Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik.Siz məhdud CSS dəstəyi ilə brauzer versiyasından istifadə edirsiniz.Ən yaxşı təcrübə üçün sizə yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyi tövsiyə edirik (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq rejimini söndürün).Bundan əlavə, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün biz saytı üslub və JavaScript olmadan göstəririk.
Eyni anda üç slayddan ibarət karuseli göstərir.Eyni anda üç slayd arasında hərəkət etmək üçün Əvvəlki və Sonrakı düymələrindən istifadə edin və ya bir anda üç slayd arasında hərəkət etmək üçün sonundakı sürüşmə düymələrindən istifadə edin.
Qan-beyin baryeri və qan-beyin maneəsi bioterapevtik agentlərin mərkəzi sinir sistemində hədəflərinə çatmasının qarşısını alır və bununla da nevroloji xəstəliklərin effektiv müalicəsinə mane olur.Yeni beyin daşıyıcılarını in vivo aşkar etmək üçün biz T7 fag peptid kitabxanasını təqdim etdik və siçovulların kanullaşdırılmış şüurlu böyük hovuz modelindən istifadə edərək ardıcıl olaraq toplanmış qan və onurğa beyni mayesini (CSF) təqdim etdik.Xüsusi faq klonları dörd seçim turundan sonra CSF-də yüksək dərəcədə zənginləşdirilmişdir.Fərdi namizəd peptidlərin sınaqları CSF-də 1000-dən çox zənginləşməni aşkar etdi.Peptid vasitəsilə beyinə çatdırılmanın bioaktivliyi müəyyən edilmiş yeni tranzit peptidlə əlaqəli BACE1 peptid inhibitorundan istifadə edərək onurğa-beyin mayesində amiloid-β səviyyəsində 40% azalma ilə təsdiq edilmişdir.Bu nəticələr göstərir ki, in vivo faq seçmə üsulları ilə müəyyən edilmiş peptidlər terapevtik təsir göstərən makromolekulların beyinə sistemli çatdırılması üçün faydalı vasitələr ola bilər.
Mərkəzi sinir sistemi (CNS) məqsədli terapiya tədqiqatları əsasən beyinə aktiv dərman çatdırılmasını təmin edən mexanizmləri aşkar etmək üçün daha az səy göstərərək, CNS hədəfləmə xüsusiyyətlərini nümayiş etdirən optimallaşdırılmış dərmanların və agentlərin müəyyən edilməsinə yönəlmişdir.Bu, indi dəyişməyə başlayır, çünki dərmanların çatdırılması, xüsusən də böyük molekullar müasir nevrologiyanın dərman inkişafının ayrılmaz hissəsidir.Mərkəzi sinir sisteminin mühiti qan-beyin baryeri (BBB) ​​və qan-beyin baryeri (BCBB)1-dən ibarət olan serebrovaskulyar maneə sistemi tərəfindən yaxşı qorunur, bu da dərmanların beyinə çatdırılmasını çətinləşdirir1,2.Demək olar ki, bütün böyük molekullu dərmanların və kiçik molekullu dərmanların 98%-dən çoxunun beyindən xaric edildiyi təxmin edilir3.Buna görə terapevtik dərmanların CNS 4,5-ə səmərəli və spesifik çatdırılmasını təmin edən yeni beyin nəqliyyat sistemlərinin müəyyən edilməsi çox vacibdir.Bununla belə, BBB və BCSFB həm də geniş damar sistemi vasitəsilə beynin bütün strukturlarına nüfuz etdikləri üçün dərmanların çatdırılması üçün əla fürsət təqdim edir.Beləliklə, beynə çatdırılmanın qeyri-invaziv üsullarından istifadə etmək üçün mövcud səylər əsasən endogen BBB6 reseptorundan istifadə edərək reseptor vasitəçiliyi (PMT) mexanizminə əsaslanır.Transferrin reseptor yolu7,8 istifadə edərək son əsas irəliləyişlərə baxmayaraq, təkmilləşdirilmiş xassələrə malik yeni çatdırılma sistemlərinin daha da inkişafı tələb olunur.Bu məqsədlə, məqsədimiz CSF daşınmasına vasitəçilik edə bilən peptidləri müəyyən etmək idi, çünki onlar prinsipcə makromolekulları MSS-ə çatdırmaq və ya yeni reseptor yollarını açmaq üçün istifadə edilə bilər.Xüsusilə, serebrovaskulyar sistemin spesifik reseptorları və daşıyıcıları (BBB və BSCFB) bioterapevtik dərmanların aktiv və spesifik çatdırılması üçün potensial hədəflər kimi xidmət edə bilər.Serebrospinal maye (CSF) xoroid pleksusun (CS) ifrazat məhsuludur və subaraknoid boşluq və mədəcik boşluğu vasitəsilə beynin interstisial mayesi ilə birbaşa təmasda olur4.Bu yaxınlarda subaraknoid serebrospinal mayenin beynin interstitiumuna həddindən artıq diffuziya etdiyi göstərilmişdir9.Ümid edirik ki, bu subaraknoid axın yolundan və ya birbaşa BBB vasitəsilə parenximal boşluğa daxil ola bilərik.Buna nail olmaq üçün biz bu iki fərqli yoldan hər hansı biri ilə daşınan peptidləri ideal şəkildə müəyyən edən möhkəm in vivo faq seçim strategiyasını həyata keçirdik.
İndi biz ən yüksək kitabxana müxtəlifliyi ilə ilkin seçim raundlarına nəzarət etmək üçün yüksək ötürmə ardıcıllığı (HTS) ilə birləşdirilmiş CSF nümunəsi ilə ardıcıl in vivo faq nümayişi skrininq metodunu təsvir edirik.Qanın çirklənməsinin qarşısını almaq üçün daimi implantasiya edilmiş böyük sisterna (CM) kanülü ilə şüurlu siçovullarda skrininq aparıldı.Əhəmiyyətli olan odur ki, bu yanaşma həm beyin hədəfini, həm də serebrovaskulyar maneə vasitəsilə nəqliyyat fəaliyyəti olan peptidləri seçir.Kiçik ölçülərinə görə (~ 60 nm)10 T7 faqlarından istifadə etdik və onların endotel və/və ya epiteliya-medulla maneəsinin hüceyrələrarası keçidinə imkan verən veziküllərin daşınması üçün uyğun olduğunu təklif etdik.Dörd turdan sonra faj populyasiyaları təcrid olundu, bu da in vivo CSF-nin güclü zənginləşdirilməsini və beyin mikrodamar assosiasiyasını göstərdi.Əsas odur ki, biz üstünlük verilən və kimyəvi cəhətdən sintez edilmiş ən yaxşı namizəd peptidlərin zülal yüklərini onurğa-beyin mayesinə daşıya bildiyini nümayiş etdirməklə tapıntılarımızı təsdiq edə bildik.Birincisi, mərkəzi sinir sisteminin farmakodinamik təsirləri aparıcı tranzit peptidi BACE1 peptidinin inhibitoru ilə birləşdirməklə müəyyən edilmişdir.İn vivo funksional skrininq strategiyalarının yeni beyin nəqli peptidlərini effektiv zülal yük daşıyıcıları kimi müəyyən edə biləcəyini nümayiş etdirməklə yanaşı, biz oxşar funksional seçim yanaşmalarının yeni beyin daşıma yollarının müəyyən edilməsində də vacib olacağını gözləyirik.
Lövhə əmələ gətirən vahidlərə (PFU) əsaslanaraq, fag qablaşdırma addımından sonra, müxtəlifliyi təxminən 109 olan təsadüfi 12-mer xətti T7 faj peptidlərinin kitabxanası hazırlanmış və yaradılmışdır (bax: Materiallar və Metodlar).Qeyd etmək vacibdir ki, biz bu kitabxananı in vivo sürüşmədən əvvəl diqqətlə təhlil etmişik.Dəyişdirilmiş primerlərdən istifadə edərək faj kitabxana nümunələrinin PCR gücləndirilməsi birbaşa HTS-ə tətbiq olunan amplikonları yaratdı (Əlavə Şəkil 1a).a) HTS11 ardıcıllıq səhvləri, b) primerlərin keyfiyyətinə təsir (NNK)1-12 və c) gözləmə kitabxanasında vəhşi tipli (ağırlıq) faqların (skelet əlavələri) olması səbəbindən yalnız təsdiqlənmiş ardıcıllıq məlumatını çıxarmaq üçün ardıcıl filtrləmə proseduru həyata keçirildi (Əlavə Şəkil 1b).Bu filtr addımları bütün HTS ardıcıllıq kitabxanalarına aiddir.Standart kitabxana üçün cəmi 233 868 oxunuş əldə edilib, onlardan 39%-i filtr meyarlarından keçib və sonrakı turlar üçün kitabxana təhlili və seçim üçün istifadə edilib (Əlavə Şəkil 1c-e).Oxumalar əsasən 36 nukleotiddə zirvəsi olan 3 əsas cütün çoxluğu idi (Əlavə Şəkil 1c), kitabxana dizaynını (NNK) 1-12 təsdiqləyir.Qeyd edək ki, kitabxana üzvlərinin təqribən 11%-də 12 ölçülü vəhşi tipli (ağırlıqda) magistral PAGISRELVDKL əlavəsi və ardıcıllığın demək olar ki, yarısında (49%) əlavələr və ya silinmələr var idi.Kitabxana kitabxanasının HTS kitabxanadakı peptidlərin yüksək müxtəlifliyini təsdiqlədi: peptid ardıcıllığının 81% -dən çoxu yalnız bir dəfə tapıldı və yalnız 1,5% ≥4 nüsxədə meydana gəldi (Əlavə Şəkil 2a).Repertuardakı bütün 12 mövqedə amin turşularının (aa) tezlikləri degenerasiya olunmuş NKK repertuarının yaratdığı kodonların sayı üçün gözlənilən tezliklərlə yaxşı əlaqələndirilir (Əlavə Şəkil 2b).Bu əlavələr tərəfindən kodlanan aa qalıqlarının müşahidə edilən tezliyi hesablanmış tezliklə (r = 0.893) yaxşı əlaqələndirilir (Əlavə Şəkil 2c).Fag kitabxanalarının inyeksiya üçün hazırlanması endotoksinin gücləndirilməsi və çıxarılması mərhələlərini əhatə edir.Bunun əvvəllər fag kitabxanalarının müxtəlifliyini potensial olaraq azaltdığı göstərilmişdir12,13.Buna görə də, biz endotoksin çıxarılmasına məruz qalmış boşqab gücləndirilmiş faj kitabxanasını ardıcıllıqla sıraladıq və AA tezliyini qiymətləndirmək üçün onu orijinal kitabxana ilə müqayisə etdik.Orijinal hovuz ilə gücləndirilmiş və təmizlənmiş hovuz (Əlavə Şəkil 2d) arasında güclü korrelyasiya (r = 0.995) müşahidə edildi ki, bu da T7 faqından istifadə edərək plitələrdə gücləndirilmiş klonlar arasında rəqabətin böyük qərəzliyə səbəb olmadığını göstərir.Bu müqayisə hər bir kitabxanada tripeptid motivlərinin tezliyinə əsaslanır, çünki kitabxanaların müxtəlifliyi (~109) hətta HTS ilə də tam şəkildə tutula bilməz.Hər mövqedə aa tezliyinin təhlili, daxil edilmiş repertuarın son üç mövqeyində mövqedən asılı kiçik bir meyl aşkar etdi (Əlavə Şəkil 2e).Sonda belə qənaətə gəldik ki, kitabxananın keyfiyyəti və müxtəlifliyi məqbul idi və bir neçə seçim turu arasında faj kitabxanalarının gücləndirilməsi və hazırlanması səbəbindən müxtəliflikdə yalnız kiçik dəyişikliklər müşahidə edildi.
BBB və/və ya BCSFB vasitəsilə venadaxili (iv) yeridilmiş T7 faqının identifikasiyasını asanlaşdırmaq üçün şüurlu siçovulların CM-nə cərrahi olaraq kanula implantasiya etməklə serebrospinal maye nümunəsi götürülə bilər (Şəkil 1a-b).Biz in vivo seçimin ilk üç turunda iki müstəqil seçim qolundan (A və B qolları) istifadə etdik (Şəkil 1c).İlk üç seçim turunda təqdim edilən faqın ümumi miqdarını azaltmaqla seçimin sərtliyini tədricən artırdıq.Dördüncü turda sürüşmə üçün biz A və B filiallarından nümunələri birləşdirdik və üç əlavə müstəqil seçim etdik.Bu modeldə T7 faq hissəciklərinin in vivo xassələrini öyrənmək üçün vəhşi tipli faq (PAGISRELVDKL master insert) quyruq damarı vasitəsilə siçovullara yeridildi.Müxtəlif vaxt nöqtələrində serebrospinal mayedən və qandan faqların bərpası nisbətən kiçik T7 ikozahedral faqların qan bölməsindən sürətli ilkin təmizlənmə mərhələsinə malik olduğunu göstərdi (Əlavə Şəkil 3).Tətbiq olunan titrlərə və siçovulların qan həcminə əsaslanaraq, biz hesabladıq ki, çəki yalnız təxminən 1% təşkil edir.venadaxili inyeksiyadan 10 dəqiqə sonra qanda qəbul edilmiş dozadan fag aşkar edilmişdir.Bu ilkin sürətli enişdən sonra, 27,7 dəqiqəlik yarımxaricolma dövrü ilə daha yavaş birincil klirens ölçüldü.Əhəmiyyətli olan odur ki, CSF bölməsindən yalnız çox az faq götürülüb, bu, vəhşi tipli faqların CSF bölməsinə miqrasiyasının aşağı fonunu göstərir (Əlavə Şəkil 3).Bütün nümunə götürmə dövründə (0-250 dəq) serebrospinal mayedə orta hesabla qanda yalnız təxminən 1 x 10-3% T7 faq titri və ilkin infuziya edilmiş faqların 4 x 10-8%-i aşkar edilmişdir.Xüsusilə, serebrospinal mayedə vəhşi tipli faqların yarı ömrü (25,7 dəqiqə) qanda müşahidə olunana oxşar idi.Bu məlumatlar göstərir ki, CSF bölməsini qandan ayıran maneə CM-kanulasiya edilmiş siçovullarda toxunulmazdır və bu, qandan CSF bölməsinə asanlıqla daşınan klonları müəyyən etmək üçün fag kitabxanalarının in vivo seçiminə imkan verir.
(a) Böyük hovuzdan serebrospinal mayenin (CSF) təkrar nümunəsinin götürülməsi üçün metodun qurulması.(b) Mərkəzi sinir sistemi (CNS) maneəsinin hüceyrə yerini və qan-beyin baryerini (BBB) ​​və qan-beyin baryerini keçən peptidləri müəyyən etmək üçün istifadə edilən seçim strategiyasını göstərən diaqram.(c) In vivo faqların ekran skrininq cədvəli.Hər seçim turunda faglar (oxların içərisində heyvan identifikatorları) venadaxili yeridilirdi.İki müstəqil alternativ filial (A, B) seçimin 4-cü mərhələsinə qədər ayrıca saxlanılır.3 və 4-cü seçim turları üçün CSF-dən çıxarılan hər bir faq klonu əl ilə ardıcıllıqla sıralandı.(d) T7 peptid kitabxanasının (2 x 1012 faq/heyvan) venadaxili yeridilməsindən sonra iki kanullaşdırılmış siçovulda seçimin birinci raundunda qandan (qırmızı dairələr) və onurğa beyni mayesindən (yaşıl üçbucaqlar) təcrid olunmuş faqın kinetikası.Mavi kvadratlar ümumi qanın həcmi nəzərə alınmaqla vurulan fagın miqdarından hesablanan qanda fagın orta ilkin konsentrasiyasını göstərir.Qara kvadratlar qan fag konsentrasiyalarından ekstrapolyasiya edilən y xəttinin kəsişmə nöqtəsini göstərir.(e,f) Peptiddə tapılan bütün mümkün üst-üstə düşən tripeptid motivlərinin nisbi tezliyini və paylanmasını təqdim edin.1000 oxunuşda tapılan motivlərin sayı göstərilir.Əhəmiyyətli dərəcədə (p < 0,001) zənginləşdirilmiş motivlər qırmızı nöqtələrlə işarələnmişdir.(e) İnyeksiya edilmiş kitabxananın tripeptid motivinin nisbi tezliyini №1.1 və №1.2 heyvanların qanından əldə edilən faqla müqayisə edən korrelyasiya səpələnməsi.(f) Qanda və onurğa-beyin mayesində təcrid olunmuş heyvan faqı tripeptid motivlərinin №1.1 və №1.2-nin nisbi tezliklərini müqayisə edən korrelyasiya səpələnməsi.(g, h) Hər iki heyvanda in vivo seçimdən sonra qanla zənginləşdirilmiş faqın (g) inyeksiya edilmiş kitabxanalara qarşı və CSF ilə zənginləşdirilmiş faqın (h) qana qarşı ardıcıl identifikatoru.Bir hərfli kodun ölçüsü həmin amin turşusunun həmin mövqedə nə qədər tez-tez baş verdiyini göstərir.Yaşıl = qütb, bənövşəyi = neytral, mavi = əsas, qırmızı = turşu və qara = hidrofobik amin turşuları.Şəkil 1a, b Eduard Urich tərəfindən hazırlanmış və hazırlanmışdır.
Biz iki CM aləti siçovuluna (A və B təbəqələri) və onurğa beyni mayesindən və qandan təcrid olunmuş faqlara faj peptid kitabxanasını yeritdik (Şəkil 1d).Kitabxananın ilkin sürətli təmizlənməsi vəhşi tipli faqla müqayisədə daha az nəzərə çarpırdı.Hər iki heyvanda inyeksiya edilmiş kitabxananın orta yarımxaricolma dövrü qanda 24,8 dəqiqə, yabanı tipli faqlara bənzər, CSF-də isə 38,5 dəqiqə olmuşdur.Hər bir heyvandan alınan qan və serebrospinal maye faq nümunələri HTS-ə məruz qaldı və bütün müəyyən edilmiş peptidlər qısa tripeptid motivinin olması üçün təhlil edildi.Tripeptid motivləri seçilmişdir, çünki onlar strukturun formalaşması və peptid-protein qarşılıqlı əlaqəsi üçün minimal əsas verir14,15.İnyeksiya edilmiş faq kitabxanası və hər iki heyvanın qanından çıxarılan klonlar arasında motivlərin paylanmasında yaxşı korrelyasiya tapdıq (Şəkil 1e).Məlumatlar göstərir ki, kitabxananın tərkibi yalnız qan bölməsində az miqdarda zənginləşmişdir.Amin turşusu tezlikləri və konsensus ardıcıllığı Weblogo16 proqram təminatının uyğunlaşdırılmasından istifadə edərək hər mövqedə əlavə təhlil edilmişdir.Maraqlıdır ki, qan qlisin qalıqlarında güclü zənginləşmə tapdıq (şəkil 1g).Qan CSF-dən seçilmiş klonlarla müqayisə edildikdə, güclü seçim və motivlərin bir qədər seçilməsi müşahidə edildi (Şəkil 1f) və müəyyən amin turşuları 12 üzvdə əvvəlcədən müəyyən edilmiş mövqelərdə üstünlük təşkil edirdi (Şəkil 1h).Xüsusilə, fərdi heyvanlar serebrospinal mayedə əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənirdi, halbuki hər iki heyvanda qan qlisinin zənginləşməsi müşahidə edilmişdir (Əlavə Şəkil 4a-j).№1.1 və №1.2 heyvanların serebrospinal mayesində ardıcıllıq məlumatlarının ciddi şəkildə süzülməsindən sonra cəmi 964 və 420 unikal 12-mer peptidləri əldə edildi (Əlavə Şəkil 1d-e).Təcrid olunmuş faq klonları gücləndirildi və in vivo seçimin ikinci mərhələsinə məruz qaldı.İkinci seçim turundan çıxarılan faqlar hər bir heyvanda HTS-ə məruz qaldı və bütün müəyyən edilmiş peptidlər tripeptid motivlərinin baş verməsini təhlil etmək üçün motiv tanıma proqramına giriş kimi istifadə edildi (Şəkil 2a, b, ef).CSF-dən bərpa edilən faqın birinci dövrü ilə müqayisədə biz A və B budaqlarında CSF-də bir çox motivlərin daha çox seçilməsini və seçilməməsini müşahidə etdik (Şəkil 2).Onların ardıcıl ardıcıllığın müxtəlif nümunələrini təmsil edib etmədiyini müəyyən etmək üçün şəbəkə identifikasiyası alqoritmi tətbiq edilmişdir.Alternativ A sinfində (Şəkil 2c, d) və B təbəqəsində (Şəkil 2g, h) CSF tərəfindən bərpa edilən 12 ölçülü ardıcıllıq arasında aydın oxşarlıq müşahidə edildi.Hər bir filialda birləşdirilmiş təhlil 12-mer peptidlər üçün fərqli seçim profillərini (Əlavə Şəkil 5c, d) və birinci seçim turu ilə müqayisədə ikinci seçim turundan sonra yığılmış klonlar üçün zamanla CSF/qan titri nisbətində artım aşkar etdi (Əlavə Şəkil 5e).).
Serebrospinal mayedə motivlərin və peptidlərin in vivo funksional faq nümayişi seçiminin iki ardıcıl raundu ilə zənginləşdirilməsi.
Hər bir heyvanın (1.1 və №1.2 heyvanlar) birinci raundundan əldə edilən bütün serebrospinal maye faqları birləşdirildi, gücləndirildi, HT-ardıcıllaşdırıldı və birlikdə yenidən vuruldu (2 x 1010 faq/heyvan) 2 SM qanullaşdırılmış siçovul (#1.1 → #).2.1 və 2.2, 1.2 → 2.3 və 2.4).(a,b,e,f) Birinci və ikinci seçim turlarında bütün CSF-dən əldə edilən faqların tripeptid motivlərinin nisbi tezliyini müqayisə edən korrelyasiya səpilmə qrafikləri.Hər iki oriyentasiyada peptidlərdə tapılan bütün mümkün üst-üstə düşən tripeptidləri təmsil edən motivlərin nisbi tezliyi və paylanması.1000 oxunuşda tapılan motivlərin sayı göstərilir.Müqayisə edilən kitabxanalardan birində əhəmiyyətli dərəcədə (p <0.001) seçilmiş və ya xaric edilmiş motivlər qırmızı nöqtələrlə vurğulanır.(c, d, g, h) İn vivo seçimin 2-ci və 1-ci raundlarına əsaslanan bütün CSF ilə zəngin 12 amin turşusu uzun ardıcıllığının ardıcıl loqosu təsviri.Bir hərfli kodun ölçüsü həmin amin turşusunun həmin mövqedə nə qədər tez-tez baş verdiyini göstərir.Loqonu təmsil etmək üçün iki seçim turu arasında ayrı-ayrı heyvanlardan çıxarılan CSF ardıcıllığının tezliyi müqayisə edilir və ikinci turda zənginləşdirilmiş ardıcıllıqlar göstərilir: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 və (h) #1.2–#2.4.(c, d) heyvanlarda müəyyən bir mövqedə ən zənginləşdirilmiş amin turşuları №.2.1 və №.2.2 və ya (g, h) heyvanlarda №.2.3 və №.2.4 rənglə göstərilmişdir.Yaşıl = qütb, bənövşəyi = neytral, mavi = əsas, qırmızı = turşu və qara = hidrofobik amin turşuları.
Üçüncü seçim turundan sonra biz iki heyvandan təcrid olunmuş 332 CSF-lə yenidən qurulmuş faq klonlarından 124 unikal peptid ardıcıllığını (#3.1 və #3.2) müəyyən etdik (Əlavə Şəkil 6a).LGSVS (18,7%) ardıcıllığı ən yüksək nisbi nisbətə malik olub, ondan sonra vəhşi tipli əlavələr PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) və SARGSWREIVSLS (2,2%) olub.Son dördüncü raundda biz üç ayrı heyvandan iki müstəqil seçilmiş filialı birləşdirdik (Şəkil 1c).CSF-dən əldə edilən 925 ardıcıl faq klonundan dördüncü raundda biz 64 unikal peptid ardıcıllığı tapdıq (Əlavə Şəkil 6b), onların arasında vəhşi tipli faqların nisbi nisbəti 0,8%-ə qədər azaldı.Dördüncü raundda ən çox rast gəlinən CSF klonları LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) və RLSSVD3,%CSDSD2 idi.%)).Seçilmiş peptidlərin uzunluq diapazonu NNK kitabxanasının dizaynı üçün degenerativ kodonlardan istifadə edərkən kitabxana primerlərindəki nukleotidlərin daxil edilməsi/delesiyaları və ya vaxtından əvvəl dayandırılması kodonları ilə bağlıdır.Vaxtından əvvəl dayanma kodonları daha qısa peptidlər yaradır və onlar əlverişli aa motivini ehtiva etdikləri üçün seçilirlər.Daha uzun peptidlər sintetik kitabxanaların primerlərinə əlavələr/delesiyalar nəticəsində yarana bilər.Bu, dizayn edilmiş dayanma kodonu çərçivədən kənarda yerləşdirir və axın istiqamətində yeni dayanma kodonu görünənə qədər onu oxuyur.Ümumiyyətlə, giriş məlumatlarını nümunənin çıxış məlumatları ilə müqayisə edərək bütün dörd seçim turu üçün zənginləşdirmə əmsallarını hesabladıq.Skrinqin ilk raundu üçün biz qeyri-spesifik fon istinadı kimi vəhşi tipli faq titrlərindən istifadə etdik.Maraqlıdır ki, mənfi fag seçimi ilk CSF dövründə çox güclü idi, lakin qanda deyil (Şəkil 3a), bu, peptid kitabxanasının əksər üzvlərinin CSF bölməsinə passiv diffuziya ehtimalının aşağı olması ilə əlaqədar ola bilər və ya nisbi faqlar bakteriophlardan daha səmərəli şəkildə saxlanılır və ya qan dövranından çıxarılır.Bununla belə, sürüşdürmənin ikinci turunda hər iki kladesdə CSF-də güclü faq seçimi müşahidə edildi, bu, əvvəlki raundun CSF qəbulunu təşviq edən peptidləri göstərən faqlarla zənginləşdiyini göstərir (Şəkil 3a).Yenə əhəmiyyətli qan zənginləşdirmə olmadan.Həmçinin üçüncü və dördüncü dövrlərdə faq klonları CSF-də əhəmiyyətli dərəcədə zənginləşdirilmişdir.Seçmənin son iki mərhələsi arasında hər bir unikal peptid ardıcıllığının nisbi tezliyini müqayisə edərək, seçmənin dördüncü mərhələsində ardıcıllığın daha da zənginləşdiyini aşkar etdik (şəkil 3b).Hər iki peptid oriyentasiyasından istifadə edərək 64 unikal peptid ardıcıllığından cəmi 931 tripeptid motivi çıxarılmışdır.Dördüncü turda ən zənginləşdirilmiş motivlər inyeksiya edilmiş kitabxana ilə müqayisədə bütün dövrlər üzrə zənginləşdirmə profillərinə görə daha yaxından yoxlanılmışdır (kəsmə: 10% zənginləşdirmə) (Əlavə Şəkil 6c).Seçmənin ümumi qanunauyğunluqları göstərdi ki, tədqiq olunan motivlərin əksəriyyəti hər iki seçim qolunun bütün əvvəlki turlarında zənginləşib.Bununla belə, bəzi motivlər (məsələn, SGL, VSG, LGS GSV) əsasən alternativ A sinfindən, digərləri (məsələn, FGW, RTN, WGF, NTR) alternativ B təbəqəsində zənginləşdirilmişdir.
Streptavidin yüklərinə konyuqasiya olunmuş CSF ilə zənginləşdirilmiş faj nümayiş etdirilmiş peptidlərin və biotinillənmiş lider peptidlərin CSF daşınmasının təsdiqi.
(a) Enjekte edilmiş (giriş = I) faq (PFU) titrləri və müəyyən edilmiş CSF faq titrləri (çıxış = O) əsasında bütün dörd dövrədə (R1-R4) hesablanmış zənginləşdirmə əmsalları.Son üç raund üçün zənginləşdirmə əmsalları (R2-R4) əvvəlki dövrə və ilk dövrə (R1) çəki məlumatları ilə müqayisə edilərək hesablanmışdır.Açıq çubuqlar serebrospinal maye, kölgəli çubuqlar plazmadır.(***p<0,001, Tələbənin t-testinə əsasən).(b) Seçmənin 4-cü raundundan sonra CSF-də toplanmış bütün faqlara nisbi nisbətinə görə sıralanmış ən bol faq peptidlərinin siyahısı.Ən çox yayılmış altı faq klonu rənglə vurğulanır, nömrələnir və seçimin 3-cü və 4-cü raundları arasında onların zənginləşdirici amilləri (daxil edilir).(c,d) 4-cü raunddan ən çox zənginləşdirilmiş altı faq klonu, boş faq və valideyn faq peptid kitabxanası CSF nümunə modelində fərdi olaraq təhlil edilmişdir.CSF və qan nümunələri göstərilən vaxt nöqtələrində toplandı.(c) Bərabər miqdarda 6 namizəd faq klonu (2 x 1010 faq/heyvan), boş faqlar (№ 1779) (2 x 1010 faq/heyvan) və anbar fag peptid kitabxanası (2 x 1012 fag/heyvan) Ən azı 3 x 1012 fag/heyvan quyruğuna enjekte edilir.Zamanla vurulan hər bir faq klonunun və faj peptid kitabxanasının CSF farmakokinetikası göstərilir.(d) nümunə götürmə vaxtı ərzində bütün bərpa edilmiş faqlar/ml üçün orta CSF/qan nisbətini göstərir.(e) Dörd sintetik lider peptid və bir qarışdırılmış nəzarət biotinlə N-terminalları (tetramer ekranı) vasitəsilə streptavidinlə əlaqələndirilmiş, sonra inyeksiya (quyruq damarı iv, 10 mq streptavidin/kq).Ən azı üç intubasiya edilmiş siçovul (N = 3).).CSF nümunələri göstərilən vaxt nöqtələrində toplandı və streptavidin konsentrasiyaları CSF anti-streptavidin ELISA ilə ölçüldü (nd = aşkar edilmədi).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ANOVA testi əsasında).(f) Ən çox zənginləşdirilmiş faq peptid klon #2002 (bənövşəyi) amin turşusu ardıcıllığının 4-cü seçim mərhələsindən digər seçilmiş faq peptid klonları ilə müqayisəsi.Eyni və oxşar amin turşusu fraqmentləri rənglə kodlanır.
Dördüncü turda bütün zənginləşdirilmiş faqlardan (Şəkil 3b), CSF seçmə modelində sonrakı fərdi analiz üçün altı namizəd klon seçildi.Bərabər miqdarda altı namizəd faj, boş faj (daxil edilməmiş) və profaq peptid kitabxanası üç kanullaşdırılmış CM heyvanına yeridildi və farmakokinetikası CSF (Şəkil 3c) və qan (Əlavə Şəkil 7) analizlərində müəyyən edildi.Test edilmiş bütün faq klonları CSF bölməsini boş nəzarət faqından (#1779) 10-1000 dəfə yüksək səviyyədə hədəf aldı.Məsələn, #2020 və #2077 klonları nəzarət faqından təxminən 1000 dəfə yüksək CSF titrlərinə malikdir.Hər bir seçilmiş peptidin farmakokinetik profili fərqlidir, lakin onların hamısı yüksək CSF hominq qabiliyyətinə malikdir.Biz #1903 və #2011-ci klonlar üçün zamanla daimi azalma müşahidə etdik, halbuki #2077, #2002 və #2009-cu klonlar üçün ilk 10 dəqiqə ərzində artım aktiv nəqli göstərə bilər, lakin təsdiq edilməlidir.#2020, #2002 və #2077 klonları yüksək səviyyədə sabitləşib, #2009 klonun CSF konsentrasiyası isə ilkin artımdan sonra yavaş-yavaş azalıb.Sonra hər bir CSF namizədinin nisbi tezliyini onun qan konsentrasiyası ilə müqayisə etdik (Şəkil 3d).Bütün nümunə götürmə vaxtlarında hər bir CSF namizədinin orta titrinin onun qan titri ilə nisbəti göstərdi ki, altı namizəddən üçünün qan CSF ilə əhəmiyyətli dərəcədə zənginləşib.Maraqlıdır ki, №2077 klon daha yüksək qan sabitliyini göstərdi (Əlavə Şəkil 7).Peptidlərin özlərinin faq hissəciklərindən başqa yükləri aktiv şəkildə CSF bölməsinə daşımaq iqtidarında olduğunu təsdiqləmək üçün biz peptidlərin faj hissəciklərinə bağlandığı N-terminusda biotinlə törəmə dörd lider peptidi sintez etdik.Biotinləşdirilmiş peptidlər (n. 2002, 2009, 2020 və 2077) fag həndəsəsini bir qədər təqlid edən multimerik formalar əldə etmək üçün streptavidin (SA) ilə konyuqasiya edilmişdir.Bu format həm də yük daşıyan protein peptidləri kimi qan və serebrospinal mayedə SA-nın təsirini ölçməyə imkan verdi.Əhəmiyyətli odur ki, sintetik peptidlər bu SA-birləşmiş formatda tətbiq edildikdə faj məlumatları tez-tez təkrarlana bilər (Şəkil 3e).Pişmiş peptidlər 48 saat ərzində aşkar edilməyən səviyyələrlə daha az ilkin məruz qalma və daha sürətli CSF klirensi idi.Bu peptid faq klonlarının CSF məkanına çatdırılma yolları haqqında fikir əldə etmək üçün biz in vivo venadaxili inyeksiyadan 1 saat sonra fag hissəciklərini birbaşa aşkar etmək üçün immunohistokimyadan (IHC) istifadə edərək fərdi fag peptid hitlərinin lokalizasiyasını təhlil etdik.Qeyd edək ki, #2002, #2077 və #2009-cu klonlar beyin kapilyarlarında güclü boyanma yolu ilə aşkarlana bilər, halbuki nəzarət fagı (#1779) və №2020 klon aşkar edilməmişdir (Əlavə Şəkil 8).Bu, bu peptidlərin BBB-ni keçərək beyinə təsirinə kömək etdiyini göstərir.Bu fərziyyəni yoxlamaq üçün əlavə ətraflı təhlil tələb olunur, çünki BSCFB marşrutu da cəlb oluna bilər.Ən çox zənginləşdirilmiş klonun (#2002) amin turşusu ardıcıllığını digər seçilmiş peptidlərlə müqayisə edərkən, onların bəzilərinin oxşar amin turşusu uzantılarına malik olduğu qeyd edilmişdir ki, bu da oxşar nəqliyyat mexanizmini göstərə bilər (şək. 3f).
Unikal plazma profilinə və zamanla CSF-də əhəmiyyətli artıma görə, 2077 nömrəli fag ekran klonu daha uzun 48 saat ərzində tədqiq edildi və davamlı SA səviyyələri ilə əlaqəli olaraq müşahidə olunan CSF-də sürətli artımı təkrarlaya bildi (Şəkil 4a).Digər müəyyən edilmiş faq klonlarına gəldikdə, #2077 beyin kapilyarları üçün güclü şəkildə boyandı və daha yüksək ayırdetmədə baxıldığında kapilyar marker lektin ilə əhəmiyyətli kolokalizasiya və bəlkə də parenximal boşluqda bəzi boyanma göstərdi (Şəkil 4b).MSS-də peptid vasitəçiliyi ilə farmakoloji təsirlərin əldə edilib-edilmədiyini araşdırmaq üçün i) #2077 tranzit peptidinin və ii) BACE1 inhibitor peptidinin biotinləşdirilmiş versiyalarının iki fərqli nisbətdə SA ilə qarışdırıldığı bir təcrübə apardıq.Bir kombinasiya üçün biz yalnız BACE1 peptid inhibitorundan istifadə etdik, digərində isə BACE1 peptid inhibitorunun #2077 peptidinə 1:3 nisbətində istifadə etdik.Hər iki nümunə venadaxili yeridilmiş və beta-amiloid peptid 40 (Abeta40) qan və onurğa beyni mayesinin səviyyələri zamanla ölçülmüşdür.Abeta40 beyin parenximasında BACE1 inhibisyonunu əks etdirdiyi üçün CSF-də ölçüldü.Gözlənildiyi kimi, hər iki kompleks Abeta40-ın qan səviyyəsini əhəmiyyətli dərəcədə azaldıb (Şəkil 4c, d).Bununla belə, yalnız peptidlərin bir qarışığı olan nümunələr.2077 və SA ilə birləşmiş BACE1 peptidinin inhibitoru onurğa beyni mayesində Abeta40-ın əhəmiyyətli dərəcədə azalmasına səbəb oldu (Şəkil 4c).Məlumatlar göstərir ki, peptid no.2077 60 kDa SA zülalını CNS-ə nəql edə bilir və həmçinin BACE1 peptidinin SA ilə birləşmiş inhibitorları ilə farmakoloji təsirlər yaradır.
(a) Ən azı üç CM intubasiya edilmiş siçovulda CSF peptid #2077 (RLSSVDSDLSGC) və inyeksiya edilməmiş nəzarət faqının (#1779) uzunmüddətli farmakokinetik profillərini göstərən T7 faqının klonal inyeksiyası (2 × 10 faq/heyvan).(b) 2077 nömrəli peptid və damarların (lektin) əksini göstərən faj yeridilmiş siçovullarda (2 × 10 10 faq/heyvan) təmsil olunan kortikal mikrodamarların konfokal mikroskopik şəkli.Bu faj klonları 3 siçovula verildi və perfuziyadan əvvəl 1 saat dövriyyəyə buraxıldı.Beyinlər kəsilmiş və T7 fag kapsidinə qarşı poliklonal FITC etiketli antikorlarla boyanmışdır.Perfuziya və sonrakı fiksasiyadan on dəqiqə əvvəl DyLight594 etiketli lektin venadaxili yeridildi.Kapilyarların və perivaskulyar beyin toxumasının lümenində mikrodamarların və faqların (yaşıl) luminal tərəfinin lektinlə boyanmasını (qırmızı) göstərən flüoresan şəkillər.Ölçək çubuğu 10 µm-ə uyğundur.(c, d) Biotinləşdirilmiş BACE1 inhibitor peptidi tək və ya biotinləşdirilmiş tranzit peptid №2077 ilə kombinasiyada streptavidinlə birləşdirildi və ardınca ən azı üç kanullaşdırılmış CM siçovulunun venadaxili yeridildi (10 mq streptavidin/kq).Aβ40-da BACE1 peptid inhibitorunun vasitəçiliyi ilə azalma, göstərilən vaxt nöqtələrində qanda (qırmızı) və serebrospinal mayedə (narıncı) Aβ1-40 ELISA ilə ölçüldü.Daha yaxşı aydınlıq üçün qrafikdə 100% miqyasda nöqtəli xətt çəkilir.(c) 3:1 nisbətində tranzit peptid #2077 və BACE1 inhibitor peptidinə konyuqasiya olunmuş streptavidinlə müalicə olunan siçovullarda qanda (qırmızı üçbucaqlar) və onurğa beyni mayesində (narıncı üçbucaqlar) Aβ40-da faiz azalması.(d) Yalnız BACE1 inhibitor peptidinə birləşdirilmiş streptavidinlə müalicə olunan siçovulların qanında Aβ40 (qırmızı dairələr) və onurğa beyni mayesində (narıncı dairələr) faiz azalması.Nəzarətdə Aβ konsentrasiyası 420 pg/ml (standart kənarlaşma = 101 pg/ml) təşkil etmişdir.
Phage displey biotibbi tədqiqatların bir neçə sahələrində uğurla tətbiq edilmişdir17.Bu üsul in vivo damar müxtəlifliyi tədqiqatları18,19, eləcə də beyin damarlarını hədəf alan tədqiqatlar20,21,22,23,24,25,26 üçün istifadə edilmişdir.Bu tədqiqatda biz bu seçim metodunun tətbiqini təkcə beyin damarlarını hədəf alan peptidlərin birbaşa identifikasiyasına deyil, həm də qan-beyin baryerini keçmək üçün aktiv nəqliyyat xüsusiyyətlərinə malik namizədlərin aşkar edilməsinə qədər genişləndirdik.İndi biz CM intubasiya edilmiş siçovullarda in vivo seçim prosedurunun inkişafını təsvir edirik və onun CSF homing xüsusiyyətləri ilə peptidləri müəyyən etmək potensialını nümayiş etdiririk.12-mer təsadüfi peptidlərin kitabxanasını nümayiş etdirən T7 faqından istifadə edərək, T7 faqının qan-beyin baryerinə uyğunlaşmaq üçün kifayət qədər kiçik olduğunu (təxminən 60 nm diametrdə)10 nümayiş etdirə bildik və bununla da qan-beyin baryerini və ya xoroid pleksusunu birbaşa keçə bildik.Kanulasiya edilmiş CM siçovullarından CSF yığımının yaxşı idarə olunan in vivo funksional skrininq metodu olduğunu və çıxarılan faqın təkcə damarlara bağlanmadığını, həm də qan-beyin baryeri vasitəsilə daşıyıcı kimi fəaliyyət göstərdiyini müşahidə etdik.Bundan əlavə, eyni vaxtda qan toplamaq və CSF və qandan əldə edilən faqlara HTS tətbiq etməklə, biz təsdiq etdik ki, CSF seçimimiz qan zənginləşdirməsindən və ya seçim turları arasında genişlənməyə uyğunluğundan təsirlənməmişdir.Bununla belə, qan bölməsi seçim prosedurunun bir hissəsidir, çünki CSF bölməsinə çata bilən faqlar beyində zənginləşmək üçün kifayət qədər uzun müddət sağ qalmalı və qan dövranında dövr etməlidirlər.Xam HTS məlumatlarından etibarlı ardıcıllıq məlumatını çıxarmaq üçün biz analiz iş prosesində platformaya xas ardıcıllıq xətalarına uyğunlaşdırılmış filtrlər tətbiq etdik.Kinetik parametrləri skrininq metoduna daxil etməklə, qan24, 27, 28-də vəhşi tipli T7 faqlarının sürətli farmakokinetikasını (t½ ~ 28 dəq) təsdiqlədik və həmçinin onurğa-beyin mayesində (t½ ~ 26 dəqiqə) onların yarı ömrünü təyin etdik).Qan və CSF-də oxşar farmakokinetik profillərə baxmayaraq, fagın qan konsentrasiyasının yalnız 0,001%-i CSF-də aşkar edilə bildi ki, bu da vəhşi tipli T7 faqının qan-beyin baryeri boyunca aşağı fon hərəkətliliyini göstərir.Bu iş, xüsusilə dövriyyədən sürətlə təmizlənən faq sistemləri üçün in vivo sürüşdürmə strategiyalarından istifadə edərkən ilk seçim mərhələsinin vacibliyini vurğulayır, çünki bir neçə klon CNS bölməsinə çata bilir.Beləliklə, birinci turda kitabxana müxtəlifliyində azalma çox böyük oldu, çünki bu çox ciddi CSF modelində son nəticədə yalnız məhdud sayda klon toplandı.Bu in vivo sürüşmə strategiyasına CSF bölməsində aktiv toplanma, qan bölməsində klonun sağ qalması və ilk 10 dəqiqə ərzində qandan T7 faq klonlarının sürətlə çıxarılması kimi bir neçə seçim addımı daxil idi (Şəkil 1d və Əlavə Şəkil 4M).).Beləliklə, birinci turdan sonra CSF-də müxtəlif faq klonları müəyyən edildi, baxmayaraq ki, fərdi heyvanlar üçün eyni ilkin hovuz istifadə edildi.Bu onu göstərir ki, çoxlu sayda kitabxana üzvləri olan mənbə kitabxanaları üçün çoxsaylı ciddi seçim addımları müxtəlifliyin əhəmiyyətli dərəcədə azalması ilə nəticələnir.Buna görə də təsadüfi hadisələr nəticəyə böyük təsir göstərərək ilkin seçim prosesinin ayrılmaz hissəsinə çevriləcək.Çox güman ki, orijinal kitabxanadakı klonların çoxu çox oxşar CSF zənginləşdirmə meylinə malikdir.Bununla belə, eyni eksperimental şəraitdə belə, ilkin hovuzda hər bir xüsusi klonun az sayda olması səbəbindən seçim nəticələri fərqli ola bilər.
CSF-də zənginləşdirilmiş motivlər qanda olanlardan fərqlənir.Maraqlıdır ki, biz fərdi heyvanların qanında qlisinlə zəngin peptidlərə doğru ilk sürüşməni qeyd etdik.(Şəkil 1g, Əlavə Şəkillər 4e, 4f).Tərkibində qlisin peptidləri olan faqlar daha sabit ola bilər və dövriyyədən çıxarılma ehtimalı az ola bilər.Bununla belə, bu qlisinlə zəngin peptidlər serebrospinal maye nümunələrində aşkar edilmədi, bu, kurasiya edilmiş kitabxanaların iki fərqli seçim mərhələsindən keçdiyini göstərir: biri qanda, digəri onurğa-beyin mayesində toplanmasına icazə verdi.Dördüncü seçim turu nəticəsində əldə edilən CSF ilə zənginləşdirilmiş klonlar geniş şəkildə sınaqdan keçirilmişdir.Ayrı-ayrılıqda sınaqdan keçirilmiş klonların demək olar ki, hamısının boş nəzarət faqı ilə müqayisədə CSF-də zənginləşdiyi təsdiq edilmişdir.Bir peptid hiti (#2077) daha ətraflı araşdırıldı.Digər hitlərlə müqayisədə daha uzun plazma yarı ömrünü göstərdi (Şəkil 3d və Əlavə Şəkil 7) və maraqlısı odur ki, bu peptid C-terminusunda sistein qalığını ehtiva edir.Bu yaxınlarda göstərilmişdir ki, sisteinin peptidlərə əlavə edilməsi albumin 29 ilə bağlanaraq onların farmakokinetik xüsusiyyətlərini yaxşılaşdıra bilər.Bu, hazırda #2077 peptid üçün məlum deyil və əlavə tədqiqat tələb edir.Bəzi peptidlər CSF zənginləşdirilməsində valentlikdən asılılıq göstərdi (məlumatlar göstərilmir), bu T7 kapsidin göstərilən səth həndəsəsi ilə əlaqəli ola bilər.İstifadə etdiyimiz T7 sistemi hər bir faq hissəcikinə hər peptidin 5-15 nüsxəsini göstərdi.IHC siçovulların beyin qabığına venadaxili yeridilmiş namizəd qurğuşun faq klonları üzərində aparılmışdır (Əlavə Şəkil 8).Məlumatlar ən azı üç klonun (No. 2002, No. 2009 və No. 2077) BBB ilə qarşılıqlı əlaqədə olduğunu göstərdi.Bu BBB qarşılıqlı təsirinin CSF-nin yığılması və ya bu klonların birbaşa BCSFB-yə hərəkəti ilə nəticələndiyini müəyyən etmək qalır.Əhəmiyyətli odur ki, biz göstəririk ki, seçilmiş peptidlər sintez edildikdə və zülal yükü ilə bağlandıqda özlərinin CSF daşıma qabiliyyətini saxlayırlar.N-terminal biotinillənmiş peptidlərin SA-ya bağlanması qan və onurğa-beyin mayesində onların müvafiq faq klonları ilə əldə edilən nəticələri mahiyyətcə təkrarlayır (Şəkil 3e).Nəhayət, biz göstəririk ki, qurğuşun peptidi #2077 SA ilə konyuqasiya olunmuş BACE1-in biotinilləşdirilmiş peptid inhibitorunun beyin fəaliyyətini təşviq edə bilir, beyin omurilik sıvısında Abeta40 səviyyəsini əhəmiyyətli dərəcədə azaltmaqla MSS-də aydın farmakodinamik təsirlərə səbəb olur (Şəkil 4).Bütün hitlərin peptid ardıcıllığı homoloji axtarışını həyata keçirərək verilənlər bazasında heç bir homoloqu müəyyən edə bilmədik.Qeyd etmək vacibdir ki, T7 kitabxanasının ölçüsü təqribən 109, 12-mers üçün nəzəri kitabxana ölçüsü isə 4 x 1015-dir. Buna görə də, biz 12-mer peptid kitabxanasının müxtəliflik məkanının yalnız kiçik bir hissəsini seçmişik, bu, bu bitişik identifikasiya edilmiş ardıcıllıqların məkanını qiymətləndirməklə daha optimallaşdırılmış peptidlərin müəyyən edilə biləcəyini ifadə edə bilər.Hipotetik olaraq, bu peptidlərin heç bir təbii homoloqunu tapmamağımızın səbəblərindən biri, müəyyən peptid motivlərinin beyinə nəzarətsiz daxil olmasının qarşısını almaq üçün təkamül zamanı seçimin ləğvi ola bilər.
Birlikdə götürdükdə, nəticələrimiz in vivo olaraq serebrovaskulyar maneənin nəqliyyat sistemlərini daha ətraflı şəkildə müəyyən etmək və xarakterizə etmək üçün gələcək iş üçün əsas yaradır.Bu metodun əsas quruluşu funksional seçim strategiyasına əsaslanır ki, bu strategiya təkcə beyin damarlarını bağlayan klonları müəyyən etmir, həm də uğurlu klonların in vivo olaraq MSS bölməsinə bioloji maneələri keçmək üçün daxili aktivliyə malik olduğu kritik addımı ehtiva edir.bu peptidlərin daşınma mexanizmini və onların beyin bölgəsinə xas olan mikrodamarlara bağlanmağa üstünlük verməsini aydınlaşdırmaqdır.Bu, BBB və reseptorların daşınması üçün yeni yolların kəşfinə səbəb ola bilər.Biz gözləyirik ki, müəyyən edilmiş peptidlər birbaşa serebrovaskulyar reseptorlara və ya BBB və ya BCSFB vasitəsilə daşınan dövran edən ligandlara bağlana bilər.Bu işdə aşkar edilmiş CSF nəqliyyat aktivliyi olan peptid vektorları daha da tədqiq ediləcək.Hazırda biz bu peptidlərin BBB və/və ya BCSFB-ni keçmək qabiliyyətinə görə beyin spesifikliyini araşdırırıq.Bu yeni peptidlər yeni reseptorların və ya yolların potensial kəşfi və bioloji maddələr kimi makromolekulların beyinə çatdırılması üçün yeni yüksək səmərəli platformaların inkişafı üçün son dərəcə qiymətli alətlər olacaq.
Əvvəllər təsvir edilmiş metodun modifikasiyasından istifadə edərək böyük sisternanı (CM) cannulasiya edin.Anesteziya edilmiş Wistar siçovulları (200-350 q) stereotaksik aparata quraşdırılmış və kəllə sümüyünü ifşa etmək üçün qırxılmış və aseptik şəkildə hazırlanmış baş dərisi üzərində median kəsik edilmişdir.Üst çəngəl sahəsində iki deşik qazın və fiksasiya vintlərini deliklərə bərkidin.Paslanmayan poladdan hazırlanmış kanülün CM-ə stereotaktik yönləndirilməsi üçün lateral oksipital təpədə əlavə bir deşik qazıldı.Kanülün ətrafına diş sementi tətbiq edin və vintlər ilə bərkidin.Fotoşəkildən və sementin bərkidilməsindən sonra dəri yarası 4/0 supramid tikişi ilə bağlandı.Kanülün düzgün yerləşdirilməsi serebrospinal mayenin (CSF) kortəbii sızması ilə təsdiqlənir.Siçovulu stereotaksik aparatdan çıxarın, əməliyyatdan sonrakı müvafiq qayğı və ağrının idarə olunmasını təmin edin və onurğa-beyin mayesində qan əlamətləri müşahidə olunana qədər onun ən azı bir həftə bərpa olunmasına icazə verin.Wistar siçovulları (Crl:WI/Han) Çarlz çayından (Fransa) əldə edilmişdir.Bütün siçovullar xüsusi patogen olmayan şəraitdə saxlanılıb.Bütün heyvan təcrübələri İsveçrənin Bazel şəhərinin Baytarlıq İdarəsi tərəfindən təsdiqlənmiş və 2474 saylı Heyvan Lisenziyasına (Serebrospinal Fluid və Rat Beyində Terapevtik Namizədlərin Səviyyələrini Ölçməklə Aktiv Beyin Nəqliyyatının Qiymətləndirilməsi) uyğun olaraq həyata keçirilmişdir.
Əlindəki CM cannula ilə siçovulu ehtiyatla şüurlu saxlayın.Daturanı kanuladan çıxarın və 10 µl kortəbii axan serebrospinal maye toplayın.Kanülün açıqlığı son nəticədə pozulduğundan, bu tədqiqata yalnız qanla çirklənmə və ya rəngsizləşmə sübutu olmayan şəffaf beyin-onurğa beyni maye nümunələri daxil edilmişdir.Paralel olaraq, quyruğun ucundakı kiçik bir kəsikdən heparin (Sigma-Aldrich) olan borulara təxminən 10-20 μl qan götürüldü.T7 faqının venadaxili yeridilməsindən sonra müxtəlif vaxt nöqtələrində CSF və qan toplandı.Hər bir CSF nümunəsi toplanmazdan əvvəl təxminən 5-10 μl maye atıldı ki, bu da kateterin ölü həcminə uyğundur.
Kitabxanalar T7Select sistem təlimatında təsvir olunduğu kimi T7Select 10-3b vektorundan istifadə etməklə yaradılıb (Novagen, Rosenberg və başqaları, InNovations 6, 1-6, 1996).Qısaca, təsadüfi 12-mer DNT əlavəsi aşağıdakı formatda sintez edilmişdir:
NNK kodonu ikiqat dayanma kodonlarının və əlavədə amin turşusunun həddindən artıq ifadəsinin qarşısını almaq üçün istifadə edilmişdir.N hər bir nukleotidin əl ilə qarışdırılmış ekvimolyar nisbətidir və K adenin və sitozin nukleotidlərinin əl ilə qarışdırılmış ekvimolyar nisbətidir.Tək zəncirli bölgələr 37°C-də 3 saat ərzində Klenow buferində (New England Biolabs) dNTP (Novagen) və Klenow fermenti (New England Biolabs) ilə əlavə inkubasiya yolu ilə ikiqat zəncirli DNT-yə çevrildi.Reaksiyadan sonra ikiqat zəncirli DNT EtOH çöküntüsü ilə bərpa edildi.Nəticədə DNT məhdudlaşdırıcı fermentlər EcoRI və HindIII (hər ikisi Roche) ilə həzm olundu.Parçalanmış və təmizlənmiş (QIAquick, Qiagen) əlavə (T4 ligase, New England Biolabs) daha sonra 10B kapsid geninin amin turşusu 348-dən sonra əvvəlcədən parçalanmış T7 vektoruna çərçivə daxilində bağlandı.Bağlama reaksiyaları in vitro qablaşdırmadan əvvəl 18 saat ərzində 16°C-də inkubasiya edilmişdir.İn vitro faqların qablaşdırılması T7Select 10-3b klonlama dəsti (Novagen) ilə təchiz edilmiş təlimatlara uyğun olaraq həyata keçirilmişdir və qablaşdırma məhlulu Escherichia coli (BLT5615, Novagen) istifadə edərək lizis üçün bir dəfə gücləndirilmişdir.Lizatlar sentrifuqalanmış, titrlənmiş və qliserolun ehtiyat məhlulu kimi -80°C-də dondurulmuşdur.
Xüsusi 454/Roche-amplikon füzyon primerlərindən istifadə edərək bulyonda və ya boşqabda gücləndirilmiş faj dəyişkən bölgələrinin birbaşa PCR gücləndirilməsi.İrəli qaynaşma primeri dəyişən bölgəni (NNK) 12 (şablon üçün xüsusi), GS FLX Titanium Adapter A və dörd əsaslı kitabxana açar ardıcıllığını (TCAG) əhatə edən ardıcıllıqları ehtiva edir (Əlavə Şəkil 1a):
Əks birləşmə primerində həmçinin muncuqları tutmaq üçün əlavə edilmiş biotin və emulsiya PCR zamanı klonal gücləndirmə üçün tələb olunan GS FLX Titanium Adapter B var:
Daha sonra amplikonlar 454 GS-FLX Titan protokoluna uyğun olaraq 454/Roche pirosekvensiyasına məruz qaldı.Əl ilə Sanger ardıcıllığı (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNT Analyzer) üçün T7 faq DNT-si PCR ilə gücləndirildi və aşağıdakı primer cütləri ilə ardıcıllıqla sıralandı:
Fərdi lövhələrdən olan əlavələr Roche Fast Start DNT Polimerase Kit istifadə edərək (istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq) PCR gücləndirilməsinə məruz qaldı.İsti başlanğıc (95 °C-də 10 dəqiqə) və 35 gücləndirmə dövrü (95 °C-də 50 s, 50 °C-də 1 dəqiqə və 72 °C-də 1 dəqiqə) həyata keçirin.
Kitabxanalardan alınan faq, vəhşi tipli faq, CSF və qandan xilas edilmiş faq və ya fərdi klonlar Escherichia coli BL5615-də vərəm bulyonunda (Sigma Aldrich) və ya 500 sm2 qablarda (Thermo Scientific) 37°C-də 4 saat gücləndirilmişdir.Plitələri Tris-EDTA tamponu (Fluka Analytical) ilə yaxalamaq və ya steril pipet ucları ilə lövhələri toplamaq yolu ilə plitələrdən faq çıxarılıb.Faq, bir tur polietilen qlikol (PEG 8000) çöküntüsü (Promega) ilə mədəni supernatantdan və ya ekstraksiya tamponundan təcrid olundu və Tris-EDTA tamponunda yenidən dayandırıldı.
Gücləndirilmiş faq, venadaxili (IV) inyeksiyadan əvvəl (500 μl/heyvan) endotoksin xaric muncuqlarından (Miltenyi Biotec) istifadə edərək 2-3 dövrə endotoksin çıxarılmasına məruz qalmışdır.Birinci turda 2×1012 faqlar təqdim edildi;ikincidə 2×1010 faqlar;üçüncü və dördüncü seçim turlarında heyvan başına 2×109 fag.Göstərilən vaxt nöqtələrində toplanmış CSF və qan nümunələrində faq tərkibi istehsalçının təlimatlarına (T7Select sistem təlimatı) uyğun olaraq lövhənin sayılması ilə müəyyən edilmişdir.Faj seçimi təmizlənmiş kitabxanaların quyruq damarına venadaxili yeridilməsi və ya əvvəlki seçim turundan CSF-dən çıxarılan faqın təkrar yeridilməsi yolu ilə həyata keçirilmişdir və sonrakı məhsullar müvafiq olaraq 10 dəqiqə, 30 dəq, 60 dəq, 90 dəq, 120 dəq, 180 dəq və qan nümunəsində yerinə yetirilmişdir.Cəmi dörd raund in vivo sürüşmə aparıldı, burada iki seçilmiş budaq ayrıca saxlanıldı və seçimin ilk üç raundunda təhlil edildi.Seçmənin ilk iki mərhələsindən CSF-dən çıxarılan bütün faj əlavələri 454/Roche pirosekvensiyasına məruz qaldı, seçimin son iki mərhələsindən CSF-dən çıxarılan bütün klonlar isə əl ilə ardıcıllıqla sıralandı.Seçmənin birinci raundundan bütün qan faqları da 454/Roche pyrosequencing-ə məruz qaldı.Faj klonlarının inyeksiyası üçün seçilmiş faqlar E. coli (BL5615) içərisində 500 sm2 boşqablarda 37°C-də 4 saat ərzində gücləndirilmişdir.Fərdi olaraq seçilmiş və əl ilə ardıcıl ardıcıllıqla klonlar vərəm mühitində çoxaldılmışdır.Fag ekstraksiyasından, endotoksinin təmizlənməsindən və çıxarılmasından sonra (yuxarıda təsvir edildiyi kimi) 300 μl-də 2 × 1010 faq/heyvan bir quyruq venasına venadaxili yeridildi.
Ardıcıllıq məlumatlarının əvvəlcədən işlənməsi və keyfiyyətcə süzülməsi.Raw 454/Roche məlumatları təchizatçı proqram təminatından istifadə etməklə ikili standart axın xəritəsi formatından (sff) Pearson insan tərəfindən oxuna bilən formata (fasta) çevrildi.Nukleotid ardıcıllığının sonrakı işlənməsi aşağıda təsvir olunduğu kimi xüsusi C proqramları və skriptləri (buraxılmamış proqram paketi) istifadə edərək həyata keçirilmişdir.İlkin məlumatların təhlilinə ciddi çoxmərhələli filtrləmə prosedurları daxildir.Etibarlı 12mer daxiletmə DNT ardıcıllığını ehtiva etməyən oxunuşları süzgəcdən keçirmək üçün oxumalar ardıcıl olaraq başlanğıc etiketinə (GTGATGTCGGGGGATCCGAATTCT), dayandırma etiketinə (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) və arxa fon əlavəsinə (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTC) uyğunlaşdırıldı. Global testdən istifadə edərək.hər düzülmə üçün 2 uyğunsuzluğa imkan verən hizalama31.Buna görə də, başlanğıc və dayanma teqləri olmayan oxumalar və fon əlavələri olan oxumalar, yəni icazə verilən uyğunsuzluqların sayını aşan düzülmələr kitabxanadan silindi.Qalan oxunuşlara gəlincə, başlanğıc işarəsindən uzanan və dayanma işarəsindən əvvəl bitən N-mer DNT ardıcıllığı ilkin oxunma ardıcıllığından çıxarılıb və sonradan işlənib (bundan sonra “insert” adlandırılacaq).Əlavənin tərcüməsindən sonra, primerin 5′ ucundakı birinci dayanma kodonundan sonrakı hissə əlavədən çıxarılır.Bundan əlavə, primerin 3′ ucunda natamam kodonlara səbəb olan nukleotidlər də çıxarıldı.Yalnız fon ardıcıllığını ehtiva edən əlavələri istisna etmək üçün "PAG" amin turşusu nümunəsi ilə başlayan tərcümə edilmiş əlavələr də çıxarıldı.Tərcümə sonrası uzunluğu 3 amin turşusundan az olan peptidlər kitabxanadan çıxarıldı.Nəhayət, əlavə hovuzunda artıqlığı aradan qaldırın və hər bir unikal əlavənin tezliyini müəyyənləşdirin.Bu təhlilin nəticələrinə nukleotid ardıcıllıqlarının (əlavələrin) və onların (oxuyan) tezliklərinin siyahısı (Əlavə Şəkil 1c və 2) daxil edilmişdir.
N-mer DNT daxiletmələrini ardıcıllıq oxşarlığına görə qruplaşdırın: 454/Roche-a xas ardıcıllıq xətalarını (məsələn, homopolimer uzantılarının ardıcıllığı ilə bağlı problemlər) aradan qaldırmaq və daha az əhəmiyyətli ehtiyatları aradan qaldırmaq üçün əvvəllər süzülmüş N-mer DNT ardıcıllığı əlavələri (daxiletmələr) oxşarlığa görə sıralanır.aşağıdakı kimi müəyyən edilmiş iterativ alqoritmdən istifadə edərək əlavələr (uyğun olmayan 2 əsasa icazə verilir): daxiletmələr əvvəlcə tezliyə görə (ən yüksəkdən aşağıya), eynidirsə, uzunluğa görə ikinci dərəcəli sıralamaya görə (ən uzundan ən qısaya) sıralanır.Beləliklə, ən tez-tez və ən uzun əlavələr birinci "qrupu" müəyyənləşdirir.Qrup tezliyi əsas tezlikə təyin edilir.Sonra sıralanmış siyahıda qalan hər bir əlavə Needleman-Wunsch cüt-cüt düzülüşü ilə qrupa əlavə olunmağa çalışıldı.Düzəlişdə uyğunsuzluqların, əlavələrin və ya silinmələrin sayı 2 həddi keçmirsə, qrupa əlavə əlavə edilir və ümumi qrup tezliyi əlavənin nə qədər tez-tez əlavə edildiyi ilə artır.Qrupa əlavə edilmiş əlavələr istifadə edilmiş kimi qeyd olunur və sonrakı emaldan xaric edilir.Daxiletmə ardıcıllığı artıq mövcud qrupa əlavə edilə bilmirsə, daxiletmə ardıcıllığı müvafiq daxiletmə tezliyi ilə yeni qrup yaratmaq üçün istifadə olunur və istifadə edildiyi kimi qeyd olunur.Hər bir daxiletmə ardıcıllığı ya yeni qrup yaratmaq üçün istifadə edildikdə və ya artıq mövcud qrupa daxil edilə biləndə təkrarlama başa çatır.Axı, nukleotidlərdən ibarət qruplaşdırılmış əlavələr nəticədə peptid ardıcıllığına (peptid kitabxanalarına) çevrilir.Bu təhlilin nəticəsi ardıcıl oxunmaların sayını təşkil edən əlavələr və onların müvafiq tezlikləridir (Əlavə Şəkil 2).
Motif Generation: Unikal peptidlərin siyahısına əsasən, aşağıda göstərildiyi kimi bütün mümkün amin turşusu nümunələrini (aa) ehtiva edən bir kitabxana yaradılmışdır.Uzunluğu 3 olan hər bir mümkün nümunə peptiddən çıxarıldı və onun tərs nümunəsi bütün nümunələri (tripeptidlər) ehtiva edən ümumi motiv kitabxanası ilə birlikdə əlavə edildi.Çox təkrarlanan motivlərdən ibarət kitabxanalar ardıcıllıqla sıralandı və artıqlıq aradan qaldırıldı.Sonra motiv kitabxanasındakı hər bir tripeptid üçün hesablama alətlərindən istifadə edərək onun kitabxanada olub-olmadığını yoxladıq.Bu zaman tapılmış motiv tripeptidi olan peptidin tezliyi əlavə edilir və motiv kitabxanasındakı motivə təyin edilir (“motivlərin sayı”).Motif yaratmanın nəticəsi tripeptidlərin (motivlərin) bütün hadisələrini və onların müvafiq qiymətlərini ehtiva edən ikiölçülü massivdir, bunlar oxunuşlar süzüldükdə, qruplaşdırıldıqda və tərcümə edildikdə müvafiq motivlə nəticələnən ardıcıl oxunmaların sayıdır.Metriklər yuxarıda ətraflı təsvir olunduğu kimi.
Motiflərin və müvafiq səpələnmələrin sayının normallaşdırılması: Hər bir nümunə üçün motivlərin sayı istifadə etməklə normallaşdırılıb.
burada ni i mövzusunu ehtiva edən oxunuşların sayıdır.Beləliklə, vi nümunədə i motivini ehtiva edən oxunmaların (və ya peptidlərin) faiz tezliyini təmsil edir.Normallaşdırılmamış motivlərin sayı üçün P-dəyərləri Fisherin dəqiq testindən istifadə edərək hesablanmışdır.Motivlərin sayının korreloqramlarına gəldikdə, Spearmanın korrelyasiyaları R ilə normallaşdırılmış motivlərin sayından istifadə edərək hesablanmışdır.
Peptid kitabxanasındakı hər mövqedə amin turşularının məzmununu vizuallaşdırmaq üçün 32, 33 veb loqoqramları (http://weblogo.threeplusone.com) yaradılmışdır.Birincisi, 12-mer peptidin hər mövqeyində amin turşularının məzmunu 20 × 12 matrisdə saxlanılır.Sonra, hər mövqedə eyni nisbi amin turşusu tərkibini ehtiva edən 1000 peptid dəsti fasta ardıcıllığı formatında yaradılır və hər mövqedə nisbi amin turşusu tərkibinin qrafik təsvirini yaradan veb-loqo 3-ə giriş kimi təqdim olunur.müəyyən bir peptid kitabxanası üçün.Çoxölçülü məlumat dəstlərini vizuallaşdırmaq üçün R-də daxili olaraq hazırlanmış alətdən istifadə etməklə istilik xəritələri yaradılmışdır (biosHeatmap, hələ buraxılmamış R paketi).İstilik xəritələrində təqdim olunan dendroqramlar Uordun iyerarxik klasterləşdirmə metodu ilə Evklid məsafəsi metrikası ilə hesablanmışdır.Motif qiymətləndirmə məlumatlarının statistik təhlili üçün, normallaşdırılmamış bal üçün P dəyərləri Fisher'in dəqiq testindən istifadə edərək hesablanmışdır.Digər məlumat dəstləri üçün P-dəyərləri Student's t-test və ya ANOVA istifadə edərək R-də hesablanmışdır.
Seçilmiş faj klonları və əlavələri olmayan faqlar quyruq damarı vasitəsilə venadaxili yeridilir (300 μl PBS-də 2 × 1010 faq/heyvan).Perfuziya və sonrakı fiksasiyadan on dəqiqə əvvəl eyni heyvanlara venadaxili olaraq 100 μl DyLight594 etiketli lektin (Vector Laboratories Inc., DL-1177) yeridildi.Fag inyeksiyasından 60 dəqiqə sonra siçovullara 50 ml PBS və ardınca 50 ml 4% PFA/PBS ilə ürək vasitəsilə perfuziya edildi.Beyin nümunələri əlavə olaraq gecə ərzində 4% PFA/PBS-də sabitlənmiş və 4°C-də gecə ərzində 30% saxarozada isladılmışdır.Nümunələr OCT qarışığında dondurulur.Dondurulmuş nümunələrin immunohistokimyəvi təhlili otaq temperaturunda 1% BSA ilə bloklanmış və 4 °C-də T7 faqına (Novus NB 600-376A) qarşı poliklonal FITC etiketli antikorlarla inkubasiya edilmiş 30 µm kriyoseksiyalarda aparılmışdır.Gecədə inkubasiya edin.Nəhayət, bölmələr 3 dəfə PBS ilə yuyuldu və konfokal lazer mikroskopu (Leica TCS SP5) ilə araşdırıldı.
Minimum təmizliyi 98% olan bütün peptidlər GenScript USA tərəfindən sintez edilmiş, biotinləşdirilmiş və liyofilləşdirilmişdir.Biotin N-terminusda əlavə üçqat qlisin ayırıcı vasitəsilə bağlanır.Kütləvi spektrometriyadan istifadə edərək bütün peptidləri yoxlayın.
Streptavidin (Sigma S0677) 5-10% DMSO/incubatlı PBS-də biotinillənmiş peptid, biotinləşdirilmiş BACE1 inhibitor peptid və ya biotinləşdirilmiş BACE1 inhibitor peptid və BACE1 inhibitor peptidinin 5 qat ekvimolyar artıqlığı ilə qarışdırılmışdır.Enjeksiyondan əvvəl otaq temperaturunda 1 saat.Streptavidinlə birləşmiş peptidlər beyin boşluğu olan siçovulların quyruq damarlarından birinə 10 mq/kq dozada venadaxili yeridilirdi.
Streptavidin-peptid komplekslərinin konsentrasiyası ELISA ilə qiymətləndirilmişdir.Nunc Maxisorp mikrotiter plitələri (Sigma) gecə ərzində 4°C-də 1,5 μg/ml siçan anti-streptavidin antikoru ilə örtülmüşdür (Thermo, MA1-20011).Bloklamadan sonra (bloklama buferi: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% jelatin, 1% BSA) otaq temperaturunda 2 saat boşqabı 0,05% Tween-20/PBS (yuma tamponu) ilə yuyun və 3 saniyə ərzində boşaldılmış nümunələr əlavə edin. 1:10,000, CSF 1:115).Sonra boşqab bir gecədə 4°C-də aşkarlama antikoru (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239) ilə inkubasiya edilmişdir.Üç yuyulma addımından sonra streptavidin TMB substrat məhlulunda (Roche) 20 dəqiqəyə qədər inkubasiya yolu ilə aşkar edilmişdir.1M H2SO4 ilə rəng inkişafını dayandırdıqdan sonra 450 nm-də absorbansı ölçün.
Streptavidin-peptid-BACE1 inhibitor kompleksinin funksiyası istehsalçının protokoluna (Wako, 294-64701) uyğun olaraq Aβ(1-40) ELISA ilə qiymətləndirilmişdir.Qısaca olaraq, CSF nümunələri standart seyrelticidə (1:23) seyreltildi və BNT77 tutma antikoru ilə örtülmüş 96 quyulu boşqablarda gecə ərzində 4°C-də inkubasiya edildi.Beş yuyulma addımından sonra, HRP ilə birləşdirilmiş BA27 antikoru əlavə edildi və 2 saat 4°C-də inkubasiya edildi, sonra beş yuma addımı.Aβ(1-40) otaq temperaturunda 30 dəqiqə TMB məhlulunda inkubasiya yolu ilə aşkar edilmişdir.Rəng inkişafı dayandırma məhlulu ilə dayandırıldıqdan sonra 450 nm-də absorbansı ölçün.Plazma nümunələri Aβ(1-40) ELISA-dan əvvəl bərk fazanın çıxarılmasına məruz qalmışdır.Plazma 0,2% DEA (Sigma) 96 quyu boşqablara əlavə edildi və otaq temperaturunda 30 dəqiqə inkubasiya edildi.SPE plitələrinin (Oasis, 186000679) ardıcıl olaraq su və 100% metanol ilə yuyulmasından sonra SPE lövhələrinə plazma nümunələri əlavə edildi və bütün maye çıxarıldı.Nümunələr yuyuldu (əvvəlcə 5% metanol, sonra 30% metanol) və 2% NH4OH/90% metanol ilə yuyuldu.Eluat 55°C-də sabit N2 cərəyanında 99 dəqiqə qurudulduqdan sonra nümunələr standart seyrelticilərdə azaldıldı və Aβ(1-40) yuxarıda göstərildiyi kimi ölçüldü.
Bu məqaləyə necə istinad etmək olar: Urich, E. et al.In vivo müəyyən edilmiş tranzit peptidlərdən istifadə edərək yükün beyinə çatdırılması.elm.5, 14104;doi: 10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB və Moos T. Məqsədli terapiyadan istifadə edərək beyinə makromolekulyar dərmanların çatdırılması.Neyrokimya jurnalı 113, 1-13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., and Martinez-Martinez, P. Peptid və protein preparatlarının qan-beyin baryeri vasitəsilə çatdırılması.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Qan-beyin maneəsi: beyin dərmanının inkişafında bir darboğaz.NeuroRx 2, 3-14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, and Byrd, A. Təkmilləşdirilmiş dərman çatdırılması və xoroid pleksus-CSF yolu vasitəsilə beyinə hədəfləmə perspektivləri.Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM. Beyin çatdırılması üçün molekulyar troyan atları ilə biofarmasevtiklərin modernləşdirilməsi.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, qan-beyin baryeri vasitəsilə WM reseptor vasitəçiliyi ilə peptid nəqli.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Beyin nüfuzunu və monovalent molekulyar servislərdən istifadə edərək terapevtik antikorların effektivliyini artırın.Neuron 81, 49-60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Transferrin reseptorunun (TfR) nəqli, TfR antikorlarının yaxınlıq variantlarının beyin tərəfindən mənimsənilməsini təyin edir.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).