Некаторыя тэмы па ліквідацыі непаладак LC ніколі не састарэюць, паколькі ў практыцы LC існуюць праблемы, нават калі тэхналогія прыбораў паляпшаецца з цягам часу. Існуе мноства спосабаў узнікнення праблем у сістэме LC і ў канчатковым выніку дрэннай формы піка. Калі ўзнікаюць праблемы, звязаныя з формай піка, кароткі спіс магчымых прычын такіх вынікаў дапамагае спрасціць пошук непаладак.
Было весела пісаць гэтую калонку «Ліквідацыя непаладак LC» і разважаць аб тэмах кожны месяц, таму што некаторыя тэмы ніколі не выходзяць з моды. У той час як у галіне храматаграфічных даследаванняў пэўныя тэмы або ідэі састарэлі, бо яны выцясняюцца больш новымі і лепшымі ідэямі, у галіне пошуку і ліквідацыі непаладак першы артыкул аб ліквідацыі непаладак з'явіўся ў гэтым часопісе (у той час LC Journal), паколькі некаторыя тэмы ўсё яшчэ актуальныя) у 1983 (1) ).За апошнія некалькі гадоў я засяродзіў некалькі раздзелаў па ліквідацыі непаладак LC на сучасных тэндэнцыях, якія ўплываюць на вадкасную храматаграфію (LC) (напрыклад, адноснае параўнанне нашага разумення ўплыву ціску на ўтрыманне [2] Новыя дасягненні) Наша інтэрпрэтацыя вынікаў LC і спосабы ліквідацыі непаладак з дапамогай сучасных прыбораў LC. У выпуску гэтага месяца я працягваю сваю серыю (3), якая пачалася ў снежні 2021 г. і засяродзілася на некаторыя з тэм «жыццё і смерць» пры ліквідацыі непаладак LC — элементы, якія выдатна падыходзяць для любога інструмента ліквідацыі непаладак, важныя, незалежна ад узросту сістэмы, якую мы выкарыстоўваем. Асноўная тэма гэтай серыі вельмі актуальная для знакамітай насценнай табліцы LCGC «Кіраўніцтва па ліквідацыі непаладак LC» (4), якая вісіць у многіх лабараторыях. У трэцяй частцы гэтай серыі я вырашыў засяродзіцца на пытаннях, звязаных з формай піка або пікавымі характарыстыкамі. Неверагодна, але насценны графік пералічвае 44 розныя патэнцыйныя прычыны дрэннай пікавай формы! Мы не можам падрабязна разгледзець усе гэтыя праблемы ў адным артыкуле, таму ў гэтай першай частцы па гэтай тэме я спынюся на некаторых з тых, з якімі я сутыкаюся часцей за ўсё. Я спадзяюся, што маладыя і старыя карыстальнікі LC знойдуць некалькі карысных парад і напамінкаў па гэтай важнай тэме.
Я лічу, што ўсё часцей адказваю на пытанні па ліквідацыі непаладак словам "усё магчыма". Гэты адказ можа здацца простым, калі разглядаць назіранні, якія цяжка інтэрпрэтаваць, але я лічу, што ён часта дарэчны. З-за многіх магчымых прычын дрэннай формы піка важна захоўваць неабдуманасць, разглядаючы, у чым можа быць праблема, і мець магчымасць расставіць прыярытэты патэнцыйных прычын, каб пачаць нашы намаганні па ліквідацыі непаладак, засяроджваючыся на найбольш распаўсюджаных магчымасцях, гэты пункт вельмі важны. магчыма.
Ключавым крокам у любым практыкаванні па ліквідацыі непаладак, але я лічу яго недаацэненым, з'яўляецца прызнанне таго, што існуе праблема, якую трэба вырашыць. Прызнанне таго, што праблема існуе, часта азначае прызнанне таго, што тое, што адбываецца з інструментам, адрозніваецца ад нашых чаканняў, якія фарміруюцца тэорыяй, эмпірычнымі ведамі і вопытам (5). "Форма піка", згаданая тут, насамрэч адносіцца не толькі да формы піка (сіметрычнай, асіметрычнай, гладкай). , пушысты, пярэдні край, хвост і г.д.), але таксама і да шырыні. Нашы чаканні адносна фактычнай формы піка простыя. Тэорыя (6) добра падтрымлівае чаканне падручніка аб тым, што ў большасці выпадкаў храматаграфічныя пікі павінны быць сіметрычнымі і адпавядаць форме размеркавання Гаўса, як паказана на малюнку 1а. Тое, што мы чакаем ад шырыні піка, з'яўляецца больш складаным пытаннем, і мы абмяркуем гэтую тэму ў наступным артыкуле. Іншая форма піка s на малюнку 1 паказваюць некаторыя іншыя магчымасці, якія могуць назірацца - іншымі словамі, некаторыя спосабы, па якіх усё можа пайсці не так. У астатняй частцы гэтага раздзела мы прысвяцім час абмеркаванню некаторых канкрэтных прыкладаў сітуацый, якія могуць прывесці да гэтых тыпаў фігур.
Часам пікі наогул не назіраюцца на храматаграме там, дзе яны, як чакаецца, будуць элюіраваны. Прыведзеная вышэй насценная дыяграма паказвае, што адсутнасць піка (пры ўмове, што ўзор насамрэч змяшчае мэтавы аналіт у канцэнтрацыі, якая павінна зрабіць рэакцыю дэтэктара дастатковай, каб убачыць яго вышэй за шум) звычайна звязана з нейкай праблемай прыбора або няправільнымі ўмовамі рухомай фазы (калі назіраецца наогул).пікі, звычайна занадта «слабыя»). Кароткі спіс магчымых праблем і рашэнняў у гэтай катэгорыі можна знайсці ў табліцы I.
Як згадвалася вышэй, пытанне аб тым, наколькі пашырэнне піка трэба дапусціць, перш чым звяртаць увагу і спрабаваць яго выправіць, з'яўляецца складанай тэмай, якую я абмяркую ў будучым артыкуле. З майго вопыту значнае пашырэнне піка часта суправаджаецца значнай зменай формы піка, а хвост піку часцей сустракаецца, чым папярэдні пік або расшчапленне. Аднак намінальна сіметрычныя пікі таксама пашыраны, што можа быць выклікана некалькімі рознымі прычынамі:
Кожная з гэтых праблем падрабязна абмяркоўвалася ў папярэдніх выпусках Troubleshooting LC, і чытачы, якія цікавяцца гэтымі тэмамі, могуць звярнуцца да гэтых папярэдніх артыкулаў для атрымання інфармацыі аб асноўных прычынах і магчымых рашэннях гэтых праблем.Больш падрабязна.
Хвасты пікаў, пераход да пікаў і расшчапленне могуць быць выкліканыя хімічнымі або фізічнымі з'явамі, і спіс патэнцыйных рашэнняў гэтых праблем вар'іруецца ў залежнасці ад таго, з хімічнай ці фізічнай праблемай мы сутыкаемся. Часта, параўноўваючы розныя пікі на храматаграме, можна знайсці важныя падказкі аб тым, хто з'яўляецца вінаватым. Калі ўсе пікі на храматаграме маюць аднолькавую форму, прычына, хутчэй за ўсё, не фізічная .Калі закрануты толькі адзін або некалькі пікаў, а астатнія выглядаюць нармальна, прычына, хутчэй за ўсё, хімічная.
Хімічныя прычыны пікавага абмежавання занадта складаныя, каб іх коратка абмяркоўваць тут. Зацікаўленага чытача адсылаем да нядаўняга выпуску «Ліквідацыі непаладак LC» для больш глыбокага абмеркавання (10). Аднак лёгка паспрабаваць паменшыць масу ўведзенага аналіту і паглядзець, ці палепшыцца форма піка. Калі так, то гэта добрая падказка таго, што праблема ў «перагрузцы масы». У гэтым выпадку метад павінен быць абмежаваны ін'екцыяй. невялікія масы аналіту, або ўмовы храматаграфіі павінны быць зменены так, каб можна было атрымаць добрую форму пікаў нават пры ўвядзенні вялікіх мас.
Ёсць таксама шмат патэнцыйных фізічных прычын для пікавага хваста. Чытачы, зацікаўленыя ў дэталёвым абмеркаванні магчымасцей, адсылаюцца да іншага нядаўняга выпуску «LC Troubleshooting» (11). Адной з найбольш распаўсюджаных фізічных прычын пікавага хваста з'яўляецца дрэннае злучэнне ў кропцы паміж інжэктарам і дэтэктарам (12). Экстрэмальны прыклад паказаны на малюнку 1d, атрыманым у маёй лабараторыі некалькі тыдняў таму. У гэтым выпадку мы пабудавалі сістэму з новай ін'екцыяй клапан, які мы раней не выкарыстоўвалі, і ўсталявалі пятлю ўпырску невялікага аб'ёму з наканечнікам, які быў адліты на капіляр з нержавеючай сталі. Пасля некалькіх першапачатковых эксперыментаў па ліквідацыі непаладак мы зразумелі, што глыбіня порта ў статары клапана ўпырску была значна большай, чым мы прывыклі, што прывяло да вялікага мёртвага аб'ёму ў ніжняй частцы порта. Гэтую праблему лёгка вырашыць, замяніўшы пятлю ўпырску іншай трубкай, мы можам адрэгуляваць жалеза у патрэбнае становішча, каб ліквідаваць мёртвы аб'ём у ніжняй частцы порта.
Пікавыя франты, падобныя на тыя, што паказаны на малюнку 1e, таксама могуць быць выкліканы фізічнымі або хімічнымі праблемамі. Распаўсюджанай фізічнай прычынай пярэдняга краю з'яўляецца тое, што пласт часціц у калоне дрэнна ўпакаваны або часціцы рэарганізаваліся з цягам часу. Як і ў выпадку з хвастом пікаў, выкліканым гэтай фізічнай з'явай, лепшы спосаб выправіць гэта - замяніць калону і працягваць ісці. Па сутнасці, формы пікаў пярэдняга краю з хімічным паходжаннем часта ўзнікаюць з-за таго, што мы называем «не- лінейныя” ўмовы ўтрымання. У ідэальных (лінейных) умовах колькасць аналіту, які ўтрымліваецца ў нерухомай фазе (такім чынам, каэфіцыент утрымання), лінейна залежыць ад канцэнтрацыі аналіту ў калонцы. Храматаграфічна гэта азначае, што па меры павелічэння масы аналіту, уведзенага ў калонку, пік становіцца вышэй, але не шырэй. Гэтая залежнасць парушаецца, калі паводзіны ўтрымання нелінейныя, і пікі не толькі становяцца та больш, але і шырэй па меры ўвядзення большай масы. Акрамя таго, нелінейныя формы вызначаюць форму храматаграфічных пікаў, што прыводзіць да пярэдніх або задніх краёў. Як і ў выпадку з перагрузкай масы, якая выклікае хвост піку (10), апярэджанне піку, выкліканае нелінейным утрыманнем, таксама можа быць дыягнаставана шляхам памяншэння масы ўведзенага аналіту. Калі форма піка паляпшаецца, метад павінен быць зменены, каб не перавышаць якасць ін'екцыі, якая выклікае пярэдні край, або храматаграфічныя ўмовы павінны быць зменены, каб мінімізаваць гэта паводзіны.
Часам мы назіраем тое, што выглядае як «падзелены» пік, як паказана на малюнку 1f. Першым крокам у вырашэнні гэтай праблемы з'яўляецца вызначэнне таго, ці з'яўляецца форма піку частковым суэлюіраваннем (г.зн. прысутнасцю двух розных, але блізка элюіраваных злучэнняў). Калі насамрэч два розныя аналіты элюіруюць блізка адзін да аднаго, то гэта пытанне паляпшэння іх раздзялення (напрыклад, за кошт павышэння селектыўнасці, утрымання або колькасці пласцінак) і відавочнага «раздвоеныя» пікі звязаны з фізічнай прадукцыйнасцю. Прадукцыйнасць не мае нічога агульнага з самой калонкай. Часта найбольш важнай падказкай для гэтага рашэння з'яўляецца тое, ці маюць усе пікі на храматаграме раздвоеныя формы, ці толькі адзін ці два. Калі гэта толькі адзін ці два, гэта, верагодна, праблема сумеснага вылучэння;калі ўсе пікі падзеленыя, верагодна, гэта фізічная праблема, хутчэй за ўсё, звязаная з самой калонкай.
Раздвоеныя пікі, звязаныя з фізічнымі ўласцівасцямі самой калоны, звычайна ўзнікаюць з-за часткова заблакаванай фрыты на ўваходзе або выхадзе або рэарганізацыі часціц у калоне, што дазваляе рухомай фазе цячы хутчэй, чым рухомая фаза ў пэўных раёнах фарміравання канала калоны. У іншых рэгіёнах (11). Часткова забітую фрыту часам можна ачысціць, перавярнуўшы паток праз калону;аднак, з майго досведу, гэта звычайна кароткатэрміновае, а не доўгатэрміновае рашэнне. У сучасных калонах гэта часта бывае фатальным, калі часціцы рэкамбінуюць у калонцы. У гэты момант лепш замяніць калонку і працягваць.
Пік на малюнку 1g, таксама з нядаўняга выпадку ў маёй уласнай лабараторыі, звычайна паказвае на тое, што сігнал настолькі высокі, што ён дасягнуў верхняй мяжы дыяпазону рэакцыі. Для аптычных дэтэктараў паглынання (у дадзеным выпадку ў УФ), калі канцэнтрацыя аналіту вельмі высокая, аналіт паглынае большую частку святла, якое праходзіць праз праточную ячэйку дэтэктара, пакідаючы для выяўлення вельмі мала святла. У гэтых умовах на электрычны сігнал ад фотадэтэктара моцна ўплываюць розныя крыніцы. шуму, напрыклад, рассеянага святла і «цёмнага току», што робіць сігнал вельмі «невыразным» на выгляд і не залежыць ад канцэнтрацыі аналіту.Калі гэта адбываецца, праблему часта можна лёгка вырашыць шляхам памяншэння аб'ёму ўпырсквання аналіту - памяншэння аб'ёму ўпырску, развядзення пробы або абодвух.
У школе храматаграфіі мы выкарыстоўваем сігнал дэтэктара (г.зн. восі Y у храматаграме) у якасці паказчыка канцэнтрацыі аналіту ў пробе. Таму, здаецца, дзіўна бачыць храматаграму з сігналам ніжэй за нуль, бо простае тлумачэнне заключаецца ў тым, што гэта паказвае на адмоўную аналітычную канцэнтрацыю-якая, вядома, не з'яўляецца фізічна магчымай. V-vis).
У гэтым выпадку адмоўны пік проста азначае, што малекулы, якія вылучаюцца з калонкі, паглынаюць менш святла, чым сама рухомая фаза непасрэдна перад і пасля піку. Гэта можа адбыцца, напрыклад, пры выкарыстанні адносна нізкіх даўжынь хваль выяўлення (<230 нм) і дадаткаў рухомай фазы, якія паглынаюць большую частку святла на гэтых даўжынях хваль. Такімі дадаткамі могуць быць кампаненты растваральніка рухомай фазы, такія як метанол, або буферныя кампаненты, такія як ацэтат або фарміят. адмоўныя пікі для падрыхтоўкі калібравальнай крывой і атрымання дакладнай колькаснай інфармацыі, таму няма фундаментальных прычын пазбягаць іх саміх па сабе (гэты метад часам называюць «непрамым ультрафіялетавым выяўленнем») (13). Аднак, калі мы сапраўды жадаем наогул пазбегнуць адмоўных пікаў, у выпадку выяўлення паглынальнай здольнасці лепшым рашэннем будзе выкарыстоўваць іншую даўжыню хвалі выяўлення, каб аналіт паглынаў больш, чым рухомая фаза, або змяніць склад рухомай фазы такім чынам што яны паглынаюць менш святла, чым аналіты.
Адмоўныя пікі таксама могуць з'яўляцца пры выкарыстанні выяўлення паказчыка праламлення (RI), калі паказчык праламлення іншых кампанентаў, акрамя аналіту ва ўзоры, такіх як матрыца растваральніка, адрозніваецца ад паказчыка праламлення рухомай фазы. Гэта таксама адбываецца пры выяўленні ў УФ-віку, але гэты эфект, як правіла, аслабляецца ў параўнанні з выяўленнем RI. У абодвух выпадках адмоўныя пікі можна звесці да мінімуму шляхам больш дакладнага супадзення складу матрыцы ўзору да рухомай фазы.
У трэцяй частцы, прысвечанай асноўнай тэме ліквідацыі непаладак LC, я абмяркоўваў сітуацыі, у якіх назіраная форма піка адрозніваецца ад чаканай або нармальнай формы піка. Эфектыўнае ліквідацыю такіх праблем пачынаецца з ведання чаканых формаў пікаў (на аснове тэорыі або папярэдняга вопыту прымянення існуючых метадаў), так што адхіленні ад гэтых чаканняў відавочныя. Праблемы з формай піка маюць мноства розных патэнцыйных прычын (занадта шырокі, хвост, пярэдні край і г. д.). У гэтай частцы я падрабязна абмяркоўваю некаторыя прычыны Я сустракаюся часцей за ўсё. Веданне гэтых дэталяў дае добры пачатак для пошуку і ліквідацыі непаладак, але не ахоплівае ўсе магчымасці. Чытачы, зацікаўленыя ў больш глыбокім спісе прычын і рашэнняў, могуць звярнуцца да насценнай табліцы LCGC «Кіраўніцтва па ліквідацыі непаладак LC».
(4) Насценная табліца LCGC «Кіраўніцтва па ліквідацыі непаладак LC». https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) А. Фелінгер, Аналіз дадзеных і апрацоўка сігналаў у храматаграфіі (Elsevier, Нью-Ёрк, штат Нью-Ёрк, 1998), стар. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF і Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.