شكرًا لك على زيارة Nature.com.إصدار المتصفح الذي تستخدمه لديه دعم محدود لـ CSS.للحصول على أفضل تجربة ، نوصي باستخدام مستعرض محدث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer).في غضون ذلك ، لضمان استمرار الدعم ، سنعرض الموقع بدون أنماط وجافا سكريبت.
أنجستيفوليوس لوبين (NLL ، Lupinus angustifolius L.) هو نبات بقولي يستخدم لإنتاج الغذاء وتحسين التربة.اجتذب التوسع العالمي لـ NLL كمحصول العديد من الفطريات المسببة للأمراض ، بما في ذلك أنثراكنوز الترمس ، الذي يسبب مرض الأنثراكنوز المدمر.تم استخدام أليلين ، Lanr1 و AnMan ، اللذين يمنحان مقاومة متزايدة ، في تربية NLL ، لكن الآليات الجزيئية الأساسية لا تزال غير معروفة.في هذه الدراسة ، تم استخدام علامات Lanr1 و AnMan لفحص عينات NLL الأوروبية.أكد اختبار اللقاح في بيئة خاضعة للرقابة فعالية كلا المتبرعين المقاومين.تم إجراء تنميط التعبير الجيني التفاضلي على خطوط تمثيلية مقاومة وقابلة للتأثر.ارتبطت مقاومة الأنثراكنوز بالإفراط في التعبير عن مصطلحات الأنطولوجيا الجينية "GO: 0006952 Defense Response" و "GO: 0055114 Redox Process" و "GO: 0015979 Photosynthesis".بالإضافة إلى ذلك ، أظهر خط Lanr1 (83A: 476) إعادة برمجة نسخ كبيرة بسرعة بعد التلقيح ، بينما أظهرت الخطوط الأخرى تأخيرًا في هذه الاستجابة بحوالي 42 ساعة.ترتبط استجابات الدفاع بجينات TIR-NBS و CC-NBS-LRR و NBS-LRR ، و 10 بروتينات تشارك في التسبب في المرض ، وبروتينات نقل الدهون ، و endoglucan-1،3-β-glucosidase ، وبروتينات جدار الخلية الغنية بالجليسين ، والجينات من المسار التفاعلي للأكسجين.تزامنت الاستجابات المبكرة لـ 83A: 476 ، بما في ذلك القمع الدقيق للجينات المرتبطة بعملية التمثيل الضوئي ، مع الحماية الناجحة أثناء مرحلة النمو الخضري لبيولوجيا الفطريات ، مما يشير إلى أن المستجيب يحفز المناعة.يتباطأ رد فعل ماندلوب ، كما هو الحال مع السحب الأفقي الكلي.
الترمس ذو الأوراق الضيقة (NLL ، Lupinus angustifolius L.) عبارة عن حبوب عالية البروتين مصدرها منطقة غرب البحر الأبيض المتوسط.يُزرع حاليًا كمحصول غذائي للحيوانات والبشر.يعتبر أيضًا السماد الأخضر في أنظمة تناوب المحاصيل بسبب تثبيت النيتروجين بواسطة بكتيريا تثبيت النيتروجين التكافلية والتحسين العام لهيكل التربة.لقد خضعت NLL لعملية تدجين سريعة في القرن الماضي ولا تزال تحت ضغط تربية مرتفع 3،4،5،6،7،8،9،10،11،12.مع انتشار زراعة NLL ، طورت تعاقب الفطريات المسببة للأمراض منافذ زراعية جديدة وتسببت في أمراض جديدة تدمر المحاصيل. كان أكثر ما يميز مزارعي ومربي الترمس هو ظهور أنثراكنوز ، الناجم عن الفطريات المسببة للأمراض ، Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg ، Feiler & Hagedorn13. كان أكثر ما يميز مزارعي ومربي الترمس هو ظهور أنثراكنوز ، الناجم عن الفطريات المسببة للأمراض ، Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg ، Feiler & Hagedorn13. аиболее примечательным для ермеров и селекционеров люпина было появление антракноза، تجميع أبيني (بوندار) نيرنبرغ ، فايلر وهايدورن 13. كان من أبرز مزارعي ومربي الترمس ظهور أنثراكنوز الناجم عن الفطريات المسببة للأمراض Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg و Feiler & Hagedorn13.对于 羽扇 豆 农民 和 饲养 者 来说 ， 最 引人注目 的 是 炭疽病 的 出现 ， 它 是 由 病原 Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg، Feiler & Hagedorn13 引起 的。对于 羽扇 豆 农民 和 饲养 者 来说 ， 最 引人注目 的 是 炭疽病 的 出现 ， 它 是 由 Colletotrichum lupini (Bondar) Haired。1 аиболее поразительным для ермеров и селекционеров люпина является появление антракноза، выозываминоза 13- أوريتشوم لوبيني (بوندار) نيرنبرغ ، فيلر وهايدورن أكثر ما يلفت انتباه مزارعي ومربي الترمس هو ظهور أنثراكنوز الناجم عن الفطريات المسببة للأمراض Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg و Feiler & Hagedorn13.جاءت التقارير الأولى للمرض من البرازيل والولايات المتحدة ، مع ظهور الأعراض النموذجية في عامي 1912 و 1929 على التوالي.ومع ذلك ، بعد حوالي 30 عامًا ، تم تصنيف العامل الممرض على أنه Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc.، teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.، teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.، телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc. ، teleomorph of Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc. ， 有 目的 形态 的 Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc. ， 有 目的 形态 的 Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.، Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc.، Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld في علم التشكل المستهدف. & H. Schrenk ،. & H. Schrenk ،.و H. Schrenk. & H. 施伦克 ，。 & H. 施伦克 ，。و H. Schlenk ،.أظهر التنميط الظاهري للمرض الذي تم إجراؤه في منتصف القرن العشرين بعض المقاومة في مدخلات NLL والترمس الأصفر (L.أظهرت الدراسات أن تطور الأنثراكنوز يرتبط بزيادة هطول الأمطار (رطوبة الهواء) ودرجة الحرارة (في حدود 12-28 درجة مئوية) ، مما يؤدي إلى انتهاك المقاومة عند درجات حرارة أعلى 17 ، 18. في الواقع ، كان الوقت اللازم لإنبات الكونيديا وبدء المرض ، أقصر أربع مرات عند 24 درجة مئوية (4 ساعات) منه عند 12 درجة مئوية (16 ساعة) في ظروف الرطوبة العالية.وبالتالي ، أدى الاحتباس الحراري المستمر إلى انتشار أنثراكنوز.ومع ذلك ، لوحظ المرض في فرنسا (1982) وأوكرانيا (1983) كنذير لتهديد وشيك ، ولكن على ما يبدو تم تجاهله من قبل صناعة الترمس في ذلك الوقت.بعد بضع سنوات ، انتشر هذا المرض المدمر في جميع أنحاء العالم وأثر أيضًا على البلدان الرئيسية المنتجة للترمس مثل أستراليا وبولندا وألمانيا.بعد اندلاع أنثراكنوز في منتصف التسعينيات ، أدى الفحص المكثف إلى تحديد العديد من المتبرعين المقاومين في عينات NLL19.يتم التحكم في مقاومة NLL للأنثراكنوز بواسطة أليلين منفصلين مسيطرين موجودان في مصادر مختلفة للبلازما الجرثومية: Lanr1 في الصنف Tanjil و Wonga و AnMan في الصنف.ماندالاي 25 ، 26. هذه الأليلات تكمل الواسمات الجزيئية التي تدعم اختيار البلازما الجرثومية المقاومة في برامج التربية 25،26،27،28،29،30.تم عبور خط التكاثر المقاوم 83A: 476 الذي يحمل أليل Lanr1 مع الخط البري الحساس P27255 للحصول على مجموعة RIL التي تفصل لمقاومة الأنثراكنوز ، مما جعل من الممكن تعيين موضع Lanr1 للكروموسوم NLL-1131 ، 32 ، 33. osome (NLL-11) ، ولكن في مواقع مختلفة 29،34،35.ومع ذلك ، نظرًا للعدد القليل من RILs والمسافة الجينية الكبيرة بين العلامات والأليلات المقابلة ، لا يمكن استخلاص استنتاجات موثوقة حول الجينات الأساسية.من ناحية أخرى ، فإن استخدام علم الوراثة العكسي في الترمس أمر صعب بسبب إمكانات التجديد المنخفضة للغاية ، مما يجعل التلاعب الجيني مرهقًا.
لقد فتح تطوير البلازما الجرثومية المستأنسة التي تحمل الأليل المرغوب في الحالة المتماثلة اللواقح ، مثل 83A: 476 (Lanr1) و Mandelup (AnMan) ، الباب أمام دراسة مقاومة الأنثراكنوز في مواجهة وجود مجموعات متعارضة من الأليلات في التجمعات البرية.إمكانيات الآليات الجزيئية.قارن الاستجابات الدفاعية الناتجة عن الأنماط الجينية المحددة.قيمت هذه الدراسة الاستجابة المبكرة للنسخة من NLL لتلقيح C. lupini.أولاً ، تم فحص لوحة الأصول الوراثية الأوروبية NLL التي تحتوي على 215 سطرًا باستخدام علامات جزيئية تحدد أليلات Lanr1 و AnMan.تم بعد ذلك إجراء التنميط الظاهري للأنثراكنوز على 50 خطًا من خطوط NLL ، تم اختيارها مسبقًا للواسمات الجزيئية ، في ظل ظروف خاضعة للرقابة.بناءً على هذه التجارب ، تم اختيار أربعة خطوط مختلفة في مقاومة الأنثراكنوز والتكوين الأليلي Lanr1 / AnMan لتحديد ملامح التعبير الجيني للدفاع التفاضلي باستخدام نهجين تكميليين: تسلسل الحمض النووي الريبي عالي الإنتاجية وتقدير PCR في الوقت الفعلي.
أظهر فحص مجموعة من الأصول الوراثية NLL (N = 215) مع علامات Lanr1 (Anseq3 و Anseq4) و AnMan (Anseq4) و AnMan (AnManM1) أن سطرًا واحدًا فقط (95726 ، بالقرب من سالامانكا-ب) يضخم أليل "المقاومة" لجميع العلامات ، بينما "وجود جميع العلامات" القابلة للتأثر "في جميع العلامات تقريبًاأنتج ثلاثة عشر سطرا أليلين "مقاومين" لعلامة Lanr1 ، و 8 خطوط أنتجت أليلات "مقاومة" من Lanr1.علامة.أليل "المقاومة" لعلامة AnMan (الجدول التكميلي S1).كان هناك سطرين متغاير الزيجوت لعلامة Anseq3 وواحد متغاير الزيجوت لعلامة AnManM1.حمل 42 سطرًا (19.5 ٪) أطوارًا متعاكسة من أليلات Anseq3 و Anseq4 ، مما يشير إلى ارتفاع وتيرة إعادة التركيب بين هذين الموقعين.كشفت الأنماط الظاهرية للأنثراكنوز في ظل ظروف خاضعة للرقابة (الجدول التكميلي S2) عن تباين في مقاومة الأنماط الجينية المختبرة ، والتي انعكست في شدة الأنثراكنوز.تراوحت الفروق في متوسط ​​الدرجات من 1.8 (مقاومة متوسطة) إلى 6.9 (حساسة) وتراوحت الاختلافات في وزن النبات من 0.62 (حساس) إلى 4.45 جم (مقاومة). كان هناك ارتباط معنوي بين القيم التي لوحظت في مكررين للتجربة (0.51 لدرجات شدة المرض ، P = 0.00017 و 0.61 لوزن النبات ، P <0.0001) وكذلك بين هاتين المعاملين (- 0.59 و - 0.77 ، P <0.0001). كان هناك ارتباط معنوي بين القيم التي لوحظت في مكررين للتجربة (0.51 لدرجات شدة المرض ، P = 0.00017 و 0.61 لوزن النبات ، P <0.0001) وكذلك بين هاتين المعاملين (- 0.59 و - 0.77 ، P <0.0001). ыявлена ​​достоверная кореляция между значениями، наблюдаемыми двух повторностях ксперимента (0،51 баниянта) и، P = 0،00017 и 0،61 для الموارد растения، P <0،0001)، и، P = 0،00017 и 0،61 иля، P <0،0001) تم العثور على ارتباط معنوي بين القيم التي لوحظت في تكرارين للتجربة (0.51 لدرجات شدة المرض ، P = 0.00017 و 0.61 لوزن النبات ، P <0.0001) ، وكذلك بين هاتين المعلمتين (- 0.59 و -0.77 ، P <0.0001) 0.0001)... аблюдалась значительная корреляция между значениями، наблюдаемыми в двух повторностях (0، 51،000 тестях) масса растения 0،61، P <0،0001)، и между тими двумя параметрами (-0،59 и -0،0001) 0،77، P <0،0001. كان هناك ارتباط معنوي بين القيم التي لوحظت في نسختين (درجة شدة المرض 0.51 ، P = 0.00017 ووزن النبات 0.61 ، P <0.0001) وبين هاتين المعلمتين (-0.59 و -0 .0001) 0.77 ، P <0.0001. ).تشمل الأعراض النموذجية التي تظهر في النباتات الحساسة تجعد وتواء الجذع الذي يشبه بنية "قوس الراعي" ، متبوعًا بآفات بيضاوية مع البوغات البرتقالية / الوردية (الشكل التكميلي 1).المُدخلات الأسترالية التي تحمل جينات Lanr1 (83A: 476 و Tanjil) و AnMan (Mandelup) ذات مقاومة متوسطة ، 0.0331 و 0.0036).تظهر بعض السلالات التي تحمل أيضًا Lanr1 "المقاوم" و / أو أليلات AnMan أعراض المرض.
ومن المثير للاهتمام ، أن عددًا قليلاً من خطوط NLL التي تفتقر إلى أي أليل محدد "مقاوم" كشفت عن مستوى عالٍ من مقاومة الأنثراكنوز (يمكن مقارنتها أو أعلى منها بالنسبة للأنماط الجينية Lanr1 أو AnMan) ، مثل Boregine (قيمة P <0.0001 لكلا المعلمتين) ، Bojar (قيمة P <0.0001 للنتيجة و 0.001 لوزن النبات) وقيمة غير مهمة للوزن B-549 / 79.000 (P). ومن المثير للاهتمام ، أن عددًا قليلاً من خطوط NLL التي تفتقر إلى أي أليل محدد "مقاوم" كشفت عن مستوى عالٍ من مقاومة الأنثراكنوز (يمكن مقارنتها أو أعلى منها بالنسبة للأنماط الجينية Lanr1 أو AnMan) ، مثل Boregine (قيمة P <0.0001 لكلا المعلمتين) ، Bojar (قيمة P <0.0001 للنتيجة و 0.001 لوزن النبات) وقيمة غير مهمة للوزن B-549 / 79.000 (P). нтересно ، то несколько линий NLL ، лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля، покузый ивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий، чем для генотипов Lanr1 или AnMan)، таких (казоний) раметров)، Bojar (значение P <0،0001 для оценки и 0،001 для массы растения) и популяции B-549 / 79b (значение Pнаоние P <0،0001 ние ассы). ومن المثير للاهتمام ، أن العديد من خطوط NLL التي تفتقر إلى أي أليل محدد `` مقاوم '' أظهرت مستوى عالٍ من المقاومة لأنثراكنوز (يمكن مقارنته أو أعلى منه للأنماط الجينية Lanr1 أو AnMan) ، مثل Boregine (قيمة P <0.0001 لكلا المعلمتين) ، Bojar (قيمة P <0.0001 للتقييم و 0.001 لوزن النبات) وقيمة B-549 / 0.000 (للتقييم).. 549/79 ب 得分 ف 值 <0.0001 ， 重量 不 显 着）。 من المثير للاهتمام أن بعض أنظمة NLL التي لا تحتوي على أي علامات "مستضدية" تظهر مقاومة أفقية عالية (مكافئة لجينات Lanr1 أو AnMan أو أعلى) ، مثل Boregine (كلا المعلمتين P <0.0001) ، Bojar (قيمة P <0.0001 ، وزن النبات 0.001) والسلالة B-549 / 79b (قيمة P <0.0001 ، الوزن غير مهم). нтересно ، некоторые линии NLL ، каких-либо маркерных аллелей «резистентности» ، позистентности ивости к антракнозу (сравнимые или выше، ем у генотипов Lanr1 или AnMan)، такие как Borтя (0000) значение P <0،0001، масса растения 0،001) و популяция B-549 / 79b (оценка P-значение <0،0001، масса незначительна). ومن المثير للاهتمام ، أن بعض خطوط NLL التي تفتقر إلى أي أليلات علامة `` مقاومة '' أظهرت مستويات عالية من مقاومة الأنثراكنوز (يمكن مقارنتها أو أعلى من الأنماط الجينية Lanr1 أو AnMan) ، مثل Boregine (قيمة P لكل من المعلمات <0.0001) ، Bojar (قيمة P <0.0001 ، وزن النبات 0.001) والسكان B-549 / 79.000 (قيمة P ليست كبيرة).تشير هذه الظاهرة إلى إمكانية وجود مصدر وراثي جديد للمقاومة ، مما يفسر النقص الملحوظ في الارتباط بين الأنماط الجينية للواسم وأنماط المرض (قيم P من ~ 0.42 إلى ~ 0.98).وهكذا ، أظهر اختبار Kolmogorov-Smirnov أن البيانات الخاصة بمقاومة الأنثراكنوز تم توزيعها بشكل طبيعي تقريبًا للدرجات (قيم P 0.25 و 0.11) وكتلة النبات (قيم P 0.47 و 0.55) ، مما يوحي بأنني أفترض أن المزيد من الأليلات أكثر من Lanr1 و AnMan.
بناءً على نتائج فحص مقاومة الأنثراكنوز ، تم اختيار 4 خطوط لتحليل النسخ: 83A: 476 ، Boregine ، Mandelup ، والسكان 22660. تم إعادة اختبار هذه السلالات لمقاومة الجمرة الخبيثة في تجارب التلقيح بواسطة تسلسل الحمض النووي الريبي ، بشرط أن تكون هي نفسها كما في الاختبار السابق.كانت قيم النقاط على النحو التالي: Boregin (1.71 ± 1.39) ، 83A: 476 (2.09 ± 1.38) ، Mandelup (3.82 ± 1.42) والسكان 22660 (6.11 ± 1.29).
حقق بروتوكول Illumina NovaSeq 6000 متوسط ​​40.5 زوجًا من Mread لكل عينة (29.7 إلى 54.4 Mreads) (الجدول التكميلي S3).تراوحت درجات المحاذاة في التسلسل المرجعي من 75.5٪ إلى 88.6٪.تراوح متوسط ​​الارتباط لبيانات عدد القراءة بين المتغيرات التجريبية بين التكرارات البيولوجية من 0.812 إلى 0.997 (يعني 0.959). من بين 35170 جينًا تم تحليلها ، لم يكشف 2917 عن أي تعبير ، وتم التعبير عن الجينات الـ 4785 الأخرى بمستوى ضئيل (المتوسط ​​الأساسي <5). من بين 35170 جينًا تم تحليلها ، لم يكشف 2917 عن أي تعبير ، وتم التعبير عن الجينات الـ 4785 الأخرى بمستوى ضئيل (المتوسط ​​الأساسي <5). من 35170 شخصًا من 2917 مليونًا من أصل 2917 ، بالإضافة إلى 4785 مبنىًا على مدار الساعة. овое среднее <5). من بين 35170 جينًا تم تحليلها ، لم يُظهر 2917 أي تعبير ، وتم التعبير عن الجينات الـ 4785 المتبقية بمستوى ضئيل (المتوسط ​​الأساسي <5).在 分析 的 35170 个 基因 中 ， 2917 个 没有 表达 ， 4785 个 基因 的 表达 可以 不 计 （基本 平均值 <5）35170 من 35170 شخصًا من 2917 مليون جنيه إسترليني ، بالإضافة إلى 4785 شخصًا على مدار الساعة. تاريخ <5). من بين 35170 جينًا تم تحليلها ، لم يتم التعبير عن 2917 جينًا وكان للـ 4785 جينًا المتبقية تعبيرًا ضئيلًا (متوسط ​​القاعدة <5).وبالتالي ، كان عدد الجينات المعبر عنها (المتوسط ​​الأساسي ≥ 5) أثناء التجربة 27468 (78.1 ٪) (الجدول التكميلي S4).
من النقطة الزمنية الأولى ، استجابت جميع خطوط NLL لتلقيح C. lupini (سلالة Col-08) عن طريق إعادة برمجة النسخة (الجدول 1) ، ومع ذلك ، لوحظت اختلافات كبيرة بين السطور.وهكذا ، أظهر خط المقاومة 83A: 476 (الذي يحمل جين Lanr1) إعادة برمجة نسخ كبيرة في النقطة الزمنية الأولى (6 hpi) مع زيادة 31-69 ضعفًا في عدد الجينات المعزولة لأعلى ولأسفل مقارنة بالنقاط الزمنية الأخرى في هذه النقطة الزمنية.بالإضافة إلى ذلك ، كانت هذه الذروة قصيرة العمر ، حيث ظل التعبير عن عدد قليل من الجينات يتغير بشكل كبير في النقطة الزمنية الثانية (12 نقطة في البوصة).ومن المثير للاهتمام ، أن بوريجين ، الذي أظهر أيضًا مستوى عالٍ من المقاومة في اختبار الكسب غير المشروع ، لم يخضع لمثل هذه إعادة البرمجة النصية الضخمة أثناء التجربة.ومع ذلك ، كان عدد الجينات المعبر عنها تفاضليًا (DEG) هو نفسه بالنسبة إلى Boregine و 83A: 476 عند 12 HPI.أظهر كل من Mandelup والسكان 22660 قمم DEG في النقطة الزمنية الأخيرة (48 لتر / ثانية) ، مما يشير إلى تأخير نسبي في ردود الدفاع.
نظرًا لأن 83A: 476 خضعت لإعادة برمجة نسخ ضخمة استجابةً لـ C. lupini عند 6 HPI مقارنةً بجميع الخطوط الأخرى ، فإن حوالي 91 ٪ من DEGs التي لوحظت في هذه النقطة الزمنية كانت خاصة بالنسب (الشكل 1).ومع ذلك ، كان هناك بعض التداخل في الاستجابات المبكرة بين خطوط الدراسة ، حيث تداخل 68.5٪ و 50.9٪ و 52.6٪ DEG في Boregine و Mandelup والسكان 22660 على التوالي مع تلك الموجودة في 83A: 476 في نقاط زمنية معينة.ومع ذلك ، فإن هذه DEGs تمثل جزءًا صغيرًا فقط (0.97-1.70٪) من جميع DEGs المكتشفة حاليًا باستخدام 83A: 476.بالإضافة إلى ذلك ، كان 11 DEGs من جميع الخطوط متماسكة في هذا الوقت (الجداول التكميلية S4-S6) ، بما في ذلك المكونات الشائعة لاستجابات دفاع النبات: بروتين نقل الدهون (TanjilG_32225) ، إنزيم endoglucan-1،3-β-glucoside (TanjilG_23384) ، واثنين من البروتينات الأساسية المحفزة للإجهاد مثل SAM22G_32 ، Tanil_32 (تانيل) 2) ، واثنين من بروتينات جدار الخلية الهيكلية الغنية بالجليسين (TanjilG_19701 و TanjilG_19702).كان هناك أيضًا تداخل مرتفع نسبيًا في استجابات النسخ بين 83A: 476 و Boregine عند 24 HPI (إجمالي 16-38٪ DEG) وبين Mandelup والسكان 22660 عند 48 HPI (إجمالي 14-20٪ DEG).
يوضح مخطط فين عدد الجينات المعبر عنها تفاضليًا (DEG) في خطوط الترمس ضيقة الأوراق (NLL) الملقحة بـ Colletotrichum lupini (سلالة Col-08 التي تم الحصول عليها من حقول الترمس في Wierzhenice ، بولندا ، 1999).كانت خطوط NLL التي تم تحليلها هي: 83A: 476 (مقاومة ، تحمل أليل Lanr1) ، Boregine (مقاومة ، خلفية وراثية غير معروفة) ، Mandelup (مقاومة معتدلة ، تحمل أليل AnMan) والتعداد 22660 (حساس جدًا).اختصار hpi يقف لساعات بعد التطعيم.تمت إزالة القيم الصفرية لتبسيط الرسم البياني.
تم تحليل مجموعة الجينات المفرطة التعبير عند 6 نقاط في البوصة لوجود مجالات الجين R الكنسي (الجدول التكميلي S7).كشفت هذه الدراسة عن تحريض النسخ لجينات مقاومة الأمراض الكلاسيكية مع مجالات NBS-LRR فقط عند 83A: 476.تتكون هذه المجموعة من جين TIR-NBS-LRR واحد (tanjilg_05042) ، وخمسة جينات CC-NBS-LRR (tanjilg_06165 ، tanjilg_06162 ، tanjilg_22773 ، tanjilg_22640 ، و tanjilg_16162g_R) ، و tanjilg_16162) بالإضافة إلى أربعة NBS-Lrr (tanjilg_16162) وأربعة NBS-LRR (TANJILG_16162).كل هذه الجينات لها مجالات أساسية مرتبة في تسلسلات محفوظة.بالإضافة إلى جينات المجال NBS-LRR ، تم تنشيط العديد من كينازات RLL بمعدل 6 نقاط في البوصة ، أي واحد في Boregine (TanjilG_19877) ، واثنان في Mandelup (TanjilG_07141 و TanjilG_19877) وفي التعداد السكاني 22660 (TanjilG_09014 و TanjilG_10361: 476) واثنان.
تعرضت الجينات ذات التعبير المتغير بشكل كبير استجابة للتلقيح بـ C. lupini (سلالة Col-08) لتحليل إثراء علم الجينات (GO) (الجدول التكميلي S8). كان مصطلح العملية البيولوجية الأكثر تمثيلًا هو "GO: 0006952 استجابة دفاعية" والذي ظهر في 6 من أصل 16 مجموعة (وقت × خط) ذات أهمية عالية (قيمة P <0.001) (الشكل 2). كان مصطلح العملية البيولوجية الأكثر تمثيلًا هو "GO: 0006952 استجابة دفاعية" والذي ظهر في 6 من أصل 16 مجموعة (وقت × خط) ذات أهمية عالية (قيمة P <0.001) (الشكل 2). аиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный отвого из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0،001) (рис. 2). كان مصطلح العملية البيولوجية الأكثر تمثيلاً هو "GO: 0006952 استجابة دفاعية" ، والذي ظهر في 6 من 16 مجموعة (الوقت × النسب) ذات الأهمية العالية (قيمة P <0.001) (الشكل 2).. مصطلح العملية البيولوجية الأكثر تمثيلا هو "GO: 0006952 استجابة دفاعية" ، والذي يظهر في 6 من مجموعات 16 (时间 × 线) ، ذات الأهمية العالية (قيمة P <0.001) (图 2). аиболее асто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response»، биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response»، биологического й (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0،001) (рис. 2). كان مصطلح العملية البيولوجية الأكثر تمثيلاً هو "GO: 0006952 Defense Response" ، والذي ظهر في 6 مجموعات من أصل 16 (وقت × خط) ذات أهمية عالية (قيمة P <0.001) (الشكل 2).تم تمثيل هذا المصطلح بشكل زائد في نقطتين زمنيتين في 83A: 476 و Boregine (6 و 24 نقطة في البوصة) وفي نقطة زمنية واحدة في Mandelup و Population 22660 (12 و 6 نقطة في البوصة ، على التوالي).هذه نتيجة متوقعة ، تسلط الضوء على الاستجابة المضادة للفطريات للخطوط المقاومة.بالإضافة إلى ذلك ، استجاب 83A: 476 لـ C. lupini عن طريق حث الجينات المرتبطة بالانفجار التأكسدي الذي يمثله المصطلح "GO: 0055114 عملية الأكسدة والاختزال" ، مما يشير إلى استجابة دفاعية محددة ، بينما كشف Boregine عن استجابات دفاعية محددة تتعلق بمصطلح "GO".: 0006950 استجابة الإجهاد ".قام المجتمع 22660 بتنشيط استجابة المقاومة الأفقية التي تتضمن المستقلبات الثانوية ، مع تسليط الضوء على العدد الزائد من المصطلحات "GO: 0016104 عملية التخليق الحيوي triterpene" و "GO: 0006722 عملية التمثيل الغذائي لـ triterpene" (كلا المصطلحين ينتميان إلى نفس مجموعة الجينات) ، مع الأخذ في الاعتبار نتائج تحليل التخصيب لمصطلح GO ، واستقرار تفاعل Mandelup 226 بين Boregine و Population 6. يشمل عدد السكان 22660 المصطلح GO: 0015979 "التمثيل الضوئي" والعمليات البيولوجية الأخرى ذات الصلة.
إن مصطلحات علم الوجود الجيني للعمليات الحيوية المختارة في شرح الجينات المعبر عنها تفاضليًا أثناء استجابات النسخ للترمس الضيق الأوراق (NLL) الملقح بترمس الجمرة الخبيثة (سلالة Col-08 التي تم الحصول عليها من حقول الترمس في Wierzhenice ، بولندا ، في 1999) مبالغ فيها إلى حد كبير.كانت خطوط NLL التي تم تحليلها: 83A: 476 (مقاومة ، تحمل أليل Lanr1 متماثل الزيجوت) ، Boregine (مقاومة ، خلفية وراثية غير معروفة) ، Mandelup (مقاومة معتدلة ، تحمل أليل AnMan متماثل) والتعداد 22660 (حساس).
نظرًا لأن هذه الدراسة تهدف إلى تحديد الجينات التي تساهم في مقاومة الأنثراكنوز ، فقد تم تحليل الجينات المخصصة للمصطلحين GO "GO: 0006952 الاستجابات الدفاعية" و "GO: 0055114 عمليات الأكسدة والاختزال" مع عمليات قطع لأن خط الأساس يعني ≥ 30 مع سطر واحد على الأقل.× نقطة زمنية تجمع بين القيم المهمة إحصائيًا لـ log2 (تغيير أضعاف).كان عدد الجينات التي تستوفي هذه المعايير 65 للجينات GO: 0006952 و 524 لـ GO: 0055114.
كشفت 83A: 476 عن ذروتين DEG مشروحتين بالمصطلح GO: 0006952 ، الأول عند 6 جينات في البوصة (64 جينًا ، تنظيمًا صعودًا وهبوطًا) والثاني عند 24 جينًا لكل بوصة (15 جينًا ، تنظيم أعلى فقط).أظهر Boregine أيضًا أن GO: 0006952 بلغ ذروته في نفس النقطة الزمنية ، ولكن مع DEG أقل (11 و 8) وتنشيط تفضيلي.أظهر Mandeloop ذروتين من GO: 0006952 عند 12 و 48 HPI ، كلاهما يحمل 12 جينًا (الأول به جينات نشطة ، والثاني به جينات قمعية فقط) ، بينما كان عدد السكان 22660 عند 6 HPI (13 جينًا) غلبة أكبر لقمة الزيادة.أنظمة.وتجدر الإشارة إلى أن 96.4٪ من GO: 0006952 DEG في هذه القمم كان لها نفس النوع من الاستجابة (لأعلى أو لأسفل) ، مما يشير إلى تداخل كبير في الاستجابات الدفاعية على الرغم من الاختلافات في عدد الجينات المعنية.أكبر مجموعة من التسلسلات المتعلقة بمصطلح GO: 0006952 تشفر بروتين الرسائل المرتبط بالإجهاد 22 (يشبه SAM22) ، والذي ينتمي إلى صنف البروتين المرتبط بالإمراض من الفئة 10 (PR-10) والبروتين الأساسي لاتكس.بروتين مشابه (يشبه MLP)) بروتين (الشكل 3).اختلفت المجموعتان في طبيعة التعبير واتجاه الاستجابة.أظهرت الجينات التي تشفر البروتينات الشبيهة بـ SAM22 تحريضًا ثابتًا وهامًا في نقاط زمنية مبكرة (6 أو 12 نقطة في البوصة) ولم تستجب عمومًا في نهاية التجربة (48 حصانًا في البوصة) ، بينما أظهرت البروتينات الشبيهة بـ MLP تنسيقًا عند 6 نقاط في البوصة.HPI.83A: 476 و Mandelup بسرعة 48 حصان / بوصة ، كانت جميع نقاط البيانات الأخرى تقريبًا غير مستجيبة.بالإضافة إلى ذلك ، اتبعت الاختلافات في ملامح التعبير عن جينات البروتين الشبيهة بـ SAM22 التباين الملحوظ في مقاومة الأنثراكنوز ، حيث أن الخطوط الأكثر مقاومة لديها نقاط زمنية أكثر تحفز بشكل كبير هذه الجينات من الجينات الأكثر حساسية.أظهر جين LlR18A / B-like PR-10 الآخر نمط تعبير مشابه جدًا لجين البروتين الشبيه بـ SAM22.
تم تحديد المكونات الرئيسية لمصطلح العملية البيولوجية "GO: 0006952 Defense Response" وأنماط التعبير عن الجينات المرشحة لأليلات Lanr1 و AnMan.يمثل مقياس Log2 قيم log2 (تغيير أضعاف) بين التطعيم (Colletotrichum lupini ، سلالة Col-08 ، تم الحصول عليها من حقول الترمس ، Wizhenica ، بولندا ، 1999) ونباتات التحكم (تلقيح الشام) في نفس النقطة الزمنية.تم تحليل خطوط الترمس الضيقة التالية: 83A: 476 (مقاومة ، تحمل أليل Lanr1 متماثل الزيجوت) ، Boregine (مقاومة ، الخلفية الوراثية غير معروفة) ، Mandelup (مقاومة معتدلة ، تحمل أليل AnMan متماثل) ، والسكان 22660 (حساس).
بالإضافة إلى ذلك ، تم تقييم ملامح التعبير عن الجينات المرشحة لـ RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) و AnMan (TanjilG_12861) (الشكل 3).أظهر جين TanjilG_05042 استجابة كبيرة (تنشيط) عند 83A: 476 فقط عند النقطة الزمنية الأولى (6 نقاط في البوصة) ، بينما كان TanjilG_12861 مهمًا في Mandeloop فقط في نقطتين زمنيتين: 6 نقاط في البوصة (تنظيم منخفض) و 24 نقطة في البوصة (6 نقاط في البوصة).مع.).قابل للتعديل)).
كانت الجينات الأكثر إفراطًا في التعبير في مصطلح GO: 0055114 "عملية الأكسدة والاختزال" هي الجينات التي تشفر بروتينات السيتوكروم P450 والبيروكسيديز (الشكل 4).بالنسبة للعينات المعزولة من 83A: 476 عند 6 HPI ، لوحظت قيم السجل 2 (تغير أضعاف) الحد الأقصى أو الأدنى (لـ 86.6 ٪ من الجينات) بشكل عام بين النباتات الملقحة والنباتات الضابطة ، مما يبرز الاستجابة العالية لهذا النمط الوراثي لتلقيح الجنس.أظهر 83A: 476 أهم GO: 0055114 DEG بمعدل 6 نقاط في البوصة (503 جينات) ، بينما أظهرت بقية الخطوط 48 نقطة في البوصة (Boregine ، 31 جينًا ؛ Mandelup ، 85 جينًا ؛ والسكان 22660 ، 78 جينًا)).في معظم جينات عائلة GO: 0055114 ، لوحظ نوعان من الاستجابات للتلقيح (التنشيط والتثبيط).ومن المثير للاهتمام ، أن ما يصل إلى 97.6 ٪ من DEGs التي تم تحديدها لمصطلح GO: 0055114 في Mandelupe بسرعة 48 حصان تشير هذه الملاحظات إلى أنه على الرغم من النطاق الأصغر بكثير (أي عدد جينات الأكسدة والاختزال المتحولة ، 85 مقابل 503) ، فإن نمط استجابات النسخ المتأخرة لماندلوب لأنثراكنوز يشبه الاستجابة المبكرة 83A: 476.في Boregine و Population 22660 ، يكون هذا التقارب أقل عند 51.6٪ و 75.6٪ على التوالي.
تم الكشف عن أنماط التعبير عن المكونات الرئيسية لمصطلح العملية البيولوجية "GO: 0055114 عملية الأكسدة والاختزال".يمثل مقياس Log2 قيم log2 (تغيير أضعاف) بين التطعيم (Colletotrichum lupini ، سلالة Col-08 ، تم الحصول عليها من حقول الترمس ، Wizhenica ، بولندا ، 1999) ونباتات التحكم (تلقيح الشام) في نفس النقطة الزمنية.تم تحليل خطوط الترمس الضيقة التالية: 83A: 476 (مقاومة ، تحمل أليل Lanr1 متماثل الزيجوت) ، Boregine (مقاومة ، الخلفية الوراثية غير معروفة) ، Mandelup (مقاومة معتدلة ، تحمل أليل AnMan متماثل) ، والسكان 22660 (حساس).
83A: 476 استجابات نسخية للتلقيح مع C. lupini (سلالة Col-08) تضمنت أيضًا إسكات منسق للجينات المنسوبة إلى مصطلح GO: 0015979 "التمثيل الضوئي" والعمليات البيولوجية الأخرى ذات الصلة (الشكل 5).تحتوي مجموعة GO: 0015979 DEG هذه على 105 جينات تم قمعها بشكل كبير عند 6 نقاط في البوصة عند 83A: 476.في هذه المجموعة الفرعية ، تم أيضًا تقليل تنظيم 37 جينًا في Mandelup عند 48 HPI و 35 في نفس النقطة الزمنية في 22660 من السكان ، بما في ذلك 19 DEGs المشتركة لكلا الطرز الوراثية.لا توجد DEGs مرتبطة بالمصطلح GO: تم تنشيط 0015979 بشكل كبير في أي مجموعة (سطر × وقت).
تم الكشف عن أنماط التعبير عن المكونات الرئيسية لمصطلح العملية البيولوجية "GO: 0015979 التمثيل الضوئي".يمثل مقياس Log2 قيم log2 (تغيير أضعاف) بين التطعيم (Colletotrichum lupini ، سلالة Col-08 ، تم الحصول عليها من حقول الترمس ، Wizhenica ، بولندا ، 1999) ونباتات التحكم (تلقيح الشام) في نفس النقطة الزمنية.تم تحليل خطوط الترمس الضيقة التالية: 83A: 476 (مقاومة ، تحمل أليل Lanr1 متماثل الزيجوت) ، Boregine (مقاومة ، الخلفية الوراثية غير معروفة) ، Mandelup (مقاومة معتدلة ، تحمل أليل AnMan متماثل) ، والسكان 22660 (حساس).
استنادًا إلى نتائج تحليل التعبير التفاضلي والمشارك المفترض في استجابات الدفاع ضد الفطريات المسببة للأمراض ، تم اختيار هذه المجموعة المكونة من سبعة جينات لتقدير ملفات تعريف التعبير بواسطة PCR في الوقت الفعلي (الجدول التكميلي S9).
تم تحفيز جين البروتين المفترض TanjilG_10657 بشكل كبير في جميع الخطوط والنقاط الزمنية المدروسة مقارنة بنباتات التحكم (المقلدة) (الجداول التكميلية S10 ، S11).بالإضافة إلى ذلك ، أظهر ملف تعريف تعبير TanjilG_10657 اتجاهًا متزايدًا على مدار التجربة لجميع الخطوط.أظهر المجتمع 22660 أعلى حساسية لـ TanjilG_10657 للتلقيح مع تنشيط 114 ضعفًا وأعلى مستوى تعبير نسبي (4.4 ± 0.4) عند 24 HPI (الشكل 6 أ).أظهر جين البروتين PR10 LlR18A TanjilG_27015 أيضًا تنشيطًا عبر جميع الخطوط والنقاط الزمنية ، مع دلالة إحصائية في معظم نقاط البيانات (الشكل 6 ب).على غرار TanjilG_10657 ، لوحظ أعلى مستوى تعبير نسبي لـ TanjilG_27015 في 22660 من السكان الملقحين عند 24 HPI (19.5 ± 2.4).تم تنظيم جين إندوكيتيناز الحمضي TanjilG_04706 بشكل كبير في جميع الخطوط وفي جميع النقاط الزمنية باستثناء Boregine 6 hpi (الشكل 6 ج).تم تحريضه بقوة عند النقطة الزمنية الأولى (6 HPI) عند 83A: 476 (بمقدار 10.5 مرة) وزاد بشكل معتدل في الخطوط الأخرى (بمقدار 6.6-7.5 مرة).أثناء التجربة ، ظل تعبير TanjilG_04706 عند مستويات مماثلة في 83A: 476 و Boregine ، بينما في Mandelup و Population 22660 زاد بشكل ملحوظ ، ووصل إلى قيم عالية نسبيًا (5.9 ± 1.5 و 6.2 ± 1.5 على التوالي).أظهر الجين الشبيه بـ endoglucan-1،3-β-glucosidase TanjilG_23384 تنشيطًا عاليًا في أول نقطتين زمنيتين (6 و 12 نقطة في البوصة) في جميع الخطوط باستثناء السكان 22660 (الشكل 6 د).لوحظت أعلى مستويات التعبير النسبي لـ TanjilG_23384 في النقطة الزمنية الثانية (12 نقطة في البوصة) في Mandelup (2.7 ± 0.3) و 83A: 476 (1.5 ± 0.1).عند 24 نقطة لكل بوصة ، كان تعبير TanjilG_23384 منخفضًا نسبيًا في جميع الخطوط المدروسة (من 0.04 ± 0.009 إلى 0.44 ± 0.12).
ملامح التعبير عن الجينات المختارة (ag) التي كشفت عنها PCR الكمي.تمثل الأرقام 6 و 12 و 24 ساعات بعد التطعيم.تم استخدام جينات LanDExH7 و LanTUB6 للتطبيع واستخدم LanTUB6 للمعايرة بين السلاسل.تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري على أساس ثلاث مكررات بيولوجية ، كل منها يمثل متوسط ​​ثلاث مكررات تقنية. تم تمييز الدلالة الإحصائية للاختلافات في مستويات التعبير بين التطعيم (Colletotrichum lupini ، سلالة Col-08 ، التي تم الحصول عليها في 1999 من حقل الترمس في Wierzenica ، بولندا) والتحكم (التلقيح الوهمي) فوق نقاط البيانات (* قيمة P <0.05 ، ** قيمة P ≤ 0.01 ، *** قيمة P ≤ 0.001). تم تمييز الدلالة الإحصائية للاختلافات في مستويات التعبير بين التطعيم (Colletotrichum lupini ، سلالة Col-08 ، التي تم الحصول عليها في 1999 من حقل الترمس في Wierzenica ، بولندا) والتحكم (التلقيح الوهمي) فوق نقاط البيانات (* قيمة P <0.05 ، ** قيمة P ≤ 0.01 ، *** قيمة P ≤ 0.001). Статистическая значимость различий в уровнях кспресии между инокулированными (Colletotrichum lupini، повня кспресии между инокулированными (Colletotrichum lupini، повня 1999) ина в. ние P ≤ 0،01 ، *** значение P ≤ 0،001). لوحظت فروق ذات دلالة إحصائية في مستويات التعبير بين التلقيح (Colletotrichum lupini ، سلالة Col-08 ، تم الحصول عليها في 1999 من حقل الترمس في Wierzhenice ، بولندا) والتحكم (تلقيح الشام) فوق نقاط البيانات (* قيمة P <0.05 ، ** قيمة P ≤ 0.01 ، *** قيمة P ≤ 0.001).接种 （Colletotrichum lupini Col-08 株 ， 1999 年 从 波兰 Wierzenica 的 羽扇 豆 田 获得 对照 （模拟 接种） 水平 差异 的 统计学 在 数据 点 上方 （* P <0.01)接种 （كوليتوتريشوم لوبيني ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 植物 之间 水平 的 性 标记 数据 点 * p 值 <0.05، ** P ≤ 0.01، *** P 0.001)。 Статистически значимые различия в уровнях кспресии между инокулированными (Colletotrichum lupini، поволовня، полования، таммлированными) ерженице، ольша، в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены точнакны значение ≤ 0،01 ، *** P-значение 0،001). لوحظت فروق ذات دلالة إحصائية في مستويات التعبير بين التلقيح (Colletotrichum lupini ، سلالة Col-08 ، تم الحصول عليها من حقول الترمس في Verzhenice ، بولندا ، في عام 1999) ونباتات التحكم (تلقيح الشام) فوق نقاط البيانات (* قيمة P <0.05 ، ** قيمة P ≤ 0.01 ، *** قيمة P ≤ 0.001).كانت خطوط NLL التي تم تحليلها: 83A: 476 (مقاومة ، تحمل أليل Lanr1 متماثل الزيجوت) ، Mandelup (مقاومة معتدلة ، تحمل أليل AnMan متماثل الزيجوت) ، Boregine (مقاومة ، خلفية وراثية غير معروفة) والسكان 22660 (حساس).
أظهر الجين المرشح TanjilG_05042 في موضع Lanr1 نمط تعبير مختلفًا بشكل ملحوظ عن الملامح التي تم الحصول عليها من دراسات RNA-seq (الشكل 6 هـ).لوحظ تنشيط كبير لهذا الجين في Mandelup و 22660 من السكان (حتى 39.7 و 11.7 مرة ، على التوالي) ، مما أدى إلى مستويات تعبير عالية نسبيًا (تصل إلى 1.4 ± 0.14 و 7.2 ± 1.3 ، على التوالي).كشفت 83A: 476 أيضًا عن بعض التنظيم لجين TanjilG_05042 (يصل إلى 3.8 ضعفًا) ، ومع ذلك ، كانت مستويات التعبير النسبي التي تم تحقيقها (0.044 ± 0.002) أكثر من 30 ضعفًا من تلك التي لوحظت في Mandelup و 22660.تم تحليله بواسطة qPCR أظهر اختلافات كبيرة في مستويات التعبير بين الأنماط الجينية في المتغيرات المحصنة (الضابطة) ، حيث وصل إلى 58 ضعفًا بين السكان 22660 و 83 أ: 476 ، وكذلك بين السكان 22660 و 22660. تم تحقيق فرق مضاعف بين بوريجين وماندالوب.
تم تنشيط الجين المرشح في موضع AnMan ، TanjilG_12861 ، استجابةً للتلقيح في 83A: 476 و Mandelup ، وكان محايدًا في عدد 22660 من السكان ، وخضع للتنظيم في Boregine (الشكل 6f).كان التعبير النسبي لجين TanjilG_12861 هو الأعلى في التلقيح 83A: 476 (0.14 ± 0.01).أظهر جين بروتين الصدمة الحرارية 17.4 كيلو دالتون فئة 1 TanjilG_05080 HSP17.4 مستويات تعبير نسبي أقل في جميع السلالات المدروسة ونقاط الوقت (الشكل 6 جم).لوحظت أعلى قيمة عند 24 نقطة لكل بوصة في 22660 من السكان (0.14 ± 0.02 ، بزيادة ثمانية أضعاف استجابة للتلقيح).
كشفت مقارنة ملفات تعريف التعبير الجيني (الشكل 7) عن وجود ارتباط كبير بين TanjilG_10657 وأربعة جينات أخرى: TanjilG_27015 (r = 0.89) و TanjilG_05080 (r = 0.85) و TanjilG_05042 (r = 0.80) و TanjilG_04706 (r = 0.79).قد تشير هذه النتائج إلى التنظيم المشترك لهذه الجينات أثناء الاستجابات الدفاعية.أظهرت جينات TanjilG_12861 و TanjilG_23384 أشكال تعبير مختلفة مع قيم معامل ارتباط بيرسون أقل (من 0.08 إلى 0.43 و -0.19 إلى 0.28 على التوالي) مقارنة بالجينات الأخرى.
تم الكشف عن الارتباطات بين ملفات تعريف التعبير الجيني باستخدام PCR الكمي.تم تحليل خطوط الترمس الضيقة التالية: 83A: 476 (مقاوم ، يحمل أليل Lanr1 متماثل الزيجوت) ، Mandelup (مقاوم بشكل معتدل ، يحمل أليل AnMan متماثل) ، Boregine (مقاوم ، الخلفية الوراثية غير معروفة) ، والسكان 22660 (حساس).تم حساب ثلاث نقاط زمنية (6 و 12 و 24 ساعة بعد التلقيح) ، بما في ذلك التلقيح (Colletotrichum lupini ، سلالة Col-08 ، التي تم الحصول عليها من حقول الترمس في Wierzhenice ، بولندا ، في عام 1999) والنباتات الضابطة (تلقيح الشام).يوضح المقياس قيمة معامل ارتباط بيرسون.
استنادًا إلى البيانات التي تم الحصول عليها عند 6 حصان لكل بوصة ، تم إجراء WGCNA على 9981 DEG تم تحديده من خلال مقارنة النباتات الملقحة والتحكم للتركيز على استجابات الدفاع المبكرة (الجدول التكميلي S12).تم العثور على اثنين وعشرين وحدة جينية (مجموعات) مع ملامح تعبير مرتبطة (إيجابية أو سلبية) بين الأنماط الجينية والمتغيرات التجريبية. في المتوسط ​​، كانت مستويات التعبير الجيني تنخفض بالترتيب 83A: 476> Mandelup> Boregine> رقم 22660 (في كلا المتغيرين ، كان هذا الاتجاه أقوى في النباتات الضابطة). في المتوسط ​​، كانت مستويات التعبير الجيني تنخفض بالترتيب 83A: 476> Mandelup> Boregine> رقم 22660 (في كلا المتغيرين ، كان هذا الاتجاه أقوى في النباتات الضابطة). В среднем уровни кспрессии генов снижались в порядке 83A: 476> Mandelup> Boregine> تعداد السكان 22660 (в обоих вариантах، одснания) нее у контрольных растений). في المتوسط ​​، انخفضت مستويات التعبير الجيني بالترتيب 83A: 476> Mandelup> Boregine> رقم 22660 (في كلا المتغيرين ، كان هذا الاتجاه أقوى في النباتات الضابطة).平均 而言 ， 基因 表达 水平 按 83A: 476> Mandelup> Boregine> تعداد السكان 22660 顺序 下降 （然而 ， 两种 变 体 中 ， 这种 趋势 在 对照 植物 中 更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 83a: 476> Mandelup> boregine> السكان 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种 在 在 植物 中 更） 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 عدد السكان: 22660 نسمة контрольных растений). في المتوسط ​​، انخفضت مستويات التعبير الجيني في السلسلة 83A: 476> Mandelup> Boregine> رقم 22660 (ومع ذلك ، في كلا المتغيرين ، كان هذا الاتجاه أقوى في النباتات الضابطة).أدى التطعيم إلى زيادة تنظيم التعبير الجيني ، خاصة في الوحدات 18 و 19 و 14 و 6 و 1 (بترتيب تنازلي للتأثير) أو التنظيم السلبي (مثل الوحدات 9 و 20) أو بتأثيرات محايدة (مثل الوحدات 11 و 22 و 8 و 13).كشف تحليل إثراء مصطلح GO (الجدول التكميلي S13) عن "GO: 0006952 استجابات واقية" للوحدة الملقحة (18) بأقصى قدر من التنشيط ، بما في ذلك الجينات التي تم تحليلها بواسطة qPCR (TanjilG_04706 و TanjilG_23384 و TanjilG_10657 و TanjilG_27015) ، بالإضافة إلى العديد من التطعيمات الأكثر كبتًا ضوئيًا (9).تم تحديد مُكثِّف الوحدة 18 (الشكل 8) على أنه جين تانجيل G_26536 الذي يشفر بروتين LlR18B الذي يشبه PR-10 ، وتم تحديد مُكثِّف الوحدة 9 على أنه جين تانجيلG_28955 الذي يشفر بروتين النظام الضوئي II PsbQ.تم العثور على جين مرشح مقاومة أنثراكنوز Lanr1 ، TanjilG_05042 ، في الوحدة 22 (الشكل 9) ويرتبط بالمصطلحات "GO: 0044260 عمليات التمثيل الغذائي للجزيئات الكبيرة الخلوية" و "GO: 0006355 تنظيم النسخ ، قالب الحمض النووي" الذي يحمل مركز TanjilG_01212.الجين يشفر عامل نسخ الإجهاد الحراري A-4a (HSFA4a).
تحليل الشبكة الموزون للتعبير المشترك للجينات عن الوحدات ذات المصطلحات العملية البيولوجية الممثلة تمثيلاً زائداً "GO: 0006952 استجابات الدفاع".تم تبسيط الربط لتسليط الضوء على الجينات الأربعة التي تم تحليلها بواسطة qPCR (TanjilG_04706 و TanjilG_23384 و TanjilG_10657 و TanjilG_27015).
تحليل الشبكة الموزونة للتعبير المشترك للجين عن وحدة مع مصطلح عملية بيولوجية تم تمثيلها بشكل كبير "GO: 0006355: تنظيم النسخ ، قوالب الحمض النووي" وتحمل جين مقاومة أنثراكنوز مرشح Lanr1 TanjilG_05042.تم تبسيط عملية الربط لعزل جين TanjilG_05042 وجين TanjilG_01212 المركزي.
أظهر فحص مقاومة الأنثراكنوز الذي تم جمعه في أستراليا أن معظم الأصناف التي تم إطلاقها في وقت مبكر كانت حساسة ؛تم وصف Kalya و Coromup و Mandelup بالمقاومة المعتدلة ، بينما تم وصف Wonga و Tanjil و 83A: 476 بأنها شديدة المقاومة.كان له نفس أليل المقاومة ، المعين Lanr1 ، وكان لدى Coromup و Mandelup أليل مختلف ، اسمه AnMan10 ، 26 ، 39 ، بينما مرر كاليا أليلًا مختلفًا.، Lanr2.أدى فحص مقاومة الأنثراكنوز في ألمانيا إلى تحديد خط مقاومة Bo7212 بأليل مرشح بخلاف Lanr1 ، المعين LanrBo36.
كشفت دراستنا عن تردد منخفض جدًا (حوالي 6٪) من أليل Lanr1 في البلازما الجرثومية المختبرة.تتوافق هذه الملاحظة مع نتائج فحص الأصول الوراثية لأوروبا الشرقية باستخدام علامات Anseq3 و Anseq4 ، والتي أظهرت أن أليل Lanr1 موجود في سطرين فقط من بيلاروسيا.يشير هذا إلى أن أليل Lanr1 لم يتم استخدامه على نطاق واسع في برامج التربية المحلية ، على عكس أستراليا ، حيث يُعد أحد الأليلات الرئيسية للتربية بمساعدة الواسمات.قد يكون هذا بسبب انخفاض مستوى المقاومة الذي يوفره Lanr1 allele في الظروف الميدانية الأوروبية مقارنة بالتقرير الأسترالي.بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت دراسات أنثراكنوز في مناطق هطول الأمطار الغزيرة في أستراليا أن استجابات المقاومة بوساطة أليل Lanr1 قد لا تكون فعالة في الظروف الجوية التي تفضل النمو والتطور السريع للعامل الممرض.في الواقع ، في هذه الدراسة ، لوحظت أيضًا بعض أعراض أنثراكنوز في الأنماط الجينية التي تحمل أليل Lanr1 ، مما يشير إلى أن المقاومة قد تختفي في ظل الظروف المثلى لتطوير C. lupini.بالإضافة إلى ذلك ، فإن التفسيرات الإيجابية الخاطئة لوجود علامات Anseq3 و Anseq4 ، والتي تبلغ حوالي 1 سم من موقع Lanr1 ، ممكنة 28،30،43.
أظهرت دراستنا أن 83A: 476 ، التي تحمل أليل Lanr1 ، استجابت لتلقيح C. lupini بإعادة برمجة نسخ على نطاق واسع في أول نقطة زمنية تم تحليلها (6 نقاط في البوصة) ، بينما في Mandelup ، التي تحمل أليل AnMan ، لوحظت الاستجابات النسخية في وقت لاحق.(من 24 إلى 48 حصان).ترتبط هذه الاختلافات الزمنية في الاستجابات الدفاعية بالاختلافات في أعراض المرض ، مما يبرز أهمية التعرف المبكر على مسببات الأمراض من أجل الاستجابة الناجحة للمقاومة.لإصابة الأنسجة النباتية ، يجب أن تمر جراثيم الجمرة الخبيثة بعدة مراحل نمو على سطح العائل ، بما في ذلك الإنبات ، وانقسام الخلايا ، وتشكيل أبريسوريوم.الزائدة هي بنية معدية تلتصق بسطح العائل وتسهل الاختراق في الأنسجة المضيفة.وهكذا ، أظهرت أبواغ C. gloeosporioides في مستخلص البازلاء التقسيم الأول للنواة بعد 75-90 دقيقة من الحضانة ، وتشكيل أنبوب جرثومي بعد 90-120 دقيقة ، والقمع بعد 4 ساعات 45.أظهر مانجو C. gloeosporioides أكثر من 40٪ إنبات كونيدي بعد 3 ساعات من الحضانة وحوالي 20٪ تشكل خافضات بعد 4 ساعات.أظهر جين CAP20 المرتبط بالضراوة في C. gloeosporioides نشاطًا نسخيًا في الكونيديا المكونة للنبات المشاشية بعد فترة حضانة لمدة 3.5 ساعة في شمع سطح الأفوكادو بتركيزات عالية من بروتين CAP20 بعد 4 ساعات و 46 دقيقة.وبالمثل ، تم تحفيز نشاط جينات التركيب الحيوي للميلانين في C. trifolii خلال فترة حضانة لمدة ساعتين متبوعة بتكوين أبريسوريوم بعد ساعة واحدة.أظهرت الدراسات التي أجريت على أنسجة الأوراق أن الفراولة الملقحة بـ C. acutatum لها قمع أولًا عند 8 نقاط في البوصة ، في حين أن الطماطم الملقحة بكوكود C.تتفق إلى حد كبير مع النطاق الزمني لـ Colletotrichum spp.عملية معدية.تشير الاستجابات الدفاعية السريعة لـ 83A: 476 إلى تورط جينات مقاومة النبات والمناعة المحفزة (ETI) في هذا الخط ، بينما تدعم استجابات Mandelup المتأخرة فرضية المناعة المحفزة بالنمط الجزيئي (MTI) 50. الاستجابات المبكرة لـ 83A: 476 و Mandelup.كما يدعم التداخل الجزئي بين الجينات المنظمة لأعلى أو لأسفل في الاستجابة المتأخرة هذا المفهوم ، حيث يُنظر إلى ETI غالبًا على أنه استجابة MTI متسارعة ومعززة تبلغ ذروتها في موت الخلية المبرمج في موقع الإصابة ، والمعروف باسم صدمة الحساسية 51،52.
معظم الجينات المنسوبة إلى مصطلح Gene Ontology GO: 0006952 "الاستجابة الدفاعية" هي المتماثلات الـ 11 لبروتين 22 رسالة الصيام الناتجة عن الإجهاد (على غرار SAM22) وسبعة بروتينات لاتكس (MLPs).- أظهرت البروتينات 31 و 34 و 43 و 423 تشابهًا في التسلسل.أظهرت الجينات الشبيهة بـ SAM22 نشاطًا كبيرًا استمر لفترة أطول ، وأظهر مستويات متزايدة من مقاومة الأنثراكنوز (83A: 476 و Boregine).ومع ذلك ، تم تقليل تنظيم الجينات الشبيهة بـ MLP فقط في السلالات التي تحمل أليل المقاومة المرشح (83A: 476 / Lanr1 عند 6 نقاط في البوصة و Mandelup / AnMan بسرعة 24 نقطة في البوصة).وتجدر الإشارة إلى أن جميع المتماثلات التي تشبه SAM22 التي تم تحديدها تنشأ من مجموعة جينية تمتد حوالي 105 كيلو بايت ، بينما تنشأ الجينات الشبيهة بـ MLP من مناطق منفصلة من الجينوم.تم العثور أيضًا على التنشيط المنسق لهذه الجينات الشبيهة بـ SAM22 في دراستنا السابقة لمقاومة NLL لتلقيح Diaporthetoxica ، مما يشير إلى أنها متورطة في المكونات الأفقية للاستجابة الدفاعية.هذا الاستنتاج مدعوم أيضًا بتقارير عن استجابة إيجابية للجينات الشبيهة بـ SAM22 للإصابة أو العلاج بحمض الساليسيليك أو محرضات الفطريات أو بيروكسيد الهيدروجين.
لقد ثبت أن الجينات الشبيهة بـ MLP تستجيب لمختلف الضغوط اللاأحيائية والحيوية ، بما في ذلك الالتهابات الفطرية البكتيرية والفيروسية والممرضة في العديد من أنواع النباتات.تراوحت اتجاهات الاستجابة لتفاعلات معينة بين النباتات ومسببات الأمراض من الزيادة الشديدة (أي أثناء الإصابة بالقطن مع Verticillium dahliae) إلى الانخفاض بشكل كبير (أي بعد إصابة شجرة التفاح بـ Alternaria spp.).لوحظ انخفاض كبير في التنظيم لجين 423 الشبيه بـ MLP أثناء دفاعات الأفوكادو لعدوى F. niger وأثناء إصابة شجرة التفاح Botryosphaeria berengeriana f.CN.piricola و Alternaria alternata من أنواع التفاح الفطرية.بالإضافة إلى ذلك ، كان لدى تفاح كالي الذي يفرط في التعبير عن جين 423 الشبيه بـ MLP تعبير أقل عن الجينات المرتبطة بالمقاومة وكان أكثر عرضة للعدوى الفطرية.بعد Fusarium oxysporum f ، تم أيضًا قمع الجين 423 الشبيه بـ MLP في البلازما الجرثومية للفاصوليا الشائعة المقاومة.CN.عدوى الفاصوليا 60.
الأعضاء الآخرون في عائلة PR-10 التي تم تحديدها في دراستنا RNA-seq كانت جينات LlR18A و LlR18B استجابة للتنظيم ، بالإضافة إلى الجين المنتظم (جين واحد) أو الجين المنظم (3 جينات) لبروتين نقل الدهون DIR1..بالإضافة إلى ذلك ، يسلط WGCNA الضوء على جين LlR18B كمحور في هذه الوحدة ، والذي يكون شديد التأثر بالتطعيم ويحمل العديد من جينات الاستجابة الوقائية.تم تحفيز جينات LlR18A و LlR18B في أوراق الترمس الصفراء استجابةً للبكتيريا المسببة للأمراض ، وكذلك في السيقان NLL بعد تلقيح D. المقاومة المكتسبة (ريال سعودي).مع تطور التفاعلات الوقائية ، يتم نقل بروتين DIR1 من بؤرة العدوى عبر اللحاء لتحفيز SAR في الأعضاء البعيدة.ومن المثير للاهتمام ، أن جين TanjilG_02313 DIR1 قد تم تحريضه بشكل كبير في أول نقطة زمنية في السطور 84A: 476 والسطر 22660 ، ولكن مقاومة الأنثراكنوز تطورت بنجاح فقط في السطر 84A: 476.قد يشير هذا إلى بعض الوظائف الفرعية لجين DIR1 في NLL ، نظرًا لأن المتماثلات الثلاثة المتبقية استجابت للتلقيح فقط في خط 83A: 476 عند 6 نقاط في البوصة ، وتم توجيه هذه الاستجابة لأسفل.
في دراستنا ، كانت المكونات الأكثر شيوعًا المطابقة للعملية البيولوجية المسماة "GO: 0055114 عملية الأكسدة والاختزال" هي بروتين السيتوكروم P450 ، بيروكسيداز ، حمض اللينوليك 9S- / 13S-lipoxygenase ، و 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase.بالإضافة إلى ذلك ، يعرّف WGCNA الخاص بنا متماثل HSFA4a كمحور يحمل وحدات مثل مرشح الجين المقاومة Lanr1 TanjilG_05042.HSFA4a هو أحد مكونات التنظيم المعتمد على الأكسدة والاختزال للنسخ النووي في النباتات.
بروتينات السيتوكروم P450 هي عبارة عن إنزيم مؤكسد يحفز تفاعلات الهيدروكسيل المعتمدة على NADPH و / أو O2 في التمثيل الغذائي الأولي والثانوي ، بما في ذلك استقلاب xenobiotics ، بالإضافة إلى الهرمونات والأحماض الدهنية والستيرولات ومكونات جدار الخلية والبوليمرات الحيوية والتركيب الحيوي للمركبات الواقية. إلى 5.7 بسبب عدد كبير من المتماثلات المتغيرة (37) والاختلافات في أنماط الاستجابة بين جينات معينة ، مما يعكس مراجعة تصاعدية..إن استخدام بيانات RNA-seq فقط لتوضيح الوظيفة البيولوجية المفترضة لجينات NLL في عائلة بروتينية كبيرة كهذه سيكون تخمينيًا للغاية.ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن بعض جينات السيتوكروم P450 مرتبطة بزيادة المقاومة للفطريات أو البكتيريا المسببة للأمراض ، بما في ذلك المساهمة في تفاعلات الحساسية.
البيروكسيدات من الفئة الثالثة هي إنزيمات نباتية متعددة الوظائف تشارك في مجموعة واسعة من عمليات التمثيل الغذائي أثناء نمو النبات وتطوره ، وكذلك استجابة للضغوط البيئية مثل الملوحة والجفاف وكثافة الضوء العالية وهجوم العوامل الممرضة.تشارك البيروكسيدات في تفاعل العديد من الأنواع النباتية مع الجمرة الخبيثة ، بما في ذلك Stylosanthes humilis و C. gloeosporioides و Lens culinaris و C. truncatum و Phaseolus vulgaris و C. lindemuthianum و Cucumis sativus و C. lagenarium 73،74،75،76.تكون الاستجابة سريعة جدًا ، حتى في بعض الأحيان عند 4 نقاط HPI ، قبل أن يخترق الفطر نسيج النبات.استجاب جين البيروكسيداز أيضًا لتلقيح D.oxica NLL.بالإضافة إلى وظائفها النموذجية لتنظيم الانفجار التأكسدي أو القضاء على الإجهاد التأكسدي ، يمكن أن تتداخل البيروكسيداز مع نمو مسببات الأمراض عن طريق إنشاء حواجز مادية تعتمد على تعزيز جدار الخلية أثناء التنشيط ، أو الوحدة الفرعية أو الارتباط المتبادل لمركبات معينة.يمكن أن تُعزى هذه الوظيفة في السيليكو إلى جين TanjilG_03329 الذي يقوم بتشفير بيروكسيداز الأنيون المشكل للجنين والذي تم تنظيمه بشكل كبير في دراستنا في الخط المقاوم 83A: 476 عند 6 HPI ، ولكن ليس في السلالات الأخرى والنقاط الزمنية التي لم تستجب.
9S- / 13S-lipoxygenase من حمض اللينوليك هو الخطوة الأولى في المسار التأكسدي للتخليق الحيوي للدهون.منتجات هذا المسار لها وظائف متعددة في الدفاع عن النبات ، بما في ذلك تقوية جدار الخلية من خلال تكوين رواسب الكالوز والبكتين ، وتنظيم الإجهاد التأكسدي من خلال إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية.في هذه الدراسة ، تم تغيير تعبير حمض اللينوليك 9S- / 13S-lipoxygenase في جميع السلالات ، ولكن في المجموعة الحساسة 22660 ، ساد التنظيم في نقاط زمنية مختلفة ، بينما في السلالات التي تحمل مقاومة Lanr1 وأليل AnMan ، فإنها تؤكد على تنوع طبقة الأوكسيليبين في تفاعلات الجمرة الخبيثة الواقية بين هذه الأنماط الجينية.
تمت إعادة تنظيم متماثل 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACO) بشكل كبير (9 جينات) أو تقليل التنظيم (جيناتان) عند تلقيح الترمس.مع استثناءين ، حدثت كل هذه الاستجابات بقوة 6 حصان.في 83 أ: 476.التفاعل الأنزيمي بوساطة بروتينات ACO هو خطوة تحديد المعدل في إنتاج الإيثيلين ، وبالتالي فهو منظم للغاية.الإيثيلين هو هرمون نباتي يلعب مجموعة متنوعة من الأدوار في تنظيم نمو النبات والاستجابة لظروف الإجهاد اللاأحيائي والحيوي.يشارك تحريض نسخ ACO وتفعيل مسار إشارات الإيثيلين في زيادة مقاومة الأرز للفطر hemibiotrophic oryzae oryzae من خلال تنظيم إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية و phytoalexins.تم العثور على عملية مشابهة جدًا لعدوى الأوراق بين M. oryzae و C. lupini ، على خلفية تنظيم كبير لمتناظرات ACO في خط 83A: 476 الذي تم الإبلاغ عنه في هذه الدراسة ، مما يغير إمكانية منح مقاومة لـ NLL anthracnose Ethylene خطوة مركزية للإشارة في المسارات الجزيئية.
في هذه الدراسة ، لوحظ قمع واسع النطاق للعديد من الجينات المرتبطة بالتمثيل الضوئي عند 6 نقاط في البوصة في 83A: 476 وعند 48 نقطة في البوصة في Mandeloop و 22660 من السكان.مدى وتقدم هذه التغييرات يتناسب مع المستوى.لوحظت مقاومة الأنثراكنوز في هذه التجربة.في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن قمع قوي ومبكر للنصوص المتعلقة بالتمثيل الضوئي في العديد من نماذج تفاعلات مسببات الأمراض النباتية ، بما في ذلك البكتيريا المسببة للأمراض والفطريات.يمكن أن يؤدي التعجيل (من 2 HPI في بعض التفاعلات) والقمع العالمي للجينات المرتبطة بالتمثيل الضوئي استجابةً للعدوى إلى تحفيز مناعة النبات بناءً على نشر أنواع الأكسجين التفاعلية وتفاعلها مع مسار حمض الساليسيليك للتوسط في تفاعلات الحساسية 90،94.
في الختام ، تشتمل آليات الاستجابة الدفاعية المقترحة للسلالة الأكثر مقاومة (83A: 476) على التعرف السريع على العوامل الممرضة بواسطة جين R (يُفترض أن TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) وإشارات حمض الساليسيليك والإيثيلين بوساطة الاستجابة التحسسية ، تليها إنشاء SAR بعيد المدى.يتم دعم الإجراء بواسطة بروتين DIR-1.وتجدر الإشارة إلى أن فترة التغذية الحيوية لعدوى C. lupini قصيرة جدًا (حوالي يومين) ، يليها نمو نخر 95.قد يرتبط الانتقال بين هذه المراحل بالنخر والتعبير عن البروتينات المحفزة للإيثيلين التي تعمل كمحفزات لتفاعلات فرط الحساسية في النباتات المضيفة.لذلك ، فإن النافذة الزمنية للالتقاط الناجح لـ C. lupini في مرحلة التغذية الحيوية تكون ضيقة جدًا.إن إعادة برمجة الجينات المرتبطة بالأكسدة والاختزال التي لوحظت في 83A: 476 عند 6 نقاط في البوصة تتوافق مع تطور الخيوط الفطرية وتبشر بتطوير استجابة وقائية ناجحة في مرحلة التغذية الحيوية.قد تتأخر ردود نصية Mandelup و 22660 كثيرًا لالتقاط الفطر قبل التحول إلى النمو النخر ، ومع ذلك ، قد يكون Mandelup أكثر فاعلية من مجتمع 22660 لأن التنظيم السريع نسبيًا لبروتين PR-10 يعزز المقاومة الأفقية.
يبدو أن ETI ، مدفوعًا بجين R المتعارف عليه ، آلية شائعة لمقاومة الفاصوليا لأنثراكنوز.وهكذا ، في نموذج البقوليات Medicago truncatula ، يتم منح مقاومة أنثراكنوز من قبل جين RCT1 ، وهو عضو في فئة الجين R للنبات TIR-NBS-LRR97.يمنح هذا الجين أيضًا مقاومة واسعة النطاق لأنثراكنوز في البرسيم عند نقله إلى نباتات حساسة.في الفول الشائع (P. vulgaris) ، تم تحديد أكثر من عشرين جينًا مقاومًا للأنثراكنوز حتى الآن.تم العثور على بعض هذه الجينات في المناطق التي تفتقر إلى أي جينات R المتعارف عليها ، ولكن العديد من الجينات الأخرى تقع عند حواف الكروموسومات التي تحمل مجموعة الجينات NBS-LRR ، بما في ذلك TIR-NBS-LRRs99.أكدت دراسة SSR على مستوى الجينوم أيضًا ارتباط جين NBS-LRR بمقاومة الأنثراكنوز في الفول الشائع.تم العثور على الجين R الكنسي أيضًا في المنطقة الجينومية التي تحمل موقع مقاومة الأنثراكنوز الرئيسي في الترمس الأبيض 101.
يوضح عملنا أن تفاعل المقاومة الفوري ، الذي يتم تنشيطه في مرحلة مبكرة من عدوى النبات (يفضل في موعد لا يتجاوز 12 نقطة في البوصة) ، يحمي الترمس الضيق الأوراق بشكل فعال من أنثراكنوز الناجم عن الفطريات المسببة للأمراض Collelotrichum lupini.باستخدام تسلسل الإنتاجية العالية ، أظهرنا ملامح تعبير تفاضلي لجينات مقاومة أنثراكنوز في نباتات NLL بوساطة جينات مقاومة Lanr1 و AnMan.يتضمن الدفاع الناجح تصميمًا دقيقًا للجينات للبروتينات المشاركة في الأكسدة والاختزال ، والتركيب الضوئي ، والتسبب في المرض في غضون ساعات من أول اتصال للنبات مع العامل الممرض.ردود الفعل الوقائية المماثلة ، ولكن متأخرة في الوقت المناسب ، تكون أقل فعالية في حماية النباتات من الأمراض.تشبه مقاومة الجمرة الخبيثة التي يتوسطها جين Lanr1 الاستجابة السريعة النموذجية للجين R (المناعة التي يسببها المستجيب) ، بينما يوفر جين AnMan على الأرجح استجابة أفقية (المناعة الناتجة عن نمط جزيئي مرتبط بالميكروبات) ، مما يوفر مستوى معتدلًا من الاستدامة.
تتكون خطوط 215 NLL المستخدمة للكشف عن علامات الأنثراكنوز من 74 صنفًا ، و 60 سطرا تم الحصول عليها عن طريق التهجين أو التكاثر ، و 5 طفرات ، و 76 من البلازما الجرثومية البرية أو الأصلية.جاءت الخطوط من 17 دولة ، معظمها من بولندا (58) وإسبانيا (47) وألمانيا (27) وأستراليا (26) وروسيا (19) وبيلاروسيا (7) وإيطاليا (5) وخطوط أخرى.من 10 دول.تشتمل المجموعة أيضًا على خطوط مقاومة مرجعية: 83A: 476 ، Tanjil ، Wonga التي تحمل أليل Lanr1 ، و Mandelup الذي يحمل أليل AnMan.تم الحصول على الخطوط من قاعدة بيانات الموارد الوراثية الأوروبية لترمس تحتفظ بها Poznań Plant Breeding Ltd. ، Wiatrowo ، بولندا (الجدول التكميلي S1).
نمت النباتات تحت ظروف خاضعة للرقابة (فترة ضوئية 16 ساعة ، درجة حرارة 25 درجة مئوية خلال النهار و 18 درجة مئوية في الليل).تم تحليل مكررين بيولوجيين.تم عزل الحمض النووي من أوراق عمرها ثلاثة أسابيع باستخدام مجموعة DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen ، Hilden ، ألمانيا) وفقًا للبروتوكول.تم تقييم جودة وتركيز الحمض النووي المعزول بواسطة طرق القياس الطيفي (NanoDrop 2000 ؛ Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية).تم تحليل علامة AnManM1 التي تميز جين مقاومة الأنثراكنوز AnMan (المشتق من السيرة الذاتية Mandelup) والعلامات Anseq3 و Anseq4 التي تحيط بالجين Lanr1 (المشتق من السيرة الذاتية Tanjil) 11،26،28.تم تسجيل متجانسات الزيجوت للأليل المقاوم على أنها "1" ، حساسة - كـ "0" ، ومتغايرة الزيجوت - 0.5.
بناءً على نتائج الفرز للعلامات AnManM1 و AnSeq3 و AnSeq4 وتوافر البذور لتجارب المتابعة النهائية ، تم اختيار 50 خطًا من خطوط NLL للنمط الظاهري لمقاومة الأنثراكنوز.تم إجراء التحليل من نسختين في دفيئة يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر مع فترة ضوئية مدتها 14 ساعة مع نطاق درجة حرارة 22 درجة مئوية خلال النهار و 19 درجة مئوية في الليل.يتم خدش البذور (قطع طبقة البذرة على الجانب المقابل للجنين بشفرة حادة) قبل البذر لمنع سبات البذور بسبب صلابة طبقة البذرة ولضمان الإنبات المنتظم.نمت النباتات في أواني (11 × 11 × 21 سم) بتربة معقمة (TS-1 REC 085 Medium Basic ، Klasmann-Deilmann Polska ، وارسو ، بولندا).تم إجراء التلقيح بسلالة Colletotrichum lupini Col-08 ، التي نمت في عام 1999 من سيقان نباتات الترمس ضيقة الأوراق المزروعة في حقل في Verzhenitsa ، بولندا الكبرى (52 ° 27 ′ 42 شمال 17 ° 04 ′ 05 شرقًا).احصل على منطقة.زرعت العزلات في وسط SNA عند 20 درجة مئوية تحت ضوء أسود لمدة 21 يومًا للحث على التبويض.بعد أربعة أسابيع من البذر ، عندما وصلت النباتات إلى مرحلة 4-6 أوراق ، تم التلقيح بالرش بمعلق من الكونيديا بتركيز 0.5 × 106 كونيديا لكل مل.بعد التلقيح ، بقيت النباتات في الظلام لمدة 24 ساعة عند رطوبة حوالي 98٪ ودرجة حرارة 25 درجة مئوية لتسهيل إنبات الكونيديا وعملية العدوى.ثم نمت النباتات في فترة ضوئية مدتها 14 ساعة عند 22 درجة مئوية نهارًا / 19 درجة مئوية ليلا و 70٪ رطوبة.تم إجراء نتيجة المرض بعد 22 يومًا من التلقيح وتراوحت من 0 (مناعي) إلى 9 (حساس جدًا) اعتمادًا على وجود أو عدم وجود آفات نخرية على السيقان والأوراق.بالإضافة إلى ذلك ، بعد التسجيل ، تم قياس وزن النباتات.تم حساب العلاقات بين الأنماط الجينية للعلامة والأنماط الظاهرية للمرض على أنها ارتباطات نقطية ثنائية التسلسل (عدم وجود علامات متغايرة الزيجوت في مجموعة الخطوط لتحليل النمط الظاهري لمقاومة الأنثراكنوز).