Дзякуй за наведванне Nature.com.Вы выкарыстоўваеце версію браўзера з абмежаванай падтрымкай CSS.Для найлепшага вопыту мы рэкамендуем вам выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer).Акрамя таго, каб забяспечыць пастаянную падтрымку, мы паказваем сайт без стыляў і JavaScript.
Адлюстроўвае карусель з трох слайдаў адначасова.Выкарыстоўвайце кнопкі «Папярэдні» і «Наступны», каб перамяшчацца па трох слайдах адначасова, або выкарыстоўвайце кнопкі паўзунка ў канцы, каб перамяшчацца па трох слайдах адначасова.
Гематоэнцефаліческій бар'ер і гематоэнцефаліческій бар'ер перашкаджаюць біятэрапеўтычным агентам дасягнуць сваіх мэтаў у цэнтральнай нервовай сістэме, тым самым перашкаджаючы эфектыўнаму лячэнню неўралагічных захворванняў.Каб выявіць новыя мазгавыя транспарцёры in vivo, мы прадставілі бібліятэку пептыдаў фага Т7 і серыйна збіралі кроў і спіннамазгавую вадкасць (СМЖ) з дапамогай канюляванай мадэлі пацукоў, якія знаходзяцца ў свядомасці.Спецыфічныя фагавыя клоны былі моцна ўзбагачаны СМЖ пасля чатырох раундаў адбору.Тэставанне асобных пептыдаў-кандыдатаў выявіла больш чым 1000-кратнае ўзбагачэнне СМЖ.Біяактыўнасць апасродкаванай пептыдамі дастаўкі ў мозг была пацверджана зніжэннем на 40% узроўню амилоида-β ў спіннамазгавой вадкасці з дапамогай інгібітару пептыда BACE1, звязанага з выяўленым новым транзітным пептыдам.Гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што пептыды, ідэнтыфікаваныя метадамі адбору фагаў in vivo, могуць быць карыснымі сродкамі для сістэмнай дастаўкі макрамалекул у мозг з тэрапеўтычным эфектам.
Даследаванні таргетнай тэрапіі цэнтральнай нервовай сістэмы (ЦНС) у асноўным сканцэнтраваны на выяўленні аптымізаваных лекаў і агентаў, якія дэманструюць уласцівасці нацэльвання на ЦНС, з меншымі намаганнямі на выяўленні механізмаў, якія кіруюць актыўнай дастаўкай лекаў у мозг.Цяпер гэта пачынае мяняцца, паколькі дастаўка лекаў, асабліва вялікіх малекул, з'яўляецца неад'емнай часткай сучаснай распрацоўкі лекаў у неўралогіі.Навакольнае асяроддзе цэнтральнай нервовай сістэмы добра абаронена сістэмай цэрэбраваскулярнага бар'ера, якая складаецца з гематоэнцефаліческій бар'ера (ГЭБ) ​​і гематоэнцефаліческій бар'ер (ГЭББ)1, што робіць складаным дастаўку лекаў у мозг1,2.Мяркуецца, што амаль усе высокамалекулярныя прэпараты і больш за 98% малых малекул выводзяцца з мозгу3.Таму вельмі важна вызначыць новыя транспартныя сістэмы мозгу, якія забяспечваюць эфектыўную і спецыфічную дастаўку лячэбных прэпаратаў у ЦНС 4,5.Аднак BBB і BCSFB таксама прадстаўляюць выдатную магчымасць для дастаўкі лекаў, паколькі яны пранікаюць і трапляюць ва ўсе структуры мозгу праз яго шырокую сасудзістую сетку.Такім чынам, сучасныя намаганні па выкарыстанні неінвазіўных метадаў дастаўкі ў мозг у значнай ступені заснаваны на механізме рэцэптар-апасродкаванага транспарту (PMT) з выкарыстаннем эндагеннага рэцэптара BBB6.Нягледзячы на ​​​​нядаўнія ключавыя дасягненні з выкарыстаннем шляху рэцэптараў трансферыну 7,8, неабходная далейшая распрацоўка новых сістэм дастаўкі з палепшанымі ўласцівасцямі.З гэтай мэтай нашай мэтай было вызначыць пептыды, здольныя апасродкаваць транспарт СМЖ, паколькі яны ў прынцыпе могуць быць выкарыстаны для дастаўкі макрамалекул у ЦНС або для адкрыцця новых рэцэптарных шляхоў.У прыватнасці, патэнцыйнымі мішэнямі для актыўнай і спецыфічнай дастаўкі біятэрапеўтычных прэпаратаў могуць служыць спецыфічныя рэцэптары і транспарцёры цэрэбраваскулярнай сістэмы (ГЭБ і БСКФБ).Спіннамазгавая вадкасць (СМЖ) з'яўляецца сакраторнай прадуктам судзінкавага спляцення (КС) і знаходзіцца ў непасрэдным кантакце з міжтканкавай вадкасцю галаўнога мозгу праз субарахноидальное прастору і прастору страўнічкаў4.Нядаўна было паказана, што субарахноидальная спіннамазгавая вадкасць празмерна дыфузіюе ў міжсценне галаўнога мозгу9.Мы спадзяемся атрымаць доступ да парэнхіматознага прасторы з дапамогай гэтага субарахноидального ўваходнага гасцінца або непасрэдна праз ГЭБ.Каб дасягнуць гэтага, мы ўкаранілі надзейную стратэгію адбору фагаў in vivo, якая ідэальна вызначае пептыды, якія транспартуюцца любым з гэтых двух розных шляхоў.
Цяпер мы апісваем паслядоўны метад скрынінга фагавага дысплея in vivo з адборам проб СМЖ у спалучэнні з секвенаваннем з высокай прапускной здольнасцю (HTS) для маніторынгу пачатковых раундаў адбору з найбольшай разнастайнасцю бібліятэк.Скрынінг праводзіўся на пацуках у свядомасці з пастаянна імплантаванай канюляй вялікай цыстэрны (CM), каб пазбегнуць заражэння крыві.Важна адзначыць, што гэты падыход выбірае як мазгавыя, так і пептыды з транспартнай актыўнасцю праз цэрэбраваскулярны бар'ер.Мы выкарысталі фагі T7 з-за іх малога памеру (~60 нм)10 і выказалі здагадку, што яны падыходзяць для транспарціроўкі везікул, якія дазваляюць трансцеллюлярное перасячэнне эндотелиального і/або эпітэліяльна-мазгавога бар'ера.Пасля чатырох раундаў пэнінгу былі ізаляваны папуляцыі фагаў, якія дэманструюць моцнае ўзбагачэнне СМЖ in vivo і асацыяцыю мікрасасудаў галаўнога мозгу.Важна адзначыць, што мы змаглі пацвердзіць нашы высновы, прадэманстраваўшы, што пераважныя і хімічна сінтэзаваныя лепшыя пептыды-кандыдаты здольныя транспартаваць бялковы груз у спіннамазгавую вадкасць.Па-першае, фармакадынамічныя эфекты ЦНС былі ўстаноўлены шляхам спалучэння вядучага транзітнага пептыда з інгібітарам пептыда BACE1.У дадатак да дэманстрацыі таго, што функцыянальныя стратэгіі скрынінга in vivo могуць ідэнтыфікаваць новыя транспартныя пептыды мозгу ў якасці эфектыўных носьбітаў бялковага грузу, мы чакаем, што падобныя падыходы функцыянальнага выбару таксама стануць важнымі ў выяўленні новых шляхоў транспарту мозгу.
На аснове блокаў, якія ўтвараюць бляшкі (PFU), пасля этапу ўпакоўкі фага была распрацавана і створана бібліятэка выпадковых 12-мерных лінейных пептыдаў фага T7 з разнастайнасцю прыкладна 109 (гл. Матэрыялы і метады).Важна адзначыць, што мы старанна прааналізавалі гэтую бібліятэку перад панарамаваннем in vivo.ПЦР-ампліфікацыя узораў бібліятэкі фагаў з выкарыстаннем мадыфікаваных праймераў стварыла ампліконы, якія непасрэдна прымяняліся да HTS (дадатковы малюнак 1а).З-за а) памылак секвенирования HTS11, б) уплыву на якасць праймераў (NNK) 1-12 і в) прысутнасці фага дзікага тыпу (wt) (устаўкі шкілета) у рэзервовай бібліятэцы была рэалізавана працэдура фільтрацыі паслядоўнасці, каб атрымаць толькі правераную інфармацыю аб паслядоўнасці (дадатковы малюнак 1b).Гэтыя этапы фільтрацыі прымяняюцца да ўсіх бібліятэк паслядоўнасці HTS.Для стандартнай бібліятэкі было атрымана ў агульнай складанасці 233 868 чытанняў, з якіх 39% прайшлі крытэрыі фільтра і выкарыстоўваліся для аналізу бібліятэкі і адбору для наступных раундаў (дадатковы малюнак 1c–e).Счытванні былі пераважна кратнымі 3 парам асноў у даўжыню з пікам у 36 нуклеатыдаў (дадатковы малюнак 1c), што пацвярджае дызайн бібліятэкі (NNK) 1-12.Характэрна, што прыблізна 11% членаў бібліятэкі ўтрымлівалі 12-мерную асноўную ўстаўку PAGISRELVDKL дзікага тыпу (wt), і амаль палова паслядоўнасцей (49%) утрымлівала ўстаўкі або выдаленні.HTS бібліятэчнай бібліятэкі пацвердзіла высокую разнастайнасць пептыдаў у бібліятэцы: больш за 81% пептыдных паслядоўнасцей былі знойдзены толькі адзін раз і толькі 1,5% сустракаліся ў ≥4 копіях (дадатковая мал. 2а).Частаты амінакіслот (аа) ва ўсіх 12 пазіцыях у рэпертуары добра карэлююць з чаканымі частотамі для колькасці кодонов, якія ўтвараюцца дэгенератыўным рэпертуарам NKK (дадатковы мал. 2b).Назіраная частата астаткаў аа, закадаваных гэтымі ўстаўкамі, добра карэлявала з разліковай частатой (r = 0,893) (дадатковы малюнак 2c).Падрыхтоўка фагавых бібліятэк для ін'екцыі ўключае этапы ампліфікацыі і выдалення эндатаксіну.Раней было паказана, што гэта патэнцыйна зніжае разнастайнасць бібліятэк фагаў12,13.Такім чынам, мы секвенировали фагавую бібліятэку з ампліфікаванымі пласцінамі, з якой быў выдалены эндатаксіны, і параўналі яе з зыходнай бібліятэкай, каб ацаніць частату АА.Назіралася моцная карэляцыя (r = 0,995) паміж зыходным пулам і ампліфікаваным і ачышчаным пулам (дадатковы малюнак 2d), што паказвае на тое, што канкурэнцыя паміж клонамі, ампліфікаванымі на пласцінах з выкарыстаннем фага Т7, не выклікала сур'ёзнага зрушэння.Гэта параўнанне заснавана на частаце трыпептыдных матываў у кожнай бібліятэцы, паколькі разнастайнасць бібліятэк (~109) не можа быць цалкам ахоплена нават з дапамогай HTS.Частотны аналіз аа ў кожнай пазіцыі выявіў невялікае зрушэнне, якое залежыць ад пазіцыі, у апошніх трох пазіцыях уведзенага рэпертуару (дадатковы мал. 2e).У заключэнне мы прыйшлі да высновы, што якасць і разнастайнасць бібліятэкі былі прымальнымі і толькі нязначныя змены ў разнастайнасці назіраліся з-за ампліфікацыі і падрыхтоўкі фагавых бібліятэк паміж некалькімі раундамі адбору.
Серыйны адбор проб спіннамазгавой вадкасці можа быць выкананы шляхам хірургічнай імплантацыі канюлі ў CM пацукоў, якія знаходзяцца ў свядомасці, каб палегчыць ідэнтыфікацыю фага T7, уведзенага нутравенна (IV) праз BBB і/або BCSFB (мал. 1a-b).Мы выкарыстоўвалі дзве незалежныя рукі адбору (зброі і B) у першых трох раўндах выбару ў натуральных умовах (мал. 1c).Мы паступова павялічвалі строгасць адбору, памяншаючы агульную колькасць фага, уведзенага ў першыя тры раунды адбору.Для чацвёртага раўнда панарамавання мы аб'ядналі ўзоры з галін А і В і правялі тры дадатковыя незалежныя выбары.Для вывучэння in vivo уласцівасцей часціц фага Т7 у гэтай мадэлі пацукам праз хваставую вену ўводзілі фаг дзікага тыпу (галоўная ўстаўка PAGISRELVDKL).Аднаўленне фагаў з спіннамазгавой вадкасці і крыві ў розныя моманты часу паказала, што адносна невялікія икосаэдрические фагі T7 мелі хуткую пачатковую фазу ачышчэння ад аддзела крыві (дадатковы малюнак 3).Зыходзячы з уведзеных тытраў і аб'ёму крыві пацукоў, мы падлічылі, што толькі прыблізна 1% мас.фаг з уведзенай дозы выяўляўся ў крыві праз 10 хвілін пасля ўнутрывеннага ўвядзення.Пасля гэтага першапачатковага хуткага зніжэння быў вымераны больш павольны першасны кліранс з перыядам паўраспаду 27,7 хвілін.Важна адзначыць, што толькі вельмі нешматлікія фагі былі здабыты з аддзела СМЖ, што паказвае на нізкі фон для міграцыі фагаў дзікага тыпу ў аддзел СМЖ (дадатковы малюнак 3).У сярэднім толькі каля 1 х 10-3% тытраў фага Т7 ў крыві і 4 х 10-8% першапачаткова уведзеных фагаў было выяўлена ў спіннамазгавой вадкасці за ўвесь перыяд адбору пробаў (0-250 мін).Характэрна, што перыяд паўраспаду (25,7 хвілін) фага дзікага тыпу ў спіннамазгавой вадкасці быў аналагічны таму, які назіраўся ў крыві.Гэтыя дадзеныя дэманструюць, што бар'ер, які аддзяляе аддзяленне СМЖ ад крыві, у пацукоў з канюляй СМ некрануты, што дазваляе in vivo адбіраць бібліятэкі фагаў для ідэнтыфікацыі клонаў, якія лёгка транспартуюцца з крыві ў аддзяленне СМЖ.
(а) Наладжванне метаду паўторнага ўзяцця проб спіннамазгавой вадкасці (ліквора) з вялікага басейна.(b) Схема, якая паказвае клеткавае размяшчэнне бар'ера цэнтральнай нервовай сістэмы (ЦНС) і стратэгію выбару, якая выкарыстоўваецца для ідэнтыфікацыі пептыдаў, якія перасякаюць гематоэнцефаліческій бар'ер (ГЭБ) і гематоэнцефаліческій бар'ер.(c) Блок-схема скрынінга фагавага дысплея in vivo.У кожным раундзе адбору нутравенна ўводзілі фагі (ідэнтыфікатары жывёл унутры стрэлак).Дзве незалежныя альтэрнатыўныя галіны (A, B) захоўваюцца асобна да 4-га раунда адбору.Для 3 і 4 раундаў адбору кожны фагавы клон, выняты з СМЖ, секвенировали ўручную.(d) Кінетыка фага, вылучанага з крыві (чырвоныя кружочкі) і спіннамазгавой вадкасці (зялёныя трохкутнікі) падчас першага раунда адбору ў дзвюх пацукоў з канюляй пасля ўнутрывеннай ін'екцыі бібліятэкі пептыдаў Т7 (2 х 1012 фагаў/жывёлу).Сінімі квадратамі пазначана сярэдняя пачатковая канцэнтрацыя фага ў крыві, разлічаная з колькасці ўведзенага фага з улікам агульнага аб'ёму крыві.Чорныя квадраты паказваюць кропку перасячэння лініі y, экстрапаляванай з канцэнтрацый фагаў крыві.(e,f) Уявіце адносную частату і размеркаванне ўсіх магчымых трыпептыдных матываў, якія перакрываюцца, знойдзеных у пептыдзе.Паказана колькасць матываў, знойдзеных у 1000 чытаннях.Значна (p <0,001) узбагачаныя матывы адзначаны чырвонымі кропкамі.(e) Карэляцыйная дыяграма рассейвання, якая параўноўвае адносную частату трыпептыднага матыву ўведзенай бібліятэкі з фагам, атрыманым з крыві жывёл № 1.1 і № 1.2.(f) Дыяграма рассейвання карэляцыі, якая параўноўвае адносныя частоты трыпептыдных матываў фага жывёл № 1.1 і № 1.2, ізаляваных у крыві і спіннамазгавой вадкасці.(g, h) Прадстаўленне ідэнтыфікатара паслядоўнасці фага, узбагачанага крывёю (g), у параўнанні з уведзенымі бібліятэкамі, і фага, узбагачанага ЦСЖ (h), у параўнанні з крывёю пасля раунда адбору in vivo ў абедзвюх жывёл.Памер адналітарнага кода паказвае, як часта гэтая амінакіслата сустракаецца ў гэтай пазіцыі.Зялёны = палярны, фіялетавы = нейтральны, сіні = асноўны, чырвоны = кіслотныя і чорны = гідрафобныя амінакіслоты.Малюнак 1а, б быў распрацаваны і выраблены Эдуардам Урычам.
Мы ўвялі бібліятэку фагавых пептыдаў двум пацукам CM instrument (клады A і B) і вылучылі фаг з спіннамазгавой вадкасці і крыві (малюнак 1d).Першапачатковае хуткае ачышчэнне бібліятэкі было менш выяўленым у параўнанні з фагам дзікага тыпу.Сярэдні перыяд паўраспаду ўведзенай бібліятэкі ў абедзвюх жывёл склаў 24,8 хвілін у крыві, падобна фагам дзікага тыпу, і 38,5 хвілін у СМЖ.Узоры фагаў крыві і спіннамазгавой вадкасці кожнай жывёлы падвяргалі HTS, і ўсе выяўленыя пептыды аналізавалі на наяўнасць кароткага трыпептыднага матыву.Трыпептыдныя матывы былі выбраны таму, што яны забяспечваюць мінімальную аснову для фарміравання структуры і пептыд-бялковых узаемадзеянняў 14,15.Мы выявілі добрую карэляцыю ў размеркаванні матываў паміж уведзенай бібліятэкай фагаў і клонамі, вынятымі з крыві абодвух жывёл (мал. 1e).Дадзеныя паказваюць, што склад бібліятэкі толькі нязначна ўзбагачаны ў аддзяленні крыві.Частаты амінакіслот і кансенсусныя паслядоўнасці былі дадаткова прааналізаваны ў кожнай пазіцыі з дапамогай адаптацыі праграмнага забеспячэння Weblogo16.Цікава, што мы выявілі моцнае ўзбагачэнне рэшткаў гліцыну ў крыві (мал. 1g).Калі кроў параўноўвалі з клонамі, адабранымі з CSF, моцны адбор і некаторая адмена выбару матываў назіраліся (мал. 1f), і некаторыя амінакіслоты пераважна прысутнічалі ў зададзеных месцах у 12-члене (мал. 1h).Характэрна, што асобныя жывёлы значна адрозніваліся па спіннамазгавой вадкасці, у той час як узбагачэнне крыві гліцынам назіралася ў абедзвюх жывёл (дадатковы малюнак 4a–j).Пасля строгай фільтрацыі дадзеных аб паслядоўнасці ў спіннамазгавой вадкасці жывёл № 1.1 і № 1.2 было атрымана ў агульнай складанасці 964 і 420 унікальных 12-мерных пептыдаў (дадатковы малюнак 1d–e).Выдзеленыя фагавыя клоны былі ампліфікаваны і падвергнуты другому раўнду селекцыі in vivo.Фагі, вынятыя з другога раунда адбору, падвяргаліся HTS у кожнай жывёлы, і ўсе ідэнтыфікаваныя пептыды выкарыстоўваліся ў якасці ўваходных дадзеных для праграмы распазнання матываў для аналізу з'яўлення трыпептыдных матываў (мал. 2a, b, ef).У параўнанні з першым цыклам фага, выдзеленага з СМЖ, мы назіралі далейшы выбар і адмену выбару многіх матываў у СМЖ у галінах А і В (мал. 2).Алгарытм ідэнтыфікацыі сеткі быў ужыты, каб вызначыць, ці ўяўляюць яны розныя ўзоры паслядоўнасці.Відавочнае падабенства назіралася паміж 12-мерных паслядоўнасцяў, адноўленых CSF ў альтэрнатыўнай клады (мал. 2c, d) і клады B (мал. 2g, h).Аб'яднаны аналіз у кожнай галіны выявіў розныя профілі адбору для 12-мерных пептыдаў (дадатковы малюнак 5c,d) і павелічэнне суадносін тытраў СМЖ/кроў з цягам часу для аб'яднаных клонаў пасля другога раўнда адбору ў параўнанні з першым раўндам адбору (дадатковы малюнак 5e).).
Ўзбагачэнне матываў і пептыдаў у спіннамазгавой вадкасці двума паслядоўнымі раундамі адбору функцыянальнага фагавага дысплея in vivo.
Усе фагі спіннамазгавой вадкасці, здабытыя ў першым раўндзе кожнай жывёлы (жывёлы № 1.1 і № 1.2), былі аб'яднаны, ампліфікаваны, секвеніраваны НТ і паўторна ўведзены разам (2 х 1010 фагаў/жывёлу) 2 пацукам з канюляй SM (№ 1.1 → #).2.1 і 2.2, 1.2 → 2.3 і 2.4).(a,b,e,f) Карэляцыйныя дыяграмы рассеяння, якія параўноўваюць адносную частату трыпептыдных матываў усіх фагаў, атрыманых з СМЖ, у першым і другім раундах адбору.Адносная частата і размеркаванне матываў, якія прадстаўляюць усе магчымыя трыпептыды, якія перакрываюцца, выяўленыя ў пептыдах у абедзвюх арыентацыях.Паказана колькасць матываў, знойдзеных у 1000 чытаннях.Матывы, якія былі значна (p <0,001) выбраны або выключаны ў адной з параўноўваных бібліятэк, вылучаны чырвонымі кропкамі.(c, d, g, h) Прадстаўленне лагатыпа паслядоўнасці ўсіх паслядоўнасцей, багатых на 12 амінакіслот, багатых на аснове ЦСЖ, заснаваных на раундах 2 і 1 выбару in vivo.Памер адналітарнага кода паказвае, як часта гэтая амінакіслата сустракаецца ў гэтай пазіцыі.Каб прадставіць лагатып, параўноўваецца частата паслядоўнасцяў СМЖ, выцягнутых з асобных жывёл паміж двума раундамі адбору, і паказаны ўзбагачаныя паслядоўнасці ў другім раундзе: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 і (h) #1.2–#2.4.Найбольш узбагачаных амінакіслотамі ў дадзеным становішчы ў (в, г) жывёл няма.2.1 і няма.2.2 або (g, h) у жывёл няма.2.3 і няма.2.4 паказаны ў колеры.Зялёны = палярны, фіялетавы = нейтральны, сіні = асноўны, чырвоны = кіслотныя і чорны = гідрафобныя амінакіслоты.
Пасля трэцяга раунда адбору мы ідэнтыфікавалі 124 унікальныя пептыдныя паслядоўнасці (№ 3.1 і № 3.2) з 332 фагавых клонаў, адноўленых у СМЖ, ізаляваных ад дзвюх жывёл (дадатковы малюнак 6а).Паслядоўнасць LGSVS (18,7%) мела найбольшую адносную долю, за якой ішлі ўстаўкі дзікага тыпу PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) і SARGSWREIVSLS (2,2%).У заключным чацвёртым раундзе мы аб'ядналі дзве незалежна адабраныя галіны трох асобных жывёл (мал. 1с).З 925 секвенированных фагавых клонаў, вынятых з СМЖ, у чацвёртым раундзе мы знайшлі 64 унікальныя пептыдныя паслядоўнасці (дадатковы малюнак 6b), сярод якіх адносная доля фага дзікага тыпу знізілася да 0,8%.Найбольш распаўсюджанымі клонамі ЦСЖ у чацвёртым раундзе былі LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) і RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Дыяпазон даўжынь выбраных пептыдаў абумоўлены ўстаўкамі/выдаленнямі нуклеатыдаў або заўчаснымі стоп-кадонамі ў праймерах бібліятэкі пры выкарыстанні выроджаных кадонаў для праектавання бібліятэкі NNK.Заўчасныя стоп-кодоны генеруюць больш кароткія пептыды і выбіраюцца таму, што яны ўтрымліваюць спрыяльны матыў аа.Больш доўгія пептыды могуць узнікаць у выніку ўставак/выдаленняў у праймерах сінтэтычных бібліятэк.Гэта размяшчае распрацаваны стоп-кодон па-за рамкай і счытвае яго, пакуль новы стоп-кодон не з'явіцца ўнізе.Увогуле, мы разлічылі каэфіцыенты ўзбагачэння для ўсіх чатырох раундаў адбору шляхам параўнання ўваходных даных з выхаднымі дадзенымі выбаркі.Для першага раўнда скрынінга мы выкарыстоўвалі тытры фагаў дзікага тыпу ў якасці неспецыфічнага фону.Цікава, што адмоўны адбор фагаў быў вельмі моцным у першым цыкле ЦСЖ, але не ў крыві (мал. 3а), што можа быць звязана з нізкай верагоднасцю пасіўнай дыфузіі большасці членаў пептыднай бібліятэкі ў аддзяленне СМЖ, або адпаведныя фагі, як правіла, больш эфектыўна ўтрымліваюцца або выдаляюцца з крывацёку, чым бактэрыяфагі.Аднак у другім раундзе пэнінгу ў абедзвюх кладах назіраўся моцны выбар фагаў у СМЖ, што сведчыць аб тым, што папярэдні раунд быў узбагачаны фагамі, якія дэманструюць пептыды, якія спрыяюць паглынанню СМЖ (мал. 3а).Зноў жа без істотнага ўзбагачэння крыві.Таксама ў трэцім і чацвёртым раундах фагавыя клоны былі значна ўзбагачаны СМЖ.Параўноўваючы адносную частату кожнай унікальнай паслядоўнасці пептыда паміж двума апошнімі раундамі адбору, мы выявілі, што паслядоўнасці былі яшчэ больш узбагачаны ў чацвёртым раўндзе адбору (мал. 3b).У агульнай складанасці 931 трыпептыдны матыв быў выняты з усіх 64 унікальных пептыдных паслядоўнасцей з выкарыстаннем абедзвюх пептыдных арыентацый.Найбольш узбагачаныя матывы ў чацвёртым раундзе былі больш уважліва вывучаны на прадмет іх узбагачэння профіляў ва ўсіх раундах у параўнанні з уведзенай бібліятэкай (адсечка: 10% узбагачэнне) (дадатковы малюнак 6c).Агульныя заканамернасці адбору паказалі, што большасць вывучаных матываў ўзбагачаліся ва ўсіх папярэдніх турах абедзвюх галін адбору.Аднак некаторыя матывы (напрыклад, SGL, VSG, LGS GSV) былі пераважна з альтэрнатыўнага кладу A, у той час як іншыя (напрыклад, FGW, RTN, WGF, NTR) былі ўзбагачаны альтэрнатыўным кладам B.
Праверка транспарціроўкі СМЖ пептыдаў, узбагачаных фагамі, і біятыніляваных лідэрскіх пептыдаў, кан'югаваных са стрэптавідынам.
(a) Каэфіцыенты ўзбагачэння, разлічаныя ва ўсіх чатырох раундах (R1-R4) на аснове ўведзеных (уваход = I) тытраў фага (PFU) і вызначаных тытраў фага СМЖ (выхад = O).Каэфіцыенты ўзбагачэння для апошніх трох раундаў (R2-R4) былі разлічаны шляхам параўнання з папярэднім раундам і першым раундам (R1) з вагавымі дадзенымі.Незакрытыя палоскі - гэта спіннамазгавая вадкасць, заштрыхаваныя - плазма.(***p<0,001, заснавана на крытэрыі Ст'юдэнта).(b) Спіс самых распаўсюджаных фагавых пептыдаў, ранжыраваных у адпаведнасці з іх адноснай доляй да ўсіх фагаў, сабраных у СМЖ пасля 4 раунда адбору.Шэсць найбольш распаўсюджаных клонаў фагаў вылучаны колерам, пранумараваны і іх каэфіцыенты ўзбагачэння паміж 3 і 4 раундамі адбору (устаўкі).(c,d) Шэсць найбольш узбагачаных фагавых клонаў, пустыя фагавыя і бацькоўскія фагавыя пептыдныя бібліятэкі з раунда 4 былі прааналізаваны індывідуальна ў мадэлі выбаркі ЦСЖ.СМЖ і ўзоры крыві былі сабраныя ў пазначаныя моманты часу.(c) Роўныя колькасці 6 фагавых клонаў-кандыдатаў (2 х 1010 фагаў/жывёл), пустых фагаў (№ 1779) (2 х 1010 фагаў/жывёл) ​​і асноўных фагавых пептыдных бібліятэк (2 х 1012 фагаў/жывёл). Ін'екцыю па меншай меры 3 CM ўводзяць канюляванай жывёле асобна праз хваставую вену.Паказана фармакакінетыка СМЖ кожнага ўведзенага клона фага і бібліятэкі фагавых пептыдаў з цягам часу.(d) паказвае сярэдняе суадносіны СМЖ/кроў для ўсіх адноўленых фагаў/мл за час адбору пробаў.(e) Чатыры сінтэтычных вядучых пептыда і адзін зашыфраваны кантроль былі звязаны з біятынам са стрэптавідынам праз іх N-канец (тэтрамерны дысплей) з наступнай ін'екцыяй (в/в хваставую вену, 10 мг стрэптавідыну/кг).Прынамсі тры інтубаваных пацукі (N = 3).).Узоры СМЖ былі сабраны ў пазначаныя моманты часу і канцэнтрацыі стрэптавідыну былі вымераныя з дапамогай ІФА супраць стрэптавідыну ў СМЖ (nd = не выяўлена).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, заснавана на тэсце ANOVA).(f) Параўнанне амінакіслотнай паслядоўнасці найбольш узбагачанага фагавага пептыднага клона №2002 (фіялетавы) з іншымі адабранымі фагавымі пептыднымі клонамі з 4-га раунда адбору.Ідэнтычныя і падобныя фрагменты амінакіслот пазначаны колерам.
З усіх узбагачаных фагаў у чацвёртым раундзе (мал. 3b) шэсць клонаў-кандыдатаў былі адабраны для далейшага індывідуальнага аналізу ў мадэлі выбаркі СМЖ.Роўныя колькасці шасці бібліятэк фагаў-кандыдатаў, пустых фагаў (без устаўкі) і пептыдаў прафагаў былі ўведзены тром жывёлам з канюлямі CM, а фармакокінетыка была вызначана ў аналізах СМЖ (мал. 3c) і крыві (дадатковы малюнак 7).Усе правераныя клоны фагаў нацэліліся на адсек СМЖ на ўзроўні, які ў 10-1000 разоў перавышаў ўзровень пустога кантрольнага фага (№1779).Напрыклад, клоны № 2020 і № 2077 мелі прыкладна ў 1000 разоў большы тытр СМЖ, чым кантрольны фаг.Фармакокинетический профіль кожнага абранага пептыда адрозніваецца, але ўсе яны валодаюць высокай здольнасцю да саманавядзення СМЖ.Мы назіралі пастаяннае зніжэнне з цягам часу для клонаў № 1903 і № 2011, у той час як для клонаў № 2077, № 2002 і № 2009 павелічэнне на працягу першых 10 хвілін можа сведчыць аб актыўным транспарціроўцы, але яго неабходна праверыць.Клоны №2020, №2002 і №2077 стабілізаваліся на высокіх узроўнях, у той час як канцэнтрацыя СМЖ клона №2009 павольна зніжалася пасля першапачатковага павышэння.Затым мы параўналі адносную частату кожнага кандыдата ў СМЖ з яго канцэнтрацыяй у крыві (мал. 3d).Карэляцыя сярэдняга тытра кожнага кандыдата ў СМЖ з тытрам крыві ў любы час адбору пробаў паказала, што тры з шасці кандыдатаў былі значна ўзбагачаны ў крыві СМЖ.Цікава, што клон № 2077 паказаў больш высокую стабільнасць крыві (дадатковы малюнак 7).Каб пацвердзіць, што самі пептыды здольныя актыўна транспартаваць груз, акрамя фагавых часціц, у адсек СМЖ, мы сінтэзавалі чатыры вядучых пептыда, дэрыватызаваных біятынам на N-канцы, дзе пептыды прымацоўваюцца да фагавой часціцы.Біятыніляваныя пептыды (№ 2002, 2009, 2020 і 2077) былі кан'югаваныя са стрэптавідынам (SA) для атрымання мультымерных формаў, якія ў некаторай ступені імітуюць геаметрыю фага.Гэты фармат таксама дазволіў нам вымераць уздзеянне SA ў крыві і спіннамазгавой вадкасці ў якасці бялковых пептыдаў, якія транспартуюць груз.Важна адзначыць, што дадзеныя аб фагах часта можна было прайграць, калі сінтэтычныя пептыды ўводзілі ў гэтым SA-кан'югаваным фармаце (мал. 3e).Змешаныя пептыды мелі меншае першапачатковае ўздзеянне і больш хуткае ачышчэнне СМЖ з невызначаемым узроўнем на працягу 48 гадзін.Каб атрымаць уяўленне аб шляхах дастаўкі гэтых пептыдных фагавых клонаў у прастору СМЖ, мы прааналізавалі лакалізацыю асобных фагавых пептыдаў з дапамогай імунагістахіміі (IHC) для непасрэднага выяўлення фагавых часціц праз 1 гадзіну пасля ўнутрывеннай ін'екцыі in vivo.Характэрна, што клоны № 2002, № 2077 і № 2009 можна было выявіць шляхам моцнага афарбоўвання ў капілярах мозгу, у той час як кантрольны фаг (№ 1779) і клон № 2020 не былі выяўлены (дадатковы малюнак 8).Гэта сведчыць аб тым, што гэтыя пептыды спрыяюць уплыву на мозг менавіта шляхам перасячэння ГЭБ.Для праверкі гэтай гіпотэзы неабходны далейшы дэталёвы аналіз, бо таксама можа быць задзейнічаны маршрут BSCFB.Пры параўнанні амінакіслотнай паслядоўнасці найбольш ўзбагачанага клона (#2002) з іншымі выбранымі пептыдамі было адзначана, што некаторыя з іх маюць падобныя амінакіслотныя пашырэнні, што можа сведчыць аб падобным механізме транспарту (мал. 3f).
Дзякуючы ўнікальнаму профілю ў плазме і значнаму павелічэнню СМЖ з цягам часу, клон фагавага дысплея №2077 быў дадаткова даследаваны на працягу больш доўгага 48-гадзіннага перыяду і змог прайграць хуткае павелічэнне СМЖ, якое назіралася ў сувязі з устойлівымі ўзроўнямі SA (мал. 4а).Што тычыцца іншых ідэнтыфікаваных фагавых клонаў, № 2077 моцна афарбоўваўся на капіляры галаўнога мозгу і дэманстраваў значную калакалізацыю з капілярным лектынам-маркерам пры праглядзе ў больш высокім раздзяленні і, магчыма, некаторую афарбоўку ў парэнхіматозным прасторы (малюнак 4b).Каб даследаваць, ці могуць апасродкаваныя пептыдамі фармакалагічныя эфекты быць атрыманы ў ЦНС, мы правялі эксперымент, у якім біятыніляваныя версіі i) транзітнага пептыда #2077 і ii) пептыда-інгібітара BACE1 змешвалі з SA у двух розных суадносінах.Для адной камбінацыі мы выкарыстоўвалі толькі інгібітар пептыда BACE1, а для другой - суадносіны інгібітара пептыда BACE1 да пептыда №2077 1:3.Абедзве пробы ўводзілі нутравенна і з часам вымяралі ўзровень бэта-амілаіднага пептыда 40 (Abeta40) у крыві і спіннамазгавой вадкасці.Abeta40 вымяралі ў СМЖ, паколькі ён адлюстроўвае інгібіраванне BACE1 у парэнхіме мозгу.Як і варта было чакаць, абодва комплексу значна знізілі ўзровень Abeta40 у крыві (мал. 4c, d).Аднак толькі узораў, якія змяшчаюць сумесь пептыдаў, няма.2077 і інгібітар пептыда BACE1, кан'югаванага з SA, выклікалі значнае зніжэнне Abeta40 у спіннамазгавой вадкасці (мал. 4c).Дадзеныя паказваюць, што пептыд №.2077 здольны транспартаваць бялок SA 60 кДа ў ЦНС, а таксама індукуе фармакалагічныя эфекты з SA-кан'югаванымі інгібітарамі пептыда BACE1.
(a) Кланальная ін'екцыя (2 × 10 фагаў/жывёлу) фага Т7, якая дэманструе доўгатэрміновыя фармакокінетычныя профілі пептыда СМЖ № 2077 (RLSSVDSDLSGC) і неін'екцыйнага кантрольнага фага (№ 1779) па меншай меры ў трох пацукоў, інтубаваных СМ.(b) Канфакальны мікраскапічны малюнак рэпрэзентатыўных коркавых мікрасасудаў у пацукоў з ін'екцыяй фагаў (2 × 10 10 фагаў/жывёлу), які паказвае контрафарбоўку пептыда № 2077 і сасудаў (лектыну).Гэтыя фагавыя клоны ўвялі 3 пацукам і далі магчымасць цыркуляваць на працягу 1 гадзіны перад перфузией.Мозг разразалі і афарбоўвалі поліклональнымі FITC-мечанымі антыцеламі супраць капсіда фага Т7.За дзесяць хвілін да перфузии і наступнай фіксацыі лектин, пазначаны DyLight594, ўводзілі нутравенна.Флуарэсцэнтныя выявы, якія паказваюць афарбоўванне лектынам (чырвоным) прасвету мікрасасудаў і фагамі (зялёным) у прасвеце капіляраў і перываскулярнай тканіны мозгу.Шкала шкалы адпавядае 10 мкм.(c, d) Биотинилированный BACE1 інгібіруючы пептыд асобна або ў камбінацыі з биотинилированным транзітным пептыдам № 2077 злучалі са стрэптавідынам з наступнай нутравеннай ін'екцыяй як мінімум тром пацукам CM з канюляй (10 мг стрэптавідыну/кг).Зніжэнне Aβ40, апасродкаванае інгібітарам пептыда BACE1, вымяралася з дапамогай аналізу Aβ1-40 ELISA ў крыві (чырвоны) і спіннамазгавой вадкасці (аранжавы) у пазначаныя моманты часу.Для лепшай нагляднасці на графіцы ў маштабе 100% праведзена пункцірная лінія.(c) Працэнтнае зніжэнне Aβ40 у крыві (чырвоныя трыкутнікі) і спіннамазгавой вадкасці (аранжавыя трыкутнікі) у пацукоў, якія атрымлівалі стрэптавідын, кан'югаваны з транзітным пептыдам № 2077 і інгібіруючым пептыдам BACE1 у суадносінах 3:1.(D) Працэнтнае зніжэнне ў крыві Aβ40 (чырвоныя кружочкі) і спіннамазгавой вадкасці (аранжавыя кружочкі) у пацукоў, якія атрымлівалі толькі стрэптавідын у спалучэнні з інгібіруючым пептыдам BACE1.Канцэнтрацыя Ар ў кантролі складала 420 пг/мл (стандартнае адхіленне = 101 пг/мл).
Фагавы дысплей паспяхова выкарыстоўваецца ў некалькіх галінах біямедыцынскіх даследаванняў17.Гэты метад выкарыстоўваўся для даследаванняў сасудзістай разнастайнасці in vivo 18,19, а таксама для даследаванняў сасудаў галаўнога мозгу 20,21,22,23,24,25,26.У гэтым даследаванні мы пашырылі прымяненне гэтага метаду адбору не толькі на прамую ідэнтыфікацыю пептыдаў, накіраваных на сасуды галаўнога мозгу, але і на выяўленне кандыдатаў з актыўнымі транспартнымі ўласцівасцямі перасякаць гематоэнцефаліческій бар'ер.Зараз мы апісваем распрацоўку працэдуры выбару ў натуральных умовах у інтубаваных пацукоў CM і дэманструем яе патэнцыял для ідэнтыфікацыі пептыдаў з уласцівасцямі саманавядзення СМЖ.Выкарыстоўваючы фаг Т7, які адлюстроўвае бібліятэку 12-мерных выпадковых пептыдаў, мы змаглі прадэманстраваць, што фаг Т7 досыць малы (прыблізна 60 нм у дыяметры)10, каб быць адаптаваным да гематоэнцефаліческій бар'еру, тым самым непасрэдна перасякаючы гематоэнцефаліческій бар'ер або судзінкавае спляценне.Мы заўважылі, што збор СМЖ у канюляваных пацукоў CM быў добра кантраляваным метадам функцыянальнага скрынінга in vivo і што экстрагаваны фаг не толькі звязваўся з сасудзістай сеткай, але і функцыянаваў як транспарцёр праз гематоэнцефаліческій бар'ер.Акрамя таго, адначасовым зборам крыві і прымяненнем HTS да СМЖ і фагам, атрыманым з крыві, мы пацвердзілі, што на наш выбар СМЖ не паўплывала ўзбагачэнне крыві або прыдатнасць для пашырэння паміж раундамі адбору.Тым не менш, частка крыві з'яўляецца часткай працэдуры адбору, паколькі фагі, здольныя дасягнуць аддзела СМЖ, павінны выжыць і цыркуляваць у крывацёку дастаткова доўга, каб узбагаціцца ў мозгу.Каб атрымаць надзейную інфармацыю аб паслядоўнасці з неапрацаваных даных HTS, мы ўкаранілі ў працоўны працэс аналізу фільтры, адаптаваныя да памылак секвеніравання, якія залежаць ад платформы.Уключыўшы кінэтычныя параметры ў метад скрынінга, мы пацвердзілі хуткую фармакокінетіку фагаў Т7 дзікага тыпу (t½ ~ 28 мін) у крыві24, 27, 28, а таксама вызначылі перыяд іх паўраспаду ў спіннамазгавой вадкасці (t½ ~ 26 мін) у хвіліну).Нягледзячы на ​​падобныя фармакокінетычныя профілі ў крыві і СМЖ, толькі 0,001% ад канцэнтрацыі фага ў крыві можа быць выяўлена ў СМЖ, што паказвае на нізкую фонавую рухомасць фага Т7 дзікага тыпу праз гематоэнцефаліческій бар'ер.У гэтай працы падкрэсліваецца важнасць першага раунда адбору пры выкарыстанні стратэгій пэнінга in vivo, асабліва для фагавых сістэм, якія хутка выводзяцца з цыркуляцыі, паколькі нешматлікія клоны здольныя дасягнуць аддзела ЦНС.Такім чынам, у першым раундзе памяншэнне разнастайнасці бібліятэк было вельмі вялікім, бо толькі абмежаваная колькасць клонаў была ў канчатковым выніку сабрана ў гэтай вельмі строгай мадэлі CSF.Гэтая стратэгія пэнінгу in vivo ўключала некалькі этапаў адбору, такіх як актыўнае назапашванне ў аддзеле СМЖ, выжыванне клонаў у аддзеле крыві і хуткае выдаленне клонаў фага Т7 з крыві на працягу першых 10 хвілін (мал. 1d і дадатковы малюнак 4M).).Такім чынам, пасля першага раўнду розныя клоны фагаў былі ідэнтыфікаваныя ў СМЖ, хоць для асобных жывёл выкарыстоўваўся адзін і той жа пачатковы пул.Гэта сведчыць аб тым, што некалькі этапаў строгага адбору для бібліятэк-крыніц з вялікай колькасцю членаў бібліятэкі прыводзяць да значнага памяншэння разнастайнасці.Такім чынам, выпадковыя падзеі стануць неад'емнай часткай працэсу першапачатковага адбору, моцна ўплываючы на ​​вынік.Цалкам верагодна, што многія з клонаў у арыгінальнай бібліятэцы мелі вельмі падобную схільнасць да ўзбагачэння СМЖ.Аднак нават у аднолькавых эксперыментальных умовах вынікі адбору могуць адрознівацца з-за невялікай колькасці кожнага канкрэтнага клона ў першапачатковым пуле.
Матывы, узбагачаныя СМЖ, адрозніваюцца ад матываў крыві.Цікава, што мы адзначылі першы зрух у бок багатых гліцынам пептыдаў у крыві асобных жывёл.(Малюнак 1g, дадатковыя малюнкі 4e, 4f).Фаг, які змяшчае пептыды гліцыну, можа быць больш устойлівым і з меншай верагоднасцю выводзіцца з цыркуляцыі.Аднак гэтыя багатыя гліцынам пептыды не былі выяўленыя ва ўзорах спіннамазгавой вадкасці, што сведчыць аб тым, што падрыхтаваныя бібліятэкі прайшлі два розныя этапы адбору: адзін у крыві, а другі дазволіў назапашвацца ў спіннамазгавой вадкасці.Клоны, узбагачаныя СМЖ, атрыманыя ў выніку чацвёртага раунда адбору, былі старанна пратэставаны.Было пацверджана, што амаль усе асобна пратэставаныя клоны былі ўзбагачаны СМЖ у параўнанні з пустым кантрольным фагам.Адзін пептыдны ўдар (№ 2077) быў разгледжаны больш падрабязна.Ён паказаў больш працяглы перыяд паўраспаду ў плазме ў параўнанні з іншымі хітамі (малюнак 3d і дадатковы малюнак 7), і што цікава, гэты пептыд утрымліваў рэшту цыстэіну на С-канцы.Нядаўна было паказана, што даданне цистеина да пептыдаў можа палепшыць іх фармакокинетические ўласцівасці за кошт звязвання з альбумінам 29.У цяперашні час гэта невядома для пептыда № 2077 і патрабуе далейшага вывучэння.Некаторыя пептыды прадэманстравалі залежнасць ад валентнасці ва ўзбагачэнні СМЖ (дадзеныя не паказаны), што можа быць звязана з адлюстраванай геаметрыяй паверхні капсіда Т7.Сістэма T7, якую мы выкарыстоўвалі, паказала 5-15 копій кожнага пептыда на часціцу фага.IHC была праведзена на клонах свінцовага фага-кандыдата, уведзеных нутравенна ў кару галаўнога мозгу пацукоў (дадатковы малюнак 8).Дадзеныя паказалі, што як мінімум тры клона (№ 2002, № 2009 і № 2077) ўзаемадзейнічалі з BBB.Застаецца вызначыць, ці прыводзіць гэта ўзаемадзеянне BBB да назапашвання CSF або руху гэтых клонаў непасрэдна да BCSFB.Важна адзначыць, што мы паказваем, што выбраныя пептыды захоўваюць сваю транспартную здольнасць СМЖ пры сінтэзе і звязванні з бялковым грузам.Звязванне N-канцавых біятыніляваных пептыдаў з SA па сутнасці паўтарае вынікі, атрыманыя з іх адпаведнымі фагавымі клонамі ў крыві і спіннамазгавой вадкасці (мал. 3e).Нарэшце, мы паказваем, што пептыд свінцу № 2077 здольны ўзмацняць дзеянне ў мозгу біятыніляванага пептыда, інгібітару BACE1, кан'югаванага з SA, выклікаючы выяўленыя фармакадынамічныя эфекты ў ЦНС за кошт значнага зніжэння ўзроўню Abeta40 у СМЖ (мал. 4).Мы не змаглі ідэнтыфікаваць якія-небудзь гамолагі ў базе даных, выканаўшы пошук па гамалогіі пептыднай паслядоўнасці ўсіх хітоў.Важна адзначыць, што памер бібліятэкі T7 складае прыблізна 109, у той час як тэарэтычны памер бібліятэкі для 12-мераў складае 4 х 1015. Такім чынам, мы выбралі толькі невялікую частку прасторы разнастайнасці 12-мернай бібліятэкі пептыдаў, што можа азначаць, што больш аптымізаваныя пептыды могуць быць ідэнтыфікаваныя шляхам ацэнкі сумежнай прасторы паслядоўнасці гэтых ідэнтыфікаваных хітоў.Гіпатэтычна адной з прычын, па якой мы не знайшлі натуральных гамолагаў гэтых пептыдаў, можа быць дэселекцыя падчас эвалюцыі, каб прадухіліць некантралюемае пранікненне пэўных пептыдных матываў у мозг.
У сукупнасці нашы вынікі ствараюць аснову для будучай працы па выяўленні і больш дэталёвай характарыстыкі транспартных сістэм цэрэбраваскулярнага бар'ера in vivo.Асноўная ўстаноўка гэтага метаду заснавана на функцыянальнай стратэгіі адбору, якая не толькі ідэнтыфікуе клоны са ўласцівасцямі звязвання сасудаў галаўнога мозгу, але таксама ўключае крытычны этап, на якім паспяховыя клоны валодаюць унутранай актыўнасцю пераадольваць біялагічныя бар'еры in vivo ў аддзел ЦНС.заключаецца ў высвятленні механізму транспарту гэтых пептыдаў і іх перавагі для звязвання з мікрасасудзістай сістэмай, характэрнай для вобласці мозгу.Гэта можа прывесці да адкрыцця новых шляхоў для транспарціроўкі ГЭБ і рэцэптараў.Мы чакаем, што ідэнтыфікаваныя пептыды могуць непасрэдна звязвацца з цэрэбраваскулярнымі рэцэптарамі або з цыркулявалымі лигандами, якія транспартуюцца праз BBB або BCSFB.Пептыдныя вектары з транспартнай актыўнасцю СМЖ, выяўленыя ў гэтай працы, будуць даследаваны далей.У цяперашні час мы даследуем спецыфічнасць мозгу гэтых пептыдаў на прадмет іх здольнасці пранікаць праз ГЭБ і/або BCSFB.Гэтыя новыя пептыды будуць надзвычай каштоўнымі інструментамі для патэнцыйнага адкрыцця новых рэцэптараў або шляхоў і для распрацоўкі новых высокаэфектыўных платформ для дастаўкі макрамалекул, такіх як біяпрэпараты, у мозг.
Канюляваць вялікую цыстэрну (CM), выкарыстоўваючы мадыфікацыю апісанага раней метаду.Пад наркозам пацукоў Wistar (200-350 г) усталявалі на стэрэатаксічным апараце і зрабілі сярэдні разрэз на паголенай і асептычна падрыхтаванай скуры галавы, каб агаліць чэрап.Прасвідруйце два адтуліны ў раёне верхняй створкі і замацуеце ў адтулінах крапежныя шрубы.Дадатковае адтуліну было прасвідравана ў бакавым патылічным грэбні для стереотаксического навядзення канюлі з нержавеючай сталі ў CM.Вырабіце стаматалагічны цэмент вакол канюлі і замацуеце шрубамі.Пасля фотоотвержденія і зацвярдзення цэменту скурная рана зашыта супрамидным швом 4/0.Правільнае размяшчэнне канюлі пацвярджаецца самаадвольнай уцечкай спіннамазгавой вадкасці (ліквора).Выдаліце ​​​​пацука са стэрэатаксічнага апарата, атрымлівайце належны пасляаперацыйны догляд і абязбольванне і дайце яму аднавіцца як мінімум на адзін тыдзень, пакуль у спіннамазгавой вадкасці не з'явяцца прыкметы крыві.Пацукі Wistar (Crl:WI/Han) былі атрыманы з Charles River (Францыя).Усе пацукі ўтрымліваліся ў спецыфічных умовах, свабодных ад патагенаў.Усе эксперыменты на жывёл былі адобраны Ветэрынарным упраўленнем горада Базель, Швейцарыя, і праводзіліся ў адпаведнасці з ліцэнзіяй на жывёл № 2474 (Ацэнка актыўнага транспарту мозгу шляхам вымярэння ўзроўню тэрапеўтычных кандыдатаў у спіннамазгавой вадкасці і галаўным мозгу пацукоў).
Асцярожна падтрымлівайце пацука ў свядомасці, трымаючы ў руках канюлю CM.Выміце дурман з канюлі і збярыце 10 мкл спіннамазгавой вадкасці, якая самаадвольна цячэ.Паколькі праходнасць канюлі ў канчатковым рахунку была парушана, у гэта даследаванне былі ўключаны толькі празрыстыя ўзоры спіннамазгавой вадкасці без прыкмет заражэння крыві або змены колеру.Паралельна з невялікага разрэзу на кончыку хваста бралі прыкладна 10-20 мкл крыві ў прабіркі з гепарыну (Sigma-Aldrich).ЦСЖ і кроў збіралі ў розныя моманты часу пасля ўнутрывеннай ін'екцыі фага Т7.Прыблізна 5-10 мкл вадкасці было адкінута перад кожным узорам СМЖ, што адпавядае мёртваму аб'ёму катетера.
Бібліятэкі ствараліся з выкарыстаннем вектара T7Select 10-3b, як апісана ў інструкцыі па сістэме T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Коратка, выпадковая 12-мерная ўстаўка ДНК была сінтэзавана ў наступным фармаце:
Кадон NNK быў выкарыстаны, каб пазбегнуць падвойных стоп-кодонаў і празмернай экспрэсіі амінакіслот ва ўстаўцы.N - змешанае ўручную эквімалярнае суадносіны кожнага нуклеатыда, а K - змешанае ўручную эквімалярнае суадносіны нуклеатыдаў адэніну і цытазіну.Адналанцуговыя вобласці былі пераўтвораны ў двухцепочечную ДНК шляхам далейшай інкубацыі з dNTP (Novagen) і ферментам Klenow (New England Biolabs) у буферы Klenow (New England Biolabs) на працягу 3 гадзін пры 37°C.Пасля рэакцыі двухцепочечную ДНК аднаўлялі ападкам EtOH.Атрыманую ДНК расшчапляюць рестриктазами EcoRI і HindIII (абодва ад Roche).Расшчапленую і ачышчаную (QIAquick, Qiagen) устаўку (лігаза T4, New England Biolabs) затым лигировали ў кадры ў папярэдне расшчаплены вектар T7 пасля амінакіслоты 348 гена капсіда 10B.Рэакцыі перавязкі інкубавалі пры 16°C на працягу 18 гадзін перад упакоўкай in vitro.Фагавая ўпакоўка in vitro была праведзена ў адпаведнасці з інструкцыямі, якія ўваходзяць у камплект для кланавання T7Select 10-3b (Novagen), і раствор для ўпакоўкі быў ампліфікаваны адзін раз для лізісу з дапамогай кішачнай палачкі (BLT5615, Novagen).Лізаты центрифугировали, тытравалі і замарожвалі пры -80°C у якасці зыходнага раствора гліцэрыны.
Прамая ПЦР-ампліфікацыя варыябельных абласцей фага, ампліфікаваных у булёне або пласціне з выкарыстаннем запатэнтаваных праймераў для зліцця 454/Roche-amplicon.Праймер прамога зліцця змяшчае паслядоўнасці, якія ахопліваюць зменную вобласць (NNK) 12 (спецыфічную для шаблону), адаптар A GS FLX Titanium і паслядоўнасць ключоў бібліятэкі з чатырма базамі (TCAG) (дадатковы малюнак 1a):
Праймер зваротнага зліцця таксама змяшчае біятын, прымацаваны да захопліваючых шарыкаў, і GS FLX Titanium Adapter B, неабходны для клональной ампліфікацыі падчас эмульсійнай ПЦР:
Затым ампліконы былі падвергнуты пиросеквенированию 454/Roche у адпаведнасці з пратаколам 454 GS-FLX Titanium.Для ручнога секвенирования Sanger (аналізатар ДНК Applied Biosystems Hitachi 3730 xl) ДНК фага T7 была ампліфікавана з дапамогай ПЦР і секвенирована з дапамогай наступных пар праймераў:
Ўстаўкі з асобных бляшак падвяргалі ПЦР-ампліфікацыі з дапамогай Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (па інструкцыі вытворцы).Выканайце гарачы старт (10 хвілін пры 95 °C) і 35 цыклаў павышэння (50 секунд пры 95 °C, 1 хвіліна пры 50 °C і 1 хвіліна пры 72 °C).
Фаг з бібліятэк, фаг дзікага тыпу, фаг, выратаваны ад СМЖ і крыві, або асобныя клоны былі ампліфікаваны ў Escherichia coli BL5615 у сухотным булёне (Sigma Aldrich) або ў чашках плошчай 500 см2 (Thermo Scientific) на працягу 4 гадзін пры 37°C.Фаг экстрагавалі з пласцін прамываннем пласцін буферам Трыс-ЭДТА (Fluka Analytical) або зборам бляшак стэрыльнымі наканечнікамі піпеткі.Фагі вылучалі з культуральнага супернатанту або буфера для экстракцыі з дапамогай аднаго раунда асаджэння поліэтыленгліколем (ПЭГ 8000) (Promega) і рэсуспендавалі ў буферы Трыс-ЭДТА.
Ампліфікаваны фаг быў падвергнуты 2-3 этапам выдалення эндатаксіну з выкарыстаннем шарыкаў для выдалення эндатаксіну (Miltenyi Biotec) перад нутравеннай (IV) ін'екцыяй (500 мкл/жывёла).У першым раундзе было ўведзена 2×1012 фагаў;у другім — 2×1010 фагаў;у трэцім і чацвёртым раундах адбору, 2×109 фагаў на жывёлу.Утрыманне фага ў СМЖ і ўзорах крыві, сабраных у пазначаныя моманты часу, вызначалі шляхам падліку бляшак у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы (інструкцыя па сістэме T7Select).Адбор фага праводзіўся шляхам нутравенных ін'екцый вычышчаных бібліятэк у хваставую вену або шляхам паўторнай ін'екцыі фага, экстрагаванага з СМЖ з папярэдняга раунда адбору, а наступныя зборы праводзіліся праз 10 мін, 30 мін, 60 мін, 90 мін, 120 мін, 180 мін і 240 мін адпаведна ўзораў СМЖ і крыві.У агульнай складанасці было праведзена чатыры раунда панарамавання in vivo, у якіх дзве выбраныя галіны захоўваліся асобна і аналізаваліся падчас першых трох раундаў адбору.Усе фагавыя ўстаўкі, выдзеленыя з СМЖ з першых двух раундаў адбору, былі падвергнуты пиросеквенированию 454/Роша, у той час як усе клоны, вынятыя з СМЖ з апошніх двух раундаў адбору, секвенировали ўручную.Усе фагі крыві з першага раунда адбору таксама былі падвергнуты пиросеквенированию 454/Roche.Для ін'екцыі фагавых клонаў адабраныя фагі амплифицировали ў E. coli (BL5615) на пласцінах плошчай 500 см2 пры 37°C на працягу 4 гадзін.Індывідуальна адабраныя і секвенированные ўручную клоны размнажалі ў туберкулёзным асяроддзі.Пасля экстракцыі фага, ачысткі і выдалення эндатаксіну (як апісана вышэй), 2×1010 фагаў/жывёла ў 300 мкл ўводзілі нутравенна ў адну хваставую вену.
Папярэдняя апрацоўка і якасная фільтрацыя дадзеных паслядоўнасці.Неапрацаваныя дадзеныя 454/Roche былі пераўтвораны з двайковага стандартнага фармату карты патоку (sff) у фармат Pearson, які чытаецца чалавекам (fasta) з дапамогай праграмнага забеспячэння пастаўшчыка.Далейшая апрацоўка нуклеатыднай паслядоўнасці была праведзена з выкарыстаннем запатэнтаваных праграм і сцэнарыяў на C (нявыдадзены пакет праграм), як апісана ніжэй.Аналіз першасных даных прадугледжвае строгую шматэтапную фільтрацыю.Каб адфільтраваць паказанні, якія не ўтрымлівалі сапраўднай 12-мернай паслядоўнасці ўстаўкі ДНК, чытанні былі паслядоўна выраўнаваны па пачатковай метцы (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), стоп-метцы (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) і фонавай устаўцы (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) з дапамогай глабальнага тэсту Нідлмана-Вунша.выраўноўванне, якое дапускае да 2 неадпаведнасцей на адно выраўноўванне31.Такім чынам, чытанні без тэгаў пачатку і прыпынку і чытанні, якія змяшчаюць фонавыя ўстаўкі, г.зн. выраўноўванні, якія перавышаюць дазволеную колькасць несупадзенняў, былі выдалены з бібліятэкі.Што тычыцца астатніх чытанняў, паслядоўнасць ДНК N-mer, якая распасціраецца ад пачатковай пазнакі і заканчваецца перад пазнакай прыпынку, была выдзелена з зыходнай паслядоўнасці счытвання і апрацавана далей (далей "устаўка").Пасля трансляцыі ўстаўкі частка пасля першага стоп-кодона на 5'-канцы праймера выдаляецца з устаўкі.Акрамя таго, нуклеатыды, якія вядуць да няпоўных кадонаў на 3'-канцы праймера, таксама былі выдалены.Каб выключыць устаўкі, якія змяшчаюць толькі фонавыя паслядоўнасці, былі таксама выдалены трансляваныя ўстаўкі, якія пачынаюцца з амінакіслотнага малюнка "PAG".Пептыды з посттрансляционной даўжынёй менш за 3 амінакіслоты былі выдалены з бібліятэкі.Нарэшце, выдаліце ​​празмернасць у пуле ўставак і вызначыце частату кожнай унікальнай устаўкі.Вынікі гэтага аналізу ўключалі спіс нуклеатыдных паслядоўнасцей (уставак) і іх (чытанне) частот (дадатковыя малюнкі 1c і 2).
Згрупуйце ўстаўкі ДНК N-mer па падабенстве паслядоўнасці: каб ліквідаваць памылкі секвеніравання, характэрныя для 454/Roche (напрыклад, праблемы з секвенированием гомополимерных пашырэнняў) і выдаліць менш важныя празмернасці, раней адфільтраваныя ўстаўкі паслядоўнасці N-mer ДНК (устаўкі) сартуюцца па падабенстве.устаўкі (дазваляецца да 2 несупадаючых баз) з выкарыстаннем ітэрацыйнага алгарытму, вызначанага наступным чынам: устаўкі сартуюцца спачатку па іх частаце (ад самых высокіх да самых нізкіх), а калі яны аднолькавыя, па другасным сартаванні па даўжыні (ад самых доўгіх да самых кароткіх)).Такім чынам, найбольш частыя і доўгія ўстаўкі вызначаюць першую «групу».Групавая частата ўсталёўваецца на ключавую частату.Затым кожную ўстаўку, якая засталася ў адсартаваным спісе, спрабавалі дадаць у групу шляхам парнага выраўноўвання Нідлмана-Вунша.Калі колькасць неадпаведнасцяў, уставак або выдаленняў у выраўноўванні не перавышае парогавае значэнне ў 2, устаўка дадаецца ў групу, і агульная частата групы павялічваецца на тое, наколькі часта дадавалася ўстаўка.Укладышы, дададзеныя ў групу, пазначаюцца як выкарыстаныя і выключаюцца з далейшай апрацоўкі.Калі паслядоўнасць устаўкі немагчыма дадаць да ўжо існуючай групы, паслядоўнасць устаўкі выкарыстоўваецца для стварэння новай групы з адпаведнай частатой устаўкі і пазначаецца як выкарыстаная.Ітэрацыя заканчваецца, калі кожная паслядоўнасць устаўкі альбо выкарыстоўваецца для стварэння новай групы, альбо можа быць уключана ва ўжо існуючую групу.У рэшце рэшт, згрупаваныя ўстаўкі, якія складаюцца з нуклеатыдаў, у канчатковым выніку транслююцца ў пептыдныя паслядоўнасці (пептыдныя бібліятэкі).Вынікам гэтага аналізу з'яўляецца набор уставак і адпаведных ім частот, якія складаюць колькасць паслядоўных чытанняў (дадатковы мал. 2).
Стварэнне матываў: На аснове спісу унікальных пептыдаў была створана бібліятэка, якая змяшчае ўсе магчымыя шаблоны амінакіслот (aa), як паказана ніжэй.Кожны магчымы ўзор даўжынёй 3 быў выняты з пептыда і яго зваротны ўзор быў дададзены разам з агульнай бібліятэкай матываў, якая змяшчае ўсе ўзоры (трипептиды).Бібліятэкі часта паўтаральных матываў былі секвеніраваны і празмернасць выдалена.Затым для кожнага трыпептыда ў бібліятэцы матываў мы праверылі яго прысутнасць у бібліятэцы з дапамогай вылічальных інструментаў.У гэтым выпадку частата пептыда, які змяшчае трыпептыд знойдзенага матыву, дадаецца і прысвойваецца матыву ў бібліятэцы матываў («колькасць матываў»).Вынікам генерацыі матыву з'яўляецца двухмерны масіў, які змяшчае ўсе ўваходжанні трыпептыдаў (матываў) і іх адпаведныя значэнні, якія з'яўляюцца колькасцю чытанняў паслядоўнасці, якія прыводзяць да адпаведнага матыву, калі чытанні фільтруюцца, групуюцца і транслююцца.Метрыкі, як апісана вышэй.
Нармалізацыя колькасці матываў і адпаведных дыяграм рассейвання: колькасць матываў для кожнага ўзору была нармалізавана з дапамогай
дзе ni - колькасць чытанняў, якія змяшчаюць тэму i.Такім чынам, vi ўяўляе працэнтную частату чытанняў (або пептыдаў), якія змяшчаюць матыў i ва ўзоры.P-значэнні для ненармалізаванай колькасці матываў былі разлічаны з дапамогай дакладнага крытэра Фішэра.Што тычыцца карэлаграм колькасці матываў, карэляцыі Спірмена былі разлічаны з выкарыстаннем нармалізаванай колькасці матываў з R.
Для візуалізацыі ўтрымання амінакіслот у кожнай пазіцыі ў бібліятэцы пептыдаў былі створаны вэб-лагаграмы 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).Па-першае, змест амінакіслот у кожным становішчы 12-мернага пептыда захоўваецца ў матрыцы 20×12.Затым набор з 1000 пептыдаў, якія змяшчаюць аднолькавае адноснае ўтрыманне амінакіслот у кожным становішчы, ствараецца ў фармаце фаст-паслядоўнасці і падаецца ў якасці ўваходных дадзеных для вэб-лагатыпа 3, які стварае графічнае адлюстраванне адноснага ўтрымання амінакіслот у кожным становішчы.для дадзенай бібліятэкі пептыдаў.Каб візуалізаваць шматмерныя наборы даных, цеплавыя карты былі створаны з выкарыстаннем унутрана распрацаванага інструмента ў R (biosHeatmap, пакет R, які яшчэ не выпушчаны).Дэндраграмы, прадстаўленыя на цеплавых картах, былі разлічаны з выкарыстаннем метаду іерархічнай кластарызацыі Уорда з метрыкай эўклідава адлегласці.Для статыстычнага аналізу дадзеных ацэнкі матываў значэнні P для ненармаванай ацэнкі былі разлічаны з дапамогай дакладнага крытэра Фішэра.P-значэнні для іншых набораў даных былі разлічаны ў R з дапамогай t-крытэрыю Ст'юдэнта або ANOVA.
Адабраныя клоны фагаў і фагі без уставак уводзілі нутравенна праз хваставую вену (2×1010 фагаў/жывёлу ў 300 мкл PBS).За дзесяць хвілін да перфузии і наступнай фіксацыі тым жа жывёлам нутравенна ўвялі 100 мкл лектыну, пазначанага DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).Праз 60 хвілін пасля ін'екцыі фага пацукам праз сэрца ўвялі 50 мл PBS, а затым 50 мл 4% PFA/PBS.Узоры мозгу дадаткова фіксавалі на ноч у 4% PFA/PBS і замочвалі ў 30% цукрозе на ноч пры 4°C.Узоры хутка замарожваюцца ў сумесі OCT.Імунагістахімічны аналіз замарожаных узораў праводзілі пры пакаёвай тэмпературы на крыясрэзах 30 мкм, заблакаваных 1% BSA і інкубаваных з поліклональнымі FITC-мечанымі антыцеламі супраць фага Т7 (Novus NB 600-376A) пры 4 °C.Вытрымаць ноч.Нарэшце, зрэзы прамывалі 3 разы PBS і даследавалі з дапамогай канфакальнага лазернага мікраскопа (Leica TCS SP5).
Усе пептыды з мінімальнай чысцінёй 98% былі сінтэзаваны GenScript USA, біятыніляваны і ліяфілізаваны.Біятын звязваецца праз дадатковы патройны спейсер гліцыну на N-канцы.Праверце ўсе пептыды з дапамогай мас-спектраметрыі.
Стрэптавідын (Sigma S0677) змешвалі з 5-кратным эквимолярным лішкам біятыніляванага пептыда, біятыніляванага інгібіруючага пептыда BACE1 або камбінацыі (суадносіны 3: 1) біятыніляванага інгібіруе пептыда BACE1 і інгібіруе пептыда BACE1 у 5–10% ДМСО/інкубаваны ў PBS.1 гадзіна пры пакаёвай тэмпературы перад ін'екцыяй.Кан'югаваныя са стрэптавідынам пептыды ўводзілі нутравенна ў дозе 10 мг/кг у адну з хваставых вен пацукоў з паражніной галаўнога мозгу.
Канцэнтрацыю стрептавидин-пептыдных комплексаў ацэньвалі метадам ІФА.Мікратытрацыйныя пласціны Nunc Maxisorp (Sigma) пакрывалі на ноч пры 4°C 1,5 мкг/мл мышыных антыцелаў супраць стрэптавідыну (Thermo, MA1-20011).Пасля блакіроўкі (блакіруючы буфер: 140 нМ NaCL, 5 мм ЭДТА, 0,05% NP40, 0,25% жэлацін, 1% BSA) пры пакаёвай тэмпературы на працягу 2 гадзін прамывайце пласціну 0,05% Tween-20/PBS (прамыўны буфер) на працягу 3 секунд, у лункі, разведзеныя блакіруючым буферам (плазма 1:), дадавалі ўзоры СМЖ і плазмы. 10 000, CSF 1:115).Затым пласціну інкубавалі на працягу ночы пры 4°C з антыцеламі для выяўлення (1 мкг/мл, анты-стрэптавідын-HRP, Novus NB120-7239).Пасля трох этапаў прамывання стрэптавідын быў выяўлены шляхам інкубацыі ў растворы субстрата TMB (Roche) на працягу да 20 хвілін.Пасля спынення афарбоўвання з дапамогай 1 М H2SO4 вымерайце паглынанне пры 450 нм.
Функцыю комплексу стрэптавідын-пептыд-інгібітар BACE1 ацэньвалі з дапамогай Aβ(1-40) ELISA у адпаведнасці з пратаколам вытворцы (Wako, 294-64701).Карацей кажучы, узоры СМЖ разводзілі ў стандартным разбаўляльніку (1:23) і інкубавалі на працягу ночы пры 4°C у 96-лункавых пласцінах, пакрытых захопліваючымі антыцеламі BNT77.Пасля пяці этапаў прамывання дадавалі HRP-кан'югаваныя антыцелы BA27 і інкубавалі 2 гадзіны пры 4°C, пасля чаго ішлі пяць этапаў прамывання.Aβ(1–40) выяўлялі шляхам інкубацыі ў растворы ТМБ на працягу 30 хвілін пры пакаёвай тэмпературы.Пасля спынення афарбоўвання стоп-растворам вымерайце абсорбцыю пры 450 нм.Узоры плазмы падвяргалі цвёрдафазнай экстракцыі перад ІФА з Aβ(1–40).Плазму дадавалі ў 0,2% DEA (Sigma) у 96-лункавыя пласціны і інкубавалі пры пакаёвай тэмпературы на працягу 30 хвілін.Пасля паслядоўнага прамывання пласцін SPE (Oasis, 186000679) вадой і 100% метанолам узоры плазмы дадаваліся ў пласціны SPE і выдалялася ўся вадкасць.Узоры прамывалі (спачатку 5% метанолам, потым 30% метанолам) і элюіравалі 2% NH4OH/90% метанолам.Пасля сушкі элюата пры 55 ° C на працягу 99 хвілін пры пастаянным току N2, узоры былі паменшаныя ў стандартных разбаўляльнікаў і Aβ (1-40) быў вымераны, як апісана вышэй.
Як цытаваць гэты артыкул: Urich, E. et al.Дастаўка грузу ў мозг з дапамогай транзітных пептыдаў, выяўленых in vivo.навука.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Lihota J., Skjorringe T., Thomsen LB і Moos T. Дастаўка макрамалекулярных прэпаратаў у мозг з дапамогай таргетную тэрапіі.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., і Martinez-Martinez, P. Дастаўка пептыдаў і бялковых прэпаратаў праз гематоэнцефаліческій бар'ер.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Пардрыдж, WM Гематоэнцефаліческій бар'ер: вузкае месца ў распрацоўцы лекаў для мозгу.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, і Byrd, A. Перспектывы паляпшэння дастаўкі лекаў і нацэльвання ў мозг праз шлях судзінкавага спляцення-ліквора.Фармацэўтычныя даследаванні 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Мадэрнізацыя биофармацевтических прэпаратаў з малекулярнымі траянскіх коней для дастаўкі мозгу.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Пардрыдж, WM рэцэптар-апасродкаваны транспарт пептыдаў праз гематоэнцефаліческій бар'ер.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. і інш.Павышэнне пранікнення ў мозг і эфектыўнасці тэрапеўтычных антыцелаў з дапамогай манавалентных малекулярных чаўнакоў.Нейрон 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Б'ен-Лі, Н. і інш.Транспарт рэцэптара трансферыну (TfR) вызначае паглынанне мозгам афінных варыянтаў антыцелаў TfR.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).