Дзякуй за наведванне Nature.com. Версія браўзера, якой вы карыстаецеся, мае абмежаваную падтрымку CSS. Для найлепшага вопыту мы рэкамендуем вам выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або выключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Тым часам, каб забяспечыць пастаянную падтрымку, мы будзем адлюстроўваць сайт без стыляў і JavaScript.
Марфагенез кішачніка чалавека ўсталёўвае асаблівасці крыпта-ворсінкі трохмернай эпітэліяльнай мікраархітэктуры і прасторавай арганізацыі. Гэтая унікальная структура неабходная для падтрымання гамеастазу кішачніка шляхам абароны нішы ствалавых клетак у базальнай крыпце ад экзагенных мікробных антыгенаў і іх метабалітаў. Акрамя таго, варсінкі кішачніка і сакрэтуючая слізь прадстаўляюць функцыянальна дыферэнцыраваныя эпітэліяльныя клеткі з ахоўным бар'ерам на паверхні слізістай абалонкі кішачніка. Такім чынам, узнаўленне трохмерных эпітэліяльных структур мае вырашальнае значэнне для пабудовы мадэляў кішачніка in vitro. Характэрна, што арганічны міметычны кішачнік на чыпе можа выклікаць спантанны трохмерны марфагенез кішачнага эпітэлія з палепшанымі фізіялагічнымі функцыямі і біямеханікай. Тут мы прапануем узнаўляльны пратакол для надзейнай індукцыі марфагенезу кішачніка ў гу t на мікрафлюідным чыпе, а таксама ва ўбудаваным гібрыдным чыпе Transwell. Мы апісваем падрабязныя метады вырабу прылад, культывавання эпітэліяльных клетак Caco-2 або арганоідаў кішачніка ў звычайных умовах, а таксама на мікрафлюіднай платформе, індукцыі 3D-марфагенезу і характарыстыкі ўсталяванага 3D-эпітэлія з выкарыстаннем некалькіх метадаў візуалізацыі. Гэты пратакол забяспечвае рэгенерацыю функцыянальнай кішкі. мікраархітэктура, кантралюючы базолатеральный паток вадкасці на працягу 5 дзён. Наш метад марфагенезу in vitro выкарыстоўвае фізіялагічна рэлевантнае напружанне зруху і механічны рух і не патрабуе складанай клеткавай інжынерыі або маніпуляцый, якія могуць пераўзыходзіць іншыя існуючыя метады. Мы мяркуем, што прапанаваны намі пратакол можа мець шырокія наступствы для біямедыцынскай даследчай супольнасці, забяспечваючы метад рэгенерацыі 3D слаёў кішачнага эпітэлія in vitro для біямедыцынскіх, клінічных і фармацэўтычных прыкладанняў.
Эксперыменты дэманструюць, што кішачныя эпітэліяльныя клеткі Caco-2, культываваныя ў мікрафлюідных прыладах "кішачнік-на-чыпе" 1, 2, 3, 4, 5 або ў двухслаёвых мікрафлюідных прыладах 6, 7, могуць падвяргацца спантанаму трохмернаму марфагенезу in vitro без дакладнага разумення асноўнага механізму. У нашым нядаўнім даследаванні мы выявілі, што выдаленне базалатэральна сакрэтаваных антаганістаў марфогена з культуральных прылад неабходна і дастаткова для індукцыі 3D эпітэліяльнай гібелі. фагенез in vitro, які быў прадэманстраваны Caco-2 і кішачнымі арганоідамі, атрыманымі ад пацыентаў.Эпітэліяльныя клеткі былі пацверджаны. У гэтым даследаванні мы асабліва засяродзіліся на вытворчасці клетак і размеркаванні канцэнтрацыі моцнадзейнага антаганіста Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), у кішачніку на чыпе і мадыфікаваных мікрафлюідных прыладах, якія змяшчаюць устаўкі Transwell, якія называюцца «гібрыдным чыпам». Мы дэманструем, што даданне экзагенных антаганістаў Wnt (такіх як DKK-1, Wnt repressor 1, сакрэтуюць frizzled -звязаны бялок 1, або Soggy-1) у кішачніку на чыпе інгібіруе марфагенез або парушае папярэдне структураваны трохмерны эпітэліяльны пласт, што сведчыць аб тым, што антаганістычны стрэс падчас культывавання адказвае за кішачны марфагенез in vitro. Такім чынам, практычны падыход да дасягнення надзейнага марфагенезу на эпітэліяльнай мяжы заключаецца ў выдаленні або мінімальным падтрыманні ўзроўню антаганістаў Wnt у базолатеральной частцы мент шляхам актыўнага прамывання (напрыклад, на платформах "кішка-на-чыпе" або "гібрыд-на-чыпе") або дыфузіі.
У гэтым пратаколе мы прапануем падрабязны метад вырабу мікраўстройстваў "кішачнік на чыпе" і гібрыдных чыпаў, якія ўстаўляюцца Transwell (этапы 1-5), для культывавання эпітэліяльных клетак кішачніка на порыстых мембранах на аснове полідыметылсілаксана (PDMS) (этапы 6A, 7A, 8, 9) або поліэфірных мембранах уставак Transwell (этапы 6B, 7B, 8, 9) і індукаваны трохмерны марфагенез in vitro (этап 10). Мы таксама вызначылі клеткавыя і малекулярныя асаблівасці, якія сведчаць аб тканкаспецыфічным гістагенезе і клеткавай дыферэнцыяцыі, якая залежыць ад роду, шляхам прымянення некалькіх метадаў візуалізацыі (этапы 11-24). Мы індукуем марфагенез з выкарыстаннем эпітэліяльных клетак кішачніка чалавека, такіх як Caco-2 або кішачных арганоідаў, у двух фарматах культуры з тэхнічнымі дэталямі, уключаючы моды паверхні. іфікацыя порыстых мембран, стварэнне 2D-манаслояў, біяхімічнае і ўзнаўленне біямеханічнага мікраасяроддзя кішачніка in vitro. Каб выклікаць 3D-марфагенез з 2D-эпітэліяльных аднаслояў, мы выдалілі антаганісты марфогена ў абедзвюх культывуемых формах, запусціўшы асяроддзе ў базолатеральный аддзел культуры. Нарэшце, мы прапануем прадстаўленне аб карыснасці аднаўляльнага 3D-эпітэлія. тэліяльны пласт, які можна выкарыстоўваць для мадэлявання марфаген-залежнага росту эпітэлія, падоўжных сумесных культур гаспадара і мікрабіёма, патагеннай інфекцыі, запаленчага пашкоджання, дысфункцыі эпітэліяльнага бар'ера і тэрапіі на аснове прабіётыкаў.
Наш пратакол можа быць карысны шырокаму колу навукоўцаў у галіне фундаментальных (напрыклад, біялогіі слізістай абалонкі кішачніка, біялогіі ствалавых клетак і біялогіі развіцця) і прыкладных даследаванняў (напрыклад, даклінічных выпрабаванняў лекаў, мадэлявання захворванняў, тканкавай інжынерыі і гастраэнтэралогіі). Дзякуючы ўзнаўляльнасці і надзейнасці нашага пратакола для індукцыі трохмернага марфагенезу кішачнага эпітэлія in vitro, мы мяркуем, што нашы тэхнічная стратэгія можа быць распаўсюджана сярод аўдыторыі, якая вывучае дынаміку клетачнай сігналізацыі падчас развіцця кішачніка, рэгенерацыі або гамеастазу. Акрамя таго, наш пратакол карысны для апытання інфекцыі пры розных інфекцыйных агентах, такіх як Norovirus 8, цяжкі востры рэспіраторны сіндром Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 або Vibrio cholerae.Таксама карысныя аўдыторыі паталогіі і патагенезу захворвання. Выкарыстанне сістэмы мікрафізіялогіі кішачніка на чыпе можа дазволіць падоўжнае сумеснае культываванне 10 і наступную ацэнку абароны гаспадара, імунных рэакцый і аднаўлення пашкоджанняў, звязаных з патагенамі ў страўнікава-кішачным тракце 11. Іншыя страўнікава-кішачныя засмучэнні, звязаныя з сіндромам дзіравай кішкі, целиакией, хваробай Крона, язвавым калітам, ілеітам або Сіндром раздражнёнага кішачніка можа быць змадэляваны, калі 3D пласты кішачнага эпітэлія падрыхтаваны з выкарыстаннем 3D пластоў кішачнага эпітэлія пацыента. Гэтыя захворванні ўключаюць атрафію варсінак, скарачэнне крыпты, пашкоджанне слізістай абалонкі або парушэнне эпітэліяльнага бар'ера. Біяпсія або атрыманыя з ствалавых клетак кішачныя арганоіды 12, 13. Каб лепш змадэляваць высокую складанасць асяроддзя захворвання, чытачы можа разгледзець пытанне аб даданні тыпаў клетак, звязаных з захворваннем, такіх як монануклеары перыферычнай крыві пацыента (МКПК), у мадэлі, якія змяшчаюць 3D-мікраархітэктуры кішачных варсінак-крыптаў.тканкаспецыфічныя імунныя клеткі, 5.
Паколькі 3D-мікраструктуру эпітэлія можна зафіксаваць і візуалізаваць без працэсу разрэзу, гледачы, якія працуюць над прасторавай транскрыптамікай і візуалізацыяй з высокім або звышраздзяленнем, могуць зацікавіцца нашым адлюстраваннем прасторава-часавай дынамікі генаў і бялкоў у эпітэліяльных нішах.Цікавіцца тэхналогіяй. Рэакцыя на мікробныя або імунныя раздражняльнікі. Акрамя таго, падоўжныя перакрыжаваныя перашкоды паміж гаспадаром і мікрабіёмам 10, 14, якія каардынуюць гамеастаз кішачніка, могуць быць устаноўлены ў трохмерным пласце слізістай абалонкі кішачніка шляхам сумеснага культывавання розных відаў мікробаў, мікробных супольнасцей або фекальнай мікрабіёты, асабліва ў кішачніку на чыпе.на платформе. Гэты падыход асабліва прывабны для аўдыторыі, якая вывучае імуналогію слізістых абалонак, гастраэнтэралогію, мікрабіём чалавека, культураміку і клінічную мікрабіялогію, якія імкнуцца культываваць раней некультураную мікрабіёту кішачніка ў лабараторыі. Калі наш пратакол марфагенезу in vitro можа быць адаптаваны да маштабаваных фарматаў культуры, такіх як шматлункавыя ўстаўкі ў 24, 96 або 384-лункавыя пласціны, якія пастаянна папаўняюць база У бакавых аддзяленнях пратакол таксама можна распаўсюдзіць тым, хто распрацоўвае фармацэўтычныя, біямедыцынскія або высокапрадукцыйныя платформы скрынінга або праверкі для харчовай прамысловасці. У якасці пацверджання прынцыпу мы нядаўна прадэманстравалі магчымасць стварэння мультыплекснай высокапрадукцыйнай сістэмы марфагенезу, якая можа маштабавацца да фармату 24-лункавага пласціны. Акрамя таго, некалькі прадуктаў органа-на-чыпе былі камерцыялізаваны16,17,18. Інакш, пацверджанне нашага метаду марфагенезу in vitro можа быць паскорана і патэнцыйна прынята многімі даследчыцкімі лабараторыямі, прамысловасцю або дзяржаўнымі і рэгулюючымі органамі, каб зразумець клеткавае перапраграмаванне марфагенезу кішачніка in vitro на транскрыптамічным узроўні для тэставання лекаў або біятэрапеўтычных прэпаратаў. Паглынанне і транспарціроўка лекаў-кандыдатаў ацэньвалася з выкарыстаннем 3D сурагатаў кішачніка або з выкарыстаннем індывідуальных або камерцыйных мадэляў органаў на чыпе для ацэнкі ўзнаўляльнасці працэс морфогенеза кішачніка.
Для вывучэння марфагенезу кішачнага эпітэлія выкарыстоўвалася абмежаваная колькасць эксперыментальных мадэляў, якія маюць дачыненне да чалавека, галоўным чынам з-за адсутнасці рэалізаваных пратаколаў для індукцыі трохмернага марфагенезу in vitro. Фактычна, большая частка сучасных ведаў аб марфагенезе кішачніка заснавана на даследаваннях на жывёл (напрыклад, на рыбках даніо20, мышах21 або курах22). Аднак яны працаёмкія і затратныя, могуць быць этычна сумнеўна, і, самае галоўнае, не вызначаюць дакладна працэсы развіцця чалавека. Гэтыя мадэлі таксама вельмі абмежаваныя ў сваёй здольнасці быць тэставанымі ў шматбаковай маштабаванай манеры. Такім чынам, наш пратакол для рэгенерацыі 3D структур тканіны in vitro пераўзыходзіць мадэлі in vivo на жывёл, а таксама іншыя традыцыйныя статычныя 2D мадэлі клетачнай культуры. Як было апісана раней, выкарыстанне 3D эпітэліяльных структур дазволіла нам вывучыць прасторавыя лакалізацыя дыферэнцыраваных клетак па восі крыпта-ворсінкі ў адказ на розныя слізістыя або імунныя раздражняльнікі. 3D эпітэліяльныя пласты могуць даць прастору для вывучэння таго, як мікробныя клеткі канкуруюць за фарміраванне прасторавых ніш і экалагічнай эвалюцыі ў адказ на фактары гаспадара (напрыклад, унутраны і знешні пласты слізі, сакрэцыя IgA і антымікробных пептыдаў). Акрамя таго, 3D эпітэліяльная марфалогія можа дазволіць нам зразумець, як мікрабіёта кішачніка структуруе свае суполкі і сінэргічны вырабляе мікробныя метабаліты (напрыклад, тоўстыя кіслоты з кароткай ланцугом), якія фармуюць клеткавую арганізацыю і нішы ствалавых клетак у базальных крыптах. Гэтыя асаблівасці можна прадэманстраваць толькі тады, калі трохмерныя пласты эпітэлія створаны in vitro.
У дадатак да нашага метаду стварэння трохмерных эпітэліяльных структур кішачніка існуе некалькі метадаў in vitro. Культываванне кішачных арганоідаў - гэта сучасная методыка тканкавай інжынерыі, заснаваная на культываванні кішачных ствалавых клетак у пэўных марфагенных умовах23,24,25. Аднак выкарыстанне трохмерных мадэляў арганоідаў для аналізу транспарту або сумесных культур гаспадара і мікрабіёма часта з'яўляецца складанай задачай, таму што прасвет кішачніка заключаны ў арганоід і, такім чынам, увядзенне кампанентаў прасвету, такіх як мікробныя клеткі або экзагенныя антыгены, абмежавана.Доступ да прасвету арганоідаў можна палепшыць з дапамогай мікраін'ектара,26,27, але гэты метад з'яўляецца інвазівным і працаёмкім і патрабуе спецыяльных ведаў для выканання. Акрамя таго, традыцыйныя культуры арганоідаў, якія захоўваюцца ў гідрагелевых каркасах у статычных умовах, не адлюстроўваюць дакладна актыўную біямеханіку in vivo.
Іншыя падыходы, якія выкарыстоўваюцца некалькімі даследчыцкімі групамі, выкарыстоўваюць папярэдне структураваныя трохмерныя гідрагелевыя каркасы для імітацыі эпітэліяльнай структуры кішачніка шляхам культывавання ізаляваных клетак кішачніка чалавека на паверхні геля. Вырабляйце гідрагелевыя каркасы з выкарыстаннем 3D-друкаваных, мікрафрэзераваных або літаграфічна вырабленых формаў. Гэты метад паказвае самаарганізаванае размяшчэнне ізаляваных эпітэліяльных клетак in vitro з фізіялагічна адпаведнымі градыентамі марфогена. , усталёўваючы эпітэліяльную структуру з высокім суадносінамі бакоў і строму-эпітэліяльныя перакрыжаваныя перашкоды шляхам уключэння стромальных клетак у каркас. Аднак прырода папярэдне структураваных каркасаў можа перашкаджаць дэманстрацыі самога спантанага марфагенетычнага працэсу. Гэтыя мадэлі таксама не забяспечваюць дынамічнага люмінальнага або міжтканкавага патоку, пазбаўленага стрэсу зруху вадкасці, неабходнага клеткам кішачніка для марфагенезу і атрымання фізіялагічнай функцыі. У іншым нядаўнім даследаванні выкарыстоўваліся гідрагелевыя каркасы ў мікрафлюіднай платформе і ўзорыстыя эпітэліяльныя структуры кішачніка з выкарыстаннем метадаў лазернага тручэння. Арганоіды кішачніка мышэй ідуць па вытраўленых узорах, каб сфармаваць трубчастыя структуры кішачніка, а ўнутрыпрасветны паток вадкасці можна паўтарыць з дапамогай модуля мікрафлюідыкі. Аднак гэтая мадэль не дэманструе ні спантанных марфагенетычных працэсаў, ні механічных рухаў кішачніка. Метады .3D-друку гэтай жа групы змаглі стварыць мініяцюрныя кішачныя трубкі са спантаннымі марфагенетычнымі працэсамі. Нягледзячы на ​​складаную вытворчасць розных сегментаў кішачніка ўнутры трубкі, у гэтай мадэлі таксама адсутнічае прасветны паток вадкасці і механічная дэфармацыя. Акрамя таго, працаздольнасць мадэлі можа быць абмежавана, асабліва пасля завяршэння працэсу біядруку, што парушае эксперыментальныя ўмовы або ўзаемадзеянне паміж клеткамі. Замест гэтага прапанаваны намі пратакол забяспечвае спантанны марфаген кішачніка esis, фізіялагічна адпаведнае напружанне зруху, біямеханіка, якая імітуе маторыку кішачніка, даступнасць незалежных апікальных і базолатеральных аддзелаў і аднаўленне складаных біялагічных мікраасяроддзяў модульнасці. Такім чынам, наш пратакол марфагенезу in vitro 3D можа забяспечыць дадатковы падыход для пераадолення праблем існуючых метадаў.
Наш пратакол цалкам сканцэнтраваны на трохмерным эпітэліяльным марфагенезе з толькі эпітэліяльнымі клеткамі ў культуры і адсутнасцю іншых тыпаў навакольных клетак, такіх як мезенхімальныя клеткі, эндатэліяльныя клеткі і імунныя клеткі. Як апісвалася раней, ядром нашага пратакола з'яўляецца індукцыя эпітэліяльнага марфагенезу шляхам выдалення інгібітараў марфогена, сакрэтаваных на базолатеральном баку ўведзенага асяроддзя. У той час як надзейная модульнасць наш кішачнік-на-чыпе і гібрыд-на-чыпе дазваляе нам узнавіць хвалісты трохмерны эпітэліяльны пласт, дадатковыя біялагічныя складанасці, такія як эпітэліяльна-мезенхімальныя ўзаемадзеянні33,34, адклад пазаклеткавага матрыкса (ECM)35 і, у нашай мадэлі, асаблівасці крыпты-варсінкі, якія перадаюць нішы ствалавых клетак у базальных крыптах, яшчэ трэба разгледзець далей. Стромальные клеткі (напрыклад, фібра бласты) у мезенхіме гуляюць ключавую ролю ў выпрацоўцы бялкоў ECM і рэгуляцыі кішачнага морфогенеза in vivo 35, 37, 38. Даданне мезенхімальных клетак да нашай мадэлі ўзмацняе морфогенетический працэс і эфектыўнасць прымацавання клетак. Эндотелиальный пласт (г.зн. капіляры або лімфатычныя рэчывы) гуляе важную ролю ў рэгуляцыі малекулярнага транспарту 39 і вярбоўкі імунных клетак 40 у кішачніку. мікраасяроддзе. Акрамя таго, кампаненты сасудзістай сеткі, якія можна злучыць паміж мадэлямі тканін, з'яўляюцца неабходнай умовай, калі мадэлі тканін распрацаваны для дэманстрацыі ўзаемадзеяння некалькіх органаў. Такім чынам, можа спатрэбіцца ўключэнне эндотелиальных клетак для мадэлявання больш дакладных фізіялагічных характарыстык з дазволам на ўзроўні органаў. Імунныя клеткі, атрыманыя ад пацыента, таксама неабходныя для дэманстрацыі прыроджаных імунных рэакцый, прэзентацыі антыгена, прыроджаных адаптыўных імунных перакрыжаваных перашкод і тканкаспецыфічных перашкод. c імунітэтам у кантэксце імітацыі кішачнага захворвання.
Выкарыстанне гібрыдных чыпаў больш простае, чым "кішачнік на чыпе", таму што ўстаноўка прылады прасцейшая, а выкарыстанне ўставак Transwell дазваляе маштабаваць культуру кішачнага эпітэлія. Аднак даступныя ў продажы ўстаўкі Transwell з поліэфірнымі мембранамі не з'яўляюцца эластычнымі і не могуць імітаваць перистальтические рухі. Акрамя таго, апікальнае аддзяленне ўстаўкі Transwell, змешчанай у гібрыдны чып, заставалася нерухомым. нагрузка на апікальным баку. Відавочна, што статычныя ўласцівасці ў апікальным аддзеле рэдка дазваляюць доўгатэрміновае сумеснае культываванне бактэрый у гібрыдных чыпах. Нягледзячы на ​​тое, што мы можам надзейна індукаваць 3D-марфагенез ва ўстаўках Transwell пры выкарыстанні гібрыдных чыпаў, недахоп фізіялагічна рэлевантнай біямеханікі і апікальнага патоку вадкасці можа абмежаваць магчымасці выкарыстання платформ гібрыдных чыпаў для патэнцыйнага прымянення.
Поўнамаштабная рэканструкцыя восі крыпта-варсінка чалавека ў культурах "кішачнік-на-чыпе" і "гібрыд-на-чыпе" не была цалкам створана. Паколькі марфагенез пачынаецца з эпітэліяльнага аднаслаёвага пласта, 3D-мікраархітэктуры не абавязкова забяспечваюць марфалагічнае падабенства з крыптамі in vivo. Хоць мы ахарактарызавалі папуляцыю праліферуючых клетак каля базальнага дамена крыпты ў мікрарухавіку У трохмерным эпітэліі крыпта і варсінкі не былі выразна размежаваны. Хоць больш высокія верхнія каналы на чыпе прыводзяць да павелічэння вышыні мікраінжынернага эпітэлія, максімальная вышыня па-ранейшаму абмежаваная ~300–400 мкм. Фактычная глыбіня кішачных крыпт чалавека ў тонкім і тоўстым кішачніку складае ~135 мкм і ~400 мкм адпаведна, а вышыня варсінкі тонкай кішкі складаюць ~600 мкм41.
З пункту гледжання візуалізацыі, візуалізацыя 3D-мікраархітэктур in situ з звышраздзяленнем можа быць абмежавана "нутром на чыпе", паколькі неабходная рабочая адлегласць ад лінзы аб'ектыва да эпітэліяльнага пласта складае парадку некалькіх міліметраў. Каб пераадолець гэтую праблему, можа спатрэбіцца аддалены аб'ектыў. Акрамя таго, выраб тонкіх зрэзаў для падрыхтоўкі ўзору візуалізацыі з'яўляецца складанай задачай з-за высокай эластычнасці PDMS. Акрамя таго, паколькі папластовае мікрафабрыкаванне кішачніка на чыпе прадугледжвае пастаянную адгезію паміж кожным пластом, надзвычай складана адкрыць або выдаліць верхні пласт, каб даследаваць структуру паверхні эпітэліяльнага пласта. Напрыклад, з дапамогай сканавальнага электроннага мікраскопа (SEM).
Гідрафобнасць PDMS была абмежавальным фактарам у мікрафлюідных даследаваннях, прысвечаных гідрафобным малым малекулам, паколькі PDMS можа неспецыфічна адсарбаваць такія гідрафобныя малекулы. Альтэрнатыву PDMS можна разглядаць з іншымі палімернымі матэрыяламі. У якасці альтэрнатывы можна разглядаць мадыфікацыю паверхні PDMS (напрыклад, пакрыццё ліпафільнымі матэрыяламі 42 або полі(этыленгліколь) 43) для мінімізацыі адсорбцыі гідрафобных малекул.
Нарэшце, наш метад не быў добра ахарактарызаваны з пункту гледжання забеспячэння высокапрадукцыйнага скрынінга або «ўніверсальнай» зручнай эксперыментальнай платформы. Цяперашні пратакол патрабуе шпрыцавага помпы на кожную мікрапрыладу, якая займае месца ў CO2-інкубатары і прадухіляе буйнамаштабныя эксперыменты. Гэта абмежаванне можа быць значна палепшана за кошт маштабаванасці інавацыйных фарматаў культуры (напрыклад, 24-лункавы, 96-лункавы або 384-лункавы). добра порыстыя ўстаўкі, якія дазваляюць пастаянна папаўняць і выдаляць базолатеральную сераду).
Каб выклікаць трохмерны марфагенез кішачнага эпітэлія чалавека in vitro, мы выкарысталі мікрафлюідны чып для кішачніка, які змяшчае два паралельныя мікраканалы і эластычную кіпрую мембрану паміж імі, каб стварыць інтэрфейс прасвет-капіляр. Мы таксама дэманструем выкарыстанне аднаканальнага мікрафлюіднага прылады (гібрыдны чып), які забяспечвае бесперапынны базалатэральны паток пад палярызаванымі эпітэліяльнымі пластамі, вырашчанымі на ўстаўках Transwell. На абедзвюх платформах можна прадэманстраваць марфагенез розных эпітэліяльных клетак кішачніка чалавека шляхам прымянення накіраванай маніпуляцыі патокам для выдалення антаганістаў марфогена з базолатерального аддзела. Уся эксперыментальная працэдура (малюнак 1) складаецца з пяці частак: (i) мікравытворчасць кішачнага чыпа або ўстаўляльнага гібрыднага чыпа Transwell (этапы 1-5; поле 1), (ii) падрыхтоўка эпітэліяльныя клеткі кішачніка (клеткі Caco-2) або арганоіды кішачніка чалавека;скрынкі 2-5), (iii) культура кішачных эпітэліяльных клетак на кішачных чыпах або гібрыдных чыпах (этапы 6-9), (iv) індукцыя трохмернага марфагенезу in vitro (этап 10) і (v) ), каб ахарактарызаваць трохмерную эпітэліяльную мікраструктуру (этапы 11-24). Нарэшце, адпаведная кантрольная група (разгледжаная ніжэй) была створана для праверкі эфектыўнасць марфагенезу in vitro шляхам параўнання эпітэліяльнага марфагенезу з прасторавым, часавым, умоўным або працэдурным кантролем.
Мы выкарысталі дзве розныя культуральныя платформы: кішачнік на чыпе з прамымі каналамі або нелінейнымі звілістымі каналамі, або гібрыдныя чыпы, якія змяшчаюць устаўкі Transwell (TW) у мікрафлюідным прыладзе, вырабленыя, як апісана ў Рамцы 1, і крок 1-5. «Выраб прылады» паказвае асноўныя этапы стварэння аднаго чыпа або гібрыднага чыпа. «Культура эпітэліяльных клетак кішачніка чалавека» тлумачыць крыніцу клетак. (Caco-2 або кішачныя арганоіды чалавека) і працэдура культывавання, якая выкарыстоўваецца ў гэтым пратаколе. «Марфагенез in vitro» паказвае агульныя этапы, на якіх Caco-2 або атрыманыя з арганоідаў эпітэліяльныя клеткі культывуюцца на кішачным чыпе або на ўстаўках Transwell гібрыднага чыпа з наступнай індукцыяй трохмернага марфагенезу і фарміраваннем характэрнай эпітэліяльнай структуры. Нумар кроку праграмы або нумар поля паказаны ніжэй кожная стрэлка. Дадатак змяшчае прыклады таго, як можна выкарыстоўваць усталяваныя слаі кішачнага эпітэлія, напрыклад, для характарыстыкі дыферэнцыяцыі клетак, фізіялагічных даследаванняў кішачніка, стварэння экасістэм мікрабіёма гаспадара і мадэлявання захворвання. Імунафлюарэсцэнтныя выявы ў раздзеле «Дыферэнцыяцыя клетак», якія паказваюць ядра, F-актын і MUC2, экспрэсіраваныя ў 3D эпітэліяльным слоі Caco-2, які ствараецца ў кішачніку. чып. Сігналізацыя MUC2 прысутнічае ў бокаловидных клетках і слізі, якая вылучаецца з паверхняў слізістых абалонак. Флуарэсцэнтныя выявы ў Gut Physiology паказваюць слізь, якая ўтвараецца ў выніку афарбоўвання на рэшткі сіялавай кіслаты і N-ацэтылглюкозаміну з выкарыстаннем флуоресцентного аглютыніну зародкаў пшаніцы. Два перакрываючыяся выявы ў «Сумесных культурах гаспадара і мікраба» паказваюць рэпрэзентатыўныя сумесныя культуры гаспадара і мікрабіёма ў кішачніку. чып. На левай панэлі паказана сумесная культура кішачнай палачкі, якая экспрэсіруе зялёны флуарэсцэнтны бялок (GFP), з мікраінжынернымі 3D Caco-2 эпітэліяльнымі клеткамі. Правая панэль паказвае лакалізацыю GFP E. coli, сумесна культываваную з 3D Caco-2 эпітэліяльнымі клеткамі, з наступным імунафлюарэсцэнтным афарбоўваннем F-акцінам (чырвоны) і ядрамі (сіні). Мадэляванне захворвання ілюструе здаровыя у параўнанні з дзіравай кішкай у мікрасхемах запалення кішачніка пры фізіялагічным заражэнні бактэрыяльнымі антыгенамі (напрыклад, ліпапаліцукрыдам, ЛПС) і імуннымі клеткамі (напрыклад, PBMC;зялёны). Клеткі Caco-2 культывавалі для стварэння трохмернага эпітэліяльнага пласта. Маштабная паласа, 50 мкм. Выявы ў ніжнім радку: «Дыферэнцыяцыя клетак», адаптаваная з дазволу спасылкі. 2.Oxford University Press;Прайгравана з дазволу Ref.5.NAS;«Сумесная культура гаспадара і мікроба» адаптавана з дазволу ref.3.NAS;«Мадэляванне хваробы» адаптавана з дазволу reference.5.НАН.
І чыпы «кішка-на-чыпе», і гібрыдныя чыпы былі выраблены з выкарыстаннем копій PDMS, якія былі вынятыя з крамянёвых формаў з дапамогай мяккай літаграфіі1,44 і нанесеныя на малюнак SU-8. Дызайн мікраканалаў у кожным чыпе вызначаецца з улікам гідрадынамікі, такой як напружанне зруху і гідрадынамічны ціск1,4,12. Арыгінальная канструкцыя «кішка-на-чыпе» (Пашыраныя дадзеныя, мал. 1а), якая складалася з з двух размешчаных побач паралельных прамых мікраканалаў, ператварыўся ў складаную кішку на чыпе (Пашыраныя дадзеныя, мал. 1b), якая ўключае пару выгнутых мікраканалаў для індукцыі павялічанага часу знаходжання вадкасці, нелінейных патэрнаў патоку і шматвосевай дэфармацыі культывуемых клетак (мал. 2a–f). Можна выбраць t-on-a-чыпы. Мы прадэманстравалі, што закручаны Gut-Chip таксама моцна індукуе 3D-марфагенез у аналагічны перыяд часу з такой жа ступенню росту эпітэлія ў параўнанні з зыходным Gut-Chip, незалежна ад тыпу культывуемых клетак. Такім чынам, каб выклікаць 3D-марфагенез, лінейныя і складаныя канструкцыі кішачніка на чыпе ўзаемазаменныя. Рэплікі PDMS, адверджаныя на молі крэмнія ds з узорамі SU-8 далі негатыўныя характарыстыкі пасля дэфармацыі (мал.2a). Каб вырабіць кішачнік на чыпе, падрыхтаваны верхні пласт PDMS паслядоўна злучалі з кіпрай плёнкай PDMS, а затым выраўноўвалі з ніжнім пластом PDMS шляхам незваротнага злучэння з выкарыстаннем кароннага апрацоўшчыка (мал. 2b–f). Каб вырабіць гібрыдныя чыпы, копіі зацвярдзелых PDMS былі прымацаваны да прадметных шклоў для стварэння аднаканальных мікрафлюідных прылад, якія маглі б прыняць мадыфікаваць устаўкі Transwell (мал. 2h і пашыраныя дадзеныя, мал. 2). Працэс злучэння выконваецца шляхам апрацоўкі паверхняў копіі PDMS і шкла кіслароднай плазмай або кароннай апрацоўкай. Пасля стэрылізацыі мікрафабрыкаванага прылады, прымацаванага да сіліконавай трубкі, устаноўка прылады была гатовая да выканання трохмернага марфагенезу кішачнага эпітэлія (малюнак 2g).
a, Схематычная ілюстрацыя падрыхтоўкі дэталяў PDMS з узорных крамянёвых формаў SU-8. Неотвержденный раствор PDMS быў выліты ў крамянёвую форму (злева), адверджаны пры 60 °C (у сярэдзіне) і выняты з формы (справа). Выняты PDMS быў разрэзаны на часткі і ачышчаны для далейшага выкарыстання. b, Фатаграфія крамянёвай формы, якая выкарыстоўвалася для падрыхтоўкі верхняга пласта PDMS.c, Фатаграфія крамянёвай формы. d, які выкарыстоўваецца для вырабу кіпрай мембраны PDMS.d, серыя фатаграфій верхніх і ніжніх кампанентаў PDMS і сабранага кішачнага прылады на чыпе.e, схема выраўноўвання верхняга, мембраннага і ніжняга кампанентаў PDMS.Кожны пласт незваротна злучаецца плазменнай або кароннай апрацоўкай.f, схема вырабленага прылады "кішачнік-на-чыпе" з накладзеным сагнутым мікраканалам nels and vacuum chambers.g, Наладжванне кішачніка на чыпе для мікрафлюіднай клетачнай культуры. Вырабленая кішка на чыпе, сабраная з сіліконавай трубкі і шпрыца, была змешчана на покрыўнае шкло. Чып быў змешчаны на вечка 150-міліметровай чашкі Петры для апрацоўкі. Звязальнае выкарыстоўваецца для закрыцця сіліконавай трубкі.h, Візуальныя здымкі вырабу гібрыднага чыпа і 3D-марфагенез з выкарыстаннем гібрыдных чыпаў. Устаўкі Transwell, падрыхтаваныя незалежна для культывавання 2D-манаслояў эпітэліяльных клетак кішачніка, былі ўстаўлены ў гібрыдны чып для індукцыі 3D-марфагенезу ў кішачніку. Асяроддзе працякае праз мікраканалы пад пластом клетак, усталяваным на ўстаўцы Transwell. Маштабная паласа, 1 см. ч. Друкуецца з дазволу спасылкі.4.Elsevier.
У гэтым пратаколе клеткавая лінія Caco-2 і кішачныя арганоіды выкарыстоўваліся ў якасці эпітэліяльных крыніц (мал. 3a). Абодва тыпы клетак культываваліся незалежна (Box 2 і Box 5) і выкарыстоўваліся для засявання пакрытых ECM мікраканалаў кішачніка на чыпе або ўставак Transwell. Калі клеткі зліваюцца (>95% пакрыцця ў колбах), звычайна культывуюцца клеткі Caco-2 (паміж пасажамі). 10 і 50) у Т-колбах збіраюць для падрыхтоўкі суспензіі дысацыяваных клетак шляхам трыпсінізацыі вадкасці (полка 2). Кішэчныя арганоіды чалавека з біяпсіі кішачніка або хірургічных рэзекцый культывавалі ў купалах матрыгеля ў 24-лункавых пласцінах для падтрымання структурнага мікраасяроддзя. Асяроддзе, якое змяшчае асноўныя марфагены (такія як Wnt, R-спондын і No ggin) і фактары росту, прыгатаваныя, як апісана ў Рамцы 3, дабаўлялі праз дзень, пакуль арганоіды не выраслі да ~500 мкм у дыяметры. Цалкам выраслі арганоіды збіраюць і разбіваюць на асобныя клеткі для пасеву ў кішачнік або ўстаўкі Transwell на чып (Рок 5). Як мы паведамлялі раней, гэта можна дыферэнцаваць у залежнасці ад тыпу захворвання 12, 13 (напрыклад, язвавы каліт, хвароба Крона, карэкцыя рак або нармальны донар), месца паразы (напрыклад, паражэнне ў параўнанні з вобласцю без паразы) і размяшчэнне ў страўнікава-кішачным тракце (напрыклад, дванаццаціперсная кішка, худая кішка, падуздышная кішка, сляпая кішка, тоўстая кішка або прамая кішка). Мы прапануем аптымізаваны пратакол у Рамцы 5 для культывавання арганоідаў тоўстай кішкі (калоідаў), якія звычайна патрабуюць больш высокіх канцэнтрацый марфагенаў, чым арганоідаў тонкай кішкі.
a, Рабочы працэс для індукцыі марфагенезу кішачніка ў чыпе кішачніка. Кішачны эпітэлій чалавека і арганоіды кішачніка Caco-2 выкарыстоўваюцца ў гэтым пратаколе для дэманстрацыі 3D-марфагенезу. Ізаляваныя эпітэліяльныя клеткі былі высеяны ў падрыхтаваную прыладу "кішачнік на чыпе" (падрыхтоўка чыпа). сітаватая мембрана ў дзень 0 (D0), апікальны (AP) паток ініцыюецца і падтрымліваецца на працягу першых 2 дзён (паток, AP, D0-D2). Базалатэральны (BL) паток таксама ініцыюецца разам з цыклічнымі рухамі расцяжэння (расцяжэнне, паток, AP і BL), калі ўтворыцца поўны 2D-манаслой. Кішачны 3D-марфагенез адбыўся спантанна пасля 5 дзён мікрафлюіднай культуры (марфагенез, D 5). Выявы з фазавым кантрастам паказваюць рэпрэзентатыўную марфалогію клетак Caco-2 на кожным этапе эксперыменту або ў момант часу (гістограма, 100 мкм). Чатыры схематычныя дыяграмы, якія ілюструюць адпаведныя каскады марфагенезу кішачніка (справа ўверсе). Пункцірныя стрэлкі на схеме паказваюць кірунак патоку вадкасці. b, SEM-малюнак, які паказвае тапалогію паверхні ўсталяванага трохмернага эпітэлія Caco-2 (злева). Устаўка вылучана павялічаная вобласць (белая пункцірная рамка) паказвае рэгенераваныя мікраворсінкі на 3D-слоі Caco-2 (справа).c, Гарызантальны выгляд спераду ўстаноўленага Caco-2 3D, клаудзіна (ZO-1, чырвоны) і бесперапыннай пэндзлявай аблямоўкі мембран, пазначаных F-актынам (зялёны) і ядрамі (сіні) Канфакальная візуалізацыя імунафлюарэсцэнцыі эпітэліяльных клетак на чыпах кішачніка. Стрэлкі, якія паказваюць на сярэдняй схеме пазначаюць размяшчэнне факальнай плоскасці для кожнага канфакальнага выгляду.d, Час марфалагічных змен у арганоідах, культывуемых на чыпе, атрыманым з дапамогай фазава-кантрастнай мікраскапіі ў дні 3, 7, 9, 11 і 13. Устаўка (уверсе справа) паказвае высокае павелічэнне прадстаўленага малюнка.e, DIC-мікрафатаграфія арганоіда 3D эпітэлія, створанага ў кішачніку на зрэзе, зробленым на 7 дзень.f, За закладзены імунафлюарэсцэнтныя выявы, якія паказваюць маркеры ствалавых клетак (LGR5;пурпурны), бокаловидные клеткі (MUC2; зялёны), F-актын (шэры) і ядра (блакітныя), вырашчаныя на кішачных чыпах на працягу 3 дзён, адпаведна (злева) і 13-дзённых (пасярэдзіне) арганоідаў на эпітэліяльным пласце. Глядзіце таксама пашыраныя дадзеныя, малюнак 3, на якім вылучана сігналізацыя LGR5 без сігналізацыі MUC2. Флуарэсцэнтныя выявы, якія паказваюць эпітэліяльную мікраструктуру (справа) 3D-органа падобны эпітэлій, усталяваны ў кішачніку на чыпе шляхам афарбоўвання плазматычнай мембраны фарбавальнікам CellMask (справа) на 13 дзень культывавання. Маштабная паласа складае 50 мкм, калі не пазначана іншае.b Друкуецца з дазволу спасылкі.2.Oxford University Press;c Адаптавана з дазволу Reference.2.Oxford University Press;e і f адаптаваны з дазволу па спасылцы.12 У адпаведнасці з ліцэнзіяй Creative Commons CC BY 4.0.
У кішачніку на чыпе неабходна змяніць гідрафобную паверхню кіпрай мембраны PDMS для паспяховага нанясення ECM-пакрыцця. У гэтым пратаколе мы прымяняем два розныя метады для змены гідрафобнасці мембран PDMS. Для культывавання клетак Caco-2 толькі актывацыі паверхні апрацоўкай УФ/азонам было дастаткова, каб паменшыць гідрафобнасць паверхні PDMS, пакрыць ECM і прымацаваць клеткі Caco-2 да мембраны PDMS. .Аднак мікрафлюідная культура эпітэлія-арганоіда патрабуе хімічнай функцыяналізацыі паверхні для дасягнення эфектыўнага адкладу бялкоў ECM шляхам паслядоўнага нанясення поліэтыленіміну (PEI) і глутаральдэгіду на мікраканалы PDMS. Пасля мадыфікацыі паверхні вавёркі ECM асадзілі, каб пакрыць функцыяналізаваную паверхню PDMS, а затым увялі ў ізаляваны эпітэлій-арганоід. Пасля прымацавання клетак пачынаецца мікражидкостная культура клетак. шляхам перфузіі толькі асяроддзя ў верхні мікраканал, пакуль клеткі не ўтвораць поўны аднаслаёвы пласт, у той час як ніжні мікраканал падтрымлівае статычныя ўмовы. Гэты аптымізаваны метад актывацыі паверхні і пакрыцця ECM дазваляе прымацоўваць арганоідны эпітэлій для індукцыі трохмернага марфагенезу на паверхні PDMS.
Трансвеллавыя культуры таксама патрабуюць пакрыцця ECM перад пасевам клетак;аднак культуры Transwell не патрабуюць складаных этапаў папярэдняй апрацоўкі для актывацыі паверхні порыстых уставак. Для вырошчвання клетак Caco-2 на ўстаўках Transwell пакрыццё ECM на порыстых устаўках паскарае прымацаванне дысацыяваных клетак Caco-2 (<1 гадзіны) і фарміраванне бар'ера шчыльнага злучэння (<1-2 дзён). Для культывавання арганоідаў на ўстаўках Transwell ізаляваныя арганоіды высейваюць на ўстаўкі з паверхняй ECM, прымацаваныя да мембраны. (<3 ч) і вытрымлівалі да таго часу, пакуль арганоіды не ўтвораць поўны монаслой з цэласнасцю бар'ера. Трансвеллавыя культуры праводзяцца ў 24-лункавых пласцінах без выкарыстання гібрыдных чыпаў.
3D-марфагенез in vitro можа быць ініцыяваны шляхам прымянення патоку вадкасці да базолатеральной частцы ўсталяванага эпітэліяльнага пласта. У кішачніку на чыпе эпітэліяльны марфагенез пачаўся, калі асяроддзе перфузировали ў верхні і ніжні мікраканалы (мал. 3a). Як было апісана раней, вельмі важна ўвесці паток вадкасці ў ніжні (базалатеральный) аддзел для бесперапыннага выдалення накіраваных інгібітараў марфогена. .Каб забяспечыць дастатковую колькасць пажыўных рэчываў і сыроваткі для клетак, звязаных з кіпрымі мембранамі, і стварыць напружанне зруху ў прасвете, мы звычайна ўжываем двайны паток у кішачніку на чыпе. У гібрыдных чыпах у гібрыдныя чыпы ўстаўлялі ўстаўкі Transwell, якія змяшчаюць эпітэліяльныя аднаслаёвыя пласты. Затым асяроддзе наносілі пад базалатэральны бок порыстай устаўкі Transwell праз мікраканал. Адбываўся марфагенез кішачніка 3 -5 дзён пасля пачатку базолатерального патоку ў абедзвюх культуральных платформах.
Марфалагічныя характарыстыкі мікраінжынерных трохмерных эпітэліяльных слаёў можна прааналізаваць з дапамогай розных метадаў візуалізацыі, уключаючы мікраскапію з фазавым кантрастам, мікраскапію з дыферэнцыяльным інтэрферэнцыйным кантрастам (DIC), SEM або імунафлюарэсцэнтную канфакальную мікраскапію (малюнкі 3 і 4). Фазавы кантраст або візуалізацыю з ДВС-кантрастам можна лёгка выканаць у любы час падчас культывавання для маніторынгу формы і выступу трохмерных слаёў эпітэлія.D Дзякуючы аптычнай празрыстасці плёнак PDMS і поліэфірных плёнак, платформы «кішачнік-на-чыпе» і гібрыдныя чыпы могуць забяспечваць візуалізацыю на месцы ў рэжыме рэальнага часу без неабходнасці разрэзу або разборкі прылады. Пры выкананні імунафлюарэсцэнтнай візуалізацыі (малюнкі 1, 3c, f і 4b, c) клеткі звычайна фіксуюць 4% (вага/аб'ём) парафармальдэгідам ( PFA), затым Triton X-100 і 2% (мас./аб.) бычынага сыроватачна альбуміна (BSA), па парадку. У залежнасці ад тыпу клеткі можна выкарыстоўваць розныя фіксатары, пермеабілізатары і блакіроўшчыкі. Першасныя антыцелы, накіраваныя на маркеры клетак або рэгіёнаў, якія залежаць ад роду, выкарыстоўваюцца для вылучэння клетак, імабілізаваных in situ на чыпе, а затым другасныя антыцелы разам з фарбавальнікам, накіраваным на адно з ядраў. нас (напрыклад, 4',6-дыямідзіна-2-фенілен) індол, DAPI) або F-актын (напрыклад, флуарэсцэнтна пазначаны фаллоідзін). Жывая візуалізацыя на аснове флуарэсцэнцыі таксама можа быць выканана in situ для выяўлення адукацыі слізі (мал.1, «Дыферэнцыяцыя клетак» і «Фізіялогія кішачніка»), выпадковая каланізацыя мікробных клетак (мал. 1, «Сумесная культура гаспадара і мікроба»), вярбоўка імунных клетак (мал. 1, «Мадэляванне захворвання») або контуры трохмернай марфалогіі эпітэлія (мал. 3c,f і 4b,c). Пры мадыфікацыі кішачніка на чып для аддзялення верхняга пласта ад ніжняга пласта мікраканалаў, як апісана ў спасылцы. Як паказана на мал. 2, трохмерная эпітэліяльная марфалогія, а таксама мікраварсінкі на апікальным краі пэндзля могуць быць візуалізаваны з дапамогай SEM (мал. 3b). Экспрэсію маркераў дыферэнцыяцыі можна ацаніць, выконваючы колькасную ПЦР5 або секвенирование аднаклеткавай РНК. У гэтым выпадку трохмерныя пласты эпітэліяльных клетак растуць n у кішачніку чыпсы або гібрыдныя чыпсы збіраюць трыпсінізацыяй і затым выкарыстоўваюць для малекулярнага або генетычнага аналізу.
a, Рабочы працэс для індукцыі кішачнага марфагенезу ў гібрыдным чыпе. Caco-2 і кішачныя арганоіды выкарыстоўваюцца ў гэтым пратаколе для дэманстрацыі 3D-марфагенезу ў платформе гібрыднага чыпа. Дысацыяваныя эпітэліяльныя клеткі былі высеяны ў падрыхтаваныя ўстаўкі Transwell (TW prep; гл. малюнак ніжэй). Пасля таго, як клеткі былі высеяны (высеяны) і прымацаваны да поліэфірных мембран у Устаўкі Transwell, усе клеткі культываваліся ў статычных умовах (культура TW). Праз 7 дзён адна ўстаўка Transwell, якая змяшчае 2D-манаслой эпітэліяльных клетак, была інтэграваная ў гібрыдны чып для ўвядзення базолатерального патоку (Flow, BL), што ў канчатковым выніку прывяло да стварэння 3D-эпітэліяльнага пласта (марфагенез). Мікрафатаграфіі з фазавым кантрастам, якія паказваюць марфалагічныя асаблівасці эпітэліяльных клетак органаў чалавека, атрыманых з нармальны донар (лінія C103) узыходзячая тоўстая кішка на кожным эксперыментальным этапе або ў момант часу. Схемы ў верхніх пластах ілюструюць эксперыментальную канфігурацыю для кожнага этапу.b Гібрыдныя чыпы (схема злева) могуць прывесці да трохмернага марфагенезу арганоідных эпітэліяльных клетак з канфакальнай мікраскапіяй зверху ўніз, зробленай у розных пазіцыях Z (верхняя, сярэдняя і ніжняя);гл. схему справа і адпаведныя пункцірныя лініі).дэманструе відавочныя марфалагічныя характарыстыкі. F-актын (блакітны), ядро ​​(шэры).c, канфакальныя мікрафатаграфіі флуарэсцэнцыі (3D пад вуглом) эпітэліяльных клетак, атрыманых з арганоідаў, культываваных у статычным Transwell (TW; устаўка ў белым пункцірным полі) у параўнанні з гібрыдным чыпам (самы вялікі поўны здымак), параўноўваючы 2D і 3D марфалогію адпаведна. Пара 2D вертыкальных перакрыжаваных разрэзы (устаўка ў правым верхнім куце; «XZ») таксама паказваюць 2D і 3D асаблівасці. Маштабная панэль, 100 мкм.c Друкуецца з дазволу спасылкі.4.Elsevier.
Кантролі можна прыгатаваць шляхам культывавання тых жа клетак (Caco-2 або эпітэліяльных клетак кішачнага арганоіда) у двухмерныя аднаслойныя пласты ў звычайных статычных умовах культывавання. У прыватнасці, знясіленне пажыўных рэчываў можа адбыцца з-за абмежаванага аб'ёму мікраканалаў (г.зн. ~4 мкл у верхнім канале на арыгінальнай канструкцыі кішачнага чыпа). у параўнанні.
Працэс мяккай літаграфіі павінен выконвацца ў чыстым памяшканні. Для кожнага пласта чыпа (верхняга і ніжняга слаёў і мембран) і гібрыдных чыпаў выкарыстоўваліся розныя фоташаблоны, вырабленыя на асобных крамянёвых пласцінах, таму што вышыня мікраканалаў адрознівалася. Мэтавая вышыня верхніх і ніжніх мікраканалаў кішачніка на чыпе складае 500 мкм і 200 мкм адпаведна. Мэтавы канал вышыня гібрыднага чыпа складае 200 мкм.
Змесціце 3-цалевую крамянёвую пласціну ў посуд з ацэтонам. Акуратна пакруціце пласціну на працягу 30 секунд, затым высушыце пласціну на паветры. Перакладзеце пласціну на талерку з IPA, затым круціце пласціну на працягу 30 секунд, каб ачысціць.
Раствор піранні (сумесь перакісу вадароду і канцэнтраванай сернай кіслаты, 1:3 (аб'ём/аб'ём)) можна дадаткова выкарыстоўваць для максімальнага выдалення арганічных рэшткаў з паверхні крамянёвай пласціны.
Раствор Piranha вельмі агрэсіўны і вылучае цяпло. Неабходныя дадатковыя меры бяспекі. Для ўтылізацыі адходаў дайце раствору астыць і пераліце ​​яго ў чысты, сухі кантэйнер для смецця. Выкарыстоўвайце другасныя кантэйнеры і належным чынам маркіруйце кантэйнеры для смецця. Калі ласка, прытрымлівайцеся рэкамендацый па тэхніцы бяспекі, каб атрымаць больш падрабязныя працэдуры.
Абязводжваюць пласціны, змясціўшы іх на пліту з тэмпературай 200 °C на 10 хвілін. Пасля дэгідратаціі пласціны пяць разоў страсянуць на паветры для астывання.
Наліце ​​~10 г фотарэзіста SU-8 2100 на цэнтр вычышчанай крэмніевай пласціны. Выкарыстоўвайце пінцэт, каб раўнамерна размеркаваць фотарэзіст на пласціне. Час ад часу кладзіце пласціну на нагрэтую да 65°C пліту, каб зрабіць фотарэзіст менш ліпкім і лягчэй намазвацца. Не кладзіце пласціну непасрэдна на гарачую пліту.
SU-8 быў раўнамерна размеркаваны на пласціне шляхам нанясення пакрыцця спінінгам. Запраграмуйце ўваходнае кручэнне SU-8 на працягу 5–10 с для распаўсюджвання з хуткасцю 500 абаротаў у хвіліну пры паскарэнні 100 абаротаў у хвіліну/с. Усталюйце асноўнае кручэнне для нанясення ўзору таўшчынёй 200 мкм пры 1500 абаротах у хвіліну або дасягніце таўшчыні 250 мкм (робячы вышыню 500 мкм). для верхняга пласта кішачніка на чыпе; гл. «Важныя крокі» ніжэй) усталяваць паскарэнне 300 абаротаў у хвіліну/с 30 секунд пры 1200 абаротаў у хвіліну.
Асноўную хуткасць адціску можна рэгуляваць у адпаведнасці з зададзенай таўшчынёй малюнка SU-8 на крамянёвай пласціне.
Каб вырабіць малюнкі SU-8 вышынёй 500 мкм для верхняга пласта кішачніка на чыпе, этапы нанясення спінінга і мяккага запякання гэтай скрынкі (этапы 7 і 8) паслядоўна паўтараліся (гл. крок 9), каб атрымаць два пласта таўшчынёй 250 мкм. Тоўсты пласт SU-8, які можа быць нанесены пластамі і злучаны ўльтрафіялетавым апрамяненнем на этапе 12 гэтай скрынкі, атрымаўшы пласт 500 мкм вышынёй.
Мякка выпякайце вафлі з пакрыццём SU-8, асцярожна змясціўшы вафлі на гарачую пліту пры тэмпературы 65 °C на 5 хвілін, затым пераключыце наладу на 95 °C і інкубуйце яшчэ 40 хвілін.
Для дасягнення вышыні малюнка SU-8 у верхнім мікраканале 500 мкм паўтарыце крокі 7 і 8 для стварэння двух слаёў SU-8 таўшчынёй 250 мкм.
Выкарыстоўваючы UV Mask Aligner, правядзіце тэст лямпай у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы, каб разлічыць час экспазіцыі пласціны. (час экспазіцыі, мс) = (доза экспазіцыі, мДж/см2)/(магутнасць лямпы, мВт/см2).
Пасля вызначэння часу экспазіцыі пакласці фоташаблон на маскодержатель УФ-маскаэклайнера і пакласці фоташаблон на пласціну з пакрыццём СУ-8.
Размесціце надрукаваную паверхню фоташаблона непасрэдна на баку крамянёвай пласціны з пакрыццём SU-8, каб мінімізаваць рассейванне УФ-прамянёў.
Падвяргайце пласціну з пакрыццём SU-8 і фоташаблон вертыкальна ўздзеянню ультрафіялетавага святла 260 мДж/см2 на загадзя зададзены час экспазіцыі (гл. крок 10 гэтай скрынкі).
Пасля ўздзеяння ультрафіялетам крамянёвыя пласціны з пакрыццём SU-8 выпякаліся пры 65°C на працягу 5 хвілін і 95°C на працягу 15 хвілін на кожнай гарачай пліце для вырабу ўзораў вышынёй 200 мкм. Павялічце час пасля выпякання пры 95 °C да 30 хвілін для вырабу ўзораў вышынёй 500 мкм.
Праяўляльнік наліваецца ў шкляны посуд, і выпечаная вафля змяшчаецца ў посуд. Аб'ём праяўляльніка SU-8 можа вар'іравацца ў залежнасці ад памеру шкляной пласціны. Пераканайцеся, што выкарысталі дастатковую колькасць праяўляльніка SU-8, каб цалкам выдаліць неэкспонаваны SU-8. Напрыклад, калі выкарыстоўваеце шкляны посуд дыяметрам 150 мм і ёмістасцю 1 л, выкарыстоўвайце ~300 мл праяўляльніка SU-8. Праяўляйце форму на працягу 25 хвілін, перыядычна асцярожна кручэнне.
Прамыйце развітую форму ~10 мл свежага праяўляльніка, а затым IPA, распыляючы раствор з дапамогай піпеткі.
Змесціце пласціну ў плазменны ачышчальнік і падвяргайце ўздзеянню кіслароднай плазмы (атмасферны газ, мэтавы ціск 1 × 10−5 Torr, магутнасць 125 Вт) на працягу 1,5 хвілін.
Змесціце пласціны ў вакуумны эксікатар з прадметным шклом унутры. Пласціны і прадметныя шкла можна размясціць побач. Калі вакуумны эксікатар падзелены на некалькі слаёў пласцінай, змесціце прадметныя шкла ў ніжнюю камеру, а пласціны - у верхнюю камеру. Капніце на шклянку 100 мкл раствора трыхлара(1Н, 1Н, 2Н, 2Н-перфтароктыл)сілану. слайд і прымяніць вакуум для силанизации.
Размарозьце флакон з замарожанымі клеткамі Caco-2 на вадзяной лазні пры 37 °C, затым перанясіце размарожаныя клеткі ў колбу T75, якая змяшчае 15 мл папярэдне нагрэтай да 37 °C асяроддзя Caco-2.
Каб прапусціць клеткі Caco-2 пры ~90% канфлюэнтнасці, спачатку нагрэйце асяроддзе Caco-2, PBS і 0,25% трыпсінаў/1 мм ЭДТА на вадзяной лазні пры 37°C.
Аспіруйце асяроддзе з дапамогай вакуумнай аспірацыі. Двойчы прамыйце клеткі 5 мл цёплага PBS, паўтарыўшы вакуумную аспірацыю і дадаўшы свежы PBS.