شكرًا لزيارتكم موقع Nature.com. إصدار المتصفح الذي تستخدمونه يدعم CSS بشكل محدود. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح مُحدّث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). في هذه الأثناء، ولضمان استمرار الدعم، سنُقدّم الموقع بدون أنماط أو JavaScript.
هناك حاجة إلى نظام موثوق به في المختبر يمكنه إعادة إنتاج البيئة الفسيولوجية للقلب بدقة لاختبار الأدوية. أدى التوفر المحدود لأنظمة زراعة أنسجة القلب البشرية إلى تفسيرات غير دقيقة لتأثيرات الأدوية القلبية. هنا، قمنا بتطوير نموذج زراعة أنسجة القلب (CTCM) الذي يحفز شرائح القلب كهروميكانيكيًا ويخضع للتمدد الفسيولوجي خلال المرحلتين الانقباضية والانبساطية للدورة القلبية. بعد 12 يومًا من الزراعة، أدى هذا النهج إلى تحسين قابلية أقسام القلب للحياة جزئيًا، ولكنه لم يحافظ تمامًا على سلامتها الهيكلية. لذلك، بعد فحص الجزيئات الصغيرة، وجدنا أن إضافة 100 نانومول من ثلاثي يودوثيرونين (T3) و 1 ميكرومول من ديكساميثازون (Dex) إلى وسطنا حافظ على البنية الدقيقة للمقاطع لمدة 12 يومًا. بالاقتران مع علاج T3/Dex، حافظ نظام CTCM على ملفات النسخ وقابلية الحياة والنشاط الأيضي والسلامة الهيكلية بنفس مستوى أنسجة القلب الطازجة لمدة 12 يومًا. بالإضافة إلى ذلك، يُحفّز التمدد المفرط لأنسجة القلب في المزرعة إشارات قلبية تضخمية، مما يُثبت قدرة CTCM على محاكاة حالات التضخم الناتجة عن تمدد القلب. ختامًا، يُمكن لـ CTCM نمذجة وظائف القلب ومرضه في المزرعة لفترات طويلة، مما يُتيح فحصًا دقيقًا للأدوية.
قبل إجراء البحوث السريرية، يلزم وجود أنظمة مختبرية موثوقة قادرة على محاكاة البيئة الفسيولوجية لقلب الإنسان بدقة. ينبغي أن تحاكي هذه الأنظمة التغيرات في التمدد الميكانيكي ومعدل ضربات القلب والخصائص الكهربية الفيزيولوجية. تُستخدم النماذج الحيوانية عادةً كمنصة فحص لوظائف القلب، مع موثوقية محدودة في عكس تأثيرات الأدوية على قلب الإنسان1،2. في نهاية المطاف، يُعد النموذج التجريبي المثالي لزراعة أنسجة القلب (CTCM) نموذجًا عالي الحساسية والدقة لمختلف التدخلات العلاجية والدوائية، حيث يُحاكي بدقة وظائف القلب والفيزيولوجيا المرضية له3. يحد غياب مثل هذا النظام من اكتشاف علاجات جديدة لقصور القلب4،5، وقد أدى إلى اعتبار سمية الدواء القلبية سببًا رئيسيًا لخروجه من السوق6.
على مدار العقد الماضي، سُحبت ثمانية أدوية غير قلبية وعائية من الاستخدام السريري لأنها تُسبب إطالة فترة QT، مما يؤدي إلى عدم انتظام ضربات القلب البطيني والموت المفاجئ7. وبالتالي، هناك حاجة متزايدة لاستراتيجيات فحص ما قبل سريرية موثوقة لتقييم فعالية وسمية القلب والأوعية الدموية. يُقدم الاستخدام الحديث لخلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية (hiPS-CM) في فحص الأدوية واختبار السمية حلاً جزئيًا لهذه المشكلة. ومع ذلك، فإن الطبيعة غير الناضجة لخلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية (hiPS-CM) ونقص التعقيد متعدد الخلايا لأنسجة القلب يُمثلان قيودًا رئيسية لهذه الطريقة. أظهرت الدراسات الحديثة أنه يمكن التغلب على هذا القيد جزئيًا باستخدام خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية (hiPS-CM) في وقت مبكر لتكوين هلاميات مائية لأنسجة القلب بعد وقت قصير من بدء الانقباضات التلقائية وزيادة التحفيز الكهربائي تدريجيًا بمرور الوقت. ومع ذلك، تفتقر أنسجة عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية (hiPS-CM) الدقيقة هذه إلى الخصائص الكهربية الفيزيولوجية الناضجة والانقباضية لعضلة القلب البالغة. بالإضافة إلى ذلك، يتميز نسيج القلب البشري ببنية أكثر تعقيدًا، إذ يتكون من خليط غير متجانس من أنواع مختلفة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا البطانية والعصبونات والأرومات الليفية السدوية، مترابطة بمجموعات محددة من بروتينات المصفوفة خارج الخلية. يُشكل هذا التباين في التجمعات غير العضلية القلبية (11،12،13) في قلب الثدييات البالغة عائقًا رئيسيًا أمام نمذجة نسيج القلب باستخدام أنواع الخلايا الفردية. تُؤكد هذه القيود الرئيسية على أهمية تطوير أساليب لزراعة نسيج عضلة القلب السليم في ظل ظروف فسيولوجية ومرضية.
لقد أثبتت المقاطع الرقيقة المزروعة (300 ميكرومتر) من قلب الإنسان أنها نموذج واعد لعضلة القلب البشرية السليمة. توفر هذه الطريقة الوصول إلى نظام متعدد الخلايا ثلاثي الأبعاد كامل يشبه أنسجة القلب البشرية. ومع ذلك، حتى عام 2019، كان استخدام مقاطع القلب المزروعة محدودًا بسبب بقاء المزرعة لمدة قصيرة (24 ساعة). ويرجع ذلك إلى عدد من العوامل بما في ذلك نقص التمدد الفيزيائي الميكانيكي، وواجهة الهواء والسائل، واستخدام وسائط بسيطة لا تدعم احتياجات أنسجة القلب. في عام 2019، أظهرت العديد من مجموعات البحث أن دمج العوامل الميكانيكية في أنظمة زراعة أنسجة القلب يمكن أن يطيل عمر المزرعة، ويحسن التعبير القلبي، ويحاكي أمراض القلب. تظهر دراستان أنيقتان 17 و 18 أن التحميل الميكانيكي أحادي المحور له تأثير إيجابي على النمط الظاهري للقلب أثناء المزرعة. ومع ذلك، لم تستخدم هذه الدراسات التحميل الفيزيائي الميكانيكي الديناميكي ثلاثي الأبعاد لدورة القلب، حيث تم تحميل مقاطع القلب إما بقوى شد متساوية القياس 17 أو تحميل أوكسوتوني خطي 18. أدت طرق تمدد الأنسجة هذه إلى تثبيط العديد من الجينات القلبية أو الإفراط في التعبير عن الجينات المرتبطة باستجابات التمدد غير الطبيعية. والجدير بالذكر أن بيتوليس وآخرون 19 طوروا حمام ثقافة شريحة القلب الديناميكي لإعادة بناء دورة القلب باستخدام ردود الفعل لمحول القوة ومحركات التوتر. وعلى الرغم من أن هذا النظام يسمح بنمذجة دورة القلب في المختبر بدقة أكبر، إلا أن تعقيد الطريقة وانخفاض إنتاجيتها يحد من تطبيق هذا النظام. وقد طور مختبرنا مؤخرًا نظام ثقافة مبسط باستخدام التحفيز الكهربائي ووسط محسن للحفاظ على قابلية مقاطع أنسجة القلب الخنزيرية والبشرية للبقاء لمدة تصل إلى 6 أيام20،21.
في هذه المخطوطة، نصف نموذج زراعة أنسجة القلب (CTCM) باستخدام مقاطع من قلب الخنزير، تتضمن إشارات خلطية لتلخيص فسيولوجيا القلب ثلاثية الأبعاد والتمدد الفيزيولوجي المرضي خلال الدورة القلبية. يمكن لهذا النموذج زيادة دقة التنبؤ بالأدوية قبل السريرية إلى مستوى لم يسبق له مثيل، وذلك بتوفير نظام قلبي فعال من حيث التكلفة ومتوسط ​​الإنتاجية، يحاكي فسيولوجيا/فيزيولوجيا مرض قلب الثدييات لاختبار الأدوية قبل السريرية.
تلعب الإشارات الميكانيكية الديناميكية الدموية دورًا حاسمًا في الحفاظ على وظيفة عضلة القلب في المختبر 22،23،24. في هذه المخطوطة، قمنا بتطوير CTCM (الشكل 1أ) يمكنه محاكاة بيئة القلب لدى البالغين عن طريق إحداث تحفيز كهربائي وميكانيكي بترددات فسيولوجية (1.2 هرتز، 72 نبضة في الدقيقة). لتجنب تمدد الأنسجة المفرط أثناء الانبساط، استُخدم جهاز طباعة ثلاثية الأبعاد لزيادة حجم الأنسجة بنسبة 25% (الشكل 1ب). تم توقيت التحفيز الكهربائي المُستحث بواسطة نظام C-PACE ليبدأ قبل 100 مللي ثانية من الانقباض باستخدام نظام اكتساب بيانات لإعادة إنتاج الدورة القلبية بالكامل. يستخدم نظام زراعة الأنسجة مشغلًا هوائيًا قابلًا للبرمجة (LB Engineering، ألمانيا) لتوسيع غشاء سيليكون مرن دوريًا لإحداث تمدد في شرائح القلب في الحجرة العلوية. تم توصيل النظام بخط هواء خارجي من خلال محول ضغط، مما جعل من الممكن ضبط الضغط (± 1 مم زئبق) والوقت (± 1 مللي ثانية) بدقة (الشكل 1ج).
أ- ثبت مقطع الأنسجة بحلقة الدعم بقطر 7 مم، الموضحة باللون الأزرق، داخل حجرة زراعة الجهاز. تُفصل حجرة الزراعة عن حجرة الهواء بغشاء سيليكوني رقيق ومرن. ضع حشية بين كل حجرة لمنع التسرب. يحتوي غطاء الجهاز على أقطاب جرافيتية تُوفر تحفيزًا كهربائيًا. ب- رسم تخطيطي لجهاز الأنسجة الكبير وحلقة التوجيه وحلقة الدعم. توضع مقاطع الأنسجة (البنية) على الجهاز كبير الحجم مع وضع حلقة التوجيه في الأخدود الموجود على الحافة الخارجية للجهاز. باستخدام الدليل، ضع حلقة الدعم المطلية بمادة لاصقة أكريليكية للأنسجة بعناية فوق مقطع أنسجة القلب. ج- رسم بياني يوضح زمن التحفيز الكهربائي كدالة لضغط حجرة الهواء الذي يتم التحكم فيه بواسطة مشغل هوائي قابل للبرمجة (PPD). استُخدم جهاز اكتساب بيانات لمزامنة التحفيز الكهربائي باستخدام مستشعرات الضغط. عندما يصل الضغط في حجرة الزراعة إلى الحد الأقصى المحدد، تُرسل إشارة نبضية إلى جهاز C-PACE-EM لتحفيز التحفيز الكهربائي. د- صورة لأربعة أجهزة CTCM موضوعة على رف حاضنة. أربعة أجهزة متصلة بجهاز PPD واحد عبر دائرة هوائية، وتُدخل مستشعرات ضغط في الصمام المُرقئ لمراقبة الضغط في الدائرة الهوائية. يحتوي كل جهاز على ستة أقسام نسيجية.
باستخدام مشغل هوائي واحد، تمكنا من التحكم في 4 أجهزة CTCM، يمكن لكل منها استيعاب 6 مقاطع نسيجية (الشكل 1د). في CTCM، يتحول ضغط الهواء في حجرة الهواء إلى ضغط متزامن في حجرة السائل ويحفز التمدد الفسيولوجي لشريحة القلب (الشكل 2أ والفيلم التكميلي 1). تقييم تمدد الأنسجة عند 80 مم زئبق. أظهرت المادة تمدد مقاطع الأنسجة بنسبة 25٪ (الشكل 2ب). وقد تبين أن هذه النسبة المئوية للتمدد تتوافق مع طول الساركومير الفسيولوجي البالغ 2.2-2.3 ميكرومتر لانقباض مقطع القلب الطبيعي17،19،25. تم تقييم حركة الأنسجة باستخدام إعدادات كاميرا مخصصة (الشكل التكميلي 1). تتوافق سعة وسرعة حركة الأنسجة (الشكل 2ج، د) مع التمدد أثناء الدورة القلبية والوقت أثناء الانقباض والانبساط (الشكل 2ب). ظل تمدد وسرعة أنسجة القلب أثناء الانقباض والاسترخاء ثابتين لمدة 12 يومًا في المزرعة (الشكل 2و). لتقييم تأثير التحفيز الكهربائي على الانقباض أثناء المزرعة، طورنا طريقة لتحديد التشوه النشط باستخدام خوارزمية التظليل (الشكل التكميلي 2أ، ب)، وتمكنا من التمييز بين التشوهات مع وبدون تحفيز كهربائي. نفس المقطع من القلب (الشكل 2و). في المنطقة المتحركة من القطع (R6-9)، كان الجهد أثناء التحفيز الكهربائي أعلى بنسبة 20% منه في حالة عدم التحفيز الكهربائي، مما يشير إلى مساهمة التحفيز الكهربائي في وظيفة الانقباض.
تؤكد الآثار التمثيلية لضغط حجرة الهواء وضغط حجرة السائل وقياسات حركة الأنسجة أن ضغط الحجرة يغير ضغط حجرة السائل، مما يتسبب في حركة مقابلة لشريحة الأنسجة. ب آثار تمثيلية لنسبة التمدد (الأزرق) لمقاطع الأنسجة المقابلة لنسبة التمدد (البرتقالي). ج الحركة المقاسة لشريحة القلب تتوافق مع سرعة الحركة المقاسة. (د) مسارات تمثيلية للحركة الدورية (الخط الأزرق) والسرعة (الخط المنقط البرتقالي) في شريحة القلب. هـ تحديد كمية زمن الدورة (ن = 19 شريحة لكل مجموعة، من خنازير مختلفة)، وزمن الانقباض (ن = 19 شريحة لكل مجموعة)، وزمن الاسترخاء (ن = 19 شريحة لكل مجموعة، من خنازير مختلفة)، وحركة الأنسجة (ن = 25). شرائح)/مجموعة من خنازير مختلفة)، وسرعة الانقباض القصوى (ن = 24(D0)، 25(D12) شريحة/مجموعة من خنازير مختلفة) ومعدل الاسترخاء الأقصى (ن = 24(D0)، 25(D12) شريحة/مجموعة من خنازير مختلفة). لم يُظهر اختبار t للطلاب ثنائي الذيل أي فرق كبير في أي من المعلمات. f آثار تحليل الإجهاد التمثيلية لمقاطع الأنسجة مع (أحمر) وبدون (أزرق) التحفيز الكهربائي، عشر مناطق إقليمية من مقاطع الأنسجة من نفس المقطع. تُظهر الألواح السفلية تقدير النسبة المئوية لاختلاف الإجهاد في مقاطع الأنسجة مع وبدون التحفيز الكهربائي في عشر مناطق من مقاطع مختلفة. (n = 8 شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار t للطلاب ثنائي الذيل؛ ****p < 0.0001، **p < 0.01، *p < 0.05). (n = 8 شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار t للطلاب ثنائي الذيل؛ ****p < 0.0001، **p < 0.01، *p < 0.05). (n = 8 срезов/гruппу от разных свиней, проводится двусторонний t-клитераий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (ن = 8 أقسام/مجموعة من خنازير مختلفة، اختبار t للطلاب ثنائي الذيل؛ ****p<0.0001، **p<0.01، *p<0.05). (n = 8 片/组، في حالة وجود إجابة على هذا السؤال، t 检验؛ ****p < 0.0001، **p < 0.01، *p < 0.05). (n = 8 片/组، في حالة وجود إجابة على هذا السؤال، t 检验؛ ****p < 0.0001، **p < 0.01، *p < 0.05). (n = 8 срезов/гruппу, от разных свиней, двусторонний кriteryй Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (ن = 8 أقسام/مجموعة، من خنازير مختلفة، اختبار t للطلاب ثنائي الذيل؛ ****p<0.0001، **p<0.01، *p<0.05).تمثل أشرطة الخطأ المتوسط ​​± الانحراف المعياري.
في نظام زراعة شرائح القلب الحيوية الساكنة السابق لدينا [20، 21]، حافظنا على قابلية البقاء والوظيفة والسلامة الهيكلية لشرائح القلب لمدة 6 أيام من خلال تطبيق التحفيز الكهربائي وتحسين تركيبة الوسط. ومع ذلك، بعد 10 أيام، انخفضت هذه الأرقام بشكل حاد. سنشير إلى الأقسام المزروعة في ظروف التحكم في نظام الزراعة الحيوية الساكنة السابق لدينا 20، 21 (Ctrl) وسنستخدم وسطنا المحسن مسبقًا كظروف MC والثقافة تحت التحفيز الميكانيكي والكهربائي المتزامن (CTCM). يسمى . أولاً، حددنا أن التحفيز الميكانيكي بدون تحفيز كهربائي لم يكن كافياً للحفاظ على قابلية بقاء الأنسجة لمدة 6 أيام (الشكل التكميلي 3أ، ب). ومن المثير للاهتمام، مع إدخال التحفيز الفيزيائي والميكانيكي والكهربائي باستخدام STCM، ظلت قابلية بقاء أقسام القلب لمدة 12 يومًا كما هي في أقسام القلب الطازجة تحت ظروف MS، ولكن ليس تحت ظروف Ctrl، كما هو موضح من خلال تحليل MTT (الشكل 1). 3أ). يشير هذا إلى أن التحفيز الميكانيكي ومحاكاة الدورة القلبية يمكن أن يحافظ على أقسام الأنسجة قابلة للحياة لمدة أطول بمرتين مما ورد في نظامنا السابق للزراعة الثابتة. ومع ذلك، أظهر تقييم السلامة الهيكلية لمقاطع الأنسجة عن طريق الوسم المناعي لتروبونين القلب T وكونيكسين 43 أن التعبير عن كونيكسين 43 كان أعلى بكثير في أنسجة الخلايا القلبية النخاعية في اليوم 12 منه في الضوابط في نفس اليوم. ومع ذلك، لم يتم الحفاظ على التعبير المنتظم لكونيكسين 43 وتكوين القرص Z بشكل كامل (الشكل 3ب). نستخدم إطار عمل الذكاء الاصطناعي (AI) لقياس السلامة الهيكلية للأنسجة26، وخط أنابيب التعلم العميق القائم على الصور يعتمد على تلطيخ تروبونين-T وكونيكسين43 لقياس السلامة الهيكلية والفلورية لشرائح القلب تلقائيًا من حيث قوة التوطين. تستخدم هذه الطريقة شبكة عصبية تلافيفية (CNN) وإطار عمل التعلم العميق لقياس السلامة الهيكلية لأنسجة القلب بشكل موثوق بطريقة آلية وغير متحيزة، كما هو موضح في المرجع. ٢٦. أظهرت أنسجة MC تشابهًا هيكليًا أفضل في اليوم ٠ مقارنةً بمقاطع التحكم الثابتة. بالإضافة إلى ذلك، كشف تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان عن نسبة أقل بكثير من التليف في ظل ظروف MS مقارنةً بظروف التحكم في اليوم الثاني عشر من الزراعة (الشكل ٣ج). في حين أن CTCM زاد من قابلية مقاطع أنسجة القلب للبقاء في اليوم الثاني عشر إلى مستوى مماثل لمستوى أنسجة القلب الطازجة، إلا أنه لم يُحسّن بشكل ملحوظ من السلامة الهيكلية لمقاطع القلب.
يوضح الرسم البياني الشريطي كمية قابلية MTT للبقاء لشرائح القلب الطازجة (D0) أو ثقافة شرائح القلب لمدة 12 يومًا إما في الثقافة الثابتة (D12 Ctrl) أو في CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl)، 12 (D12 MC) شريحة/مجموعة من خنازير مختلفة، يتم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ####p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و**p < 0.01 مقارنة بـ D12 Ctrl). يوضح الرسم البياني الشريطي كمية قابلية MTT للبقاء لشرائح القلب الطازجة (D0) أو ثقافة شرائح القلب لمدة 12 يومًا إما في الثقافة الثابتة (D12 Ctrl) أو في CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl)، 12 (D12 MC) شريحة/مجموعة من خنازير مختلفة، يتم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ####p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و**p < 0.01 مقارنة بـ D12 Ctrl).يوضح الرسم البياني التوزيعي كمية قابلية البقاء لمقاطع القلب الطازجة MTT (D0) أو ثقافة مقاطع القلب لمدة 12 يومًا في الثقافة الثابتة (مجموعة التحكم D12) أو CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (مجموعة التحكم D12). ) ، 12 (D12 MC) مقطعًا/مجموعة من خنازير مختلفة، يتم إجراء اختبار تحليل التباين أحادي الاتجاه؛####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و**p < 0.01 مقارنة بـ D12 (Ctrl). أ مفتاح التحكم (D12 Ctrl) أو CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) تم اختباره على أساس 12 لونًا من MTT، و12 لونًا (D12 MC) من ANOVA测试؛ 与D0 相比، ####p < 0.0001، إلى D12 Ctrl 相比، **p <0.01) . أ مفتاح التحكم (D12 Ctrl) أو CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ، قم باستبدال رقم 12 (D12 MC) باستخدام / 组، قم باستبدال ANOVA ；与D0 相比، ####p < 0.0001، 与D12 Ctrl 相比، **p.)رسم بياني يوضح كمية قابلية MTT للبقاء في أقسام القلب الطازجة (D0) أو أقسام القلب المزروعة لمدة 12 يومًا في مزرعة ثابتة (مجموعة التحكم D12) أو CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (D12 control))، 12 (D12 MC) قسمًا/مجموعة من خنازير مختلفة، اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 مقارنة بـ D0، **p < 0.01 مقارنة بـ D12 (Ctrl).ب- تروبونين-تي (أخضر)، كونيكسين 43 (أحمر)، وDAPI (أزرق) في أقسام القلب المعزولة حديثًا (D0) أو أقسام القلب المزروعة في ظل ظروف ثابتة (Ctrl) أو ظروف CTCM (MC) لمدة 12 يومًا) من صور المناعة الفلورية التمثيلية (مقياس فارغ = 100 ميكرومتر). تحديد كمية الذكاء الاصطناعي لسلامة بنية أنسجة القلب (ن = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) شرائح/مجموعة لكل منها من خنزير مختلف، يتم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ####p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و****p < 0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl). تحديد كمية الذكاء الاصطناعي لسلامة بنية أنسجة القلب (ن = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) شرائح/مجموعة لكل منها من خنازير مختلفة، يتم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ####p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و****p < 0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl). تتميز البنية الهيكلية الشاملة بذكاء متقن (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) من مسافة/مجموعة اختلافات مختلفة، اختبار خاص ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению مع D12 Ctrl). تحديد كمية السلامة البنيوية لأنسجة القلب باستخدام الذكاء الاصطناعي (ن = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) أقسام/مجموعات من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ####p < 0.0001 مقابل D0 و****p < 0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性(n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) شرائح/مجموعة لكل من الخنازير المختلفة، اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛####p <0.0001 与D0相比،****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比).人工智能量化心脏组织结构完整性(n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) شرائح/مجموعة لكل من الخنازير المختلفة، اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛####p <0.0001与D0相比، ****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比). الذكاء المتقن لتجميع النقاط الهيكلية ذات الصلة المتبادلة (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) المجموعة/المجموعة كل شيء من مختلف الألوان، اختبار متماثل ANOVA ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12; كنترول). الذكاء الاصطناعي لقياس سلامة بنية أنسجة القلب (ن = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) أقسام/مجموعة لكل خنزير مختلف، اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ####p<0.0001 مقابل .D0 للمقارنة ****p <0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl). ج- صور تمثيلية (يسار) وتقدير كمي (يمين) لشرائح القلب الملطخة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (المقياس العاري = 500 ميكرومتر) (ن = 10 شرائح/مجموعة من كل خنزير مختلف، تم إجراء اختبار تحليل التباين أحادي الاتجاه؛ ####p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و***p < 0.001 مقارنة بـ D12 Ctrl). ج- صور تمثيلية (يسار) وتقدير كمي (يمين) لشرائح القلب الملطخة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (المقياس العاري = 500 ميكرومتر) (ن = 10 شرائح/مجموعة من كل خنزير مختلف، تم إجراء اختبار تحليل التباين أحادي الاتجاه؛ #### p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و***p < 0.001 مقارنة بـ D12 Ctrl). c التصوير التمثيلي (الشرفة) والنقاط المجمعة (الحقيقية) على الجانب الآخر من ماسونا الثلاثي الأبعاد المزخرف (الماسون) بدون تغطية = 500 متر) (العدد = 10 مجموعات/مجموعة من خيول مختلفة، يتم استخدام مفردة اختبار أنوفا. #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). ج- صور تمثيلية (يسار) وتقدير كمي (يمين) لمقاطع القلب الملطخة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (مقياس غير مطلي = 500 ميكرومتر) (ن = 10 مقاطع/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار تحليل التباين أحادي الاتجاه؛ #### p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و***p < 0.001 مقارنة بـ D12 Ctrl). ج ماسون ماسون لديه القدرة على تحديد حجم الصفائح المعدنية (左) و 和量化 (右) (الحجم = 500 ميكرومتر) (ن = 10)个切片/组، 组来自不同的猪، 进行单向ANOVA 测试；#### p <0.0001 与D0 相比،***p <0.001 与D12 Ctrl 相比). C 用 ماسون 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 (左 左) 量化 (右) 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度= 500 ميكرومتر) (ن = 10 ميكرومترات في المتر المربع في المتر المربع في المتر المربع في أنوفا 测试；#### p <0.0001 في D0 相比،***p <0.001 与D12 Ctrl 相比). ج التصوير التمثيلي (العلوي) والتحليل الجماعي (الصحيح) على طول الجزء العلوي من ثلاثية ماسونا (الشفاف) نطاق = 500 متر) (ن = 10 مجموعات/مجموعات، من سفن أخرى، متظاهرة مع تعزيز однофактолного диспронного анлиза ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). ج- صور تمثيلية (يسار) وتقدير كمي (يمين) لمقاطع القلب الملطخة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (فارغ = 500 ميكرومتر) (ن = 10 مقاطع/مجموعة، كل منها من خنزير مختلف، تم اختبارها بواسطة تحليل التباين أحادي الاتجاه؛ ### # p < 0.0001 مقارنة بـ D0، ***p < 0.001 مقارنة بـ D12 Ctrl).تمثل أشرطة الخطأ المتوسط ​​± الانحراف المعياري.
افترضنا أنه بإضافة جزيئات صغيرة إلى وسط الزراعة، يُمكن تحسين سلامة خلايا عضلة القلب وتقليل تطور التليف أثناء زراعة CTCM. لذلك، فحصنا الجزيئات الصغيرة باستخدام مزارع التحكم الثابتة لدينا20،21 نظرًا لقلة عوامل التداخل. تم اختيار ديكساميثازون (Dex)، وثلاثي يودوثيرونين (T3)، وSB431542 (SB) لهذا الفحص. استُخدمت هذه الجزيئات الصغيرة سابقًا في مزارع hiPSC-CM لتحفيز نضوج خلايا عضلة القلب عن طريق زيادة طول الساركومير، والأنابيب المستعرضة، وسرعة التوصيل. بالإضافة إلى ذلك، من المعروف أن كلاً من Dex (جلوكوكورتيكويد) وSB يُثبطان الالتهاب29،30. لذلك، اختبرنا ما إذا كان إدراج واحد أو مزيج من هذه الجزيئات الصغيرة سيُحسّن السلامة الهيكلية لأقسام القلب. للفحص الأولي، تم اختيار جرعة كل مركب بناءً على التركيزات الشائعة الاستخدام في نماذج زراعة الخلايا (1 ميكرومولار من Dex27، و100 نانومولار من T327، و2.5 ميكرومولار من SB31). بعد 12 يومًا من الزراعة، أدى الجمع بين T3 وDex إلى سلامة هيكلية مثالية لخلايا عضلة القلب، مع الحد الأدنى من إعادة تشكيل الألياف (الشكلان التكميليان 4 و5). بالإضافة إلى ذلك، أدى استخدام تركيزات مضاعفة أو مضاعفة من T3 وDex إلى آثار ضارة مقارنةً بالتركيزات الطبيعية (الشكل التكميلي 6أ، ب).
بعد الفحص الأولي، أجرينا مقارنة مباشرة لأربعة ظروف زراعة (الشكل 4أ): Ctrl: مقاطع قلب مزروعة في ثقافتنا الثابتة الموصوفة سابقًا باستخدام وسطنا المُحسَّن؛ 20.21 TD: T3 وCtrl s Added Dex يوم الأربعاء؛ MC: مقاطع قلب مزروعة في CTCM باستخدام وسطنا المُحسَّن سابقًا؛ وMT: CTCM مع إضافة T3 وDex إلى الوسط. بعد 12 يومًا من الزراعة، ظلت قابلية أنسجة MS وMT للحياة كما هي في الأنسجة الطازجة التي تم تقييمها بواسطة اختبار MTT (الشكل 4ب). ومن المثير للاهتمام أن إضافة T3 وDex إلى مزارع transwell (TD) لم تسفر عن تحسن كبير في قابلية الحياة مقارنةً بظروف Ctrl، مما يشير إلى الدور المهم للتحفيز الميكانيكي في الحفاظ على قابلية حياة مقاطع القلب للحياة.
رسم تخطيطي للتصميم التجريبي يصور الظروف الثقافية الأربعة المستخدمة لتقييم تأثيرات التحفيز الميكانيكي ومكملات T3/Dex على الوسط لمدة 12 يومًا. ب- يوضح الرسم البياني الشريطي كمية قابلية البقاء بعد 12 يومًا من الثقافة في جميع ظروف الثقافة الأربعة (Ctrl وTD وMC وMT) مقارنة بشرائح القلب الطازجة (D0) (ن = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl وD12 TD وD12 MT)، 12 (D12 MC) شريحة/مجموعة من خنازير مختلفة، يتم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ####p < 0.0001، ###p < 0.001 مقارنة بـ D0 و**p < 0.01 مقارنة بـ D12 Ctrl). ب- يوضح الرسم البياني الشريطي كمية قابلية البقاء بعد 12 يومًا من الثقافة في جميع ظروف الثقافة الأربعة (Ctrl وTD وMC وMT) مقارنة بشرائح القلب الطازجة (D0) (ن = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl وD12 TD وD12 MT)، 12 (D12 MC) شريحة/مجموعة من خنازير مختلفة، يتم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ####p < 0.0001، ###p < 0.001 مقارنة بـ D0 و**p < 0.01 مقارنة بـ D12 ctrl). ب يُظهر السجل القيمة الجماعية للثروة خلال 12 يومًا من الثقافة في جميع الخدمات الأربع الزراعة (التحكم، TD، MC وMT) من خلال سلاسل من الخيوط (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD وD12 MT)، 12 (D12 MC) مجموعة/مجموعة من خيوط مختلفة، توفر اختبار التباين ANOVA؛ ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ب- يوضح الرسم البياني الشريطي كمية قابلية البقاء على قيد الحياة بعد 12 يومًا من الثقافة في جميع ظروف الثقافة الأربعة (المجموعة الضابطة، المجموعة TD، المجموعة MC، والمجموعات MT) مقارنة بأقسام القلب الطازجة (D0) (ن = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD، وD12 MT)، 12 (D12 MC) قسمًا/مجموعة من خنازير مختلفة، اختبار تحليل التباين أحادي الاتجاه؛ ####p < 0.0001، ###p < 0.001 مقابل D0 و**p < 0.01 بالمقارنة مع D12 Ctrl). b قم باختيار 4 种培养条件(Ctrl، TD، MC وMT) من أجل تحديد (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD وD12 MT)، تحليل 12 (D12 MC) 切片/组، 进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001،###p < 0.001 与D0 相比،**p < 0.01 与D12 控制).ب 4 12 (د12 MC) ب السجل، يسلط الضوء على جميع 4 أنواع من الزراعة (التحكم، TD، MC وMT) من خلال سلاسل التوريد العالمية (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD وD12 MT)، من مختلف الألوان 12 (D12 MC) مجموعات/مجموعة، اختبار عادي ANOVA ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с control D12). ب- رسم بياني يوضح جميع ظروف الثقافة الأربعة (المجموعة الضابطة، المجموعة TD، المجموعة MC والمجموعة MT) مقارنة بمقاطع القلب الطازجة (D0) (ن = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD وD12 MT)، من خنازير مختلفة 12 (D12 MC) مقطع/مجموعة، اختبار تحليل التباين أحادي الاتجاه؛ ####p<0.0001، ###p<0.001 مقابل D0، **p<0.01 مقابل المجموعة الضابطة D12). يوضح الرسم البياني الشريطي تقدير كمية تدفق الجلوكوز بعد 12 يومًا من الثقافة في جميع ظروف الثقافة الأربعة (Ctrl وTD وMC وMT) مقارنة بشرائح القلب الطازجة (D0) (n = 6 شرائح / مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ###p < 0.001، مقارنة بـ D0 و***p < 0.001 مقارنة بـ D12 Ctrl). يوضح الرسم البياني الشريطي تقدير كمية تدفق الجلوكوز بعد 12 يومًا من الثقافة في جميع ظروف الثقافة الأربعة (Ctrl وTD وMC وMT) مقارنة بشرائح القلب الطازجة (D0) (n = 6 شرائح / مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ###p < 0.001، مقارنة بـ D0 و***p < 0.001 مقارنة بـ D12 Ctrl). c يُظهر السجل انخفاضًا جماعيًا في نسبة الجلوكوز خلال 12 يومًا بعد الزراعة في جميع الخدمات الأربع تربية (التحكم، TD، MC وMT) من خلال تداخل سلسلة من الخيوط (D0) (ن = 6 مجموعات/مجموعة من مختلف الأنواع) يتم اختبار الخنازير الفردية بواسطة اختبار ANOVA ؛ ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). يوضح الرسم البياني التوزيعي كمية تدفق الجلوكوز بعد 12 يومًا من الزراعة في ظل جميع ظروف الزراعة الأربعة (المجموعة الضابطة، المجموعة TD، المجموعة MC والمجموعة MT) مقارنة بأقسام القلب الطازجة (D0) (ن = 6 أقسام/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار تحليل التباين أحادي الاتجاه؛ ###p < 0.001 مقارنة بـ D0 و***p < 0.001 مقارنة بـ D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件(Ctrl، TD، MC وMT) قم بإلغاء تحديد (D0) 相比، 培养后12 تحليل التباين (n = 6 片/组، 不同猪، 单向执行ANOVA 测试؛ ###p < 0.001، 与D0 相比، ***p < 0.001与D12 Ctrl . C تم تصميمه بواسطة 4 种 条件 （(ctrl , td , mc وmt) تم تصميمه من خلال الصور الملتقطة بواسطة 相比، 培养 后 后12 天 的 通量 定量 (n = 6 片 / 组 , 猪 , , , , , , , 猪单向执ANOVA) 测试؛ ###p < 0.001، 与D0 相比، ***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比). ج السجل الذي يوضح مجموع نقاط الجلوكوز خلال 12 يومًا من الزراعة لجميع 4 أجيال تربية (التحكم، TD، MC وMT) من خلال سلاسل من الخيوط (D0) (ن = 6 مجموعات/مجموعة، من تم اختبار اختبارات ANOVA لخيوط مختلفة ومتميزة؛ ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (التحكم). ج- رسم بياني يوضح كمية تدفق الجلوكوز بعد 12 يومًا من الزراعة لجميع ظروف الزراعة الأربعة (المجموعة الضابطة، المجموعة التجريبية، المجموعة التجريبية، والمجموعات التجريبية) مقارنة بأقسام القلب الطازجة (D0) (ن = 6 أقسام/مجموعة، من خنازير مختلفة، أحادية الجانب). حيث تم إجراء اختبارات تحليل التباين، ###p < 0.001 مقارنة بـ D0، ***p < 0.001 مقارنة بـ D12 (المجموعة الضابطة).د. مخططات تحليل السلالة لأنسجة طازجة (أزرق)، وأنسجة MC في اليوم الثاني عشر (أخضر)، وأنسجة MT في اليوم الثاني عشر (أحمر) عند عشر نقاط مقطعية إقليمية للأنسجة (ن = 4 شرائح/مجموعة، اختبار تحليل التباين أحادي الاتجاه؛ لم يُلاحظ فرق كبير بين المجموعات). هـ. مخطط بركان يُظهر جينات مُعبَّر عنها بشكل مختلف في مقاطع القلب الطازجة (D0) مقارنةً بمقاطع القلب المُزروعة في ظروف ثابتة (Ctrl) أو في ظروف MT (MT) لمدة 10-12 يومًا. و. خريطة حرارية لجينات الساركومير لمقاطع القلب المُزروعة في كلٍّ من ظروف المزرعة. تُمثل أشرطة الخطأ المتوسط ​​± الانحراف المعياري.
يُعدّ الاعتماد الأيضي على التحول من أكسدة الأحماض الدهنية إلى تحلل الجلوكوز سمةً مميزةً لاختلال تمايز خلايا عضلة القلب. تستخدم خلايا عضلة القلب غير الناضجة الجلوكوز بشكل أساسي لإنتاج ATP، ولديها ميتوكوندريا ناقصة التنسج مع عدد قليل من الأعراف5،32. أظهرت تحليلات استخدام الجلوكوز أنه في ظل ظروف MC وMT، كان استخدام الجلوكوز مشابهًا لاستخدامه في أنسجة اليوم 0 (الشكل 4ج). ومع ذلك، أظهرت عينات Ctrl زيادةً ملحوظةً في استخدام الجلوكوز مقارنةً بالأنسجة الطازجة. يشير هذا إلى أن الجمع بين CTCM وT3/Dex يعزز قابلية الأنسجة للحياة ويحافظ على النمط الأيضي لمقاطع القلب المزروعة لمدة 12 يومًا. بالإضافة إلى ذلك، أظهر تحليل الإجهاد أن مستويات الإجهاد ظلت كما هي في أنسجة القلب الطازجة لمدة 12 يومًا في ظل ظروف MT وMS (الشكل 4د).
لتحليل التأثير الكلي لـ CTCM و T3/Dex على المشهد النسخي العالمي لأنسجة شرائح القلب، أجرينا RNAseq على شرائح القلب من جميع ظروف الزراعة الأربعة المختلفة (البيانات التكميلية 1). ومن المثير للاهتمام، أظهرت مقاطع MT تشابهًا نسخيًا كبيرًا مع أنسجة القلب الطازجة، مع 16 جينًا فقط معبرًا عنها تفاضليًا من أصل 13642 جينًا. ومع ذلك، وكما أوضحنا سابقًا، أظهرت شرائح Ctrl 1229 جينًا معبرًا عنها تفاضليًا بعد 10-12 يومًا في المزرعة (الشكل 4هـ). وقد تم تأكيد هذه البيانات بواسطة qRT-PCR لجينات القلب والأرومات الليفية (الشكل التكميلي 7أ-ج). ومن المثير للاهتمام، أظهرت مقاطع Ctrl انخفاضًا في تنظيم جينات القلب ودورة الخلية وتنشيطًا لبرامج الجينات الالتهابية. تشير هذه البيانات إلى أن فقدان التمايز، الذي يحدث عادةً بعد الزراعة طويلة الأمد، يضعف تمامًا في ظل ظروف MT (الشكل التكميلي 8أ، ب). أظهرت دراسة متأنية لجينات الساركومير أنه في ظل ظروف MT فقط، تُحفظ الجينات المُرمِّزة للساركومير (الشكل 4و) والقناة الأيونية (الشكل التكميلي 9)، مما يحميها من الكبت في ظل ظروف Ctrl وTD وMC. تُشير هذه البيانات إلى أنه مع الجمع بين التحفيز الميكانيكي والهرموني (T3/Dex)، يُمكن أن يظل نُسخة شريحة القلب مُشابهةً لشرائح القلب الطازجة بعد 12 يومًا من الزراعة.
تدعم هذه النتائج النسخية حقيقة أن السلامة الهيكلية لخلايا عضلة القلب في مقاطع القلب تُحفظ بشكل أفضل في ظروف النقل المجهري لمدة 12 يومًا، كما يتضح من كونيكسين 43 سليم وموضعي (الشكل 5أ). بالإضافة إلى ذلك، انخفض التليف في مقاطع القلب في ظروف النقل المجهري بشكل ملحوظ مقارنةً بمقاطع Ctrl، وهو ما يُشبه مقاطع القلب الطازجة (الشكل 5ب). تُظهر هذه البيانات أن الجمع بين التحفيز الميكانيكي وعلاج T3/Dex يحافظ بفعالية على بنية القلب في مقاطع القلب في المزرعة.
صور المناعة الفلورية التمثيلية لتروبونين-T (أخضر)، وكونيكسين 43 (أحمر)، وDAPI (أزرق) في أقسام القلب المعزولة حديثًا (D0) أو المزروعة لمدة 12 يومًا في جميع ظروف زراعة أقسام القلب الأربعة (مقياس الشريط = 100 ميكرومتر). تحديد كمية الذكاء الاصطناعي لسلامة بنية أنسجة القلب (ن = 7 (D0 و D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC و D12 MT) شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة، يتم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ####p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و *p < 0.05، أو ****p < 0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl). تحديد كمية الذكاء الاصطناعي لسلامة بنية أنسجة القلب (ن = 7 (D0 و D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC و D12 MT) شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة، يتم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ #### p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و *p < 0.05، أو ****p < 0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl). نقاط تكاملية هيكلية ذات جودة عالية مع الذكاء الذكي (n = 7 (D0 و D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC وD12) MT) сразов/group от зный свиней, проведен однофаctorный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 أو ****p < 0,0001 بواسطة D12 Ctrl). قياس سلامة بنية أنسجة القلب باستخدام الذكاء الاصطناعي (ن = 7 (D0 و D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC و D12 MT) أقسام/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ #### p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و *p < 0.05 أو ****p < 0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl).قم بتكوين مجموعة من العناصر (n = 7 (D0 وD12 Ctrl) و5 (D12 TD وD12 MC وD12 MT) 片 / 组) 进行 人工智能量化، 进行单向ANOVA 测试；#### p <0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比، أو ****p < 0.0001 اضغط على D12 Ctrl.يمكن أن يتم تحديد عدد من العناصر بواسطة n = 7 (d0 وd12 ctrl) (5 (d12 td، d12 mc، d12 mt) 组) ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比، أو ****p < 0.0001 与D12 Ctrl .قياس سلامة بنية أنسجة القلب باستخدام الذكاء الاصطناعي في الخنازير المختلفة (ن = 7 (D0 و D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC و D12 MT) أقسام/مجموعة) مع اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و*p < 0.05 أو ****p < 0.0001 مقارنة بـ D12 (Ctrl). ب- صور تمثيلية وتقدير كمي لشرائح القلب الملطخة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (شريط المقياس = 500 ميكرومتر) (ن = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD، وD12 MC)، 9 (D12 MT) شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار تحليل التباين أحادي الاتجاه؛ ####p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و***p < 0.001، أو ****p < 0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl). ب- صور تمثيلية وتقدير كمي لشرائح القلب الملطخة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (شريط المقياس = 500 ميكرومتر) (ن = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD، وD12 MC)، 9 (D12 MT) شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار تحليل التباين أحادي الاتجاه؛ ####p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و***p < 0.001، أو ****p < 0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl). ب تصوير تمثيلي ومجموع نقاط على طول الطريق، حدود ثلاثية الأبعاد لماسونا (خط الإنتاج = 500) مم) (n = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD وD12 MC)، 9 (D12 MT) مجموعات/مجموعة من خيول مختلفة، يتم اختيارها اختبار التباين ANOVA؛ ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). ب- صور تمثيلية وتقدير كمية مقاطع القلب الملطخة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (شريط المقياس = 500 ميكرومتر) (ن = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD وD12 MC)، 9 (D12 MT) مقاطع/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء تحليل التباين أحادي الاتجاه؛ ####p < 0.0001 مقابل D0 و***p < 0.001 أو ****p < 0.0001 مقابل D12 Ctrl). ب تم تصميم ماسون لتصنيع الصفائح المعدنية وقياس حجمها (حجم = 500 ميكرومتر) (n = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD وD12 MC)، 来自不同猪的9 个(D12 MT)切片/组،进行单因素方差分析；####p <0.0001 与D0 相比،***p <0.001، أو****p <0.0001، D12 Ctrl 相比). ب 用 ماسون 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 و 量化 (الحجم = 500 ميكرومتر) `n = 10 `d0، d12 ctrl، d12 td و d12 mc) 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 لا يمكن أن يكون هناك أي مشكلة في هذا المنتج؛####p <0.0001 与D0相比،***p <0.001، أو****p <0.0001، D12 Ctrl 相比). ب تصوير تمثيلي ومجموع نقاط على طول الطريق، ماسون ثلاثي الألوان (الخط الضخم = 500 م) (ن = 10) (D0، D12 Ctrl، D12 TD وD12 MC)، 9 (D12 MT) من خلال مجموعات / مجموعات مختلفة، один- способ ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 أو ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). ب- صور تمثيلية وتقدير كمية مقاطع القلب الملطخة بثلاثي ألوان ماسون (شريط المقياس = 500 ميكرومتر) (ن = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD وD12 MC)، 9 (D12 MT) مقاطع من خنازير/مجموعة مختلفة، طريقة تحليل التباين واحدة؛ ####p < 0.0001 مقارنة بـ D0، ***p < 0.001 أو ****p < 0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl).تمثل أشرطة الخطأ المتوسط ​​± الانحراف المعياري.
أخيرًا، تم تقييم قدرة CTCM على محاكاة تضخم القلب عن طريق زيادة تمدد أنسجة القلب. في CTCM، زاد ضغط حجرة الهواء الأقصى من 80 مم زئبق إلى 80 مم زئبق. Art. (تمدد طبيعي) حتى 140 مم زئبق Art. (الشكل 6أ). يتوافق هذا مع زيادة بنسبة 32٪ في التمدد (الشكل 6ب)، والذي تم عرضه سابقًا على أنه النسبة المئوية المقابلة للتمدد المطلوبة لأقسام القلب لتحقيق طول الساركومير المماثل لما شوهد في تضخم القلب. ظل تمدد وسرعة أنسجة القلب أثناء الانقباض والاسترخاء ثابتين لمدة ستة أيام من المزرعة (الشكل 6ج). خضعت أنسجة القلب من ظروف MT لتمدد طبيعي (MT (طبيعي)) أو ظروف فرط التمدد (MT (OS)) لمدة ستة أيام. بعد أربعة أيام من المزرعة، ارتفع المؤشر الحيوي للتضخم NT-ProBNP بشكل ملحوظ في الوسط تحت ظروف MT (OS) مقارنة بظروف MT (طبيعية) (الشكل 7أ). بالإضافة إلى ذلك، بعد ستة أيام من الزراعة، ازداد حجم الخلايا في أنسجة MT (OS) (الشكل 7ب) بشكل ملحوظ مقارنةً بأقسام قلب MT (الطبيعية). كما ازداد انتقال NFATC4 النووي بشكل ملحوظ في الأنسجة المفرطة التمدد (الشكل 7ج). تُظهر هذه النتائج التطور التدريجي لإعادة التشكيل المرضي بعد فرط التمدد، وتدعم مفهوم إمكانية استخدام جهاز CTCM كمنصة لدراسة إشارات تضخم القلب الناتج عن التمدد.
تؤكد الآثار التمثيلية لضغط حجرة الهواء وضغط حجرة السائل وقياسات حركة الأنسجة أن ضغط الحجرة يغير ضغط حجرة السائل، مما يتسبب في حركة مقابلة لشريحة الأنسجة. ب منحنى النسبة المئوية للتمدد ومعدل التمدد التمثيلي لمقاطع الأنسجة الممتدة بشكل طبيعي (البرتقالية) والممتدة بشكل مفرط (الزرقاء). ج رسم بياني شريطي يوضح وقت الدورة (ن = 19 شريحة لكل مجموعة، من خنازير مختلفة)، ووقت الانكماش (ن = 18-19 شريحة لكل مجموعة، من خنازير مختلفة)، ووقت الاسترخاء (ن = 19 شريحة لكل مجموعة، من خنازير مختلفة))، وسعة حركة الأنسجة (ن = 14 شريحة/مجموعة، من خنازير مختلفة)، وسرعة الانقباض القصوى (ن = 14 شريحة/مجموعة، من خنازير مختلفة) ومعدل الاسترخاء الأقصى (ن = 14 (D0)، 15 (D6)) مقطع/مجموعة) من خنازير مختلفة)، ولم يُظهر اختبار t للطلاب ثنائي الذيل أي فرق كبير في أي معلمة، مما يشير إلى أن هذه المعلمات ظلت ثابتة خلال 6 أيام من الثقافة مع الجهد الزائد. تمثل أشرطة الخطأ المتوسط ​​± الانحراف المعياري.
تحديد كمية تركيز NT-ProBNP في وسائط الثقافة من شرائح القلب المزروعة في ظل ظروف التمدد الطبيعي للـMT (Norm) أو التمدد الزائد (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm، وD4 MTOS) شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة، يتم إجراء تحليل التباين ثنائي الاتجاه؛ **p < 0.01 مقارنة بالتمدد الطبيعي). تحديد كمية تركيز NT-ProBNP في وسائط الثقافة من شرائح القلب المزروعة في ظل ظروف التمدد الطبيعي للـMT (Norm) أو التمدد الزائد (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm، وD4 MTOS) شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة، يتم إجراء تحليل التباين ثنائي الاتجاه؛ **p < 0.01 مقارنة بالتمدد الطبيعي).رسم بياني كمي لتركيز NT-ProBNP في وسط الثقافة من شرائح القلب المزروعة في ظل ظروف تمدد MT الطبيعي (الطبيعي) أو التمدد الزائد (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm، وD4).MTOS) شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة، يتم إجراء تحليل التباين ثنائي العوامل؛**p < 0,01 по сравнению с ноrmальным растязением). **p < 0.01 مقارنة بالتمدد الطبيعي). a نظام التشغيل MT (المعيار) المعتمد من نظام التشغيل (OS) يعتمد على نظام التشغيل NT-ProBNP الذي يعتمد على نظام التشغيل (n) = 4 (D2 MTNorm)、3(D2 MTOS、D4 MTNorm وD4 MTOS) قم بالتسجيل في 猪的切片/组، 进行双向方差分析；**与正常拉伸相比،p < 0.01) تقدير كمي لتركيز NT-ProBNP في شرائح القلب المستزرعة تحت ظروف التمدد العادي (Norm) أو التمدد الزائد (OS) لـ MT (ن = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm وD4 MTOS) من مختلف أنواع الخلايا؛ **مقارنة مع التمدد الطبيعي، P <0.01).رسم بياني توزيعي لتحديد تركيزات NT-ProBNP في شرائح القلب المزروعة في ظل ظروف تمدد MT الطبيعي (الطبيعي) أو التمدد الزائد (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)، و3 (D2 MTOS، D4 MTNorm) وD4 MTOS) شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة، وتحليل التباين ثنائي الاتجاه؛**p < 0,01 по сравнению с ноrmальным растязением). **p < 0.01 مقارنة بالتمدد الطبيعي). ب- صور تمثيلية لشرائح القلب الملطخة بالتروبونين-تي وWGA (يسار) وتقدير حجم الخلية (يمين) (ن = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) خلية/مجموعة من 10 شرائح مختلفة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار t للطلاب ثنائي الذيل؛ ****p < 0.0001 مقارنة بالامتداد الطبيعي). ب- صور تمثيلية لشرائح القلب الملطخة بالتروبونين-تي وWGA (يسار) وتقدير حجم الخلية (يمين) (ن = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) خلية/مجموعة من 10 شرائح مختلفة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار t للطلاب ثنائي الذيل؛ ****p < 0.0001 مقارنة بالامتداد الطبيعي). ب تصوير تمثيلي لسلسلة من الخيوط والتروبونيوم المزخرف-T وAP (السطح) ومجموعة من المقابض ذات حجم التقريب (صحيح) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) مجموعة/مجموعة من 10 مجموعات مختلفة من سلاسل مختلفة، اثنان- ينشئ طالبًا متميزًا على شكل حرف T ؛ ****p < 0,0001 по сравнению с ноrmальным растязением). ب- صور تمثيلية لمقاطع القلب الملطخة بالتروبونين-T وAZP (يسار) وتقدير حجم الخلية (يمين) (ن = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) خلية/مجموعة من 10 مقاطع مختلفة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار t للطلاب ثنائي الذيل؛ ****p < 0.0001 مقارنة بالسلالة الطبيعية). ب 用肌钙蛋白-T وWGA(左) و细胞大小量化(右)染色的心脏切片的代表性图像(n = 330(D6) MTOS)، 10 سلاسل من 369 (D6 MTNorm)، 细胞/组، 两进行有尾学生t 检验؛ 与正常拉伸相比، ****p <0.0001). ب- صور تمثيلية لشرائح القلب الملطخة بالكالكيرين-تي وWGA (يسار) وحجم الخلية (يمين) (ن = 330 (D6 MTOS)، 369 من 10 شرائح مختلفة (D6 MTNorm)) خلايا/اختبار t؛ مقارنة بالتمدد الطبيعي، ****p < 0.0001). ب تصوير تمثيلي من خلال البحر والتروبونيوم المزخرف- TP و AP (السطح) والأوساخ ذات الحجم الكلي (الصحيح) (ن = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) من بين 10 مجموعات مختلفة من مجموعات/مجموعات الخنازير المختلفة، الطالبة المعيارية؛ ****p < 0,0001 по сравнению с ноrmальным растязением). ب- صور تمثيلية لمقاطع القلب الملطخة بالتروبونين-T وAZP (يسار) وتقدير حجم الخلية (يمين) (ن = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) من 10 مقاطع مختلفة من خنازير مختلفة) الخلايا/المجموعة، معيار ثنائي الذيل t للطلاب؛ ****p < 0.0001 مقارنة بالسلالة الطبيعية). ج- صور تمثيلية لشرائح قلب MTOS في اليوم 0 واليوم 6 المُعَلَّمة مناعيًا بالتروبونين-T وNFATC4 وتقدير كمية انتقال NFATC4 إلى نوى الخلايا العضلية المتعادلة (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار t للطلاب ثنائي الذيل؛ *p < 0.05). ج- صور تمثيلية لشرائح قلب MTOS في اليوم 0 واليوم 6 المُعَلَّمة مناعيًا بالتروبونين-T وNFATC4 وتقدير كمية انتقال NFATC4 إلى نوى الخلايا العضلية المتعادلة (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار t للطلاب ثنائي الذيل؛ *p < 0.05). c تصوير تمثيلي لسلسلة من 0 و6 أيام MTOS، وخلايا مناعية للتروبوني-T وNFATC4، ونقاط تجميع نقل NFATC4 إلى وحدة التحكم الكهرومغناطيسية (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) من مجموعة/مجموعة من سلاسل مختلفة، выполняется двусторонний t-criteriй Student; * ع <0,05). ج- صور تمثيلية لمقاطع القلب عند 0 و6 أيام من MTOS، مُعَلَّمة مناعيًا لـ Troponin-T وNFATC4، وتقدير كمية انتقال NFATC4 في نواة الخلايا الكهفية (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة) تم إجراؤها باستخدام اختبار t للطلاب ثنائي الذيل؛ *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T وNFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS تم تحديد حجم الصورة الحقيقية، وقد تم تحديدها من قبل NFATC4 أو CM من CM (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS)片/组، 进行双尾学生t 检验；*p <0.05). c صور تمثيلية لشرائح القلب المناعية calcanin-T و NFATC4 第0天和第6天MTOS، و NFATC4 من كمية مختلفة من نواة خلية NFATC4 CM (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) 切礼 / 组،时间双尾学生et 电影；*p <0.05). c تصوير تمثيلي لسلسلة MTOS من 0 إلى 6 أيام للعلامات المناعية-T وNFATC4 وجمع نقل النقاط NFATC4 في CM من أسلاك مختلفة (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) بين/المجموعة، ثنائي-معيار t مخصص الطالب; * ع <0,05). ج- صور تمثيلية لشرائح قلب MTOS في اليوم 0 واليوم 6 لتحديد العلامات المناعية لتروبونين-T وNFATC4 وتقدير كمية انتقال NFATC4 في نواة CM من خنازير مختلفة (ن = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) شرائح/مجموعة، معيار t ثنائي الذيل للطلاب؛ *ص < 0.05).تمثل أشرطة الخطأ المتوسط ​​± الانحراف المعياري.
تتطلب أبحاث القلب والأوعية الدموية الانتقالية نماذج خلوية تُحاكي بدقة بيئة القلب. في هذه الدراسة، طُوِّر جهاز CTCM ووُصف بأنه قادر على تحفيز أقسام رقيقة للغاية من القلب. يتضمن نظام CTCM تحفيزًا كهروميكانيكيًا متزامنًا فسيولوجيًا وإثراءً لسوائل T3 وDex. عند تعريض أقسام قلب الخنزير لهذه العوامل، ظلت قابليتها للحياة، وسلامتها الهيكلية، ونشاطها الأيضي، وتعبيرها النسخي كما هي في أنسجة القلب الطازجة بعد 12 يومًا من الزراعة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يُسبب التمدد المفرط لأنسجة القلب تضخمًا في القلب ناتجًا عن فرط التمدد. بشكل عام، تدعم هذه النتائج الدور الحاسم لظروف الزراعة الفسيولوجية في الحفاظ على نمط ظاهري طبيعي للقلب، وتوفر منصةً لفحص الأدوية.
تساهم عوامل عديدة في تهيئة بيئة مثالية لعمل خلايا عضلة القلب وبقائها. أبرز هذه العوامل تتعلق بـ (1) التفاعلات بين الخلايا، (2) التحفيز الكهروميكانيكي، (3) العوامل الخلطية، و(4) الركائز الأيضية. تتطلب التفاعلات الفسيولوجية بين الخلايا شبكات ثلاثية الأبعاد معقدة من أنواع خلايا متعددة مدعومة بمصفوفة خارج خلوية. يصعب إعادة بناء هذه التفاعلات الخلوية المعقدة في المختبر عن طريق الزراعة المشتركة لأنواع خلايا فردية، ولكن يمكن تحقيق ذلك بسهولة باستخدام الطبيعة العضوية لمقاطع القلب.
يُعدّ التمدد الميكانيكي والتحفيز الكهربائي لخلايا عضلة القلب أمرًا بالغ الأهمية للحفاظ على النمط الظاهري للقلب33،34،35. في حين استُخدم التحفيز الميكانيكي على نطاق واسع لتكييف ونضج الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات (hiPSC-CM)، فقد حاولت العديد من الدراسات المتميزة مؤخرًا التحفيز الميكانيكي لشرائح القلب في المزرعة باستخدام التحميل أحادي المحور. تُظهر هذه الدراسات أن التحميل الميكانيكي أحادي المحور ثنائي الأبعاد له تأثير إيجابي على النمط الظاهري للقلب أثناء المزرعة. في هذه الدراسات، تم تحميل مقاطع من القلب إما بقوى شد متساوية القياس17، أو تحميل خطي أوكوسوتوني18، أو إعادة إنشاء الدورة القلبية باستخدام ردود فعل محول القوة ومحركات الشد. ومع ذلك، تستخدم هذه الطرق تمددًا أحادي المحور للأنسجة دون تحسين بيئي، مما يؤدي إلى تثبيط العديد من الجينات القلبية أو الإفراط في التعبير عن الجينات المرتبطة باستجابات التمدد غير الطبيعية. يوفر CTCM الموصوف هنا تحفيزًا كهروميكانيكيًا ثلاثي الأبعاد يُحاكي الدورة القلبية الطبيعية من حيث زمن الدورة والتمدد الفسيولوجي (25% تمدد، 40% انقباض، 60% انبساط، و72 نبضة في الدقيقة). على الرغم من أن هذا التحفيز الميكانيكي ثلاثي الأبعاد وحده لا يكفي للحفاظ على سلامة الأنسجة، إلا أن الجمع بين التحفيز الخلطي والميكانيكي باستخدام T3/Dex ضروري للحفاظ على حيوية الأنسجة ووظيفتها وسلامتها بشكل كافٍ.
تلعب العوامل الخلطية دورًا هامًا في تعديل النمط الظاهري لقلب البالغين. وقد سُلِّط الضوء على ذلك في دراسات HiPS-CM التي أُضيف فيها T3 وDex إلى أوساط الزراعة لتسريع نضج الخلايا. قد يؤثر T3 على نقل الأحماض الأمينية والسكريات والكالسيوم عبر أغشية الخلايا36. بالإضافة إلى ذلك، يعزز T3 التعبير عن MHC-α وتثبيط MHC-β، مما يعزز تكوين اللييفات العضلية سريعة الانقباض في خلايا عضلة القلب الناضجة مقارنةً باللييفات العضلية بطيئة الانقباض في عضلة القلب الجنينية. يؤدي نقص T3 لدى مرضى قصور الغدة الدرقية إلى فقدان الأشرطة الليفية العضلية وانخفاض معدل تطور التوتر37. يؤثر Dex على مستقبلات الجلوكوكورتيكويد، وقد ثبت أنه يزيد من انقباض عضلة القلب في القلوب المعزولة المروية؛38 ويُعتقد أن هذا التحسن مرتبط بالتأثير على دخول الكالسيوم المدفوع برواسب (SOCE)39،40. بالإضافة إلى ذلك، يرتبط ديكس بمستقبلاته، مما يسبب استجابة واسعة النطاق داخل الخلايا تعمل على قمع الوظيفة المناعية والالتهابات30.
تشير نتائجنا إلى أن التحفيز الميكانيكي الفيزيائي (MS) قد حسّن الأداء العام للزراعة مقارنةً بـ Ctrl، لكنه فشل في الحفاظ على قابلية البقاء والسلامة الهيكلية والتعبير القلبي على مدار 12 يومًا في المزرعة. وبالمقارنة مع Ctrl، فإن إضافة T3 وDex إلى مزارع CTCM (MT) قد حسّن قابلية البقاء وحافظ على أنماط نسخ مماثلة والسلامة الهيكلية والنشاط الأيضي مع أنسجة القلب الطازجة لمدة 12 يومًا. بالإضافة إلى ذلك، من خلال التحكم في درجة تمدد الأنسجة، تم إنشاء نموذج تضخم القلب الناجم عن فرط التمدد باستخدام STCM، مما يوضح تنوع نظام STCM. تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أن إعادة تشكيل القلب والتليف عادةً ما ينطويان على أعضاء سليمة يمكن لخلاياها الدائرية توفير السيتوكينات المناسبة بالإضافة إلى البلعمة وعوامل إعادة التشكيل الأخرى، إلا أن أقسام القلب لا تزال قادرة على محاكاة العملية الليفية استجابةً للإجهاد والصدمة. في الخلايا الليفية العضلية. وقد تم تقييم ذلك سابقًا في نموذج شريحة القلب هذا. تجدر الإشارة إلى أنه يمكن تعديل معلمات CTCM بتغيير الضغط/السعة الكهربائية والتردد لمحاكاة العديد من الحالات، مثل تسرع القلب وبطء القلب، والدعم الميكانيكي للدورة الدموية (القلب غير المُحمّل ميكانيكيًا). هذا يجعل النظام وسيطًا فعالًا لاختبار الأدوية. تُمهد قدرة CTCM على نمذجة تضخم القلب الناتج عن الإجهاد المفرط الطريق لاختبار هذا النظام للعلاج المُخصص. ختامًا، تُوضح هذه الدراسة أن التمدد الميكانيكي والتحفيز الخلطي أساسيان للحفاظ على زراعة مقاطع أنسجة القلب.
على الرغم من أن البيانات المقدمة هنا تشير إلى أن CTCM منصة واعدة للغاية لنمذجة عضلة القلب السليمة، إلا أن طريقة الزراعة هذه لها بعض القيود. يتمثل القيد الرئيسي لزراعة CTCM في أنها تفرض ضغوطًا ميكانيكية ديناميكية مستمرة على الشرائح، مما يحول دون القدرة على مراقبة انقباضات شريحة القلب بنشاط خلال كل دورة. بالإضافة إلى ذلك، نظرًا لصغر حجم المقاطع القلبية (7 مم)، فإن القدرة على تقييم الوظيفة الانقباضية خارج أنظمة الزراعة باستخدام مستشعرات القوة التقليدية محدودة. في المخطوطة الحالية، تغلبنا جزئيًا على هذا القيد من خلال تقييم الجهد البصري كمؤشر على الوظيفة الانقباضية. ومع ذلك، سيتطلب هذا القيد مزيدًا من العمل ويمكن معالجته في المستقبل من خلال تقديم طرق للمراقبة البصرية لوظيفة شرائح القلب في المزرعة، مثل رسم الخرائط البصرية باستخدام الكالسيوم والأصباغ الحساسة للجهد. يتمثل قيد آخر لـ CTCM في أن النموذج العامل لا يتلاعب بالإجهاد الفسيولوجي (الحمل المسبق والحمل اللاحق). في تقنية CTCM، تم إحداث ضغط في اتجاهين متعاكسين لإنتاج تمدد فسيولوجي بنسبة 25% في الانبساط (التمدد الكامل) والانقباض (طول الانقباض أثناء التحفيز الكهربائي) في الأنسجة الكبيرة جدًا. ينبغي إزالة هذا القيد في تصميمات CTCM المستقبلية من خلال الضغط الكافي على أنسجة القلب من كلا الجانبين، وتطبيق علاقات الضغط والحجم الدقيقة التي تحدث في حجرات القلب.
يقتصر إعادة التشكيل الناتج عن التمدد المفرط المذكور في هذه المخطوطة على محاكاة إشارات التمدد المفرط الضخامي. وبالتالي، يمكن أن يُسهم هذا النموذج في دراسة إشارات التمدد الضخامي الناتج عن التمدد دون الحاجة إلى عوامل خلطية أو عصبية (وهي غير موجودة في هذا النظام). هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لزيادة تعدد CTCM، على سبيل المثال، فإن الزراعة المشتركة مع الخلايا المناعية، وعوامل الخلط البلازمية الدائرية، والتعصيب عند الزراعة المشتركة مع الخلايا العصبية سيُحسّن من إمكانيات نمذجة الأمراض باستخدام CTCM.
استُخدم ثلاثة عشر خنزيرًا في هذه الدراسة. أُجريت جميع الإجراءات على الحيوانات وفقًا للإرشادات المؤسسية، وحصلت على موافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة لويزفيل. ثُبّت قوس الأبهر، ورُوي القلب بللتر واحد من محلول كارديوبليجيا المعقم (١١٠ ملي مولار كلوريد الصوديوم، ١.٢ ملي مولار كلوريد الكالسيوم، ١٦ ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، ١٦ ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، ١٠ ملي مولار كلوريد الصوديوم، ٥ وحدات/مليلتر من الهيبارين، درجة حموضة تصل إلى ٧.٤). تم حفظ القلوب في محلول شلل القلب البارد حتى يتم نقلها إلى المختبر على الجليد والذي عادة ما يكون أقل من 10 دقائق. تم حفظ القلوب في محلول شلل القلب البارد حتى يتم نقلها إلى المختبر على الجليد والذي عادة ما يكون أقل من 10 دقائق. يتم نقل سلسلة من الشقوق في القلب إلى وسائل النقل في مختبرات البشر، والتي يتم إجراؤها بشكل طبيعي <10 دقائق. تم تخزين القلوب في محلول شلل القلب البارد حتى يتم نقلها إلى المختبر على الجليد، وهو ما يستغرق عادة أقل من 10 دقائق.لا داعي للقلق بشأن هذا الأمر.لا داعي للقلق بشأن هذا الأمر. يتم توصيله عبر أجهزة القلب والأوعية الدموية إلى وسائل النقل في مختبرات البشر، بشكل طبيعي <10 دقائق. إبقاء القلوب على الجليد حتى نقلها إلى المختبر على الجليد، عادة أقل من 10 دقائق.
طُوِّر جهاز CTCM باستخدام برنامج التصميم بمساعدة الحاسوب SolidWorks (CAD). صُنعت حجرات الزراعة والفواصل وحجرات الهواء من بلاستيك أكريليك شفاف مُحوسب باستخدام الحاسب الآلي. الحلقة الداعمة بقطر 7 مم مصنوعة من البولي إيثيلين عالي الكثافة (HDPE) في المنتصف، وتحتوي على أخدود حلقي لاستيعاب حلقة السيليكون المستخدمة لإغلاق الوسائط تحتها. يفصل غشاء رقيق من السيليكا حجرة الزراعة عن صفيحة الفصل. غشاء السيليكون مقطوع بالليزر من صفيحة سيليكون بسمك 0.02 بوصة، وله صلابة 35 أمبير. أما حشوات السيليكون السفلية والعلوية فمقطوعة بالليزر من صفيحة سيليكون بسمك 1/16 بوصة، ولها صلابة 50 أمبير. تُستخدم براغي وصواميل مجنحة من الفولاذ المقاوم للصدأ 316L لتثبيت الكتلة وإنشاء سد محكم.
صُممت لوحة دوائر مطبوعة (PCB) مخصصة للتكامل مع نظام C-PACE-EM. تتصل مقابس التوصيل الآلية السويسرية الموجودة على لوحة الدوائر المطبوعة بأقطاب الجرافيت بواسطة أسلاك نحاسية مطلية بالفضة وبراغي برونزية 0-60 مثبتة في الأقطاب. تُوضع لوحة الدوائر المطبوعة في غطاء الطابعة ثلاثية الأبعاد.
يتم التحكم في جهاز CTCM بواسطة مشغل هوائي قابل للبرمجة (PPD) يخلق ضغطًا دوريًا متحكمًا به مشابهًا للدورة القلبية. مع زيادة الضغط داخل حجرة الهواء، يتمدد غشاء السيليكون المرن لأعلى، مما يجبر الوسط تحت موقع الأنسجة. سيتم بعد ذلك تمدد منطقة الأنسجة عن طريق طرد السائل هذا، محاكياً التمدد الفسيولوجي للقلب أثناء الانبساط. في ذروة الاسترخاء، تم تطبيق التحفيز الكهربائي من خلال أقطاب الجرافيت، مما أدى إلى تقليل الضغط في حجرة الهواء وتسبب في انكماش أقسام الأنسجة. يوجد داخل الأنبوب صمام مرقئ مزود بمستشعر ضغط للكشف عن الضغط في نظام الهواء. يتم تطبيق الضغط الذي يستشعره مستشعر الضغط على مجمع بيانات متصل بالكمبيوتر المحمول. يسمح هذا بمراقبة مستمرة للضغط داخل حجرة الغاز. عندما تم الوصول إلى الحد الأقصى لضغط الغرفة (80 مم زئبق قياسي، 140 مم زئبق OS)، تم إصدار أمر لجهاز جمع البيانات لإرسال إشارة إلى نظام C-PACE-EM لتوليد إشارة جهد ثنائية الطور لمدة 2 مللي ثانية، مضبوطة على 4 فولت.
تم الحصول على مقاطع القلب وتم تنفيذ ظروف الزراعة في 6 آبار على النحو التالي: نقل القلوب المحصودة من وعاء النقل إلى صينية تحتوي على شلل القلب البارد (4 درجات مئوية). تم عزل البطين الأيسر بشفرة معقمة وتقطيعه إلى قطع من 1-2 سم3. تم ربط كتل الأنسجة هذه بدعامات الأنسجة بمادة لاصقة للأنسجة ووضعها في حمام أنسجة مهتز يحتوي على محلول تايرود ومؤكسج باستمرار (3 جم / لتر 2،3-بيوتانيديون مونوكسيم (BDM)، 140 ملي مولار كلوريد الصوديوم (8.18 جم) ، 6 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم (0.447 جم)، 10 ملي مولار جلوكوز D (1.86 جم)، 10 ملي مولار هيبس (2.38 جم)، 1 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم (1 مل محلول 1 مولار)، 1.8 ملي مولار كلوريد الكالسيوم (1.8 مل محلول 1 مولار)، حتى 1 لتر من ddH2O). تم ضبط الميكروتوم الاهتزازي لقطع شرائح بسمك 300 ميكرومتر بتردد 80 هرتز، وسعة اهتزاز أفقية 2 مم، ومعدل تقدم 0.03 مم/ثانية. كان حمام الأنسجة محاطًا بالثلج للحفاظ على المحلول باردًا وتم الحفاظ على درجة الحرارة عند 4 درجات مئوية. انقل أقسام الأنسجة من حمام الميكروتوم إلى حمام حضانة يحتوي على محلول تايرود المؤكسج باستمرار على الثلج حتى يتم الحصول على أقسام كافية لصفيحة زراعة واحدة. بالنسبة لمزارع النقل عبر البئر، تم ربط أقسام الأنسجة بدعامات بولي يوريثين معقمة بعرض 6 مم ووضعها في 6 مل من الوسط الأمثل (وسط 199، مكمل ITS واحد، 10٪ FBS، 5 نانوغرام/مل VEGF، 10 نانوغرام/مل FGF قلوي و 2X مضاد حيوي مضاد للفطريات). تم تطبيق التحفيز الكهربائي (10 فولت، تردد 1.2 هرتز) على أقسام الأنسجة من خلال C-Pace. في ظروف TD، أُضيف T3 وDex جديدان بتركيز 100 نانومول و1 ميكرومول عند كل تغيير للوسط. أُشبع الوسط بالأكسجين قبل استبداله ثلاث مرات يوميًا. زُرعت المقاطع النسيجية في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون.
بالنسبة لثقافات CTCM، تم وضع مقاطع الأنسجة على طابعة ثلاثية الأبعاد مصنوعة خصيصًا في طبق بتري يحتوي على محلول Tyrode المعدل. تم تصميم الجهاز لزيادة حجم شريحة القلب بنسبة 25٪ من مساحة حلقة الدعم. يتم ذلك حتى لا تتمدد مقاطع القلب بعد نقلها من محلول Tyrode إلى الوسط وأثناء الانبساط. باستخدام غراء الهيستوأكريليك، تم تثبيت المقاطع التي يبلغ سمكها 300 ميكرومتر على حلقة دعم قطرها 7 مم. بعد ربط مقاطع الأنسجة بحلقة الدعم، اقطع مقاطع الأنسجة الزائدة وضع مقاطع الأنسجة المرفقة مرة أخرى في حمام محلول Tyrode على الثلج (4 درجات مئوية) حتى يتم تحضير مقاطع كافية لجهاز واحد. يجب ألا يتجاوز إجمالي وقت المعالجة لجميع الأجهزة ساعتين. بعد ربط 6 مقاطع أنسجة بحلقات الدعم الخاصة بها، تم تجميع جهاز CTCM. تم ملء حجرة ثقافة CTCM مسبقًا بوسط مؤكسج مسبقًا سعة 21 مل. انقل أقسام الأنسجة إلى حجرة الثقافة وأزل أي فقاعات هواء بعناية باستخدام ماصة. ثم يتم توجيه قسم الأنسجة إلى الفتحة والضغط برفق في مكانه. وأخيرًا، ضع غطاء القطب على الجهاز وانقله إلى الحاضنة. ثم قم بتوصيل CTCM بأنبوب الهواء ونظام C-PACE-EM. يفتح المشغل الهوائي ويفتح صمام الهواء CTCM. تم تكوين نظام C-PACE-EM لتوصيل 4 فولت عند 1.2 هرتز أثناء التحفيز ثنائي الطور لمدة 2 مللي ثانية. تم تغيير الوسط مرتين في اليوم وتم تغيير الأقطاب مرة واحدة في اليوم لتجنب تراكم الجرافيت على الأقطاب. إذا لزم الأمر، يمكن إزالة أقسام الأنسجة من آبار ثقافتها لطرد أي فقاعات هواء قد تكون سقطت تحتها. بالنسبة لظروف معالجة MT، تمت إضافة T3 / Dex طازجًا مع كل تغيير للوسط مع 100 نانومولار T3 و 1 ميكرومولار Dex. تمت زراعة أجهزة CTCM في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
للحصول على مسارات ممتدة لشرائح القلب، تم تطوير نظام كاميرا خاص. تم استخدام كاميرا SLR (Canon Rebel T7i، Canon، Tokyo، Japan) مع عدسة ماكرو Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar، San Francisco، CA). تم إجراء التصور في درجة حرارة الغرفة بعد استبدال الوسيط بوسط جديد. تم وضع الكاميرا بزاوية 51 درجة وتم تسجيل الفيديو بمعدل 30 إطارًا في الثانية. أولاً، تم استخدام برنامج مفتوح المصدر (MUSCLEMOTION43) مع Image-J لقياس حركة شرائح القلب. تم إنشاء القناع باستخدام MATLAB (MathWorks، Natick، MA، USA) لتحديد مناطق الاهتمام لشرائح القلب النابض لتجنب الضوضاء. يتم تطبيق أقنعة مجزأة يدويًا على جميع الصور في تسلسل إطارات ثم يتم تمريرها إلى المكون الإضافي MUSCLEMOTION. يستخدم Muscle Motion متوسط ​​شدة البكسل في كل إطار لقياس حركته بالنسبة للإطار المرجعي. سُجِّلت البيانات وفُصِّلت، ثم استُخدمت لقياس زمن الدورة وتقييم تمدد الأنسجة خلال الدورة القلبية. خضع الفيديو المُسجَّل لمعالجة لاحقة باستخدام مُرشِّح رقمي ذي طور صفري من الدرجة الأولى. ولقياس تمدد الأنسجة (من الذروة إلى الذروة)، أُجري تحليل من الذروة إلى الذروة للتمييز بين القمم والقيعان في الإشارة المُسجَّلة. بالإضافة إلى ذلك، يُجرى إزالة الاتجاه باستخدام مُتعدِّد حدود من الدرجة السادسة لإزالة انحراف الإشارة. طُوِّرَ رمز البرنامج في MATLAB لتحديد حركة الأنسجة الكلية، وزمن الدورة، وزمن الاسترخاء، وزمن الانقباض (رمز البرنامج المُكمِّل 44).
لتحليل الإجهاد، وباستخدام نفس مقاطع الفيديو المُعدّة لتقييم التمدد الميكانيكي، رسمنا أولًا صورتين تُمثّلان ذروات الحركة (أعلى وأدنى نقطتي حركة) وفقًا لبرنامج MUSCLEMOTION. ثم قسّمنا مناطق الأنسجة وطبّقنا خوارزمية تظليل على الأنسجة المُجزّأة (الشكل التكميلي 2أ). قُسّم النسيج المُجزّأ إلى عشرة أسطح فرعية، وحُسب الإجهاد على كل سطح باستخدام المعادلة التالية: الإجهاد = (Sup-Sdown)/Sdown، حيث Sup وSdown هما بُعدا الشكل عن الظلال العلوية والسفلية للنسيج، على التوالي (الشكل التكميلي 2ب).
ثُبّتت مقاطع القلب في محلول بارافورمالدهيد بتركيز 4% لمدة 48 ساعة. جُفّفت الأنسجة المُثبّتة في محلول سكروز بتركيز 10% و20% لمدة ساعة، ثم في محلول سكروز بتركيز 30% طوال الليل. ثم غُطّنت المقاطع في مُركّب درجة حرارة القطع المُثلى (مركب OCT) وجُمّدت تدريجيًا في حمام من الأيزوبنتان/الثلج الجاف. تُخزّن كتل التضمين OCT عند درجة حرارة -80 مئوية حتى فصلها. حُضّرت الشرائح كمقاطع بسُمك 8 ميكرومتر.
لإزالة تصوير الأوعية الدموية البصرية (OCT) من مقاطع القلب، سخّن الشرائح على لوح تسخين عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أضف 1 مل من محلول فوسفات الصوديوم (PBS) إلى كل شريحة، واحضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم انقع المقاطع بوضع 0.1% من تريتون-إكس في محلول فوسفات الصوديوم (PBS) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير النوعية بالعينة، أضف 1 مل من محلول فوسفات الصوديوم (BSA) 3% إلى الشرائح، واحضنها لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أُزيل محلول فوسفات الصوديوم (BSA) وغُسلت الشرائح بمحلول فوسفات الصوديوم (PBS). حدّد كل عينة بقلم رصاص. تمت إضافة الأجسام المضادة الأولية (المخففة بنسبة 1:200 في 1% من BSA) (connexin 43 (Abcam؛ #AB11370)، وNFATC4 (Abcam؛ #AB99431)، وtroponin-T (Thermo Scientific؛ #MA5-12960) على مدار 90 دقيقة، ثم الأجسام المضادة الثانوية (المخففة بنسبة 1:200 في 1% من BSA) ضد فأر Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific؛ #A16079)، ضد أرنب Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific؛ #T6391) لمدة 90 دقيقة إضافية. تم غسلها 3 مرات باستخدام PBS للتمييز بين تلطيخ الهدف والخلفية، استخدمنا فقط الجسم المضاد الثانوي كعنصر تحكم. أخيرًا، تمت إضافة صبغة DAPI النووية وتم وضع الشرائح في vectashield (Vector Laboratories) وإغلاقها بطلاء الأظافر. تم استخدام المجهر Keyence بتكبير 40x.
استُخدمت مادة WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific؛ رقم W32464) بتركيز 5 ميكروغرام/مل في محلول PBS لصبغ WGA، وطُبّقت على أجزاء ثابتة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم غُسلت الشرائح بمحلول PBS، وأُضيف إليها أسود السودان، وحُضنت لمدة 30 دقيقة. ثم غُسلت الشرائح بمحلول PBS، وأُضيف إليها وسط التضمين Vectashield. وُضِعت الشرائح على مجهر Keyence بتكبير 40 ضعفًا.
تم إزالة OCT من العينات كما هو موضح أعلاه. بعد إزالة OCT، اغمر الشرائح في محلول Bouin طوال الليل. ثم تم شطف الشرائح بالماء المقطر لمدة ساعة واحدة ثم وضعها في محلول Bibrich aloe acid fuchsin لمدة 10 دقائق. بعد ذلك تم غسل الشرائح بالماء المقطر ووضعها في محلول من 5٪ فوسفوموليبدينوم / 5٪ حمض الفوسفوتنجستيك لمدة 10 دقائق. بدون شطف، انقل الشرائح مباشرة إلى محلول أزرق الأنيلين لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك تم غسل الشرائح بالماء المقطر ووضعها في محلول حمض الأسيتيك 1٪ لمدة دقيقتين. تم تجفيف الشرائح في 200 N إيثانول ونقلها إلى زيلين. تم تصور الشرائح الملطخة باستخدام مجهر Keyence مع 10x الهدف. تم تحديد النسبة المئوية لمساحة التليف باستخدام برنامج Keyence Analyzer.
اختبار قابلية الخلايا للبقاء CyQUANT™ MTT (Invitrogen، كارلسباد، كاليفورنيا)، رقم الكتالوج V13154، وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة مع بعض التعديلات. على وجه الخصوص، تم استخدام مثقاب جراحي بقطر 6 مم لضمان حجم أنسجة موحد أثناء تحليل MTT. تم وضع الأنسجة بشكل فردي في آبار صفيحة ذات 12 بئرًا تحتوي على ركيزة MTT وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. يتم تحضين المقاطع عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات، ويقوم النسيج الحي باستقلاب ركيزة MTT لتكوين مركب فورمازان أرجواني. يتم استبدال محلول MTT بـ 1 مل من DMSO ويتم تحضينه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لاستخراج فورمازان أرجواني من مقاطع القلب. تم تخفيف العينات بنسبة 1:10 في DMSO في ألواح ذات قاع شفاف 96 بئرًا، وتم قياس شدة اللون الأرجواني عند 570 نانومتر باستخدام قارئ ألواح Cytation (BioTek). تم تطبيع القراءات على وزن كل شريحة من القلب.
استُبدلت وسائط شرائح القلب بوسائط تحتوي على 1 ميكروكوري/مل [5-3H]-جلوكوز (شركة مورفيك بيوكيماكس، بريا، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) لاختبار استخدام الجلوكوز كما هو موضح سابقًا. بعد 4 ساعات من الحضانة، أُضيف 100 ميكرولتر من الوسط إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مفتوح يحتوي على 100 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك بتركيز 0.2 نيوتن. ثم وُضع الأنبوب في أنبوب وميض يحتوي على 500 ميكرولتر من dH2O لتبخير [3H]2O لمدة 72 ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. بعد ذلك، أُزيل أنبوب الطرد المركزي الدقيق من أنبوب الومض وأُضيف 10 مل من سائل الومض. أُجريت عدّات الومض باستخدام جهاز تحليل الومض السائل Tri-Carb 2900TR (شركة باكارد بيوساينس، ميريدن، كونيتيكت، الولايات المتحدة الأمريكية). ثم حُسب استخدام الجلوكوز مع مراعاة النشاط النوعي للجلوكوز [5-3H]، وعدم اكتمال التوازن والخلفية، وتخفيف تركيز الجلوكوز [5-3H] إلى الجلوكوز غير المُسمّى، وكفاءة عداد الوميض. وُزنت البيانات وفقًا لكتلة أجزاء القلب.
بعد تجانس الأنسجة في تريزول، عُزل الحمض النووي الريبوزي من مقاطع القلب باستخدام طقم Qiagen miRNeasy Micro Kit رقم 210874 وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. أُجريت عمليات تحضير مكتبة RNAsec، والتسلسل، وتحليل البيانات على النحو التالي:
استُخدم ميكروغرام واحد من الحمض النووي الريبي (RNA) لكل عينة كمواد أولية لإعداد مكتبة الحمض النووي الريبي. أُنشئت مكتبات التسلسل باستخدام مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الريبي (RNA Library Preparation Kit) من شركة NEBNext UltraTM لشركة Illumina (NEB، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة، وأُضيفت رموز الفهرس إلى تسلسلات السمات لكل عينة. باختصار، نُقي mRNA من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام خرزات مغناطيسية مُرفقة بأليغنوكليوتيدات بولي-T. أُجريت عملية التجزئة باستخدام كاتيونات ثنائية التكافؤ عند درجة حرارة عالية في مُنظِّم تفاعل تخليق السلسلة الأولى (5X) من NEBNext. تم تخليق cDNA للسلسلة الأولى باستخدام بادئات سداسية عشوائية وإنزيم النسخ العكسي M-MuLV (RNase H-). ثم تم تخليق cDNA للسلسلة الثانية باستخدام بوليميراز الحمض النووي I وRNase H. تُحوَّل النتوءات المتبقية إلى نهايات غير حادة بواسطة نشاط إكسونوكلياز/بوليميراز. بعد تكوين أدينلة للطرف الثالث من قطعة الحمض النووي، يُربط بها مُحوّل NEBNext ذو بنية حلقية على شكل دبوس شعر لتحضيرها للتهجين. لاختيار قطع الحمض النووي التكميلي ذات الطول المُفضّل (150-200 زوج قاعدي)، نُقّيت قطع المكتبة باستخدام نظام AMPure XP (Beckman Coulter، بيفرلي، الولايات المتحدة الأمريكية). بعد ذلك، استُخدم 3 ميكرولتر من إنزيم USER (NEB، الولايات المتحدة الأمريكية) مع الحمض النووي التكميلي المُختار حسب الحجم والمُرتبط بمُحوّل لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، ثم لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة 95 درجة مئوية قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). أُجري تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بعد ذلك باستخدام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Phusion، وبادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل العالمي، وبادئات الفهرس (X). أخيرًا، نُقّيت منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (نظام AMPure XP) وقُيّمت جودة المكتبة باستخدام نظام Agilent Bioanalyzer 2100. ثم سُلسِلت مكتبة الحمض النووي التكميلي باستخدام مُسلسل Novaseq. حُوِّلت ملفات الصور الخام من Illumina إلى قراءات خام باستخدام استدعاء قاعدة CASAVA. تُخزَّن البيانات الخام في ملفات بتنسيق FASTQ(fq) تحتوي على تسلسلات القراءة وجودة القاعدة المقابلة. اختر HISAT2 لمطابقة قراءات التسلسل المُرشَّحة مع الجينوم المرجعي Sscrofa11.1. بشكل عام، يدعم HISAT2 الجينومات من أي حجم، بما في ذلك الجينومات التي يزيد حجمها عن 4 مليارات قاعدة، ويتم ضبط القيم الافتراضية لمعظم المعلمات. يمكن محاذاة قراءات الربط من بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA Seq) بكفاءة باستخدام HISAT2، وهو أسرع نظام متاح حاليًا، بدقة مماثلة أو أفضل من أي طريقة أخرى.
تعكس وفرة النسخ مباشرةً مستوى التعبير الجيني. تُقيَّم مستويات التعبير الجيني من خلال وفرة النسخ (عدد التسلسلات) المرتبطة بالجينوم أو الإكسونات. يتناسب عدد القراءات طرديًا مع مستويات التعبير الجيني، وطول الجين، وعمق التسلسل. حُسبت FPKM (عدد الشظايا لكل ألف زوج قاعدي من النسخ المُتسلسلة لكل مليون زوج قاعدي)، وحُددت القيم الاحتمالية للتعبير التفاضلي باستخدام حزمة DESeq2. ثم حسبنا معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) لكل قيمة احتمالية باستخدام طريقة بنياميني-هوشبرغ9 استنادًا إلى دالة R المُدمجة "p.adjust".
تم تحويل الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين المعزول من مقاطع القلب إلى الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين التكميلي بتركيز 200 نانوغرام/ميكرولتر باستخدام مزيج SuperScript IV Vilo Master من شركة Thermo (رقم الفهرس 11756050). أُجري تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي الكمي باستخدام صفيحة تفاعل شفافة من نوع Endura Plate Microamp ذات 384 بئرًا من شركة Applied Biosystems (رقم الفهرس 4483319) وشريط لاصق بصري من نوع Microamp (رقم الفهرس 4311971). يتكون مزيج التفاعل من 5 ميكرولتر من مزيج Taqman Fast Advanced Master (رقم الفهرس 4444557)، و0.5 ميكرولتر من بادئ Taqman، و3.5 ميكرولتر من الماء، مخلوطة لكل بئر. تم تشغيل دورات qPCR القياسية وتم قياس قيم CT باستخدام أداة PCR في الوقت الحقيقي Applied Biosystems Quantstudio 5 (وحدة 384 بئر؛ رقم المنتج A28135). تم شراء برايمرات Taqman من Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1)، PARP12 (Ss06908795_m1)، PKDCC (Ss06903874_m1)، CYGB (Ss06900188_m1)، RGL1 (Ss06868890_m1)، ACTN1 (Ss01009508_mH)، GATA4 (Ss03383805_u1)، GJA1 (Ss03374839_u1)، COL1A2 (Ss03375009_u1)، COL3A1 (Ss04323794_m1)، ACTA2 (Ss04245588_m1). تم تطبيع قيم CT لجميع العينات على الجين المنزلي GAPDH.
تم تقييم النشرة الإعلامية لـ NT-ProBNP باستخدام طقم NT-ProBNP (خنزير) (رقم الكتالوج MBS2086979، MyBioSource) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. باختصار، تمت إضافة 250 ميكرولتر من كل عينة ومعيار في نسختين إلى كل بئر. مباشرة بعد إضافة العينة، أضف 50 ميكرولتر من كاشف الاختبار A إلى كل بئر. رجّ الصفيحة برفق وأغلقها بمادة مانعة للتسرب. ثم حُضنت الأقراص عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، اسحب المحلول واغسل الآبار 4 مرات بـ 350 ميكرولتر من محلول الغسيل 1X، مع حضن محلول الغسيل لمدة دقيقة إلى دقيقتين في كل مرة. بعد ذلك، أضف 100 ميكرولتر من كاشف الاختبار B لكل بئر وأغلقها بمادة مانعة للتسرب. رُجّ القرص برفق وحُضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. اسحب المحلول واغسل الآبار خمس مرات باستخدام 350 ميكرولترًا من محلول الغسيل 1X. أضف 90 ميكرولترًا من محلول الركيزة إلى كل بئر، وأغلق الصفيحة. احضن الصفيحة عند 37 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة. أضف 50 ميكرولترًا من محلول الإيقاف إلى كل بئر. قُيست الصفيحة فورًا باستخدام قارئ صفيحة Cytation (BioTek) مضبوط على 450 نانومتر.
تم إجراء تحليلات الطاقة لاختيار أحجام المجموعة التي ستوفر طاقة تزيد عن 80% لاكتشاف تغيير مطلق بنسبة 10% في المعلمة مع معدل خطأ من النوع الأول بنسبة 5%. تم إجراء تحليلات الطاقة لاختيار أحجام المجموعة التي ستوفر طاقة تزيد عن 80% لاكتشاف تغيير مطلق بنسبة 10% في المعلمة مع معدل خطأ من النوع الأول بنسبة 5%. تم استخدام التحليل لاختيار مجموعة واسعة النطاق التي تشمل > 80% قوة للتوعية 10% تقدير مطلق معلمة بنسبة 5% من النوع I. تم إجراء تحليل الطاقة لاختيار أحجام المجموعات التي من شأنها أن توفر طاقة >80% لاكتشاف تغيير مطلق في المعلمات بنسبة 10% مع معدل خطأ من النوع الأول بنسبة 5%.进行功效分析以选择将提供> 80% من الماء المقطر 10% من الماء و5% من الفوسفات.进行功效分析以选择将提供> 80% من الماء المقطر 10% من الماء و5% من الفوسفات. تم التحقق من قوة التحليل لاختيار مجموعات كبيرة الحجم والتي يجب أن تكون > 80% قوة للتغطية 10% مطلقة معلمات التحسين ونسبة 5% من النوع الأول. تم إجراء تحليل الطاقة لاختيار حجم المجموعة الذي من شأنه أن يوفر طاقة أكبر من 80% لاكتشاف 10% من التغيير المطلق في المعلمات و5% من معدل الخطأ من النوع الأول.تم اختيار مقاطع الأنسجة عشوائيًا قبل التجربة. أُجريت جميع التحليلات دون أي شروط، ولم تُفكّك العينات إلا بعد تحليل جميع البيانات. استُخدم برنامج GraphPad Prism (سان دييغو، كاليفورنيا) لإجراء جميع التحليلات الإحصائية. بالنسبة لجميع الإحصائيات، تم اعتبار القيم الاحتمالية ذات دلالة إحصائية عند القيم <0.05. بالنسبة لجميع الإحصائيات، تم اعتبار القيم الاحتمالية ذات دلالة إحصائية عند القيم <0.05. لجميع الإحصائيات p-значения значимым по значения <0,05. بالنسبة لجميع الإحصائيات، تم اعتبار القيم الاحتمالية ذات دلالة إحصائية عند القيم <0.05.对于所有统计数据،p 值在值<0.05 时被认为是显着的.对于所有统计数据،p 值在值<0.05 时被认为是显着的. لجميع الإحصائيات p-значения значимым по значения <0,05. بالنسبة لجميع الإحصائيات، تم اعتبار القيم الاحتمالية ذات دلالة إحصائية عند القيم <0.05.أُجري اختبار t للطلاب ثنائي الذيل على البيانات بمقارنتين فقط. استُخدم تحليل التباين أحادي الاتجاه أو ثنائي الاتجاه لتحديد الدلالة الإحصائية بين مجموعات متعددة. عند إجراء اختبارات لاحقة، طُبق تصحيح توكي لمراعاة المقارنات المتعددة. لبيانات RNAsec اعتبارات إحصائية خاصة عند حساب FDR وp.adjust كما هو موضح في قسم الطرق.
لمزيد من المعلومات حول تصميم الدراسة، راجع ملخص تقرير أبحاث الطبيعة المرتبط بهذه المقالة.