Некаторыя тэмы пошуку і ліквідацыі непаладак вадкаснага катранера ніколі не састарэюць, бо праблемы ўзнікаюць і ў практыцы вадкаснага катранера, нават калі тэхналогія прыбораў з цягам часу ўдасканальваецца. Існуе мноства спосабаў узнікнення праблем у сістэме вадкаснага катранера і прывядзення да дрэннай формы піка. Калі ўзнікаюць праблемы, звязаныя з формай піка, кароткі спіс магчымых прычын гэтых вынікаў дапамагае спрасціць наш працэс пошуку і ліквідацыі непаладак.
Было весела пісаць гэтую калонку «Ліквідацыя непаладак ВХ» і разважаць пра тэмы кожны месяц, бо некаторыя тэмы ніколі не выходзяць з моды. У той час як у галіне храматаграфіі некаторыя тэмы ці ідэі састарэлі, бо іх выцеснілі новыя і лепшыя ідэі, у галіне ліквідацыі непаладак, з моманту з'яўлення першага артыкула пра ліквідацыю непаладак у гэтым часопісе (у той час часопісе LC Journal), паколькі некаторыя тэмы дагэтуль актуальныя) у 1983 годзе (1). За апошнія некалькі гадоў я сканцэнтраваў некалькі раздзелаў пра ліквідацыю непаладак ВХ на сучасных тэндэнцыях, якія ўплываюць на вадкасную храматаграфію (ВХ) (напрыклад, адноснае параўнанне нашага разумення ўплыву ціску на ўтрыманне [2] Новыя дасягненні), нашай інтэрпрэтацыі вынікаў ВХ і спосабах ліквідацыі непаладак з дапамогай сучасных прыбораў ВХ. У гэтым месяцы я працягваю сваю серыю (3), якая пачалася ў снежні 2021 года і была прысвечана некаторым «жыццёва-смяротным» тэмам ліквідацыі непаладак ВХ — элементы, якія выдатна падыходзяць для любога спецыяліста па ліквідацыі непаладак, з'яўляюцца неабходнымі, незалежна ад узросту сістэмы, якую мы выкарыстоўваем. Асноўная тэма гэтай серыі вельмі актуальная для знакамітай насценнай дыяграмы LCGC «Кіраўніцтва па ліквідацыі непаладак ВХ» (4), якая вісіць у... многія лабараторыі. У трэцяй частцы гэтай серыі я вырашыў засяродзіцца на пытаннях, звязаных з формай піка або характарыстыкамі піка. Дзіўна, але на насценнай табліцы пералічаны 44 розныя патэнцыйныя прычыны дрэннай формы піка! Мы не можам падрабязна разгледзець усе гэтыя праблемы ў адным артыкуле, таму ў гэтай першай частцы па гэтай тэме я засяроджуся на некаторых з тых, якія я бачу часцей за ўсё. Спадзяюся, што маладыя і старыя карыстальнікі ВХ знойдуць карысныя парады і напаміны па гэтай важнай тэме.
Я ўсё часцей адказваю на пытанні па ліквідацыі непаладак словам «усё магчыма». Гэты адказ можа здацца простым, калі разглядаць назіранні, якія цяжка інтэрпрэтаваць, але я лічу яго часта дарэчным. Пры наяўнасці мноства магчымых прычын дрэннай формы піка важна быць адкрытым да разважанняў, разглядаючы, у чым можа быць праблема, і мець магчымасць расставіць прыярытэты патэнцыйных прычын, каб пачаць нашы намаганні па ліквідацыі непаладак, засяродзіўшыся на найбольш распаўсюджаных магчымасцях, гэты момант вельмі важны.
Ключавы крок у любой практыцы па ліквідацыі непаладак — але той, які, на маю думку, недаацэньваецца — гэта прызнанне таго, што існуе праблема, якую трэба вырашыць. Прызнанне таго, што праблема існуе, часта азначае прызнанне таго, што тое, што адбываецца з інструментам, адрозніваецца ад нашых чаканняў, якія сфарміраваны тэорыяй, эмпірычнымі ведамі і вопытам (5). «Форма піка», пра якую тут гаворыцца, насамрэч адносіцца не толькі да формы піка (сіметрычная, асіметрычная, гладкая, пышная, пярэдні край, хвост і г.д.), але і да шырыні. Нашы чаканні адносна рэальнай формы піка простыя. Тэорыя (6) добра пацвярджае чаканне з падручніка, што ў большасці выпадкаў храматаграфічныя пікі павінны быць сіметрычнымі і адпавядаць форме гаўсавага размеркавання, як паказана на малюнку 1a. Тое, што мы чакаем ад шырыні пікаў, — гэта больш складанае пытанне, і мы абмяркуем гэтую тэму ў наступным артыкуле. Іншыя формы пікаў на малюнку 1 паказваюць некаторыя іншыя магчымасці, якія можна назіраць, — іншымі словамі, некаторыя са спосабаў, якімі могуць пайсці не так. У астатняй частцы гэтай часткі мы прысвяцім час абмеркаванню некаторых канкрэтных прыкладаў сітуацый, якія могуць прывесці да гэтых тыпаў формы.
Часам пікі зусім не назіраюцца на храматаграме там, дзе яны павінны быць элюяваныя. Прыведзеная вышэй насценная табліца паказвае, што адсутнасць піка (пры ўмове, што ўзор сапраўды змяшчае мэтавы аналіт у канцэнтрацыі, якая павінна зрабіць рэакцыю дэтэктара дастатковай, каб убачыць яго вышэй за шум) звычайна звязана з нейкай праблемай прыбора або няправільнымі ўмовамі рухомай фазы (калі наогул назіраюцца). Пікі, звычайна занадта «слабыя»). Кароткі спіс патэнцыйных праблем і рашэнняў у гэтай катэгорыі можна знайсці ў Табліцы I.
Як ужо згадвалася вышэй, пытанне аб тым, наколькі шырокае пашырэнне піка павінна быць дапушчальным, перш чым звяртаць на яго ўвагу і спрабаваць выправіць яго, — складаная тэма, якую я абмяркую ў наступным артыкуле. Мой вопыт паказвае, што значнае пашырэнне піка часта суправаджаецца значнай зменай формы піка, і «хваст» піка сустракаецца часцей, чым перадпікавая стадыя або расшчэпленне. Аднак намінальна сіметрычныя пікі таксама пашыраюцца, што можа быць выклікана некалькімі рознымі прычынамі:
Кожная з гэтых праблем была падрабязна абмеркавана ў папярэдніх выпусках часопіса «Ліквідацыя непаладак LC», і чытачы, зацікаўленыя ў гэтых тэмах, могуць звярнуцца да гэтых папярэдніх артыкулаў, каб атрымаць інфармацыю аб першапрычынах і магчымых рашэннях гэтых праблем. Больш падрабязна.
Хвост піка, франтальны выступ піка і расшчэпліванне могуць быць выкліканы хімічнымі або фізічнымі з'явамі, і спіс магчымых рашэнняў гэтых праблем моцна адрозніваецца ў залежнасці ад таго, ці маем мы справу з хімічнай або фізічнай праблемай. Часта, параўноўваючы розныя пікі на храматаграме, можна знайсці важныя падказкі аб тым, які з іх з'яўляецца вінаватым. Калі ўсе пікі на храматаграме маюць падобную форму, прычына, хутчэй за ўсё, не фізічная. Калі пашкоджаны толькі адзін або некалькі пікаў, але астатнія выглядаюць добра, прычына, хутчэй за ўсё, хімічная.
Хімічныя прычыны хваставання пікаў занадта складаныя, каб коратка абмяркоўваць іх тут. Зацікаўленаму чытачу варта звярнуцца да нядаўняга выпуску «Ліханне вадкаснай хроматографіі» для больш падрабязнага абмеркавання (10). Аднак можна лёгка паспрабаваць паменшыць масу ўведзенага аналіту і паглядзець, ці палепшыцца форма піка. Калі так, то гэта добрая падказка, што праблема заключаецца ў «перагрузцы масай». У гэтым выпадку метад павінен быць абмежаваны ўвядзеннем малых мас аналіту або змяніць храматаграфічныя ўмовы, каб можна было атрымаць добрую форму пікаў нават пры ўведзеных большых масах.
Існуе таксама шмат патэнцыйных фізічных прычын знікнення пікаў. Чытачам, зацікаўленым у падрабязным абмеркаванні магчымасцей, варта звярнуцца да іншага нядаўняга выпуску часопіса «Лахаванне і ліквідацыя непаладак LC» (11). Адной з найбольш распаўсюджаных фізічных прычын знікнення пікаў з'яўляецца дрэннае злучэнне ў кропцы паміж інжэктарам і дэтэктарам (12). Экстрэмальны прыклад паказаны на малюнку 1d, атрыманым у маёй лабараторыі некалькі тыдняў таму. У гэтым выпадку мы пабудавалі сістэму з новым інжэктарным клапанам, які раней не выкарыстоўвалі, і ўсталявалі інжэктарную пятлю невялікага аб'ёму з абмоткай, якая была адліта на капіляр з нержавеючай сталі. Пасля некаторых пачатковых эксперыментаў па ліквідацыі непаладак мы зразумелі, што глыбіня порта ў статары інжэктарнага клапана значна глыбейшая, чым мы прывыклі, што прывяло да вялікага мёртвага аб'ёму ў ніжняй частцы порта. Гэтую праблему лёгка вырашыць, замяніўшы інжэктарную пятлю іншай трубкай, мы можам адрэгуляваць абмотку ў патрэбнае становішча, каб ліквідаваць мёртвы аб'ём у ніжняй частцы порта.
Фронты пікаў, падобныя да паказаных на малюнку 1e, таксама могуць быць выкліканыя фізічнымі або хімічнымі праблемамі. Распаўсюджанай фізічнай прычынай пярэдняга краю з'яўляецца тое, што часціцы ў калоне дрэнна ўпакаваныя або часціцы з часам пераарганізаваліся. Як і ў выпадку з хвастамі пікаў, выкліканымі гэтай фізічнай з'явай, лепшы спосаб выправіць гэта — замяніць калону і працягваць працу. Па сутнасці, формы пікаў пярэдняга краю хімічнага паходжання часта ўзнікаюць з-за таго, што мы называем «нелінейнымі» ўмовамі ўтрымання. У ідэальных (лінейных) умовах колькасць аналіту, якая ўтрымліваецца стацыянарнай фазай (адсюль і каэфіцыент утрымання), лінейна звязана з канцэнтрацыяй аналіту ў калоне. Храматаграфічна гэта азначае, што па меры павелічэння масы аналіту, які ўводзіцца ў калону, пік становіцца вышэйшым, але не шырэйшым. Гэтая залежнасць парушаецца, калі паводзіны ўтрымання нелінейныя, і пікі становяцца не толькі вышэйшымі, але і шырэйшымі па меры ўвядзення большай масы. Акрамя таго, нелінейныя формы вызначаюць форму храматаграфічных пікаў, што прыводзіць да пярэдніх або задніх краёў. Як і ў выпадку з перагрузкай масай, якая выклікае хвасты пікаў (10), лідарства пікаў, выкліканае Нелінейнае ўтрыманне таксама можна дыягнаставаць шляхам зніжэння масы ўведзенага аналіту. Калі форма піка паляпшаецца, метад неабходна змяніць, каб не перавышаць якасць ўвядзення, якая выклікае пярэдні край, або змяніць храматаграфічныя ўмовы, каб мінімізаваць гэтую паводзіны.
Часам мы назіраем тое, што выглядае як «раздзелены» пік, як паказана на малюнку 1f. Першы крок у вырашэнні гэтай праблемы — вызначыць, ці з'яўляецца форма піка вынікам частковай сумеснай элюцыі (г.зн. прысутнасці двух розных, але блізка элюіруемых злучэнняў). Калі насамрэч два розныя аналіты элюіруюцца блізка адзін да аднаго, то гаворка ідзе пра паляпшэнне іх раздзяляльнай здольнасці (напрыклад, шляхам павелічэння селектыўнасці, утрымання або колькасці пласцін), і бачныя «раздзеленыя» пікі звязаны з фізічнымі характарыстыкамі. Прадукцыйнасць не мае нічога агульнага з самой калонкай. Часта найважнейшай падказкай для гэтага рашэння з'яўляецца тое, ці ўсе пікі на храматаграме маюць раздзельную форму, ці толькі адзін ці два. Калі гэта толькі адзін ці два, гэта, верагодна, праблема сумеснай элюцыі; калі ўсе пікі раздзелены, гэта, верагодна, фізічная праблема, хутчэй за ўсё, звязаная з самой калонкай.
Расшчэпленыя пікі, звязаныя з фізічнымі ўласцівасцямі самой калоны, звычайна ўзнікаюць з-за часткова заблакаваных уваходных або выходных фрытаў або рэарганізацыі часціц у калоне, што дазваляе рухомай фазе цячы хутчэй, чым рухомая фаза ў пэўных зонах фарміравання канала калоны ў іншых зонах (11). Часткова забітую фрыту часам можна ачысціць, змяніўшы кірунак патоку праз калону; аднак, па маім вопыце, гэта звычайна кароткатэрміновае, а не доўгатэрміновае рашэнне. Гэта часта бывае фатальна з сучаснымі калонамі, калі часціцы рэкамбінуюцца ўнутры калоны. У гэты момант лепш за ўсё замяніць калону і працягнуць працу.
Пік на малюнку 1g, таксама нядаўна выяўлены ў маёй лабараторыі, звычайна паказвае, што сігнал настолькі высокі, што дасягнуў верхняй мяжы дыяпазону рэакцыі. Для аптычных дэтэктараў паглынання (у дадзеным выпадку УФ-бачнага выпраменьвання), калі канцэнтрацыя аналіту вельмі высокая, аналіт паглынае большую частку святла, якое праходзіць праз праточную ячэйку дэтэктара, пакідаючы вельмі мала святла для выяўлення. У гэтых умовах на электрычны сігнал ад фотадэтэктара моцна ўплываюць розныя крыніцы шуму, такія як рассеянае святло і «цёмны ток», што робіць сігнал вельмі «размытым» па вонкавым выглядзе і не залежыць ад канцэнтрацыі аналіту. Калі гэта адбываецца, праблему часта можна лёгка вырашыць, паменшыўшы аб'ём увядзення аналіту — паменшыўшы аб'ём увядзення, развёўшы ўзор або і тое, і другое.
У храматаграфіі мы выкарыстоўваем сігнал дэтэктара (г.зн. вось y на храматаграме) як індыкатар канцэнтрацыі аналіту ва ўзоры. Таму здаецца дзіўным бачыць храматаграму з сігналам ніжэй за нуль, бо простая інтэрпрэтацыя заключаецца ў тым, што гэта сведчыць аб адмоўнай канцэнтрацыі аналіту, што, вядома, фізічна немагчыма. Паводле майго досведу, адмоўныя пікі часцей за ўсё назіраюцца пры выкарыстанні аптычных дэтэктараў паглынання (напрыклад, УФ-бачнага выпраменьвання).
У гэтым выпадку адмоўны пік проста азначае, што малекулы, якія элюююцца з калонкі, паглынаюць менш святла, чым сама рухомая фаза непасрэдна перад і пасля піка. Гэта можа адбыцца, напрыклад, пры выкарыстанні адносна нізкіх даўжынь хваль дэтэктавання (<230 нм) і дабавак рухомай фазы, якія паглынаюць большую частку святла на гэтых даўжынях хваль. Такімі дадаткамі могуць быць кампаненты растваральніка рухомай фазы, такія як метанол, або кампаненты буфера, такія як ацэтат або фарыят. Насамрэч, можна выкарыстоўваць адмоўныя пікі для падрыхтоўкі калібравальнай крывой і атрымання дакладнай колькаснай інфармацыі, таму няма фундаментальнай прычыны пазбягаць іх як такіх (гэты метад часам называюць «ўскосным УФ-дэтэктаваннем») (13). Аднак, калі мы сапраўды хочам пазбегнуць адмоўных пікаў цалкам, у выпадку дэтэктавання паглынання, лепшым рашэннем з'яўляецца выкарыстанне іншай даўжыні хвалі дэтэктавання, каб аналіт паглынаў больш, чым рухомая фаза, або змена складу рухомай фазы, каб яны паглыналі менш святла, чым аналіты.
Адмоўныя пікі могуць таксама з'яўляцца пры выкарыстанні дэтэктара паказчыка праламлення (ППР), калі паказчык праламлення кампанентаў, акрамя аналіту ва ўзоры, такіх як матрыца растваральніка, адрозніваецца ад паказчыка праламлення рухомай фазы. Гэта таксама адбываецца пры дэтэктары ў УФ-бачным дыяпазоне, але гэты эфект, як правіла, аслабляецца ў параўнанні з дэтэктарам ППР. У абодвух выпадках адмоўныя пікі можна мінімізаваць, больш дакладна падабраўшы склад матрыцы ўзору да складу рухомай фазы.
У трэцяй частцы, прысвечанай асноўнай тэме ліквідацыі непаладак LC, я абмеркаваў сітуацыі, калі форма назіранага піка адрозніваецца ад чаканай або нармальнай формы піка. Эфектыўнае ліквідацыя непаладак такіх праблем пачынаецца з ведання чаканых формаў пікаў (заснаваных на тэорыі або папярэднім вопыце працы з існуючымі метадамі), таму адхіленні ад гэтых чаканняў відавочныя. Праблемы з формай пікаў маюць шмат розных патэнцыйных прычын (занадта шырокія, хваставыя, пярэдні фронт і г.д.). У гэтай частцы я падрабязна абмяркоўваю некаторыя прычыны, якія я бачу часцей за ўсё. Веданне гэтых дэталяў з'яўляецца добрай адпраўной кропкай для пачатку ліквідацыі непаладак, але не ахоплівае ўсіх магчымасцей. Чытачы, зацікаўленыя ў больш падрабязным спісе прычын і рашэнняў, могуць звярнуцца да насценнай табліцы LCGC «Кіраўніцтва па ліквідацыі непаладак LC».
(4) Насценная табліца LCGC «Кіраўніцтва па ліквідацыі непаладак вадкаснай хроматографіі». https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) А. Фелінгер, Аналіз дадзеных і апрацоўка сігналаў у храматаграфіі (Elsevier, Нью-Ёрк, штат Нью-Ёрк, 1998), с. 43–96.
(8) Вахаб М. Ф., Дасгупта П. К., Каджо А. Ф. і Армстранг Д. У., Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.