Дзякуй за наведванне Nature.com.Версія браўзера, якую вы выкарыстоўваеце, мае абмежаваную падтрымку CSS.Для найлепшага вопыту мы рэкамендуем вам выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer).Тым часам, каб забяспечыць бесперапынную падтрымку, мы будзем візуалізаваць сайт без стыляў і JavaScript.
Вадкасная біяпсія (LB) - гэта канцэпцыя, якая хутка набірае папулярнасць у галіне біямедыцыны.Канцэпцыя ў асноўным заснавана на выяўленні фрагментаў цыркулявалай пазаклеткавай ДНК (ccfDNA), якія ў асноўным вызваляюцца ў выглядзе невялікіх фрагментаў пасля гібелі клетак у розных тканінах.Невялікая частка гэтых фрагментаў паходзіць з чужародных (чужародных) тканін або арганізмаў.У бягучай працы мы прымянілі гэтую канцэпцыю да мідый, вартавога віду, вядомага сваёй высокай здольнасцю фільтрацыі марской вады.Мы выкарыстоўваем здольнасць мідый дзейнічаць як натуральныя фільтры для захопу фрагментаў ДНК навакольнага асяроддзя з розных крыніц, каб даць інфармацыю аб біяразнастайнасці марскіх прыбярэжных экасістэм.Нашы вынікі паказваюць, што гемалімфа мідый змяшчае фрагменты ДНК, якія моцна адрозніваюцца па памеры, ад 1 да 5 кб.Секвеніраванне стрэльбы паказала, што вялікая колькасць фрагментаў ДНК маюць чужароднае мікробнае паходжанне.Сярод іх мы знайшлі фрагменты ДНК бактэрый, архей і вірусаў, у тым ліку вірусы, якія, як вядома, заражаюць мноства гаспадароў, якія звычайна сустракаюцца ў прыбярэжных марскіх экасістэмах.У заключэнне, наша даследаванне дэманструе, што канцэпцыя LB, прымененая да мідый, уяўляе сабой багатую, але яшчэ недаследаваную крыніцу ведаў аб разнастайнасці мікробаў у марскіх прыбярэжных экасістэмах.
Уплыў змены клімату (CC) на біяразнастайнасць марскіх экасістэм з'яўляецца хутка растучай вобласцю даследаванняў.Глабальнае пацяпленне не толькі выклікае важныя фізіялагічныя стрэсы, але і рассоўвае эвалюцыйныя межы цеплавой стабільнасці марскіх арганізмаў, уплываючы на ​​асяроддзе пражывання шэрагу відаў, падштурхоўваючы іх да пошуку больш спрыяльных умоў [1, 2].У дадатак да ўздзеяння на біяразнастайнасць метазоа, CC парушае далікатны баланс узаемадзеяння гаспадар-мікроб.Гэты мікробны дысбактэрыёз уяўляе сур'ёзную пагрозу для марскіх экасістэм, бо робіць марскія арганізмы больш успрымальнымі да інфекцыйных патагенаў [3, 4].Лічыцца, што СС гуляюць важную ролю ў масавай гібелі людзей, што з'яўляецца сур'ёзнай праблемай для кіравання глабальнымі марскімі экасістэмамі [5, 6].Гэта важнае пытанне, улічваючы эканамічны, экалагічны і харчовы ўплыў многіх марскіх відаў.Гэта асабліва актуальна для двухстворкавых малюскаў, якія жывуць у палярных рэгіёнах, дзе ўздзеянне CK больш неадкладнае і сур'ёзнае [6, 7].Фактычна, двухстворкавыя малюскі, такія як Mytilus spp.шырока выкарыстоўваюцца для маніторынгу ўздзеяння CC на марскія экасістэмы.Нядзіўна, што адносна вялікая колькасць біямаркераў была распрацавана для кантролю за іх здароўем, часта з выкарыстаннем двухузроўневага падыходу з выкарыстаннем функцыянальных біямаркераў, заснаваных на ферментатыўнай актыўнасці або клеткавых функцыях, такіх як жыццяздольнасць клетак і фагацытарную актыўнасць [8].Гэтыя метады таксама ўключаюць вымярэнне канцэнтрацыі паказчыкаў спецыфічнага ціску, якія назапашваюцца ў мяккіх тканінах пасля паглынання вялікай колькасці марской вады.Аднак высокая фільтрацыйная здольнасць і напаўадкрытая крывяносная сістэма двухстворкавых малюскаў даюць магчымасць распрацаваць новыя біямаркеры гемалімфы з выкарыстаннем канцэпцыі вадкаснай біяпсіі (LB), простага і малаінвазіўнага падыходу да вядзення пацыента.пробы крыві [9, 10].Хоць некалькі тыпаў цыркулюючых малекул можна знайсці ў LB чалавека, гэтая канцэпцыя ў асноўным заснавана на аналізе секвенирования ДНК фрагментаў цыркулюючай пазаклеткавай ДНК (ccfDNA) у плазме.Фактычна, наяўнасць цыркулявалай ДНК у плазме чалавека была вядома з сярэдзіны 20-га стагоддзя [11], але толькі ў апошнія гады з'яўленне высокапрадукцыйных метадаў секвенирования прывяло да клінічнай дыягностыкі на аснове ccfDNA.Наяўнасць гэтых цыркулюючых фрагментаў ДНК збольшага звязана з пасіўным вызваленнем геномнай ДНК (ядзернай і мітахандрыяльнай) пасля смерці клетак. У здаровых людзей канцэнтрацыя ccfDNA звычайна нізкая (<10 НГ/мл), але можа павышацца ў 5-10 разоў у пацыентаў, якія пакутуюць рознымі паталогіямі або падвяргаюцца стрэсу, што прыводзіць да пашкоджання тканін. У здаровых людзей канцэнтрацыя ccfDNA звычайна нізкая (<10 НГ/мл), але можа павышацца ў 5-10 разоў у пацыентаў, якія пакутуюць рознымі паталогіямі або падвяргаюцца стрэсу, што прыводзіць да пашкоджання тканін. У здаровых людзей канцэнтрацыя вккДНК ў норме нізкая (<10 нг/мл), але можа павышацца ў 5-10 разоў у хворых з рознай паталогіяй або якія падвяргаюцца стрэсу, які прыводзіць да пашкоджання тканін. У здаровых людзей канцэнтрацыя кссДНК звычайна невысокая (<10 НГ/мл), але можа павялічвацца ў 5-10 разоў у пацыентаў з рознымі паталогіямі або пры стрэсе, які прыводзіць да пашкоджання тканін.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低．(<10 нг/мл），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 нг/мл） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Канцэнтрацыі ccfDNA звычайна нізкія (<10 нг/мл) у здаровых людзей, але могуць быць павялічаны ў 5-10 разоў у пацыентаў з рознымі паталогіямі або стрэсам, што прыводзіць да пашкоджання тканін. Канцэнтрацыі ccfDNA звычайна нізкія (<10 НГ/мл) у здаровых людзей, але могуць павышацца ў 5-10 разоў у пацыентаў з рознымі паталогіямі або стрэсам, што прыводзіць да пашкоджання тканін.Памер фрагментаў ccfDNA вар'іруецца ў шырокіх межах, але звычайна вагаецца ад 150 да 200 пн.[12].Аналіз самастойна атрыманай ccfDNA, г.зн. ccfDNA з нармальных або трансфармаваных клетак гаспадара, можа быць выкарыстаны для выяўлення генетычных і эпігенетычных змяненняў, прысутных у ядзерным і/або мітахандрыяльным геноме, тым самым дапамагаючы клініцыстам выбраць канкрэтныя малекулярна-мэтавыя метады лячэння [13] .Аднак ccfDNA можа быць атрымана з замежных крыніц, такіх як ccfDNA з клетак плёну падчас цяжарнасці або з трансплантаваных органаў [14,15,16,17].ccfDNA таксама з'яўляецца важнай крыніцай інфармацыі для выяўлення прысутнасці нуклеінавых кіслот інфекцыйнага агента (чужароднага), што дазваляе неинвазивно выяўляць шырока распаўсюджаныя інфекцыі, не ідэнтыфікаваныя пасевамі крыві, пазбягаючы інвазівной біяпсіі заражанай тканіны [18].Нядаўнія даследаванні сапраўды паказалі, што кроў чалавека змяшчае багатую крыніцу інфармацыі, якая можа быць выкарыстана для ідэнтыфікацыі вірусных і бактэрыяльных узбуджальнікаў, і што каля 1% ccfDNA, выяўленай у плазме чалавека, мае замежнае паходжанне [19].Гэтыя даследаванні дэманструюць, што біяразнастайнасць цыркулявалага мікрабіёма арганізма можна ацаніць з дапамогай аналізу ccfDNA.Аднак да нядаўняга часу гэтае паняцце выкарыстоўвалася выключна ў дачыненні да чалавека і, у меншай ступені, да іншых пазваночных [20, 21].
У дадзенай працы мы выкарыстоўваем патэнцыял LB для аналізу ccfDNA Aulacomya atra, паўднёвага віду, які звычайна сустракаецца на субантарктычных астравах Кергелен, групе астравоў на вяршыні вялікага плато, якое ўтварылася 35 мільёнаў гадоў таму.вывяржэнне вулкана.Выкарыстоўваючы эксперыментальную сістэму in vitro, мы выявілі, што фрагменты ДНК у марской вадзе хутка паглынаюцца мідыямі і трапляюць у адсек гемалімфы.Секвеніраванне стрэльбы паказала, што ccfDNA гемалімфы мідый змяшчае фрагменты ДНК уласнага і чужога паходжання, у тым ліку сімбіятычныя бактэрыі і фрагменты ДНК з біёмаў, характэрных для халодных вулканічных марскіх прыбярэжных экасістэм.ccfDNA гемалімфы таксама змяшчае вірусныя паслядоўнасці, атрыманыя з вірусаў з рознымі дыяпазонамі гаспадароў.Мы таксама знайшлі фрагменты ДНК мнагаклетачных жывёл, такіх як касцяныя рыбы, актыніі, багавінне і казуркі.У заключэнне наша даследаванне дэманструе, што канцэпцыя LB можа быць паспяхова прыменена да марскіх бесхрыбтовых для стварэння багатага геномнага рэпертуару ў марскіх экасістэмах.
Дарослыя асобіны (55-70 мм даўжынёй) Mytilus platensis (M. platensis) і Aulacomya atra (A. atra) былі сабраны з прыліўных скалістых берагоў Порт-о-Франс (049°21,235 пд.ш., 070°13,490 у.д.).Астравы Кергелен у снежні 2018 г. Іншыя дарослыя блакітныя мідыі (Mytilus spp.) былі атрыманы ад камерцыйнага пастаўшчыка (PEI Mussel King Inc., Востраў Прынца Эдуарда, Канада) і змешчаны ў аэрацыйны рэзервуар з кантраляванай тэмпературай (4°C), які змяшчае 10–20 л штучнага расола 32‰.(штучная марская соль Reef Crystal, Instant Ocean, Вірджынія, ЗША).Для кожнага эксперыменту вымяралася даўжыня і вага асобных ракавін.
Бясплатны пратакол адкрытага доступу для гэтай праграмы даступны ў Інтэрнэце (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Карацей кажучы, гемалімфа LB была сабрана з якія адводзяць цягліц, як апісана [22].Гемалімфу асвятлялі цэнтрыфугаваннем пры 1200×g на працягу 3 хвілін, супернатант замарожвалі (-20°C) да выкарыстання.Для вылучэння і ачысткі вкДНК узоры (1,5-2,0 мл) размарожвалі і апрацоўвалі з дапамогай набору вкДНК NucleoSnap (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы.ccfDNA захоўвалі пры -80°C да наступнага аналізу.У некаторых эксперыментах ccfDNA была вылучана і ачышчана з дапамогай QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Таронта, Антарыё, Канада).Вычышчаную ДНК колькасна вызначалі з дапамогай стандартнага аналізу PicoGreen.Размеркаванне фрагментаў ізаляванай ccfDNA аналізавалі з дапамогай капілярнага электрафарэзу з выкарыстаннем біяаналізатара Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Санта-Клара, Каліфорнія) з выкарыстаннем набору ДНК высокай адчувальнасці.Аналіз праводзіўся з выкарыстаннем 1 мкл узору ccfDNA ў адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы.
Для секвенирования фрагментаў ccfDNA гемалімфы кампанія Génome Québec (Манрэаль, Квебек, Канада) падрыхтавала бібліятэкі стрэльбаў з дапамогай набору Illumina DNA Mix з набору Illumina MiSeq PE75.Выкарыстоўваўся стандартны адаптар (BioO).Файлы неапрацаваных даных даступныя ў архіве чытання паслядоўнасці NCBI (SRR8924808 і SRR8924809).Базавая якасць чытання ацэньвалася з дапамогай FastQC [23].Trimmomatic [24] выкарыстоўваўся для адсячэння адаптараў і дрэннай якасці чытання.Стрэльба чытае з парнымі канцамі FLASH аб'яднаны ў больш доўгія адзінкавыя чытанні з мінімальным перакрыццем 20 bp, каб пазбегнуць неадпаведнасці [25]. Аб'яднаныя паказанні былі анатаванымі з дапамогай BLASTN з выкарыстаннем базы дадзеных таксанаміі двухстворкавых NCBI (значэнне e <1e-3 і 90% гамолагі), а маскіроўка паслядоўнасцяў нізкай складанасці была выканана з дапамогай DUST [26]. Аб'яднаныя паказанні былі анатаванымі з дапамогай BLASTN з выкарыстаннем базы дадзеных таксанаміі двухстворкавых NCBI (значэнне e <1e-3 і 90% гамолагі), а маскіроўка паслядоўнасцяў нізкай складанасці была выканана з дапамогай DUST [26]. Аб'яднаныя чтения былі анотированы з дапамогай BLASTN з выкарыстаннем базы дадзеных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значэнне e < 1e-3 і 90% гамалогіі), а маскіроўка паслядоўнасці нізкай складанасці была выканана з дапамогай DUST [26]. Аб'яднаныя паказанні былі анатаваны з дапамогай BLASTN з выкарыстаннем базы дадзеных таксанаміі двухстворкавых NCBI (значэнне e <1e-3 і 90% гамолагі), а маскіроўка паслядоўнасці нізкай складанасці была выканана з дапамогай DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26] 行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 пыл [26] 行复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Аб'яднаныя чтения былі анотированы з дапамогай BLASTN з выкарыстаннем таксономической базы дадзеных двухствораных моллюсков NCBI (пазначэнне <1e-3 і 90% гамалогіі), а маскіроўка паслядоўнасці нізкай складанасці была выканана з дапамогай DUST [26]. Аб'яднаныя паказанні былі анатаваны з дапамогай BLASTN з выкарыстаннем таксанамічнай базы дадзеных двухстворкавых NCBI (значэнне e <1e-3 і 90% гамолагі), а маскіроўка паслядоўнасці нізкай складанасці была выканана з дапамогай DUST [26].Счытванні былі падзелены на дзве групы: звязаныя з двухстворкавымі паслядоўнасцямі (тут званыя самачытаннямі) і не звязаныя (несамачытанні).Дзве групы былі асобна сабраны з дапамогай MEGAHIT для стварэння кантыгаў [27].Тым часам таксанамічнае размеркаванне чужародных мікрабіёмаў было класіфікавана з дапамогай Kraken2 [28] і графічна прадстаўлена кругавой дыяграмай Krona на Galaxy [29, 30].Аптымальным kmer з нашых папярэдніх эксперыментаў быў вызначаны kmer-59. Затым для канчатковай анатацыі ідэнтыфікавалі ўласныя кантыгі шляхам выраўноўвання з BLASTN (база дадзеных NCBI двухстворкавых, значэнне e <1e-10 і 60% гамолагі). Затым для канчатковай анатацыі ідэнтыфікавалі ўласныя кантыгі шляхам выраўноўвання з BLASTN (база дадзеных NCBI двухстворкавых, значэнне e <1e-10 і 60% гамолагі). Затым уласныя кантыгі былі ідэнтыфікаваны шляхам супастаўлення з BLASTN (база дадзеных двухствораных малюскаў NCBI, значэнне e <1e-10 і гамалогія 60%) для канчатковай анатацыі. Self-contigs былі затым ідэнтыфікаваныя шляхам супастаўлення з BLASTN (NCBI двухстворкавых база дадзеных, значэнне e <1e-10 і 60% гамолагі) для канчатковай анатацыі.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN，双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затым былі ідэнтыфікаваныя ўласныя кантыгі для канчатковай анатацыі шляхам супастаўлення з BLASTN (база дадзеных NCBI для двухтворных малюскаў, значэнне e <1e-10 і гамалогія 60%). Self-contigs затым былі вызначаны для канчатковай анатацыі шляхам супастаўлення з BLASTN (NCBI база дадзеных двухстворкавых, значэнне e <1e-10 і 60% гамалогіі). Паралельна несамастойныя групавыя кантыгі былі анатаваны BLASTN (база дадзеных nt NCBI, значэнне e <1e-10 і 60% гамалогіі). Паралельна несамастойныя групавыя кантыгі былі анатаваны BLASTN (база дадзеных nt NCBI, значэнне e <1e-10 і 60% гамалогіі). Паралельна чужародныя групавыя кантыгі былі анатаваныя з дапамогай BLASTN (база дадзеных nt NCBI, значэнне e <1e-10 і гамалогія 60%). Паралельна кантыгі замежнай групы былі анатаваны BLASTN (база дадзеных NT NCBI, значэнне e <1e-10 і 60% гамалогіі).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Паралельна кантыгі, якія не адносяцца да ўласнай групы, былі анотированы з дапамогай BLASTN (база дадзеных nt NCBI, значэнне e <1e-10 і гамалогія 60%). Паралельна несамастойныя групавыя кантыгі былі анатаваны BLASTN (база дадзеных nt NCBI, значэнне e <1e-10 і 60% гамалогіі). BLASTX таксама праводзіўся на несамастойных кантыгах з выкарыстаннем баз дадзеных NCBI бялку nr і RefSeq (значэнне E <1e-10 і 60% гамолагі). BLASTX таксама праводзіўся на несамастойных кантыгах з выкарыстаннем баз дадзеных NCBI бялку nr і RefSeq (значэнне E <1e-10 і 60% гамолагі). BLASTX таксама быў праведзены на несамастойных кантыгах з выкарыстаннем базы дадзеных белка nr і RefSeq NCBI (значэнне e <1e-10 і гамалогія 60%). BLASTX таксама праводзілі на несамастойных кантыгах з выкарыстаннем баз дадзеных бялкоў nr і RefSeq NCBI (значэнне e <1e-10 і 60% гамолагі).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX таксама выконваў на несамастойных кантыгах з выкарыстаннем базы дадзеных белка nr і RefSeq NCBI (значэнне e <1e-10 і гамалогія 60%). BLASTX таксама праводзілі на несамастойных кантыгах з выкарыстаннем баз дадзеных бялкоў nr і RefSeq NCBI (значэнне e <1e-10 і 60% гамолагі).Пулы несамастойных кантыгаў BLASTN і BLASTX прадстаўляюць канчатковыя кантыгі (гл. Дадатковы файл).
Праймеры, якія выкарыстоўваюцца для ПЦР, пералічаны ў табліцы S1.ДНК-палімераза Taq (Bio Basic Canada, Markham, ON) выкарыстоўвалася для ампліфікацыі генаў-мішэняў ccfDNA.Выкарыстоўваліся наступныя ўмовы рэакцыі: дэнатурацыя пры 95°C на працягу 3 хвілін, 95°C на працягу 1 хвіліны, усталяваная тэмпература адпалу на працягу 1 хвіліны, элангацыя пры 72°C на працягу 1 хвіліны, 35 цыклаў і, нарэшце, 72°C на працягу 10 хвілін..ПЦР-прадукты раздзялялі электрафарэзам у агарозных гелях (1,5%), якія змяшчаюць SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) пры 95 В.
Мідыі (Mytilus spp.) акліматызаваліся ў 500 мл кіслароднай марской вады (32 PSU) на працягу 24 гадзін пры 4°C.Плазмідная ДНК, якая змяшчае ўстаўку, якая кадуе паслядоўнасць кДНК галектыну-7 чалавека (нумар доступу NCBI L07769), была дададзена ў флакон у канчатковай канцэнтрацыі 190 мкг/мкл.Мідыі, інкубаваныя ў тых жа ўмовах без дадання ДНК, былі кантролем.Трэці кантрольны рэзервуар утрымліваў ДНК без мідый.Для маніторынгу якасці ДНК у марской вадзе ўзоры марской вады (20 мкл; тры паўторы) былі ўзятыя з кожнай ёмістасці ў паказаны час.Для прасочвання плазміднай ДНК мідыі LB збіралі ў пазначаны час і аналізавалі з дапамогай кПЦР і ддПЦР.З-за высокага ўтрымання солі ў марской вадзе аліквоты разводзіліся ў якаснай вадзе ПЦР (1:10) перад усімі аналізамі ПЦР.
Лічбавая кропельная ПЦР (ddPCR) была праведзена з выкарыстаннем пратаколу BioRad QX200 (Місісага, Антарыё, Канада).Выкарыстоўвайце тэмпературны профіль, каб вызначыць аптымальную тэмпературу (табліца S1).Кроплі былі атрыманы з дапамогай генератара кропель QX200 (BioRad).ddPCR праводзілі наступным чынам: 95 °C на працягу 5 хвілін, 50 цыклаў 95 °C на працягу 30 секунд і зададзенай тэмпературы адпалу на працягу 1 хвіліны і 72 °C на працягу 30 секунд, 4 °C на працягу 5 хвілін і 90 °C на працягу 5 хвілін.Колькасць кропель і станоўчых рэакцый (колькасць копій/мкл) вымяралася пры дапамозе счытвальніка кропель QX200 (BioRad).Узоры з менш чым 10 000 кроплямі былі адбракаваныя.Кантроль шаблону не выконваўся пры кожным запуску ddPCR.
КПЦР праводзілася з выкарыстаннем Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Сіднэй, Аўстралія) і спецыяльных праймераў LGALS7.Усе колькасныя ПЦР праводзіліся ў 20 мкл з выкарыстаннем набору QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN).КПЦР пачыналася з 15-хвіліннай інкубацыі пры 95°C з наступным 40 цыкламі пры 95°C на працягу 10 секунд і пры 60°C на працягу 60 секунд з адным зборам даных.Крывыя плаўлення былі створаны з дапамогай паслядоўных вымярэнняў пры 95°C на працягу 5 с, 65°C на працягу 60 с і 97°C у канцы кПЦР.Кожную кПЦР праводзілі ў трох паўторах, за выключэннем кантрольных узораў.
Паколькі мідыі вядомыя сваёй высокай хуткасцю фільтрацыі, мы спачатку даследавалі, ці могуць яны фільтраваць і ўтрымліваць фрагменты ДНК, якія прысутнічаюць у марской вадзе.Нас таксама цікавіла, ці назапашваюцца гэтыя фрагменты ў іх напаўадкрытай лімфатычнай сістэме.Мы вырашылі гэтую праблему эксперыментальна, прасачыўшы лёс растваральных фрагментаў ДНК, дададзеных у акварыумы з блакітнымі мідыямі.Для палягчэння адсочвання фрагментаў ДНК мы выкарыстоўвалі чужародную (не сваю) плазмидную ДНК, якая змяшчае ген галектыну-7 чалавека.ddPCR адсочвае фрагменты плазмидной ДНК у марской вадзе і мідыях.Нашы вынікі паказваюць, што калі колькасць фрагментаў ДНК у марской вадзе заставалася адносна нязменным на працягу доўгага часу (да 7 дзён) у адсутнасць мідый, то ў прысутнасці мідый гэты ўзровень амаль цалкам знік на працягу 8 гадзін (мал. 1a,b).Фрагменты экзагеннай ДНК лёгка выяўляюцца на працягу 15 хвілін ва внутриклапанной вадкасці і гемолимфе (мал. 1в).Гэтыя фрагменты ўсё яшчэ можна было выявіць да 4 гадзін пасля ўздзеяння.Гэтая фільтруючая актыўнасць у адносінах да фрагментаў ДНК параўнальная з фільтруючай актыўнасцю бактэрый і багавіння [31].Гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што мідыі могуць фільтраваць і назапашваць чужародную ДНК у сваіх вадкасцях.
Адносныя канцэнтрацыі плазмидной ДНК у марской вадзе ў прысутнасці (A) або адсутнасці (B) мідый, вымераныя метадам ddPCR.У A вынікі выражаны ў працэнтах, а межы палёў уяўляюць сабой 75-ы і 25-ы працэнтылі.Падабраная лагарыфмічная крывая паказана чырвоным колерам, а вобласць, зацененая шэрым колерам, уяўляе сабой 95% даверны інтэрвал.У B чырвоная лінія ўяўляе сярэдняе значэнне, а сіняя лінія ўяўляе сабой 95% даверны інтэрвал для канцэнтрацыі.C Назапашванне плазміднай ДНК у гемалімфе і затамкавай вадкасці мідый у розны час пасля дабаўлення плазміднай ДНК.Вынікі прадстаўлены ў выглядзе абсалютных копій выяўленага/мл (±SE).
Затым мы даследавалі паходжанне ccfDNA ў мідый, сабраных з мідый на астравах Кергелен, аддаленай групе астравоў з абмежаваным антрапагенным уплывам.З гэтай мэтай была выдзелена і ачышчана cccDNA з гемалімф мідый метадамі, якія звычайна выкарыстоўваюцца для ачысткі cccDNA чалавека [32, 33].Мы выявілі, што сярэднія канцэнтрацыі ccfDNA гемалімфы ў мідыях знаходзяцца ў нізкім дыяпазоне мікраграмаў на мл гемалімфы (гл. табліцу S2, дадатковая інфармацыя).Гэты дыяпазон канцэнтрацый значна шырэй, чым у здаровых людзей (нізкі нанаграм на мілілітр), але ў рэдкіх выпадках у хворых на рак узровень ccfDNA можа дасягаць некалькіх мікраграмаў на мілілітр [34, 35].Аналіз размеркавання ccfDNA гемалімфы па памерах паказаў, што гэтыя фрагменты моцна вар'іруюцца па памерах, пачынаючы ад 1000 да 1000 п.н.да 5000 пн (мал. 2).Падобныя вынікі былі атрыманы з выкарыстаннем набору QIAamp Investigator Kit на аснове дыяксіду крэмнія, метаду, які звычайна выкарыстоўваецца ў крыміналістыцы для хуткага выдзялення і ачысткі геномнай ДНК з узораў ДНК з нізкай канцэнтрацыяй, уключаючы ccfDNA [36].
Рэпрэзентатыўная электрафарэграма ccfDNA гемалімфы мідый.Вынята з дапамогай плазменнага набору NucleoSnap (уверсе) і набору QIAamp DNA Investigator Kit.B Дыяграма Violin, якая паказвае размеркаванне канцэнтрацый ccfDNA гемалімфы (±SE) у мідыях.Чорная і чырвоная лініі ўяўляюць медыяну і першую і трэцюю квартылі адпаведна.
Прыкладна 1% ccfDNA ў чалавека і прыматаў мае замежны крыніца [21, 37].Улічваючы напаўадкрытую крывяносную сістэму двухстворкавых малюскаў, багатую мікробамі марскую ваду і размеркаванне ccfDNA мідый па памерах, мы выказалі здагадку, што ccfDNA гемалімфы мідый можа ўтрымліваць багаты і разнастайны пул мікробнай ДНК.Каб праверыць гэтую гіпотэзу, мы секвенавалі ccfDNA гемалімфы з узораў Aulacomya atra, сабраных з астравоў Кергелен, што дало больш за 10 мільёнаў чытанняў, 97,6% з якіх прайшлі кантроль якасці.Затым паказанні былі класіфікаваны ў адпаведнасці з уласнымі і не-самастойнымі крыніцамі з выкарыстаннем баз дадзеных двухстворкавых BLASTN і NCBI (мал. S1, дадатковая інфармацыя).
У чалавека як ядзерная, так і мітахандрыяльная ДНК могуць вылучацца ў кроў [38].Аднак у дадзеным даследаванні не ўдалося падрабязна апісаць ядзерную геномную ДНК мідый, улічваючы, што геном A. atra не секвенирован і не апісаны.Тым не менш, мы змаглі ідэнтыфікаваць шэраг фрагментаў ccfDNA нашага ўласнага паходжання з дапамогай бібліятэкі двухстворкавых (мал. S2, дадатковая інфармацыя).Мы таксама пацвердзілі наяўнасць фрагментаў ДНК нашага ўласнага паходжання шляхам накіраванай ПЦР-ампліфікацыі тых генаў A. atra, якія былі секвенированы (мал. 3).Аналагічным чынам, улічваючы, што мітахандрыяльны геном A. atra даступны ў публічных базах дадзеных, можна знайсці доказы наяўнасці фрагментаў мітахандрыяльнай ccfDNA ў гемалімфе A. atra.Наяўнасць фрагментаў мітахандрыяльнай ДНК пацверджана метадам ПЦР-амплификации (мал. 3).
Розныя мітахандрыяльныя гены прысутнічалі ў гемалімфе A. atra (чырвоныя кропкі - інвентарны нумар: SRX5705969) і M. platensis (сінія кропкі - інвентарны нумар: SRX5705968), ампліфікаванай з дапамогай ПЦР.Малюнак узяты з Breton et al., 2011 B Ампліфікацыя супернатанта гемалімфы з A. atra Захоўваецца на паперы FTA.Скарыстайцеся перфаратарам 3 мм, каб дадаць непасрэдна ў прабірку для ПЦР, якая змяшчае сумесь ПЦР.
Улічваючы багатае ўтрыманне мікробаў у марской вадзе, мы першапачаткова засяродзіліся на характарыстыцы паслядоўнасцяў мікробнай ДНК у гемалімфе.Для гэтага мы выкарыстоўваем дзве розныя стратэгіі.Першая стратэгія выкарыстоўвала Kraken2, праграму класіфікацыі паслядоўнасці на аснове алгарытму, якая можа ідэнтыфікаваць мікробныя паслядоўнасці з дакладнасцю, параўнальнай з BLAST і іншымі інструментамі [28].Больш за 6719 паказанняў было вызначана як бактэрыяльнае паходжанне, у той час як 124 і 64 былі ад архей і вірусаў адпаведна (мал. 4).Самымі распаўсюджанымі фрагментамі бактэрыяльнай ДНК былі Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) і Bacteroidetes (17%) (мал. 4а).Такое размеркаванне адпавядае папярэднім даследаванням мікрабіёма марской блакітнай мідыі [39, 40].Гамапратэабактэрыі былі асноўным класам пратэабактэрый (44%), уключаючы шмат Vibrionales (мал. 4b).Метад ddPCR пацвердзіў наяўнасць фрагментаў ДНК вібрыён ў ccfDNA гемалімфы A. atra (мал. 4в) [41].Каб атрымаць больш інфармацыі аб бактэрыяльным паходжанні ccfDNA, быў прыняты дадатковы падыход (мал. S2, дадатковая інфармацыя). У гэтым выпадку чытанні, якія перакрываліся, былі сабраны як парныя чытанні і былі класіфікаваны як уласныя (двухстворкавыя) або несамастойныя паходжання з выкарыстаннем BLASTN і значэння e 1e-3 і адсечкі з> 90% гамалогіі. У гэтым выпадку чытанні, якія перакрываліся, былі сабраны як парныя чытанні і былі класіфікаваны як уласныя (двухстворкавыя) або несамастойныя паходжання з выкарыстаннем BLASTN і значэння e 1e-3 і адсечкі з> 90% гамалогіі. У гэтым выпадку перакрываючыя чтения былі сабраны як чтения з парнымі канцамі і былі класіфікаваны як уласныя (двустворчатые моллюски) або чужыя па паходжанні з выкарыстаннем BLASTN і значэнняў e 1e-3 і ацэнкі з гамалогіяй> 90%. У гэтым выпадку паказанні, якія перакрываюцца, былі сабраны як чытанні з парнымі канцамі і класіфікаваны як натыўныя (двухстворкавыя) або неарыгінальныя з выкарыстаннем BLASTN і значэння e 1e-3 і адсечкі з >90% гамалогіі.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90% 同源性的截止值分类为自身，双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的 值和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 У гэтым выпадку перакрываючыя чтения былі сабраны як чтения з парнымі канцамі і класіфікаваны як уласныя (двустворчатые моллюски) або неасаблівыя па паходжанні з выкарыстаннем значэнняў e BLASTN і 1e-3 і парога гамалогіі> 90%. У гэтым выпадку счытванні, якія перакрываюцца, былі сабраны як счытванні з парнымі канцамі і класіфікаваны як уласныя (двухстворкавыя малюскі) або неарыгінальныя з выкарыстаннем значэнняў e BLASTN і 1e-3 і парога гамолагі >90%.Паколькі геном A. atra яшчэ не секвенирован, мы выкарысталі стратэгію зборкі de novo асэмблера MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).У агульнай складанасці 147 188 кантыгаў былі ідэнтыфікаваны як залежныя (двухстворкавыя) паходжання.Затым гэтыя кантыгі былі разбіты на e-значэнні 1e-10 з дапамогай BLASTN і BLASTX.Гэтая стратэгія дазволіла нам ідэнтыфікаваць 482 недвухстворкавыя фрагменты, якія прысутнічаюць у ccfDNA A. atra.Больш за палову (57%) гэтых фрагментаў ДНК былі атрыманы ад бактэрый, галоўным чынам ад жаберных сімбіёнтаў, уключаючы сульфатрофных сімбіёнтаў, і ад жаберных сімбіёнтаў Solemya velum (мал. 5).
Адносная колькасць на тыпавым узроўні.B Мікробная разнастайнасць двух асноўных тыпаў (Firmicutes і Proteobacteria).Рэпрэзентатыўная ампліфікацыя ddPCR C Vibrio spp.А. Фрагменты гена 16S рРНК (сіні) у трох гемалімфах атра.
Усяго было прааналізавана 482 сабраных кантыга.Агульны профіль таксанамічнага размеркавання метагеномных анатацый кантыгаў (пракарыёты і эўкарыёты).B Дэталёвае размеркаванне фрагментаў бактэрыяльнай ДНК, ідэнтыфікаваных BLASTN і BLASTX.
Аналіз Kraken2 таксама паказаў, што ccfDNA мідый змяшчае фрагменты ДНК архей, у тым ліку фрагменты ДНК Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) і Thaurmarcheota (11%) (мал. 6a).Наяўнасць фрагментаў ДНК, атрыманых з Euryarchaeota і Crenarchaeota, раней выяўленых у мікробнай супольнасці каліфарнійскіх мідый, не павінна выклікаць здзіўлення [42].Хоць Euryarchaeota часта асацыюецца з экстрэмальнымі ўмовамі, цяпер прызнана, што Euryarchaeota і Crenarcheota з'яўляюцца аднымі з найбольш распаўсюджаных пракарыётаў у марскім крыягенным асяроддзі [43, 44].Прысутнасць метанагенных мікраарганізмаў у мідыях не выклікае здзіўлення, улічваючы нядаўнія паведамленні аб шырокіх уцечках метану з донных уцечак на плато Кергелен [45] і магчымай мікробнай выпрацоўцы метану, якая назіралася ля ўзбярэжжа астравоў Кергелен [46].
Затым наша ўвага пераключылася на паказанні ДНК вірусаў.Наколькі нам вядома, гэта першае нямэтавае даследаванне ўтрымання вірусаў у мідыях.Як і чакалася, мы знайшлі фрагменты ДНК бактэрыяфагаў (Caudovirales) (мал. 6б).Аднак найбольш распаўсюджаная вірусная ДНК паходзіць з тыпу нуклеацытавірусаў, таксама вядомага як вірус вялікай ДНК ядзернай цытаплазмы (NCLDV), які мае самы вялікі геном з усіх вірусаў.Унутры гэтага тыпу большасць паслядоўнасцей ДНК належаць да сямействаў Mimimidoviridae (58%) і Poxviridae (21%), чые натуральныя гаспадары ўключаюць пазваночных і членістаногіх, у той час як невялікая частка гэтых паслядоўнасцей ДНК належыць да вядомых вірусалагічных водарасцяў.Заражае марскія эўкарыятычныя багавінне.Паслядоўнасці таксама былі атрыманы з віруса Pandora, гіганцкага віруса з самым вялікім памерам геному з усіх вядомых вірусных родаў.Цікава, што дыяпазон гаспадароў, якія, як вядома, былі заражаныя вірусам, як вызначана паслядоўнасцю ccfDNA гемалімфы, быў адносна вялікім (малюнак S3, дадатковая інфармацыя).Ён уключае вірусы, якія заражаюць такіх насякомых, як Baculoviridae і Iridoviridae, а таксама вірусы, якія заражаюць амёб, багавінне і пазваночных жывёл.Мы таксама знайшлі паслядоўнасці, якія адпавядаюць геному Pithovirus sibericum.Питовирусы (таксама вядомыя як «вірусы-зомбі») упершыню былі вылучаныя з 30 000-гадовай вечнай мерзлаты ў Сібіры [47].Такім чынам, нашы вынікі супадаюць з папярэднімі справаздачамі, якія паказваюць, што не ўсе сучасныя віды гэтых вірусаў вымерлі [48] і што гэтыя вірусы могуць прысутнічаць у аддаленых субарктычных марскіх экасістэмах.
Нарэшце, мы праверылі, ці зможам мы знайсці фрагменты ДНК іншых мнагаклетачных жывёл.У агульнай складанасці 482 замежныя кантыгі былі ідэнтыфікаваны BLASTN і BLASTX з бібліятэкамі nt, nr і RefSeq (геномнай і бялковай).Атрыманыя вынікі паказваюць, што сярод чужародных фрагментаў ccfDNA мнагаклетачных жывёл пераважае ДНК касцяных костак (мал. 5).Таксама знойдзены фрагменты ДНК насякомых і іншых відаў.Адносна значная частка фрагментаў ДНК не была ідэнтыфікавана, магчыма, з-за недастатковай прадстаўленасці вялікай колькасці марскіх відаў у геномных базах дадзеных у параўнанні з наземнымі відамі [49].
У гэтым артыкуле мы ўжываем канцэпцыю LB да мідый, сцвярджаючы, што паслядоўнасць ccfDNA гемалімфы можа даць зразумець склад марскіх прыбярэжных экасістэм.У прыватнасці, мы выявілі, што 1) гемалімфа мідый змяшчае адносна высокія канцэнтрацыі (узроўні мікраграмаў) адносна вялікіх (~1-5 кб) цыркулюючых фрагментаў ДНК;2) гэтыя фрагменты ДНК як незалежныя, так і незалежныя 3) Сярод замежных крыніц гэтых фрагментаў ДНК мы выявілі бактэрыяльную, архейную і вірусную ДНК, а таксама ДНК іншых мнагаклетачных жывёл;4) Назапашванне гэтых чужародных фрагментаў ccfDNA ў гемалімфе адбываецца хутка і спрыяе ўнутранай фільтруючай дзейнасці мідый.У заключэнне, наша даследаванне дэманструе, што канцэпцыя LB, якая да гэтага часу ўжывалася ў асноўным у галіне біямедыцыны, кадуе багатую, але недаследаваную крыніцу ведаў, якія могуць быць выкарыстаны для лепшага разумення ўзаемадзеяння паміж вартавымі відамі і навакольным асяроддзем.
Акрамя прыматаў, вылучэнне ccfDNA было зафіксавана ў млекакормячых, уключаючы мышэй, сабак, катоў і коней [50, 51, 52].Аднак, наколькі нам вядома, наша даследаванне з'яўляецца першым, у якім паведамляецца аб выяўленні і секвенировании ccfDNA ў марскіх відаў з адкрытай сістэмай цыркуляцыі.Гэтая анатамічная асаблівасць і фільтруючая здольнасць мідый могуць, па меншай меры часткова, растлумачыць розныя характарыстыкі памеру цыркулюючых фрагментаў ДНК у параўнанні з іншымі відамі.У чалавека большасць фрагментаў ДНК, якія цыркулююць у крыві, уяўляюць сабой невялікія фрагменты памерам ад 150 да 200 п.н.з максімальным пікам 167 bp [34, 53].Невялікая, але значная частка фрагментаў ДНК мае памер ад 300 да 500 п.н., а каля 5% даўжэйшыя за 900 п.н.[54].Прычына такога размеркавання па памерах заключаецца ў тым, што асноўная крыніца ccfDNA ў плазме ўзнікае ў выніку гібелі клетак, альбо з-за гібелі клетак, альбо з-за некрозу цыркулюючых крывятворных клетак у здаровых людзей, альбо з-за апоптозу опухолевых клетак у хворых на рак (вядомы як цыркулюючая ДНК пухліны)., ктДНК).Размеркаванне ccfDNA гемалімфы па памерах, якое мы выявілі ў мідыях, вар'іравалася ад 1000 да 5000 bp, што сведчыць аб тым, што ccfDNA мідый мае іншае паходжанне.Гэта лагічная гіпотэза, паколькі мідыі маюць напаўадкрытую сасудзістую сістэму і жывуць у марскіх водных асяроддзях, якія змяшчаюць высокую канцэнтрацыю мікробнай геномнай ДНК.Фактычна, нашы лабараторныя эксперыменты з выкарыстаннем экзагеннай ДНК паказалі, што мідыі назапашваюць фрагменты ДНК у марской вадзе, па меншай меры, праз некалькі гадзін яны дэградуюць пасля паглынання клеткамі і/або вызваляюцца і/або захоўваюцца ў розных арганізацыях.Улічваючы рэдкасць клетак (як пракарыётычных, так і эукарыётычных), выкарыстанне ўнутрыклапанных аддзяленняў паменшыць колькасць ccfDNA з уласных крыніц, а таксама з замежных крыніц.Улічваючы важнасць прыроджанага імунітэту двухстворкавых абалонак і вялікай колькасці цыркулюючых фагацытаў, мы выказалі здагадку, што нават чужародная ccfDNA узбагачана цыркулюючымі фагацытамі, якія назапашваюць чужародную ДНК пры праглынанні мікраарганізмаў і/або клеткавага смецця.У сукупнасці нашы вынікі паказваюць, што ccfDNA гемалімфы двухстворкавых малюскаў з'яўляецца унікальным сховішчам малекулярнай інфармацыі і ўмацоўвае іх статус вартавога віду.
Нашы дадзеныя паказваюць, што секвенирование і аналіз фрагментаў ccfDNA гемалімфы бактэрыяльнага паходжання могуць даць ключавую інфармацыю аб бактэрыяльнай флоры гаспадара і бактэрыях, якія прысутнічаюць у навакольнага марской экасістэме.Метады секвеніравання здымкаў выявілі паслядоўнасці камменсальных бактэрый A. atra gill, якія былі б прапушчаны, калі б выкарыстоўваліся звычайныя метады ідэнтыфікацыі 16S рРНК, часткова з-за зрушэння эталоннай бібліятэкі.Фактычна, наша выкарыстанне дадзеных LB, сабраных з M. platensis у тым жа пласце мідый у Кергелене, паказала, што склад бактэрыяльных сімбіёнтаў, звязаных з жабрамі, быў аднолькавым для абодвух відаў мідый (мал. S4, дадатковая інфармацыя).Гэта падабенства дзвюх генетычна розных мідый можа адлюстроўваць склад бактэрыяльных супольнасцей у халодных, сярністых і вулканічных адкладах Кергелена [55, 56, 57, 58].Больш высокія ўзроўні мікраарганізмаў, якія аднаўляюць серу, былі добра апісаны пры здабычы мідый з біятурбаваных прыбярэжных раёнаў [59], такіх як узбярэжжа Порт-о-Франс.Іншая магчымасць заключаецца ў тым, што камменсальная флора мідый можа пацярпець ад гарызантальнай перадачы [60, 61].Неабходныя дадатковыя даследаванні, каб вызначыць карэляцыю паміж марскім асяроддзем, паверхняй марскога дна і складам сімбіятычных бактэрый у мідыях.Гэтыя даследаванні ў цяперашні час працягваюцца.
Даўжыня і канцэнтрацыя ccfDNA гемалімфы, лёгкасць яе ачысткі і высокая якасць, якая дазваляе хутка вызначаць паслядоўнасць стрэльбы, з'яўляюцца аднымі з многіх пераваг выкарыстання ccfDNA мідый для ацэнкі біяразнастайнасці ў марскіх прыбярэжных экасістэмах.Гэты падыход асабліва эфектыўны для характарыстыкі вірусных супольнасцяў (виромов) у дадзенай экасістэме [62, 63].У адрозненне ад бактэрый, архей і эўкарыёт, вірусныя геномы не ўтрымліваюць філагенетычна кансерватыўных генаў, такіх як паслядоўнасці 16S.Нашы вынікі паказваюць, што вадкія біяпсіі відаў-індыкатараў, такіх як мідыі, можна выкарыстоўваць для ідэнтыфікацыі адносна вялікай колькасці фрагментаў віруса ccfDNA, якія, як вядома, заражаюць гаспадароў, якія звычайна насяляюць у прыбярэжных марскіх экасістэмах.Сюды ўваходзяць вірусы, якія, як вядома, заражаюць найпростых, членістаногіх, насякомых, расліны і бактэрыяльныя вірусы (напрыклад, бактэрыяфагі).Падобнае размеркаванне было выяўлена, калі мы даследавалі вірус ccfDNA гемалімфы блакітных мідый (M. platensis), сабраных у тым жа пласце мідый у Кергелене (табліца S2, дадатковая інфармацыя).Стрэльба паслядоўнасці ccfDNA сапраўды новы падыход, які набірае абароты ў вывучэнні віруса чалавека або іншых відаў [21, 37, 64].Гэты падыход асабліва карысны для вывучэння двухцепочечных ДНК-вірусаў, паколькі ні адзін ген не захоўваецца сярод усіх двухцепочечных ДНК-вірусаў, якія прадстаўляюць самы разнастайны і шырокі клас вірусаў у Балтыморы [65].Нягледзячы на ​​тое, што большасць з гэтых вірусаў застаюцца некласіфікаванымі і могуць уключаць вірусы з зусім невядомай часткі віруснага свету [66], мы выявілі, што віромы і дыяпазоны гаспадароў мідый A. atra і M. platensis знаходзяцца паміж гэтымі двума відамі.аналагічна (гл. малюнак S3, дадатковая інфармацыя).Такое падабенства не з'яўляецца дзіўным, бо можа адлюстроўваць адсутнасць селектыўнасці ў паглынанні ДНК, якая прысутнічае ў навакольным асяроддзі.Будучыя даследаванні з выкарыстаннем ачышчанай РНК у цяперашні час неабходныя для характарыстыкі віруса РНК.
У нашым даследаванні мы выкарысталі вельмі строгі канвеер, узяты з працы Каварскага і яго калег [37], якія выкарыстоўвалі двухэтапнае выдаленне аб'яднаных чытанняў і кантыгаў да і пасля зборкі ўласнай ccfDNA, што прывяло да высокай долі неадлюстраваных чытанняў.Такім чынам, мы не можам выключаць, што некаторыя з гэтых некартаваных чытанняў усё яшчэ могуць мець уласнае паходжанне, перш за ўсё таму, што ў нас няма эталоннага геному для гэтага віду мідый.Мы таксама выкарысталі гэты канвеер, таму што былі занепакоеныя хімерамі паміж уласнымі і не ўласнымі чытаннямі і даўжынямі чытання, створанымі Illumina MiSeq PE75.Яшчэ адна прычына большасці нязведаных паказанняў заключаецца ў тым, што вялікая частка марскіх мікробаў, асабліва ў аддаленых раёнах, такіх як Кергелен, не была анатавана.Мы выкарыстоўвалі Illumina MiSeq PE75, мяркуючы, што даўжыня фрагментаў ccfDNA аналагічная ccfDNA чалавека.Для будучых даследаванняў, улічваючы нашы вынікі, якія паказваюць, што ccfDNA гемалімфы счытваецца даўжэй, чым людзі і/або млекакормячыя, мы рэкамендуем выкарыстоўваць платформу секвенирования, больш прыдатную для больш доўгіх фрагментаў ccfDNA.Такая практыка значна палегчыць выяўленне дадатковых прыкмет для больш глыбокага аналізу.Атрыманне недаступнай у цяперашні час поўнай паслядоўнасці ядзернага геному A. atra таксама значна палегчыла б адрозненне ccfDNA ад уласных і чужых крыніц.Улічваючы, што наша даследаванне было засяроджана на магчымасці прымянення канцэпцыі вадкай біяпсіі да мідый, мы спадзяемся, што па меры выкарыстання гэтай канцэпцыі ў будучых даследаваннях будуць распрацаваны новыя інструменты і канвееры, каб павялічыць патэнцыял гэтага метаду для вывучэння мікробнай разнастайнасці мідый.марская экасістэма.
Як неінвазіўны клінічны біямаркер, павышаныя ўзроўні ccfDNA ў плазме чалавека звязаны з рознымі захворваннямі, пашкоджаннямі тканін і стрэсавымі станамі [67,68,69].Гэта павелічэнне звязана з вызваленнем фрагментаў ДНК уласнага паходжання пасля пашкоджання тканін.Мы вырашылі гэтую праблему з дапамогай вострага цеплавога стрэсу, пры якім мідыі ненадоўга падвяргаліся ўздзеянню тэмпературы 30 °C.Мы правялі гэты аналіз на трох розных відах мідый у трох незалежных эксперыментах.Аднак мы не выявілі ніякіх змен ва ўзроўні ccfDNA пасля вострага цеплавога стрэсу (гл. малюнак S5, дадатковая інфармацыя).Гэта адкрыццё можа растлумачыць, па меншай меры часткова, той факт, што мідыі маюць напаўадкрытую крывяносную сістэму і назапашваюць вялікую колькасць чужароднай ДНК з-за сваёй высокай фільтруючай актыўнасці.З іншага боку, мідыі, як і многія бесхрыбтовыя, могуць быць больш устойлівымі да пашкоджання тканін, выкліканага стрэсам, тым самым абмяжоўваючы вызваленне ccfDNA ў іх гемалімфе [70, 71].
На сённяшні дзень аналіз ДНК біяразнастайнасці ў водных экасістэмах у асноўным сканцэнтраваны на метабаркадаванні ДНК навакольнага асяроддзя (эДНК).Аднак гэты метад звычайна абмежаваны ў аналізе біяразнастайнасці, калі выкарыстоўваюцца грунтоўкі.Выкарыстанне секвенирования стрэльбы дазваляе абыйсці абмежаванні ПЦР і неаб'ектыўны выбар набораў праймераў.Такім чынам, у пэўным сэнсе наш метад бліжэй да нядаўна выкарыстоўванага высокапрадукцыйнага метаду секвеніравання eDNA Shotgun, які здольны наўпрост секвенировать фрагментаваную ДНК і аналізаваць практычна ўсе арганізмы [72, 73].Аднак ёсць шэраг фундаментальных праблем, якія адрозніваюць LB ад стандартных метадаў эДНК.Безумоўна, галоўнае адрозненне паміж eDNA і LB заключаецца ў выкарыстанні натуральных хастоў-фільтраў.Паведамляецца аб выкарыстанні марскіх відаў, такіх як губкі і двухстворкавыя малюскі (Dresseina spp.), у якасці натуральнага фільтра для вывучэння эДНК [74, 75].Аднак у даследаванні Дрэйсены выкарыстоўваліся біяпсіі тканін, з якіх была вынятая ДНК.Аналіз ccfDNA з LB не патрабуе біяпсіі тканіны, спецыяльнага і часам дарагога абсталявання і матэрыяльна-тэхнічнага забеспячэння, звязанага з eDNA або біяпсіі тканіны.Фактычна, нядаўна мы паведамлялі, што ccfDNA з LB можна захоўваць і аналізаваць пры падтрымцы FTA без падтрымання халоднага ланцуга, што з'яўляецца сур'ёзнай праблемай для даследаванняў у аддаленых раёнах [76].Вылучэнне ccfDNA з вадкіх біяпсіяў таксама простае і забяспечвае высакаякасную ДНК для секвенирования стрэльбы і аналізу ПЦР.Гэта вялікая перавага, улічваючы некаторыя тэхнічныя абмежаванні, звязаныя з аналізам эДНК [77].Прастата і нізкі кошт метаду выбаркі таксама асабліва падыходзіць для доўгатэрміновых праграм маніторынгу.Акрамя іх высокай фільтруючай здольнасці, яшчэ адной добра вядомай асаблівасцю двухстворкавых малюскаў з'яўляецца хімічны мукапалісахарідны склад іх слізі, які спрыяе паглынанню вірусаў [78, 79].Гэта робіць двухстворкавыя малюскі ідэальным натуральным фільтрам для характарыстыкі біяразнастайнасці і ўплыву змены клімату ў дадзенай воднай экасістэме.Хаця наяўнасць фрагментаў ДНК гаспадара можна разглядаць як абмежаванне метаду ў параўнанні з eDNA, кошт, звязаны з наяўнасцю такой натыўнай ccfDNA у параўнанні з eDNA, адначасова зразумелы з-за велізарнай колькасці інфармацыі, даступнай для даследаванняў здароўя.афсетны гаспадар.Гэта ўключае ў сябе наяўнасць вірусных паслядоўнасцяў, інтэграваных у геном гаспадара-гаспадара.Гэта асабліва важна для мідый, улічваючы наяўнасць гарызантальна перадаюцца лейкозныя рэтравіруса ў двухстворкавых малюскаў [80, 81].Яшчэ адна перавага LB перад eDNA заключаецца ў тым, што ён выкарыстоўвае фагацытарную актыўнасць клетак крыві, якія цыркулююць у гемалімфе, якая паглынае мікраарганізмы (і іх геномы).Фагацытоз з'яўляецца асноўнай функцыяй клетак крыві ў двухстворкавых малюскаў [82] .Нарэшце, метад выкарыстоўвае высокую здольнасць фільтрацыі мідый (у сярэднім 1,5 л/гадз марской вады) і двухдзённую цыркуляцыю, якія павялічваюць змешванне розных слаёў марской вады, што дазваляе захопліваць гетэралагічную эДНК.[83, 84].Такім чынам, аналіз ccfDNA мідый з'яўляецца цікавым шляхам, улічваючы ўплыў мідый на харчаванне, эканоміку і навакольнае асяроддзе.Падобна аналізу LB, сабранага ў людзей, гэты метад таксама адкрывае магчымасць вымярэння генетычных і эпігенетычных змяненняў у ДНК гаспадара ў адказ на экзагенныя рэчывы.Напрыклад, можна прадугледзець тэхналогіі секвеніравання трэцяга пакалення для правядзення агульнагеномнага аналізу метылявання ў натыўнай ccfDNA з выкарыстаннем секвеніравання нанапор.Гэтаму працэсу павінен спрыяць той факт, што даўжыня фрагментаў ccfDNA мідыі ідэальна сумяшчальная з даўно прачытанымі платформамі секвеніравання, якія дазваляюць аналізаваць метыляванне ДНК у геноме з аднаго цыкла секвенавання без неабходнасці хімічных пераўтварэнняў.85,86] Гэта цікавая магчымасць, бо было паказана, што шаблоны метылявання ДНК адлюстроўваюць рэакцыю на стрэс навакольнага асяроддзя і захоўваюцца на працягу многіх пакаленняў.Такім чынам, гэта можа даць каштоўную інфармацыю аб асноўных механізмах, якія рэгулююць адказ пасля ўздзеяння змены клімату або забруджвальных рэчываў [87].Аднак выкарыстанне LB не без абмежаванняў.Залішне казаць, што гэта патрабуе наяўнасці ў экасістэме відаў-індыкатараў.Як ужо згадвалася вышэй, выкарыстанне LB для ацэнкі біяразнастайнасці дадзенай экасістэмы таксама патрабуе строгага канвеера біяінфарматыкі, які ўлічвае наяўнасць фрагментаў ДНК з крыніцы.Яшчэ адна сур'ёзная праблема - наяўнасць эталонных геномаў для марскіх відаў.Ёсць надзея, што такія ініцыятывы, як праект геномаў марскіх млекакормячых і нядаўна заснаваны праект Fish10k [88], будуць спрыяць такому аналізу ў будучыні.Прымяненне канцэпцыі LB да марскіх арганізмаў, якія сілкуюцца фільтрамі, таксама сумяшчальна з найноўшымі дасягненнямі ў тэхналогіі секвеніравання, што робіць яе добра прыдатнай для распрацоўкі шматомных біямаркераў для атрымання важнай інфармацыі пра здароўе марскіх асяроддзяў пражывання ў адказ на стрэс навакольнага асяроддзя.
Дадзеныя секвенирования геному былі захаваны ў NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 пад Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Уплыў змены клімату на марское жыццё і экасістэмы.Коўл біялогія.2009 год;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S і інш.Разгледзім сумесны ўплыў змены клімату і іншых мясцовых фактараў стрэсу на марское асяроддзе.агульнанавуковае асяроддзе.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P і інш.).Навука першага сакавіка.2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Зніжэнне тэрмаўстойлівасці пры перыядычных умовах цеплавога стрэсу тлумачыць высокую летнюю смяротнасць блакітных мідый.Навуковая справаздача 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER і інш.Апошнія змены ў частаце, прычынах і ступені гібелі жывёл.Proc Natl Acad Sci ЗША.2015;112:1083-8.
Скарпа Ф., Санна Д., Аззена І., Мугеці Д., Чэруці Ф., Хасейні С. і інш.Множныя неспецыфічныя для відаў узбуджальнікі маглі быць прычынай масавай гібелі Pinna nobilis.жыццё.2020;10:238.
Брэдлі М, Каутс С.Дж., Джэнкінс Э., О'Хара ТМ.Патэнцыйны ўплыў змены клімату на арктычныя зоонозные хваробы.Int J Циркумполярное здароўе.2005 год;64:468–77.
Бейер Дж., Грын Н.В., Брукс С., Алан І.Дж., Руус А., Гомес Т. і інш.Сінія мідыі (Mytilus edulis spp.) як сігнальныя арганізмы ў маніторынгу прыбярэжнага забруджвання: агляд.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Інтэграцыя вадкай біяпсіі ў лячэнні рака.Nat Rev Clean Oncol.2017 год;14: 531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C і інш.Паспяванне вадкай біяпсіі: Дазваляе ДНК пухліны цыркуляваць.Nat Rev Рак.2017;17:223–38.
Мандэл П., Метаіс П. Нуклеінавыя кіслоты ў плазме чалавека.Пратаколы пасяджэнняў даччыных прадпрыемстваў Soc Biol.1948 год;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Новая роля бясклетачнай ДНК у якасці малекулярнага маркера для лячэння рака.Колькасная ацэнка биомолярного аналізу.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS. Вадкая біяпсія ўваходзіць у клініку - праблемы з укараненнем і будучыя праблемы.Nat Rev Clin Oncol.2021 год;18: 297-312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW і іншыя.ДНК плёну прысутнічае ў плазме і сыроватцы крыві маці.Ланцэт.1997 год;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Даследаванне плыні цяжарнасці і яе ускладненняў з выкарыстаннем цыркулявалай пазаклеткавай РНК у крыві жанчын падчас цяжарнасці.Дапедыятрыі.2020; 8: 605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J і інш.Вадкая біяпсія: донарская бясклетачная ДНК выкарыстоўваецца для выяўлення алагенных пашкоджанняў у трансплантанце ныркі.Nat Rev Nephrol.2021 год;17: 591-603.
Хуан ФК, Ло Ю.М. Інавацыі ў прэнатальнай дыягностыцы: секвенирование генома плазмы маці.Ганна, доктар медыцынскіх навук.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D і інш.Хуткае выяўленне ўзбуджальнікаў з метагеномным секвенированием інфіцыраваных цялесных вадкасцей новага пакалення.Нац медыцына.2021;27:115-24.