Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik.İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında məhdud CSS dəstəyi var.Ən yaxşı təcrübə üçün sizə yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyi tövsiyə edirik (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq rejimini söndürün).Bu arada, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün biz saytı üslub və JavaScript olmadan təqdim edəcəyik.
Maye biopsiyası (LB) biotibbi sahədə sürətlə populyarlıq qazanan bir konsepsiyadır.Konsepsiya əsasən müxtəlif toxumalarda hüceyrə ölümündən sonra kiçik fraqmentlər şəklində sərbəst buraxılan dövran edən hüceyrədənkənar DNT (ccfDNA) fraqmentlərinin aşkarlanmasına əsaslanır.Bu fraqmentlərin kiçik bir hissəsi yad (xarici) toxuma və ya orqanizmlərdən qaynaqlanır.Hazırkı işimizdə biz bu konsepsiyanı yüksək dəniz suyu filtrasiya qabiliyyəti ilə tanınan gözətçi növü olan midyelərə tətbiq etdik.Biz dəniz sahili ekosistemlərinin biomüxtəlifliyi haqqında məlumat vermək üçün müxtəlif mənbələrdən ətraf mühitin DNT fraqmentlərini tutmaq üçün midyelərin təbii filtr kimi fəaliyyət göstərmək qabiliyyətindən istifadə edirik.Nəticələrimiz göstərir ki, midye hemolimfasında 1 ilə 5 kb arasında ölçüləri çox dəyişən DNT fraqmentləri var.Ov tüfənginin ardıcıllığı çoxlu sayda DNT fraqmentinin yad mikrob mənşəli olduğunu göstərdi.Onların arasında bakteriya, arxeya və viruslardan, o cümlədən sahilyanı dəniz ekosistemlərində çox rast gəlinən müxtəlif ev sahiblərinə yoluxduğu bilinən viruslardan DNT fraqmentləri tapdıq.Nəticə olaraq, araşdırmamız göstərir ki, midyelərə tətbiq olunan LB konsepsiyası dəniz sahili ekosistemlərində mikrob müxtəlifliyi haqqında zəngin, lakin hələ öyrənilməmiş bilik mənbəyidir.
İqlim dəyişikliyinin (CC) dəniz ekosistemlərinin biomüxtəlifliyinə təsiri sürətlə böyüyən tədqiqat sahəsidir.Qlobal istiləşmə təkcə mühüm fizioloji gərginliklərə səbəb olmur, həm də dəniz orqanizmlərinin istilik dayanıqlığının təkamül hüdudlarını itələyir, bir sıra növlərin yaşayış mühitinə təsir edir, onları daha əlverişli şərait axtarmağa sövq edir [1, 2].Metazoanların biomüxtəlifliyinə təsir etməklə yanaşı, CC ev sahibi-mikrob qarşılıqlı təsirinin zərif tarazlığını pozur.Bu mikrob disbakteriozu dəniz ekosistemləri üçün ciddi təhlükə yaradır, çünki dəniz orqanizmlərini yoluxucu patogenlərə daha həssas edir [3, 4].Qlobal dəniz ekosistemlərinin idarə olunması üçün ciddi problem olan kütləvi ölümlərdə SS-nin mühüm rol oynadığı güman edilir [5, 6].Bu, bir çox dəniz növlərinin iqtisadi, ekoloji və qidalanma təsirlərini nəzərə alaraq mühüm məsələdir.Bu xüsusilə qütb bölgələrində yaşayan ikiqapaqlılar üçün doğrudur, burada CK təsirləri daha tez və şiddətlidir [6, 7].Əslində, Mytilus spp kimi ikiqapaqlılar.CC-nin dəniz ekosistemlərinə təsirini izləmək üçün geniş istifadə olunur.Təəccüblü deyil ki, onların sağlamlığına nəzarət etmək üçün nisbətən çox sayda biomarkerlər işlənib hazırlanmışdır, çox vaxt fermentativ fəaliyyətə və ya hüceyrənin canlılığı və faqositik aktivliyə əsaslanan funksional biomarkerləri əhatə edən iki səviyyəli yanaşmadan istifadə edilir [8].Bu üsullara həmçinin böyük miqdarda dəniz suyunun udulmasından sonra yumşaq toxumalarda toplanan xüsusi təzyiq göstəricilərinin konsentrasiyasının ölçülməsi daxildir.Bununla belə, ikiqapaqlıların yüksək filtrasiya qabiliyyəti və yarı açıq qan dövranı sistemi xəstələrin idarə edilməsinə sadə və minimal invaziv yanaşma olan maye biopsiyası (LB) konsepsiyasından istifadə edərək yeni hemolimfa biomarkerlərinin işlənib hazırlanmasına imkan yaradır.qan nümunələri [9, 10].İnsan LB-də dövran edən molekulların bir neçə növü tapıla bilsə də, bu konsepsiya ilk növbədə plazmada dövran edən hüceyrədənkənar DNT (ccfDNA) fraqmentlərinin DNT ardıcıl analizinə əsaslanır.Əslində, insan plazmasında dövran edən DNT-nin olması 20-ci əsrin ortalarından bəri məlumdur [11], lakin yalnız son illərdə yüksək məhsuldarlıqlı sekvensiya üsullarının meydana çıxması ccfDNA əsasında klinik diaqnostikaya səbəb olmuşdur.Bu dövran edən DNT fraqmentlərinin olması qismən hüceyrə ölümündən sonra genomik DNT-nin (nüvə və mitoxondrial) passiv buraxılması ilə bağlıdır. Sağlam insanlarda ccfDNA-nın konsentrasiyası normal olaraq aşağıdır (<10 ng/ml), lakin müxtəlif patologiyalardan əziyyət çəkən və ya stressə məruz qalan xəstələrdə 5-10 dəfə artırıla bilər, nəticədə toxuma zədələnir. Sağlam insanlarda ccfDNA-nın konsentrasiyası normal olaraq aşağıdır (<10 ng/ml), lakin müxtəlif patologiyalardan əziyyət çəkən və ya stressə məruz qalan xəstələrdə 5-10 dəfə artırıla bilər, nəticədə toxuma zədələnir. U zdorovыh lädäy lövhäläri vccDNKK-da norme nizkaya (<10 нг/мл), lakin 5-10 räz märzində qädär çäkişdirə bilär. Sağlam insanlarda cccDNA-nın konsentrasiyası normal olaraq aşağıdır (<10 ng/ml), lakin müxtəlif patologiyaları olan və ya toxuma zədələnməsinə səbəb olan stress altında olan xəstələrdə 5-10 dəfə arta bilər.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或各种病理或公力或宗5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 戗 病理 或 戗可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伍 损伤ccfDNA konsentrasiyası insanlar üçün çox zəifdir (<10 нг/мл), lakin xəstələrin müxtəlif xəstəlikləri və ya stresləri ilə 5-10 dəqiqə ərzində yüksək səviyyəyə qalxa bilər. ccfDNA konsentrasiyası sağlam insanlarda adətən aşağıdır (<10 ng/ml), lakin müxtəlif patologiyaları və ya stressi olan xəstələrdə 5-10 dəfə artırıla bilər, nəticədə toxuma zədələnir.ccfDNA fraqmentlərinin ölçüsü geniş şəkildə dəyişir, lakin adətən 150 ilə 200 bp arasında dəyişir.[12].Öz-özünə əldə edilən ccfDNA-nın, yəni normal və ya transformasiya olunmuş ana hüceyrələrdən ccfDNA-nın təhlili nüvə və/yaxud mitoxondrial genomda mövcud olan genetik və epigenetik dəyişiklikləri aşkar etmək üçün istifadə oluna bilər və bununla da klinisyenlərə xüsusi molekulyar hədəflənmiş müalicələri seçməyə kömək edə bilər [13].Bununla belə, ccfDNA hamiləlik zamanı fetal hüceyrələrdən və ya transplantasiya edilmiş orqanlardan ccfDNA kimi xarici mənbələrdən əldə edilə bilər [14,15,16,17].ccfDNA həm də yoluxmuş toxumanın invaziv biopsiyasından qaçaraq, qan kulturaları ilə müəyyən edilməmiş geniş yayılmış infeksiyaların qeyri-invaziv aşkarlanmasına imkan verən yoluxucu agentin (xarici) nuklein turşularının mövcudluğunu aşkar etmək üçün vacib məlumat mənbəyidir [18].Son tədqiqatlar həqiqətən də insan qanının viral və bakterial patogenləri müəyyən etmək üçün istifadə edilə bilən zəngin məlumat mənbəyini ehtiva etdiyini və insan plazmasında tapılan ccfDNA-nın təxminən 1%-nin xarici mənşəli olduğunu göstərdi [19].Bu tədqiqatlar göstərir ki, orqanizmin dövran edən mikrobiomunun biomüxtəlifliyi ccfDNA analizindən istifadə etməklə qiymətləndirilə bilər.Lakin son vaxtlara qədər bu anlayışdan yalnız insanlarda və daha az dərəcədə digər onurğalılarda istifadə olunurdu [20, 21].
Hazırkı məqalədə biz 35 milyon il əvvəl yaranmış böyük bir yaylanın üstündəki adalar qrupu olan, subantarktik Kerguelen adalarında tez-tez rast gəlinən cənub növü olan Aulacomya atranın ccfDNT-sini təhlil etmək üçün LB potensialından istifadə edirik.vulkan püskürməsi.İn vitro eksperimental sistemdən istifadə edərək, dəniz suyundakı DNT fraqmentlərinin midye tərəfindən sürətlə götürüldüyünü və hemolimfa bölməsinə daxil olduğunu gördük.Ov tüfənginin ardıcıllığı göstərdi ki, midye hemolimfa ccfDNA-sında soyuq vulkanik dəniz sahil ekosistemlərinə xas olan simbiotik bakteriyalar və biomlardan alınan DNT fraqmentləri də daxil olmaqla, özünə məxsus və qeyri-öz mənşəli DNT fraqmentləri var.Hemolymph ccfDNA həmçinin müxtəlif host diapazonlu viruslardan əldə edilən viral ardıcıllıqları ehtiva edir.Sümüklü balıqlar, dəniz anemonları, yosunlar və həşəratlar kimi çoxhüceyrəli heyvanların DNT fraqmentlərini də tapdıq.Nəticə olaraq, tədqiqatımız göstərir ki, LB konsepsiyası dəniz ekosistemlərində zəngin genomik repertuar yaratmaq üçün dəniz onurğasızlarına uğurla tətbiq oluna bilər.
Yetkinlər (55-70 mm uzunluqda) Mytilus platensis (M. platensis) və Aulacomya atra (A. atra) Port-au-Fransın gelgitlərarası qayalı sahillərindən (049°21.235 S, 070°13.490 E.) toplanmışdır.Kerguelen adaları, 2018-ci ilin dekabrında. Digər yetkin mavi midye (Mytilus spp.) kommersiya təchizatçısından (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) alınmış və 10-20 L 32‰ süni duzlu su olan temperatura nəzarət edilən (4°C) qazlı çənə yerləşdirilmişdir.(süni dəniz duzu Reef Crystal, Instant Ocean, Virciniya, ABŞ).Hər bir təcrübə üçün ayrı-ayrı qabıqların uzunluğu və çəkisi ölçüldü.
Bu proqram üçün pulsuz açıq giriş protokolu onlayn mövcuddur (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Qısaca, LB hemolimfa təsvir edildiyi kimi qaçıran əzələlərdən toplanmışdır [22].Hemolimfa 3 dəqiqə ərzində 1200 × g-də sentrifuqa ilə aydınlaşdırıldı, supernatant istifadə olunana qədər donduruldu (-20 ° C).CfDNA-nın təcrid edilməsi və təmizlənməsi üçün nümunələr (1,5-2,0 ml) istehsalçının göstərişlərinə uyğun olaraq NucleoSnap cfDNA dəsti (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) istifadə edərək əridildi və emal edildi.ccfDNA sonrakı analizə qədər -80°C-də saxlanıldı.Bəzi təcrübələrdə ccfDNA QIAamp DNT Tədqiqatçı Kitindən (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada) istifadə edilərək təcrid olunmuş və təmizlənmişdir.Təmizlənmiş DNT standart PicoGreen analizi ilə ölçüldü.Təcrid olunmuş ccfDNA-nın fraqment paylanması Yüksək Həssaslıq DNT Kitindən istifadə edərək Agilent 2100 bioanalizatorundan (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) istifadə edərək kapilyar elektroforez vasitəsilə təhlil edilmişdir.Təhlil istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq 1 µl ccfDNA nümunəsindən istifadə edilməklə aparılmışdır.
Hemolimfa ccfDNA fraqmentlərinin ardıcıllığı üçün Génome Québec (Monreal, Kvebek, Kanada) Illumina MiSeq PE75 dəstinin Illumina DNT Mix dəstindən istifadə edərək ov tüfəngi kitabxanaları hazırladı.Standart adapterdən (BioO) istifadə olunub.Xam məlumat faylları NCBI Sequence Read Archive-dən əldə edilə bilər (SRR8924808 və SRR8924809).Əsas oxu keyfiyyəti FastQC [23] istifadə edərək qiymətləndirilmişdir.Trimmomatic [24] adapterləri kəsmək və keyfiyyətsiz oxumaq üçün istifadə edilmişdir.Uçları qoşalaşmış ov tüfəngi oxunuşları uyğunsuzluğun qarşısını almaq üçün minimum 20 bp üst-üstə düşən daha uzun tək oxunuşlara FLASH birləşdirildi [25]. Birləşdirilmiş oxunuşlar ikiqapalı NCBI Taksonomiya verilənlər bazasından (e dəyəri < 1e−3 və 90% homologiya) istifadə edərək BLASTN ilə şərh edildi və DUST [26] istifadə edərək aşağı mürəkkəblik ardıcıllığının maskalanması həyata keçirildi. Birləşdirilmiş oxunuşlar ikiqapalı NCBI Taksonomiya verilənlər bazasından (e dəyəri < 1e−3 və 90% homologiya) istifadə edərək BLASTN ilə şərh edildi və DUST [26] istifadə edərək aşağı mürəkkəblik ardıcıllığının maskalanması həyata keçirildi. Obъedindennıe chteniya by annotirovanıs pomoщью BLASTN ilə istifadə olunur bazası dannıx taksonomii dvustvorcatıx mollyuskov NCBI (znachie e < 1e-3 və 90% гомологии), a maskirovanie posledovatelnostey niskoy ispolST2 [[2] daha çox problem var. Birləşdirilmiş oxunuşlar NCBI ikiqapalı taksonomiya verilənlər bazasından (e dəyəri < 1e-3 və 90% homologiya) istifadə edərək BLASTN ilə şərh edildi və DUST [26] istifadə edərək aşağı mürəkkəblik ardıcıllığının maskalanması həyata keçirildi.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读合并的读合并的读合并的读合并的读合 的读）低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 合并 读数 合并 读数 （（（<1e-3 和复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Obъedindennıe chteniya by annotirovanıs pomoщью BLASTN ilə istifadə edilən təxminlərə uyğun olaraq dannıx dvustvorcatıx mollyuskov NCBI (znachie e <1e-3 və 90% гомологии), a maskirovanie posledovatelnostey by DUST2 daha çox istifadə olunur. Birləşdirilmiş oxunuşlar NCBI ikiqapalı taksonomik verilənlər bazasından (e dəyəri <1e-3 və 90% homologiya) istifadə edərək BLASTN ilə şərh edildi və DUST [26] istifadə edərək aşağı mürəkkəblik ardıcıllığının maskalanması həyata keçirildi.Oxumalar iki qrupa bölünürdü: ikiqapalı ardıcıllıqla əlaqəli (burada öz-özünə oxuyurlar) və əlaqəsiz (özünü oxumayanlar).Kontiglər yaratmaq üçün MEGAHIT istifadə edərək iki qrup ayrıca yığılmışdır [27].Eyni zamanda, yad mikrobiom oxunuşlarının taksonomik paylanması Kraken2 [28] istifadə edərək təsnif edildi və qrafik olaraq Galaxy-də Krona pasta diaqramı ilə təmsil olundu [29, 30].İlkin təcrübələrimizdən optimal kmerlərin kmer-59 olduğu müəyyən edilmişdir. Daha sonra son annotasiya üçün BLASTN (ikivalve NCBI verilənlər bazası, e dəyəri < 1e−10 və 60% homologiya) ilə uyğunlaşma yolu ilə öz kontigmaları müəyyən edildi. Daha sonra son annotasiya üçün BLASTN (ikivalve NCBI verilənlər bazası, e dəyəri < 1e−10 və 60% homologiya) ilə uyğunlaşma yolu ilə öz kontigmaları müəyyən edildi. BLASTN (baza dannıx dvustvennıe contiqy by identificrovanı putem sopostavleniya NCBI, значение e <1e-10 və гомология 60%) üçün okonchatelnoy annotacii. Daha sonra son annotasiya üçün BLASTN (NCBI ikiqapaqlı verilənlər bazası, e dəyəri <1e-10 və 60% homologiya) ilə uyğunlaşdırılaraq öz-özünə bitişikliklər müəyyən edildi.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识贝类对齐来识别別最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% BLASTN (dvustvorcatıx mollyuskov üçün NCBI bazası, <1e-10 və гомология 60%) üçün identifikasiya sənədləri. Daha sonra BLASTN (NCBI ikiqapaqlı verilənlər bazası, e dəyəri <1e-10 və 60% homologiya) ilə uyğunlaşdırılaraq yekun annotasiya üçün öz-özünə bitişmələr müəyyən edildi. Paralel olaraq, BLASTN (nt NCBI verilənlər bazası, e dəyəri < 1e−10 və 60% homologiya) ilə öz-özünə olmayan qrup kontigləri qeyd edildi. Paralel olaraq, BLASTN (nt NCBI verilənlər bazası, e dəyəri < 1e−10 və 60% homologiya) ilə öz-özünə olmayan qrup kontigləri qeyd edildi. BLASTN (baza dannıx nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Paralel olaraq, xarici qrup kontigləri BLASTN (NT NCBI verilənlər bazası, e dəyəri <1e-10 və 60% homologiya) ilə şərh edilmişdir.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组释非自身组重参参平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组释非自身组重参参 Параллельно контиг, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (baza dannıx nt NCBI, значение e <1e-10 və гомология 60%). Paralel olaraq, öz-özünə olmayan qrup kontigləri BLASTN (nt NCBI verilənlər bazası, e dəyəri <1e-10 və 60% homologiya) ilə şərh edilmişdir. BLASTX həmçinin nr və RefSeq protein NCBI verilənlər bazalarından (e dəyəri < 1e−10 və 60% homologiya) istifadə edərək, öz-özünə olmayan kontiglər üzərində aparılmışdır. BLASTX həmçinin nr və RefSeq protein NCBI verilənlər bazalarından (e dəyəri < 1e−10 və 60% homologiya) istifadə edərək, öz-özünə olmayan kontiglər üzərində aparılmışdır. BLASTX eyni zamanda qeyri-müəyyən kontiqahları istifadə edərək, dannıx belka nr və RefSeq NCBI (znachie e <1e-10 və гомология 60%) ilə sübut edilmişdir. BLASTX həmçinin nr və RefSeq NCBI zülal verilənlər bazalarından (e dəyəri < 1e-10 və 60% homologiya) istifadə edərək, öz-özünə olmayan kontiglər üzərində həyata keçirilib.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 撌60% 吧 吧还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 撌60% 吧 吧 BLASTX eyni zamanda dannıx belka nr və RefSeq NCBI (znachie e <1e-10 və гомология 60%) ilə istifadə olunur. BLASTX həmçinin nr və RefSeq NCBI zülal verilənlər bazalarından (e dəyəri <1e-10 və 60% homologiya) istifadə edərək, öz-özünə olmayan kontiglər üzərində həyata keçirilib.Öz-özünə olmayan BLASTN və BLASTX hovuzları son kontigləri təmsil edir (Əlavə fayla baxın).
PCR üçün istifadə olunan primerlər Cədvəl S1-də verilmişdir.Taq DNT polimeraza (Bio Basic Canada, Markham, ON) ccfDNA hədəf genlərini gücləndirmək üçün istifadə edilmişdir.Aşağıdakı reaksiya şərtlərindən istifadə edilmişdir: 3 dəqiqə ərzində 95°C-də denatürasiya, 1 dəqiqə ərzində 95°C, yumşalma temperaturu 1 dəqiqə, uzanma 72°C-də 1 dəqiqə, 35 dövr və nəhayət, 10 dəqiqə ərzində 72°C..PCR məhsulları 95 V-də SYBRTM Safe DNT Gel Ləkəsi (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) olan agaroz gellərində (1,5%) elektroforez yolu ilə ayrıldı.
Midiya (Mytilus spp.) 4°C-də 24 saat ərzində 500 ml oksigenli dəniz suyunda (32 PSU) aklimatlaşdırılmışdır.İnsan qalektin-7 cDNA ardıcıllığını (NCBI qoşulma nömrəsi L07769) kodlayan əlavəni ehtiva edən plazmid DNT flakona 190 μg/μl yekun konsentrasiyada əlavə edildi.DNT əlavə edilmədən eyni şəraitdə inkubasiya edilmiş midyelər nəzarət idi.Üçüncü nəzarət tankında midyesiz DNT var idi.Dəniz suyunda DNT-nin keyfiyyətinə nəzarət etmək üçün göstərilən vaxtda hər bir tankdan dəniz suyu nümunələri (20 μl; üç təkrar) götürülmüşdür.Plazmid DNT-nin izlənməsi üçün LB midyeləri göstərilən vaxtlarda yığılmış və qPCR və ddPCR ilə təhlil edilmişdir.Dəniz suyunun yüksək duz tərkibinə görə, alikvotlar bütün PCR analizlərindən əvvəl PCR keyfiyyətli suda (1:10) seyreltildi.
Rəqəmsal damcı PCR (ddPCR) BioRad QX200 protokolundan (Missisauga, Ontario, Kanada) istifadə edərək həyata keçirilmişdir.Optimal temperaturu müəyyən etmək üçün temperatur profilindən istifadə edin (Cədvəl S1).Damcılar QX200 damcı generatoru (BioRad) istifadə edərək yaradıldı.ddPCR aşağıdakı kimi həyata keçirildi: 5 dəqiqə ərzində 95°C, 30 saniyə ərzində 95°C-də 50 dövr və verilmiş yumşalma temperaturu 1 dəqiqə və 72°C 30 saniyə, 5 dəqiqə ərzində 4°C və 5 dəqiqə ərzində 90°C.Damcıların sayı və müsbət reaksiyalar (nüsxələrin sayı/µl) QX200 damcı oxuyucusu (BioRad) ilə ölçüldü.10.000 damcıdan az olan nümunələr rədd edildi.ddPCR hər dəfə işə salındıqda nümunə nəzarəti həyata keçirilmədi.
qPCR Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sidney, Avstraliya) və LGALS7 spesifik primerlərindən istifadə etməklə həyata keçirilib.Bütün kəmiyyət PCR-lər QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) istifadə edərək 20 µl-də yerinə yetirildi.qPCR bir məlumat toplanması ilə 95°C-də 15 dəqiqəlik inkubasiya, ardınca 95°C-də 10 saniyə və 60°C-də 60 saniyə ərzində 40 dövrə ilə başladıldı.Ərimə əyriləri qPCR-nin sonunda 95°C-də 5 s, 65°C-də 60 s və 97°C-də ardıcıl ölçmələrdən istifadə etməklə yaradılmışdır.Nəzarət nümunələri istisna olmaqla, hər bir qPCR üç nüsxədə yerinə yetirildi.
Midiya yüksək filtrasiya sürəti ilə tanındığından, biz əvvəlcə onların dəniz suyunda mövcud olan DNT fraqmentlərini süzüb saxlaya bilmələrini araşdırdıq.Bu fraqmentlərin yarıaçıq limfa sistemində toplanıb-toplanmaması ilə də maraqlandıq.Mavi midye çənlərinə əlavə olunan həll olunan DNT fraqmentlərinin taleyini izləməklə bu məsələni eksperimental şəkildə həll etdik.DNT fraqmentlərinin izlənilməsini asanlaşdırmaq üçün insan galektin-7 genini ehtiva edən xarici (özünü deyil) plazmid DNT-dən istifadə etdik.ddPCR dəniz suyunda və midyelərdə plazmid DNT fraqmentlərini izləyir.Əldə etdiyimiz nəticələr göstərir ki, əgər dəniz suyunda DNT fraqmentlərinin miqdarı midye olmadıqda zamanla (7 günə qədər) nisbətən sabit qalırsa, midyelərin varlığında bu səviyyə 8 saat ərzində demək olar ki, tamamilə yox olur (şəkil 1a,b).ekzogen DNT fraqmentləri asanlıqla intravalvular maye və hemolymph (Şəkil. 1c) 15 dəqiqə ərzində aşkar edilmişdir.Bu fraqmentlər hələ də məruz qaldıqdan 4 saat sonra aşkar edilə bilər.DNT fraqmentləri ilə bağlı bu filtrləmə fəaliyyəti bakteriya və yosunların filtrasiya fəaliyyəti ilə müqayisə edilə bilər [31].Bu nəticələr midyelərin maye bölmələrində yad DNT-ni süzüb toplaya bildiyini göstərir.
ddPCR ilə ölçülən midye varlığında (A) və ya yoxluğunda (B) dəniz suyunda plazmid DNT-nin nisbi konsentrasiyası.A-da nəticələr 75-ci və 25-ci faizləri təmsil edən xanaların sərhədləri ilə faizlə ifadə edilir.Quraşdırılmış loqarifmik əyri qırmızı rənglə göstərilir və boz rəngdə kölgələnmiş sahə 95% etibarlılıq intervalını təmsil edir.B-də qırmızı xətt orta, mavi xətt konsentrasiya üçün 95% etimad intervalını təmsil edir.C Plazmid DNT-nin əlavə edilməsindən sonra müxtəlif vaxtlarda midyelərin hemolimfa və qapaq mayesində plazmid DNT-nin toplanması.Nəticələr aşkar edilmiş mütləq nüsxələr/ml (±SE) kimi təqdim olunur.
Daha sonra, məhdud antropogen təsirə malik olan uzaq adalar qrupu olan Kerguelen adalarında midye yataqlarından toplanmış midyelərdə ccfDNA-nın mənşəyini araşdırdıq.Bu məqsədlə midye hemolimflərindən cccDNT təcrid olunmuş və insan cccDNT-sini təmizləmək üçün ümumi istifadə edilən üsullarla təmizlənmişdir [32, 33].Midiyadakı orta hemolimfa ccfDNA konsentrasiyalarının ml hemolimfa diapazonunda aşağı mikroqramlarda olduğunu aşkar etdik (bax Cədvəl S2, Əlavə Məlumat).Bu konsentrasiya diapazonu sağlam insanlarla müqayisədə çox böyükdür (mililitrdə aşağı nanoqram), lakin nadir hallarda xərçəng xəstələrində ccfDNA səviyyəsi millilitrdə bir neçə mikroqrama çata bilər [34, 35].Hemolimfa ccfDNA-nın ölçü paylanmasının təhlili göstərdi ki, bu fraqmentlər 1000 bp ilə 1000 bp arasında dəyişir.5000 bp-ə qədər (şək. 2).Oxşar nəticələr, ccfDNA da daxil olmaqla, aşağı konsentrasiyalı DNT nümunələrindən genomik DNT-ni sürətlə təcrid etmək və təmizləmək üçün məhkəmə-tibb elmində geniş istifadə olunan bir üsul olan silisium əsaslı QIAamp Tədqiqatçı Kitindən istifadə etməklə əldə edilmişdir [36].
Midiya hemolimfinin nümayəndəsi ccfDNT elektroforeqramı.NucleoSnap Plazma Dəsti (yuxarı) və QIAamp DNT Tədqiqatçı Kiti ilə çıxarılmışdır.B Midiyalarda hemolimf ccfDNT konsentrasiyalarının (±SE) paylanmasını göstərən skripka süjeti.Qara və qırmızı xətlər müvafiq olaraq medianı və birinci və üçüncü kvartilləri təmsil edir.
İnsanlarda və primatlarda ccfDNT-nin təxminən 1%-i xarici mənbəyə malikdir [21, 37].İki qapaqlıların yarı açıq qan dövranı sistemini, mikroblarla zəngin dəniz suyunu və midye ccfDNT-nin ölçüdə paylanmasını nəzərə alaraq, biz fərz etdik ki, midye hemolimfa ccfDNA-nın zəngin və müxtəlif mikrob DNT hovuzu ola bilər.Bu fərziyyəni yoxlamaq üçün biz Kerguelen adalarından toplanmış Aulacomya atra nümunələrindən hemolimfa ccfDNT-ni sıraladıq və 10 milyondan çox oxunuş əldə etdik, bunların 97,6%-i keyfiyyət nəzarətindən keçdi.Daha sonra oxunuşlar BLASTN və NCBI ikiqapalı verilənlər bazalarından istifadə edərək öz və qeyri-özünə mənbələrə görə təsnif edildi (Şəkil S1, Əlavə Məlumat).
İnsanlarda həm nüvə, həm də mitoxondrial DNT qan dövranına buraxıla bilər [38].Bununla belə, bu işdə A. atra genomunun ardıcıllığı və təsvir edilməməsi nəzərə alınmaqla, midyelərin nüvə genomik DNT-sini ətraflı təsvir etmək mümkün olmayıb.Bununla belə, biz ikiqapalı kitabxanadan istifadə edərək öz mənşəyimizdən olan bir sıra ccfDNA fraqmentlərini müəyyən edə bildik (Şəkil S2, Əlavə Məlumat).Biz, həmçinin, ardıcıl olaraq təyin olunan A. atra genlərinin PCR-nin yönləndirilərək gücləndirilməsi ilə öz mənşəyimizə aid DNT fraqmentlərinin mövcudluğunu təsdiqlədik (Şəkil 3).Eynilə, A.atra-nın mitoxondrial genomunun ictimai məlumat bazalarında mövcud olduğunu nəzərə alsaq, A.atra-nın hemolimfasında mitoxondrial ccfDNA fraqmentlərinin olması üçün dəlil tapmaq olar.Mitoxondrial DNT fraqmentlərinin olması PCR amplifikasiyası ilə təsdiq edilmişdir (Şəkil 3).
PCR ilə gücləndirilmiş A. atra (qırmızı nöqtələr – ehtiyat nömrəsi: SRX5705969) və M. platensis (mavi nöqtələr – ehtiyat nömrəsi: SRX5705968) hemolimfasında müxtəlif mitoxondrial genlər mövcud olmuşdur.Şəkil Breton et al., 2011-dən uyğunlaşdırılmışdır.PCR qarışığı olan PCR borusuna birbaşa əlavə etmək üçün 3 mm-lik punch istifadə edin.
Dəniz suyunda bol mikrob tərkibini nəzərə alaraq, biz ilkin olaraq hemolimfdə mikrob DNT ardıcıllığının xarakteristikasına diqqət yetirdik.Bunun üçün iki fərqli strategiyadan istifadə edirik.Birinci strategiyada mikrob ardıcıllığını BLAST və digər alətlərlə müqayisə edilə bilən dəqiqliklə müəyyən edə bilən alqoritm əsaslı ardıcıllıq təsnifatı proqramı olan Kraken2 istifadə edilmişdir [28].6719-dan çox oxunmanın bakterial mənşəli olduğu müəyyən edildi, 124 və 64-ü isə müvafiq olaraq arxeya və viruslardan idi (Şəkil 4).Ən çox yayılmış bakterial DNT fraqmentləri Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) və Bacteroidetes (17%) idi (Şəkil 4a).Bu paylama dəniz mavisi midye mikrobiomunun əvvəlki tədqiqatlarına uyğundur [39, 40].Gammaproteobacteria çox Vibrionales (Şəkil. 4b) daxil olmaqla, Proteobacteria (44%) əsas sinfi idi.ddPCR metodu A. atra hemolimfin ccfDNA-sında Vibrio DNT fraqmentlərinin olmasını təsdiqlədi (Şəkil 4c) [41].ccfDNA-nın bakterial mənşəyi haqqında daha çox məlumat əldə etmək üçün əlavə yanaşma tətbiq edilmişdir (Şəkil S2, Əlavə Məlumat). Bu halda, üst-üstə düşən oxunuşlar qoşalaşmış oxunuşlar kimi yığılıb və BLASTN və e dəyəri 1e−3 və >90% homologiya ilə kəsimdən istifadə edərək öz (ikiqapaqlı) və ya öz mənşəli kimi təsnif edilib. Bu halda, üst-üstə düşən oxunuşlar qoşalaşmış oxunuşlar kimi yığılıb və BLASTN və e dəyəri 1e−3 və >90% homologiya ilə kəsimdən istifadə edərək öz (ikiqapaqlı) və ya öz mənşəli kimi təsnif edilib. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами və были классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN və значения в 190%. Bu halda, üst-üstə düşən oxunuşlar qoşalaşmış oxunuşlar kimi toplandı və BLASTN və e dəyəri 1e-3 və >90% homologiya ilə kəsimdən istifadə edərək yerli (ikivalve) və ya qeyri-orijinal kimi təsnif edildi.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值0% 值天值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 使用 嚄用 佚用和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения бли собраны как чтения с парными концами və классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) və ya несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN i 1e-i BLASTN və 1e. Bu halda, üst-üstə düşən oxunuşlar qoşalaşmış oxunuşlar kimi toplandı və e BLASTN və 1e-3 dəyərlərindən və homologiya həddini >90% istifadə edərək öz (ikivalv) və ya orijinal olmayan kimi təsnif edildi.A. atra genomu hələ ardıcıllaşdırılmadığı üçün biz MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assemblerinin de novo montaj strategiyasından istifadə etdik.Cəmi 147,188 kontig mənşədən asılı (ikivalv) kimi müəyyən edilmişdir.Bu kontiglər daha sonra BLASTN və BLASTX istifadə edərək 1e-10 e-dəyərləri ilə partladıldı.Bu strategiya bizə A. atra ccfDNA-da mövcud olan 482 ikivalv olmayan fraqmentləri müəyyən etməyə imkan verdi.Bu DNT fraqmentlərinin yarıdan çoxu (57%) bakteriyalardan, əsasən sulfotrofik simbiontlar da daxil olmaqla, gill simbiontlarından və solemya velum gill simbionlarından əldə edilmişdir (şək. 5).
Növ səviyyəsində nisbi bolluq.B İki əsas filanın (Firmicutes və Proteobacteria) mikrob müxtəlifliyi.ddPCR C Vibrio spp-nin reprezentativ gücləndirilməsi.A. Üç atra hemolimfada 16S rRNA geninin fraqmentləri (mavi).
Cəmi 482 toplanmış kontig analiz edilmişdir.Metagenomik kontig annotasiyalarının taksonomik paylanmasının ümumi profili (prokaryotlar və eukaryotlar).B BLASTN və BLASTX tərəfindən müəyyən edilmiş bakterial DNT fraqmentlərinin ətraflı paylanması.
Kraken2 analizi həmçinin göstərdi ki, midye ccfDNA-da arxaeal DNT fraqmentləri, o cümlədən Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) və Thaurmarcheota (11%) (Şəkil 6a) DNT fraqmentləri var.Əvvəllər Kaliforniya midyelərinin mikrob icmasında aşkar edilmiş Euryarchaeota və Crenarchaeota-dan əldə edilən DNT fraqmentlərinin olması təəccüblü olmamalıdır [42].Euryarchaeota tez-tez ekstremal şəraitlə əlaqələndirilsə də, indi məlumdur ki, həm Euryarchaeota, həm də Crenarcheota dəniz kriogen mühitində ən çox yayılmış prokaryotlardandır [43, 44].Kerguelen platosunda [45] dib sızmalarından geniş metan sızması və Kerguelen adaları sahillərində müşahidə edilən mümkün mikrob metan istehsalı haqqında son hesabatları nəzərə alsaq, midyelərdə metanogen mikroorqanizmlərin olması təəccüblü deyil.
Daha sonra diqqətimiz DNT viruslarının oxunuşlarına keçdi.Bildiyimiz qədər, bu, midyelərin virus tərkibinin hədəfdən kənar ilk tədqiqatıdır.Gözlənildiyi kimi, biz bakteriofaqların (Caudovirales) DNT fraqmentlərini tapdıq (Şəkil 6b).Bununla birlikdə, ən çox yayılmış viral DNT, hər hansı bir virusun ən böyük genomuna sahib olan nüvə sitoplazmik böyük DNT virusu (NCLDV) kimi də tanınan nukleositoviruslar filumundan gəlir.Bu filumda DNT ardıcıllığının əksəriyyəti Mimimidoviridae (58%) və Poxviridae (21%) ailələrinə aiddir, onların təbii sahiblərinə onurğalılar və artropodlar daxildir, bu DNT ardıcıllığının kiçik bir hissəsi isə məlum virusoloji yosunlara aiddir.Dəniz eukaryotik yosunları yoluxdurur.Ardıcıllıqlar həmçinin hər hansı məlum virus nəslinin ən böyük genom ölçüsünə malik nəhəng virus olan Pandora virusundan əldə edilib.Maraqlıdır ki, hemolimfa ccfDNA ardıcıllığı ilə müəyyən edilən virusa yoluxduğu bilinən hostların diapazonu nisbətən böyük idi (Şəkil S3, Əlavə məlumat).Buraya Baculoviridae və Iridoviridae kimi həşəratları yoluxduran viruslar, həmçinin amöba, yosun və onurğalıları yoluxduran viruslar daxildir.Pithovirus sibericum genomuna uyğun gələn ardıcıllıqları da tapdıq.Pitoviruslar (“zombi virusları” kimi də tanınır) ilk dəfə Sibirdə 30.000 illik permafrostdan təcrid edilmişdir [47].Beləliklə, bizim nəticələrimiz bu virusların bütün müasir növlərinin nəsli kəsilmədiyini göstərən əvvəlki hesabatlara uyğundur [48] və bu viruslar uzaq subarktik dəniz ekosistemlərində mövcud ola bilər.
Nəhayət, digər çoxhüceyrəli heyvanların DNT fraqmentlərini tapa bilməyəcəyimizi yoxlamaq üçün sınaqdan keçirdik.NT, nr və RefSeq kitabxanaları (genomik və zülal) ilə BLASTN və BLASTX tərəfindən cəmi 482 xarici kontig müəyyən edilmişdir.Nəticələrimiz göstərir ki, çoxhüceyrəli heyvanların ccfDNA-nın yad fraqmentləri arasında sümüklü sümüklərin DNT-si üstünlük təşkil edir (şək. 5).Həşəratlardan və digər növlərdən DNT parçaları da tapılıb.DNT fraqmentlərinin nisbətən böyük bir hissəsi müəyyən edilməmişdir, ola bilsin ki, yerüstü növlərlə müqayisədə çoxlu sayda dəniz növlərinin genomik məlumat bazalarında az təmsil olunması səbəbindən [49].
Hazırkı məqalədə biz LB konsepsiyasını midyelərə tətbiq edirik və hemolimf ccfDNA atış ardıcıllığının dəniz sahil ekosistemlərinin tərkibinə dair fikir təmin edə biləcəyini iddia edirik.Xüsusilə, biz tapdıq ki, 1) midye hemolimfasında nisbətən böyük (~1-5 kb) dövr edən DNT fraqmentlərinin nisbətən yüksək konsentrasiyası (mikroqram səviyyələri) var;2) bu DNT fraqmentləri həm müstəqil, həm də qeyri-müstəqildir 3) Bu DNT fraqmentlərinin xarici mənbələri arasında biz bakterial, arxa və virus DNT-sini, eləcə də digər çoxhüceyrəli heyvanların DNT-lərini tapdıq;4) Bu yad ccfDNA fraqmentlərinin hemolimfada toplanması sürətlə baş verir və midyelərin daxili filtrasiya fəaliyyətinə kömək edir.Nəticə olaraq, araşdırmamız göstərir ki, indiyədək əsasən biotibb sahəsində tətbiq edilən LB konsepsiyası sentinel növləri ilə onların ətraf mühiti arasındakı qarşılıqlı əlaqəni daha yaxşı başa düşmək üçün istifadə edilə bilən zəngin, lakin öyrənilməmiş bilik mənbəyini kodlaşdırır.
Primatlara əlavə olaraq, siçanlar, itlər, pişiklər və atlar da daxil olmaqla məməlilərdə ccfDNA izolyasiyası bildirilmişdir [50, 51, 52].Bununla belə, bildiyimizə görə, tədqiqatımız açıq dövriyyə sistemi ilə dəniz növlərində ccfDNA-nın aşkarlanması və ardıcıllığını bildirən ilk tədqiqatdır.Midiyaların bu anatomik xüsusiyyəti və filtrasiya qabiliyyəti, digər növlərlə müqayisədə dövriyyədə olan DNT fraqmentlərinin fərqli ölçü xüsusiyyətlərini ən azı qismən izah edə bilər.İnsanlarda qanda dolaşan DNT fraqmentlərinin əksəriyyəti 150 ilə 200 bp arasında dəyişən kiçik fraqmentlərdir.maksimum pik ilə 167 bp [34, 53].DNT fraqmentlərinin kiçik, lakin əhəmiyyətli bir hissəsinin ölçüsü 300 ilə 500 bp arasındadır və təxminən 5% -i 900 bp-dən uzundur.[54].Bu ölçüdə paylanmanın səbəbi plazmadakı ccfDNA-nın əsas mənbəyinin hüceyrə ölümü nəticəsində ya hüceyrə ölümü, ya da sağlam fərdlərdə dövran edən hematopoetik hüceyrələrin nekrozu və ya xərçəng xəstələrində şiş hüceyrələrinin apoptozu (sirkulyasiya edən şiş DNT kimi tanınır) nəticəsində baş verməsidir., ctDNA).Midiyalarda tapdığımız hemolimfa ccfDNA-nın ölçü bölgüsü 1000 ilə 5000 bp arasında dəyişdi və bu, midye ccfDNA-nın fərqli mənşəli olduğunu göstərir.Bu, məntiqi bir fərziyyədir, çünki midye yarı açıq damar sisteminə malikdir və mikrob genomik DNT-nin yüksək konsentrasiyası olan dəniz su mühitində yaşayır.Əslində, ekzogen DNT-dən istifadə etməklə apardığımız laboratoriya təcrübələri göstərdi ki, midye dəniz suyunda DNT fraqmentləri toplayır, ən azı bir neçə saat sonra hüceyrənin qəbulundan sonra parçalanır və/yaxud sərbəst buraxılır və/yaxud müxtəlif təşkilatlarda saxlanılır.Hüceyrələrin (həm prokaryotik, həm də eukaryotik) nadirliyini nəzərə alaraq, intravalvulyar bölmələrin istifadəsi həm öz mənbələrindən, həm də xarici mənbələrdən əldə edilən ccfDNA miqdarını azaldacaq.İkiqapaqlı anadangəlmə toxunulmazlığın əhəmiyyətini və dövran edən çoxlu sayda faqositləri nəzərə alaraq, daha sonra belə fərz etdik ki, hətta yad ccfDNA mikroorqanizmlərin və/və ya hüceyrə zibilinin qəbulu zamanı xarici DNT toplayan dövran edən faqositlərlə zənginləşir.Birgə götürdükdə, əldə etdiyimiz nəticələr göstərir ki, ikiqapalı hemolimfa ccfDNA molekulyar məlumatların unikal anbarıdır və onların gözətçi növ kimi statusunu gücləndirir.
Məlumatlarımız göstərir ki, bakteriya mənşəli hemolimfa ccfDNA fraqmentlərinin ardıcıllığı və təhlili ev sahibi bakterial flora və ətraf dəniz ekosistemində mövcud olan bakteriyalar haqqında əsas məlumatları təmin edə bilər.Atış ardıcıllığı üsulları, adi 16S rRNT identifikasiya metodlarından istifadə edilsəydi, buraxılmış ola biləcək komensal bakteriya A. atra gill ardıcıllığını aşkar etdi, bu da qismən istinad kitabxanasının qərəzliyi ilə əlaqədardır.Əslində, Kerguelendə eyni midye qatında M. platensis-dən toplanmış LB məlumatlarından istifadəmiz göstərdi ki, gilllə əlaqəli bakterial simbiontların tərkibi hər iki midye növü üçün eynidir (Şəkil S4, Əlavə Məlumat).Genetik cəhətdən fərqli iki midyenin bu oxşarlığı Kerguelen soyuq, kükürdlü və vulkanik yataqlarındakı bakteriya icmalarının tərkibini əks etdirə bilər [55, 56, 57, 58].Port-au-Fransa sahilləri kimi bioturbasiya olunmuş sahil ərazilərindən [59] midye yığarkən kükürd azaldan mikroorqanizmlərin yüksək səviyyələri yaxşı təsvir edilmişdir.Başqa bir ehtimal, kommensal midye florasının üfüqi ötürülmədən təsirlənə bilməsidir [60, 61].Dəniz mühiti, dəniz dibinin səthi və midyelərdə simbiotik bakteriyaların tərkibi arasında əlaqəni müəyyən etmək üçün daha çox araşdırmaya ehtiyac var.Hazırda bu araşdırmalar davam edir.
Hemolimf ccfDNA-nın uzunluğu və konsentrasiyası, təmizlənmənin asanlığı və sürətli ov tüfənginin ardıcıllığına imkan verən yüksək keyfiyyət dəniz sahili ekosistemlərində biomüxtəlifliyi qiymətləndirmək üçün midye ccfDNA-dan istifadə etməyin bir çox üstünlüklərindən bəziləridir.Bu yanaşma xüsusi olaraq verilmiş ekosistemdə viral icmaları (viromları) xarakterizə etmək üçün effektivdir [62, 63].Bakteriyalardan, arxeyalardan və eukariotlardan fərqli olaraq, viral genomlarda 16S ardıcıllığı kimi filogenetik olaraq qorunan genlər yoxdur.Nəticələrimiz göstərir ki, midye kimi indikator növlərindən maye biopsiyaları adətən sahilyanı dəniz ekosistemlərində məskunlaşan hostları yoluxdurduğu bilinən nisbətən çox sayda ccfDNA virus fraqmentlərini müəyyən etmək üçün istifadə edilə bilər.Buraya protozoaları, artropodları, həşəratları, bitkiləri və bakterial virusları (məsələn, bakteriofaqlar) yoluxdurduğu bilinən viruslar daxildir.Kerguelendə eyni midye qatında toplanmış mavi midyelərin (M. platensis) hemolimfa ccfDNA viromunu tədqiq etdiyimiz zaman oxşar paylanma aşkar edilmişdir (Cədvəl S2, Əlavə məlumat).ccfDNA-nın ov tüfənginin ardıcıllığı həqiqətən insanların və ya digər növlərin viromunun öyrənilməsində təcil qazanan yeni bir yanaşmadır [21, 37, 64].Baltimorda virusların ən müxtəlif və geniş sinfini təmsil edən bütün ikiqat zəncirli DNT virusları arasında heç bir tək gen qorunmadığı üçün bu yanaşma ikiqat zəncirli DNT viruslarının öyrənilməsi üçün xüsusilə faydalıdır [65].Baxmayaraq ki, bu virusların əksəriyyəti təsnif edilməmiş qalır və viruslar dünyasının tamamilə naməlum hissəsindən olan virusları ehtiva edə bilər [66], A. atra və M. platensis midyelərinin viromları və host diapazonlarının iki növ arasında olduğunu aşkar etdik.oxşar şəkildə (bax şəkil S3, əlavə məlumat).Bu oxşarlıq təəccüblü deyil, çünki ətraf mühitdə mövcud olan DNT-nin qəbulunda seçiciliyin olmamasını əks etdirə bilər.RNT viromunu xarakterizə etmək üçün hal-hazırda təmizlənmiş RNT istifadə edərək gələcək tədqiqatlara ehtiyac var.
Tədqiqatımızda biz Kovarski və həmkarlarının [37] işinə uyğunlaşdırılmış çox ciddi boru kəmərindən istifadə etdik, onlar doğma ccfDNA-nın yığılmasından əvvəl və sonra yığılmış oxunuşların və kontiglərin iki addımlı silinməsindən istifadə etdilər, nəticədə xəritələnməmiş oxunuşların yüksək nisbəti yarandı.Buna görə də, biz istisna edə bilmərik ki, bu xəritəsiz oxunuşların bəziləri hələ də öz mənşəyinə malik ola bilər, ilk növbədə bu midye növü üçün istinad genomumuz yoxdur.Biz həm də bu boru kəmərindən istifadə etdik, çünki biz öz-özünə oxunan və öz-özünə olmayan oxunuşlar və Illumina MiSeq PE75 tərəfindən yaradılan oxunma uzunluqları arasındakı kimeralardan narahat idik.Kəşf edilməmiş oxunuşların əksəriyyətinin başqa bir səbəbi dəniz mikroblarının çoxunun, xüsusən Kerguelen kimi ucqar ərazilərdə şərh edilməməsidir.İnsan ccfDNA-sına oxşar ccfDNA fraqmentinin uzunluğunu fərz edərək, Illumina MiSeq PE75 istifadə etdik.Gələcək tədqiqatlar üçün, hemolimf ccfDNA-nın insanlardan və/və ya məməlilərdən daha uzun oxunduğunu göstərən nəticələrimizi nəzərə alaraq, daha uzun ccfDNA fraqmentləri üçün daha uyğun bir sıralama platformasından istifadə etməyi tövsiyə edirik.Bu təcrübə daha dərin təhlil üçün daha çox əlaməti müəyyən etməyi xeyli asanlaşdıracaq.Hal-hazırda mövcud olmayan tam A. atra nüvə genomu ardıcıllığının əldə edilməsi həm də ccfDNA-nın öz və özünə aid olmayan mənbələrdən ayrı-seçkiliyini xeyli asanlaşdırar.Tədqiqatımızın əsas diqqəti maye biopsiyası konsepsiyasının midyelərə tətbiqi imkanlarına yönəltdiyini nəzərə alaraq, ümid edirik ki, bu konsepsiya gələcək tədqiqatlarda istifadə olunduğu üçün midyelərin mikrob müxtəlifliyini öyrənmək üçün bu metodun potensialını artırmaq üçün yeni alətlər və boru kəmərləri hazırlanacaqdır.dəniz ekosistemi.
Qeyri-invaziv klinik biomarker kimi insan plazmasında ccfDNA-nın yüksək səviyyələri müxtəlif xəstəliklər, toxuma zədələnməsi və stress şəraiti ilə əlaqələndirilir [67,68,69].Bu artım toxuma zədələndikdən sonra öz mənşəli DNT fraqmentlərinin sərbəst buraxılması ilə əlaqələndirilir.Midiyaların 30 °C temperaturda qısa müddətə məruz qaldığı kəskin istilik stresindən istifadə edərək bu məsələni həll etdik.Biz bu analizi üç müstəqil təcrübədə üç müxtəlif növ midye üzərində apardıq.Bununla belə, kəskin istilik stressindən sonra ccfDNA səviyyələrində heç bir dəyişiklik tapmadıq (bax Şəkil S5, əlavə məlumat).Bu kəşf qismən də olsa, midyelərin yarı açıq qan dövranı sisteminə malik olmasını və yüksək filtrasiya aktivliyinə görə çoxlu miqdarda yad DNT toplamasını izah edə bilər.Digər tərəfdən, midye, bir çox onurğasızlar kimi, stressin səbəb olduğu toxuma zədələnməsinə daha davamlı ola bilər və bununla da hemolimflərində ccfDNA-nın sərbəst buraxılmasını məhdudlaşdıra bilər [70, 71].
Bu günə qədər su ekosistemlərində biomüxtəlifliyin DNT təhlili əsasən ətraf mühitin DNT (eDNT) metabarkodlanmasına yönəlmişdir.Bununla belə, primerlərdən istifadə edildikdə bu üsul adətən biomüxtəlifliyin təhlilində məhduddur.Ov tüfənginin ardıcıllığının istifadəsi PCR-nin məhdudiyyətlərini və primer dəstlərinin qərəzli seçimindən yayınır.Beləliklə, bizim metodumuz müəyyən mənada, parçalanmış DNT-ni birbaşa ardıcıllıqla sıralamağa və demək olar ki, bütün orqanizmləri təhlil etməyə qadir olan son zamanlar istifadə olunan yüksək məhsuldarlıqlı eDNA Shotgun sekvensləşdirmə metoduna daha yaxındır [72, 73].Bununla belə, LB-ni standart eDNA metodlarından fərqləndirən bir sıra fundamental məsələlər var.Əlbəttə ki, eDNA və LB arasındakı əsas fərq təbii filtr sahiblərinin istifadəsidir.eDNT-nin öyrənilməsi üçün təbii filtr kimi süngər və ikiqapaqlı (Dresseina spp.) kimi dəniz növlərinin istifadəsi bildirilmişdir [74, 75].Bununla belə, Dreissena-nın tədqiqatında DNT-nin çıxarıldığı toxuma biopsiyalarından istifadə edilmişdir.LB-dən ccfDNA-nın təhlili toxuma biopsiyası, eDNA və ya toxuma biopsiyası ilə əlaqəli ixtisaslaşmış və bəzən bahalı avadanlıq və logistika tələb etmir.Əslində, biz bu yaxınlarda məlumat vermişdik ki, LB-dən ccfDNA soyuq zəncir saxlamadan FTA dəstəyi ilə saxlanıla və təhlil edilə bilər ki, bu da uzaq ərazilərdə tədqiqatlar üçün böyük problemdir [76].Maye biopsiyalarından ccfDNA-nın çıxarılması da sadədir və ov tüfənginin ardıcıllığı və PCR analizi üçün yüksək keyfiyyətli DNT təmin edir.Bu, eDNA analizi ilə bağlı bəzi texniki məhdudiyyətlər nəzərə alınmaqla böyük üstünlükdür [77].Nümunə götürmə metodunun sadəliyi və aşağı qiyməti də uzunmüddətli monitorinq proqramları üçün xüsusilə uyğundur.Yüksək filtrasiya qabiliyyətinə əlavə olaraq, ikiqapaqlıların digər tanınmış xüsusiyyəti, virusların udulmasına kömək edən selikli mukopolisaxaridlərin kimyəvi tərkibidir [78, 79].Bu, ikiqapaqlıları müəyyən su ekosistemində biomüxtəlifliyi və iqlim dəyişikliyinin təsirini xarakterizə etmək üçün ideal təbii filtrə çevirir.Ev sahibi tərəfindən alınmış DNT fraqmentlərinin mövcudluğu eDNA ilə müqayisədə metodun məhdudiyyəti kimi qəbul edilsə də, eDNA ilə müqayisədə belə bir yerli ccfDNA-ya malik olmanın dəyəri sağlamlıq tədqiqatları üçün mövcud olan çoxlu məlumat üçün eyni zamanda başa düşüləndir.ofset host.Buraya ev sahibinin genomuna inteqrasiya olunmuş viral ardıcıllığın mövcudluğu daxildir.İkiqapaqlılarda üfüqi yolla ötürülən leykemik retrovirusların mövcudluğunu nəzərə alaraq bu, midye üçün xüsusilə vacibdir [80, 81].LB-nin eDNA-dan daha bir üstünlüyü mikroorqanizmləri (və onların genomlarını) əhatə edən hemolimfada dövran edən qan hüceyrələrinin faqositik aktivliyindən istifadə etməsidir.Faqositoz iki qapaqlı qan hüceyrələrinin əsas funksiyasıdır [82].Nəhayət, metod midyelərin yüksək filtrasiya qabiliyyətindən (orta hesabla 1,5 l/saat dəniz suyu) və iki günlük dövriyyədən istifadə edir ki, bu da dəniz suyunun müxtəlif təbəqələrinin qarışmasını artırır, heteroloji eDNT-nin tutulmasına imkan verir.[83, 84].Beləliklə, midye ccfDNA analizi midyelərin qidalanma, iqtisadi və ətraf mühitə təsirləri nəzərə alınmaqla maraqlı bir yoldur.İnsanlardan toplanmış LB-nin təhlili kimi, bu üsul da ekzogen maddələrə cavab olaraq ev sahibi DNT-də genetik və epigenetik dəyişikliklərin ölçülməsi imkanını açır.Məsələn, nanopore sequencing istifadə edərək yerli ccfDNA-da genom-geniş metilasiya analizini həyata keçirmək üçün üçüncü nəsil sekvensiya texnologiyaları nəzərdə tutula bilər.Bu proses, midye ccfDNA fraqmentlərinin uzunluğunun kimyəvi çevrilmələrə ehtiyac olmadan bir sıralamadan genom boyu DNT metilasiya analizinə imkan verən uzun müddət oxunan sekvensiya platformaları ilə ideal şəkildə uyğunlaşması ilə asanlaşdırılmalıdır.85,86] Bu, maraqlı bir imkandır, çünki DNT-nin hər bir stressə cavab verdiyini və ətraf mühitin çoxlu nəsillərə cavab verdiyini göstərmişdir.Buna görə də, o, iqlim dəyişikliyinə və ya çirkləndiricilərə məruz qaldıqdan sonra reaksiyanı tənzimləyən əsas mexanizmlər haqqında dəyərli fikir verə bilər [87].Bununla belə, LB-nin istifadəsi məhdudiyyətsiz deyil.Söz yox ki, bunun üçün ekosistemdə indikator növlərinin olması lazımdır.Yuxarıda qeyd edildiyi kimi, verilmiş ekosistemin biomüxtəlifliyini qiymətləndirmək üçün LB-dən istifadə də mənbədən DNT fraqmentlərinin mövcudluğunu nəzərə alan ciddi bioinformatika boru xəttini tələb edir.Digər əsas problem dəniz növləri üçün istinad genomlarının mövcudluğudur.Dəniz məməlilərinin genomları layihəsi və bu yaxınlarda yaradılmış Fish10k layihəsi [88] kimi təşəbbüslərin gələcəkdə bu cür təhlili asanlaşdıracağına ümid edilir.LB konsepsiyasının dəniz süzgəcləri ilə qidalanan orqanizmlərə tətbiqi, eyni zamanda, sekvensiya texnologiyasındakı ən son nailiyyətlərə uyğundur və bu, ətraf mühitin stresinə cavab olaraq dəniz yaşayış yerlərinin sağlamlığı haqqında mühüm məlumatları təmin etmək üçün çox ohmlu biomarkerlərin inkişafı üçün çox uyğundur.
Genom ardıcıllığı məlumatları NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 Bioprojects SRR8924808 altında saxlanılıb.
Brierley AS, Kingsford MJ İqlim dəyişikliyinin dəniz həyatı və ekosistemlərə təsiri.Cole Biologiya.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S və s.İqlim dəyişikliyinin və digər yerli stres amillərinin dəniz mühitinə birgə təsirlərini nəzərdən keçirin.ümumi elmi mühit.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P və s.).Martın birinci elmi.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Təkrarlanan istilik stresi şəraitində aşağı istilik dözümlülüyü mavi midyelərin yüksək yay ölümünü izah edir.Elmi hesabat 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER və s.Heyvan ölümlərinin tezliyində, səbəblərində və dərəcəsində son dəyişikliklər.Proc Natl Acad Sci ABŞ.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Bir çox qeyri-spesifik patogenlər Pinna nobilis-in kütləvi ölümünə səbəb ola bilər.Həyat.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.İqlim dəyişikliyinin Arktika zoonoz xəstəliklərinə potensial təsiri.Int J Circumpolar sağlamlıq.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Mavi midye (Mytilus edulis spp.) Sahil çirklənməsinin monitorinqində siqnal orqanizmləri kimi: icmal.Mart Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Xərçəng müalicəsində maye biopsiyanın inteqrasiyası.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Maye biopsiyanın yetişməsi: şiş DNT-nin dövranını təmin edir.Nat Rev Xərçəng.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. İnsan plazmasında nuklein turşuları.Soc Biol törəmə şirkətlərinin iclas protokolları.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Xərçəngin müalicəsi üçün molekulyar marker kimi hüceyrəsiz DNT üçün yeni rol.Biomolyar analizin kəmiyyəti.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Maye biopsiyası klinikaya daxil olur – həyata keçirmə problemləri və gələcək problemlər.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW və s.Dölün DNT-si ananın plazmasında və serumunda mövcuddur.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Hamiləlik zamanı qadınların qanında dövran edən hüceyrədənkənar RNT istifadə edərək hamiləliyin gedişatının və onun ağırlaşmalarının öyrənilməsi.Dopediatriya.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Maye biopsiyası: donor hüceyrəsiz DNT böyrək greftində allogenik lezyonları aşkar etmək üçün istifadə olunur.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Prenatal diaqnostikada yeniliklər: ana plazma genomunun ardıcıllığı.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Yoluxmuş bədən mayelərinin növbəti nəsil metagenomik ardıcıllığı ilə sürətli patogen aşkarlanması.Nat Tibb.2021;27:115-24.