Дзякуй за наведванне сайта Nature.com. Версія браўзера, якой вы карыстаецеся, мае абмежаваную падтрымку CSS. Для найлепшага карыстання рэкамендуем выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Тым часам, каб забяспечыць бесперапынную падтрымку, мы будзем адлюстроўваць сайт без стыляў і JavaScript.
Марфагенез кішачніка чалавека ўстанаўлівае крыпта-вілузорныя асаблівасці трохмернай эпітэліяльнай мікраархітэктуры і прасторавай арганізацыі. Гэтая ўнікальная структура неабходная для падтрымання гамеастазу кішачніка, абараняючы нішу ствалавых клетак у базальнай крыпце ад экзагенных мікробных антыгенаў і іх метабалітаў. Акрамя таго, кішачныя вілусы і слізь, якая вылучае слізь, прадстаўляюць функцыянальна дыферэнцыяваныя эпітэліяльныя клеткі з ахоўным бар'ерам на паверхні слізістай абалонкі кішачніка. Такім чынам, аднаўленне трохмерных эпітэліяльных структур мае вырашальнае значэнне для пабудовы мадэляў кішачніка in vitro. Варта адзначыць, што арганічны міметычны кішачнік на чыпе можа выклікаць спантанны трохмерны марфагенез кішачнага эпітэлія з палепшанымі фізіялагічнымі функцыямі і біямеханікай. Тут мы прапануем прайгравальны пратакол для надзейнай індукцыі кішачнага марфагенезу ў кішачніку на мікрафлюідным чыпе, а таксама на ўбудаваным гібрыдным чыпе Transwell. Мы апісваем падрабязныя метады вырабу прылад, культывавання клетак Caco-2 або арганоіднага эпітэлія кішачніка ў звычайных умовах, а таксама на мікрафлюіднай платформе, індукцыі трохмернага марфагенезу і характарыстыкі ўсталяванага трохмернага эпітэлія з выкарыстаннем розных метадаў візуалізацыі. Гэты пратакол дасягае рэгенерацыі функцыянальнай мікраархітэктуры кішачніка шляхам кантролю базалатэральнага патоку вадкасці на працягу 5 дзён. Наш метад марфагенезу in vitro выкарыстоўвае фізіялагічна значныя напружанні зруху і механічны рух і не патрабуе складанай клетачнай інжынерыі або маніпуляцый, што можа пераўзысці іншыя існуючыя метады. Мы мяркуем, што прапанаваны намі пратакол можа мець шырокія наступствы для біямедыцынскай даследчай супольнасці, прапаноўваючы метад рэгенерацыі трохмерных слаёў кішачнага эпітэлія in vitro для біямедыцынскіх, клінічных і фармацэўтычных прымяненняў.
Эксперыменты паказваюць, што клеткі кішачнага эпітэлія Caco-2, якія культывуюцца ў прыладах тыпу «кішка на чыпе»1,2,3,4,5 або двухслаёвых мікрафлюідных прыладах6,7, могуць падвяргацца спантаннаму трохмернаму марфагенезу in vitro без выразнага разумення асноўнага механізму. У нашым нядаўнім даследаванні мы выявілі, што выдаленне базалатэральна сакрэтаваных антаганістаў марфагенаў з прылад для культывавання неабходна і дастаткова для індукцыі трохмернага эпітэліяльнага марфагенезу in vitro, што было прадэманстравана з дапамогай Caco-2 і арганоідаў кішачніка, атрыманых ад пацыента. Эпітэліяльныя клеткі былі правераны. У гэтым даследаванні мы спецыяльна засяродзіліся на вытворчасці клетак і размеркаванні канцэнтрацыі магутнага антаганіста Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), у прыладах тыпу «кішачнік на чыпе» і мадыфікаваных мікрафлюідных прыладах, якія змяшчаюць устаўкі Transwell, якія называюцца «гібрыдны чып». Мы дэманструем, што даданне экзагенных антаганістаў Wnt (такіх як DKK-1, рэпрэсар Wnt 1, сакрэтаваны бялок frizzled-related 1 або Soggy-1) да кішачніка на чыпе інгібіруе марфагенез або парушае папярэдне структураваны трохмерны эпітэліяльны пласт, што сведчыць аб тым, што антаганістычны стрэс падчас культывавання адказвае за марфагенез кішачніка in vitro. Такім чынам, практычны падыход да дасягнення надзейнага марфагенезу на эпітэліяльным інтэрфейсе заключаецца ў выдаленні або мінімальным падтрыманні ўзроўняў антаганістаў Wnt у базалатэральным адсеку шляхам актыўнага прамывання (напрыклад, у платформах тыпу «кішачнік на чыпе» або «гібрыд на чыпе») або дыфузіі ў базалатэральных асяроддзях (напрыклад, з уставак Transwell у вялікія базалатэральныя рэзервуары ў свідравінах).
У гэтым пратаколе мы прапануем падрабязны метад вырабу мікрапрылад «кішка на чыпе» і гібрыдных чыпаў, якія можна ўставіць у Transwell (этапы 1-5) для культывавання клетак кішачнага эпітэлія на сітаватых мембранах на аснове полідыметылсілоксану (PDMS) (этапы 6A, 7A, 8, 9) або поліэфірных мембранах уставак Transwell (этапы 6B, 7B, 8, 9) і індукаванага 3D-марфагенезу in vitro (этап 10). Мы таксама вызначылі клеткавыя і малекулярныя асаблівасці, якія сведчаць аб тканінаспецыфічным гістагенезе і лінейна-залежнай клеткавай дыферэнцыяцыі, ужываючы некалькі метадаў візуалізацыі (этапы 11-24). Мы індукуем морфагенез з выкарыстаннем клетак кішачнага эпітэлія чалавека, такіх як Caco-2 або кішачныя арганоіды, у двух фарматах культывавання з тэхнічнымі дэталямі, уключаючы мадыфікацыю паверхні сітаватых мембран, стварэнне 2D-манаслаёў і біяхімічныя змены кішачніка і рэпрадукцыю біямеханічнага мікраасяроддзя in vitro. Каб індукаваць 3D-морфагенез з 2D-эпітэліяльных манаслаёў, мы выдалілі антаганісты морфагенаў у абедзвюх культываваных формах шляхам праточнай апрацоўкі. асяроддзе ў базалатэральны адсек культуры. Нарэшце, мы прадстаўляем прадстаўленне карыснасці рэгенеруючага трохмернага эпітэліяльнага пласта, які можа быць выкарыстаны для мадэлявання морфаген-залежнага росту эпітэлія, падоўжных сумесных культур гаспадара і мікрабіёма, інфекцыі патагенамі, запаленчых пашкоджанняў, дысфункцыі эпітэліяльнага бар'ера і тэрапіі на аснове прабіётыкаў. Прыклад уплываў.
Наш пратакол можа быць карысным для шырокага кола навукоўцаў у галіне фундаментальных (напрыклад, біялогія слізістай абалонкі кішачніка, біялогія ствалавых клетак і біялогія развіцця) і прыкладных даследаванняў (напрыклад, даклінічныя выпрабаванні лекаў, мадэляванне захворванняў, тканінная інжынерыя і гастраэнтэралогія) з шырокім уплывам. Дзякуючы ўзнаўляльнасці і надзейнасці нашага пратаколу для індукцыі 3D-марфагенезу кішачнага эпітэлія in vitro, мы мяркуем, што наша тэхнічная стратэгія можа быць распаўсюджана сярод аўдыторыі, якая вывучае дынаміку клеткавай сігналізацыі падчас развіцця, рэгенерацыі або гамеастазу кішачніка. Акрамя таго, наш пратакол карысны для даследавання інфекцыі пры розных інфекцыйных агентах, такіх як наравірус 8, каранавірус цяжкага вострага рэспіраторнага сіндрому 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 або халерны вібрыён. Карысныя таксама аўдыторыі паталогіі і патагенезу захворванняў. Выкарыстанне сістэмы мікрафізіялогіі кішачніка на чыпе можа дазволіць праводзіць падоўжнае сумеснае культываванне 10 і наступную ацэнку абароны гаспадара, імунных рэакцый і аднаўлення пашкоджанняў, звязаных з патагенамі, у страўнікава-кішачным тракце (ЖКТ) 11. Іншыя захворванні ЖКТ, звязаныя з сіндромам дзіравага кішачніка, целиакией, хваробай Крона, язвавым калітам, паухітам або сіндромам раздражнёнага кішачніка, можна мадэляваць, калі 3D-слаі кішачнага эпітэлія падрыхтаваны з выкарыстаннем 3D-слаёў кішачнага эпітэлія пацыента. Да гэтых захворванняў адносяцца атрафія ворсінак, скарачэнне крыпт, пашкоджанне слізістай абалонкі або парушэнне эпітэліяльнага бар'ера. Біяпсія або кішачныя арганоіды, атрыманыя са ствалавых клетак 12,13. Каб лепш мадэляваць больш высокую складанасць асяроддзя захворвання, чытачы могуць разгледзець магчымасць дадання тыпаў клетак, адпаведных захворванню, такіх як монануклеарныя клеткі перыферычнай крыві пацыента (PBMC), да мадэляў, якія змяшчаюць 3D-мікраархітэктуру ворсінак і крыпт кішачніка. тканінаспецыфічныя імунныя клеткі, 5.
Паколькі трохмерную эпітэліяльную мікраструктуру можна фіксаваць і візуалізаваць без працэсу сячэння, гледачы, якія працуюць над прасторавай транскрыптамікай і візуалізацыяй высокага або звышвысокага разрознення, могуць быць зацікаўлены ў нашым картаграфаванні прасторава-часавай дынамікі генаў і бялкоў на эпітэліяльных нішах. Цікавяцца тэхналогіямі. Рэакцыя на мікробныя або імунныя раздражняльнікі. Акрамя таго, падоўжныя перакрыжаваныя сувязі паміж гаспадаром і мікрабіёмам 10, 14, якія каардынуюць гамеастаз кішачніка, могуць быць устаноўлены ў трохмерным пласце слізістай абалонкі кішачніка шляхам сумеснага культывавання розных мікробных відаў, мікробных супольнасцей або фекальнай мікрабіёты, асабліва ў кішачніку на чыпе. на платформе. Гэты падыход асабліва прывабны для аўдыторыі, якая вывучае імуналогію слізістай абалонкі, гастраэнтэралогію, мікрабіём чалавека, культураміку і клінічную мікрабіялогію, імкнучыся культываваць раней некультываваны мікрабіёт кішачніка ў лабараторыі. Калі наш пратакол марфагенезу in vitro можа быць адаптаваны да маштабуемых фарматаў культуры, такіх як шматлункавыя ўстаўкі ў 24-, 96- або 384-лункавыя пласціны, якія бесперапынна папаўняюць базалатэральныя адсекі, пратакол таксама можа быць распаўсюджаны сярод тых, хто распрацоўвае фармацэўтычныя, біямедыцынскія або высокапрадукцыйныя платформы скрынінгу або валідацыі для харчовай прамысловасці. У якасці доказу прынцыпу мы нядаўна прадэманстравалі магчымасць стварэння мультыплекснай высокапрадукцыйнай сістэмы марфагенезу, маштабуемай да фармату 24-лункавага пласціны. Акрамя таго, былі камерцыялізаваны некалькі прадуктаў «орган на чыпе»16,17,18. Такім чынам, валідацыя нашага метаду марфагенезу in vitro можа быць паскорана і патэнцыйна прынята многімі даследчымі лабараторыямі, прамысловасцю або ўрадавымі і рэгулюючымі органамі для разумення клеткавага перапраграмавання марфагенезу кішачніка in vitro на транскрыптомным узроўні для тэставання лекаў або біятэрапеўтычных прэпаратаў. Паглынанне і Транспарт кандыдатаў у лекі ацэньвалі з выкарыстаннем 3D-сурагатных мадэляў кішачніка або з выкарыстаннем карыстальніцкіх або камерцыйных мадэляў органаў на чыпе для ацэнкі ўзнаўляльнасці працэсу марфагенезу кішачніка.
Для вывучэння марфагенезу кішачнага эпітэлія выкарыстоўвалася абмежаваная колькасць эксперыментальных мадэляў, адпаведных чалавеку, галоўным чынам з-за адсутнасці рэалізуемых пратаколаў для індукцыі 3D-марфагенезу in vitro. Фактычна, значная частка сучасных ведаў аб марфагенезе кішачніка заснавана на даследаваннях на жывёлах (напрыклад, на рыбках даніо-рэрыо20, мышэй21 або курэй22). Аднак яны з'яўляюцца працаёмкімі і дарагімі, могуць быць этычна сумніўнымі і, самае галоўнае, не дакладна вызначаюць працэсы развіцця чалавека. Гэтыя мадэлі таксама вельмі абмежаваныя ў сваёй здольнасці да тэставання шматбаковым маштабуемым спосабам. Такім чынам, наш пратакол для рэгенерацыі 3D-структур тканін in vitro пераўзыходзіць мадэлі на жывёлах in vivo, а таксама іншыя традыцыйныя статычныя 2D-мадэлі культур клетак. Як апісана раней, выкарыстанне 3D-эпітэліяльных структур дазволіла нам вывучыць прасторавую лакалізацыю дыферэнцыяваных клетак у восі крыпта-ворсінка ў адказ на розныя слізістыя або імунныя стымулы. 3D-эпітэліяльныя пласты могуць даць прастору для вывучэння таго, як мікробныя клеткі канкуруюць за фарміраванне прасторавых ніш і экалагічную эвалюцыю ў адказ на фактары гаспадара (напрыклад, унутраныя і вонкавыя пласты слізі, сакрэцыя IgA і антымікробныя пептыды). Акрамя таго, трохмерная эпітэліяльная марфалогія дазваляе нам зразумець, як мікрабіёта кішачніка структуруе свае супольнасці і сінергічна выпрацоўвае мікробныя метабаліты (напрыклад, кароткаланцуговыя тоўстыя кіслоты), якія фарміруюць клетачную арганізацыю і нішы ствалавых клетак у базальных крыптах. Гэтыя асаблівасці можна прадэманстраваць толькі пры стварэнні трохмерных эпітэліяльных слаёў in vitro.
Акрамя нашага метаду стварэння трохмерных эпітэліяльных структур кішачніка, існуе некалькі метадаў in vitro. Культура арганоідаў кішачніка — гэта сучасны метад тканіннай інжынерыі, заснаваны на культываванні ствалавых клетак кішачніка ў пэўных умовах морфагенаў23,24,25. Аднак выкарыстанне трохмерных мадэляў арганоідаў для аналізу транспарту або сумесных культур гаспадара і мікрабіёма часта з'яўляецца складаным, паколькі прасвет кішачніка заключаны ўнутры арганоіда, і таму ўвядзенне кампанентаў прасвету, такіх як мікробныя клеткі або экзагенныя антыгены, абмежавана. Доступ да прасветаў арганоідаў можна палепшыць з дапамогай мікраін'ектара26,27, але гэты метад з'яўляецца інвазівным і працаёмкім і патрабуе спецыялізаваных ведаў для выканання. Акрамя таго, традыцыйныя культуры арганоідаў, якія падтрымліваюцца ў гідрагелевых каркасах у статычных умовах, не дакладна адлюстроўваюць актыўную біямеханіку in vivo.
Іншыя падыходы, якія выкарыстоўваюцца некалькімі даследчымі групамі, выкарыстоўваюць папярэдне структураваныя 3D-гідрагелевыя каркасы для імітацыі структуры кішачнага эпітэлія шляхам культывавання ізаляваных клетак кішачніка чалавека на паверхні геля. Вырабляюць гідрагелевыя каркасы з выкарыстаннем 3D-друкаваных, мікрафрэзераваных або літаграфічна вырабленых формаў. Гэты метад паказвае самаарганізаванае размяшчэнне ізаляваных эпітэліяльных клетак in vitro з фізіялагічна адпаведнымі градыентамі морфагенаў, усталёўваючы эпітэліяльную структуру з высокім суадносінамі бакоў і перакрыжаваныя перашкоды паміж стромой і эпітэліяй шляхам уключэння стромальных клетак у каркас. Аднак прырода папярэдне структураваных каркасаў можа перашкаджаць адлюстраванню самога спантанага морфагенетычнага працэсу. Гэтыя мадэлі таксама не забяспечваюць дынамічнага прасветнага або міжтканкавага патоку, не маючы напружання зруху вадкасці, неабходнага кішачным клеткам для праходжання морфагенезу і атрымання фізіялагічнай функцыі. У іншым нядаўнім даследаванні выкарыстоўваліся гідрагелевыя каркасы ў мікрафлюіднай платформе і ўзорныя структуры кішачнага эпітэлія з выкарыстаннем метадаў лазернага травлення. Мышыныя арганоіды кішачніка прытрымліваюцца вытраўленых шаблонаў, каб утварыць кішачныя трубчастыя структуры, і ўнутрыпрасветны паток вадкасці можна праілюстраваць з дапамогай мікрафлюіднага модуля. Аднак гэтая мадэль не праяўляе спантаннасці. марфагенетычныя працэсы, а таксама не ўключаюць механабіялагічныя рухі кішачніка. Метады 3D-друку з той жа групы дазволілі стварыць мініяцюрныя кішачныя трубкі са спантаннымі марфагенетычнымі працэсамі. Нягледзячы на ​​складаную канструкцыю розных сегментаў кішачніка ўнутры трубкі, у гэтай мадэлі таксама адсутнічае паток вадкасці ў прасвете і механічная дэфармацыя. Акрамя таго, працаздольнасць мадэлі можа быць абмежаваная, асабліва пасля завяршэння працэсу біядруку, што парушае эксперыментальныя ўмовы або ўзаемадзеянне клетак з клеткамі. Замест гэтага прапанаваны намі пратакол забяспечвае спантанны марфагенез кішачніка, фізіялагічна значную напругу зруху, біямеханіку, якая імітуе рухомасць кішачніка, даступнасць незалежных апікальных і базалатэральных адсекаў і аднаўленне складаных біялагічных мікраасяроддзяў модульнасці. Такім чынам, наш пратакол 3D-марфагенезу in vitro можа забяспечыць дадатковы падыход да пераадолення праблем існуючых метадаў.
Наш пратакол цалкам сканцэнтраваны на трохмерным эпітэліяльным марфагенезе, прычым у культуры прысутнічаюць толькі эпітэліяльныя клеткі і адсутнічаюць іншыя тыпы навакольных клетак, такія як мезенхімальныя клеткі, эндатэліяльныя клеткі і імунныя клеткі. Як апісана раней, асновай нашага пратакола з'яўляецца індукцыя эпітэліяльнага марфагенезу шляхам выдалення інгібітараў марфагенаў, якія вылучаюцца на базалатэральным баку ўведзенага асяроддзя. Хоць надзейная модульнасць нашых тэхналогій «кішка на чыпе» і «гібрыд на чыпе» дазваляе нам узнавіць хвалісты трохмерны эпітэліяльны пласт, дадатковыя біялагічныя складанасці, такія як эпітэліяльна-мезенхімальныя ўзаемадзеянні33,34, адклад пазаклеткавага матрыкса (ECM)35 і, у нашай мадэлі, асаблівасці крыпта-ворсінкі, якія перадаюць нішы ствалавых клетак у базальных крыптах, застаюцца неразгледжанымі. Стромальныя клеткі (напрыклад, фібрабласты) у мезенхіме гуляюць ключавую ролю ў выпрацоўцы бялкоў ECM і рэгуляцыі кішачнага марфагенезу in vivo35,37,38. Даданне мезенхімальных клетак да нашай мадэлі палепшыла працэс марфагенезу і прымацаванне клетак. эфектыўнасць. Эндатэліяльны пласт (г.зн. капіляры або лімфатычныя вузлы) адыгрывае важную ролю ў рэгуляванні малекулярнага транспарту39 і прыцягненні імунных клетак40 у мікраасяроддзі кішачніка. Акрамя таго, кампаненты сасудзістай сістэмы, якія могуць быць звязаны паміж мадэлямі тканін, з'яўляюцца абавязковай умовай пры распрацоўцы мадэляў тканін для дэманстрацыі ўзаемадзеяння паміж органамі. Такім чынам, эндатэліяльныя клеткі могуць спатрэбіцца для мадэлявання больш дакладных фізіялагічных асаблівасцей з дазволам на ўзроўні органаў. Імунныя клеткі, атрыманыя ад пацыента, таксама неабходныя для дэманстрацыі прыроджаных імунных рэакцый, прэзентацыі антыгена, прыроджаных адаптыўных імунных перакрыжаваных перашкод і тканінаспецыфічнага імунітэту ў кантэксце імітацыі кішачных захворванняў.
Выкарыстанне гібрыдных чыпаў больш простае, чым кішачнік на чыпе, таму што налада прылады прасцейшая, а выкарыстанне ўставак Transwell дазваляе маштабаваць культуру кішачнага эпітэлія. Аднак камерцыйна даступныя ўстаўкі Transwell з поліэфірнымі мембранамі не з'яўляюцца эластычнымі і не могуць імітаваць перыстальтычныя рухі. Акрамя таго, апікальны адсек устаўкі Transwell, размешчанай у гібрыдным чыпе, заставаўся нерухомым без напружання зруху на апікальным баку. Відавочна, што статычныя ўласцівасці ў апікальным адсеку рэдка дазваляюць доўгатэрміновае сумеснае культываванне бактэрый у гібрыдных чыпах. Хоць мы можам надзейна выклікаць трохмерны марфагенез ва ўстаўках Transwell пры выкарыстанні гібрыдных чыпаў, недахоп фізіялагічна адпаведнай біямеханікі і апікальнага патоку вадкасці можа абмежаваць магчымасць выкарыстання гібрыдных чып-платформаў для патэнцыйных ужыванняў.
Поўнамаштабныя рэканструкцыі восі крыпта-ворсінка чалавека ў культурах кішачніка на чыпе і гібрыда на чыпе яшчэ не цалкам устаноўлены. Паколькі марфагенез пачынаецца з эпітэліяльнага монаслоя, трохмерныя мікраархітэктуры не абавязкова забяспечваюць марфалагічнае падабенства з крыптамі in vivo. Нягледзячы на ​​тое, што мы ахарактарызавалі папуляцыю праліферуючых клетак паблізу базальнага дамена крыпты ў мікраінжынерным трохмерным эпітэліі, вобласці крыпты і ворсінкі не былі выразна размежаваны. Нягледзячы на ​​тое, што больш высокія верхнія каналы на чыпе прыводзяць да павелічэння вышыні мікраінжынернага эпітэлія, максімальная вышыня ўсё яшчэ абмежаваная ~300–400 мкм. Фактычная глыбіня кішачных крыпт чалавека ў тонкім і тоўстым кішачніку складае ~135 мкм і ~400 мкм адпаведна, а вышыня ворсінак тонкага кішачніка складае ~600 мкм41.
З пункту гледжання візуалізацыі, in situ звышвыразрозная візуалізацыя трохмерных мікраархітэктур можа быць абмежаваная кішачнікам на чыпе, паколькі неабходная працоўная адлегласць ад аб'ектыва да эпітэліяльнага пласта складае каля некалькіх міліметраў. Каб пераадолець гэтую праблему, можа спатрэбіцца аддалены аб'ектыў. Акрамя таго, стварэнне тонкіх зрэзаў для падрыхтоўкі ўзораў для візуалізацыі з'яўляецца складанай задачай з-за высокай эластычнасці PDMS. Больш за тое, паколькі папластовая мікрафабрыкацыя кішачніка на чыпе прадугледжвае пастаяннае счапленне паміж кожным пластом, надзвычай складана адкрыць або выдаліць верхні пласт для вывучэння павярхоўнай структуры эпітэліяльнага пласта. Напрыклад, з дапамогай сканіруючага электроннага мікраскопа (SEM).
Гідрафобнасць PDMS з'яўляецца абмежавальным фактарам у мікрафлюідных даследаваннях, прысвечаных гідрафобным малым малекулам, паколькі PDMS можа неспецыфічна адсарбаваць такія гідрафобныя малекулы. Альтэрнатывы PDMS могуць быць разгледжаны з выкарыстаннем іншых палімерных матэрыялаў. Акрамя таго, для мінімізацыі адсорбцыі гідрафобных малекул можна разгледзець мадыфікацыю паверхні PDMS (напрыклад, пакрыццё ліпафільнымі матэрыяламі 42 або поліэтыленгліколем 43).
Нарэшце, наш метад не быў добра ахарактарызаваны з пункту гледжання забеспячэння высокапрадукцыйнага скрынінга або універсальнай эксперыментальнай платформы, зручнай для ўсіх карыстальнікаў. Дзеючы пратакол патрабуе шпрыцавага помпы на кожную мікрапрыладу, што займае месца ў CO2-інкубатары і перашкаджае правядзенню маштабных эксперыментаў. Гэта абмежаванне можа быць значна палепшана дзякуючы маштабаванасці інавацыйных фарматаў культур (напрыклад, 24-лункавыя, 96-лункавыя або 384-лункавыя порыстыя ўстаўкі, якія дазваляюць бесперапынна папаўняць і выдаляць базалатэральныя асяроддзя).
Каб выклікаць трохмерны марфагенез кішачнага эпітэлія чалавека in vitro, мы выкарысталі мікрафлюідную прыладу для кішачніка, якая змяшчае два паралельныя мікраканалы і эластычную сітаватую мембрану паміж імі для стварэння інтэрфейсу прасвет-капіляр. Мы таксама дэманструем выкарыстанне аднаканальнай мікрафлюіднай прылады (гібрыднага чыпа), якая забяспечвае бесперапынны базалатэральны паток пад палярызаванымі эпітэліяльнымі пластамі, вырашчанымі на ўстаўках Transwell. На абедзвюх платформах марфагенез розных клетак кішачнага эпітэлія чалавека можна прадэманстраваць, ужываючы накіраваную маніпуляцыю патокам для выдалення антаганістаў марфагенаў з базалатэральнага адсека. Уся эксперыментальная працэдура (Малюнак 1) складаецца з пяці частак: (i) мікравыраб кішачнага чыпа або ўстаўляемага гібрыднага чыпа Transwell (этапы 1-5; Рамка 1), (ii) падрыхтоўка клетак кішачнага эпітэлія (клеткі Caco-2) або арганоідаў кішачніка чалавека; рамкі 2-5), (iii) культываванне клетак кішачнага эпітэлія на кішачных чыпах або гібрыдных чыпах (этапы 6-9), (iv) індукцыя трохмернага марфагенезу in vitro (этап 10) і (v)) для характарыстыкі трохмернай эпітэліяльнай мікраструктуры (этапы 11-24). Нарэшце, была распрацавана адпаведная кантрольная група (абмеркаваная ніжэй) для праверкі эфектыўнасці марфагенезу in vitro шляхам параўнання эпітэліяльнага марфагенезу з прасторавым, часавым, умоўным або працэдурным кантролем.
Мы выкарыстоўвалі дзве розныя платформы для культывавання: кішачнік на чыпе з прамымі каналамі або нелінейнымі згорнутымі каналамі, або гібрыдныя чыпы, якія змяшчаюць устаўкі Transwell (TW) у мікрафлюіднай прыладзе, вырабленай, як апісана ў рамцы 1, і крок 1-5. «Выраб прылады» паказвае асноўныя этапы стварэння аднаго чыпа або гібрыднага чыпа. «Культываванне клетак кішачнага эпітэлія чалавека» тлумачыць крыніцу клетак (Caco-2 або арганоіды кішачніка чалавека) і працэдуру культывавання, якая выкарыстоўваецца ў гэтым пратаколе. «Марфагенез in vitro» паказвае агульныя этапы, на якіх эпітэліяльныя клеткі, атрыманыя з Caco-2 або арганоідаў, культывуюцца на кішачным чыпе або на ўстаўках Transwell гібрыднага чыпа, а затым індукуюць 3D-марфагенез і фарміруюць характарызаваную эпітэліяльную структуру. Нумар кроку праграмы або нумар поля адлюстроўваецца пад кожнай стрэлкай. Прыкладанне дае прыклады таго, як можна выкарыстоўваць устаноўленыя пласты кішачнага эпітэлія, напрыклад, для характарыстыкі дыферэнцыяцыі клетак, даследаванняў фізіялогіі кішачніка, стварэння экасістэм гаспадар-мікрабіём і мадэлявання захворванняў. Імунафлуарэсцэнтныя выявы ў «Дыферэнцыяцыі клетак». паказаны ядры, F-акцін і MUC2, экспрэсаваныя ў 3D Caco-2 эпітэліяльным пласце, створаным на чыпе кішачніка. Сігналізацыя MUC2 прысутнічае ў келіхападобных клетках і слізі, якая вылучаецца з паверхняў слізістай абалонкі. Флуарэсцэнтныя выявы ў Gut Physiology паказваюць слізь, атрыманую шляхам афарбоўвання на рэшткі сіялавай кіслаты і N-ацэтылглюказаміна з выкарыстаннем флуарэсцэнтнага аглютыніну зародкаў пшаніцы. Два перакрываючыяся выявы ў «Сумесных культурах гаспадара-мікроба» паказваюць рэпрэзентатыўныя сумесныя культуры гаспадара-мікрабіёма ў кішачніку на чыпе. Левая панэль паказвае сумесную культуру E. coli, якая экспрэсуе зялёны флуарэсцэнтны бялок (GFP), з мікраінжынернымі 3D Caco-2 эпітэліяльнымі клеткамі. Правая панэль паказвае лакалізацыю GFP E. coli, сумесна культываванай з 3D Caco-2 эпітэліяльнымі клеткамі, а затым імунафлуарэсцэнтнае афарбоўванне F-акцінам (чырвоны) і ядрамі (сіні). Мадэляванне захворванняў ілюструе здаровы супраць дзіравога кішачніка ў чыпах запалення кішачніка пры фізіялагічным уздзеянні бактэрыяльных антыгенаў (напрыклад, ліпапаліцукрыду, ЛПС) і імунных клетак (напрыклад, PBMC; зялёны). Клеткі Caco-2 культывавалі для стварэння трохмернага эпітэліяльнага пласта. Маштабная лінейка, 50 мкм. Выявы ў ніжнім радзе: «Дыферэнцыяцыя клетак», адаптаваная з дазволу спасылкі.2. Oxford University Press; Узнаўлена з дазволу спасылкі.5. NAS; «Сумесная культура гаспадара і мікроба», адаптаваная з дазволу спасылкі.3. NAS; «Мадэляванне захворванняў», адаптавана з дазволу спасылкі.5. NAS.
Як чыпы тыпу «кішка на чыпе», так і гібрыдныя чыпы былі выраблены з выкарыстаннем PDMS-рэплік, якія былі выняты з крэмніевых формаў з дапамогай мяккай літаграфіі1,44 і сфармаваны з дапамогай SU-8. Канструкцыя мікраканалаў у кожным чыпе вызначаецца з улікам гідрадынамікі, такіх як напружанне зруху і гідрадынамічны ціск1,4,12. Першапачатковая канструкцыя тыпу «кішка на чыпе» (пашыраныя дадзеныя, мал. 1a), якая складалася з двух размешчаных побач паралельных прамых мікраканалаў, ператварылася ў складаную канструкцыю тыпу «кішка на чыпе» (пашыраныя дадзеныя, мал. 1b), якая ўключае пару выгнутых мікраканалаў для стымулявання павелічэння часу знаходжання вадкасці, нелінейных патокаў і шматвосевай дэфармацыі культываваных клетак (мал. 2a–f)12. Калі неабходна аднавіць больш складаную біямеханіку кішачніка, можна выбраць складаную канструкцыю тыпу «кішка на чыпе». Мы паказалі, што звілісты чып тыпу «кішка на чыпе» таксама моцна індукуе трохмерны марфагенез за падобныя прамежкі часу з падобнай ступенню росту эпітэлія ў параўнанні з першапачатковым чыпам тыпу «кішка». незалежна ад тыпу культываваных клетак. Такім чынам, для стымуляцыі трохмернага марфагенезу лінейныя і складаныя канструкцыі кішачніка на чыпе ўзаемазаменныя. Рэплікі PDMS, зацвярдзелыя на крэмніевых формах з шаблонамі SU-8, забяспечвалі негатыўныя характарыстыкі пасля дэфармацыі (мал. 2a). Для вырабу кішачніка на чыпе падрыхтаваны верхні пласт PDMS паслядоўна злучалі з сітаватай плёнкай PDMS, а затым выраўноўвалі з ніжнім пластом PDMS шляхам незваротнага злучэння з выкарыстаннем кароннага апрацавальніка (мал. 2b-f). Для вырабу гібрыдных чыпаў зацвярдзелыя рэплікі PDMS злучалі са шклянымі слайдамі для стварэння аднаканальных мікрафлюідных прылад, якія маглі б змясціць устаўкі Transwell (мал. 2h і пашыраныя дадзеныя, мал. 2). Працэс злучэння выконваецца шляхам апрацоўкі паверхняў рэплікі PDMS і шкла кіслароднай плазмай або кароннай апрацоўкай. Пасля стэрылізацыі мікравырабленай прылады, прымацаванай да сіліконавай трубкі, прылада была гатовая да выканання трохмернага марфагенезу кішачнага эпітэлія (мал. 2g).
a, Схематычная ілюстрацыя падрыхтоўкі дэталяў PDMS з крэмніевых формаў з малюнкам SU-8. Незацвярдзелы раствор PDMS вылілі на крэмніевую форму (злева), зацвярдзелі пры тэмпературы 60 °C (пасярэдзіне) і вынялі з формы (справа). Выняты з формы PDMS разрэзалі на кавалкі і ачысцілі для далейшага выкарыстання.b, Фотаздымак крэмніевай формы, якая выкарыстоўвалася для падрыхтоўкі верхняга пласта PDMS.c, Фотаздымак крэмніевай формы, якая выкарыстоўвалася для вырабу сітаватай мембраны PDMS.d, Серыя фатаграфій верхніх і ніжніх кампанентаў PDMS і сабранай кішачнай прылады на чыпе.e, Схема выраўноўвання верхняга, мембраннага і ніжняга кампанентаў PDMS. Кожны пласт незваротна звязаны плазмавай або кароннай апрацоўкай.f, Схема вырабленай прылады «кішка на чыпе» з накладзенымі звілістымі мікраканаламі і вакуумнымі камерамі.g, Усталёўка «кішка на чыпе» для мікрафлюіднай культуры клетак. Вырабленая «кішка на чыпе», сабраная з сіліконавай трубкай і шпрыцом, была размешчана на покрыўным шкле. Прылада з чыпам была размешчана на вечку 150-мм куба Петры. чашка для апрацоўкі. Злучнае рэчыва выкарыстоўваецца для закрыцця сіліконавай трубкі.h, Візуальныя здымкі вырабу гібрыднага чыпа і 3D-марфагенезу з выкарыстаннем гібрыдных чыпаў. Устаўкі Transwell, падрыхтаваныя незалежна для культывавання 2D-манаслаёў клетак кішачнага эпітэлія, былі ўстаўлены ў гібрыдны чып для індукцыі 3D-марфагенезу кішачніка. Асяроддзе перфузуецца праз мікраканалы пад клеткавым пластом, створаным на ўстаўцы Transwell. Маштабная лінейка, 1 см.h Перадрук з дазволу спасылкі.4. Elsevier.
У гэтым пратаколе ў якасці крыніц эпітэлія выкарыстоўваліся клеткавая лінія Caco-2 і кішачныя арганоіды (мал. 3a). Абодва тыпы клетак культываваліся незалежна (рамка 2 і рамка 5) і выкарыстоўваліся для пасеву пакрытых ECM мікраканалаў кішачніка на чыпе або ўставак Transwell. Калі клеткі дасягаюць канфлюэнтнасці (>95% пакрыцця ў колбах), руцінна культываваныя клеткі Caco-2 (паміж пасажамі 10 і 50) у Т-вобразных колбах збіралі для падрыхтоўкі дысацыяваных клеткавых суспензій з дапамогай трыпсінізацыі (рамка 2). Кішачныя арганоіды чалавека з кішачных біяпсій або хірургічных рэзекцый культывавалі ў купалах Matrigel у 24-лункавых пласцінах для падтрымкі структурнага мікраасяроддзя. Асяроддзе, якое змяшчае неабходныя морфагены (напрыклад, Wnt, R-спондын і Noggin) і фактары росту, падрыхтаваныя, як апісана ў радку 3, дапаўнялі праз дзень, пакуль арганоіды не выраслі да ~500 мкм у дыяметры. Цалкам вырашчаныя арганоіды збіралі і дысацыявалі на асобныя клеткі для пасеву на кішачнік або Устаўкі Transwell на чыпе (Устаўка 5). Як мы ўжо паведамлялі раней, яго можна дыферэнцыяваць у залежнасці ад тыпу захворвання12,13 (напрыклад, язвавы каліт, хвароба Крона, каларэктальны рак або нармальны донар), месца паражэння (напрыклад, паражэнне супраць непашкоджанай вобласці) і месцазнаходжання ў страўнікава-кішачным тракце (напрыклад, дванаццаціперсная кішка, худая кішка, падуздышная кішка, сляпая кішка, тоўстая кішка або прамая кішка). У Устаўцы 5 мы прапануем аптымізаваны пратакол для культывавання арганоідаў тоўстай кішкі (калоідаў), якія звычайна патрабуюць больш высокіх канцэнтрацый марфагенаў, чым арганоіды тонкай кішкі.
а, Працоўны працэс індукцыі кішачнага марфагенезу ў кішачным чыпе. У гэтым пратаколе для дэманстрацыі 3D-марфагенезу выкарыстоўваюцца кішачны эпітэлій чалавека Caco-2 і кішачныя арганоіды. Ізаляваныя эпітэліяльныя клеткі былі пасеяны ў падрыхтаваную прыладу "кішачнік на чыпе" (падрыхтоўка чыпа). Пасля таго, як клеткі пасеяны (пасеяны) і прымацаваны (прымацаваны) да сітаватай мембраны PDMS у дзень 0 (D0), ініцыюецца апікальны (AP) паток і падтрымліваецца на працягу першых 2 дзён (паток, AP, D0-D2). Таксама ініцыюецца базалатэральны (BL) паток разам з цыклічнымі рухамі расцяжэння (расцяжэнне, паток, AP і BL), калі фармуецца поўны 2D-манаслой. Кішачны 3D-марфагенез адбыўся спантанна праз 5 дзён мікрафлюіднай культуры (марфагенез, D5). Фазава-кантрастныя выявы паказваюць рэпрэзентатыўную марфалогію клетак Caco-2 на кожным эксперыментальным этапе або ў кожным моманте часу (гістаграма, 100 мкм). Чатыры схематычныя дыяграмы, якія ілюструюць адпаведныя каскады кішачнага марфагенезу (уверсе справа). Пункцірныя стрэлкі. На схеме паказаны кірунак патоку вадкасці.b, SEM-выява, якая паказвае павярхоўную тапалогію ўсталяванага трохмернага эпітэлія Caco-2 (злева). Устаўка, якая вылучае павялічаную вобласць (белая штрыхаваная рамка), паказвае рэгенераваныя мікраворсінкі на трохмерным пласце Caco-2 (справа).c, Гарызантальны франтальны выгляд усталяванага трохмернага эпітэлія Caco-2, клаўдзіну (ZO-1, чырвоны) і мембран са шчоткавай аблямоўкай, пазначаных F-акцінам (зялёны) і ядрамі (сіні). Імунафлуарэсцэнтная канфакальная візуалізацыя эпітэліяльных клетак на кішачных чыпах.Стрэлкі, якія паказваюць на сярэднюю схему, паказваюць размяшчэнне факальнай плоскасці для кожнага канфакальнага выгляду.d, Часавы ход марфалагічных змен у арганоідах, культываваных на чыпе, атрыманы метадам фазава-кантрастнай мікраскапіі на 3, 7, 9, 11 і 13 дні.Устаўка (уверсе справа) паказвае вялікае павелічэнне прадстаўленага малюнка.e, DIC-фотамікрафатаграфія трохмернага эпітэлія арганоіда, усталяванага ў кішачніку, на зрэзе, зробленым на 7 дзень.f, Накладзеныя імунафлуарэсцэнтныя выявы, якія паказваюць маркеры для ствалавых клетак. (LGR5; пурпурны), келіхападобныя клеткі (MUC2; зялёны), F-акцін (шэры) і ядры (блакітны), вырашчаныя на чыпах кішачніка на працягу 3 дзён адпаведна (злева) і 13-дзённыя (сярэднія) арганоіды на эпітэліяльным пласце. Глядзіце таксама пашыраныя дадзеныя, малюнак 3, на якім паказаны сігналізацыя LGR5 без сігналізацыі MUC2. Флуарэсцэнтныя выявы, якія паказваюць эпітэліяльную мікраструктуру (справа) трохмернага арганоіднага эпітэлія, створанага ў кішачніку на чыпе шляхам афарбоўвання плазматычнай мембраны фарбавальнікам CellMask (справа) на 13-ы дзень культывавання. Маштабная шкала складае 50 мкм, калі не пазначана іншае.b Перадрукавана з дазволу спасылкі.2. Oxford University Press;c Адаптавана з дазволу спасылкі.2. Oxford University Press;e і f адаптаваны з дазволу па спасылцы.12 Па ліцэнзіі Creative Commons CC BY 4.0.
У кішачніку на чыпе неабходна мадыфікаваць гідрафобную паверхню сітаватай мембраны PDMS для паспяховага пакрыцця ECM. У гэтым пратаколе мы ўжываем два розныя метады мадыфікацыі гідрафобнасці мембран PDMS. Для культывавання клетак Caco-2 актывацыя паверхні толькі УФ/азонавай апрацоўкай была дастатковай для зніжэння гідрафобнасці паверхні PDMS, пакрыцця ECM і прымацавання клетак Caco-2 да мембраны PDMS. Аднак мікрафлюідная культура арганоіднага эпітэлія патрабуе хімічнай функцыяналізацыі паверхні для дасягнення эфектыўнага адкладання бялкоў ECM шляхам паслядоўнага нанясення поліэтыленіміну (PEI) і глутаральдэгіду на мікраканалы PDMS. Пасля мадыфікацыі паверхні бялкі ECM былі адкладзены для пакрыцця функцыяналізаванай паверхні PDMS, а затым уведзены ў ізаляваны арганоідны эпітэлій. Пасля прымацавання клетак мікрафлюідная культура клетак пачынаецца з перфузіі толькі асяроддзя ў верхні мікраканал, пакуль клеткі не ўтвараюць поўны монаслой, у той час як ніжні мікраканал падтрымлівае статычныя ўмовы. Гэты аптымізаваны метад актывацыі паверхні і пакрыцця ECM дазваляе прымацаванню арганоіднага эпітэлія выклікаць 3D-марфагенез на паверхні PDMS.
Культуры Transwell таксама патрабуюць пакрыцця ECM перад пасевам клетак; аднак культуры Transwell не патрабуюць складаных этапаў папярэдняй апрацоўкі для актывацыі паверхні сітаватых уставак. Для вырошчвання клетак Caco-2 на ўстаўках Transwell пакрыццё ECM на сітаватых устаўках паскарае прымацаванне дысацыяваных клетак Caco-2 (<1 гадзіна) і ўтварэнне шчыльнага бар'ера злучэння (<1-2 дні). Для культывавання арганоідаў на ўстаўках Transwell ізаляваныя арганоіды высейваюць на ўстаўкі, пакрытыя ECM, прымацоўваюць да паверхні мембраны (<3 гадзіны) і вытрымліваюць, пакуль арганоіды не ўтвараюць поўны монаслой з цэласнасцю бар'ера. Культуры Transwell праводзяцца ў 24-лункавых планшэтах без выкарыстання гібрыдных чыпаў.
Трохмерны морфагенез in vitro можна ініцыяваць шляхам падачы патоку вадкасці на базалатэральны бок сфарміраванага эпітэліяльнага пласта. У кішачніку на чыпе эпітэліяльны морфагенез пачынаўся, калі асяроддзе перфузіравалася ў верхні і ніжні мікраканалы (мал. 3a). Як апісана раней, вельмі важна ўвесці паток вадкасці ў ніжні (базалатэральны) адсек для бесперапыннага выдалення накіраваных сакрэтаваных інгібітараў морфагенаў. Каб забяспечыць дастатковую колькасць пажыўных рэчываў і сыроваткі клеткам, звязаным на порыстых мембранах, і стварыць напружанне зруху ў прасвете, мы звычайна ўжываем двайны паток у кішачніку на чыпе. У гібрыдных чыпах у гібрыдныя чыпы ўстаўкі Transwell, якія змяшчалі эпітэліяльныя монаслаі. Затым асяроддзе наносілася пад базалатэральны бок порыстай устаўкі Transwell праз мікраканал. Кішачны морфагенез адбываўся праз 3-5 дзён пасля пачатку базалатэральнага патоку ў абедзвюх культуральных платформах.
Марфалагічныя асаблівасці мікраінжынерных трохмерных эпітэліяльных слаёў можна прааналізаваць з дапамогай розных метадаў візуалізацыі, у тым ліку фазава-кантрастнай мікраскапіі, дыферэнцыяльна-інтэрферэнцыйна-кантрастнай (DIC) мікраскапіі, SEM або імунафлуарэсцэнтнай канфакальнай мікраскапіі (малюнкі 3 і 4). Фазава-кантрастную або DIC-візуалізацыю можна лёгка выканаць у любы час падчас культывавання для кантролю формы і выступаў трохмерных эпітэліяльных слаёў. Дзякуючы аптычнай празрыстасці PDMS і поліэфірных плёнак, як платформы gut-on-a-chip, так і гібрыдныя чыпавыя платформы могуць забяспечваць візуалізацыю in situ ў рэжыме рэальнага часу без неабходнасці разразання або разборкі прылады. Пры правядзенні імунафлуарэсцэнтнай візуалізацыі (малюнкі 1, 3c, f і 4b, c) клеткі звычайна фіксуюць 4% (мас./аб.) парафармальдэгідам (PFA), затым Triton X-100 і 2% (мас./аб.) бычыным сыроватачным альбумінам (BSA) па парадку. У залежнасці ад тыпу клетак можна выкарыстоўваць розныя фіксатары, пермеабілізатары і блакуючыя агенты. Першасныя антыцелы, накіраваныя на клетку або вобласць, якая залежыць ад лініі. Маркеры выкарыстоўваюцца для вылучэння клетак, імабілізаваных in situ на чыпе, а затым другасныя антыцелы разам з кантрастным фарбавальнікам, накіраваным альбо на ядро ​​(напрыклад, 4',6-дыямідзіна-2-фенілен)індол, DAPI), альбо на F-акцін (напрыклад, флуарэсцэнтна мечаны фалоідын). Флуарэсцэнтная жывая візуалізацыя таксама можа быць праведзена in situ для выяўлення выпрацоўкі слізі (мал. 1, «Дыферэнцыяцыя клетак» і «Фізіялогія кішачніка»), выпадковай каланізацыі мікробных клетак (мал. 1, «Сумесная культура гаспадара і мікроба»), рэкрутавання імунных клетак (мал. 1, «Мадэляванне захворванняў») або контураў трохмернай эпітэліяльнай марфалогіі (мал. 3c,f і 4b,c). Пры мадыфікацыі кішачніка на чыпе для аддзялення верхняга пласта ад ніжняга пласта мікраканальнага, як апісана ў спасылцы. Як паказана на мал. 2, трохмерную эпітэліяльную марфалогію, а таксама мікраворсінкі на апікальнай шчоткавай аблямоўцы можна візуалізаваць з дапамогай SEM (мал. 3b). Экспрэсія Маркеры дыферэнцыяцыі можна ацаніць з дапамогай колькаснага ПЛР5 або секвенавання РНК адной клеткі. У гэтым выпадку трохмерныя пласты эпітэліяльных клетак, вырашчаных у кішачных чыпах або гібрыдных чыпах, збіраюцца шляхам трыпсінізацыі, а затым выкарыстоўваюцца для малекулярнага або генетычнага аналізу.
а, Працоўны працэс індукцыі кішачнага морфагенезу ў гібрыдным чыпе. Caco-2 і кішачныя арганоіды выкарыстоўваюцца ў гэтым пратаколе для дэманстрацыі 3D морфагенезу на платформе гібрыднага чыпа. Дысацыяваныя эпітэліяльныя клеткі былі пасеяны ў падрыхтаваныя ўстаўкі Transwell (TW prep; гл. малюнак ніжэй). Пасля пасеву клетак (seeded) і прымацавання да поліэфірных мембран ва ўстаўках Transwell, усе клеткі культываваліся ў статычных умовах (TW culture). Праз 7 дзён адна ўстаўка Transwell, якая змяшчае 2D монаслой эпітэліяльных клетак, была інтэгравана ў гібрыдны чып для ўвядзення базалатэральнага патоку (Flow, BL), што ў канчатковым выніку прывяло да стварэння 3D эпітэліяльнага пласта (морфагенез). Фазава-кантрастныя мікрафотаграфіі, якія паказваюць марфалагічныя асаблівасці эпітэліяльных клетак органаў чалавека, атрыманых ад нармальнага донара (лінія C103) узыходнай абадковай кішкі на кожным эксперыментальным этапе або ў кожным моманте часу. Схема ў верхніх пластах ілюструе эксперыментальную канфігурацыю для кожнага этапу. б, Гібрыдныя чыпы (левая схема) могуць прывесці да 3D морфагенезу арганоідных эпітэліяльных клетак з дапамогай канфакальнай мікраскапіі зверху ўніз, атрыманай у розных умовах. Пазіцыі Z (верхняя, сярэдняя і ніжняя; гл. правую схему і адпаведныя пункцірныя лініі). паказалі відавочныя марфалагічныя характарыстыкі. F-акцін (блакітны), ядро ​​(шэры).c, Флуарэсцэнтныя канфакальныя мікрафатаграфіі (3D-вуглавы выгляд) эпітэліяльных клетак, атрыманых з арганоідаў, культываваных у статычнай Transwell (TW; устаўка ўнутры белай штрыхаванай рамкі) у параўнанні з гібрыдным чыпам (найбуйнейшы поўны здымак), якія параўноўваюць 2D і 3D марфалогію адпаведна. Пара 2D вертыкальных папярочных праглядаў (устаўка ў правым верхнім куце; «XZ») таксама паказвае 2D і 3D асаблівасці. Маштабная лінейка, 100 мкм.c Перадрук з дазволу спасылкі.4. Elsevier.
Кантрольныя ўзоры можна падрыхтаваць шляхам культывавання тых жа клетак (Caco-2 або кішачных арганоідных эпітэліяльных клетак) у двухмерныя монаслаі ў звычайных статычных умовах культывавання. Варта адзначыць, што знясіленне пажыўных рэчываў можа адбыцца з-за абмежаванай аб'ёмнай ёмістасці мікраканалаў (г.зн. ~4 мкл у верхнім канале на арыгінальнай канструкцыі кішачнага чыпа). Такім чынам, можна параўнаць марфалогію эпітэлія да і пасля ўжывання базалатэральнага патоку.
Працэс мяккай літаграфіі павінен выконвацца ў чыстым памяшканні. Для кожнага пласта на чыпе (верхні і ніжні пласты і мембраны) і гібрыдных чыпаў выкарыстоўваліся розныя фоташаблоны, якія вырабляліся на асобных крэмніевых пласцінах, паколькі вышыня мікраканалаў была рознай. Вышыня мішэняў для верхняга і ніжняга мікраканалаў кішкі на чыпе складае 500 мкм і 200 мкм адпаведна. Вышыня мішэні канала гібрыднага чыпа складае 200 мкм.
Змясціце 3-цалевую крэмніевую пласціну ў кубак з ацэтонам. Акуратна паварочвайце пласціну на працягу 30 секунд, затым высушыце пласціну на паветры. Перанясіце пласціну на пласціну з IPA, затым паварочвайце пласціну на працягу 30 секунд для ачысткі.
Для максімальнага выдалення арганічных рэшткаў з паверхні крэмніевай пласціны можна выкарыстоўваць раствор піранні (сумесь перакісу вадароду і канцэнтраванай сернай кіслаты, 1:3 (аб'ём/аб'ём)).
Раствор піраній надзвычай каразійны і вылучае цяпло. Неабходныя дадатковыя меры бяспекі. Для ўтылізацыі адходаў дайце раствору астыць і пераліце ​​яго ў чысты, сухі кантэйнер для адходаў. Выкарыстоўвайце другасныя кантэйнеры і належным чынам маркіруйце кантэйнеры для адходаў. Калі ласка, выконвайце рэкамендацыі па бяспецы ўстановы для атрымання больш падрабязных працэдур.
Абязводжвайце вафлі, змясціўшы іх на гарачую пліту пры тэмпературы 200 °C на 10 хвілін. Пасля абязводжвання вафлі пяць разоў страсянулі на паветры для астуджэння.
Наліце ​​~10 г фотарэзісту SU-8 2100 у цэнтр ачышчанай крэмніевай пласціны. Выкарыстоўвайце пінцэт, каб раўнамерна размеркаваць фотарэзіст па пласціне. Час ад часу кладзіце пласціну на гарачую пліту з тэмпературай 65°C, каб зрабіць фотарэзіст менш ліпкім і лягчэйшым для нанясення. Не кладзіце пласціну непасрэдна на гарачую пліту.
SU-8 быў раўнамерна размеркаваны на пласціне шляхам нанясення пакрыцця кручэннем. Запраграмуйце ўваходнае кручэнне SU-8 на працягу 5-10 секунд для распаўсюджвання з хуткасцю 500 абаротаў у хвіліну з паскарэннем 100 абаротаў у хвіліну/с. Усталюйце асноўнае кручэнне для фарміравання малюнка таўшчынёй 200 мкм пры 1500 абаротаў у хвіліну або дасягніце таўшчыні 250 мкм (створыўшы вышыню 500 мкм для верхняга пласта кішкі на чыпе; гл. «Крытычныя крокі» ніжэй), усталяваўшы паскарэнне 300 абаротаў у хвіліну/с на працягу 30 секунд пры 1200 абаротаў у хвіліну.
Асноўную хуткасць кручэння можна рэгуляваць у залежнасці ад мэтавай таўшчыні малюнка SU-8 на крэмніевай пласціне.
Для вырабу шаблонаў SU-8 вышынёй 500 мкм для верхняга пласта кішкі на чыпе, этапы нанясення пакрыцця кручэннем і мяккага выпякання гэтай скрынкі (этапы 7 і 8) былі паслядоўна паўтораны (гл. этап 9), каб атрымаць два пласты SU-8 таўшчынёй 250 мкм, якія можна накладваць і злучаць пад уздзеяннем УФ-выпраменьвання на этапе 12 гэтай скрынкі, ствараючы пласт вышынёй 500 мкм.
Акуратна змясціце вафлі з пакрыццём SU-8 на гарачую пліту пры тэмпературы 65 °C на 5 хвілін, затым зменіце тэмпературу на 95 °C і інкубуйце яшчэ 40 хвілін.
Каб дасягнуць вышыні малюнка SU-8 у верхнім мікраканале 500 мкм, паўтарыце крокі 7 і 8, каб стварыць два пласты SU-8 таўшчынёй 250 мкм.
Выкарыстоўваючы прыладу для выраўноўвання УФ-маскі, правядзіце тэст лямпы ў адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы, каб разлічыць час экспазіцыі пласціны. (час экспазіцыі, мс) = (доза экспазіцыі, мДж/см2) / (магутнасць лямпы, мВт/см2).
Пасля вызначэння часу экспазіцыі змесціце фоташаблон на трымальнік маскі выраўноўвальніка УФ-маскі і змесціце фоташаблон на пакрытую пласціну SU-8.
Размясціце друкаваную паверхню фоташаблону непасрэдна на пакрытым SU-8 баку крэмніевай пласціны, каб мінімізаваць рассейванне ультрафіялетавага выпраменьвання.
Падвергніце пакрытую SU-8 пласціну і фоташаблон вертыкальна ўздзеянню УФ-святла магутнасцю 260 мДж/см2 на працягу зададзенага часу экспазіцыі (гл. крок 10 гэтай рамкі).
Пасля ўздзеяння УФ-выпраменьвання крэмніевыя пласціны, пакрытыя SU-8, абпальвалі пры тэмпературы 65°C на працягу 5 хвілін і пры тэмпературы 95°C на працягу 15 хвілін на кожнай гарачай пліце для вырабу шаблонаў вышынёй 200 мкм. Час пасля абпалу пры тэмпературы 95°C павялічылі да 30 хвілін для вырабу шаблонаў вышынёй 500 мкм.
Праяўляльнік наліваецца ў шкляны посуд, і туды змяшчаецца выпечаная пласціна. Аб'ём праяўляльніка SU-8 можа адрознівацца ў залежнасці ад памеру шкляной пласціны. Пераканайцеся, што вы выкарыстоўваеце дастатковую колькасць праяўляльніка SU-8, каб цалкам выдаліць непрадстаўлены SU-8. Напрыклад, пры выкарыстанні шклянога посуду дыяметрам 150 мм і ёмістасцю 1 л выкарыстоўвайце ~300 мл праяўляльніка SU-8. Праяўляйце форму на працягу 25 хвілін, перыядычна акуратна паварочваючы яе.
Прамыйце праяўленую форму ~10 мл свежага праяўляльніка, а затым IPA, распыляючы раствор з дапамогай піпеткі.
Змясціце пласціну ў плазменны ачышчальнік і падвергніце ўздзеянню кіслароднай плазмы (атмасферны газ, ціск мішэні 1 × 10−5 Тор, магутнасць 125 Вт) на працягу 1,5 хвіліны.
Змясціце пласціну ў вакуумны эксікатар са шкляным прадметным шклом унутры. Пласціны і прадметныя шкло можна размяшчаць побач. Калі вакуумны эксікатар падзелены на некалькі слаёў пласцінай, змясціце прадметныя шкло ў ніжнюю камеру, а пласціны — у верхнюю. Капніце 100 мкл раствора трыхлор(1H, 1H, 2H, 2H-перфторактыл)сілану на шкляное прадметнае шкло і прымяніце вакуум для сіланізацыі.
Размарозьце флакон з замарожанымі клеткамі Caco-2 на вадзяной лазні з тэмпературай 37°C, затым перанясіце размарожаныя клеткі ў колбу T75, якая змяшчае 15 мл разагрэтага да 37°C асяроддзя Caco-2.
Каб клеткі Caco-2 прайшлі праз сераду пры ~90% канфлюэнтнасці, спачатку нагрэйце асяроддзе Caco-2, PBS і 0,25% трыпсіну/1 мМ EDTA на вадзяной лазні пры тэмпературы 37°C.
Аспіруйце асяроддзе з дапамогай вакуумнай аспірацыі. Прамыйце клеткі двойчы 5 мл цёплага PBS, паўтарыўшы вакуумную аспірацыю і дадаўшы свежы PBS.