شكرًا لزيارتكم موقع Nature.com. أنتم تستخدمون إصدار متصفح يدعم CSS بشكل محدود. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح مُحدّث (أو تعطيل وضع التوافق في إنترنت إكسبلورر). ولضمان استمرارية الدعم، نعرض الموقع بدون أنماط أو جافا سكريبت.
يعرض عرضًا دائريًا لثلاث شرائح دفعةً واحدة. استخدم زري "السابق" و"التالي" للتنقل بين ثلاث شرائح في آنٍ واحد، أو استخدم أزرار التمرير في النهاية للتنقل بين ثلاث شرائح في آنٍ واحد.
حُضِّرت جسيمات السيليكا المسامية بطريقة السول-جيل مع بعض التعديلات للحصول على جسيمات واسعة المسام. حُوِّلت هذه الجسيمات إلى جسيمات مشتقة باستخدام إن-فينيل ماليميد-ميثيل فينيل إيزوسيانات (PMI) والستايرين عبر بلمرة تجزئة نقل السلسلة العكسية (RAFT) لإنتاج بولي أميدات متداخلة مع إن-فينيل ماليميد. الطور الثابت للستايرين (PMP). حُشِيت أعمدة من الفولاذ المقاوم للصدأ ضيقة الثقب (قطرها الداخلي 100 × 1.8 مم) بحشوة ملاطية. قُيِّم الأداء الكروماتوغرافي لعمود PMP لفصل خليط من الببتيدات الاصطناعية المكونة من خمسة ببتيدات (جلي-تير، جلي-ليو-تير، جلي-جلي-تير-أرج، تير-إيل-جلي-سير-أرج، إنكيفالين حمض ليو الأميني)، ومحلل التربتيك لألبومين المصل البشري (HAS). في ظل ظروف الإيلوشن المثلى، بلغ العدد النظري للصفائح التي تحتوي على خليط من الببتيدات 280,000 صفيحة/متر مربع. وبمقارنة أداء فصل العمود المُطوّر مع عمود Ascentis Express RP-Amide التجاري، لوحظ أن كفاءة فصل عمود PMP تفوقت على العمود التجاري من حيث كفاءة الفصل ودقة النتائج.
أصبحت صناعة المستحضرات الصيدلانية الحيوية سوقًا عالميًا متناميًا، وشهدت زيادة ملحوظة في حصتها السوقية في السنوات الأخيرة. ومع النمو الهائل لهذه الصناعة1،2،3، ازدادت الحاجة إلى تحليل الببتيدات والبروتينات. فبالإضافة إلى الببتيد المستهدف، تتشكل شوائب مختلفة أثناء تخليق الببتيد، لذا يلزم التنقية الكروماتوغرافية للحصول على النقاء المطلوب للببتيد. ويُعد تحليل وتوصيف البروتينات في سوائل الجسم والأنسجة والخلايا مهمة بالغة الصعوبة نظرًا للعدد الكبير من الأنواع التي يُحتمل اكتشافها والموجودة في عينة واحدة. وعلى الرغم من فعالية مطياف الكتلة في تحديد تسلسل الببتيدات والبروتينات، إلا أن إدخال هذه العينات مباشرةً في مطياف الكتلة قد يؤدي إلى فصل غير مُرضٍ. ويمكن حل هذه المشكلة بإجراء كروماتوغرافيا سائلة (LC) قبل تحليل مطياف الكتلة، مما يقلل من كمية المُحللات التي تدخل مطياف الكتلة في وقت معين4،5،6. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تركيز المُحللات في منطقة ضيقة أثناء فصل الطور السائل، مما يُعزز تركيز هذه المُحللات ويزيد من حساسية الكشف باستخدام طيف الطيف الكتلي (MS). وقد تطورت تقنية الكروماتوغرافيا السائلة (LC) بشكل ملحوظ خلال العقد الماضي، وأصبحت طريقةً شائعة الاستخدام في تحليل البروتينات.7،8،9،10
تُستخدم كروماتوغرافيا السائل ذات الطور العكسي (RP-LC) على نطاق واسع لتنقية وفصل مخاليط الببتيدات باستخدام السيليكا المعدلة بأوكتاديسيل (ODS) كطور ثابت. 11، 12، 13. ومع ذلك، نظرًا لتركيبها المعقد وطبيعتها الأمفوتيرية، 14، 15 لا تستطيع أطوار RP الثابتة فصل الببتيدات والبروتينات بشكل كافٍ. لذلك، يتطلب تحليل الببتيدات والبروتينات ذات الشظايا القطبية وغير القطبية أطوارًا ثابتة مصممة خصيصًا للتفاعل مع هذه المُحللات والاحتفاظ بها. 16. يُمكن أن تكون الكروماتوغرافيا المختلطة، التي تُتيح تفاعلات متعددة الوسائط، بديلاً عن RP-LC لفصل الببتيدات والبروتينات والمخاليط المعقدة الأخرى. تم تحضير العديد من الأطوار الثابتة المختلطة، واستُخدمت أعمدة مملوءة بهذه الأطوار الثابتة لفصل الببتيدات والبروتينات. 17، 18، 19، 20، 21. نظرًا لوجود مجموعات قطبية وغير قطبية، فإن المراحل الثابتة ذات الوضع المختلط (WAX/RPLC، HILIC/RPLC، التداخل القطبي/RPLC) مناسبة لفصل الببتيدات والبروتينات22،23،24،25،26،27،28. تُظهر المراحل الثابتة المتداخلة القطبية ذات المجموعات القطبية المرتبطة تساهميًا قدرات فصل جيدة وانتقائية فريدة للمحللات القطبية وغير القطبية لأن الفصل يعتمد على التفاعل بين المحلل والطور الثابت تفاعلات متعددة الوسائط 29،30،31،32. في الآونة الأخيرة، حصل Zhang et al. 30 على مراحل ثابتة منتهية بالبهينيل من البوليامينات وفصلوا بنجاح الهيدروكربونات ومضادات الاكتئاب والفلافونويدات والنوكليوسيدات والإستروجينات وبعض المحللات الأخرى. تحتوي المادة الثابتة المضمنة القطبية على مجموعات قطبية وغير قطبية، لذا يمكن استخدامها لفصل الببتيدات والبروتينات إلى أجزاء كارهة للماء ومحبة للماء. تتوفر الأعمدة القطبية المضمنة (على سبيل المثال، أعمدة C18 مع أعمدة أميد مضمنة) تحت الاسم التجاري أعمدة Ascentis Express RP-Amide، ولكن تم استخدام هذه الأعمدة فقط لتحليل الأمين 33.
في الدراسة الحالية، تم تحضير طور ثابت قطبي مُضمّن (N-فينيل ماليميد، بوليسترين مُضمّن) وتقييمه لفصل الببتيد وانقسام HSA التربسينية. استُخدمت الاستراتيجية التالية لتحضير الطور الثابت. حُضّرت جسيمات السيليكا المسامية وفقًا للإجراءات الموضحة في منشوراتنا السابقة، مع بعض التغييرات في مخططات التحضير 31، 34، 35، 36، 37، 38، 39. عُدّلت نسب اليوريا، والبولي إيثيلين جلايكول (PEG)، وTMOS، وحمض الأسيتيك المائي للحصول على جسيمات سيليكا ذات أحجام مسام كبيرة. ثانيًا، تم تصنيع ربيطة جديدة من فينيل ماليميد-ميثيل فينيل إيزوسيانات، واستُخدمت جسيمات السيليكا المشتقة منها لتحضير أطوار ثابتة قطبية مُضمّنة. حُشِيَ الطور الثابت الناتج في عمود من الفولاذ المقاوم للصدأ (القطر الداخلي 100 × 1.8 مم) وفقًا لمخطط تعبئة مُحسّن. يتم تعبئة العمود بمساعدة الاهتزاز الميكانيكي لضمان طبقة موحدة داخل العمود. تم تقييم العمود المعبأ لفصل خليط من الببتيدات يتكون من خمسة ببتيدات (Gly-Tyr و Gly-Leu-Tyr و Gly-Gly-Tyr-Arg و Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg وببتيد الليوسين-إنكيفالين). ومحللات التربسين لألبومين المصل البشري (HSA). لوحظ أن خليط الببتيد ومهضم التربسين لألبومين المصل البشري انفصلا بدقة وكفاءة جيدتين. تمت مقارنة كفاءة فصل عمود PMP بكفاءة عمود Ascentis Express RP-Amide. لوحظ أن الببتيدات والبروتينات تتمتع بدقة جيدة وكفاءة فصل عالية على عمود PMP، وأن كفاءة فصل عمود PMP أعلى من كفاءة عمود Ascentis Express RP-Amide.
بولي إيثيلين جلايكول (PEG)، يوريا، حمض الأسيتيك، ثلاثي ميثوكسي أورثوسيليكات (TMOS)، ثلاثي ميثيل كلورو سيلان (TMCS)، تريبسين، ألبومين مصل الدم البشري (HSA)، كلوريد الأمونيوم، يوريا، هيكساميثيل ميثاكريلويل ديزيلازين (HMDS)، ميثاكريلويل كلوريد (MC)، ستايرين، 4-هيدروكسي-TEMPO، بنزويل بيروكسيد (BPO)، أسيتونتريل (ACN) لتقنية كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC)، ميثانول، 2-بروبانول، وأسيتون. شركة سيجما-ألدريتش (سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية).
حُرّك خليط من اليوريا (8 غرامات) وبولي إيثيلين جلايكول (8 غرامات) و8 مل من حمض الأسيتيك بتركيز 0.01 نيوتن لمدة 10 دقائق، ثم أُضيف إليه 24 مل من TMOS تحت التبريد بالثلج. سُخّن خليط التفاعل عند درجة حرارة 40 درجة مئوية لمدة 6 ساعات، ثم عند درجة حرارة 120 درجة مئوية لمدة 8 ساعات في وعاء أوتوكلاف من الفولاذ المقاوم للصدأ. صُفّي الماء وجُفّفت البقايا عند درجة حرارة 70 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. طُحنت الكتل اللينة المجففة بسلاسة، وحُمّصت في فرن عند درجة حرارة 550 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. حُضّرت ثلاث دفعات ووُصفت لاختبار قابلية تكرار أحجام الجسيمات، وحجم المسام، ومساحة السطح.
المجموعة القطبية والطور الثابت لسلاسل البوليسترين. خطوات التحضير موضحة أدناه.
تم إذابة N-فينيل ماليميد (200 ملغ) وميثيل فينيل إيزوسيانات (100 ملغ) في التولوين اللامائي، ثم تمت إضافة 0.1 مل من 2،2'-أزويزوبيوتيرونيتريل (AIBN) إلى قارورة التفاعل للحصول على كوبوليمر من فينيل ماليميد وميثيل فينيل إيزوسيانات (PMCP). تم تسخين الخليط عند 60 درجة مئوية لمدة 3 ساعات، وتم ترشيحه وتجفيفه في فرن عند 40 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
تم تشتيت جزيئات السيليكا المجففة (2 جم) في التولوين الجاف (100 مل)، وحركت وخضعت للموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق في دورق دائري القاع سعة 500 مل. تم إذابة PMCP (10 ملغ) في التولوين وأضيف قطرة قطرة إلى دورق التفاعل عبر قمع إضافة. تم إعادة تسخين الخليط عند 100 درجة مئوية لمدة 8 ساعات، وتم ترشيحه وغسله بالأسيتون وتجفيفه عند 60 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. بعد ذلك، تم إذابة جزيئات السيليكا المرتبطة بـ PMCP (100 جم) في التولوين (200 مل)، وأضيف إليه 4-هيدروكسي-TEMPO (2 مل) في وجود 100 ميكرولتر من ثنائي بيوتيل قصدير ثنائي اللوريت كمحفز. تم تحريك الخليط عند 50 درجة مئوية لمدة 8 ساعات، وتم ترشيحه وتجفيفه عند 50 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
تم تشتيت ستيرين (1 مل)، وبنزويل بيروكسيد BPO (0.5 مل)، وجسيمات سيليكا ملتصقة بـ TEMPO-PMCP (1.5 جم) في التولوين، ثم طُهِّرت بالنيتروجين. أُجريت عملية بلمرة الستيرين عند درجة حرارة 100 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. غُسل المنتج الناتج بالميثانول وجُفِّف طوال الليل عند درجة حرارة 60 درجة مئوية. يوضح الشكل 1 المخطط العام للتفاعل.
تم نزع الغازات من العينات عند درجة حرارة 393 كلفن لمدة ساعة واحدة حتى تم الحصول على ضغط متبقي أقل من 10-3 تور. تم استخدام كمية N2 الممتزة عند الضغط النسبي P/P0 = 0.99 لتحديد الحجم الكلي للمسام. تم فحص مورفولوجيا جزيئات السيليكا النقية والمرتبطة بالربيط باستخدام مجهر مسح إلكتروني (هيتاشي للتكنولوجيا العالية، طوكيو، اليابان). تم وضع عينات جافة (سيليكا نقية وجزيئات سيليكا مرتبطة بالربيط) على قضبان ألومنيوم باستخدام شريط كربون. تم ترسيب الذهب على العينة باستخدام جهاز الرش Q150T، وتم ترسيب طبقة من الذهب بسمك 5 نانومتر على العينة. هذا يحسن كفاءة عملية الجهد المنخفض ويوفر رشًا باردًا دقيقًا. تم إجراء التحليل العنصري باستخدام محلل تكوين العناصر Flash EA1112 من Thermo Electron (والثام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية). استُخدم جهاز تحليل حجم الجسيمات "ماسترسايزر 2000" من مالفرن (وورسيستيرشاير، المملكة المتحدة) للحصول على توزيع حجم الجسيمات. بُعثرت جسيمات السيليكا غير المغلفة وجسيمات السيليكا المرتبطة بالربيط (5 ملغ لكل منهما) في 5 مل من الأيزوبروبانول، وعُرّضت للموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق، ثم رُكّبت لمدة 5 دقائق، ثم وُضعت على طاولة بصرية من جهاز "ماسترسايزر". أُجري التحليل الوزني الحراري بمعدل 5 درجات مئوية في الدقيقة ضمن نطاق درجات حرارة يتراوح بين 30 و800 درجة مئوية.
تم تعبئة أعمدة من الفولاذ المقاوم للصدأ ذات تجويف ضيق ومبطنة بألياف زجاجية بأبعاد (القطر الداخلي 100 × 1.8 مم) بطريقة تعبئة الملاط باتباع نفس الإجراء الموضح في المرجع 31. تم توصيل عمود من الفولاذ المقاوم للصدأ (مبطن بالزجاج، القطر الداخلي 100 × 1.8 مم) ومخرج يحتوي على فريت 1 ميكرومتر إلى آلة تعبئة الملاط (Alltech Deerfield، IL، الولايات المتحدة الأمريكية). قم بإعداد معلق للطور الثابت عن طريق تعليق 150 ملغ من الطور الثابت في 1.2 مل من الميثانول وتغذيته في عمود الخزان. تم استخدام الميثانول كمذيب الملاط والمذيب الضابط. قم بتعبئة العمود عن طريق تطبيق تسلسل ضغط 100 ميجابكسل لمدة 10 دقائق و80 ميجابكسل لمدة 15 دقيقة و60 ميجابكسل لمدة 30 دقيقة. استخدمت عملية التعبئة اثنين من هزازات عمود الغاز الكروماتوغرافي (Alltech، Deerfield، IL، الولايات المتحدة الأمريكية) للاهتزاز الميكانيكي لضمان تعبئة العمود بشكل موحد. أغلق عبوة الملاط وحرر الضغط ببطء لمنع تلف الخيط. فُصل العمود عن فوهة الملاط، ووُضعت وصلة أخرى بالمدخل ورُبطت بنظام LC لاختبار عمله.
تم بناء MLC مخصص باستخدام مضخة LC (10AD Shimadzu، اليابان)، وجهاز أخذ عينات مزود بحلقة حقن سعة 50 نانولتر (Valco (USA) C14 W.05)، ومزيل غاز غشائي (Shimadzu DGU-14A)، ونافذة شعرية للأشعة فوق البنفسجية والمرئية. جهاز كشف (UV-2075) وعمود مجهري مطلي بالمينا. تُستخدم أنابيب توصيل ضيقة وقصيرة جدًا لتقليل تأثير تمدد العمود الإضافي. بعد ملء العمود، يُركّب أنبوب شعري (50 ميكرومتر، قطر داخلي 365 مم) عند مخرج وصلة الاختزال 1/16 بوصة، ثم يُركّب أنبوبًا شعريًا (50 ميكرومتر) على وصلة الاختزال. يتم جمع البيانات ومعالجة الكروماتوغرام باستخدام برنامج Multichro 2000. عند 254 نانومتر، تمت مراقبة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية للمحللات عند 0. تم تحليل البيانات الكروماتوغرافية باستخدام OriginPro8 (نورثامبتون، ماساتشوستس).
ألبومين مصل الإنسان، مسحوق مجفف بالتجميد، ≥ 96% (الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز)، 3 ملغ ممزوج بالتربسين (1.5 ملغ)، 4.0 مولار يوريا (1 مل)، و0.2 مولار بيكربونات الأمونيوم (1 مل). حُرّك المحلول لمدة 10 دقائق، ثم حُفظ في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات، ثم أُخمد باستخدام 1 مل من TFA بتركيز 0.1%. رُشّح المحلول وحُفظ في درجة حرارة أقل من 4 درجات مئوية.
تم تقييم فصل خليط من الببتيدات وحمض الهيالورونيك المهضوم التربسين على عمود PMP بشكل منفصل. تحقق من التحلل المائي التربسين لخليط من الببتيدات وحمض الهيالورونيك المفصول بواسطة عمود PMP، وقارن النتائج بعمود Ascentis Express RP-Amide. يُحسب عدد الصفائح النظرية باستخدام المعادلة التالية:
تظهر في الشكل 2 صور المجهر الإلكتروني الماسح لجسيمات السيليكا النقية وجسيمات السيليكا المرتبطة بالربيط. تُظهر صور المجهر الإلكتروني الماسح لجسيمات السيليكا النقية (أ، ب) شكلًا كرويًا تكون فيه الجسيمات ممدودة أو ذات تماثل غير منتظم مقارنةً بدراساتنا السابقة. سطح جسيمات السيليكا المرتبطة بالربيط (ج، د) أكثر نعومة من سطح جسيمات السيليكا النقية، وقد يعود ذلك إلى سلاسل البوليسترين التي تغطي سطح جسيمات السيليكا.
صور مجهرية إلكترونية ماسحة لجزيئات السيليكا النقية (أ، ب) وجزيئات السيليكا المرتبطة بالربيط (ج، د).
يوضح الشكل 2.3(أ) توزيع حجم الجسيمات لجسيمات السيليكا النقية وجسيمات السيليكا المرتبطة بالربيط. أظهرت منحنيات توزيع حجم الجسيمات الحجمي أن حجم جسيم السيليكا زاد بعد التعديل الكيميائي (الشكل 3أ). تمت مقارنة بيانات توزيع حجم جسيم السيليكا من الدراسة الحالية والدراسة السابقة في الجدول 1(أ). كان حجم الجسيمات الحجمي d(0.5) لـ PMP 3.36 ميكرومتر، مقارنةً بقيمة ad(0.5) البالغة 3.05 ميكرومتر في دراستنا السابقة (جسيمات السيليكا المرتبطة بالبوليسترين)34. نظرًا للتغير في نسبة PEG واليوريا وTMOS وحمض الأسيتيك في خليط التفاعل، كان توزيع حجم الجسيمات لهذه الدفعة أضيق مقارنةً بدراستنا السابقة. حجم جسيم طور PMP أكبر قليلاً من حجم طور جسيم السيليكا المرتبط بالبوليسترين الذي درسناه سابقًا. وهذا يعني أن عملية التوظيف السطحي لجزيئات السيليكا باستخدام الستايرين أرست طبقة من البوليسترين فقط (0.97 ميكرومتر) على سطح السيليكا، بينما في مرحلة PMP كان سمك الطبقة 1.38 ميكرومتر.
توزيع حجم الجسيمات (أ) وتوزيع حجم المسام (ب) لجزيئات السيليكا النقية وجزيئات السيليكا المرتبطة بالربيط.
يوضح الجدول 1 (ب) حجم المسام وحجم المسام ومساحة سطح جزيئات السيليكا المستخدمة في هذه الدراسة. كما يوضح الشكل 3 (ب) ملفات تعريف PSD لجزيئات السيليكا النقية وجزيئات السيليكا المرتبطة بالربيط. وكانت النتائج مماثلة لدراستنا السابقة 34. وكانت أحجام مسام جزيئات السيليكا النقية والمرتبطة بالربيط 310 Å و241 Å على التوالي، مما يشير إلى أنه بعد التعديل الكيميائي، انخفض حجم المسام بمقدار 69 Å، كما هو موضح في الجدول 1 (ب)، ويظهر منحنى التحول في الشكل. وتبلغ المساحة السطحية النوعية لجزيئات السيليكا في الدراسة الحالية 116 م2/جم، وهي مماثلة لدراستنا السابقة (124 م2/جم). وكما هو موضح في الجدول 1 (ب)، انخفضت أيضًا المساحة السطحية (م2/جم) لجزيئات السيليكا بعد التعديل الكيميائي من 116 م2/جم إلى 105 م2/جم.
تُعرض نتائج التحليل العنصري للطور الثابت في الجدول 2. تبلغ نسبة الكربون في الطور الثابت الحالي 6.35%، وهي نسبة أقل من تلك المسجلة في دراستنا السابقة (جسيمات السيليكا المرتبطة بالبوليسترين، 7.93%35 و10.21% على التوالي). 42. يظهر محتوى الكربون في الطور الثابت الحالي أدناه، حيث استُخدمت بعض الربائط القطبية مثل فينيل ماليميد ميثيل فينيل إيزوسيانات (PCMP) و4-هيدروكسي-تيمبو بالإضافة إلى الستايرين في تحضير SP. تبلغ النسبة المئوية للنيتروجين في الطور الثابت الحالي 2.21% مقارنةً بـ 0.1735 و0.85% في الدراسات السابقة. 42. هذا يعني أن الطور الثابت الحالي يحتوي على نسبة عالية من النيتروجين بسبب فينيل ماليميد. وبالمثل، يحتوي المنتجان (4) و(5) على نسبة كربون تبلغ 2.7% و2.9% على التوالي، بينما يحتوي المنتج النهائي (6) على نسبة كربون تبلغ 6.35%، كما هو موضح في الجدول 2. تم استخدام التحليل الوزني الحراري (TGA) على الطور الثابت من PMP لاختبار فقدان الوزن، ويظهر منحنى TGA في الشكل 4. يُظهر منحنى TGA فقدانًا في الوزن بنسبة 8.6%، وهو ما يتفق جيدًا مع محتوى الكربون (6.35%)، حيث تحتوي الربيطة ليس فقط على C، ولكن أيضًا على N وO وH.
تم اختيار ربيطة فينيل ماليميد-ميثيل فينيل إيزوسيانات لتعديل سطح جسيمات السيليكا بسبب مجموعات فينيل ماليميد وفينيل إيزوسيانات القطبية. يمكن لمجموعات فينيل إيزوسيانات التفاعل مع الستيرين عن طريق بلمرة الجذور الحية. والسبب الثاني هو إدخال مجموعة ذات تفاعلات معتدلة مع المُحلل ولا توجد تفاعلات إلكتروستاتيكية قوية بين المُحلل والطور الثابت، لأن مجموعة فينيل ماليميد لا تحتوي على شحنة افتراضية عند درجة حموضة طبيعية. يمكن التحكم في قطبية الطور الثابت من خلال الكمية المثلى من الستيرين وزمن تفاعل بلمرة الجذور الحرة. الخطوة الأخيرة من التفاعل (بلمرة الجذور الحرة) حاسمة لأنها تغير قطبية الطور الثابت. تم إجراء تحليل عنصري للتحقق من محتوى الكربون في هذه الأطوار الثابتة. وقد لوحظ أن زيادة كمية الستيرين وزمن التفاعل يزيدان من محتوى الكربون في الطور الثابت والعكس صحيح. تحتوي الأطوار الثابتة المُحضرة بتركيزات مختلفة من الستايرين على أحمال كربونية مختلفة. وبالمثل، وُضعت هذه الأطوار الثابتة على أعمدة من الفولاذ المقاوم للصدأ، وفُحصت خصائصها الكروماتوغرافية (الانتقائية، الدقة، قيمة النيتروجين، إلخ). بناءً على هذه التجارب، تم اختيار تركيبة مُثلى لتحضير الطور الثابت PMP لضمان قطبية مُتحكم بها واحتفاظ جيد بالمُحلل.
تم تقييم عمود PMP أيضًا لتحليل خمسة مخاليط من الببتيدات (Gly-Tyr و Gly-Leu-Tyr و Gly-Gly-Tyr-Arg و Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg و leucine-enkephalin) باستخدام سعة الطور المتحرك. 60/40 (حجم/حجم) ACN/ماء (0.1% TFA) بمعدل تدفق 80 ميكرولتر/دقيقة. في ظل ظروف الإيلوشن المثلى (200000 طبق/م)، يكون عدد الأطباق النظرية (N) لكل عمود (100 × 1.8 مم) 20000 ± 100. تظهر قيم N لأعمدة PMP الثلاثة في الجدول 3 وتظهر الكروماتوغرامات في الشكل 5A. تحليل سريع بمعدل تدفق عالٍ (700 ميكرولتر/دقيقة) على عمود PMP، حيث تم استخلاص خمسة ببتيدات خلال دقيقة واحدة، وقيمة N ممتازة تبلغ 13500 ± 330 لكل عمود (قطر 100 × 1.8 مم)، أي ما يعادل 135000 صفيحة/م (الشكل 5ب). تم ملء ثلاثة أعمدة بنفس الحجم (القطر الداخلي 100 × 1.8 مم) بثلاث دفعات مختلفة من طور PMP الثابت لاختبار قابلية التكرار. تم تسجيل المُحللات لكل عمود عن طريق فصل خليط الاختبار نفسه على كل عمود باستخدام ظروف الاستخلاص المثلى، وعدد الصفائح النظرية N، ومدة الاحتفاظ. تظهر بيانات قابلية التكرار لأعمدة PMP في الجدول 4. ارتبطت قابلية التكرار لعمود PMP ارتباطًا جيدًا بقيم RSD منخفضة جدًا كما هو موضح في الجدول 3.
فصل مخاليط الببتيد على عمود PMP (B) وعمود Ascentis Express RP-Amide (A)، الطور المتحرك 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%)، أبعاد عمود PMP (100 × 1.8 مم قطر داخلي)، تحليل ترتيب إيلوشن المركبات: 1 (Gly-Tyr)، 2 (Gly-Leu-Tyr)، 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg)، 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) و5 (حمض الليوسيك إنكيفالين).
تم تقييم عمود PMP (قطره الداخلي 100 × 1.8 مم) لفصل مُحلل التربسين من ألبومين مصل الإنسان باستخدام كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC). يُظهر الكروماتوغرام في الشكل 6 أن العينات منفصلة جيدًا بدقة عالية. حُللت محاليل HSA بمعدل تدفق 100 ميكرولتر/دقيقة، وطور متحرك من 70/30 أسيتونتريل/ماء، و0.1% TFA. قُسِّم انقسام HSA إلى 17 قمة، كما هو موضح في الكروماتوغرام (الشكل 6)، تُقابل 17 ببتيدًا. حُسبت كفاءة فصل كل قمة على حدة من مُحلل HSA، وتُوضح القيم في الجدول 5.
تم فصل مستخلصات حمض التريبسين HSA على عمود PMP (القطر الداخلي 100 × 1.8 مم)، ومعدل التدفق (100 ميكرولتر / دقيقة)، والطور المتحرك 60/40 أسيتونتريل / ماء، و 0.1٪ TFA.
حيث L هو طول العمود، وη هي لزوجة الطور المتحرك، وΔP هو الضغط الخلفي للعمود، وu هي السرعة الخطية للطور المتحرك. بلغت نفاذية عمود PMP 2.5 × 10-14 متر مربع، ومعدل التدفق 25 ميكرولتر/دقيقة، واستُخدمت نسبة 60/40 v/v. ACN/ماء. كانت نفاذية عمود PMP (القطر الداخلي 100 × 1.8 مم) مماثلة لتلك الواردة في دراستنا السابقة Ref.34. تبلغ نفاذية عمود مملوء بجسيمات مسامية سطحية 1.7 × 10 0.6 ميكرومتر، و2.5 × 10-14 متر مربع لجسيمات 5 ميكرومتر43. لذلك، فإن نفاذية طور PMP مماثلة لنفاذية جسيمات النواة والقشرة بحجم 5 ميكرومتر.
حيث Wx هي كتلة العمود المملوء بالكلوروفورم، وWy هي كتلة العمود المملوء بالميثانول، وρ هي كثافة المذيب. كثافة الميثانول (ρ = 0.7866) والكلوروفورم (ρ = 1.484). بلغت المسامية الكلية لعمود جسيمات السيليكا-C18 (القطر الداخلي 100 × 1.8 مم)34 وعمود اليوريا-C18 الذي دُرست سابقًا 0.63 و0.55 على التوالي. هذا يعني أن وجود ربيطات اليوريا يُقلل من نفاذية الطور الثابت. من ناحية أخرى، تبلغ المسامية الكلية لعمود PMP (القطر الداخلي 100 × 1.8 مم) 0.60. أعمدة PMP أقل نفاذية من الأعمدة المعبأة بجسيمات السيليكا المرتبطة بـ C18 لأنه في المراحل الثابتة من نوع C18 تكون ربيطات C18 مرتبطة بجسيمات السيليكا في سلاسل خطية، بينما في المراحل الثابتة من نوع البوليسترين يتكون بوليمر سميك نسبيًا حول الجسيمات. الطبقة أ. في تجربة نموذجية، يتم حساب مسامية العمود على النحو التالي:
يوضح الشكلان 7أ، ب مخططات فان ديمتر لعمود PMP (القطر الداخلي 100 × 1.8 مم) وعمود Ascentis Express RP-Amide (القطر الداخلي 100 × 1.8 مم) في ظل نفس ظروف الإيلوشن، بتركيز 60/40 ACN/H2O و0.1% TFA بمعدل تدفق 20 ميكرولتر/دقيقة إلى 800 ميكرولتر/دقيقة في كلا العمودين. بلغت قيم HETP الدنيا عند معدل التدفق الأمثل (80 ميكرولتر/دقيقة) 2.6 ميكرومتر و3.9 ميكرومتر لعمود PMP وعمود Ascentis Express RP-Amide، على التوالي. تُظهر قيم HETP أن كفاءة فصل عمود PMP (القطر الداخلي 100 × 1.8 مم) أعلى بكثير من كفاءة فصل عمود Ascentis Express RP-Amide المتوفر تجاريًا (القطر الداخلي 100 × 1.8 مم). يوضح رسم فان ديمتر البياني في الشكل 7(أ) أن انخفاض قيمة النيتروجين ليس أعلى بكثير مع زيادة التدفق مقارنةً بدراستنا السابقة. وتعتمد كفاءة الفصل الأعلى لعمود PMP (بقطر 100 × 1.8 مم) مقارنةً بعمود Ascentis Express RP-Amide على تحسين شكل وحجم الجسيمات، بالإضافة إلى عملية تعبئة العمود المتطورة المستخدمة في العمل الحالي.
(أ) رسم فان ديمتر (HETP مقابل السرعة الخطية للطور المتحرك) تم الحصول عليه على عمود PMP (القطر الداخلي 100 × 1.8 مم) في 60/40 ACN/H2O مع 0.1% TFA. (ب) رسم فان ديمتر (HETP مقابل السرعة الخطية للطور المتحرك) تم الحصول عليه على عمود Ascentis Express RP-Amide (القطر الداخلي 100 × 1.8 مم) في 60/40 ACN/H2O مع 0.1% TFA.
تم تحضير طور ثابت قطبي من البوليسترين المتداخل وتقييمه لفصل خليط من الببتيدات الاصطناعية ومحلل التربتيك لألبومين المصل البشري (HSA) باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء. يتميز الأداء الكروماتوغرافي لأعمدة PMP لمخاليط الببتيدات بكفاءة فصل ودقة ممتازة. ويرجع تحسين كفاءة الفصل لأعمدة PMP إلى عدة أسباب، منها حجم جسيمات السيليكا وحجم المسام، والتركيب المتحكم للأطوار الثابتة، ومواد تعبئة العمود المعقدة. بالإضافة إلى كفاءة الفصل العالية، يتميز هذا الطور الثابت بميزة أخرى تتمثل في انخفاض ضغط العمود الخلفي عند معدلات تدفق عالية. تتميز أعمدة PMP بسهولة إعادة إنتاجها، ويمكن استخدامها لتحليل خلائط الببتيدات والهضم التربسيني لمختلف البروتينات. نعتزم استخدام هذا العمود لفصل المركبات النشطة بيولوجيًا من المنتجات الطبيعية، ومستخلصات النباتات الطبية، والفطريات باستخدام كروماتوغرافيا سائلة. في المستقبل، سيتم أيضًا تقييم أعمدة PMP لفصل البروتينات والأجسام المضادة وحيدة النسيلة.
فيلد، جيه كيه، يويربي، إم آر، لاو، جيه، ثوجرسن، إتش، وبيترسون، بي. التحقيق في أنظمة فصل الببتيد باستخدام كروماتوغرافيا الطور العكسي الجزء الأول: تطوير بروتوكول لتوصيف العمود. فيلد، جيه كيه، يويربي، إم آر، لاو، جيه، ثوجرسن، إتش، وبيترسون، بي. التحقيق في أنظمة فصل الببتيد باستخدام كروماتوغرافيا الطور العكسي الجزء الأول: تطوير بروتوكول لتوصيف العمود.فيلد، جيه كيه، أويربي، إم آر، لاو، جيه، توجرسن، إتش، وبيترسون، بي. التحقيق في أنظمة فصل الببتيد باستخدام الكروماتوغرافيا ذات الطور العكسي، الجزء الأول: تطوير بروتوكول لتوصيف العمود. فيلد، جيه كيه، يويربي، إم آر، لاو، جيه، ثوجرسن، إتش، وبيترسون، بي. التحقيق في أنظمة فصل الببتيد باستخدام كروماتوغرافيا الطور العكسي الجزء الأول: تطوير بروتوكول لخصائص العمود. فيلد، جيه كيه، يويربي، إم آر، لاو، جيه، ثوجرسن، إتش، وبيترسون، بي. التحقيق في أنظمة فصل الببتيد باستخدام كروماتوغرافيا الطور العكسي الجزء الأول: تطوير بروتوكول لخصائص العمود.فيلد، جيه كيه، أويربي، إم آر، لاو، جيه، توجرسن، إتش، وبيترسون، بي. التحقيق في أنظمة فصل الببتيد باستخدام الكروماتوغرافيا ذات الطور العكسي، الجزء الأول: تطوير بروتوكول لتوصيف العمود.J.色谱法Â 1603،113-129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019).
جوميز، ب. وآخرون. طرق إنتاج ببتيدات نشطة مُحسّنة لعلاج الأمراض المُعدية. التكنولوجيا الحيوية. الإنجازات 36(2)، 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
فليغي، ب.، ليسوفسكي، ف.، مارتينيز، ج. وخريستشاتيسكي، م. الببتيدات العلاجية الاصطناعية: العلم والسوق. فليغي، ب.، ليسوفسكي، ف.، مارتينيز، ج. وخريستشاتيسكي، م. الببتيدات العلاجية الاصطناعية: العلم والسوق.فليج بي، ليسوفسكي في، مارتينيز جيه وكريسشاتيسكي إم. الببتيدات العلاجية الاصطناعية: العلم والسوق.فليج ب، ليسوفسكي ف، مارتينيز ج، وخريشاتسكي م. الببتيدات العلاجية الاصطناعية: العلم والسوق. اكتشاف الأدوية. اليوم 15 (1-2)، 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
شي، ف.، سميث، ر.د. وشين، ي. كروماتوغرافيا السائل البروتيني المتقدمة. شي، ف.، سميث، ر.د. وشين، ي. كروماتوغرافيا السائل البروتيني المتقدمة.انظر F.، Smith RD وShen Yu. كروماتوغرافيا السائل البروتيني المتقدمة. شيه، إف، سميث، آر دي وشين، واي. Xie، F.، Smith، RD & Shen، Y. تكوين البروتين المتقدم 液相色谱.انظر F.، Smith RD وShen Yu. كروماتوغرافيا السائل البروتيني المتقدمة.مجلة الكروماتوغرافيا. أ 1261، 78-90 (2012).
ليو، و. وآخرون. تقنية الكروماتوغرافيا السائلة المتقدمة-مطياف الكتلة قادرة على الجمع بين التحليلات الأيضية والبروتينية واسعة النطاق. الشرج. كيم. أكتا 1069، 89-97 (2019).
تشيسنات، SM وسالزبوري، JJ دور UHPLC في تطوير الأدوية. تشيسنات، SM وسالزبوري، JJ دور UHPLC في تطوير الأدوية.تشيسنوت، إس إم وسالزبوري، جيه جيه دور UHPLC في تطوير الأدوية.تشيسنات، إس إم وسالزبوري، جيه جيه. دور كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء في تطوير الأدوية. مجلة العلوم. 30(8)، 1183-1190 (2007).
وو، ن. وكلاوسن، أ.م. الجوانب الأساسية والعملية للكروماتوغرافيا السائلة تحت الضغط العالي للغاية للفصل السريع. وو، ن. وكلاوسن، أ.م. الجوانب الأساسية والعملية للكروماتوغرافيا السائلة تحت الضغط العالي للغاية للفصل السريع.وو، ن. وكلاوسن، أ.م. الجوانب الأساسية والعملية للكروماتوغرافيا السائلة عالية الضغط للفصل السريع. Wu، N. & Clausen، AM. وو، ن. وكلاوسن، أ.م. الجوانب الأساسية والعملية للكروماتوغرافيا السائلة تحت الضغط العالي للغاية للفصل السريع.وو، ن. وكلاوسن، أ.م. الجوانب الأساسية والعملية للكروماتوغرافيا السائلة عالية الضغط للفصل السريع.مجلة العلوم. 30(8)، 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
رين، إس إيه وتشيليتشيف، بي. استخدام كروماتوغرافيا السائل فائقة الأداء في تطوير الأدوية. رين، إس إيه وتشيليتشيف، بي. استخدام كروماتوغرافيا السائل فائقة الأداء في تطوير الأدوية.رين، إس إيه وتشيليشيف، بي. استخدام كروماتوغرافيا السائل عالية الأداء في تطوير الأدوية. رين، إس إيه وتشيليتشيف، بي. رين، إس إيه وتشيليتشيف، بي.رين، إس إيه وتشيليشيف، بي. تطبيق كروماتوغرافيا السائل فائقة الأداء في تطوير الأدوية.مجلة الكروماتوغرافيا. 1119(1-2)، 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
جو، هـ. وآخرون. هيدروجيل متجانس كبير المسامات، مشتق من مستحلب زيت في ماء ذي طور داخلي مرتفع لتنقية فعالة للفيروس المعوي 71. مشروع كيميائي. مجلة 401، 126051 (2020).
شي، واي، شيانغ، آر، هورفاث، سي، وويلكينز، جيه إيه دور الكروماتوغرافيا السائلة في تحليل البروتينات. شي، واي، شيانغ، آر، هورفاث، سي، وويلكينز، جيه إيه دور الكروماتوغرافيا السائلة في تحليل البروتينات.شي، واي، شيانغ، آر، هورفاث، سي، وويلكينز، جيه إيه دور الكروماتوغرافيا السائلة في تحليل البروتينات. شي، واي.، شيانغ، آر.، هورفاث، سي. ويلكنز، JA. شي، واي.، شيانغ، آر.، هورفاث، سي. & ويلكنز، JAشي، واي، شيانغ، آر، هورفاث، سي، وويلكينز، جيه إيه دور الكروماتوغرافيا السائلة في تحليل البروتينات.مجلة الكروماتوغرافيا. أ 1053 (1-2)، 27-36 (2004).
فيكيتي، س.، فوتي، ج.-ل. & Guillarme، D. اتجاهات جديدة في فصل الكروماتوغرافيا السائلة في الطور العكسي للببتيدات والبروتينات العلاجية: النظرية والتطبيقات. & Guillarme، D. اتجاهات جديدة في فصل الكروماتوغرافيا السائلة في الطور العكسي للببتيدات والبروتينات العلاجية: النظرية والتطبيقات. & Guillarme، D. اتجاهات جديدة في الببتيدات العلاجية المتنوعة والأفضل من خلال كروماتوغرافيا حيوية ذات طبيعة واضحة: النظرية والتطبيق. & Guillarme، D. اتجاهات جديدة في فصل الببتيدات والبروتينات العلاجية باستخدام كروماتوغرافيا السائل في الطور العكسي: النظرية والتطبيقات. & Guillame، D. & جيلارميه، د.و Guillarmé، D. اتجاهات جديدة في فصل الببتيدات والبروتينات العلاجية باستخدام كروماتوغرافيا السائل في الطور العكسي: النظرية والتطبيقات.مجلة الصيدلة، العلوم الطبية الحيوية. الشرج. 69، 9-27 (2012).
جيلار، م.، أوليفوفا، ب.، دالي، أ. إي. وجيبلر، ج. سي. الفصل ثنائي الأبعاد للببتيدات باستخدام نظام RP-RP-HPLC مع درجة حموضة مختلفة في أبعاد الفصل الأولى والثانية. جيلار، م.، أوليفوفا، ب.، دالي، أ. إي. وجيبلر، ج. سي. الفصل ثنائي الأبعاد للببتيدات باستخدام نظام RP-RP-HPLC مع درجة حموضة مختلفة في أبعاد الفصل الأولى والثانية.جيلار م، أوليفوفا ب، دالي أ. إ. وجيبلر ج. ك. الفصل ثنائي الأبعاد للببتيدات باستخدام نظام RP-RP-HPLC مع درجة حموضة مختلفة في أبعاد الفصل الأول والثاني.جيلار م.، أوليفوفا ب.، دالي أ. إي.، وجيبلر ج. ك. فصل ثنائي الأبعاد للببتيدات باستخدام قيم مختلفة للرقم الهيدروجيني في بُعدي الفصل الأول والثاني باستخدام نظام RP-RP-HPLC. مجلة العلوم سبتمبر. 28 (14)، 1694-1703 (2005).
فيليتي، س. وآخرون. دراسة انتقال الكتلة والخصائص الحركية لأعمدة الكروماتوغرافيا عالية الأداء المعبأة بجسيمات C18 مسامية بالكامل ومسامية سطحيًا، أصغر من 2 ميكرومتر. مجلة العلوم. 43 (9-10)، 1737-1745 (2020).
بيوفيسانا، س. وآخرون. الاتجاهات الحديثة والتحديات التحليلية في عزل وتحديد والتحقق من صحة الببتيدات النباتية النشطة بيولوجيًا. الشرج. شرجي المخلوق. كيميائي. 410(15)، 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
مولر، ج. ب. وآخرون. المشهد البروتيني لمملكة الحياة. مجلة الطبيعة، 582 (7813)، 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
دي لوكا، ك. وآخرون. المعالجة اللاحقة للببتيدات العلاجية بالكروماتوغرافيا السائلة التحضيرية. مجلة الجزيئات (بازل، سويسرا) 26(15)، 4688 (2021).
يانغ، ي. وجينغ، إكس. الكروماتوغرافيا ذات الوضع المختلط وتطبيقاتها على البوليمرات الحيوية. يانغ، ي. وجينغ، إكس. الكروماتوغرافيا ذات الوضع المختلط وتطبيقاتها على البوليمرات الحيوية.يانغ، يو. وجينغ، إكس. كروماتوغرافيا الوضع المختلط وتطبيقاتها على البوليمرات الحيوية. Yang، Y. & Geng، X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用. يانغ، ي. وجينغ، إكس. كروماتوغرافيا الوضع المختلط وتطبيقاتها في البوليمرات الحيوية.يانغ، يو. وجين، إكس. كروماتوغرافيا الوضع المختلط وتطبيقاتها على البوليمرات الحيوية.مجلة الكروماتوغرافيا. أ 1218(49)، 8813–8825 (2011).