Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik. Siz məhdud CSS dəstəyi ilə brauzer versiyasından istifadə edirsiniz. Ən yaxşı təcrübə üçün sizə yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyi tövsiyə edirik (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq rejimini söndürün). Bundan əlavə, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün biz saytı üslub və JavaScript olmadan göstəririk.
Eyni anda üç slayddan ibarət karuseli göstərir. Eyni anda üç slayd arasında hərəkət etmək üçün Əvvəlki və Sonrakı düymələrindən istifadə edin və ya bir anda üç slayd arasında hərəkət etmək üçün sonundakı sürüşmə düymələrindən istifadə edin.
Məsaməli silisium hissəcikləri sol-gel üsulu ilə geniş məsaməli hissəciklər əldə etmək üçün bəzi modifikasiyalarla hazırlanmışdır. Bu hissəciklər N-fenilmaleimid interkalasiyalı poliamidləri istehsal etmək üçün tərs zəncir ötürülməsi-parçalanma (RAFT) polimerləşməsi vasitəsilə N-fenilmaleimid-metilvinil izosiyanat (PMI) və stirol ilə törəmə edilmişdir. Stirol (PMP) stasionar faza. Dar çuxurlu paslanmayan polad sütunlar (100 × 1,8 mm daxili diametr) çamur qablaşdırması ilə doludur. PMP sütununun xromatoqrafik performansı beş peptiddən (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu amin turşusu enkefalinat) və triptik insan hidrolizi albomundan (Hidrolizin HA) ibarət sintetik peptidlərin qarışığını ayırmaq üçün qiymətləndirildi. Optimal elüsyon şəraitində peptidlərin qarışığı olan lövhələrin nəzəri sayı 280 000 plitə/kv.m-ə çatdı. Hazırlanmış sütunun ayırma performansını kommersiya Ascentis Express RP-Amide sütunu ilə müqayisə etdikdə, PMP sütununun ayırma səmərəliliyinin ayırma səmərəliliyi və həlli baxımından kommersiya sütunundan daha üstün olduğu müşahidə edildi.
Biofarmasevtika sənayesi son illərdə bazar payının əhəmiyyətli dərəcədə artması ilə genişlənən qlobal bazara çevrilmişdir. Biofarmasevtika sənayesinin partlayıcı böyüməsi ilə1,2,3 peptid və zülal analizinə böyük ehtiyac var. Hədəf peptidinə əlavə olaraq, peptid sintezi zamanı müxtəlif çirklər əmələ gəlir, buna görə də peptidin istənilən saflığını əldə etmək üçün xromatoqrafik təmizləmə tələb olunur. Bədən mayelərində, toxumalarında və hüceyrələrində zülalların təhlili və səciyyələndirilməsi bir nümunədə çoxlu sayda potensial aşkar edilə bilən növlərin olması səbəbindən olduqca çətin bir işdir. Kütləvi spektrometriya peptidlərin və zülalların ardıcıllığını təyin etmək üçün effektiv vasitə olsa da, belə nümunələr birbaşa kütlə spektrometrinə daxil edilərsə, ayırma qeyri-qənaətbəxş olacaqdır. Bu problemi MS analizindən əvvəl maye xromatoqrafiyası (LC) aparmaqla həll etmək olar ki, bu da müəyyən vaxtda kütlə spektrometrinə daxil olan analitlərin miqdarını azaldacaq4,5,6. Bundan əlavə, maye fazanın ayrılması zamanı analitlər dar bir bölgədə cəmləşə bilər və bununla da bu analitləri cəmləşdirir və MS aşkarlanmasının həssaslığını artırır. Maye xromatoqrafiyası (LC) son onillikdə əhəmiyyətli dərəcədə irəliləmiş və proteomik analiz üçün geniş istifadə olunan metoda çevrilmişdir7,8,9,10.
Əks fazalı maye xromatoqrafiyası (RP-LC) stasionar faza kimi oktadesillə dəyişdirilmiş silisium (ODS) istifadə edərək peptidlərin qarışıqlarını təmizləmək və ayırmaq üçün geniş istifadə olunur11,12,13. Bununla belə, mürəkkəb quruluşu və amfoter təbiətinə görə, 14,15 RP stasionar fazaları peptidlərin və zülalların qənaətbəxş bir şəkildə ayrılmasını təmin edə bilməz. Buna görə də, qütblü və qeyri-qütb fraqmentləri olan peptidlərin və zülalların təhlili bu analitləri16 qarşılıqlı əlaqədə saxlamaq və saxlamaq üçün xüsusi hazırlanmış stasionar fazaları tələb edir. Multimodal qarşılıqlı təsirlər təklif edən qarışıq xromatoqrafiya peptidləri, zülalları və digər mürəkkəb qarışıqları ayırmaq üçün RP-LC-yə alternativ ola bilər. Bir neçə qarışıq tipli stasionar fazalar hazırlanmış və bu stasionar fazalarla doldurulmuş sütunlar peptidləri və zülalları ayırmaq üçün istifadə edilmişdir17,18,19,20,21. Qütblü və qeyri-qütblü qrupların olması səbəbindən qarışıq rejimli stasionar fazalar (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polar intercalation/RPLC) peptidlərin və zülalların ayrılması üçün uyğundur22,23,24,25,26,27,28. , kovalent bağlı qütb qrupları ilə qütblərarası interkalasiyalı stasionar fazalar qütblü və qeyri-qütblü analitlər üçün yaxşı ayırma imkanları və unikal seçicilik nümayiş etdirir, çünki ayrılma analit və stasionar faza arasındakı qarşılıqlı təsirdən asılıdır Multimodal qarşılıqlı təsirlər 29,30,31,32. Bu yaxınlarda Zhang et al. 30 poliaminlərin behenil ilə bitən stasionar fazalarını və uğurla ayrılmış karbohidrogenləri, antidepresanları, flavonoidləri, nukleozidləri, estrogenləri və bəzi digər analitləri əldə etdi. Qütblərə yerləşdirilmiş stasionar material həm qütb, həm də qeyri-qütb qruplarına malikdir, buna görə də peptidləri və zülalları hidrofobik və hidrofilik hissələrə ayırmaq üçün istifadə edilə bilər. Qütb daxili sütunlar (məsələn, amid xətti ilə C18 sütunları) Ascentis Express RP-Amide sütunları ticarət adı altında mövcuddur, lakin bu sütunlar yalnız amin 33-ün təhlili üçün istifadə edilmişdir.
Cari tədqiqatda peptidlərin ayrılması və triptik HSA parçalanması üçün qütblü yerləşdirmə stasionar fazası (N-fenilmaleimid, embedding polistirol) hazırlanmış və qiymətləndirilmişdir. Stasionar mərhələni hazırlamaq üçün aşağıdakı strategiyadan istifadə edilmişdir. Məsaməli silisium hissəcikləri 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39 hazırlıq sxemlərində bəzi dəyişikliklər edilməklə, əvvəlki nəşrlərimizdə təsvir edilmiş prosedurlara uyğun olaraq hazırlanmışdır. Karbamid, polietilen qlikol (PEG), TMOS və sulu-sirkə turşusunun nisbətləri böyük pore hissəcikləri ilə silisium hissəcikləri əldə etmək üçün tənzimlənmişdir. İkincisi, yeni bir fenilmaleimid-metilvinil izosiyanat liqandı sintez edilmiş və onun törəmə silisium hissəciklərindən qütblə bağlı stasionar fazaların hazırlanması üçün istifadə edilmişdir. Alınan stasionar faza optimallaşdırılmış qablaşdırma sxeminə uyğun olaraq paslanmayan polad sütuna (daxili diametri 100 × 1,8 mm) qablaşdırıldı. Sütun içərisində vahid təbəqəni təmin etmək üçün sütunun qablaşdırılması mexaniki vibrasiya ilə kömək edir. Qablaşdırılmış sütun beş peptiddən (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkephalin peptide) ibarət peptidlərin qarışığının ayrılması üçün qiymətləndirilmişdir. və insan serum albuminin (HSA) triptik hidrolizatları. Peptid qarışığının və HSA triptik həzminin yaxşı həll və effektivliklə ayrıldığı müşahidə edilmişdir. PMP sütununun ayırma səmərəliliyi Ascentis Express RP-Amid sütununun effektivliyi ilə müqayisə edilmişdir. Müşahidə olundu ki, peptidlər və zülallar PMP sütununda yaxşı ayırdetmə qabiliyyətinə və yüksək ayırma effektivliyinə malikdir və PMP sütununun ayırma effektivliyi Ascentis Express RP-Amide sütunundan daha yüksəkdir.
PEG (polietilen qlikol), sidik cövhəri, sirkə turşusu, trimetoksiyortosilikat (TMOS), trimetilxlorosilan (TMCS), tripsin, insan serum albumini (HSA), ammonium xlorid, karbamid, heksametilmetakriloildisilazan (HMDS), methloride 4-hidroksi- TEMPO, benzoil peroksid (BPO), HPLC üçün asetonitril (ACN), metanol, 2-propanol və aseton. Sigma-Aldrich şirkəti (Sent-Luis, Missuri, ABŞ).
Karbamid (8 q), polietilen qlikol (8 q) və 8 ml 0,01 N. sirkə turşusunun qarışığı 10 dəqiqə qarışdırıldı və buzla soyutma altında ona 24 ml TMOS əlavə edildi. Reaksiya qarışığı paslanmayan poladdan hazırlanmış avtoklavda 6 saat ərzində 40°C-də, sonra isə 8 saat ərzində 120°C-də qızdırılıb. Su süzülür və qalıq 12 saat ərzində 70°C-də qurudulur. Qurudulmuş yumşaq bloklar hamar bir şəkildə üyüdülmüş və 12 saat ərzində 550 ° C-də sobada kalsine edilmişdir. Hissəcik ölçülərinin, məsamə ölçüsünün və səth sahəsinin təkrar istehsalını yoxlamaq üçün üç partiya hazırlanmış və xarakterizə edilmişdir.
Polistirol zəncirləri üçün polar qrup və stasionar faza. Hazırlıq proseduru aşağıda təsvir edilmişdir.
N-fenilmaleimid (200 mq) və metil vinil izosiyanat (100 mq) susuz toluolda həll edildi və sonra fenilmaleimidin (CPPM və metil) kopolimerini almaq üçün reaksiya qabına 0,1 ml 2,2′-azoizobutironitril (AIBN) əlavə edildi. ) Qarışıq 3 saat ərzində 60°C-də qızdırılıb, süzülüb və sobada 40°C-də 3 saat qurudulub.
Qurudulmuş silisium hissəcikləri (2 q) quru toluolda (100 ml) səpələnmiş, qarışdırılmış və 500 ml yuvarlaq dibli kolbada 10 dəqiqə sonikasiya edilmişdir. PMCP (10 mq) toluolda həll edildi və əlavə huni vasitəsilə reaksiya qabına damcı-damcı əlavə edildi. Qarışıq 8 saat ərzində 100 ° C-də geri soyulur, süzülür, aseton ilə yuyulur və 60 ° C-də 3 saat qurudulur. Sonra PMCP (100 q) ilə əlaqəli silisium hissəcikləri toluolda (200 ml) həll edildi və katalizator kimi 100 μl dibutiltin dilauratın iştirakı ilə 4-hidroksi-TEMPO (2 ml) əlavə edildi. Qarışıq 8 saat ərzində 50°C-də qarışdırılmış, süzülmüş və 3 saat ərzində 50°C-də qurumuşdur.
Stirol (1 ml), benzoil peroksid BPO (0,5 ml) və TEMPO-PMCP-yə (1,5 q) qoşulmuş silisium hissəcikləri toluolda səpələnmiş və azotla təmizlənmişdir. Stirolun polimerləşməsi 100°C-də 12 saat ərzində aparılmışdır. Nəticədə məhsul metanol ilə yuyulur və bir gecədə 60 ° C-də qurudulur. Reaksiyanın ümumi sxemi Şəkildə göstərilmişdir. bir .
Nümunələr 10-3 Torr-dan az qalıq təzyiq əldə olunana qədər 1 saat ərzində 393 K-də qazsızlaşdırıldı. Ümumi məsamə həcmini təyin etmək üçün P/P0 = 0,99 nisbi təzyiqdə adsorbsiya edilmiş N2 miqdarından istifadə edilmişdir. Təmiz və liqandla bağlanmış silisium hissəciklərinin morfologiyası skan edən elektron mikroskopdan (Hitachi High Technologies, Tokio, Yaponiya) istifadə edilərək tədqiq edilmişdir. Quru nümunələr (saf silisium və liqandla əlaqəli silisium hissəcikləri) karbon lentindən istifadə edərək alüminium çubuqlara yerləşdirildi. Qızıl Q150T püskürtmə cihazından istifadə edərək nümunənin üzərinə çökdürülmüş və nümunənin üzərinə 5 nm qalınlığında Au təbəqəsi qoyulmuşdur. Bu, aşağı gərginlikli prosesin səmərəliliyini artırır və incə soyuq püskürtmə təmin edir. Element analizi Thermo Electron (Waltham, MA, ABŞ) Flash EA1112 elementar tərkibi analizatorundan istifadə etməklə aparılmışdır. Hissəcik ölçüsünün paylanmasını əldə etmək üçün Malvern hissəcik ölçüsü analizatoru (Worcestershire, Böyük Britaniya) Mastersizer 2000 istifadə edilmişdir. Örtülməmiş silisium hissəcikləri və liqandla bağlanmış silisium hissəcikləri (hər biri 5 mq) 5 ml izopropanolda dispers edildi, 10 dəqiqə səslə, 5 dəqiqə qarışdırıldı və Mastersizer optik dəzgahına yerləşdirildi. Termogravimetrik analiz 30-dan 800 °C-ə qədər olan temperatur intervalında dəqiqədə 5 °C sürətlə aparılır.
Ölçüləri (ID 100 × 1.8 mm) olan şüşə lifli astarlı dar buruqlu paslanmayan polad sütunlar 31-ci istinadda göstərildiyi kimi eyni prosedura riayət etməklə məhlulla doldurulma üsulu ilə qablaşdırıldı. Paslanmayan polad sütun (şüşə astarlı, ID 100 × 1.8 mm) və 1 µm frit olan bir çıxış (ILA, texnoloji maşına qoşuldu) ABŞ). 150 mq stasionar fazanın 1,2 ml metanolda dayandırılması və bir rezervuar sütununa qidalanması ilə stasionar fazanın süspansiyonunu hazırlayın. Metanol məhlul həlledicisi və nəzarət həlledicisi kimi istifadə edilmişdir. 10 dəqiqə üçün 100 MP, 15 dəqiqə üçün 80 MP və 30 dəqiqə üçün 60 MP təzyiq ardıcıllığını tətbiq edərək sütunu qablaşdırın. Qablaşdırma prosesində sütunun vahid qablaşdırılmasını təmin etmək üçün mexaniki vibrasiya üçün iki qaz xromatoqrafiya sütun vibratorundan (Alltech, Deerfield, IL, ABŞ) istifadə edilmişdir. Şlamın qablaşdırıcısını bağlayın və ipin zədələnməsinin qarşısını almaq üçün təzyiqi yavaş-yavaş buraxın. Sütun məhlul ucluğundan ayrıldı və onun işini yoxlamaq üçün girişə başqa fitinq qoşuldu və LC sisteminə qoşuldu.
Xüsusi MLC LC nasosundan (10AD Shimadzu, Yaponiya), 50 nL enjeksiyon dövrəsi olan nümunə götürəndən (Valco (ABŞ) C14 W.05), membran deqazatorundan (Shimadzu DGU-14A) və UV-VIS kapilyar pəncərəsindən istifadə etməklə qurulmuşdur. Detektor cihazı (UV-2075) və minalanmış mikrokolon. Əlavə sütun genişlənməsinin təsirini minimuma endirmək üçün çox dar və qısa birləşdirici borulardan istifadə edin. Sütunu doldurduqdan sonra 1/16″ reduktor qovşağının çıxışına bir kapilyar (50 µm id 365) quraşdırın və azaldıcı qovşağın kapilyarını (50 µm) quraşdırın. Məlumatların toplanması və xromatoqrammanın işlənməsi Multichro 2000 proqram təminatından istifadə etməklə həyata keçirilir. 254 nm-də, subyektlərin analitlərinin UV absorbsiyasına 0-da nəzarət edildi. Xromatoqrafik məlumatlar OriginPro8 (Northampton, MA) istifadə edərək təhlil edildi.
İnsan serum albumini, liyofilləşdirilmiş toz, ≥ 96% (agaroz gel elektroforezi) 3 mq tripsin (1,5 mq), 4,0 M karbamid (1 ml) və 0,2 M ammonium bikarbonat (1 ml) ilə qarışdırılır. Məhlul 10 dəqiqə qarışdırıldı və 37°C-də 6 saat su banyosunda saxlanıldı, sonra 1 ml 0,1% TFA ilə söndürüldü. Məhlulu süzün və 4°C-dən aşağı temperaturda saxlayın.
PMP sütununda peptidlərin və triptik həzm HSA qarışığının ayrılması ayrıca qiymətləndirilmişdir. PMP sütunu ilə ayrılmış peptidlərin və HSA qarışığının triptik hidrolizini yoxlayın və nəticələri Ascentis Express RP-Amid sütunu ilə müqayisə edin. Nəzəri lövhələrin sayı aşağıdakı tənlikdən istifadə edərək hesablanır:
Təmiz silisium hissəciklərinin və liqandla əlaqəli silisium hissəciklərinin SEM şəkilləri Şəkil 2-də göstərilmişdir. Saf silisium hissəciklərinin (A, B) SEM şəkilləri əvvəlki tədqiqatlarımızla müqayisədə hissəciklərin uzandığı və ya qeyri-müntəzəm simmetriyaya malik olduğu sferik formanı göstərir. Liqand (C, D) ilə bağlanmış silisium hissəciklərinin səthi təmiz silisium hissəciklərindən daha hamardır, bu, silisium hissəciklərinin səthini örtən polistirol zəncirlərinə görə ola bilər.
Təmiz silisium hissəciklərinin (A, B) və liqandla əlaqəli silisium hissəciklərinin (C, D) elektron mikroqrafiklərinin skan edilməsi.
Təmiz silisium hissəciklərinin və liqandla bağlı silisium hissəciklərinin hissəcik ölçüsünə görə paylanması Şəkil 2. 3(A)-da göstərilmişdir. Həcmli hissəcik ölçüsünün paylanması əyriləri kimyəvi modifikasiyadan sonra silisium hissəciklərinin ölçüsünün artdığını göstərdi (Şəkil 3A). Cari tədqiqat və əvvəlki tədqiqatın silisium hissəciklərinin ölçüsünün paylanması məlumatları Cədvəl 1(A)-da müqayisə edilir. PMP-nin həcmli hissəcik ölçüsü d(0,5) əvvəlki tədqiqatımızda (polistirollə bağlanmış silisium hissəcikləri) 3,05 µm ad(0,5) dəyəri ilə müqayisədə 3,36 µm olmuşdur. Reaksiya qarışığında PEG, sidik cövhəri, TMOS və sirkə turşusunun nisbətinin dəyişməsi ilə əlaqədar olaraq, bu partiyanın hissəcik ölçüsü paylanması əvvəlki tədqiqatımızla müqayisədə daha dar olmuşdur. PMP fazasının hissəcik ölçüsü əvvəllər öyrəndiyimiz polistirolla əlaqəli silisium hissəcik fazasından bir qədər böyükdür. Bu o deməkdir ki, silisium hissəciklərinin stirol ilə səthi funksionallaşması silisium səthində yalnız polistirol təbəqəsi (0,97 µm) çökdürdü, PMP mərhələsində isə təbəqənin qalınlığı 1,38 µm idi.
Təmiz silisium hissəciklərinin və liqandla əlaqəli silisium hissəciklərinin hissəcik ölçüsü paylanması (A) və məsamə ölçüsü paylanması (B).
Bu işdə istifadə edilən silisium hissəciklərinin məsamə ölçüsü, məsamə həcmi və səth sahəsi Cədvəl 1 (B)-də göstərilmişdir. Təmiz silisium hissəciklərinin və liqandla bağlı silisium hissəciklərinin PSD profilləri Şek. 3(B). Nəticələr əvvəlki tədqiqatımızla müqayisə oluna bilər34. Saf və liqandla bağlanmış silisium hissəciklərinin məsamə ölçüləri müvafiq olaraq 310 Å və 241 Å idi, bu, kimyəvi modifikasiyadan sonra məsamələrin ölçüsünün Cədvəl 1 (B)-də göstərildiyi kimi 69 Å azaldığını və yerdəyişmə əyrisinin Şəkildə göstərildiyini göstərir. Silisium dioksid hissəciklərinin xüsusi səth sahəsi 1/2 q olan cari tədqiqatda əvvəlki tədqiqatımızla müqayisə edilə bilər (124 m2/q). Cədvəl 1(B)-də göstərildiyi kimi, kimyəvi modifikasiyadan sonra silisium hissəciklərinin səthinin sahəsi (m2/q) də 116 m2/q-dan 105 m2/q-a qədər azalmışdır.
Stasionar fazanın elementar təhlilinin nəticələri Cədvəldə təqdim olunur. 2. Cari stasionar fazanın karbon tərkibi 6,35% təşkil edir ki, bu da əvvəlki tədqiqatımızdan aşağıdır (polistirol ilə əlaqəli silisium hissəcikləri, müvafiq olaraq 7,93%35 və 10,21%) 42. Aşağıdakı cari stasionar fazanın karbon tərkibi, çünki bəzi qütb ligandları, məsələn, fenilmaleimid (metilmaleimid) MP və MP-dir. SP-nin hazırlanmasında stirolla yanaşı 4-hidroksi-TEMPO da istifadə edilmişdir. Hazırkı stasionar fazada azotun çəki faizi əvvəlki tədqiqatlarda 0,1735 və 0,85% ilə müqayisədə 2,21% təşkil edir42. Bu o deməkdir ki, cari stasionar faza fenilmaleimid hesabına azotun yüksək çəki faizinə malikdir. Eynilə, (4) və (5) məhsulların karbon tərkibi müvafiq olaraq 2,7% və 2,9%, son məhsulun (6) isə Cədvəl 2-də göstərildiyi kimi 6,35% karbon tərkibinə malikdir. Çəki itirilməsini yoxlamaq üçün PMP-nin stasionar mərhələsində termoqravimetrik analiz (TGA) istifadə edilmişdir və TGA əyrisi Şəkil 4-də çəki itkisini göstərir. 8,6%, bu da karbonun tərkibinə (6,35%) yaxşı uyğun gəlir, çünki liqandlarda təkcə C deyil, həm də N, O və H var.
Fenilmaleimid-metilvinil izosiyanat liqandı qütblü fenilmaleimid və vinilizosiyanat qruplarına görə silisium hissəciklərinin səthini dəyişdirmək üçün seçilmişdir. Vinil izosiyanat qrupları canlı radikal polimerləşmə yolu ilə stirol ilə daha çox reaksiya verə bilər. İkinci səbəb, analitlə orta dərəcədə qarşılıqlı təsirə malik olan və analit və stasionar faza arasında güclü elektrostatik qarşılıqlı təsirlərə malik olmayan bir qrup daxil etməkdir, çünki fenilmaleimid hissəsinin normal pH-da virtual yükü yoxdur. Stasionar fazanın polaritesi stirolun optimal miqdarı və sərbəst radikal polimerləşmənin reaksiya müddəti ilə idarə oluna bilər. Reaksiyanın son mərhələsi (sərbəst radikal polimerləşmə) stasionar fazanın polaritesini dəyişdirdiyi üçün çox vacibdir. Bu stasionar fazalarda karbon tərkibini yoxlamaq üçün elementar analiz aparılmışdır. Müşahidə edilmişdir ki, stirolun miqdarının və reaksiya vaxtının artırılması stasionar fazanın karbon tərkibini artırır və əksinə. Müxtəlif konsentrasiyalarda stirol ilə hazırlanan SP-lər müxtəlif karbon yüklərinə malikdir. Eynilə, bu stasionar fazalar paslanmayan polad sütunlara yerləşdirilib və onların xromatoqrafik xüsusiyyətləri (seçmə qabiliyyəti, ayırdetmə qabiliyyəti, N dəyəri və s.) yoxlanılıb. Bu təcrübələrə əsasən, idarə olunan polariteyi və analitin yaxşı saxlanmasını təmin etmək üçün PMP stasionar fazasının hazırlanması üçün optimallaşdırılmış tərkib seçilmişdir.
PMP sütunu həmçinin mobil fazanın tutumundan istifadə etməklə peptidlərin beş qarışığının (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkephalin) təhlili üçün qiymətləndirilmişdir. 80 µl/dəq axın sürətində 60/40 (h/v) ACN/su (0,1% TFA). Optimal elüsyon şəraitində (200.000 plitə/m), bir sütun üçün nəzəri lövhələrin (N) sayı (100 × 1.8 mm) 20.000 ± 100-dür. Üç PMP sütunu üçün N dəyərləri Cədvəl 3-də və xromatoqramlar Şəkil 5A-da göstərilmişdir. PMP sütununda yüksək axın sürətində (700 µl/dəq) sürətli analiz, bir dəqiqə ərzində çıxarılan beş peptid, hər sütun üçün əla N dəyəri 13,500 ± 330 (100 x 1,8 mm diametr), 135,000 lövhə/m ekvivalentdir (Şəkil 5B). Eyni ölçülü üç sütun (daxili diametri 100 x 1,8 mm) təkrar istehsal qabiliyyətini yoxlamaq üçün PMP stasionar fazasının üç müxtəlif partiyası ilə dolduruldu. Optimal elüsiya şəraitindən, N nəzəri lövhələrin sayından və saxlama müddətindən istifadə etməklə hər bir sütunda eyni sınaq qarışığını ayırmaqla analitlər hər sütun üçün qeydə alınmışdır. PMP sütunları üçün təkrar istehsal məlumatları Cədvəl 4-də göstərilmişdir. PMP sütununun təkrar istehsal qabiliyyəti Cədvəl 3-də göstərildiyi kimi çox aşağı %RSD dəyərləri ilə yaxşı əlaqələndirilir.
Peptid qarışıqlarının PMP sütununda (B) və Ascentis Express RP-Amid sütununda (A) ayrılması, mobil faza 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP sütun ölçüləri (100 x 1,8 mm id), analiz Birləşmələrin elüsyon sırası: 1 (Gly-Tyr), 2Tyr, 2-G (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) və 5 (leucic acid enkephalin).
PMP sütunu (daxili diametri 100 x 1,8 mm) HPLC ilə insan serum albuminin triptik hidrolizatının ayrılması üçün qiymətləndirilmişdir. Şəkil 6-dakı xromatoqram nümunələrin çox yaxşı həlli ilə yaxşı ayrıldığını göstərir. HSA məhlulları 100 μl/dəq axın sürəti, mobil faza 70/30 asetonitril/su və 0,1% TFA istifadə edərək təhlil edilmişdir. HSA-nın parçalanması xromatoqramda (Şəkil 6) göstərildiyi kimi 17 peptidə uyğun olaraq 17 zirvəyə bölündü. HSA hidrolizatından fərdi zirvələrin ayrılması səmərəliliyi hesablanmış və dəyərlər Cədvəl 5-də göstərilmişdir.
HSA triptik hidrolizatları PMP sütununda (daxili diametri 100 x 1,8 mm), axın sürəti (100 μl/dəq), mobil faza 60/40 asetonitril/su və 0,1% TFA-da ayrılmışdır.
burada L sütunun uzunluğu, η mobil fazanın özlülüyü, ΔP sütunun arxa təzyiqi, u isə mobil fazanın xətti sürətidir. PMP sütununun keçiriciliyi 2,5 × 10-14 m2, axın sürəti 25 µl/dəq, 60/40 v/v istifadə edilmişdir. ACN/su. PMP sütununun keçiriciliyi (ID 100 × 1.8 mm) bizim əvvəlki Ref.34 tədqiqatımıza bənzəyirdi. Səthi məsaməli hissəciklərlə doldurulmuş sütunun keçiriciliyi 1,7×10,6 µm, 5 µm hissəciklər üçün 2,5×10-14 m2 təşkil edir43. Buna görə də, PMP fazasının keçiriciliyi 5 mkm ölçüsündə nüvəli qabıq hissəciklərinin keçiriciliyinə bənzəyir.
burada Wx xloroformla doldurulmuş sütunun kütləsi, Wy metanolla doldurulmuş sütunun kütləsi, ρ isə həlledicinin sıxlığıdır. Metanol (ρ = 0,7866) və xloroformun (ρ = 1,484) sıxlığı. Silisium-C18 hissəcik sütununun (100 × 1,8 mm ID)34 və bizim əvvəllər tədqiq etdiyimiz C18-karbamid31 sütununun ümumi məsaməliliyi müvafiq olaraq 0,63 və 0,55 olmuşdur. Bu o deməkdir ki, karbamid liqandlarının olması stasionar fazanın keçiriciliyini azaldır. Digər tərəfdən, PMP sütununun ümumi gözenekliliyi (daxili diametri 100 × 1,8 mm) 0,60-dır. PMP sütunları C18 ilə əlaqəli silisium hissəcikləri ilə dolu sütunlara nisbətən daha az keçiricidir, çünki C18 tipli stasionar fazalarda C18 liqandları xətti zəncirlərdə silisium hissəciklərinə bağlanır, polistirol tipli stasionar fazalarda isə hissəciklərin ətrafında nisbətən qalın polimer əmələ gəlir. qat A. Tipik bir təcrübədə sütun məsaməliliyi aşağıdakı kimi hesablanır:
Əncirdə. 7A, B PMP sütunu (id 100 x 1,8 mm) və Ascentis Express RP-Amide sütunu (id 100 x 1,8 mm) üçün Van Deemter qrafiklərini göstərir, eyni elüsyon şəraitində, 60/40 ACN/H2O və 0,1% TFA 20 µl/dəq.-80 µl/dəq. Optimal axın sürətində (80 µl/dəq) minimum HETP dəyərləri PMP sütunu və Ascentis Express RP-Amide sütunu üçün müvafiq olaraq 2,6 µm və 3,9 µm olmuşdur. HETP dəyərləri göstərir ki, PMP sütununun (100 x 1,8 mm id) ayırma səmərəliliyi kommersiyada mövcud Ascentis Express RP-Amide sütunundan (100 x 1,8 mm id) çox yüksəkdir. Şəkil 7(A)-dakı van Deemter qrafiki göstərir ki, N dəyərindəki azalma əvvəlki tədqiqatımızla müqayisədə artan axınla əhəmiyyətli dərəcədə yüksək deyil. Ascentis Express RP-Amide sütunu ilə müqayisədə PMP sütununun (id 100 × 1,8 mm) daha yüksək ayırma səmərəliliyi təkmilləşdirilmiş hissəcik forması və ölçüsünə və cari işdə istifadə edilən mürəkkəb sütun qablaşdırma proseduruna əsaslanır34.
(A) 0,1% TFA ilə 60/40 ACN/H2O-da PMP sütununda (id 100 x 1,8 mm) əldə edilmiş Van Deemter qrafiki (HETP və mobil faza xətti sürəti). (B) 0,1% TFA ilə 60/40 ACN/H2O-da Ascentis Express RP-Amide sütununda (id 100 x 1,8 mm) əldə edilmiş Van Deemter qrafiki (HETP və mobil faza xətti sürəti).
Sintetik peptidlərin qarışığının və insan serum albuminin (HSA) triptik hidrolizatının yüksək performanslı maye xromatoqrafiyasında ayrılması üçün interkalasiya edilmiş polistirolun qütb stasionar fazası hazırlanmış və qiymətləndirilmişdir. Peptid qarışıqları üçün PMP sütunlarının xromatoqrafik performansı ayırma səmərəliliyi və həlli baxımından əladır. PMP sütunlarının təkmilləşdirilmiş ayırma səmərəliliyi silisium hissəciklərinin ölçüsü və məsamə ölçüsü, stasionar fazaların idarə olunan sintezi və mürəkkəb sütun qablaşdırma materialları kimi bir neçə səbəblə bağlıdır. Yüksək ayırma səmərəliliyinə əlavə olaraq, bu stasionar fazanın başqa bir üstünlüyü yüksək axın sürətlərində aşağı sütun arxa təzyiqidir. PMP sütunları yüksək dərəcədə təkrarlanır və peptidlərin qarışıqlarını və müxtəlif zülalların triptik həzmini təhlil etmək üçün istifadə edilə bilər. Biz bu sütunu maye xromatoqrafiyada təbii məhsullardan, dərman bitkilərinin ekstraktlarından və göbələklərdən bioaktiv birləşmələrin ayrılması üçün istifadə etmək niyyətindəyik. Gələcəkdə PMP sütunları da zülalların və monoklonal antikorların ayrılması üçün qiymətləndiriləcəkdir.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Ters fazalı xromatoqrafiya peptid ayırma sistemlərinin tədqiqi I hissə: Sütun xarakteristikası üçün protokolun hazırlanması. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Tədqiqat tərs fazalı xromatoqrafiya peptid ayırma sistemlərinin I hissəsi: Sütun xarakteristikası üçün protokolun hazırlanması.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., and Petersson, P. Peptid Separation Systems of Reverse-fase Xromatography, I Hisse: Column Characterization for Protokolun hazırlanması. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Ters fazalı xromatoqrafiya peptid ayırma sistemlərinin tədqiqi I hissə: Sütun xüsusiyyətləri üçün protokolun hazırlanması. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Ters fazalı xromatoqrafiya peptid ayırma sistemlərinin tədqiqi I hissə: Sütun xüsusiyyətləri üçün protokolun hazırlanması.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., and Petersson, P. Peptid Separation Systems of Reverse-fase Xromatography, I Hisse: Column Characterization for Protokolun hazırlanması.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. et al. Yoluxucu xəstəliklərin müalicəsi üçün təkmilləşdirilmiş aktiv peptidlərin yaradılması üsulları. Biotexnologiya. Nailiyyətlər 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintetik terapevtik peptidlər: Elm və bazar. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintetik terapevtik peptidlər: Elm və bazar.Vliege P, Lisowski V, Martinez J və Chreschatyski M. Sintetik terapevtik peptidlər: elm və bazar.Vliege P, Lisowski V, Martinez J və Khreschatsky M. Sintetik terapevtik peptidlər: elm və bazar. narkotik kəşfi. Bu gün 15 (1-2), 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Ətraflı proteomik maye xromatoqrafiyası. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Ətraflı proteomik maye xromatoqrafiyası.Bax F., Smith RD və Shen Yu. Təkmil proteomik maye xromatoqrafiyası. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Qabaqcıl protein tərkibi 液相色谱。Bax F., Smith RD və Shen Yu. Təkmil proteomik maye xromatoqrafiyası.J. Xromatoqrafiya. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Qabaqcıl maye xromatoqrafiyası-kütləvi spektrometriya geniş əsaslı metabolomikanı və proteomikanı birləşdirməyə qadirdir. anus. Çim. Akta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Əczaçılıq inkişafında UHPLC-nin rolu. Chesnut, SM & Salisbury, JJ Əczaçılıq inkişafında UHPLC-nin rolu.Chesnut, SM və Salisbury, JJ Əczaçılıq inkişafında UHPLC-nin rolu.Chesnut, SM və Salisbury, JJ Dərman inkişafında UHPLC-nin rolu. J. Sentyabr Elm. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Sürətli ayırmalar üçün ultra yüksək təzyiqli maye xromatoqrafiyasının əsas və praktiki aspektləri. Wu, N. & Clausen, AM Sürətli ayırmalar üçün ultra yüksək təzyiqli maye xromatoqrafiyasının əsas və praktiki aspektləri.Wu, N. və Clausen, AM Sürətli ayrılma üçün yüksək təzyiqli maye xromatoqrafiyasının əsas və praktiki aspektləri. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Sürətli ayrılma üçün ultra yüksək təzyiqli maye xromatoqrafiyasının əsas və praktiki aspektləri.Wu, N. və Clausen, AM Sürətli ayrılma üçün yüksək təzyiqli maye xromatoqrafiyasının əsas və praktiki aspektləri.J. Sentyabr Elm. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelicheff, P. Əczaçılıq inkişafında ultra-performanslı maye xromatoqrafiyasının istifadəsi. Wren, SA & Tchelicheff, P. Əczaçılıq inkişafında ultra-performanslı maye xromatoqrafiyasının istifadəsi.Ren, SA və Chelischeff, P. Əczaçılıq inkişafında ultra yüksək performanslı maye xromatoqrafiyasının istifadəsi. Wren, SA & Tchelicheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA və Tchelicheff, P.Ren, SA və Chelischeff, P. Dərman inkişafında ultra-performanslı maye xromatoqrafiyasının tətbiqi.J. Xromatoqrafiya. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Enterovirusun effektiv təmizlənməsi üçün yüksək daxili fazaya malik suda yağ emulsiyasından əldə edilən monolit makroməsaməli hidrogel 71. Kimyəvi. layihə. Jurnal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Proteomikada maye xromatoqrafiyanın rolu. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Proteomikada maye xromatoqrafiyanın rolu.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. və Wilkins, JA Proteomikada maye xromatoqrafiyanın rolu. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. və Wilkins, JA Proteomikada maye xromatoqrafiyanın rolu.J. Xromatoqrafiya. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Terapevtik peptidlərin və zülalların tərs fazalı maye xromatoqrafik ayrılmalarında yeni tendensiyalar: Nəzəriyyə və tətbiqlər. & Guillarme, D. Terapevtik peptidlərin və zülalların tərs fazalı maye xromatoqrafik ayrılmalarında yeni tendensiyalar: Nəzəriyyə və tətbiqlər. & Guillarme, D. Novыe tendensial in razdelenii terapevticheskix peptidov və belkov s pomoщyu jidkostnoy xromatography of obraschennoy fazoy: nəzəriyyə və qəbul. & Guillarme, D. Terapevtik peptidlərin və zülalların tərs fazalı maye xromatoqrafiyası ilə ayrılması üzrə yeni tendensiyalar: nəzəriyyə və tətbiqlər. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.və Guillarmé, D. Terapevtik peptidlərin və zülalların tərs fazalı maye xromatoqrafiyası ilə ayrılmasında yeni tendensiyalar: nəzəriyyə və tətbiqlər.J. Pharm. Biotibbi Elm. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Birinci və ikinci ayırma ölçülərində müxtəlif pH ilə RP-RP-HPLC sistemindən istifadə edərək peptidlərin iki ölçülü ayrılması. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Birinci və ikinci ayırma ölçülərində müxtəlif pH ilə RP-RP-HPLC sistemindən istifadə edərək peptidlərin iki ölçülü ayrılması.Gilar M., Olivova P., Dali AE və Gebler JK. Birinci və ikinci ayırma ölçülərində müxtəlif pH ilə RP-RP-HPLC sistemindən istifadə edərək peptidlərin iki ölçülü ayrılması.Gilar M., Olivova P., Dali AE və Gebler JK RP-RP-HPLC sistemindən istifadə edərək birinci və ikinci ayırma ölçülərində müxtəlif pH dəyərlərindən istifadə edərək peptidlərin iki ölçülü ayrılması. J. Sentyabr Elm. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. və başqaları. 2 µm-dən kiçik tam məsaməli və səthi məsaməli C18 hissəcikləri ilə dolu yüksək performanslı xromatoqrafiya sütunlarının kütlə ötürülməsi və kinetik xüsusiyyətlərinin tədqiqi. J. Sentyabr Elm. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Bitki bioaktiv peptidlərinin izolyasiyası, identifikasiyası və təsdiqində son tendensiyalar və analitik problemlər. anus. Məxluq anal. Kimyəvi. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Həyat səltənətinin proteomik mənzərəsi. Təbiət 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Preparativ maye xromatoqrafiyası ilə terapevtik peptidlərin sonrakı müalicəsi. Molekullar (Bazel, İsveçrə) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Qarışıq rejimli xromatoqrafiya və onun biopolimerlərə tətbiqi. Yang, Y. & Geng, X. Qarışıq rejimli xromatoqrafiya və onun biopolimerlərə tətbiqi.Yang, Yu. və Geng, X. Qarışıq rejimli xromatoqrafiya və onun biopolimerlərə tətbiqi. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Qarışıq rejimli xromatoqrafiya və onun biopolimerlərdə tətbiqi.Yang, Yu. və Gen, X. Qarışıq rejimli xromatoqrafiya və onun biopolimerlərə tətbiqi.J. Xromatoqrafiya. A 1218(49), 8813–8825 (2011).