Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik. İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında CSS üçün məhdud dəstək var. Ən yaxşı təcrübə üçün sizə yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyi (və ya Internet Explorer-də uyğunluq rejimini söndürməyi) tövsiyə edirik. Bu arada, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün saytı üslub və JavaScript olmadan göstərəcəyik.
İnsan bağırsaq morfogenezi 3D epiteliya mikroarxitekturasının və məkan təşkilinin kript-villus xüsusiyyətlərini yaradır. Bu unikal struktur bazal kriptdəki kök hüceyrə yuvasını ekzogen mikrob antigenlərindən və onların metabolitlərindən qorumaqla bağırsaq homeostazını qorumaq üçün tələb olunur. bağırsağın selikli qişasının səthi. Buna görə də, 3D epitelial strukturların yenidən yaradılması in vitro bağırsaq modellərinin qurulması üçün çox vacibdir. Xüsusilə, çip üzərində olan üzvi mimetik bağırsaq, təkmilləşdirilmiş fizioloji funksiyaları və biomexanik funksiyaları yenidən təmin etmək üçün bağırsaq epitelinin spontan 3D morfogenezinə səbəb ola bilər. bağırsaqda bağırsaq morfogenezini mikrofluidik çipdə, eləcə də Transwell quraşdırılmış hibrid çipdə inkişaf etdirin. Biz cihazın istehsalı, Caco-2 və ya bağırsaq orqanoid epitel hüceyrələrinin adi şəraitdə kulturasiyası, eləcə də mikrofluidik platformada, çoxlu epitelizasiyadan istifadə edərək müəyyən edilmiş epiteliya 3D-nin induksiyası və epiteliya hüceyrələrinin kultivasiyası üçün ətraflı üsulları təsvir edirik. Bu protokol 5 gün ərzində bazolateral maye axınına nəzarət etməklə funksional bağırsaq mikroarxitekturasının regenerasiyasına nail olur. Bizim in vitro morfogenez metodumuz fizioloji cəhətdən uyğun sürüşmə gərginliyindən və mexaniki hərəkətdən istifadə edir və mürəkkəb hüceyrə mühəndisliyi və ya manipulyasiya tələb etmir, bu da digər mövcud texnikaları üstələyə bilər. biotibbi, klinik və əczaçılıq tətbiqləri üçün in vitro 3D bağırsaq epitelial təbəqələrini yedi.
Təcrübələr göstərir ki, çip üzərində bağırsaq1,2,3,4,5 və ya ikiqatlı mikrofluidik cihazlar6,7-də yetişdirilmiş bağırsaq epitelial Caco-2 hüceyrələri, əsas mexanizmi aydın şəkildə başa düşmədən in vitroda spontan 3D morfogenezdən keçə bilər. Caco-2 və xəstədən alınan bağırsaq orqanoidləri tərəfindən nümayiş etdirilən in vitro 3D epiteliya morfogenezinə səbəb olur.Epitel hüceyrələri təsdiq edilmişdir. Bu tədqiqatda biz xüsusi olaraq güclü Wnt antaqonisti Dickkopf-1 (DKK-1) çip üzərində bağırsaqda və tərkibində "Hibrid Çip" adlanan dəyişdirilmiş mikrofluidik cihazlarda hüceyrə istehsalına və konsentrasiya paylanmasına diqqət yetirmişik. 1, çip üzərindəki bağırsağa ifraz olunan qıvrımla əlaqəli protein 1 və ya Soggy-1) morfogenezi maneə törədir və ya əvvəlcədən qurulmuş 3D epiteliya təbəqəsini pozur, beləliklə, mədəniyyət zamanı antaqonist stressin bağırsaq morfogenezindən məsul olduğunu göstərir. aktiv yuyulma yolu ilə bazolateral bölmədə nt antaqonistləri (məsələn, çip üzərində bağırsaq və ya çip üzərində hibrid platformalarda) və ya diffuziya .Bazolateral media (məsələn, Transvellin quyularda böyük bazolateral rezervuarlara daxil olmasından).
Bu protokolda biz polidimetilsiloksan (PDMS) əsaslı məsaməli membranlarda (addım 6A, 7A, 8, 8,8, polyester 6B membranlarında) bağırsaq epitel hüceyrələrini yetişdirmək üçün çip üzərində bağırsaq mikrocihazları və Transwell-ə ​​daxil edilə bilən hibrid çipləri (addım 1-5) hazırlamaq üçün ətraflı metodu təqdim edirik. , 9) və induksiya edilmiş 3D morfogenezi in vitro (addım 10). Biz, həmçinin, bir çox görüntüləmə üsullarını tətbiq etməklə (11-24-cü addımlar) toxuma-spesifik histogenez və nəsildən asılı hüceyrə diferensiasiyasının göstəricisi olan hüceyrə və molekulyar xüsusiyyətləri müəyyən etdik. Biz morfogenezi induksiya edirik. məsaməli membranların səthinin modifikasiyası, 2D monolayerlərin yaradılması və bağırsaq biokimyəvi və biomexaniki mikromühitin çoxalması.in vitro daxil olmaqla texniki detalları olan mədəniyyət formatları. 2D epiteliya monolaylarından 3D morfogenezi induksiya etmək üçün biz mədəniyyətin hər iki formasında mədəniyyəti təmsil edən morfogen antaqonistlərini çıxardıq, hər iki kultura formasında kompozisiyanı təqdim edirik. Morfogendən asılı epitelin böyüməsini, uzununa host-mikrobiom kokulturalarını, patogen infeksiyanı, iltihabi zədələnməni, epitelial maneə disfunksiyasını və probiotik əsaslı müalicələri modelləşdirmək üçün istifadə oluna bilən bərpa olunan 3D epitel təbəqəsinin faydası. Nümunə təsirləri.
Protokolumuz əsas (məsələn, bağırsaq selikli qişasının biologiyası, kök hüceyrə biologiyası və inkişaf biologiyası) və tətbiqi tədqiqatlar (məsələn, klinikadan əvvəlki dərman testi, xəstəliklərin modelləşdirilməsi, toxuma mühəndisliyi və qastroenterologiya) geniş təsir dairəsi üzrə alimlərin geniş spektri üçün faydalı ola bilər. vitro, biz texniki strategiyamızın bağırsaq inkişafı, regenerasiya və ya homeostaz zamanı hüceyrə siqnalının dinamikasını öyrənən auditoriyaya yayıla biləcəyini nəzərdə tuturuq. Bundan əlavə, protokolumuz Norovirus 8, Ağır Kəskin Tənəffüs Sindromu Coronavirus 2 (SARSella-Cophilicium, CV-2) və ya C.C. Vibrio vəba.Xəstəliyin patologiyası və patogenezi ilə bağlı auditoriyalar da faydalıdır. Çip üzərində bağırsaq mikrofiziologiyası sisteminin istifadəsi uzunlamasına birgə kulturaya 10 və daha sonra mədə-bağırsaq traktında immun cavabların və patogenlə bağlı zədələrin təmirinin qiymətləndirilməsinə imkan verə bilər 11 . Digər mədə-bağırsaq xəstəlikləri, sindirim xəstəlikləri, sindirim xəstəlikləri, selikli qişa xəstəlikləri. kolit, pouchit və ya irritabl bağırsaq sindromu xəstənin 3D bağırsaq epitelial təbəqələrindən istifadə edilməklə 3D bağırsaq epitel təbəqələri hazırlandıqda simulyasiya edilə bilər, bu xəstəliklərə villöz atrofiya, kript qısalması, selikli qişanın zədələnməsi və ya epitelial maneənin pozulması daxildir. xəstəlik mühitinin mürəkkəbliyindən asılı olaraq, oxucular 3D bağırsaq villus-kript mikroarxitekturasını ehtiva edən modellərə xəstə periferik qan mononükleer hüceyrələri (PBMCs) kimi xəstəliyə uyğun hüceyrə növlərini əlavə etməyi düşünə bilərlər.toxuma spesifik immun hüceyrələri, 5.
3D epiteliya mikrostrukturunu bölmə prosesi olmadan sabitləşdirmək və vizuallaşdırmaq mümkün olduğundan, məkan transkriptomikası və yüksək rezolyusiyaya malik və ya super rezolyusiyaya malik təsvir üzərində işləyən izləyicilər epiteliya boşluqlarında genlərin və zülalların məkan-zaman dinamikasının xəritələşdirilməsimizlə maraqlana bilər.Texnologiya ilə maraqlanır. Mikrob və ya immun stimullara cavab. Bundan əlavə, müxtəlif mikrob növlərini, mikrob icmalarını və ya nəcis mikrobiota-göbələrində birgə becərmə yolu ilə bağırsağın homeostazını koordinasiya edən uzununa host-mikrobiom 10, 14 qarışması 3D bağırsaq selikli qişasında müəyyən edilə bilər.Bu yanaşma laboratoriyada əvvəllər mədəniləşdirilməmiş bağırsaq mikrobiotasını yetişdirmək istəyən selikli qişaların immunologiyası, qastroenterologiyası, insan mikrobiomu, kulturomikası və klinik mikrobiologiyasını öyrənən auditoriya üçün xüsusilə cəlbedicidir. Əgər bizim in vitro morfogenez protokolumuz miqyaslana bilən boşqablı kultura formatlarına uyğunlaşdırıla bilərsə294, Bazolateral bölmələri davamlı olaraq dolduran s, protokol qida sənayesi üçün əczaçılıq, biotibbi və ya yüksək məhsuldarlıqlı skrininq və ya təsdiqləmə platformalarını inkişaf etdirənlərə də yayıla bilər. Prinsip sübutu olaraq, biz bu yaxınlarda multipleks yüksək məhsuldarlığa malik morfogenez sisteminin mümkünlüyünü nümayiş etdirdik. kommersiyalaşdırılıb16,17,18. Buna görə də, bizim in vitro morfogenez metodumuzun təsdiqi narkotik və ya bioterapevtlərin və ya surətlərin daşınması üçün namizədlərdən istifadə edərək qiymətləndirilmiş dərman və ya bioterapevtlərdən istifadə edərək transkriptomik səviyyədə in vitro bağırsaq morfogenezinin hüceyrə yenidən proqramlaşdırılmasını başa düşmək üçün bir çox tədqiqat laboratoriyaları, sənaye və ya hökumət və tənzimləyici qurumlar tərəfindən sürətləndirilə və potensial olaraq qəbul edilə bilər. bağırsağın morfogenez prosesinin təkrarlanmasını qiymətləndirmək üçün xüsusi və ya kommersiya orqan-on-a-chip modelləri.
Bağırsaq epitelinin morfogenezinin öyrənilməsi üçün məhdud sayda insana aid eksperimental modellərdən istifadə edilmişdir. Bu, əsasən in vitroda 3D morfogenezi induksiya etmək üçün həyata keçirilə bilən protokolların olmaması ilə əlaqədardır. Əslində, bağırsaq morfogenezi ilə bağlı mövcud biliklərin çoxu heyvan tədqiqatlarına əsaslanır (məsələn, zebra balığı20, toyuq və siçan 20, 22, 20, 20, 20, 20, 20, 20) bağırsaq morfogenezi ilə bağlı mövcud biliklər). etik cəhətdən şübhəli ola bilər və ən əsası, insanın inkişaf proseslərini dəqiq müəyyən etmir. Bu modellər həm də çoxtərəfli miqyaslı şəkildə sınaqdan keçirilmək imkanlarına görə çox məhduddur. Buna görə də, 3D toxuma strukturlarının in vitro bərpası üçün protokolumuz in vivo heyvan modellərini, eləcə də bizə əvvəlki epizodda təsvir edilən 2D hüceyrəli quruluşu təsvir edən digər ənənəvi 2D modelləri üstələyir. müxtəlif selikli qişa və ya immun stimullara cavab olaraq kript-villus oxundakı differensiallaşmış hüceyrələrin məkan lokalizasiyasını amin edin. 3D epitel təbəqələri mikrob hüceyrələrinin məkan nişləri və ev sahibi amillərə cavab olaraq ekoloji təkamülün necə rəqabət apardığını öyrənmək üçün yer təmin edə bilər (məsələn, daxili və xarici selikli təbəqələr, IgA3D peyvəndi və antimorfların ifrazı). elm bizə bağırsaq mikrobiotasının öz icmalarını necə strukturlaşdırdığını və sinergik şəkildə hüceyrə quruluşunu və bazal kriptlərdə kök hüceyrə yuvalarını formalaşdıran mikrob metabolitlərini (məsələn, qısa zəncirli yağ turşuları) istehsal etdiyini anlamağa imkan verə bilər. Bu xüsusiyyətlər yalnız 3D epitel təbəqələri in vitro şəraitdə qurulduqda nümayiş etdirilə bilər.
3D bağırsaq epiteliya strukturlarının yaradılması metodumuza əlavə olaraq, bir neçə in vitro üsul var. Bağırsaq orqanoid mədəniyyəti xüsusi morfogen şəraitdə bağırsaq kök hüceyrələrinin yetişdirilməsinə əsaslanan ən müasir toxuma mühəndisliyi texnikasıdır23,24,25.Lakin, 3D və ya host-orqanoid modellərinin daşınması, çünki tez-tez xama-test və ya host-modellərin daşınması üçün xas-mikrobikulyoloji analizdir. al lümen orqanoid daxilində qapalıdır və buna görə də, mikrob hüceyrələri və ya ekzogen antigenlər kimi luminal komponentlərin tətbiqi məhduddur.Orqanoid lümenlərə giriş mikroinjektordan istifadə etməklə yaxşılaşdırıla bilər,26,27 lakin bu üsul invaziv və əmək tutumludur və yerinə yetirmək üçün xüsusi bilik tələb edir.Bundan başqa, statik şəraitdə hidrogel iskelelərində saxlanılan ənənəvi orqanoid mədəniyyətlər in vivo biomexanikanın aktivliyini dəqiq əks etdirmir.
Bir neçə tədqiqat qrupu tərəfindən istifadə edilən digər yanaşmalar gel səthində təcrid olunmuş insan bağırsaq hüceyrələrini yetişdirməklə bağırsaq epitelinin strukturunu təqlid etmək üçün əvvəlcədən qurulmuş 3D hidrojel iskelelərindən istifadə edir. 3D çap edilmiş, mikro-frezelənmiş və ya litoqrafiya üsulu ilə hazırlanmış qəliblərdən istifadə edərək hidrogel iskeleləri hazırlayın. morfogen qradiyentlər, yüksək aspekt nisbəti epiteliya strukturu və stroma-epitelial çarpazlıq yaratmaqla stromal hüceyrələri skafolda daxil etməklə. Bununla belə, əvvəlcədən qurulmuş skafoldların təbiəti spontan morfogenetik prosesin özünü göstərməsinə mane ola bilər. genezi və fizioloji funksiyanı qazanır. Başqa bir yeni araşdırmada lazerlə aşındırma üsullarından istifadə edərək mikrofluidik platformada hidrojel iskeleləri və naxışlı bağırsaq epiteliya strukturlarından istifadə edilmişdir. Siçan bağırsaq orqanoidləri bağırsaq boru strukturlarını yaratmaq üçün həkk olunmuş nümunələri izləyir və intraluminal maye axını bu mikrofluidik modeldən istifadə etməklə təkrarlana bilər. morfogenetik proseslər, nə də bağırsağın mexanobioloji hərəkətləri daxildir. Eyni qrupdan olan 3D çap üsulları kortəbii morfogenetik prosesləri olan miniatür bağırsaq boruları yarada bildi. Boru içərisində müxtəlif bağırsaq seqmentlərinin mürəkkəb istehsalına baxmayaraq, bu modeldə həmçinin luminal maye axını və mexaniki deformasiya yoxdur. Bundan əlavə, modelin işləmə qabiliyyəti, xüsusən də hər bir hüceyrənin bioçap prosesindən sonra tam işləmə şərtləri ola bilər. Əvəzində, bizim təklif etdiyimiz protokol kortəbii bağırsaq morfogenezini, fizioloji cəhətdən müvafiq kəsilmə gərginliyini, bağırsaq hərəkətliliyini təqlid edən biomexanikanı, müstəqil apikal və bazolateral bölmələrin əlçatanlığını və modulluğun mürəkkəb bioloji mikromühitlərinin yenidən yaradılmasını təmin edir. mövcud üsullar.
Protokolumuz tamamilə 3D epiteliya morfogenezinə yönəlib, mədəniyyətdə yalnız epitel hüceyrələri və mezenximal hüceyrələr, endotel hüceyrələr və immun hüceyrələr kimi ətrafdakı hüceyrələr yoxdur. t bizim çip-on-a-chip və hibrid-on-a-chip modulluğu bizə dalğalı 3D epiteliya təbəqəsini, epiteliya-mezenximal qarşılıqlı əlaqə kimi əlavə bioloji mürəkkəblikləri, hüceyrədənkənar Matris (ECM) çöküntüsü 35 və bizim modelimizdə kriptal konstruksiyaların xüsusiyyətlərini yenidən yaratmağa imkan verir. mezenximada olan tromal hüceyrələr (məsələn, fibroblastlar) ECM zülallarının istehsalında və in vivo35,37,38 bağırsaq morfogenezinin tənzimlənməsində əsas rol oynayır. Modelimizə mezenximal hüceyrələrin əlavə edilməsi morfogenetik prosesi və hüceyrə birləşməsinin səmərəliliyini artırdı. Endotel təbəqəsi (yəni, kapilyar hüceyrələr) və ya immunokulyar hüceyrə daşımasında mühüm rol oynayır39. bağırsaq mikromühitində işə qəbul40. Bundan əlavə, toxuma modelləri çox orqan qarşılıqlı təsirlərini nümayiş etdirmək üçün nəzərdə tutulduqda, toxuma modelləri arasında birləşdirilə bilən damar komponentləri ilkin şərtdir. Buna görə də, orqan səviyyəli rezolyusiya ilə daha dəqiq fizioloji xüsusiyyətləri modelləşdirmək üçün endotel hüceyrələrinin daxil edilməsi tələb oluna bilər. bağırsaq xəstəliklərini təqlid edən kontekstdə anadangəlmə adaptiv immun çarpazlıq və toxumalara xas toxunulmazlıq.
Hibrid çiplərin istifadəsi çip üzərində bağırsağa nisbətən daha sadədir, çünki cihazın quraşdırılması daha sadədir və Transwell əlavələrinin istifadəsi bağırsaq epitelinin miqyaslı mədəniyyətinə imkan verir. Bununla belə, kommersiyada mövcud olan poliester membranlı Transwell əlavələri elastik deyil və peristaltikaya bənzər hərəkətləri simulyasiya edə bilməz. apikal tərəfdə kəsmə gərginliyi. Aydındır ki, apikal bölmədəki statik xüsusiyyətlər hibrid çiplərdə uzunmüddətli bakterial birgə kulturaya nadir hallarda imkan verir. Hibrid çiplərdən istifadə edərkən Transwell əlavələrində 3D morfogenezi möhkəm şəkildə induksiya edə bilsək də, fizioloji cəhətdən müvafiq maye axınının və platformanın potensial çip axınının apikal biomexanikasını məhdudlaşdıra bilər.
Çip-on-a-chip və hibrid-on-a-chip kulturalarında insan kript-villus oxunun tam miqyaslı rekonstruksiyaları tam olaraq müəyyən edilməmişdir. Morfogenez epitelial monolaydan başladığı üçün 3D mikroarxitekturaları mütləq şəkildə vivo-hüceyrədəki kriptovalyuta xarakterinə yaxın kriptovalyutalara morfoloji oxşarlığı təmin etmir. mikromühəndisləşdirilmiş 3D epiteli, kript və villöz bölgələr aydın şəkildə demarkasiya edilməmişdir. Çipdə daha yüksək yuxarı kanallar mikromühəndis epitelinin hündürlüyünün artmasına səbəb olsa da, maksimum hündürlük hələ də ~300–400 µm ilə məhdudlaşır. İnsan bağırsaqlarının faktiki dərinliyi kiçik və böyük testlərdə ~30 µm-dir. ly, nazik bağırsaq villi hündürlüyü ~600 µm41-dir.
Təsvir nöqteyi-nəzərindən, 3D mikroarxitekturanın yerində super rezolyusiyaya malik təsviri çip üzərindəki bağırsaqla məhdudlaşa bilər, çünki obyektiv obyektivdən epitel təbəqəsinə qədər tələb olunan iş məsafəsi bir neçə millimetrdir. Bu problemi aradan qaldırmaq üçün uzaq bir obyektiv tələb oluna bilər. Bundan əlavə, PMS-nin yüksək keyfiyyətli təsviri üçün nazik kəsiklərin hazırlanması tələb olunur. Bundan əlavə, çip üzərində bağırsağın qat-qat mikrofabrikasiyası hər bir təbəqə arasında qalıcı yapışmanı nəzərdə tutduğundan, epitel təbəqəsinin səth strukturunu araşdırmaq üçün yuxarı təbəqəni açmaq və ya çıxarmaq olduqca çətindir. Məsələn, skan edən elektron mikroskopdan (SEM) istifadə etməklə.
PDMS-nin hidrofobikliyi hidrofobik kiçik molekullarla məşğul olan mikro-maye əsaslı tədqiqatlarda məhdudlaşdırıcı amil olmuşdur, çünki PDMS belə hidrofobik molekulları qeyri-spesifik şəkildə adsorbsiya edə bilər. PDMS-yə alternativlər digər polimer materiallarla da nəzərdən keçirilə bilər. Alternativ olaraq, PDMS-nin səthinin modifikasiyası (məsələn, polietil-kolikolit materialları və ya g243) ) hidrofobik molekulların adsorbsiyasını minimuma endirmək hesab edilə bilər.
Nəhayət, bizim metodumuz yüksək məhsuldarlıqlı skrininq və ya “hamıya uyğun” istifadəçi dostu eksperimental platformanın təmin edilməsi baxımından yaxşı xarakterizə edilməmişdir. Mövcud protokol CO2 inkubatorunda yer tutan və genişmiqyaslı təcrübələrin qarşısını alan hər mikrocihaz üçün şpris pompası tələb edir. Bazolateral mühitin davamlı doldurulmasına və çıxarılmasına imkan verən 384 quyulu məsaməli əlavələr).
In vitro insan bağırsaq epitelinin 3D morfogenezini induksiya etmək üçün biz lümen-kapilyar interfeys yaratmaq üçün iki paralel mikrokanal və aralarında elastik məsaməli membran olan mikrofluidik çip bağırsaq cihazından istifadə etdik. Biz həmçinin tək kanallı mikrofluidik cihazın istifadəsini nümayiş etdiririk. Transwell əlavələrində. Hər iki platformada müxtəlif insan bağırsaq epitel hüceyrələrinin morfogenezi, morfogen antaqonistlərini bazolateral bölmədən çıxarmaq üçün axının istiqamətləndirici manipulyasiyasını tətbiq etməklə nümayiş etdirilə bilər. Bütün eksperimental prosedur (Şəkil 1) beş hissədən ibarətdir: (i) bağırsağın mikrofabrikasiyası (i) bağırsaq çipinin mikrofabrikasiyası (çip-1) ) bağırsaq epitel hüceyrələrinin (Caco-2 hüceyrələri) və ya insan bağırsaq orqanoidlərinin hazırlanması;qutular 2-5), (iii) bağırsaq çipləri və ya hibrid fişlər üzərində bağırsaq epitel hüceyrələrinin kulturası (addım 6-9), (iv) 3D epiteliya mikrostrukturunu xarakterizə etmək üçün in vitro 3D morfogenezin induksiyası (addım 10) və (v) ) 3D epiteliya mikrostrukturunu xarakterizə etmək üçün (aşağıda müvafiq olaraq 2-ci qrup nəzarət altında hazırlanmışdır). epitelial morfogenezi məkan, müvəqqəti, şərti və ya prosedur nəzarətləri ilə müqayisə edərək in vitro morfogenezin effektivliyini öyrəndi.
Biz iki fərqli mədəniyyət platformasından istifadə etdik: düz kanalları və ya qeyri-xətti bükülmüş kanalları olan çip-on-a-chip və ya Qutu 1-də təsvir olunduğu kimi hazırlanmış mikro-maye cihazında Transwell (TW) əlavələri olan hibrid çiplər və 1-5-ci addımlar. “Cihazın istehsalı” insan epitelinin tək çipinin və ya hiblilik testinin hazırlanmasında əsas addımları göstərir. hüceyrə mənbəyi (Caco-2 və ya insan bağırsaq orqanoidləri) və bu protokolda istifadə edilən mədəniyyət proseduru. “İn vitro morfogenez” Caco-2 və ya orqanoiddən törəmə epitel hüceyrələrinin bağırsaq çipində və ya Transwell əlavələrində hibrid çipin becərildiyi ümumi mərhələləri göstərir, ardınca isə epiteliya nömrəsi və ya epimorfogen quruluşun induksiyası 3D xarakterli proqramın və epimorfogen sayının induksiyası göstərilir. Hər oxun altında göstərilir. Tətbiq, məsələn, hüceyrə diferensiasiyasının xarakteristikasında, bağırsaq fiziologiyasının tədqiqində, ana-mikrobiom ekosistemlərinin qurulmasında və xəstəliklərin modelləşdirilməsində qurulmuş bağırsaq epitelial təbəqələrinin necə istifadə oluna biləcəyinə dair nümunələr təqdim edir. bağırsaq çipində.MUC2 siqnalı qabıq hüceyrələrində və selikli qişa səthlərindən ifraz olunan selikdə mövcuddur. Bağırsaq fiziologiyasındakı flüoresan şəkillərdə flüoresan buğda rüşeyminin aqlutininindən istifadə edərək sial turşusu və N-asetilqlükozamin qalıqları üçün boyanma nəticəsində əmələ gələn selik göstərilir. İki üst-üstə düşən ev sahibi komikrobikulyar təsvirlər "Mikro-H"-ni göstərir. çipdə bağırsaqda s. Sol panel mikromühəndisləşdirilmiş 3D Caco-2 epitel hüceyrələri ilə yaşıl flüoresan zülalı (GFP) ifadə edən E. coli-nin birgə kulturasını göstərir. Sağ panel 3D Caco-2 epitel hüceyrələri ilə birgə kulturasiya edilən GFP E. coli-nin lokalizasiyasını göstərir. bakterial antigenlər (məsələn, lipopolisakkarid, LPS) və immun hüceyrələri (məsələn, PBMC) ilə fizioloji sınaq altında bağırsaq iltihabı çiplərində sağlam və sızan bağırsağı təsvir edir;yaşıl).Caco-2 hüceyrələri 3D epitel təbəqəsi yaratmaq üçün becərildi. Şkala zolağı, 50 µm. Aşağı cərgədə şəkillər: “Hüceyrələrin fərqləndirilməsi” istinaddan icazə ilə uyğunlaşdırılıb.2.Oxford University Press;Ref.5-in icazəsi ilə təkrar istehsal edilmişdir.NAS;Ref.3-ün icazəsi ilə uyğunlaşdırılmış “Host-Microb Co-Culture”.NAS;“Xəstəliklərin Modelləşdirilməsi” arayışın icazəsi ilə uyğunlaşdırılmışdır.5.NAS.
Həm çip-çip, həm də hibrid çiplər silikon qəliblərdən yumşaq litoqrafiya ilə sökülən və SU-8 ilə naxışlanmış PDMS replikalarından istifadə etməklə hazırlanmışdır1,44. Hər bir çipdəki mikrokanalların dizaynı kəsilmə gərginliyi və hidrodinamik təzyiq kimi hidrodinamika nəzərə alınmaqla müəyyən edilir.1,4,12. paralel düz mikrokanallar meydana gətirdi, çipdə bir kompleksə çevrildi (Genişləndirilmiş Məlumat Şəkil. 1b) Mayenin qalma müddətini, qeyri-xətti axın modellərini və mədəni hüceyrələrin çoxoxlu deformasiyasını induksiya etmək üçün bir cüt əyri mikrokanal ehtiva edən (Şəkil 2a-f) daha çox kompleks biokanallara ehtiyac var. seçilə bilər. Biz nümayiş etdirmişik ki, bükülmüş Qut-Chip eyni zamanda, mədəni hüceyrə tipindən asılı olmayaraq, orijinal Qut-Chip ilə müqayisədə oxşar epitelial artım dərəcəsi ilə oxşar zaman çərçivəsində 3D morfogenezi güclü şəkildə induksiya edir. Buna görə də, 3D morfogenezi induksiya etmək üçün, xətti və bir-birini əvəz edə bilən silsilələr. SU-8 naxışlı ds qəlibdən çıxarıldıqdan sonra mənfi xüsusiyyətlər təmin etdi (Şəkil 2).2a).Bir çip üzərində bağırsağı hazırlamaq üçün hazırlanmış yuxarı PDMS təbəqəsi ardıcıl olaraq məsaməli bir PDMS filminə bağlandı və sonra bir korona təmizləyicidən istifadə edərək geri dönməz bağlanma yolu ilə aşağı PDMS təbəqəsi ilə uyğunlaşdırıldı (Şəkil 2b-f). Hibrid çipləri hazırlamaq üçün, müalicə olunan PDMS replikaları tək-tək transparan cihazlara birləşdirilə bilən trans-kanallı cihazlara birləşdirilə bilərdi. quyu daxilləri (Şəkil. 2h və Genişləndirilmiş Məlumat Fig. 2). Bağlama prosesi PDMS replikasının və şüşənin səthlərinin oksigen plazması və ya korona müalicəsi ilə işlənməsi ilə həyata keçirilir.Silikon boruya qoşulmuş mikrofabrikasiya cihazının sterilizasiyasından sonra cihazın quraşdırılması 3D morfogenezinin 2-ci testini yerinə yetirməyə hazır idi.
a, SU-8 naxışlı silikon qəliblərdən PDMS hissələrinin hazırlanmasının sxematik təsviri. Təmizlənməmiş PDMS məhlulu silikon qəlibə (solda) töküldü, 60 °C-də (ortada) bərkidildi və qəlibdən çıxarıldı (sağda). Qəlibdən çıxarılan PDMS parçalara kəsildi və sonrakı istifadə üçün təmizləndi.b, Silisium təbəqəsinin hazırlanmasında istifadə olunan PDMS fotoşəkli. PDMS məsaməli membranını hazırlamaq üçün istifadə olunur.d, Yuxarı və aşağı PDMS komponentlərinin və yığılmış çip üzərindəki bağırsaq cihazının fotoşəkilləri seriyası.e, Üst, membran və aşağı PDMS komponentlərinin hizalanmasının sxemi. Hər bir təbəqə plazma və ya korona müalicəsi ilə geri dönməz şəkildə bağlanır. s və vakuum kameraları.g, Mikrofluidik hüceyrə mədəniyyəti üçün çip üzərində bağırsağın qurulması. Silikon boru və şpris ilə yığılmış çip üzərində hazırlanmış bağırsaq örtüyünə yerləşdirilib. Çip cihazı emal üçün 150 mm Petri qabının qapağına yerləşdirilib. hibrid çiplərdən istifadə etməklə morfogenez. Mədəniyyət üçün müstəqil olaraq hazırlanmış Transwell insertləri Bağırsaq epitel hüceyrələrinin 2D monolayları bağırsağın 3D morfogenezini induksiya etmək üçün hibrid çipə daxil edilmişdir. Mühit Transwell insertində qurulmuş hüceyrə qatının altındakı mikrokanallar vasitəsilə perfuziya olunur, Remission insert, cm.4Sca.Elsevier.
Bu protokolda Caco-2 hüceyrə xətti və bağırsaq orqanoidləri epiteliya mənbələri kimi istifadə edilmişdir (Şəkil 3a). Hər iki növ hüceyrə müstəqil şəkildə becərilmişdir (Qutu 2 və Qutu 5) və çip üzərindəki bağırsaqların və ya Transwell insertlərinin ECM ilə örtülmüş mikrokanallarını əkmək üçün istifadə edilmişdir. en pasajlar 10 və 50) tripsinizasiya mayesi (qutu 2) ilə dissosiasiya olunmuş hüceyrə süspansiyonlarını hazırlamaq üçün T-kolbalarda yığılır. Bağırsaq biopsiyalarından və ya cərrahi rezeksiyalardan alınan insan bağırsaq orqanoidləri 24 quyudan ibarət lövhələrdə Matrigel iskele qübbələrində becərilmişdir. spondin, və Noggin) və böyümə faktorları 3-cü Qutuda təsvir olunduğu kimi hazırlanmış orqanoidlər diametri ~500 µm-ə qədər böyüyənə qədər hər gün əlavə edilmişdir. Tamamilə yetişmiş orqanoidlər yığılır və bağırsaqlara və ya çip üzərində Transwell əlavələrinə əkmək üçün tək hüceyrələrə bölünür (Qutu 5). Əvvəllər bildirdiyimiz kimi, müxtəlif növ Crouleg13 ola bilər. n xəstəliyi, kolorektal xərçəng və ya normal donor), lezyon yeri (məsələn, zədələnməmiş sahə ilə müqayisədə lezyon) və traktdakı mədə-bağırsaq yeri (məsələn, onikibarmaq bağırsaq, jejunum, ileum, cecum, kolon və ya düz bağırsaq). Biz 5-ci Qutuda optimallaşdırılmış protokolu təqdim edirik. s.
a, Bağırsaq çipində bağırsaq morfogenezinin induksiyası üçün iş axını. 3D morfogenezi nümayiş etdirmək üçün bu protokolda Caco-2 insan bağırsaq epiteli və bağırsaq orqanoidləri istifadə olunur. İzolyasiya olunmuş epitel hüceyrələri hazırlanmış çip üzərində bağırsaq cihazına əkilmişdir (hüceyrələrə yapışdırılmışdır) (hüceyrələrə yapışdırılmışdır). MS-in məsaməli membranı 0-cı gündə (D0), apikal (AP) axın başlayır və ilk 2 gün ərzində saxlanılır (axın, AP, D0-D2). Bazolateral (BL) axın da siklik uzanma hərəkətləri (uzatma, axın, AP və BL) ilə birlikdə başlanır. idik mədəniyyət (morfogenez, D5).Faza kontrast şəkilləri hər bir eksperimental addımda və ya zaman nöqtəsində Caco-2 hüceyrələrinin təmsilçi morfologiyasını göstərir (bar qrafiki, 100 µm). Bağırsaq morfogenezinin müvafiq şəlalələrini təsvir edən dörd sxematik diaqram (yuxarı sağda). Sxematik oxlar S mayenin formalaşmış səthini göstərir. -2 epitel (solda). Böyüdülmüş sahəni vurğulayan daxiletmə (ağ kəsikli qutu) 3D Caco-2 qatında (sağda) bərpa olunmuş mikrovilliləri göstərir (sağda).c, qurulmuş Caco-2 3D-nin üfüqi ön görünüşü, klaudin (ZO-1, qırmızı) və F-aktin (yaşıl) hüceyrələrin epiteli (yaşıl) və vizual konsentrasiyası ilə işarələnmiş davamlı fırça sərhəd membranları bağırsaq çiplərində.Orta sxemə işarə edən oxlar hər bir konfokal görünüş üçün fokus müstəvisinin yerini göstərir.d, 3, 7, 9, 11 və 13-cü günlərdə faza kontrast mikroskopiyası ilə əldə edilmiş çipdə becərilmiş orqanoidlərdə morfoloji dəyişikliklərin vaxt kursu. İçəridə (yuxarı sağda) D orqanının müəyyən edilmiş yüksək böyüdülməsi epikromilik təsviri göstərilir. 7.f günündə çəkilmiş dilimdəki bağırsaq, Kök hüceyrələr üçün markerləri göstərən üst-üstə yığılmış immunofluoressensiya şəkilləri (LGR5;epitel təbəqəsində müvafiq olaraq (Sol) və 13 günlük (orta) orqanoidlərdə 3 gün ərzində bağırsaq çiplərində yetişdirilən goblet hüceyrələri (MUC2; yaşıl), F-aktin (boz) və nüvələr (siyan). Mədəniyyətin 13-cü günündə plazma membranını CellMask boyası ilə (sağda) boyamaqla çip üzərində bağırsaqda qurulmuş 3D orqanoid epitel. Başqa cür qeyd edilmədiyi təqdirdə miqyas zolağı 50 μm-dir.b İstinadın icazəsi ilə yenidən çap edilmişdir.2.Oxford University Press;c İstinadın icazəsi ilə uyğunlaşdırılmışdır.2.Oxford University Press;e və f istinadla icazə ilə uyğunlaşdırılmışdır.12 Creative Commons Lisenziyası CC BY 4.0.
Çipdəki bağırsaqda, uğurlu ECM örtüyü üçün PDMS məsaməli membranının hidrofobik səthini dəyişdirmək lazımdır. Bu protokolda biz PDMS membranlarının hidrofobikliyini dəyişdirmək üçün iki fərqli üsul tətbiq edirik. Caco-2 hüceyrələrini yetişdirmək üçün yalnız UV/ozon müalicəsi ilə səthin aktivləşdirilməsi kifayət idi, PCMMS2 membranının hidrofobikliyini azaltmaq və PCMMS2 membranının hidrofobikliyini azaltmaq. .Lakin orqanoid epitelin mikrofluidik kulturası polietilenimin (PEI) və qlutaraldehidi ardıcıl olaraq PDMS mikrokanallarına tətbiq etməklə ECM zülallarının səmərəli çökməsinə nail olmaq üçün kimyəvi əsaslı səth funksionallaşdırılması tələb edir. Səth modifikasiyasından sonra ECM zülalları örtmək üçün yatırıldı. maye hüceyrə mədəniyyəti hüceyrələr tam monolayer meydana gətirənə qədər yuxarı mikrokanalda yalnız mühiti perfuziya etməklə başlayır, aşağı mikrokanal isə statik şəraiti saxlayır. Səthin aktivləşdirilməsi və ECM örtüyü üçün bu optimallaşdırılmış üsul PDMS səthində 3D morfogenezi induksiya etmək üçün orqanoid epitelin əlavə olunmasına imkan verir.
Transwell mədəniyyətləri də hüceyrə toxumundan əvvəl ECM örtüyü tələb edir;lakin Transwell kulturaları məsaməli əlavələrin səthini aktivləşdirmək üçün mürəkkəb ilkin müalicə addımlarını tələb etmir. Transwell əlavələrində Caco-2 hüceyrələrinin böyüməsi üçün məsaməli əlavələr üzərində ECM örtüyü dissosiasiya edilmiş Caco-2 hüceyrələrinin yapışmasını (<1 saat) və sıx birləşmə maneəsinin əmələ gəlməsini sürətləndirir (<1-2 gün). membran səthinə ed (<3 h) və orqanoidlər maneə bütövlüyü ilə tam monolayer təşkil qədər saxlanılır .Transwell kulturalar hibrid çiplərdən istifadə edilmədən 24 quyu boşqablarında aparılır.
In vitro 3D morfogenez, müəyyən edilmiş epiteliya təbəqəsinin bazolateral tərəfinə maye axını tətbiq etməklə başlana bilər. Çipdə bağırsaqda epitelial morfogenez mühitin yuxarı və aşağı mikrokanallara perfuziya edildiyi zaman başlamışdır (Şəkil 3a). Əvvəllər təsvir edildiyi kimi, maye axınının yan tərəfə axınının (yanal axınının və ya selikli qişanın təkrar axınının) tətbiqi çox vacibdir. morfogen inhibitorları. Məsaməli membranlarla bağlanmış hüceyrələrə kifayət qədər qida və zərdab təmin etmək və luminal kəsmə stressini yaratmaq üçün biz adətən çipdə bağırsaqda ikili axın tətbiq edirik. Hibrid çiplərdə, epitelial monolayları ehtiva edən Transwell insertləri hibrid çiplərə daxil edilmişdir. Daha sonra, transwell insertləri basesin morpogenezin alt hissəsinə transwell vasitəsilə tətbiq edilmişdir. hər iki mədəniyyət platformasında bazolateral axının başlamasından 3-5 gün sonra meydana gəldi.
Mikromühəndisləşdirilmiş 3D epitel təbəqələrinin morfoloji xüsusiyyətləri faza kontrast mikroskopiyası, diferensial müdaxilə kontrast (DIC) mikroskopiyası, SEM və ya immunofluoressensiya konfokal mikroskopiyası (Şəkil 3 və 4) daxil olmaqla müxtəlif görüntüləmə üsullarının tətbiqi ilə təhlil edilə bilər. telial təbəqələr. PDMS və polyester filmlərin optik şəffaflığına görə həm çipdə bağırsaq, həm də hibrid çip platformaları cihazın kəsilməsinə və ya sökülməsinə ehtiyac olmadan real vaxtda yerində təsviri təmin edə bilər. İmmunofluoressensiya təsvirini həyata keçirərkən (Şəkil 1, 4b/səciyyəvi olaraq hüceyrələr ilə sabitlənmişdir) aldehid (PFA), ardınca Triton X-100 və 2% (ağırlıq/həc) iribuynuzlu zərdab albumini (BSA) sıra ilə. Hüceyrə tipindən asılı olaraq müxtəlif fiksatorlar, keçiricilər və bloklayıcı maddələr istifadə edilə bilər. Nəsildən asılı hüceyrə və ya bölgəni hədəf alan ilkin antikorlar, yüksək işıqlı hüceyrələr ilə birlikdə ikinci əks-hərəkətli hüceyrələr tərəfindən istifadə olunur. nüvəni (məsələn, 4′,6-diamidino-2-fenilen) indol, DAPI) və ya F-aktini (məsələn, flüoresanla etiketlənmiş phalloidin) hədəfləyən ləkə boyası. Mucus istehsalını aşkar etmək üçün flüoresan əsaslı canlı görüntüləmə də yerində həyata keçirilə bilər (Şəkil 1).1, “Hüceyrə diferensiasiyası” və “Bağırsaq fiziologiyası”), mikrob hüceyrələrinin təsadüfi kolonizasiyası (Şəkil 1, “Host-mikrob birgə mədəniyyəti”), immun hüceyrələrin cəlb edilməsi (Şəkil 1, “Xəstəliyin Modelləşdirilməsi”) və ya 3D epitel morfologiyasının konturları (Şəkil 3b, çiplərin dəyişdirilməsi). yuxarı təbəqəni aşağı mikrokanal təbəqədən ayırmaq üçün, ref.2-də göstərildiyi kimi, 3D epiteliya morfologiyası, eləcə də apikal fırçanın sərhədindəki mikrovillilər SEM ilə görüntülənə bilər (Şəkil 3b). Fərqləndirmə markerlərinin ifadəsi kəmiyyət PCR5 yerinə yetirməklə qiymətləndirilə bilər. s və ya hibrid çiplər tripsinizasiya yolu ilə yığılır və sonra molekulyar və ya genetik analiz üçün istifadə olunur.
a, Hibrid çipdə bağırsaq morfogenezinin induksiyası üçün iş axını. Caco-2 və bağırsaq orqanoidləri bu protokolda hibrid çip platformasında 3D morfogenezi nümayiş etdirmək üçün istifadə olunur. Ayrılmış epitel hüceyrələri hazırlanmış Transwell əlavələrinə səpilmişdir (aşağıda TW transvelası əlavə edilmiş hüceyrələr) və membrana əlavə olunmuş hüceyrələr (aşağıda təsvir edilmişdir). quyu daxiletmələrində, bütün hüceyrələr statik şəraitdə (TW mədəniyyəti) becərildi. 7 gündən sonra, epitel hüceyrələrinin 2D monoqatını ehtiva edən tək Transwell inserti, bazolateral axını (Flow, BL) təqdim etmək üçün hibrid çipə inteqrasiya edildi, bu da nəticədə 3D epitelial təbəqənin (insan epitelinin mikroorqanlarının konfiqurasiya xüsusiyyətlərini göstərən 3D konfiqurasiya) əmələ gəlməsinə səbəb oldu. hər eksperimental addımda və ya zaman nöqtəsində normal donordan (C103 xətti) yüksələn kolondan əldə edilən lial hüceyrələr. Yuxarı təbəqələrdəki sxemlər hər bir addım üçün eksperimental konfiqurasiyanı göstərir.b, Hibrid çiplər (solda sxematik) orqanoid epitel hüceyrələrinin 3D morfogenezinə səbəb ola bilər (yuxarıdan aşağıya doğru, müxtəlif mikroskopik görünüşlərə malik Z və aşağı konfiqurasiyalar;sağ sxematik və uyğun nöqtəli xətlərə baxın).aşkar morfoloji xüsusiyyətlər göstərdi. F-aktin (göy), nüvə (boz).c, 2D ilə müqayisədə hibrid çiplə (ən böyük tam çəkiliş) və statik Transveldə (TW; ağ kəsikli qutuda daxil edilmiş) becərilmiş orqanoid törəmə epitel hüceyrələrinin floresan konfokal mikroqrafikləri (3D bucaqlı görünüş). şaquli çarpaz görünüşlər (yuxarı sağ küncdə yerləşdirilmiş; “XZ”) həmçinin 2D və 3D xüsusiyyətlərini göstərir. Ölçək çubuğu, 100 µm.c İstinadın icazəsi ilə yenidən çap edilmişdir.4.Elsevier.
Nəzarətlər eyni hüceyrələrin (Caco-2 və ya bağırsaq orqanoid epitel hüceyrələri) ənənəvi statik mədəniyyət şəraitində iki ölçülü monolayerlərə kulturasiyası ilə hazırlana bilər. Qeyd edək ki, mikrokanalların məhdud həcm tutumuna görə qida maddələrinin tükənməsi (yəni, orijinal bağırsaq çipinin dizaynında yuxarı kanalda ~ 4 µL, həmçinin epitelin lateral tətbiqindən əvvəl və epitelin lateral tətbiqi ola bilər). müqayisə.
Yumşaq litoqrafiya prosesi təmiz otaqda aparılmalıdır. Çipdəki hər bir təbəqə (yuxarı və aşağı təbəqələr və membranlar) və hibrid çiplər üçün müxtəlif fotomaskalar istifadə edilmiş və ayrı-ayrı silikon vaflilərdə hazırlanmışdır, çünki mikrokanalların hündürlükləri fərqli idi. çip 200 µm-dir.
3 düymlük silikon vaflini asetonlu qaba qoyun. Plitəni 30 saniyə yumşaq bir şəkildə çevirin, sonra vafli havada qurudun. Vaflini IPA ilə boşqaba köçürün, sonra təmizləmək üçün boşqabı 30 saniyə fırladın.
Silikon vafli səthindən üzvi qalıqları maksimum dərəcədə təmizləmək üçün piranya məhlulu (hidrogen peroksid və konsentratlaşdırılmış sulfat turşusu qarışığı, 1:3 (həcm/həcm)) isteğe bağlı olaraq istifadə edilə bilər.
Piranha məhlulu son dərəcə aşındırıcıdır və istilik yaradır. Əlavə təhlükəsizlik tədbirləri lazımdır. Tullantıların utilizasiyası üçün məhlulun soyumasını və təmiz, quru tullantı qabına köçürməsini gözləyin. İkinci dərəcəli qablardan istifadə edin və tullantı qablarını düzgün etiketləyin. Daha ətraflı prosedurlar üçün obyektin təhlükəsizlik qaydalarına əməl edin.
Vafliləri 10 dəqiqə ərzində 200 °C-də isti boşqaba yerləşdirməklə susuzlaşdırın. Susuzlaşdırmadan sonra vafli soyumaq üçün beş dəfə havada çalxalandı.
Təmizlənmiş silikon vaflinin mərkəzinə ~10 q fotorezist SU-8 2100 tökün. Fotorezisti vafli üzərində bərabər şəkildə yaymaq üçün cımbızdan istifadə edin. Fotorezistin daha az yapışqan və daha asan yayılması üçün vaflini bəzən 65°C qızdırılan plitə üzərinə qoyun. Vafli birbaşa isti plitə üzərinə qoymayın.
SU-8 spin örtüyünü işlətməklə vafli üzərində bərabər paylandı. SU-8-in daxil olan fırlanmasını 5-10 saniyə ərzində 100 rpm/s sürətlənmə ilə 500 rpm-də yaymaq üçün proqramlaşdırın. Əsas fırlanmanı 200 µm qalınlıqda naxışlama üçün 1,500 µm qalınlıqda (a 500 µm və ya 500 µm qalınlığında) təyin edin çipdəki bağırsağın yuxarı təbəqəsi üçün m hündürlük; aşağıda “Kritik addımlar”a baxın) 300 rpm/s sürətlənmə ilə 1200 rpm-də 30 saniyə təyin edin.
Əsas fırlanma sürəti silikon vafli üzərindəki SU-8 naxışının hədəf qalınlığına uyğun olaraq tənzimlənə bilər.
Çipdə bağırsağın yuxarı təbəqəsi üçün 500 µm hündürlükdə SU-8 naxışlarını hazırlamaq üçün bu Qutunun fırlanma örtüyü və yumşaq bişirmə mərhələləri (7 və 8-ci addımlar) ardıcıl olaraq təkrarlandı (bax. addım 9) 250 µm-lik iki qat əldə etmək. .
Gofretləri 5 dəqiqə ərzində 65 °C-də isti boşqaba yerləşdirməklə SU-8 ilə örtülmüş vafliləri yumşaq bişirin, sonra parametri 95 °C-yə keçirin və əlavə 40 dəqiqə inkubasiya edin.
Yuxarı mikrokanalda SU-8 naxışının 500 μm hündürlüyünə nail olmaq üçün 250 μm qalınlığında iki SU-8 təbəqəsi yaratmaq üçün 7 və 8-ci addımları təkrarlayın.
UV Maska Düzləşdiricisindən istifadə edərək, vaflinin ekspozisiya vaxtını hesablamaq üçün istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq lampa testini həyata keçirin.(ekspozisiya müddəti, ms) = (ekspozisiya dozası, mJ/sm2)/(lampa gücü, mV/sm2).
Ekspozisiya müddətini təyin etdikdən sonra fotomaskanı UV maska ​​düzləşdiricisinin maska ​​tutacağına yerləşdirin və fotomaskanı SU-8 ilə örtülmüş vafli üzərinə qoyun.
UV dispersiyasını minimuma endirmək üçün fotomaskanın çap olunmuş səthini birbaşa silikon vaflinin SU-8 ilə örtülmüş tərəfinə qoyun.
SU-8 ilə örtülmüş vafli və foto maskanı əvvəlcədən müəyyən edilmiş ekspozisiya müddəti üçün şaquli olaraq 260 mJ/sm2 UV işığına məruz qoyun (bu qutunun 10-cu addımına baxın).
Ultrabənövşəyi radiasiyaya məruz qaldıqdan sonra, SU-8 ilə örtülmüş silikon vaflilər 200 μm hündürlükdə naxışlar hazırlamaq üçün hər isti boşqabda 65°C-də 5 dəqiqə və 95°C-də 15 dəqiqə bişirildi. 50 µm hündürlükdə naxışlar hazırlamaq üçün sobadan sonrakı vaxtı 95 °C-də 30 dəqiqəyə qədər artırın.
Tərtibatçı şüşə qaba tökülür və bişmiş gofret qaba qoyulur. SU-8 tərtibatçısının həcmi şüşə boşqabın ölçüsündən asılı olaraq dəyişə bilər. Açıqlanmamış SU-8-i tamamilə çıxarmaq üçün kifayət qədər SU-8 tərtibatçısından istifadə etməyinizə əmin olun. Məsələn, 150 mm diametrli şüşə qabdan 1 L tutumlu istifadə edərkən, mol8000 dəqiqə istifadə edin. arabir yumşaq fırlanma ilə.
Hazırlanmış qəlibi ~ 10 mL təzə inkişaf etdirici ilə yaxalayın, ardından bir pipetdən istifadə edərək məhlulu çiləyərək IPA edin.
Gofreti plazma təmizləyicisinə qoyun və oksigen plazmasına (atmosfer qazı, hədəf təzyiqi 1 × 10−5 Torr, güc 125 Vt) 1,5 dəqiqə buraxın.
Gofreti içərisində şüşə slayd olan vakuum desikatoruna qoyun.Vafferlər və slaydlar yan-yana yerləşdirilə bilər.Vakuum desikatoru boşqab vasitəsilə bir neçə təbəqəyə bölünürsə, slaydları alt kameraya, vafliləri isə yuxarı kameraya yerləşdirin. e məhlulu şüşə slaydın üzərinə tökün və silanizasiya üçün vakuum tətbiq edin.
Dondurulmuş Caco-2 hüceyrələrinin bir flakonunu 37°C su banyosunda əridin, sonra əridilmiş hüceyrələri 15 mL 37°C əvvəlcədən isidilmiş Caco-2 mühiti olan T75 kolbasına köçürün.
Caco-2 hüceyrələrini ~90% birləşmədə keçmək üçün əvvəlcə isti Caco-2 mühiti, PBS və 0,25% tripsin/1 mM EDTA 37°C su banyosunda.
Vakuum aspirasiyası ilə mühiti aspirasiya edin. Vakuum aspirasiyasını təkrarlamaq və təzə PBS əlavə etməklə hüceyrələri iki dəfə 5 mL isti PBS ilə yuyun.