتيد (Gly-Tyr و Gly-Leu-Tyr و Gly-Gly-Tyr-Arg و Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg و leucine enkephalin) باستخدام عمود PMP باستخدام مرحلة متحركة ؛60/40 (ت / ت) أسيتونيتريل / ماء (0.1٪ TFA) بمعدل تدفق 80 ميكرولتر / دقيقة تحت ظروف الشطف المثلى ، رقم اللوحة النظري (N) لكل عمود (100 × 1.8 مم معرف) هو 20000 ± 100 (200000 لوحة / م 2) ، الجدول 3 يعطي قيم N لأعمدة PMP الثلاثة وعمود معدل تدفق كروماتوجرام μP في خمسة دقائق. تم استخلاص الببتيدات في غضون دقيقة واحدة ، وكانت قيم N جيدة جدًا ، 13500 ± 330 لكل عمود (100 × 1.8 مم معرف) ، يتوافق مع 135000 لوحة / م (الشكل 5 ب). تم تعبئة ثلاثة أعمدة متماثلة الحجم (معرف 100 × 1.8 مم) بثلاث مجموعات مختلفة من مرحلة PMP الثابتة للتحقق من إمكانية التكاثر. تم تسجيل تركيز التحليلة لكل عمود باستخدام ظروف الشطف المثلى للخليط وعدد الصفائح المنفصلة. يتم عرض أعمدة PMP في الجدول 4. ترتبط إمكانية استنساخ عمود PMP جيدًا بقيم RSD منخفضة جدًا ، كما هو موضح في الجدول 3.
فصل خليط الببتيد على عمود PMP (B) وعمود Ascentis Express RP-Amide (A) ؛المرحلة المتنقلة 60/40 ACN / H2O (TFA 0.1 ٪) ، أبعاد عمود PMP (100 × 1.8 مم معرف) ؛ترتيب الشطف التحليلي للمركبات: 1 (Gly-Tyr) ، 2 (Gly-Leu-Tyr) ، 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg) ، 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) و 5 (ليسين) حمض إنكيفالين)).
تم تقييم عمود PMP (معرف 100 × 1.8 مم) لفصل هضم تريبتي لألبومين المصل البشري في تحليل كروماتوجرافي سائل عالي الأداء. يوضح مخطط الكروماتوجرام في الشكل 6 أن العينة مفصولة جيدًا والدقة جيدة جدًا. 17 ببتيدات تم حساب كفاءة الفصل لكل ذروة في خلاصة HSA وترد القيم في الجدول 5.
تم فصل ملخص تجريبي لـ HSA (100 × 1.8 مم معرف) على عمود PMP ؛معدل التدفق (100 ميكرولتر / دقيقة) ، المرحلة المتحركة 60/40 أسيتونيتريل / ماء بنسبة 0.1٪ TFA.
حيث L هي طول العمود ، η هي لزوجة الطور المتحرك ، P هي الضغط الخلفي للعمود ، و u هي السرعة الخطية للمرحلة المتنقلة. كانت نفاذية عمود PMP 2.5 × 10-14 م 2 ، ومعدل التدفق 25 ميكرولتر / دقيقة ، وتم استخدام 60/40 فولت / فولت ACN / ماء ، وكانت نفاذية العمود PMP السابقة مماثلة (100 × 3). الجسيمات المسامية ظاهريًا هي: 1.7 × 10-15 للجسيمات 1.3 ميكرومتر ، 3.1 × 10-15 للجسيمات 1.7 ميكرومتر ، 5.2 × 10-15 و 2.5 × 10-14 م 2 لجزيئات 2.6 ميكرومتر لجزيئات 5 ميكرومتر 43 ، لذلك ، فإن نفاذية طور PMP تشبه تلك الخاصة بجزيئات النواة المكونة من 5 ميكرومتر.
حيث Wx هو وزن العمود المعبأ بالكلوروفورم ، و Wy هو وزن العمود المعبأ بالميثانول ، و هي كثافة المذيب. وتعني كثافات الميثانول (ρ = 0.7866) والكلوروفورم (ρ = 1.484) المسامية الكلية لأعمدة SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1.8 مم في عمود اليوريا) ، وهذا يعني أننا درسنا سابقًا 0.68 × C18 و 313 عمودًا C18 و 311. تقلل الروابط من نفاذية المرحلة الثابتة ، ومن ناحية أخرى ، فإن المسامية الكلية لعمود PMP (100 × 1.8 مم id) تساوي 0.60 ، وتكون نفاذية أعمدة PMP أقل من الأعمدة المعبأة بجزيئات السيليكا المرتبطة بـ C18 لأنه في المراحل الثابتة من النوع C18 ، يتم ربط روابط C18 بجزيئات السيليكا المتكونة كسلسلة خطية ، بينما تكون نفاذية أعمدة PMP أقل نسبيًا في الأطوار الثابتة من النوع C18 بجزيئات السيليكا المتكونة كسلاسل خطية التجربة ، يتم حساب مسامية العمود على النحو التالي:
يوضح الشكل 7 أ ، ب عمود PMP (معرف 100 × 1.8 مم) وعمود Ascentis Express RP-Amide (معرف 100 × 1.8 مم) باستخدام نفس شروط الشطف (على سبيل المثال ، 60/40 ACN / H2O و 0.1٪ TFA).) من مؤامرة فان ديمتر.تم تحضير مخاليط الببتيد المختارة (Gly-Tyr ، Gly-Leu-Tyr ، Gly-Gly-Tyr-Arg ، Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg ، Leucine Enkephalin) في 20 ميكرولتر / الحد الأدنى لمعدل التدفق لكلا العمودين هو 800 ميكرولتر / دقيقة ، وكانت قيم HETP دقيقة عند معدل التدفق الأمثل للعمود (80 µ). و 3.9 ميكرومتر على التوالي. تشير قيم HETP إلى أن كفاءة الفصل لعمود PMP (100 × 1.8 مم id) أفضل بكثير من عمود Ascentis Express RP-Amide المتوفر تجاريًا (100 × 1.8 مم id). توضح مؤامرة van Deemter في الشكل 7 (أ) أن الانخفاض في قيمة N مع زيادة التدفق ليس مهمًا مقارنة بدراستنا السابقة. الشكل والحجم وإجراءات تعبئة العمود المعقدة المستخدمة في العمل الحالي 34.
(أ) مؤامرة فان Deemter (HETP مقابل السرعة الخطية للطور المتحرك) التي تم الحصول عليها باستخدام عمود PMP (معرف 100 × 1.8 مم) في 60/40 ACN / H2O مع 0.1٪ TFA.
تم تحضير مرحلة ثابتة من البوليسترين المتضمن وتقييمها لفصل مخاليط الببتيد الاصطناعية وهضم التربسين لألبومين المصل البشري (HAS) في كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء ، الأداء الكروماتوغرافي لأعمدة PMP لمخاليط الببتيد ممتاز في كفاءة الفصل ودقة الوضوح ، ويعزى تحسين أداء الفصل لأعمدة PMP إلى مجموعة متنوعة من الجسيمات ، مثل حجم الجسيمات المحفورة في المسام وحجم الجسيمات في المسام. بالإضافة إلى كفاءة الفصل العالية ، يعد الضغط الخلفي المنخفض للعمود عند معدلات التدفق المرتفعة ميزة أخرى لهذه المرحلة الثابتة ، حيث تُظهر أعمدة PMP قابلية استنساخ جيدة ويمكن استخدامها لتحليل مخاليط الببتيد وهضم التربسين للبروتينات المختلفة ، ونعتزم استخدام هذا العمود لفصل المنتجات الطبيعية والمركبات النشطة بيولوجيًا من النباتات الطبية والمستخلصات الفطرية في الأعمدة البروتينية السائلة.
فيلد ، جي كيه ، يوربي ، إم آر ، لاو ، جيه ، ثوجرسن ، إتش آند بيترسون ، ب. بحث حول أنظمة فصل الببتيد بواسطة كروماتوغرافيا الطور المعكوس الجزء الأول: تطوير بروتوكول توصيف العمود.كروماتوغرافيا 1603 ، 113-129 ، https: //doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
جوميز ، ب وآخرون ، تحسين الببتيدات النشطة المصممة لعلاج الأمراض المعدية ، التكنولوجيا الحيوية المتقدمة 36 (2) ، 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe، P.، Lisowski، V.، Martinez، J. & Khrestchatisky، M.
Xie، F.، Smith، RD & Shen، Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J.كروماتوغرافيا A 1261 ، 78-90 (2012).
ليو ، دبليو وآخرون ، يتيح مطياف الكتلة اللوني السائل المتقدم دمج المستقلبات والبروتيوميات المستهدفة على نطاق واسع. anus.Chim.Acta 1069، 89–97 (2019).
Chesnut، SM & Salisbury، JJ دور UHPLC في تطوير الأدوية.سبتمبر Sci.30 (8) ، 1183-1190 (2007).
Wu، N. & Clausen، AM الجوانب الأساسية والعملية للكروماتوجرافيا السائلة ذات الضغط العالي للغاية لعمليات الفصل السريع.سبتمبر Sci.30 (8) ، 1167-1182.https: //doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren، SA & Tchelitcheff، P. تطبيق اللوني السائل فائق الأداء في تطوير الأدوية.الكروماتوغرافيا ، 1119 (1-2) ، 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu، H. et al. الهلاميات المائية أحادية المسام المحضرة من مستحلبات المرحلة الداخلية العالية للزيت في الماء من أجل تنقية الفيروسات المعوية بكفاءة.401 ، 126051 (2020).
شي ، واي ، شيانغ ، آر ، هورفاث ، سي آند ويلكنز ، جا دور الكروماتوغرافيا السائلة في البروتينات.كروماتوغرافيا A 1053 (1-2) ، 27-36 (2004).
Fekete، S.، Veuthey، J.-L. & Guillarme، D. الاتجاهات الناشئة في الفصل الكروماتوجرافي السائل ذي الطور العكسي للببتيدات العلاجية والبروتينات: النظرية والتطبيقات.الصيدلة ، العلوم الطبية الحيوية ، 69 ، 9-27 (2012).
Gilar، M.، Olivova، P.، Daly، AE & Gebler، JC فصل ثنائي الأبعاد للببتيدات باستخدام نظام RP-RP-HPLC باستخدام قيم pH مختلفة في بعدي الفصل الأول والثاني.سبتمبر Sci ، 28 (14) ، 1694-1703 (2005).
Feletti، S. et al. تم فحص خصائص نقل الكتلة والأداء الحركي للأعمدة الكروماتوغرافية عالية الكفاءة المعبأة بجزيئات C18 sub-2 ميكرومتر بشكل كامل وسطحي مسامي.سبتمبر Sci.43 (9-10) ، 1737-1745 (2020).
Piovesana ، S. وآخرون ، الاتجاهات الحديثة والتحديات التحليلية في عزل وتحديد والتحقق من صحة الببتيدات النشطة بيولوجيًا للنبات ، فتحة الشرج البيولوجية ، المواد الكيميائية 410 (15) ، 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
جي بي مولر وآخرون ، المشهد البروتيني لمملكة الحياة ، الطبيعة 582 (7813) ، 592-596 ، https: //doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca، C. et al. المعالجة اللاحقة للببتيدات العلاجية بواسطة تحليل كروماتوجرافي سائل تحضيري جزيء (بازل ، سويسرا) 26 (15) ، 4688 (2021).
Yang ، Y. & Geng ، X. كروماتوغرافيا الوضع المختلط وتطبيقه على البوليمرات الحيوية.كروماتوغرافيا A 1218 (49) ، 8813–8825 (2011).
Zhao ، G. ، Dong ، X.-Y. & Sun ، Y. Ligands للكروماتوغرافيا البروتينية المختلطة: المبدأ والتوصيف والتصميم.التكنولوجيا الحيوية 144 (1) ، 3-11 (2009).