شكرًا لزيارتكم موقع Nature.com. إصدار المتصفح الذي تستخدمونه يدعم CSS بشكل محدود. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح مُحدّث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). في هذه الأثناء، ولضمان استمرار الدعم، سنُقدّم الموقع بدون أنماط أو JavaScript.
طرق مناعية وطيف كتلي جديدة للتحليل المعقد للسكريات القليلة التعدد في قش الذرة المعالج مسبقًا بـ AFEX. تُعد الكتلة الحيوية الليغنوسليولوزية بديلاً مستدامًا للوقود الأحفوري، وتُستخدم على نطاق واسع لتطوير التقنيات الحيوية لإنتاج منتجات مثل الأغذية والأعلاف والوقود والمواد الكيميائية. يكمن سر هذه التقنيات في تطوير عمليات تنافسية من حيث التكلفة لتحويل الكربوهيدرات المعقدة الموجودة في جدران الخلايا النباتية إلى سكريات بسيطة مثل الجلوكوز والزيلوز والأرابينوز. ولأن الكتلة الحيوية الليغنوسليولوزية شديدة الصلابة، يجب إخضاعها لمعالجات حرارية كيميائية (مثل تقشير ألياف الأمونيا (AFEX)، والأحماض المخففة (DA)، والسوائل الأيونية (IL))، بالإضافة إلى معالجات بيولوجية (مثل التحلل المائي الإنزيمي والتخمير الميكروبي) معًا للحصول على المنتج المطلوب. مع ذلك، عند استخدام إنزيمات فطرية تجارية في عملية التحلل المائي، فإن 75-85% فقط من السكريات الذائبة المتكونة هي سكريات أحادية، بينما تكون نسبة 15-25% المتبقية عبارة عن سكريات قليلة التعدد قابلة للذوبان ومستعصية على الهضم، وهي غير متاحة دائمًا للكائنات الدقيقة. في السابق، نجحنا في عزل وتنقية سكريات قليلة التعدد قابلة للذوبان باستخدام مزيج من فصل الكربون وتراب الدياتومي وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم، كما درسنا خصائصها المثبطة للإنزيمات. وقد وجدنا أن السكريات القليلة التي تحتوي على بدائل حمض اليورونيك الميثيلي بدرجة بلمرة أعلى (DP) أصعب في المعالجة باستخدام مخاليط الإنزيمات التجارية مقارنةً بالسكريات القليلة التعدد منخفضة التعدد والمتعادلة. نُبلغ هنا عن استخدام عدة طرق إضافية، بما في ذلك تحديد أنماط الجليكانات باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAbs) الخاصة بجليكانات الكتلة الحيوية النباتية لتوصيف روابط الجليكانات في جدران الخلايا النباتية والمُحللات المائية الإنزيمية، والتأين بالامتصاص بالليزر بمساعدة المصفوفة، ومطياف الكتلة بزمن الطيران. يستخدم تحليل MALDI-TOF-MS قممًا تشخيصية مُفيدة للبنية، تُحصل عليها عن طريق التحليل الطيفي بعد التحلل الثانوي للأيونات السالبة، وكروماتوغرافيا الغاز، ومطياف الكتلة (GC-MS) لتوصيف روابط السكريات القليلة مع الاشتقاق وبدونه. ونظرًا لصغر حجم السكريات القليلة (DP 4-20)، يصعب استخدام هذه الجزيئات لربط الأجسام المضادة وحيدة النسيلة وتوصيفها. للتغلب على هذه المشكلة، طبقنا طريقة جديدة لتثبيت السكريات القليلة التعدد، تعتمد على اقتران البيوتين، وقد نجحت في وسم غالبية السكريات القليلة التعدد القابلة للذوبان في DP على سطح الصفيحة الدقيقة، والتي استُخدمت بعد ذلك في نظام أجسام مضادة وحيدة النسيلة عالي الإنتاجية لتحليل الربط النوعي. ستُسهّل هذه الطريقة الجديدة تطوير اختبارات جليكوميات عالية الإنتاجية وأكثر تطورًا في المستقبل، والتي يمكن استخدامها لعزل وتوصيف السكريات القليلة التعدد الموجودة في المؤشرات الحيوية لأغراض التشخيص.
الكتلة الحيوية الليغنوسليولوزية، المكونة من مواد زراعية وغابات وعشبية وخشبية، تُعدّ مادة خام محتملة لإنتاج منتجات حيوية، بما في ذلك الأغذية والأعلاف والوقود والمواد الكيميائية الأولية لإنتاج منتجات ذات قيمة أعلى1. تُحلَّل الكربوهيدرات (مثل السليلوز والهيميسليلوز) الموجودة في جدران الخلايا النباتية إلى سكريات أحادية عن طريق المعالجة الكيميائية والتحول الحيوي (مثل التحلل المائي الإنزيمي والتخمير الميكروبي). تشمل المعالجات المسبقة الشائعة تمدد ألياف الأمونيا (AFEX)، والحمض المخفف (DA)، والسائل الأيوني (IL)، والانفجار البخاري (SE)، والتي تستخدم مزيجًا من المواد الكيميائية والحرارة لتقليل إنتاج الليغنوسليولوز عن طريق فتح جدران الخلايا النباتية3،4. صلابة المادة،5. يُجرى التحلل المائي الإنزيمي عند حمولة عالية من المواد الصلبة باستخدام إنزيمات تجارية نشطة تحتوي على الكربوهيدرات (CAZymes)، والتخمير الميكروبي باستخدام الخميرة أو البكتيريا المعدلة وراثيًا لإنتاج وقود ومواد كيميائية حيوية6.
تتكون الكازيمات في الإنزيمات التجارية من خليط معقد من الإنزيمات التي تكسر روابط الكربوهيدرات والسكريات المعقدة تآزريًا لتكوين سكريات أحادية2،7. وكما ذكرنا سابقًا، فإن الشبكة المعقدة من البوليمرات العطرية لليجنين مع الكربوهيدرات تجعلها شديدة التعقيد، مما يؤدي إلى عدم اكتمال تحويل السكر، وتراكم 15-25% من السكريات قليلة التعدد التي لا تُنتج أثناء التحلل المائي الإنزيمي للكتلة الحيوية المعالجة مسبقًا. تُعد هذه مشكلة شائعة في مختلف طرق المعالجة المسبقة للكتلة الحيوية. ومن أسباب هذا الاختناق تثبيط الإنزيم أثناء التحلل المائي، أو غياب أو انخفاض مستويات الإنزيمات الأساسية اللازمة لكسر روابط السكر في الكتلة الحيوية النباتية. سيساعدنا فهم تركيب السكريات وخصائصها الهيكلية، مثل روابط السكر في السكريات قليلة التعدد، على تحسين تحويل السكر أثناء التحلل المائي، مما يجعل عمليات التكنولوجيا الحيوية تنافسية من حيث التكلفة مع المنتجات المشتقة من البترول.
يُعد تحديد بنية الكربوهيدرات أمرًا صعبًا ويتطلب مزيجًا من الطرق، مثل الكروماتوغرافيا السائلة (LC)11،12، والتصوير بالرنين المغناطيسي النووي (NMR)13، والرحلان الكهربائي الشعري (CE)14،15،16، ومطياف الكتلة (MS)17. 18. تُعد طرق مطياف الكتلة، مثل مطياف الكتلة بزمن الطيران مع الامتزاز بالليزر والتأين باستخدام مصفوفة (MALDI-TOF-MS)، طريقة متعددة الاستخدامات لتحديد بنية الكربوهيدرات. في الآونة الأخيرة، استُخدم مطياف الكتلة المترادف الناتج عن التفكك المُستحث بالتصادم (CID) لمركبات إضافة أيونات الصوديوم على نطاق واسع لتحديد البصمات المقابلة لمواضع ارتباط السكريات القليلة، والتكوينات الأنومرية، والتسلسلات، ومواضع التفرع 20، 21.
يُعد تحليل الجليكان أداةً ممتازةً لتحديد الروابط الكربوهيدراتية بدقة22. تستخدم هذه الطريقة أجسامًا مضادة وحيدة النسيلة (mAbs) موجهة إلى جليكان جدار الخلية النباتية كمسبار لفهم روابط الكربوهيدرات المعقدة. يتوفر أكثر من 250 جسمًا مضادًا وحيد النسيلة حول العالم، مصممةً ضد أنواع مختلفة من السكريات القليلة التعدد الخطية والمتفرعة باستخدام أنواع مختلفة من السكريات24. وقد استُخدمت العديد من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة على نطاق واسع لتوصيف بنية وتركيب وتعديلات جدار الخلية النباتية، نظرًا لوجود اختلافات كبيرة تبعًا لنوع الخلية النباتية، والعضو، والعمر، ومرحلة النمو، وبيئة النمو25،26. وفي الآونة الأخيرة، استُخدمت هذه الطريقة لفهم مجموعات الحويصلات في الأنظمة النباتية والحيوانية، وأدوارها في نقل الجليكان، كما هو محدد بواسطة العلامات دون الخلوية، ومراحل النمو، أو المحفزات البيئية، ولتحديد النشاط الأنزيمي. تتضمن بعض الهياكل المختلفة للجليكانات والزيلانات التي تم تحديدها البكتين (P)، والزيلان (X)، والمنان (M)، والزيلوجلوكان (XylG)، والجلوكان الرابطة المختلطة (MLG)، والأرابينوكسيلان (ArbX)، والجالاكتومانان (GalG)، وحمض الجلوكورونيك-الأرابينوكسيلان (GArbX)، والأرابينو-جالاكتان (ArbG)29.
مع ذلك، ورغم كل هذه الجهود البحثية، لم تُركز سوى دراسات قليلة على طبيعة تراكم السكريات قليلة التعدد أثناء التحلل المائي بحمولة مواد صلبة عالية (HSL)، بما في ذلك إطلاق السكريات قليلة التعدد، وتغيرات طول السلسلة قليلة التعدد أثناء التحلل المائي، ومختلف بوليمرات DP منخفضة التعدد، ومنحنياتها. توزيعات 30،31،32. في الوقت نفسه، على الرغم من أن تحليل الجليكان أثبت فائدته في إجراء تحليل شامل لبنية الجليكان، إلا أنه من الصعب تقييم السكريات قليلة التعدد القابلة للذوبان في الماء منخفضة التعدد باستخدام طرق الأجسام المضادة. السكريات قليلة التعدد ذات الوزن الجزيئي الأقل من 5-10 كيلو دالتون لا ترتبط بألواح ELISA 33،34، وتُزال قبل إضافة الأجسام المضادة.
هنا، ولأول مرة، نُجري اختبار ELISA على صفائح مُغلفة بالأفيدين باستخدام أجسام مضادة وحيدة النسيلة، يجمع بين عملية بيوتينلة أحادية الخطوة للسكريات قليلة السكاريد القابلة للذوبان المقاومة، وتحليل الجليكوم. وقد تم التحقق من صحة نهجنا في تحليل الجليكوم من خلال تحليل روابط السكريات قليلة السكاريد التكميلية باستخدام تقنيات MALDI-TOF-MS وGC-MS، وذلك باستخدام اشتقاق ثلاثي ميثيل سيليل (TMS) لتركيبات السكر المُحلل. ويمكن تطوير هذا النهج المبتكر كطريقة عالية الإنتاجية في المستقبل، وتطبيقه على نطاق أوسع في الأبحاث الطبية الحيوية.
تؤثر التعديلات ما بعد الترجمة للإنزيمات والأجسام المضادة، مثل الجليكوزيل،36 على نشاطها البيولوجي. على سبيل المثال، تلعب التغيرات في جليكوزيل بروتينات المصل دورًا مهمًا في التهاب المفاصل الالتهابي، وتُستخدم كعلامات تشخيصية37. وقد أُبلغ في الأدبيات عن ظهور أنواع مختلفة من الجليكوزيل بسهولة في مجموعة متنوعة من الأمراض، بما في ذلك الأمراض الالتهابية المزمنة في الجهاز الهضمي والكبد، والالتهابات الفيروسية، وسرطان المبيض والثدي والبروستات38،39،40. إن فهم بنية الجليكوزيل باستخدام طرق ELISA القائمة على الأجسام المضادة للجليكانات سيزيد من الثقة في تشخيص المرض دون الحاجة إلى استخدام طرق التصلب المتعدد المعقدة.
أظهرت دراستنا السابقة أن السكريات القليلة التعددة العنيدة بقيت دون تحلل مائي بعد المعالجة المسبقة والتحلل الإنزيمي (الشكل 1). في عملنا المنشور سابقًا، طورنا طريقة استخلاص بالفحم النشط في الطور الصلب لعزل السكريات القليلة التعددة من محلول نفايات الذرة المعالج مسبقًا بـ AFEX (ACSH)8. بعد الاستخلاص والفصل الأوليين، تمت تجزئة السكريات القليلة التعددة بشكل أكبر باستخدام كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي (SEC) وجمعها حسب الوزن الجزيئي. تم تحليل مونومرات وقليلات السكريات الناتجة عن معالجات مسبقة مختلفة عن طريق تحليل تركيب السكر. عند مقارنة محتوى قليلات السكريات التي تم الحصول عليها بطرق معالجة مسبقة مختلفة، فإن وجود قليلات التعددة العنيدة يمثل مشكلة شائعة في تحويل الكتلة الحيوية إلى سكريات أحادية، ويمكن أن يؤدي إلى انخفاض في إنتاج السكر بنسبة لا تقل عن 10-15%، وحتى 18%. الولايات المتحدة. تُستخدم هذه الطريقة لمزيد من الإنتاج واسع النطاق لكسور قليلات التعدد. تم استخدام ACH الناتج وكسوره اللاحقة ذات الأوزان الجزيئية المختلفة كمواد تجريبية لتوصيف السكريات القليلة في هذا العمل.
بعد المعالجة المسبقة والتحلل المائي الإنزيمي، بقيت السكريات القليلة المقاومة دون تحلل مائي. (أ) طريقة فصل السكريات القليلة، حيث تُعزل السكريات القليلة من مُحلل قش الذرة المُعالج مسبقًا بـ AFEX (ACSH) باستخدام طبقة مُعبأة من الكربون النشط والتراب الدياتومي؛ (ب) طريقة فصل السكريات القليلة. فُصلت السكريات القليلة لاحقًا باستخدام كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي (SEC)؛ (ج) مونومرات السكريات القليلة المُطلقة من معالجات مسبقة مُختلفة (حمض مُخفف: DA، سائل أيوني: IL وAFEX). ظروف التحلل المائي الأنزيمي: تحميل عالي للمواد الصلبة بنسبة 25% (وزن/وزن) (حوالي 8% تحميل جلوكان)، تحلل مائي لمدة 96 ساعة، تحميل إنزيم تجاري بنسبة 20 ملغ/غرام (نسبة Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) و(د) مونومرات السكر والقليلومرات من الجلوكوز والزيلوز والعربينوز المنبعثة من قش الذرة المعالج مسبقًا بـ AFEX (ACS).
أثبت تحليل الجليكان أنه أداة فعّالة لإجراء تحليل هيكلي شامل للجليكانات في المستخلصات المعزولة من بقايا الكتلة الحيوية الصلبة. ومع ذلك، فإن تمثيل السكريات القابلة للذوبان في الماء ضعيف باستخدام هذه الطريقة التقليدية41، نظرًا لصعوبة تثبيت السكريات قليلة الوزن الجزيئي على ألواح ELISA، وغسلها قبل إضافة الأجسام المضادة. لذلك، لربط الأجسام المضادة وتوصيفها، استُخدمت طريقة البيوتين أحادية الخطوة لتغليف السكريات قليلة التعدد القابلة للذوبان وغير المتوافقة على ألواح ELISA المغلفة بالأفيدين. اختُبرت هذه الطريقة باستخدام ACSH الذي أنتجناه سابقًا، ونسبة مئوية بناءً على وزنه الجزيئي (أو درجة البلمرة، DP). استُخدمت البيوتين أحادية الخطوة لزيادة ألفة ربط السكريات قليلة التعدد عن طريق إضافة بيوتين-LC-هيدرازيد إلى الطرف المختزل للكربوهيدرات (الشكل 2). في المحلول، تتفاعل مجموعة الهيميا أسيتال عند الطرف المختزل مع مجموعة الهيدرازيد في بيوتين-LC-هيدرازيد لتكوين رابطة هيدرازون. بوجود عامل الاختزال NaCNBH3، تُختزل رابطة الهيدرازون إلى منتج نهائي بيوتيني مستقر. مع تعديل الطرف المختزل للسكر، أصبح من الممكن ربط السكريات قليلة التعدد منخفضة التعدد بألواح ELISA، وقد تم ذلك في دراستنا على ألواح مغلفة بالأفيدين باستخدام أجسام مضادة وحيدة النسيلة مستهدفة بالجليكان.
فحص الأجسام المضادة وحيدة النسيلة باستخدام اختبار الإليزا (ELISA) للكشف عن السكريات قليلة التعدد البيوتينية. هنا (أ) يُظهر الجمع بين البيوتين والسكاريد قليلة التعدد، ثم فحص الإليزا باستخدام أجسام مضادة وحيدة النسيلة موجهة للجليكان على صفائح مغلفة بالنيوترافيدين، و(ب) يُظهر إجراءً من خطوة واحدة لبيوتين نواتج التفاعل.
أُضيفت بعد ذلك ألواح مُغلفة بالأفيدين تحتوي على أجسام مضادة مُقترنة بسكريات قليلة إلى الأجسام المضادة الأولية والثانوية، وغُسلت في وسط حساس للضوء والوقت. بعد اكتمال ارتباط الأجسام المضادة، أُضيفت ركيزة TMB لحضن الألواح. أُوقف التفاعل أخيرًا باستخدام حمض الكبريتيك. حُللت الألواح المُحضنة باستخدام قارئ ELISA لتحديد قوة ارتباط كل جسم مضاد، وذلك للكشف عن الارتباط المتبادل الخاص بالأجسام المضادة. لمزيد من التفاصيل ومعايير التجربة، يُرجى مراجعة قسم "المواد والطرق".
نُظهر فائدة هذه الطريقة المُطوّرة حديثًا في تطبيقات مُحددة من خلال توصيف السكريات القليلة الذائبة الموجودة في ACSH، وكذلك في كسور السكريات القليلة الخام والمُنقّاة المعزولة من مُحللات الليغنوسليولوز. وكما هو مُبين في الشكل 3، فإن أكثر الزيلانات المُستبدلة بالبروتينات شيوعًا، والتي تم تحديدها في ACSH باستخدام طرق تحليل الغليكوم المُؤَسَّل بيولوجيًا، هي عادةً أرابينوغالاكتانات يورونيك (U) أو ميثيلورونيك (MeU) وبكتينية. وقد وُجد معظمها أيضًا في دراستنا السابقة حول تحليل الغليكانات في المواد الصلبة غير المُحَلَّلة (UHS)43.
الكشف عن مُستضدات السكريات قليلة التعدد المقاومة باستخدام جسم مضاد وحيد النسيلة موجه نحو غليكان جدار الخلية. الجزء "المحايد" هو جزء ACN، والجزء "الحمضي" هو جزء FA. تشير الألوان الحمراء الزاهية على خريطة الحرارة إلى محتوى أعلى من المُستضد، بينما تشير الألوان الزرقاء الزاهية إلى خلفية فارغة. تستند قيم الألوان على المقياس إلى قيم OD الخام للتركيبات N=2. تظهر المُستضدات الرئيسية التي تعرفت عليها الأجسام المضادة على اليمين.
لم تتمكن أكثر إنزيمات السليلوز شيوعًا في خليط الإنزيمات التجارية المختبر، والذي يتضمن أكثر الإنزيمات التجارية شيوعًا، من شق هذه التراكيب غير السليلوزية. لذلك، يلزم وجود إنزيمات مساعدة جديدة لتحللها المائي. وبدون الإنزيمات الإضافية غير السليلوزية الضرورية، تمنع هذه الروابط غير السليلوزية التحول الكامل إلى سكريات أحادية، حتى لو تحللت بوليمرات السكر الأصلية على نطاق واسع إلى أجزاء أقصر، ثم أُذيبت باستخدام خلائط إنزيمية تجارية.
أظهرت دراسة أخرى لتوزيع الإشارة وقوة ارتباطها أن النمط الرابط كان أقل في كسور سكر DP العالية (A، B، C، DP حتى 20+) منها في كسور DP المنخفضة (D، E، F، DP) في ثنائيات الترابط) (الشكل 1). تكون الشظايا الحمضية أكثر شيوعًا في النمط غير السليلوزية منها في الشظايا المحايدة. تتوافق هذه الظواهر مع النمط الذي لوحظ في دراستنا السابقة، حيث كانت جزيئات DP العالية والحمضية أكثر مقاومة للتحلل المائي الأنزيمي. لذلك، يمكن أن يساهم وجود النمط الرابط للجليكان غير السليلوزية واستبدالات U وMeU بشكل كبير في استقرار السكريات القليلة. تجدر الإشارة إلى أن كفاءة الارتباط والكشف يمكن أن تكون مشكلة بالنسبة للسكريات القليلة DP المنخفضة، خاصةً إذا كان النمط الرابط عبارة عن سكر قليل ثنائي أو ثلاثي. يمكن اختبار ذلك باستخدام السكريات القليلة التعدد التجارية ذات الأطوال المختلفة، حيث يحتوي كل منها على نمط واحد فقط يرتبط بجسم مضاد وحيد النسيلة محدد.
وهكذا، كشف استخدام الأجسام المضادة الخاصة بالبنية عن أنواع معينة من الروابط المقاومة. وبناءً على نوع الجسم المضاد المستخدم، ونمط الربط المناسب، وقوة الإشارة التي يُنتجها (الأكثر والأقل وفرة)، يمكن تحديد إنزيمات جديدة وإضافتها بشكل شبه كمي إلى خليط الإنزيمات لتحقيق تحويل سكري أكثر اكتمالًا. وباستخدام تحليل قليلات السكاريد ACSH كمثال، يُمكننا إنشاء قاعدة بيانات لروابط الجليكان لكل مادة من مواد الكتلة الحيوية. تجدر الإشارة هنا إلى ضرورة مراعاة اختلاف ألفة الأجسام المضادة، فإذا كانت ألفتها غير معروفة، فسيؤدي ذلك إلى بعض الصعوبات عند مقارنة إشارات الأجسام المضادة المختلفة. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون مقارنة الروابط الجليكان هي الأنسب بين عينات الجسم المضاد نفسه. ويمكن بعد ذلك ربط هذه الروابط المقاومة بقاعدة بيانات CAZyme، والتي يُمكننا من خلالها تحديد الإنزيمات، واختيار الإنزيمات المرشحة، واختبار إنزيمات كسر الروابط، أو تطوير أنظمة ميكروبية للتعبير عن هذه الإنزيمات لاستخدامها في المصافي الحيوية44.
لتقييم كيفية تكامل الطرق المناعية مع الطرق البديلة لتوصيف السكريات قليلة الوزن الجزيئي الموجودة في مُحللات الليغنوسليولوز، أجرينا تحليل MALDI (الشكل 4، S1-S8) وتحليل السكريات المشتقة من TMS استنادًا إلى GC-MS على نفس اللوحة (الشكل 5) جزء السكريات قليلة التعدد. يُستخدم MALDI لمقارنة ما إذا كان التوزيع الكتلي لجزيئات السكريات قليلة التعدد يطابق البنية المقصودة. يوضح الشكل 4 التركيز الكتلي للمكونين المتعادلين ACN-A وACN-B. أكد تحليل ACN-A نطاقًا من سكريات البنتوز يتراوح من DP 4-8 (الشكل 4) إلى DP 22 (الشكل S1)، والتي تتوافق أوزانها مع سكريات قليلة التعدد MeU-xylan. أكد تحليل ACN-B سلسلة البنتوز والجلوكوزيلان مع DP 8-15. في المواد التكميلية، مثل الشكل S3، تُظهر خرائط توزيع كتلة الجزء الحمضي لـ FA-C نطاقًا من سكريات البنتوز المُستبدلة بـ (Me)U، مع قيمة DP تتراوح بين 8 و15، وهي متوافقة مع الزيلان المُستبدلة الموجودة في فحص الأجسام المضادة وحيدة النسيلة القائم على ELISA. كما أن النمط الظاهري مُتوافق.
طيف MALDI-MS للسكريات القليلة التعدد القابلة للذوبان غير المتوافقة الموجودة في ACS. هنا، (أ) كسور ACN-A منخفضة الوزن تحتوي على حمض اليورونيك الميثيلي (DP 4-8) مستبدلة بسكريات قليلة التعدد الجلوكووكسيلان، و(ب) زيلان ACN-B وسكريات قليلة التعدد الميثيلي لحمض اليورونيك مستبدلة بسكريات قليلة التعدد الجلوكووكسيلان (DP 8-15).
تحليل تركيب بقايا الجليكان في السكريات القليلة المقاومة. هنا (أ) تركيب سكريات TMS لأجزاء مختلفة من السكريات القليلة المقاومة، تم الحصول عليها باستخدام تحليل كروماتوغرافيا الغاز-مطياف الكتلة (GC-MS). (ب) هياكل السكريات المختلفة المشتقة من TMS والموجودة في السكريات القليلة المقاومة. ACN - جزء أسيتونتريل يحتوي على سكريات قليلة متعادلة، وFA - جزء حمض الفيروليك الذي يحتوي على سكريات قليلة حمضية.
تم التوصل إلى استنتاج مثير للاهتمام آخر من تحليل LC-MS لجزء السكريات القليلة، كما هو موضح في الشكل S9 (يمكن الاطلاع على الطرق في الملحق الإلكتروني). لوحظت شظايا من مجموعات الهكسوز و-OAc بشكل متكرر أثناء ربط جزء ACN-B. لا يؤكد هذا الاكتشاف التجزئة الملحوظة في تحليل الجليكوم وMALDI-TOF فحسب، بل يوفر أيضًا معلومات جديدة حول مشتقات الكربوهيدرات المحتملة في الكتلة الحيوية الليغنوسليلوزية المعالجة مسبقًا.
قمنا أيضًا بتحليل تركيبة السكر في جزء السكريات القليلة باستخدام اشتقاق السكر بتقنية TMS. باستخدام تقنية GC-MS، حددنا تركيب السكريات العصبية (غير المشتقة) والحمضية (GluA وGalA) في جزء السكريات القليلة (الشكل 5). يوجد حمض الجلوكورونيك في المكونين الحمضيين C وD، بينما يوجد حمض الجلاكتورونيك في المكونين الحمضيين A وB، وكلاهما مكونان عاليا DP للسكريات الحمضية. لا تؤكد هذه النتائج بيانات ELISA وMALDI فحسب، بل تتوافق أيضًا مع دراساتنا السابقة حول تراكم السكريات القليلة. لذلك، نعتقد أن الطرق المناعية الحديثة التي تستخدم البيوتينلة للسكريات القليلة وفحص ELISA اللاحق كافية للكشف عن السكريات القليلة المقاومة للذوبان في عينات بيولوجية مختلفة.
بما أن طرق فحص الأجسام المضادة وحيدة النسيلة القائمة على الإليزا قد تم التحقق من صحتها بطرق مختلفة، فقد أردنا مواصلة استكشاف إمكانات هذه الطريقة الكمية الجديدة. تم شراء نوعين تجاريين من السكريات القليلة التعدد، هما زيلوهكساسكاريد قليل التعدد (XHE) و23-α-L-أرابينوفورانوسيل-زيلوتريوز (A2XX)، واختبارهما باستخدام نهج جديد للأجسام المضادة وحيدة النسيلة يستهدف غليكان جدار الخلية. يوضح الشكل 6 ارتباطًا خطيًا بين إشارة الارتباط البيوتيني وتركيز اللوغاريتم لتركيز قليل التعدد، مما يشير إلى احتمال وجود نموذج امتزاز لانجموير. من بين الأجسام المضادة وحيدة النسيلة، ارتبطت CCRC-M137، وCCRC-M138، وCCRC-M147، وCCRC-M148، وCCRC-M151 بـ XHE، وارتبطت CCRC-M108، وCCRC-M109، وLM11 بـ A2XX على نطاق يتراوح بين 1 نانومتر و100 نانو. ونظرًا لمحدودية توفر الأجسام المضادة خلال التجربة، أُجريت تجارب محدودة على كل تركيز من السكريات قليلة التعدد. تجدر الإشارة هنا إلى أن بعض الأجسام المضادة تتفاعل بشكل مختلف تمامًا مع نفس السكريات قليلة التعدد كركيزة، ويفترض أن ذلك يعود إلى ارتباطها بنظائر متباينة اختلافًا طفيفًا، وقد يكون لها ألفة ارتباط مختلفة جدًا. ستكون آليات وآثار التحديد الدقيق للنظائر المتماثلة أكثر تعقيدًا بكثير عند تطبيق نهج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الجديد على عينات حقيقية.
استُخدم نوعان من السكريات القليلة التعدد التجارية لتحديد مدى الكشف عن مختلف الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المستهدفة للجليكان. هنا، تشير الارتباطات الخطية مع التركيز اللوغاريتمي لتركيز السكريات القليلة التعدد إلى أنماط امتزاز لانجماير لـ (أ) XHE مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة و(ب) A2XX مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. تشير النُسَخ المقابلة إلى هياكل السكريات القليلة التعدد التجارية المستخدمة كركائز في الاختبار.
يُعد استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المستهدفة بالجليكان (تحليل الجليكوكومات أو فحص الأجسام المضادة وحيدة النسيلة القائم على مقايسة الإليزا) أداةً فعّالة للتوصيف المتعمق لمعظم الجليكانات الرئيسية في جدار الخلية التي تُشكل الكتلة الحيوية النباتية. ومع ذلك، لا يُميز تحليل الجليكان التقليدي إلا الجليكانات الأكبر حجمًا في جدار الخلية، نظرًا لعدم تثبيت معظم السكريات القليلة بكفاءة على ألواح مقايسة الإليزا. في هذه الدراسة، حُلّلت قش الذرة المُعالج مسبقًا بـ AFEX إنزيميًا بنسبة عالية من المواد الصلبة. استُخدم تحليل السكر لتحديد تركيب الكربوهيدرات المقاومة في جدار الخلية في المُحلل المائي. ومع ذلك، فإن تحليل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة للسكريات القليلة الأصغر في المُحللات المائية لا يحظى بالتقدير الكافي، وهناك حاجة إلى أدوات إضافية لتثبيت السكريات القليلة بفعالية على ألواح مقايسة الإليزا.
نُقدّم هنا طريقةً جديدةً وفعّالةً لتثبيت السكريات قليلة التعدد لفحص الأجسام المضادة وحيدة النسيلة، وذلك من خلال الجمع بين بيوتينيل السكريات قليلة التعدد، متبوعًا بفحص ELISA على صفائح مُغطاة بـ NeutrAvidin™. أظهرت السكريات قليلة التعدد المُثبّتة بيوتينيل ألفةً كافيةً للجسم المضاد، مما يُمكّن من الكشف السريع والفعال عن السكريات قليلة التعدد المقاومة. وقد أكّد تحليل تركيب هذه السكريات قليلة التعدد العنيدة باستخدام مطياف الكتلة نتائج هذا النهج الجديد للفحص المناعي. وبالتالي، تُبيّن هذه الدراسات أن الجمع بين بيوتينيل السكريات قليلة التعدد وفحص ELISA باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المُستهدفة بالجليكان يُمكن استخدامه للكشف عن الروابط المتشابكة في السكريات قليلة التعدد، ويُمكن تطبيقه على نطاق واسع في دراسات كيميائية حيوية أخرى تُميّز بنية السكريات قليلة التعدد.
تُعد طريقة تحليل الجليكانات القائمة على البيوتين أول تقرير قادر على دراسة الروابط الكربوهيدراتية المقاومة للسكريات قليلة التعدد القابلة للذوبان في الكتلة الحيوية النباتية. وهذا يُساعد على فهم سبب صعوبة تماسك بعض أجزاء الكتلة الحيوية عند إنتاج الوقود الحيوي. تُسدّ هذه الطريقة ثغرة مهمة في طرق تحليل الجليكانات، وتُوسّع نطاق تطبيقها ليشمل نطاقًا أوسع من المواد الأساسية، بما يتجاوز السكريات قليلة التعدد النباتية. في المستقبل، قد نستخدم الروبوتات في البيوتين، ونستخدم الطريقة التي طورناها لتحليل العينات عالي الإنتاجية باستخدام تقنية الإليزا (ELISA).
تم حصاد قش الذرة (CS) المزروع من بذور هجينة من نوع بايونير 33A14 عام 2010 من مزارع كرامر في راي، كولورادو. وبإذن من مالك الأرض، يمكن استخدام هذه الكتلة الحيوية في الأبحاث. تم تخزين العينات جافة بنسبة رطوبة < 6% في أكياس بلاستيكية محكمة الغلق في درجة حرارة الغرفة. تم تخزين العينات جافة بنسبة رطوبة < 6% في أكياس بلاستيكية محكمة الغلق في درجة حرارة الغرفة. يتم طحن المواد الغذائية عند انخفاض درجة الحرارة < 6% في العبوات بدرجة حرارة معتدلة. تم تخزين العينات جافة عند نسبة رطوبة أقل من 6% في أكياس بسحّاب في درجة حرارة الغرفة.يمكن أن تكون نسبة التخفيض أقل من 6%.نسبة التخفيض في الوزن أقل من 6% المواد المعبأة في العبوات آمنة تمامًا عند درجة حرارة منخفضة < 6%. يتم تخزين العينات في أكياس بسحاب في درجة حرارة الغرفة مع رطوبة < 6٪.التزمت الدراسة بالمبادئ التوجيهية المحلية والوطنية. أُجري التحليل التركيبي باستخدام بروتوكول المختبر الوطني للطاقة المتجددة (NREL). وتبين أن التركيبة تحتوي على 31.4% جلوكان، و18.7% زيلان، و3.3% أرابينان، و1.2% غالاكتان، و2.2% أسيتيل، و14.3% ليجنين، و1.7% بروتين، و13.4% رماد.
Cellic® CTec2 (138 ملغ بروتين/مل، رقم الدفعة VCNI 0001) هو مزيج معقد من السليولاز، وبيتا جلوكوزيداز، وCellic® HTec2 (157 ملغ بروتين/مل، رقم الدفعة VHN00001) من شركة Novozymes (فرانكلينتون، كارولاينا الشمالية، الولايات المتحدة الأمريكية). تبرعت شركة DuPont Industrial Biosciences (بالو ألتو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) بـ Multifect Pectinase® (72 ملغ بروتين/مل)، وهو مزيج معقد من إنزيمات تحلل البكتين. حُددت تركيزات بروتين الإنزيم بتقدير محتوى البروتين (وطرح مساهمة النيتروجين غير البروتيني) باستخدام تحليل النيتروجين Kjeldahl (طريقة AOAC 2001.11، شركة Dairy One Cooperative Inc.، إيثاكا، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء تراب الدياتومي 545 من شركة EMD Millipore (بيليريكا، ماساتشوستس). تم شراء الكربون المنشط (DARCO، حبيبات 100 شبكة)، وAvicel (PH-101)، وزيلان الزان، وجميع المواد الكيميائية الأخرى من Sigma-Aldrich (سانت لويس، ميزوري).
أُجريت المعالجة المسبقة لـ AFEX في GLBRC (مختبر أبحاث تحويل الكتلة الحيوية، جامعة ولاية ميشيغان، لانسينغ، ميشيغان، الولايات المتحدة الأمريكية). أُجريت المعالجة المسبقة عند درجة حرارة 140 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. 46 زمن إقامة بنسبة 1:1 من الأمونيا اللامائية إلى الكتلة الحيوية عند تحميل 60% (وزن/وزن) في مفاعل دفعات من الفولاذ المقاوم للصدأ (شركة بار إنسترومنتس). استغرقت العملية 30 دقيقة. تم رفع درجة حرارة المفاعل إلى 140 درجة مئوية، وتم إطلاق الأمونيا بسرعة، مما سمح للكتلة الحيوية بالعودة بسرعة إلى درجة حرارة الغرفة. كان تركيب قش الذرة المعالج مسبقًا بـ AFEX (ACS) مشابهًا لتركيب قش الذرة غير المعالج (UT-CS).
تم تحضير مادة ACSH عالية المواد الصلبة بتركيز 25% (وزن/وزن) (بنسبة 8% تقريبًا من الدكسترين) كمادة أولية لإنتاج السكريات القليلة التعدد على نطاق واسع. أُجري التحليل الإنزيمي لـ ACS باستخدام خليط إنزيمي تجاري يتضمن: Cellic® Ctec2 بتركيز 10 ملغ بروتين/غرام جلوكان (في الكتلة الحيوية المعالجة مسبقًا)، وHtec2 (Novozymes، فرانكلينتون، كارولاينا الشمالية)، و5 ملغ بروتين/غرام جلوكان، وMultifect Pectinase (Genencor Inc، الولايات المتحدة الأمريكية). (5 ملغ بروتين/غرام ديكستران). أُجري التحليل الإنزيمي في مفاعل حيوي سعة 5 لترات، بحجم تشغيل 3 لترات، ودرجة حموضة 4.8، ودرجة حرارة 50 درجة مئوية، وسرعة دوران 250 دورة في الدقيقة. بعد التحلل المائي لمدة 96 ساعة، جُمعت المادة المُحللة بالطرد المركزي بسرعة 6000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة، ثم بسرعة 14000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة لإزالة المواد الصلبة غير المُحللة. ثم خضعت المادة المُحللة للترشيح المعقم عبر دورق ترشيح بقطر 0.22 مم. حُفظت المادة المُحللة المُرشحة في زجاجات معقمة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، ثم فُككت على الكربون.
تحليل تركيب عينات الكتلة الحيوية المستندة إلى المستخلص وفقًا لإجراءات التحليل المختبري الخاصة بالمختبر الوطني للطاقة المتجددة: إعداد العينات لتحليل التركيب (NREL/TP-510-42620) وتحديد الكربوهيدرات الهيكلية واللجنين في الكتلة الحيوية (NREL/TP-510 – 42618)47.
أُجري تحليل قليل السكاريد لتيار المُحلل المائي على مقياس 2 مل باستخدام طريقة التحليل المائي الحمضي باستخدام الأوتوكلاف. خُلطت عينة المُحلل المائي مع 69.7 ميكرولتر من حمض الكبريتيك 72% في أنبوب زراعة ذي غطاء لولبي سعة 10 مل، وحُضنت لمدة ساعة على طاولة عمل عند درجة حرارة 121 درجة مئوية، ثم بُرِّدت على الثلج، ثم رشِّحت في قارورة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC). حُدِّد تركيز قليل السكاريد بطرح تركيز السكريات الأحادية في العينة غير المُحللة من تركيز السكر الكلي في العينة المُحللة بالحمض.
تم تحليل تركيزات الجلوكوز والزيلوز والأرابينوز في الكتلة الحيوية المُحللة بالحمض باستخدام نظام شيمادزو HPLC المُجهز بجهاز أخذ عينات تلقائي، وسخان عمودي، ومضخة متساوية الضغط، وكاشف معامل الانكسار على عمود Bio-Rad Aminex HPX-87H. حُفظ العمود عند درجة حرارة 50 درجة مئوية، ثم استُخرج بتدفق 0.6 مل/دقيقة من محلول H2SO4 بتركيز 5 ملي مولار في الماء.
تم تخفيف السائل العلوي المُحلل بالماء وتحليله لتحديد محتوى المونومر والسكريات قليلة التعدد. حُللت السكريات أحادية المونومر الناتجة عن التحلل المائي الإنزيمي باستخدام جهاز HPLC مزود بعمود Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P وعمود واقي من الرماد. تم الحفاظ على درجة حرارة العمود عند 80 درجة مئوية، واستُخدم الماء كطور متحرك بمعدل تدفق 0.6 مل/دقيقة. تم تحديد السكريات قليلة التعدد بالتحلل المائي في حمض مخفف عند درجة حرارة 121 درجة مئوية وفقًا للطرق الموضحة في المراجع 41 و48 و49.
تم إجراء تحليل السكاريد على بقايا الكتلة الحيوية الخام والمعالجة مسبقًا بـ AFEX وجميع بقايا الكتلة الحيوية غير المتحللة (بما في ذلك إنتاج مستخلصات جدار الخلية التسلسلية وفحص الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الخاصة بها) باستخدام الإجراءات الموصوفة سابقًا 27 و 43 و 50 و 51. لتحليل الجليكوم، يتم تحضير بقايا غير قابلة للذوبان في الكحول من مادة جدار الخلية النباتية من بقايا الكتلة الحيوية وتعريضها للاستخراج التسلسلي باستخدام كواشف عدوانية بشكل متزايد مثل أكسالات الأمونيوم (50 ملي مولار) وكربونات الصوديوم (50 ملي مولار و 0.5٪ وزن / حجم) و CON. (1 مولار و 4 مولار، وكلاهما مع 1٪ وزن / حجم بوروهيدريد الصوديوم) وكلوريد الحمض كما هو موضح سابقًا 52 و 53. ثم خضعت المستخلصات لـ ELISA مقابل لوحة معقدة من mAb50s الموجهة إلى جليكان جدار الخلية، وتم تقديم تفاعلات ربط mAb كخريطة حرارية. تم شراء الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي تستهدف جليكان جدار الخلية النباتية من مخزونات المختبر (سلسلة CCRC وJIM وMAC).
بيوتينلة السكريات قليلة التعدد في خطوة واحدة. أُجري اقتران الكربوهيدرات مع هيدرازيد بيوتين-LC- (4.6 ملغ/12 ميكرومول) باتباع الإجراء التالي: أُذيب هيدرازيد بيوتين-LC (4.6 ملغ/12 ميكرومول) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO، 70 ميكرولتر) مع التحريك القوي والتسخين عند درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. أُضيف حمض الأسيتيك الجليدي (30 ميكرولتر)، وصُب الخليط فوق سيانوبوروهيدريد الصوديوم (6.4 ملغ/100 ميكرومول) وذاب تمامًا بعد التسخين عند درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة دقيقة تقريبًا. بعد ذلك، أُضيف من 5 إلى 8 ميكرولتر من خليط التفاعل إلى هيدرازيد قليل التعدد المجفف (1-100 نانومول) للحصول على فائض مولاري يزيد عن عشرة أضعاف أو أكثر من العلامة على الطرف المختزل. أُجري التفاعل عند درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة ساعتين، وبعدها نُقِّيت العينات فورًا. لم يُستخدم سيانوبوروهيدريد الصوديوم في تجارب الوسم دون اختزال، وتفاعلت العينات عند درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة ساعتين ونصف.
طلاء وغسل عينات السكريات قليلة التعدد البيوتين باستخدام اختبار الإليزا. أُضيف 25 ميكرولترًا من العينات البيوتينية (100 ميكرولتر من كل عينة مركزة مخففة في 5 مل من محلول تريس المنظم (TBS) بتركيز 0.1 مولار) إلى كل بئر من الصفيحة المطلية بالأفيدين. طُليت آبار الضبط بـ 50 ميكرولترًا من البيوتين بتركيز 10 ميكروغرام/مل في محلول منظم بتركيز 0.1 مولار. استُخدم الماء منزوع الأيونات كطلاء للعينة الفارغة. حُضنت الأقراص لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في مكان مظلم. اغسل الصفيحة 3 مرات بحليب خالي الدسم بتركيز 0.1% في محلول منظم بتركيز 0.1 مولار باستخدام البرنامج رقم 11 لغرينيير فلات 3A.
إضافة وغسل الأجسام المضادة الأولية. أضف 40 ميكرولترًا من الأجسام المضادة الأولية إلى كل بئر. حُضِّنت الصفيحة الدقيقة لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ثم غُسلت الصفيحة 3 مرات بحليب 0.1% في محلول 0.1 مولار من محلول ملحي باستخدام برنامج الغسيل رقم 11 لغرينيير فلات 3A.
أضف الجسم المضاد الثانوي واغسله. أضف 50 ميكرولترًا من الجسم المضاد الثانوي للفأر/الجرذ (مخفف بنسبة 1:5000 في حليب 0.1% في 0.1 مولار ملعقة كبيرة) إلى كل بئر. احضن الصفيحة الدقيقة لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ثم غُسلت الصفيحة الدقيقة 5 مرات في حليب 0.1% في 0.1 مولار ملعقة كبيرة باستخدام برنامج غسل الصفيحة Grenier Flat 5A رقم 12.
إضافة ركيزة. أضف ٥٠ ميكرولترًا من ٣،٣،٥،٥-رباعي ميثيل بنزيدين (TMB) إلى الركيزة الأساسية (بإضافة قطرتين من المحلول المنظم، و٣ قطرات من TMB، وقطرتين من بيروكسيد الهيدروجين إلى ١٥ مل من الماء منزوع الأيونات). جهّز ركيزة TMB. حرّكها جيدًا قبل الاستخدام. احضن الصفيحة الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة ٣٠ دقيقة. في الظلام.
أكمل الخطوة واقرأ القرص. أضف ٥٠ ميكرولترًا من حمض الكبريتيك بتركيز ١ نيوتن إلى كل بئر، وسجّل الامتصاصية من ٤٥٠ إلى ٦٥٥ نانومتر باستخدام قارئ ELISA.
حضّر محاليل بتركيز 1 ملغ/مل من هذه المُحللات في ماء منزوع الأيونات: أرابينوز، رامنوز، فوكوز، زيلوز، حمض الجلاكتورونيك (GalA)، حمض الجلوكورونيك (GlcA)، مانوز، جلوكوز، جلاكتوز، لاكتوز، إن-أسيتيل مانوزامين (manNAc)، إن-أسيتيل جلوكوزامين (glcNAc)، إن-أسيتيل غالاكتوزامين (galNAc)، إينوزيتول (معيار داخلي). حُضّر معياران بإضافة محاليل سكر بتركيز 1 ملغ/مل، كما هو موضح في الجدول 1. جُمّدت العينات وجُفّدت بالتجميد عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى يُزال الماء تمامًا (عادةً لمدة تتراوح بين 12 و18 ساعة).
أضف ١٠٠-٥٠٠ ميكروغرام من العينة إلى أنابيب ذات أغطية لولبية على ميزان تحليلي. سجّل الكمية المضافة. يُفضّل إذابة العينة في تركيز مُحدد من المذيب وإضافتها إلى الأنبوب كعينة سائلة. استخدم ٢٠ ميكرولترًا من إينوزيتول بتركيز ١ ملغم/مل كمعيار داخلي لكل أنبوب عينة. يجب أن تكون كمية المعيار الداخلي المُضافة إلى العينة مساوية لكمية المعيار الداخلي المُضافة إلى الأنبوب القياسي.
أضف 8 مل من الميثانول اللامائي إلى قارورة ذات غطاء لولبي. ثم أضف 4 مل من محلول 3N من حمض الهيدروكلوريك الميثانولي، مع إغلاقها ورجّها جيدًا. لا تستخدم هذه الطريقة الماء.
أضف 500 ميكرولتر من محلول الميثانول بتركيز 1 مولار من حمض الهيدروكلوريك إلى عينات السكريات قليلة التعدد وأنابيب TMS القياسية. حُضنت العينات طوال الليل (168 ساعة) عند درجة حرارة 80 درجة مئوية في كتلة حرارية. جفف ناتج التحلل الميثاني في درجة حرارة الغرفة باستخدام مشعب تجفيف. أضف 200 ميكرولتر من هيدروكسيد الميثانول وجففها مرة أخرى. كرر هذه العملية مرتين. أضف 200 ميكرولتر من الميثانول، و100 ميكرولتر من البيريدين، و100 ميكرولتر من أنهيدريد الأسيتيك إلى العينة واخلطها جيدًا. حُضنت العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ثم جففتها. أضف 200 ميكرولتر من الميثانول وجففها مرة أخرى.
أضف 200 ميكرولتر من Tri-Sil وسخّن الأنبوب المغطى لمدة 20 دقيقة. 80 درجة مئوية، ثم برّده إلى درجة حرارة الغرفة. استخدم مشعب تجفيف لتجفيف العينة بشكل إضافي إلى حجم يقارب 50 ميكرولترًا. من المهم ملاحظة أننا لم نترك العينات تجف تمامًا.
أضف ٢ مل من الهكسان واخلط جيدًا بالدوامة. املأ أطراف ماصات باستور (٥-٨ مم) بقطعة من الصوف الزجاجي، وذلك بإدخال الصوف الزجاجي فوق ماصة قطرها ٥-٣/٤ بوصة. طُردت العينات بالطرد المركزي بسرعة ٣٠٠٠ غرام لمدة دقيقتين. رُسبت أي بقايا غير قابلة للذوبان. جفف العينة إلى ١٠٠-١٥٠ ميكرولتر. حُقن حجم حوالي ١ ميكرولتر في جهاز كروماتوغرافيا الغاز-مطياف الكتلة (GC-MS) عند درجة حرارة ابتدائية ٨٠ درجة مئوية ووقت ابتدائي دقيقتان (الجدول ٢).