Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik. İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında CSS üçün məhdud dəstək var. Ən yaxşı təcrübə üçün sizə yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyi (və ya Internet Explorer-də uyğunluq rejimini söndürməyi) tövsiyə edirik. Bu arada, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün saytı üslub və JavaScript olmadan göstərəcəyik.
İnsan bağırsaq morfogenezi 3D epiteliya mikroarxitekturasının və məkan təşkilinin kript-villus xüsusiyyətlərini yaradır. Bu unikal struktur bazal kriptdəki kök hüceyrə yuvasını ekzogen mikrob antigenlərindən və onların metabolitlərindən qorumaqla bağırsaq homeostazını qorumaq üçün tələb olunur. bağırsağın selikli qişasının səthində maneə yaradır. Buna görə də, 3D epitel strukturlarının yenidən yaradılması in vitro bağırsaq modellərinin qurulması üçün çox vacibdir. Xüsusilə, çipdə olan üzvi mimetik bağırsaq bağırsaq epitelinin spontan 3D morfogenezinə təkan verə bilər, biz biofizika və funksiyaları gücləndirir. Mikrofluidik çipdə, eləcə də Transwell quraşdırılmış hibrid çipdə bağırsaqda bağırsaq morfogenezini güclü şəkildə induksiya etmək üçün təkrarlana bilən protokol. Biz cihazın istehsalı, Caco-2 və ya bağırsaq orqanoid epitel hüceyrələrinin adi şəraitdə, eləcə də mikro platformalarda kultivasiyası üçün ətraflı üsulları təsvir edirik. morfogenez və bir çox görüntüləmə üsullarından istifadə edərək qurulmuş 3D epiteliyanın səciyyələndirilməsi. Bu protokol 5 gün ərzində bazolateral maye axınına nəzarət etməklə funksional bağırsaq mikroarxitekturasının regenerasiyasına nail olur. Bizim in vitro morfogenez metodumuz fizioloji cəhətdən müvafiq kəsmə gərginliyindən və mexaniki hərəkətdən istifadə edir və mövcud ola biləcək mürəkkəb manipulyasiya və ya digər hüceyrə quruluşu texnikasını tələb etmir. Bizim təklif etdiyimiz protokolun biotibbi, klinik və əczaçılıq tətbiqləri üçün in vitro 3D bağırsaq epiteliya təbəqələrinin bərpası metodunu təmin edərək, biotibbi tədqiqat cəmiyyəti üçün geniş təsir göstərə biləcəyini nəzərdə tuturuq.
Təcrübələr göstərir ki, çip-on-a-chip1,2,3,4,5 və ya ikiqatlı mikro-maye cihazlarında yetişdirilmiş bağırsaq epitelial Caco-2 hüceyrələri6,7 əsas mexanizmi aydın başa düşmədən spontan 3D morfogenezdən keçə bilər. Caco-2 və xəstədən alınan bağırsaq orqanoidləri tərəfindən nümayiş etdirilən in vitro 3D epiteliya morfogenezini induksiya etmək üçün zəruri və kifayətdir. Epitel hüceyrələri təsdiq edilmişdir. Bu tədqiqatda biz xüsusi olaraq güclü Wnt antaqonisti Dickkopf-1 (DKK-1) çip üzərində bağırsaqda və tərkibində "Hibrid Çip" adlandırılan dəyişdirilmiş mikrofluidik cihazlarda hüceyrə istehsalı və konsentrasiyası paylanmasına diqqət yetirmişik. Çip üzərindəki bağırsağa 1-ci repressor, ifraz olunan qıvrımla əlaqəli protein 1 və ya Soggy-1) morfogenezi maneə törədir və ya əvvəlcədən qurulmuş 3D epiteliya təbəqəsini pozur, beləliklə, mədəniyyət zamanı antaqonist stressin bağırsaq morfogenezindən məsul olduğunu deməyə əsas verir. Bazolateral bölmədə Wnt antaqonistlərinin səviyyəsini aktiv yuyulma (məsələn, çip üzərində bağırsaq və ya hibrid-çip platformalarında) və ya diffuziya yolu ilə aradan qaldırmaq və ya minimum səviyyədə saxlamaqdır.
Bu protokolda biz polidimetilsiloksan (PDMS) əsaslı məsaməli membranlarda (addım 6A, 7A, 8, 6B membranlarında, transwell membranlarında) bağırsaq epitel hüceyrələrini yetişdirmək üçün çip üzərində bağırsaq mikrocihazları və Transwell-ə ​​daxil edilə bilən hibrid çipləri (addım 1-5) hazırlamaq üçün ətraflı metodu təqdim edirik. 7B, 8, 9) və induksiya edilmiş 3D morfogenez in vitro (addım 10). Biz, həmçinin, çoxlu görüntüləmə üsullarını tətbiq etməklə (11-24-cü addımlar) toxuma-spesifik histogenez və nəsildən asılı hüceyrə diferensiasiyasının göstəricisi olan hüceyrə və molekulyar xüsusiyyətləri müəyyən etdik. və ya bağırsaq orqanoidləri, məsaməli membranların səthinin modifikasiyası, 2D monolayerlərin yaradılması və bağırsaq biokimyəvi və biomexaniki mikromühitin reproduksiyası.in vitro daxil olmaqla texniki detalları olan iki mədəniyyət formatında. 2D epitelial monolaylardan 3D morfogenezi induksiya etmək üçün, biz morfogen və lateral axını formalaşdıran mühitdə basqın formalaşdırmaqla hər iki mədəniyyəti çıxardıq. mədəniyyət bölməsi. Nəhayət, biz morfogendən asılı epitelin böyüməsini, uzununa host-mikrobiom ko-kulturalarını, patogen infeksiyanı, iltihabi zədələnməni, epitelial maneə disfunksiyasını və probiotik.ampf.infunksiyanı modelləşdirmək üçün istifadə edilə bilən bərpa oluna bilən 3D epiteliya təbəqəsinin faydalılığını təqdim edirik.
Protokolumuz əsas (məsələn, bağırsaq selikli qişasının biologiyası, kök hüceyrə biologiyası və inkişaf biologiyası) və tətbiqi tədqiqatlar (məsələn, klinikadan əvvəlki dərman testi, xəstəliklərin modelləşdirilməsi, toxuma mühəndisliyi və qastroenterologiya) geniş təsir dairəsi üzrə alimlər üçün faydalı ola bilər. epithelium in vitro, biz texniki strategiyamızın bağırsaq inkişafı, regenerasiya və ya homeostaz zamanı hüceyrə siqnalının dinamikasını öyrənən auditoriyaya yayıla biləcəyini nəzərdə tuturuq. Bundan əlavə, protokolumuz Norovirus 8, Ağır Kəskin Tənəffüs Sindromu, CRSSA-CoV2triicium, Coronavirus-CoV2triicium kimi müxtəlif infeksion agentlər altında infeksiyanı sorğulamaq üçün faydalıdır. Salmonella Typhimurium 9 və ya Vibrio cholerae. Xəstəliyin patologiyası və patogenezi ilə bağlı auditoriyalar da faydalıdır. Çip üzərindəki bağırsaq mikrofiziologiyası sisteminin istifadəsi uzunlamasına birgə kulturaya 10 və daha sonra mədə-bağırsaq traktında immun reaksiyaların və patogenlə bağlı zədələrin təmirinin qiymətləndirilməsinə imkan verə bilər 11 .Sindrolez xəstəlikləri, sindirim xəstəliyi, selikli qişa xəstəliyi ilə əlaqəli digər mədə-bağırsaq xəstəlikləri. ülseratif kolit, pouchit və ya irritabl bağırsaq sindromu xəstənin 3D bağırsaq epitelial təbəqələrindən istifadə edilməklə 3D bağırsaq epitel təbəqələri hazırlandıqda simulyasiya edilə bilər, bu xəstəliklərə villöz atrofiya, kript qısalması, selikli qişanın zədələnməsi və ya epitelial hüceyrə baryerinin və ya hüceyrə testinin pozulması daxildir. orqanoidlər12,13.Xəstəlik mühitinin yüksək mürəkkəbliyini daha yaxşı modelləşdirmək üçün oxucular 3D bağırsaq villus-kript mikroarxitekturası olan modellərə xəstə periferik qan mononüvə hüceyrələri (PBMCs) kimi xəstəliyə uyğun hüceyrə növlərini əlavə etməyi düşünə bilərlər. toxuma spesifik immun hüceyrələri, 5.
3D epiteliya mikrostrukturunu bölmə prosesi olmadan sabitləşdirmək və vizuallaşdırmaq mümkün olduğundan, məkan transkriptomikası və yüksək rezolyusiyaya malik və ya super rezolyusiyaya malik təsvir üzərində işləyən izləyicilər epiteliya boşluqlarında genlərin və zülalların məkan-zaman dinamikasının xəritələşdirilməsimizlə maraqlana bilər. Texnologiya ilə maraqlanır. Mikrob və ya immun stimullara cavab. Bundan əlavə, müxtəlif mikrob növlərini, mikrob icmalarını və ya nəcis mikrobiota-göbələrində birgə becərmə yolu ilə bağırsağın homeostazını koordinasiya edən uzununa host-mikrobiom 10, 14 qarışması 3D bağırsaq selikli qişasında müəyyən edilə bilər. platformada. Bu yanaşma laboratoriyada əvvəllər kulturalanmamış bağırsaq mikrobiotasını yetişdirmək istəyən selikli qişaların immunologiyası, qastroenterologiyası, insan mikrobiomu, kulturomikası və klinik mikrobiologiyasını öyrənən auditoriya üçün xüsusilə cəlbedicidir. Əgər bizim in vitro morfogenez protokolumuz miqyaslı mədəniyyət kimi çoxlu formatlara uyğunlaşdırıla bilərsə296, Bazolateral bölmələri davamlı olaraq dolduran 384 quyu boşqabları, protokol həmçinin qida sənayesi üçün əczaçılıq, biotibbi və ya yüksək məhsuldarlıqlı skrininq və ya doğrulama platformalarını inkişaf etdirənlərə də yayıla bilər. Prinsip sübutu olaraq, biz bu yaxınlarda multileks yüksək məhsuldarlığa malik lövhə sisteminin mümkünlüyünü nümayiş etdirdik. Çoxlu orqan-on-a-chip məhsulları kommersiyalaşdırılıb16,17,18. Buna görə də, bizim in vitro morfogenez metodumuzun təsdiqi sürətləndirilə və potensial olaraq bir çox tədqiqat laboratoriyaları, sənaye və ya hökumət və tənzimləyici qurumlar tərəfindən in vitro bağırsaq morfogenezinin hüceyrə reprogramlamasını anlamaq üçün qəbul edilə bilər. Namizədlər bağırsaq morfogenez prosesinin təkrar istehsalını qiymətləndirmək üçün 3D bağırsaq surroqatlarından və ya xüsusi və ya kommersiya orqan-on-a-chip modellərindən istifadə etməklə qiymətləndirilmişdir.
Bağırsaq epitelinin morfogenezinin öyrənilməsi üçün məhdud sayda insana aid eksperimental modellərdən istifadə edilmişdir, əsasən in vitro 3D morfogenezi induksiya etmək üçün həyata keçirilə bilən protokolların olmaması səbəbindən. Əslində, bağırsaq morfogenezi ilə bağlı mövcud biliklərin çoxu heyvan tədqiqatlarına əsaslanır (məsələn, zebra balığı20 və ya siçan, onlar zebra balığı20). məsrəf tələb edən, etik cəhətdən şübhəli ola bilər və ən əsası, insan inkişafı proseslərini dəqiq müəyyən etmir. Bu modellər də çoxtərəfli miqyaslı şəkildə sınaqdan keçirilmə qabiliyyətinə görə çox məhduddur. Buna görə də, 3D toxuma strukturlarının in vitro regenerasiyası üçün protokolumuz in vivo heyvan modellərini, eləcə də əvvəlki təsvir edilən ənənəvi hüceyrə mədəniyyətini 2D üstələyir. 3D epiteliya strukturları müxtəlif selikli qişa və ya immun stimullara cavab olaraq kript-villus oxundakı differensiallaşmış hüceyrələrin məkan lokalizasiyasını tədqiq etməyə imkan verdi. 3D epitel təbəqələri mikrob hüceyrələrinin məkan nişləri yaratmaq üçün necə rəqabət apardığını və ev sahibi amillərə (məsələn, selikli qişanın daxili təbəqəsi, mikrobial və mikrob əleyhinə) cavab olaraq ekoloji təkamülü öyrənmək üçün yer təmin edə bilər. peptidlər).Bundan başqa, 3D epitelial morfologiya bizə bağırsaq mikrobiotasının öz icmalarını necə strukturlaşdırdığını və sinergik şəkildə hüceyrə quruluşunu və bazal kriptlərdə kök hüceyrə yuvalarını formalaşdıran mikrob metabolitlərini (məsələn, qısa zəncirli yağ turşuları) istehsal etdiyini anlamağa imkan verə bilər. Bu xüsusiyyətlər yalnız epitel təbəqədə müəyyən edilə bilər
3D bağırsaq epiteliya strukturlarının yaradılması metodumuza əlavə olaraq, bir neçə in vitro metodu var. Bağırsaq orqanoid mədəniyyəti xüsusi morfogen şəraitdə bağırsaq kök hüceyrələrinin yetişdirilməsinə əsaslanan ən müasir toxuma mühəndisliyi texnikasıdır23,24,25.Lakin, 3D orqanoid modellərinin istifadəsi tez-tez kro-orqanoid analizi və ya krol-orqanoid modellərinin daşınması üçün istifadə olunur. bağırsağın lümeni orqanoid içərisində qapalı olduğundan və buna görə də mikrob hüceyrələri və ya ekzogen antigenlər kimi luminal komponentlərin tətbiqi məhduddur. Orqanoid lümenlərə giriş mikroinjektordan istifadə etməklə yaxşılaşdırıla bilər,26,27 lakin bu üsul invaziv və əmək tutumludur və yerinə yetirmək üçün xüsusi bilik tələb edir.Bundan başqa, statik şəraitdə hidrogel iskelelərində saxlanılan ənənəvi orqanoid mədəniyyətlər in vivo biomexanikanın aktivliyini dəqiq əks etdirmir.
Bir neçə tədqiqat qrupu tərəfindən tətbiq edilən digər yanaşmalar gel səthində təcrid olunmuş insan bağırsaq hüceyrələrini yetişdirməklə bağırsaq epitelinin strukturunu təqlid etmək üçün əvvəlcədən qurulmuş 3D hidrojel iskelelərindən istifadə edir. 3D çap edilmiş, mikro-frezelənmiş və ya litoqrafiya üsulu ilə hazırlanmış qəliblərdən istifadə edərək hidrogel iskeleləri hazırlayır. fizioloji cəhətdən müvafiq morfogen qradientlər, yüksək aspekt nisbəti epiteliya strukturu və stroma-epitelial çarpazlıq yaratmaqla stromal hüceyrələri iskeleyə daxil etməklə. Bununla belə, əvvəlcədən qurulmuş skafoldların təbiəti spontan morfogenetik prosesin özünü göstərməsinə mane ola bilər. bağırsaq hüceyrələri morfogenezdən keçməli və fizioloji funksiya qazanmalıdır. Başqa bir son tədqiqatda lazerlə aşındırma üsullarından istifadə edərək mikrofluidik platformada hidrojel iskeleləri və naxışlı bağırsaq epiteliya strukturları istifadə edilmişdir. Siçan bağırsaq orqanoidləri bağırsaq boru strukturlarını yaratmaq üçün həkk olunmuş nümunələri izləyir və intraluminal mayedən istifadə edərək mikrofluilik maye ola bilər. modul.Lakin bu model nə kortəbii morfogenetik prosesləri nümayiş etdirir, nə də bağırsaq mexaniki hərəkətlərini ehtiva edir. Eyni qrupdan olan 3D çap üsulları kortəbii morfogenetik proseslərə malik miniatür bağırsaq boruları yarada bildi. Boru içərisində müxtəlif bağırsaq seqmentlərinin mürəkkəb istehsalına baxmayaraq, bu model həm də maye axını və mexaniki deformasiyaya malik ola bilməz. məhduddur, xüsusən də bioçap prosesi başa çatdıqdan sonra təcrübi şəraiti və ya hüceyrə-hüceyrə qarşılıqlı təsirini narahat edir. Bunun əvəzinə təklif etdiyimiz protokol spontan bağırsaq morfogenezini, fizioloji cəhətdən müvafiq kəsilmə stressini, bağırsaq hərəkətliliyini təqlid edən biomexanikanı, müstəqil apikal və bazolateral bölmələrin əlçatanlığını, kompleks mikrokreensiyanın kompleksliyini təmin edir. bizim in vitro 3D morfogenez protokolumuz mövcud metodların çətinliklərini aradan qaldırmaq üçün tamamlayıcı bir yanaşma təmin edə bilər.
Protokolumuz tamamilə 3D epiteliya morfogenezinə yönəlib, mədəniyyətdə yalnız epitel hüceyrələri və mezenximal hüceyrələr, endotel hüceyrələr və immun hüceyrələr kimi ətrafdakı hüceyrələr yoxdur. orta. Çip üzərində bağırsağımızın və çip üzərində hibridimizin möhkəm modulluğu dalğalı 3D epiteliya təbəqəsini yenidən yaratmağa imkan versə də, epiteliya-mezenximal qarşılıqlı əlaqə kimi əlavə bioloji mürəkkəbliklər33,34, hüceyrədənkənar Matris (ECM) çökməsi 35, hüceyrə konstruksiyası xüsusiyyətləri və bu hüceyrə konstruksiyalarının xüsusiyyətləri. bazal kriptlərdə daha çox nəzərə alınmalıdır. Mezenximadakı stromal hüceyrələr (məsələn, fibroblastlar) ECM zülallarının istehsalında və bağırsaq morfogenezinin tənzimlənməsində əsas rol oynayır35,37,38. Modelimizə mezenximal hüceyrələrin əlavə edilməsi morfogenetik prosesi və hüceyrənin bağlanma qatının (yəni endotheliilla qatının) effektivliyini artırdı. bağırsaq mikromühitində molekulyar daşınma39 və immun hüceyrələrin toplanması40 tənzimlənməsində mühüm rol oynayır. Bundan əlavə, toxuma modelləri çox orqan qarşılıqlı təsirlərini nümayiş etdirmək üçün nəzərdə tutulduqda, toxuma modelləri arasında birləşdirilə bilən damar komponentləri ilkin şərtdir. Buna görə də, endotel hüceyrələrinin daha dəqiq orqan-fizioloji xüsusiyyətləri ilə modelləşdirilməsinə ehtiyac ola bilər. resolution.Xəstədən əldə edilən immun hüceyrələri, həmçinin bağırsaq xəstəliklərini imitasiya edən kontekstdə anadangəlmə immun cavabları, antigen təqdimatı, fitri adaptiv immun çarpazlıq və toxuma spesifik toxunulmazlığı göstərmək üçün vacibdir.
Hibrid çiplərin istifadəsi çip üzərində bağırsağa nisbətən daha sadədir, çünki cihazın quraşdırılması daha sadədir və Transwell əlavələrinin istifadəsi bağırsaq epitelinin miqyaslı mədəniyyətinə imkan verir. Bununla belə, poliester membranlı kommersiyada mövcud olan Transwell əlavələri elastik deyil və peristaltikaya bənzər hərəkətləri simulyasiya edə bilməz. apikal tərəfdə kəsilmə gərginliyi olmadan stasionar qaldı. Aydındır ki, apikal bölmədəki statik xüsusiyyətlər hibrid çiplərdə uzunmüddətli bakterial birgə kulturaya nadir hallarda imkan verir. Hibrid çiplərdən istifadə edərkən Transwell əlavələrində 3D morfogenezi güclü şəkildə induksiya edə bilsək də, müvafiq maye axınının fizioloji və apikal axınının çatışmazlığı biomexanikliyi məhdudlaşdıra bilər. potensial tətbiqlər üçün hibrid çip platformaları.
Qut-on-a-chip və hibrid-on-a-chip kulturalarında insan kript-villus oxunun tam miqyaslı rekonstruksiyaları tam olaraq müəyyən edilməmişdir. Morfogenez epitelial monolaydan başladığı üçün 3D mikroarxitekturaları mütləq şəkildə vivolaşmış hüceyrələrdəki kriptovalyuta xarakteristikalarına morfoloji oxşarlığı təmin etmir. mikromühəndisləşdirilmiş 3D epitelindəki bazal kript sahəsi, kript və villöz bölgələr aydın şəkildə demarkasiya edilməmişdir. Çipdəki daha yüksək yuxarı kanallar mikromühəndis epitelinin hündürlüyünün artmasına səbəb olsa da, maksimum hündürlük hələ də ~300-400 µm ilə məhdudlaşır. İnsanın bağırsaq bağırsaqlarında və iri bağırsaqlarında faktiki dərinlik 5 µm olur. və müvafiq olaraq ~400 µm və nazik bağırsaq villisinin hündürlüyü ~600 µm41-dir.
Təsvir nöqteyi-nəzərindən, 3D mikroarxitekturanın yerində super rezolyusiyaya malik təsviri çip üzərindəki bağırsaqla məhdudlaşa bilər, çünki obyektiv lensdən epitel təbəqəsinə qədər tələb olunan iş məsafəsi bir neçə millimetrdir. PDMS.Bundan başqa, çip üzərində bağırsağın təbəqə-lay mikrofabrikasiyası hər bir təbəqə arasında qalıcı yapışmanı nəzərdə tutduğundan, epitelial təbəqənin səth strukturunu araşdırmaq üçün yuxarı təbəqəni açmaq və ya çıxarmaq olduqca çətindir. Məsələn, skan edən elektron mikroskopdan (SEM) istifadə etməklə.
PDMS-nin hidrofobikliyi hidrofobik kiçik molekullarla məşğul olan mikro-maye əsaslı tədqiqatlarda məhdudlaşdırıcı amil olmuşdur, çünki PDMS belə hidrofobik molekulları qeyri-spesifik adsorbsiya edə bilər. PDMS-ə alternativlər digər polimer materiallarla nəzərdən keçirilə bilər. qlikol) 43 ) hidrofobik molekulların adsorbsiyasını minimuma endirmək hesab edilə bilər.
Nəhayət, bizim metodumuz yüksək məhsuldarlıqlı skrininq və ya “hamıya uyğun” istifadəçi dostu eksperimental platformanın təmin edilməsi baxımından yaxşı xarakterizə edilməmişdir. Mövcud protokol CO2 inkubatorunda yer tutan və genişmiqyaslı təcrübələrin qarşısını alan hər mikrocihaz üçün şpris pompası tələb edir. Bazolateral mühitin davamlı doldurulmasına və çıxarılmasına imkan verən 96 quyu və ya 384 quyu məsaməli əlavələr).
In vitro insan bağırsaq epitelinin 3D morfogenezini induksiya etmək üçün biz lümen-kapilyar interfeys yaratmaq üçün iki paralel mikrokanal və aralarında elastik məsaməli membran olan mikrofluidik çip bağırsaq cihazından istifadə etdik. Biz həmçinin tək kanallı mikrofluidik cihazın istifadəsini nümayiş etdiririk. Transwell insertlərində böyüdülmüş epitel təbəqələri. Hər iki platformada müxtəlif insan bağırsaq epitel hüceyrələrinin morfogenezi, morfogen antaqonistləri bazolateral bölmədən çıxarmaq üçün axının istiqamətləndirici manipulyasiyasını tətbiq etməklə nümayiş etdirilə bilər. Bütün eksperimental prosedur (Şəkil 1) beş hissədən ibarətdir: (i) transwell çipində və ya mikrofabridin çipindən. (addım 1-5; Haşiyə 1), (ii) bağırsaq epitel hüceyrələrinin (Caco-2 hüceyrələri) və ya insan bağırsaq orqanoidlərinin hazırlanması; qutular 2-5), (iii) bağırsaq çiplərində və ya hibrid çiplərdə bağırsaq epitel hüceyrələrinin mədəniyyəti (addım 6-9), (iv) 3D morfogenezin in vitro induksiyası (addım 10) və (v) ) 3D epiteliya mikrostrukturunu xarakterizə etmək üçün (müvafiq olaraq 2-ci qrupa nəzarət edən qruplar). aşağıda) epiteliya morfogenezini məkan, zaman, şərti və ya prosedur nəzarətləri ilə müqayisə etməklə in vitro morfogenezin effektivliyini təsdiq etmək üçün nəzərdə tutulmuşdur.
Biz iki fərqli mədəniyyət platformasından istifadə etdik: düz kanalları və ya qeyri-xətti bükülmüş kanalları olan çip-on-a-chip və ya Qutu 1-də təsvir olunduğu kimi hazırlanmış mikro-maye cihazında Transwell (TW) əlavələri olan hibrid çiplər və 1-5-ci addımlar. “Cihazın istehsalı” tək çip və ya insan epitelli testinin hazırlanmasında əsas addımları göstərir. Hüceyrələr” bu protokolda istifadə olunan hüceyrə mənbəyini (Caco-2 və ya insan bağırsaq orqanoidləri) və mədəniyyət prosedurunu izah edir. “In vitro morfogenez” Caco-2 və ya orqanoiddən törəmə epitel hüceyrələrinin bağırsaq çipində və ya Transwell əlavələrində becərildiyi ümumi mərhələləri göstərir, hibridogen xarakterli çiplərin formalaşması və ardınca epitel quruluşu. Proqram addımının nömrəsi və ya qutu nömrəsi hər oxun altında göstərilir. Tətbiq bağırsaq epitelial təbəqələrinin, məsələn, hüceyrələrin diferensiasiyasının xarakteristikasında, bağırsaq fiziologiyasının öyrənilməsində, host-mikrobiom ekosistemlərinin qurulmasında və xəstəliklərin modelləşdirilməsində necə istifadə oluna biləcəyinə dair nümunələr təqdim edir. bağırsaq çipində əmələ gələn 3D Caco-2 epitel təbəqəsində ifadə edilir.MUC2 siqnalı, selikli qişa səthlərindən ifraz olunan qədəh hüceyrələrində və selikdə mövcuddur. Bağırsaq fiziologiyasındakı flüoresan şəkillərdə iki flüoresan görüntüdən istifadə edərək sial turşusu və N-asetilqlükozamin qalıqları üçün boyanma nəticəsində yaranan selik göstərilir. "Host-Mikrob Birgə Mədəniyyətləri" bir çipdə bağırsaqda təmsil olunan host-mikrobiom ko-kulturalarını göstərir. Sol panel mikromühəndisləşdirilmiş 3D Caco-2 epitel hüceyrələri ilə yaşıl flüoresan zülalı (GFP) ifadə edən E. coli kokulturasını göstərir. Sağ paneldə GFP E. E. coli, epiteli coli ilə lokalizasiyası göstərilir. ardınca F-aktin (qırmızı) və nüvələr (mavi) ilə immunofluoressensiya ilə boyanma. Xəstəliyin modelləşdirilməsi bakterial antigenlər (məsələn, lipopolisakkarid, LPS) və immun hüceyrələr (məs., PBMC-3D-yə yaşıl epitel hüceyrələrinin qurulması) ilə fizioloji sınaq altında bağırsaq iltihabı çiplərində sağlam və sızan bağırsağı göstərir. qat. Ölçək zolağı, 50 µm. Aşağı cərgədəki şəkillər: “Hüceyrələrin fərqləndirilməsi” istinaddan icazə ilə uyğunlaşdırılmışdır.2. Oxford University Press; Ref.5-in icazəsi ilə təkrar istehsal edilmişdir. NAS; Ref.3-ün icazəsi ilə uyğunlaşdırılmış “Host-Microb Co-Culture”. NAS; “Xəstəliklərin Modelləşdirilməsi” arayışın icazəsi ilə uyğunlaşdırılmışdır.5. NAS.
Həm çip-çip, həm də hibrid çiplər silikon qəliblərdən yumşaq litoqrafiya ilə sökülən və SU-8 ilə naxışlanmış PDMS replikalarından istifadə etməklə hazırlanmışdır1,44. Hər bir çipdə mikrokanalların dizaynı kəsilmə gərginliyi və hidrodinamik təzyiq kimi hidrodinamika nəzərə alınmaqla müəyyən edilir1,4,12. iki yan-yana paralel düz mikrokanaldan ibarət olub, artan mayenin qalma müddətini, qeyri-xətti axın modellərini və mədəni hüceyrələrin çoxoxlu deformasiyasını induksiya etmək üçün bir cüt əyri mikrokanal ehtiva edən kompleks bir çip üzərində bağırsaqa (Genişləndirilmiş Məlumat Şəkil 1b) çevrilmişdir (Şəkil 212a daha çox biokanal lazımdır). yenidən yaradılmış, mürəkkəb bağırsağın üzərində çiplər seçilə bilər. Biz nümayiş etdirdik ki, bükülmüş Qut-Chip də mədəni hüceyrə tipindən asılı olmayaraq, orijinal Qut-Chip ilə müqayisədə oxşar epitelial artım dərəcəsi ilə oxşar zaman çərçivəsində 3D morfogenezi güclü şəkildə induksiya edir. bir-birini əvəz edə bilər. SU-8 nümunələri ilə silikon qəliblərdə müalicə olunan PDMS replikaları qəlibdən çıxarıldıqdan sonra mənfi xüsusiyyətlər təmin etdi (Şəkil 2a). Bir çipdə bağırsağı hazırlamaq üçün hazırlanmış yuxarı PDMS təbəqəsi ardıcıl olaraq məsaməli bir PDMS filminə bağlandı və sonra geri dönməz parçadan istifadə edərək aşağı PDMS təbəqəsi ilə uyğunlaşdırıldı. hibrid çiplər, müalicəvi PDMS replikaları Transwell əlavələrini yerləşdirə bilən bir kanallı mikro-maye cihazları yaratmaq üçün şüşə slaydlara birləşdirildi (Şəkil 2h və Genişləndirilmiş Məlumat Şəkil 2). Bağlama prosesi PDMS replikasının səthlərinin işlənməsi və şüşənin oksigen plazmasının sterilizasiyası və ya mikroonab ilə kordona bağlanması ilə həyata keçirilir. silikon boru, cihaz quraşdırma bağırsaq epitelinin 3D morfogenezini yerinə yetirmək üçün hazır idi (Şəkil 2g).
a, SU-8 naxışlı silikon qəliblərdən PDMS hissələrinin hazırlanmasının sxematik təsviri. Təmizlənməmiş PDMS məhlulu bir silikon qəlibə (solda) töküldü, 60 °C-də (ortada) bərkidildi və qəlibdən çıxarıldı (sağda). Kalıpdan çıxarılan PDMS parçalara kəsildi və sonrakı istifadə üçün təmizləndi.b, Silikon qəlibin hazırlanması üçün istifadə olunan PDMS-nin fotoşəkili, Dc yuxarıda istifadə olunan PDMS şəkli. PDMS məsaməli membranını hazırlamaq üçün istifadə edilən silikon qəlib.d, Yuxarı və aşağı PDMS komponentlərinin və yığılmış çip üzərindəki bağırsaq cihazının fotoşəkilləri seriyası.e, Yuxarı, membran və aşağı PDMS komponentlərinin düzülməsinin sxemi. Hər bir təbəqə plazma və ya koronatik müalicə ilə geri dönməz şəkildə bağlanır. üst-üstə yığılmış qıvrımlı mikrokanallar və vakuum kameraları.g, Mikrofluidik hüceyrə mədəniyyəti üçün çip üzərində bağırsağın qurulması. Silikon boru və şpris ilə yığılmış çip üzərində hazırlanmış bağırsaq örtüyü üzərinə qoyulmuşdur. Çip cihazı 150 mm-lik petri qabının qapağına qoyulmuşdur. hibrid çiplərdən istifadə edərək hibrid çip istehsalının və 3D morfogenezin şəkilləri. Bağırsaq epiteliya hüceyrələrinin 2D monolaylarının mədəniyyəti üçün müstəqil olaraq hazırlanmış Transwell insertləri bağırsaq 3D morfogenezini induksiya etmək üçün hibrid çipə daxil edilmişdir. Mühit mikrokanalın içərisinə yerləşdirilir. bar, 1 sm.h İstinadın icazəsi ilə yenidən çap edilmişdir.4. Elsevier.
Bu protokolda Caco-2 hüceyrə xətti və bağırsaq orqanoidləri epiteliya mənbələri kimi istifadə edilmişdir (Şəkil 3a). Hər iki növ hüceyrə müstəqil şəkildə becərilmişdir (Qutu 2 və Qutu 5) və çip üzərindəki bağırsaqların və ya Transwell insertlərinin ECM ilə örtülmüş mikrokanallarını əkmək üçün istifadə edilmişdir. T-kolbalardakı Caco-2 hüceyrələri (10 və 50-ci keçidlər arasında) tripsinizasiya mayesi (qutu 2) vasitəsilə dissosiasiya olunmuş hüceyrə süspansiyonlarını hazırlamaq üçün yığılır. Bağırsaq biopsiyalarından və ya cərrahi rezeksiyalardan əldə edilən insan bağırsaq orqanoidləri 24-quyulu mikrostruktiv mikrostruksiyanı dəstəkləmək üçün Matrigel iskele qübbələrində becərilir. morfogenlər (Wnt, R-spondin və Noggin kimi) və Qutu 3-də təsvir olunduğu kimi hazırlanmış böyümə faktorları orqanoidlər diametri ~500 µm-ə qədər böyüyənə qədər hər gün əlavə olunurdu. Tamamilə yetişmiş orqanoidlər yığılır və bağırsaqlara və ya Transwell əlavələrinə toxum əkmək üçün tək hüceyrələrə bölünür (əvvəllər müxtəlif çiplərdə bildirilmişdir55). xəstəlik növü 12,13 (məsələn, xoralı kolit, Crohn xəstəliyi, kolorektal xərçəng və ya normal donor), lezyon yeri (məsələn, zədələnməmiş nahiyəyə qarşı) və traktdakı mədə-bağırsaq yeri (məsələn, onikibarmaq bağırsaq, jejunum, ileum, cecum, kolon və ya düz bağırsaq). (koloidlər) adətən nazik bağırsaq orqanoidlərindən daha yüksək morfogen konsentrasiyaları tələb edir.
a, Bağırsaq çipində bağırsaq morfogenezinin induksiyası üçün iş axını. Bu protokolda 3D morfogenezi nümayiş etdirmək üçün Caco-2 insan bağırsaq epiteli və bağırsaq orqanoidləri istifadə olunur. İzolyasiya olunmuş epitel hüceyrələri hazırlanmış bağırsaqda çipdə əkilmişdir (hüceyrələrə yapışdırılmışdır) və çiplənmişdir). (əlavə olunur) 0-da (D0) PDMS məsaməli membranına, apikal (AP) axın başlanır və ilk 2 gün ərzində saxlanılır (axın, AP, D0-D2). Bazolateral (BL) axın da siklik uzanma hərəkətləri (uzanma, axın, AP və BL) ilə birlikdə başlanır. 5 günlük mikrofluidik kulturadan (morfogenez, D5) sonra kortəbii olaraq baş verdi. Faza kontrast şəkilləri hər bir eksperimental addımda və ya vaxt nöqtəsində Caco-2 hüceyrələrinin təmsilçi morfologiyasını göstərir (bar qrafiki, 100 µm). Bağırsaq morfogenezinin müvafiq şəlalələrini göstərən dörd sxematik diaqram bağırsaq morfogenezinin yuxarı istiqamətini göstərir. flow.b, qurulmuş 3D Caco-2 epitelinin səth topologiyasını göstərən SEM təsviri (solda). Böyüdülmüş sahəni vurğulayan daxili hissə (ağ kəsikli qutu) 3D Caco-2 qatında (sağda) bərpa olunmuş mikrovilliləri göstərir (sağda).c, Qurulmuş Caco-2 3D-nin üfüqi frontal görünüşü, klaudin (ZO- etiketli Fırça), qırmızı (ZO- etiketli Fırça) və nüvələr (mavi) bağırsaq çiplərində epitel hüceyrələrinin immunofluoressensiya konfokal vizualizasiyası. Orta sxemə işarə edən oxlar hər bir konfokal görünüş üçün fokus müstəvisinin yerini göstərir.d, Faza kontrast mikroskopiyası ilə əldə edilmiş çipdə becərilmiş orqanoidlərdə morfoloji dəyişikliklərin vaxt kursu, 91-ci günlərdə, 3-cü günlərdə və sağda. təqdim edilən şəklin yüksək böyüdülməsini göstərir.e, 7.f günündə çəkilmiş dilimdə bağırsaqda qurulmuş orqanoid 3D epitelinin DIC fotomikroqrafı, kök hüceyrələr (LGR5; qırmızı), goblet hüceyrələri (MUC2; yaşıl), F-aktin (boz) və çiplərin böyüməsi üçün markerləri göstərən üst-üstə yığılmış immunofluoressensiya şəkilləri (Sol) və epitel təbəqəsində 13 günlük (orta) orqanoidlər. Həmçinin MUC2 siqnalı olmadan LGR5 siqnalını vurğulayan Genişləndirilmiş Məlumat Şəkil 3-ə baxın. Bağırsaqda qurulmuş 3D orqanoid epitelinin epitelial mikrostrukturunu (sağda) göstərən flüoresan şəkilləri (sağ C) membranın plazma gözü ilə çip 1-də boyanaraq mədəniyyət.Tədbir zolağı başqa cür göstərilmədiyi təqdirdə 50 μm-dir.b İstinadın icazəsi ilə yenidən çap edilmişdir.2. Oxford University Press; c İstinadın icazəsi ilə uyğunlaşdırılmışdır.2. Oxford University Press; e və f istinadla icazə ilə uyğunlaşdırılmışdır.12 Creative Commons Lisenziyası CC BY 4.0.
Bir çip üzərindəki bağırsaqda, uğurlu ECM örtüyü üçün PDMS məsaməli membranının hidrofobik səthini dəyişdirmək lazımdır. Bu protokolda biz PDMS membranlarının hidrofobikliyini dəyişdirmək üçün iki fərqli üsul tətbiq edirik. Caco-2 hüceyrələrini yetişdirmək üçün yalnız UV/ozon müalicəsi ilə səthin aktivləşdirilməsi kifayət idi, ECM2 hüceyrələrinin hidrofobikliyini azaltmaq və ECM2-nin hidrofobikliyini azaltmaq. PDMS membranı. Bununla belə, orqanoid epitelinin mikrofluidik mədəniyyəti polietilenimin (PEI) və qlutaraldehidin ardıcıl olaraq PDMS mikrokanallarına tətbiqi ilə ECM zülallarının səmərəli çökməsinə nail olmaq üçün kimyəvi əsaslı səth funksionallaşdırılması tələb edir. Səth modifikasiyasından sonra ECM zülalları PDMS-ni örtmək üçün yerləşdirildi və funksionallaşdırılmış orqanoidli səthi örtmək üçün PDMS zülalları yerləşdirildi. epitel. Hüceyrələr bağlandıqdan sonra mikrofluidik hüceyrə mədəniyyəti hüceyrələr tam monolayer əmələ gələnə qədər yalnız mühiti yuxarı mikrokanalda perfuziya etməklə başlayır, aşağı mikrokanal isə statik şəraiti saxlayır. Səthin aktivləşdirilməsi və ECM örtüyü üçün bu optimallaşdırılmış üsul, PMSD morfogenezinin səthində 3D əmələ gəlməsi üçün orqanoid epitelin bağlanmasına imkan verir.
Transwell mədəniyyətləri də hüceyrə toxumundan əvvəl ECM örtüyü tələb edir; lakin Transwell kulturaları məsaməli əlavələrin səthini aktivləşdirmək üçün mürəkkəb ilkin müalicə addımlarını tələb etmir. Transwell əlavələrində Caco-2 hüceyrələrinin böyüməsi üçün məsaməli əlavələr üzərində ECM örtüyü dissosiasiya edilmiş Caco-2 hüceyrələrinin yapışmasını (<1 saat) və sıx birləşmə maneəsinin əmələ gəlməsini sürətləndirir (<1-2 gün). əlavələr, membran səthinə əlavə olunur (<3 saat) və orqanoidlər maneə bütövlüyü ilə tam monolayer meydana gətirənə qədər saxlanılır .Transwell mədəniyyətləri hibrid fişlərdən istifadə etmədən 24 quyu boşqablarında aparılır.
In vitro 3D morfogenez, müəyyən edilmiş epitel təbəqəsinin bazolateral aspektinə maye axını tətbiq etməklə başlana bilər. Çipdə bağırsaqda epiteliya morfogenez mühitin yuxarı və aşağı mikrokanallara perfuziya edildiyi zaman başlamışdır (Şəkil 3a). Əvvəllər təsvir olunduğu kimi, maye axınının (yanal kompensasiyanın) və ya daşınma artığına davamlı olaraq daxil edilməsi vacibdir. istiqamətli ifraz olunan morfogen inhibitorları. Məsaməli membranlara bağlanmış hüceyrələrə kifayət qədər qida və zərdab vermək və luminal kəsmə gərginliyi yaratmaq üçün biz adətən bir çipdə bağırsaqda ikili axın tətbiq edirik. Hibrid çiplərdə, epitelial monolayları ehtiva edən Transwell insertləri hibrid çiplərə daxil edilmişdir. Daha sonra, transwell tərəfindən porlateral tərəfin altındakı mühit tətbiq edilmişdir. microchannel.Bağırsağın morfogenezi hər iki mədəniyyət platformasında bazolateral axının başlanmasından 3-5 gün sonra baş verdi.
Mikromühəndisləşdirilmiş 3D epitel təbəqələrinin morfoloji xüsusiyyətləri faza kontrastlı mikroskopiya, diferensial müdaxilə kontrast (DIC) mikroskopiyası, SEM və ya immunofluoresan konfokal mikroskopiya (Şəkil 3 və 4) daxil olmaqla müxtəlif görüntüləmə üsulları tətbiq edilməklə təhlil edilə bilər. 3D epitel təbəqələrinin. PDMS və polyester filmlərin optik şəffaflığına görə həm çipdə bağırsaq, həm də hibrid çip platformaları cihazın kəsilməsinə və ya sökülməsinə ehtiyac olmadan real vaxt rejimində yerində görüntüləmə təmin edə bilər. İmmunofluoressensiya görüntüləmə həyata keçirərkən (Şəkil 3c, f, hüceyrələrlə sabitlənir) 4% (ağırlıq/həcm) paraformaldehid (PFA), ardınca Triton X-100 və 2% (ağırlıq/həcm) ) iribuynuzlu heyvan serum albumini (BSA) sıra ilə. Hüceyrə tipindən asılı olaraq müxtəlif fiksatorlar, keçiricilər və bloklayıcı maddələr istifadə edilə bilər. Birincili antikorlar hüceyrənin hündürlüyündən asılı olan hüceyrələrə yönəldilmiş və ya yüksək işıqlı hüceyrə nişanları üçün istifadə olunur. nüvəni (məsələn, 4′,6-diamidino-2-fenilen) indol, DAPI) və ya F-aktini (məsələn, flüoresanla etiketlənmiş phalloidin) hədəfləyən əks boya ilə birlikdə ikincili antikorlar və ardınca ikincili antikorlar. fiziologiya”), mikrob hüceyrələrinin təsadüfi kolonizasiyası (Şəkil 1, “Host-mikrob birgə mədəniyyəti”), immun hüceyrələrin cəlb edilməsi (Şəkil 1, “Xəstəliyin Modelləşdirilməsi”) və ya 3D epiteliya morfologiyasının konturları (Şəkil 3c,f və 4b,c-də aşağı təbəqəni yuxarıdan ayırmaq üçün). mikrokanal təbəqəsi, ref.2-də göstərildiyi kimi, 3D epiteliya morfologiyası, eləcə də apikal fırça sərhədindəki mikrovillilər SEM ilə vizuallaşdırıla bilər (Şəkil 3b). Fərqlənmə markerlərinin ifadəsi kəmiyyət PCR5 və ya təkhüceyrəli RNT ardıcıllığının həyata keçirilməsi ilə qiymətləndirilə bilər. hibrid çiplər tripsinizasiya yolu ilə yığılır və sonra molekulyar və ya genetik analiz üçün istifadə olunur.
a, Hibrid çipdə bağırsaq morfogenezinin induksiyası üçün iş axını. Caco-2 və bağırsaq orqanoidləri bu protokolda hibrid çip platformasında 3D morfogenezi nümayiş etdirmək üçün istifadə olunur. Dissosiasiya olunmuş epitel hüceyrələri hazırlanmış Transwell əlavələrinə səpilmişdir (aşağıda təsvir edilmiş hüceyrələrdir). Transwell əlavələrindəki polyester membranlar, bütün hüceyrələr statik şəraitdə becərildi (TW mədəniyyəti). 7 gündən sonra, epitel hüceyrələrinin 2D monolayını ehtiva edən tək Transwell inserti, bazolateral axını (Flow, BL) təqdim etmək üçün hibrid çipə inteqrasiya edildi, bu da nəticədə 3D mikroefiliz konsentrasiyası təbəqəsinin (3P mikroefilis konsentrasiyası) yaranmasına səbəb oldu. hər bir eksperimental addımda və ya zaman nöqtəsində normal donordan (C103 xətti) yüksələn kolondan əldə edilən insan orqanının epitel hüceyrələrinin morfoloji xüsusiyyətlərini göstərən. Üst təbəqələrdəki sxemlər hər bir addım üçün eksperimental konfiqurasiyanı göstərir.b, Hibrid çiplər (solda sxematik) orqanoid-topdown hüceyrələrinin müxtəlif epitelioz konfiqurasiyaları ilə 3D morfogenezinə səbəb ola bilər. mövqelər (yuxarı, orta və aşağı; sağdakı sxematik və uyğun nöqtəli xətlərə baxın). aşkar morfoloji xüsusiyyətlər göstərdi.F-aktin (göy), nüvə (boz).c, A3D ilə müqayisədə hibrid çiplə (ən böyük tam çəkiliş) və statik Transwelldə (TW; ağ kəsikli qutunun içinə daxil edilmiş) becərilmiş orqanoid törəmə epitel hüceyrələrinin floresan konfokal mikroqrafikləri (3D bucaqlı görünüş). 2D şaquli kəsilmiş görünüşlərin (yuxarı sağ küncdə yerləşdirilmiş; “XZ”) həmçinin 2D və 3D xüsusiyyətlərini göstərir. Ölçək çubuğu, 100 µm.c İstinadın icazəsi ilə yenidən çap edilmişdir.4. Elsevier.
Nəzarətlər eyni hüceyrələrin (Caco-2 və ya bağırsaq orqanoid epitel hüceyrələri) ənənəvi statik mədəniyyət şəraitində ikiölçülü monolaylara becərilməsi yolu ilə hazırlana bilər. Qeyd edək ki, mikrokanalların məhdud həcm tutumuna görə qida maddələrinin tükənməsi (yəni, orijinal bağırsaq çipinin dizaynında yuxarı kanalda ~4 µL, epitelin lateral tətbiqindən əvvəl və epitelin lateral tətbiqi) ilə nəticələnə bilər. axını da müqayisə etmək olar.
Yumşaq litoqrafiya prosesi təmiz otaqda aparılmalıdır. Çipdəki hər bir təbəqə (yuxarı və aşağı təbəqələr və membranlar) və hibrid çiplər üçün müxtəlif fotomaskalar istifadə edilmiş və ayrı-ayrı silikon vaflilərdə hazırlanmışdır, çünki mikrokanalların hündürlükləri fərqli idi. hibrid çip 200 µm-dir.
3 düymlük silikon vaflini asetonlu qaba qoyun. Plitəni 30 saniyə yumşaq bir şəkildə çevirin, sonra vafli havada qurudun. Vaflini IPA ilə boşqaba köçürün, sonra təmizləmək üçün boşqabı 30 saniyə fırladın.
Silikon vafli səthindən üzvi qalıqları maksimum dərəcədə təmizləmək üçün piranya məhlulu (hidrogen peroksid və konsentratlaşdırılmış sulfat turşusu qarışığı, 1:3 (həcm/həcm)) isteğe bağlı olaraq istifadə edilə bilər.
Piranha məhlulu son dərəcə aşındırıcıdır və istilik yaradır. Əlavə təhlükəsizlik tədbirləri lazımdır. Tullantıların utilizasiyası üçün məhlulun soyumasını və təmiz, quru tullantı qabına köçürməsini gözləyin. İkinci dərəcəli qablardan istifadə edin və tullantı qablarını düzgün etiketləyin. Daha ətraflı prosedurlar üçün obyektin təhlükəsizlik qaydalarına əməl edin.
Vafliləri 10 dəqiqə ərzində 200 °C-də isti boşqaba yerləşdirməklə susuzlaşdırın. Susuzlaşdırmadan sonra vafli soyumaq üçün beş dəfə havada çalxalandı.
Təmizlənmiş silikon vaflinin mərkəzinə ~10 q fotorezist SU-8 2100 tökün. Fotorezisti vafli üzərində bərabər şəkildə yaymaq üçün cımbızdan istifadə edin. Fotorezistin daha az yapışqan və daha asan yayılması üçün vaflini bəzən 65°C qızdırılan plitə üzərinə qoyun. Vafli birbaşa isti plitə üzərinə qoymayın.
SU-8 spin örtüyünü işlətməklə vafli üzərində bərabər paylanmışdır. SU-8-in daxil olan fırlanmasını 100 rpm/s sürətlənmə ilə 500 rpm-də yayılmaq üçün 5-10 s proqramlaşdırın. Əsas fırlanmanı 200 µm qalınlıqda naxışlama üçün 1,500 µm və ya 500 µm2 qalınlığa çatmaq üçün təyin edin. Çipdəki bağırsağın yuxarı təbəqəsi üçün 500 µm hündürlük; aşağıda “Kritik addımlar”a baxın) 1200 rpm-də 30 saniyə 300 rpm/s sürətlənmə ilə təyin edin.
Əsas fırlanma sürəti silikon vafli üzərindəki SU-8 naxışının hədəf qalınlığına uyğun olaraq tənzimlənə bilər.
Çip üzərində bağırsağın yuxarı təbəqəsi üçün 500 µm hündürlükdə SU-8 naxışlarını hazırlamaq üçün bu Qutunun fırlanma örtüyü və yumşaq bişirmə addımları (addım 7 və 8) ardıcıl olaraq təkrarlandı (baxın addım 9) 250 µm-lik iki qat əldə etmək. 500 µm hündürlükdə.
Gofretləri 5 dəqiqə ərzində 65 °C-də isti boşqaba yerləşdirməklə SU-8 ilə örtülmüş vafliləri yumşaq bişirin, sonra parametri 95 °C-yə keçirin və əlavə 40 dəqiqə inkubasiya edin.
Yuxarı mikrokanalda SU-8 naxışının 500 μm hündürlüyünə nail olmaq üçün 250 μm qalınlığında iki SU-8 təbəqəsi yaratmaq üçün 7 və 8-ci addımları təkrarlayın.
UV Maska Düzləşdiricisindən istifadə edərək, vaflinin ekspozisiya vaxtını hesablamaq üçün istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq lampa testini həyata keçirin.(ekspozisiya müddəti, ms) = (ekspozisiya dozası, mJ/sm2)/(lampa gücü, mV/sm2).
Ekspozisiya müddətini təyin etdikdən sonra fotomaskanı UV maska ​​düzləşdiricisinin maska ​​tutacağına yerləşdirin və fotomaskanı SU-8 ilə örtülmüş vafli üzərinə qoyun.
UV dispersiyasını minimuma endirmək üçün fotomaskanın çap olunmuş səthini birbaşa silikon vaflinin SU-8 ilə örtülmüş tərəfinə qoyun.
SU-8 ilə örtülmüş vafli və foto maskanı əvvəlcədən müəyyən edilmiş ekspozisiya müddəti üçün şaquli olaraq 260 mJ/sm2 UV işığına məruz qoyun (bu qutunun 10-cu addımına baxın).
UV şüasına məruz qaldıqdan sonra SU-8 ilə örtülmüş silikon vaflilər 200 μm hündürlüyə malik naxışlar hazırlamaq üçün hər isti boşqabda 65°C-də 5 dəqiqə və 95°C-də 15 dəqiqə bişirildi. 50 µm hündürlükdə naxışlar hazırlamaq üçün sobadan sonrakı vaxtı 95 °C-də 30 dəqiqə uzatın.
Tərtibatçı şüşə qaba tökülür və bişmiş gofret qaba qoyulur. SU-8 tərtibatçısının həcmi şüşə boşqabın ölçüsündən asılı olaraq dəyişə bilər. Açılmamış SU-8-i tamamilə çıxarmaq üçün kifayət qədər SU-8 tərtibatçısından istifadə etməyinizə əmin olun. Məsələn, 150 mm diametrli şüşə qabdan 1 L tutumlu istifadə edərkən, ~L30De mol 80-dən istifadə edin. arabir yumşaq fırlanma ilə 25 dəqiqə.
Hazırlanmış qəlibi ~ 10 mL təzə inkişaf etdirici ilə yaxalayın, ardından bir pipetdən istifadə edərək məhlulu çiləyərək IPA edin.
Gofreti plazma təmizləyicisinə qoyun və oksigen plazmasına (atmosfer qazı, hədəf təzyiqi 1 × 10−5 Torr, güc 125 Vt) 1,5 dəqiqə buraxın.
Gofreti içərisində şüşə slayd olan vakuum desikatoruna yerləşdirin.Vafferlər və slaydlar yan-yana yerləşdirilə bilər.Vakuum desikatoru boşqab vasitəsilə bir neçə təbəqəyə bölünürsə, slaydları aşağı kameraya, vafliləri isə yuxarı kameraya qoyun. 100 μL trichloro,H,1H, 2H-perfluorooktil)silan məhlulu şüşə slaydda və silanizasiya üçün vakuum tətbiq olunur.
Dondurulmuş Caco-2 hüceyrələrinin bir flakonunu 37°C su banyosunda əridin, sonra əridilmiş hüceyrələri 15 mL 37°C əvvəlcədən isidilmiş Caco-2 mühiti olan T75 kolbasına köçürün.
Caco-2 hüceyrələrini ~90% birləşmədə keçmək üçün əvvəlcə isti Caco-2 mühiti, PBS və 0,25% tripsin/1 mM EDTA 37°C su banyosunda.
Vakuum aspirasiyası ilə mühiti aspirasiya edin. Vakuum aspirasiyasını təkrarlamaq və təzə PBS əlavə etməklə hüceyrələri iki dəfə 5 mL isti PBS ilə yuyun.