Дзякуй за наведванне Nature.com. Версія браўзера, якой вы карыстаецеся, мае абмежаваную падтрымку CSS. Для найлепшага вопыту мы рэкамендуем вам выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або выключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Тым часам, каб забяспечыць пастаянную падтрымку, мы будзем адлюстроўваць сайт без стыляў і JavaScript.
Часціцы порыстага дыяксіду крэмнія былі падрыхтаваны золь-гель метадам з некаторымі мадыфікацыямі для атрымання макрапорістых часціц. Гэтыя часціцы былі дэрыватызаванымі шляхам палімерызацыі з зварачальным далучэннем і фрагментацыйнай перадачай ланцуга (RAFT) з N-фенілмалеімід-метылвінілізацыянатам (PMI) і стыролам для атрымання N-фенілмалеіміднай інтэркаляцыі полістыролу (PMP) у нерухомай фазе. Вузкаствольная калона з нержавеючай сталі s (100 × 1,8 мм id) былі спакаваныя з дапамогай суспензіі packing.Evaluated PMP калонкі падзелу пептыднай сумесі, якая складаецца з пяці пептыдаў (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцын энкефалін) храматаграфічная прадукцыйнасць) і пераварванне трыпсінаў сыроватачна альбуміна чалавека (HAS). Пры аптымальных умовах элюіравання тэарэтычная колькасць пласцін пептыднай сумесі дасягае 280 000 пласцін/м². Параўноўваючы эфектыўнасць падзелу распрацаванай калонкі з камерцыйнай калонкай Ascentis Express RP-Amide, было заўважана, што эфектыўнасць падзелу калонкі PMP была лепшай, чым у камерцыйнай калонкі з пункту гледжання эфектыўнасці падзелу і дазволу.
У апошнія гады біяфармацэўтычная прамысловасць стала пашыраючымся сусветным рынкам са значным павелічэннем долі рынку. З выбуховым ростам біяфармацэўтычнай прамысловасці1,2,3 аналіз пептыдаў і бялкоў вельмі пажаданы. У дадатак да мэтавага пептыда падчас сінтэзу пептыдаў утвараецца некалькі прымешак, што патрабуе храматаграфічнай ачысткі для атрымання пептыдаў патрэбнай чысціні. Аналіз і характарыстыка бялкоў у вадкасцях арганізма, тканак і клетак з'яўляецца надзвычай складанай задачай з-за вялікай колькасці патэнцыйна выяўленых відаў у адным узоры. Хоць мас-спектраметрыя з'яўляецца эфектыўным інструментам для секвенирования пептыдаў і бялкоў, калі такія ўзоры ўводзяць у мас-спектрометр за адзін праход, падзел не будзе ідэальным. Гэтую праблему можна змякчыць шляхам укаранення падзелу вадкаснай храматаграфіі (ЖХ) перад МС-аналізам, што паменшыць колькасць аналітаў, якія паступаюць у мас-спектрометр у дадзены момант часу4,5,6. Акрамя таго, падчас падзелу вадкай фазы аналіты могуць быць сканцэнтраваны ў вузкіх абласцях, такім чынам канцэнтруючы гэтыя аналіты і паляпшаючы адчувальнасць выяўлення РС. За апошняе дзесяцігоддзе вадкасная храматаграфія (ВХ) значна прасунулася наперад і стала папулярным метадам пратэёмнага аналізу7,8,9,10.
Зваротна-фазавая вадкасная храматаграфія (RP-LC) шырока выкарыстоўваецца для ачысткі і падзелу пептыдных сумесяў з выкарыстаннем актадэцыл-мадыфікаванага дыяксіду крэмнія (ODS) у якасці нерухомай фазы 11,12,13. Аднак стацыянарныя фазы RP не забяспечваюць здавальняючага падзелу пептыдаў і бялкоў з-за іх складанай структуры і амфіфільнай прыроды 14,15. Такім чынам, спецыяльна распрацаваныя стацыянарныя фазы неабходныя для аналізу пептыдаў і бялкоў з палярнымі і непалярнымі часткамі, каб узаемадзейнічаць з гэтымі аналітамі і захоўваць іх16. Храматаграфія ў змешаным рэжыме, якая забяспечвае мультымадальныя ўзаемадзеянні, можа быць альтэрнатывай RP-LC для падзелу пептыдаў, бялкоў і іншых складаных сумесяў. Было падрыхтавана некалькі стацыянарных фаз у змешаным рэжыме, і калонкі, напоўненыя гэтымі фазамі, выкарыстоўваліся для падзелу пептыдаў і бялкоў17 ,18,19,20,21. Стацыянарныя фазы ў змешаным рэжыме (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, палярная інтэркаляцыя/RPLC) падыходзяць для падзелу пептыдаў і бялкоў з-за наяўнасці як палярных, так і непалярных груп 22,23,24,25,26,27,28. Аналагічным чынам, палярныя інтэркаляваныя стацыянарныя фазы з кавалентна звязанымі палярнымі групамі дэманструюць добрую здольнасць падзелу і унікальная селектыўнасць для палярных і непалярных аналітаў, паколькі падзел залежыць ад узаемадзеяння паміж аналітам і нерухомай фазай.Мультымадальныя ўзаемадзеяння 29, 30, 31, 32. Нядаўна Zhang et al.30 падрыхтаваў стацыянарную фазу поліаміну з канцавым дадэцылам і паспяхова аддзяліў вуглевадароды, антыдэпрэсанты, флавоноіды, нуклеазіды, эстрагены і некаторыя іншыя аналіты. Палярны інтэркалятар мае як палярныя, так і непалярныя групы, таму яго можна выкарыстоўваць для падзелу пептыдаў і бялкоў, якія маюць як гідрафобныя, так і гідрафільныя часткі. Калонкі з убудаванымі палярнікамі (напрыклад, C18 з убудаваным амідам Калонкі) камерцыйна даступныя пад гандлёвай назвай Ascentis Express RP-Amide columns, але гэтыя калонкі выкарыстоўваюцца толькі для аналізу аміна 33.
У бягучым даследаванні была падрыхтавана і ацэнена палярная стацыянарная фаза (полістырол з убудаваным N-фенілмалеімідам) для падзелу пептыдаў і трыпсінавых перавараў HSA. Стацыянарная фаза была падрыхтавана з выкарыстаннем наступнай стратэгіі. Порыстыя часціцы дыяксіду крэмнія былі падрыхтаваны ў адпаведнасці з працэдурай, прыведзенай у нашай папярэдняй публікацыі з некаторымі зменамі ў пратаколе падрыхтоўкі. Суадносіны мачавіны, поліэтыленгліколя (ПЭГ), ТМОС , ваду і воцатную кіслату адрэгулявалі для атрымання часціц дыяксіду крэмнія з вялікім памерам пор. Па-другое, новы ліганд, фенілмалеімід-пазначаў вінілізацыянат, быў сінтэзаваны і выкарыстоўваўся для дэрыватызацыі часціц дыяксіду крэмнія для падрыхтоўкі палярнай убудаванай стацыянарнай фазы. Атрыманая нерухомая фаза была запакаваная ў калонку з нержавеючай сталі (100 × 1,8 мм унутр. унутр.) з выкарыстаннем аптымізаванай схемы ўпакоўкі. з механічнай вібрацыяй для забеспячэння аднастайнага пласта ў калоне. Ацаніце падзел пептыдных сумесяў, якія складаюцца з пяці пептыдаў, у напоўненай калонцы;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) і трыпсінавы перавар сыроватачна альбуміна чалавека (HAS). Назіралася, што пептыдная сумесь і трыпсінавы перавар HSA аддзяляюцца з добрым разрозненнем і эфектыўнасцю. Прадукцыйнасць падзелу калонкі PMP параўноўвалі з калонкай Ascentis Express RP-Amide. пептыды і вавёркі былі заўважаныя як добра развязаныя і эфектыўныя на калонцы PMP, якая была больш эфектыўнай, чым калонка Ascentis Express RP-Amide.
ПЭГ (поліэтыленгліколь), мачавіна, воцатная кіслата, триметоксиортосиликат (TMOS), триметилхлорсилан (TMCS), трыпсінаў, сыроватачна альбумін чалавека (HSA), хларыд амонія, мачавіна, гексан-метилдисилазан (HMDS), метакрилоилхлорид (MC), стырол, 4-гідраксі-TEMPO, пераксід бензаілу (B). PO), ацэтанітрыл (ACN), метанол, 2-прапанол і ацэтон, набыты ў Sigma-Aldrich (Сэнт-Луіс, Місуры, ЗША).
Сумесь мачавіны (8 г), поліэтыленгліколя (8 г) і 8 мл 0,01 N воцатнай кіслаты змешвалі на працягу 10 хвілін, а затым да яе дадавалі 24 мл TMOS пры астуджэнні лёдам. Рэакцыйную сумесь награвалі пры 40 °C на працягу 6 гадзін, а затым пры 120 °C на працягу 8 гадзін у аўтаклаве з нержавеючай сталі. Ваду злівалі і рэшткавы матэрыял быў сушылі пры 70°C на працягу 12 гадзін. Высушаную мяккую масу гладка здрабнялі ў печы і кальцыніравалі пры 550°C на працягу 12 гадзін. Былі падрыхтаваны і ахарактарызаваны тры партыі для праверкі ўзнаўляльнасці памеру часціц, памеру пор і плошчы паверхні.
Шляхам мадыфікацыі паверхні часціц дыяксіду крэмнія папярэдне сінтэзаваным лігандам фенілмалеімід-метилвинилизоцианатом (PCMP) з наступнай радыяльнай полімерызацыяй са стыролам было атрымана злучэнне, якое змяшчае палярную групу.Стацыянарная фаза для запаўняльнікаў і полістыролавых ланцугоў. Працэс падрыхтоўкі апісаны ніжэй.
N-фенілмалеімід (200 мг) і метилвинилизоцианат (100 мг) раствараюць у сухім талуоле і 0,1 мл 2,2'-азаізабутыранітрылу (AIBN) дадаюць у рэакцыйную колбу для атрымання супалімера фенілмалеімід-метилвинилизоцианата (PMCP). Сумесь награваюць пры 60°C на працягу 3 ч., працаджваюць і сушаць у духоўцы пры 40°С на працягу 3 ч.
Высушаныя часціцы дыяксіду крэмнія (2 г) диспергировали ў сухім талуоле (100 мл), змешвалі і апрацоўвалі ультрагукам у круглодонной колбе аб'ёмам 500 мл на працягу 10 хвілін. PMCP (10 мг) растваралі ў талуоле і дадавалі па кроплях у рэакцыйную колбу праз капельную варонку. Сумесь кіпяцілі з зваротным халадзільнікам пры 100 °C на працягу 8 гадзін, фільтравалі і прамывалі ацэтонам і сушылі пры 60°C на працягу 3 гадзін. Затым часціцы дыяксіду крэмнія, звязаныя з PMCP (100 г), растваралі ў талуоле (200 мл) і дадавалі 4-гідраксі-TEMPO (2 мл) у прысутнасці 100 мкл дибутилолова дилаурата ў якасці каталізатара. Сумесь змешвалі пры 50°C на працягу 8 гадзін, фільтравалі і сушылі пры 50°C на працягу 3 гадзін. гадзіны.
Стырол (1 мл), пераксід бензаілу BPO (0,5 мл) і TEMPO-PMCP-злучаныя часціцы дыяксіду крэмнія (1,5 г) диспергировали ў талуоле і прадулі азотам. Полімерызацыю стыролу правялі пры 100°C на працягу 12 гадзін. Атрыманы прадукт прамывалі метанолам і сушылі пры 60°C на працягу ночы. Агульная схема рэакцыі паказана на малюнку 1.
Узоры дэгазавалі пры 393 K на працягу 1 гадзіны для атрымання рэшткавага ціску менш за 10-3 Torr. Колькасць N2, адсарбаванага пры адносным ціску P/P0 = 0,99, выкарыстоўвалася для вызначэння агульнага аб'ёму пор. Марфалогія аголеных і звязаных лігандам часціц дыяксіду крэмнія была даследавана з дапамогай сканавальнай электроннай мікраскапіі (Hitachi High Technologies, Токіо, Японія). Высушаныя ўзоры ( голы дыяксід крэмнія і часціцы дыяксіду крэмнія, злучаныя лігандам) змяшчалі на алюмініевую калонку з выкарыстаннем клейкай вугляроднай стужкі. Золата наносілася на ўзоры з дапамогай прылады для нанясення пакрыццяў Q150T, і на ўзоры наносіўся пласт Au таўшчынёй 5 нм. Гэта павышае эфектыўнасць працэсу з выкарыстаннем нізкіх напружанняў і забяспечвае дробнае зярністасць халоднага распылення. Элементны аналізатар Thermo Electron (Waltham, MA, ЗША) Flash EA1112 Для элементарнага аналізу выкарыстоўваўся аналізатар памераў часціц Malvern (Вустэршыр, Вялікабрытанія) Mastersizer 2000. Аголеныя часціцы дыяксіду крэмнія і звязаныя лігандам часціцы дыяксіду крэмнія (5 мг кожныя) диспергировали ў 5 мл ізапрапанолу, апрацоўвалі ультрагукам на працягу 10 хвілін, варочалі на працягу 5 хвілін і змяшчалі на аптычны стол Mastersizer.Thermo гравіметрычны аналіз праводзіўся з хуткасцю 5 °C у хвіліну ў дыяпазоне тэмператур ад 30 да 800 °C.
Абабітыя шклом вузкаствольныя калоны з нержавеючай сталі памерамі (100 × 1,8 мм унутр.) былі спакаваныя з выкарыстаннем метаду ўпакоўкі шлама з прымяненнем той жа працэдуры, што выкарыстоўвалася ў Ref.31.Калонка з нержавеючай сталі (абшытая шклом, унутраны памер 100 × 1,8 мм) з выхадным фітынгам, які змяшчае фрыту 1 мкм, была падлучана да ўпакоўшчыка шлама (Alltech Deerfield, Ілінойс, ЗША). Прыгатуйце завісь нерухомай фазы, суспензіруючы 150 мг нерухомай фазы ў 1,2 мл метанолу і адпраўце яе ў калонку для захоўвання. Метанол таксама выкарыстоўваўся ў якасці растваральніка шлама. у якасці рухальнага растваральніка. Запаўняйце калонку паслядоўна, ужываючы ціск 100 МП на працягу 10 хвілін, 80 МП на працягу 15 хвілін і 60 МП на працягу 30 хвілін. Падчас упакоўкі ўжывалася механічная вібрацыя з дапамогай двух шейкераў GC (Alltech, Deerfield, IL, USA), каб забяспечыць раўнамерную ўпакоўку калоны. Зачыніце ўпакоўшчык шлама і павольна паслабце ціск, каб прадухіліць пашкоджанне калоны. Адключыце калонку ад блока ўпакоўкі шлама і падключыце іншы фітынг да ўваходу і да сістэмы LC, каб праверыць яе працу.
Помпа LC (10AD Shimadzu, Японія), інжэктар (Valco (ЗША) C14 W.05) з пятлёй ін'екцыі аб'ёмам 50 нл, мембранны дэгазатар (Shimadzu DGU-14A), капілярнае акно UV-VIS. Спецыяльны дэтэктар прылады µLC (UV-2075) і мікракалонкі са шклом. Каб мінімізаваць эфект, выкарыстоўвайце вельмі вузкія і кароткія злучальныя трубкі. дадатковага пашырэння паласы калонкі. Пасля ўпакоўкі капіляры (50 мкм id 365 і аднаўляючыя аб'яднальныя капіляры (50 мкм) былі ўсталяваны на выхадзе 1/16" аднаўляючага злучэння. Збор даных і храматаграфічная апрацоўка праводзіліся з дапамогай праграмнага забеспячэння Multichro 2000. Маніторынг пры 254 нм. Аналіты выпрабоўваліся на УФ-паглынанне. Храматаграфічныя дадзеныя былі прааналізаваны OriginPro8 (Нортгемптан, Масачусэтс).
Альбумін з сыроваткі крыві чалавека, лиофилизированный парашок, ≥ 96% (электрафарэз у агарозном гелі) 3 мг, змешаны з трыпсінаў (1,5 мг), 4,0 М мачавінай (1 мл) і 0,2 М бікарбанату амонія (1 мл). Раствор змешваюць на працягу 10 хвілін і вытрымліваюць на вадзяной лазні пры 37°C на працягу 6 гадзін, затым гасяць 1 мл 0,1% TFA. Адфільтраваць раствор і захоўваць пры тэмпературы ніжэй за 4 °C.
Падзел пептыдных сумесяў і пераварвання трыпсінаў HSA ацэньвалі асобна на калонках PMP. Праверце падзел пептыднай сумесі і пераварвання трыпсінаў HSA на калонцы PMP і параўнайце вынікі з калонкай Ascentis Express RP-Amide. Тэарэтычная колькасць пласцін разлічваецца наступным чынам:
СЭМ выявы голых часціц дыяксіду крэмнія і часціц дыяксіду крэмнія, звязаных лігандам, паказаны на мал.2. СЭМ-выявы голых часціц крэмнія (A, B) паказваюць, што, у адрозненне ад нашых папярэдніх даследаванняў, гэтыя часціцы з'яўляюцца сферычнымі, пры якіх часціцы выцягнутыя альбо маюць няправільную сіметрыю. Паверхню крэмнія, звязаных з лігандамі (C, D), больш, чым на часціцы сілікаў, якія могуць быць звязаны з увядзеннем у пасеўныя прыклады па паверхні сілікі.
Выявы голых часціц дыяксіду крэмнія (A, B) і звязаных лігандам часціц дыяксіду крэмнія (C, D) са сканіруючага электроннага мікраскопа.
Размеркаванне часціц аголенага дыяксіду крэмнія па памерах і часціц дыяксіду крэмнія, звязаных з лігандамі, паказана на малюнку 3 (A). Крывыя размеркавання часціц па памеры па аб'ёме паказалі, што памер часціц дыяксіду крэмнія павялічыўся пасля хімічнай мадыфікацыі (мал. 3A). Даныя размеркавання часціц дыяксіду крэмнія па памерах з бягучага і папярэдняга даследаванняў параўноўваюцца ў табліцы 1 (A). Памер часціц P па аб'ёме, d (0,5), MP складае 3,36 мкм у параўнанні з нашым папярэднім даследаваннем са значэннем ad(0,5) 3,05 мкм (часціцы дыяксіду крэмнія, звязаныя з полістыролам)34. Гэтая партыя мела больш вузкі размеркаванне часціц па памеры ў параўнанні з нашым папярэднім даследаваннем з-за розных суадносін ПЭГ, мачавіны, ТМОС і воцатнай кіслаты ў рэакцыйнай сумесі. Памер часціц фазы PMP крыху большы, чым у звязанага з полістыролу дыяксіду крэмнія. фазу часціц, якую мы вывучалі раней. Гэта азначае, што павярхоўная функцыяналізацыя часціц дыяксіду крэмнія стыролам нанесла толькі пласт полістыролу (0,97 мкм) на паверхню дыяксіду крэмнія, у той час як у фазе PMP таўшчыня пласта была 1,38 мкм.
Размеркаванне часціц па памерах (A) і размеркаванне пор па памерах (B) голых часціц дыяксіду крэмнія і часціц дыяксіду крэмнія, звязаных з лігандам.
Памер пор, аб'ём пор і плошча паверхні часціц дыяксіду крэмнія ў бягучым даследаванні прыведзены ў табліцы 1 (B). Профілі PSD голых часціц дыяксіду крэмнія і часціц дыяксіду крэмнія, звязаных з лігандам, паказаны на малюнку 3 (B). Вынікі супастаўныя з нашым папярэднім даследаваннем. Памеры пор аголеных часціц і часціц дыяксіду крэмнія, звязаных з лігандам, складаюць 310 і 241 адпаведна, што паказвае, што памер пор памяншаецца на 69 пасля хімічнай мадыфікацыі, як паказана ў табліцы 1(B), а змяненне крывой паказана на мал. 3(B). Падобным чынам, аб'ём пор часціц дыяксіду крэмнія зменшыўся з 0,67 да 0,58 см3/г пасля хімічнай мадыфікацыі. Удзельная плошча паверхні даследаваных часціц дыяксіду крэмнія складае 116 м2/г, што параўнальна з нашым папярэднім даследаваннем (124 м2/г). Як паказана ў табліцы 1(B), плошча паверхні (м2/г) часціц дыяксіду крэмнія таксама зменшылася са 116 м2/г да 105 м2/г пасля хімічнай мадыфікацыі.
Вынікі элементнага аналізу нерухомай фазы паказаны ў табліцы 2. Утрыманне вугляроду ў бягучай стацыянарнай фазе складае 6,35 %, што ніжэй, чым утрыманне вугляроду ў нашым папярэднім даследаванні (часціцы дыяксіду крэмнія, звязаныя з полістыролу, 7,93 %35 і 10,21 %, адпаведна) 42. Утрыманне вугляроду ў бягучай стацыянарнай фазе нізкае, таму што пры падрыхтоўцы бягучага SP, акрамя стыролу, выкарыстоўваюцца некаторыя палярныя ліганды, такія як былі выкарыстаны фенілмалеімід-метылвінілізацыянат (PCMP) і 4-гідраксі-TEMPO. Масавы працэнт азоту ў бягучай стацыянарнай фазе складае 2,21 % у параўнанні з 0,1735 і 0,85 % па масе азоту ў папярэдніх даследаваннях адпаведна. Гэта азначае, што масавы % азоту вышэй у бягучай стацыянарнай фазе з-за фенілмалеіміду. 4) і (5) былі 2,7% і 2,9% адпаведна, у той час як загрузка вугляроду ў канчатковым прадукце (6) складала 6,35%, як паказана ў табліцы 2. Страта вагі была праверана з дапамогай стацыянарнай фазы PMP, а крывая TGA паказана на малюнку 4. Крывая TGA паказвае страту масы 8,6%, што добра супадае з загрузкай вугляроду (6,35%), таму што ліганды ўтрымліваюць не толькі C, але таксама N, O і H.
Фенілмалеімід-метылвінілізацыянатны ліганд быў абраны для мадыфікацыі паверхні часціц дыяксіду крэмнія, таму што ён мае палярныя фенилмалеімідныя групы і вінілізацыянатныя групы. Вінілізацыянатныя групы могуць у далейшым уступаць у рэакцыю са стыролам шляхам жывой радыкальнай полімерызацыі. Другая прычына заключаецца ў тым, каб уставіць групу, якая мае ўмеранае ўзаемадзеянне з аналізаваным рэчывам і не мае моцнага электрастатычнага ўзаемадзеяння паміж аналізаваным рэчывам і нерухомай фазай, паколькі р Фрагмент генілмалеіміду не мае віртуальнага зарада пры нармальным pH. Палярнасць нерухомай фазы можна кантраляваць аптымальнай колькасцю стыролу і часам рэакцыі свабоднарадыкальнай полімерызацыі. Апошні этап рэакцыі (свабоднарадыкальная полімерызацыя) мае вырашальнае значэнне і можа змяніць палярнасць нерухомай фазы. Для праверкі нагрузкі вугляродам гэтых нерухомых фаз быў праведзены элементны аналіз. Было заўважана, што павелічэнне колькасці стыролу і часу рэакцыі павялічвае загрузку вугляроду стацыянарнай фазы і наадварот. SP, прыгатаваныя з рознымі канцэнтрацыямі стыролу, маюць розныя нагрузкі вугляродам. Яшчэ раз загрузіце гэтыя нерухомыя фазы ў калонкі з нержавеючай сталі і праверце іх храматаграфічныя характарыстыкі (селектыўнасць, разрозненне, значэнне N і г.д.). На аснове гэтых эксперыментаў быў абраны аптымізаваны склад для падрыхтоўкі стацыянарнай фазы PMP для забеспячэння кантраляванай палярнасці і добрага ўтрымання аналізуемых рэчываў.
Пяць пептыдных сумесяў (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцын-энкефалін) таксама ацэньвалі з дапамогай калонкі PMP з выкарыстаннем рухомай фазы;60/40 (аб'ём/аб'ём) ацэтанітрыл/вада (0,1% TFA) пры хуткасці патоку 80 мкл/мін. Пры аптымальных умовах элюіравання тэарэтычная колькасць пласцін (N) на калонку (100 × 1,8 мм унутр. унутр.) складае 20 000 ± 100 (200 000 пласцін/м²). У табліцы 3 прыведзены значэнні N для трох калонак PMP і каляровасці таграмы паказаны на малюнку 5A. Хуткі аналіз на калонцы PMP пры высокай хуткасці патоку (700 мкл/мін), пяць пептыдаў былі элюіраваны на працягу адной хвіліны, значэнні N былі вельмі добрымі, 13 500 ± 330 на калонку (100 × 1,8 мм унутр. унутр.), Адпавядае 135 000 пласцін/м (малюнак 5B). Тры калонкі аднолькавага памеру (100 × Унутраны дыяметр 1,8 мм) напаўнялі трыма рознымі партыямі нерухомай фазы PMP для праверкі ўзнаўляльнасці. Канцэнтрацыя аналіту для кожнай калонкі была зарэгістравана з выкарыстаннем аптымальных умоў элюіравання і колькасці тэарэтычных пласцін N і часу ўтрымання для падзелу адной і той жа доследнай сумесі на кожнай калонцы. Дадзеныя ўзнаўляльнасці для калонак PMP паказаны ў табліцы 4. Узнаўляльнасць калонкі PMP добра карэлюе з вельмі нізкімі значэннямі %RSD, як паказана ў табліцы 3. .
Падзел сумесі пептыдаў на калонцы PMP (B) і калонцы Ascentis Express RP-Amide (A);рухомая фаза 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), памеры калонкі PMP (100 × 1,8 мм унутр.);аналітычны Парадак элюіравання злучэнняў: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) і 5 (лейцынавая кіслата энкефалін)).
Калонка PMP (унутраны памер 100 × 1,8 мм) была ацэненая для падзелу трыптычных перавараў сыроватачна альбуміна чалавека ў высокаэфектыўнай вадкаснай храматаграфіі. Храматаграма на малюнку 6 паказвае, што ўзор добра падзелены і раздзяленне вельмі добрае. Расшчапленні HSA аналізаваліся з выкарыстаннем хуткасці патоку 100 мкл/мін, рухомай фазы 70/30 ацэтанітрыл/вада і 0,1% TFA. Як паказана на храматаграме (малюнак 6) расшчапленне HSA было падзелена на 17 пікаў, якія адпавядаюць 17 пептыдам. Была разлічана эфектыўнасць падзелу кожнага піка ў расшчапленні HSA, а значэнні прыведзены ў табліцы 5.
Трыптычны перавар HSA (100 × 1,8 мм унутр.) аддзялялі на калонцы PMP;хуткасць патоку (100 мкл/мін), рухомая фаза 60/40 ацэтанітрыл/вада з 0,1% TFA.
дзе L - даўжыня слупка, η - глейкасць рухомай фазы, ΔP - супрацьціск слупка, і u - лінейная хуткасць рухомай фазы. Пранікальнасць калонкі PMP была 2,5 × 10-14 м2, хуткасць патоку - 25 мкл/мін, выкарыстоўвалася 60/40 аб'ём ACN/вада. Пранікальнасць калонкі PMP (100 × 1,8 мм унутр. ) была аналагічная пранікальнасці нашага папярэдняга даследавання Ref.34. Пранікальнасць калоны, напоўненай павярхоўна сітаватымі часціцамі, складае: 1,7 × 10-15 для часціц памерам 1,3 мкм, 3,1 × 10-15 для часціц памерам 1,7 мкм, 5,2 × 10-15 і 2,5 × 10-14 м2 для часціц памерам 2,6 мкм Для 5 часціцы мкм 43. Такім чынам, пранікальнасць фазы PMP падобная на пранікальнасць часціц ядро-абалонка памерам 5 мкм.
дзе Wx - вага калонкі, напоўненай хлараформам, Wy - вага калонкі, напоўненай метанолам, а ρ - шчыльнасць растваральніка. Шчыльнасць метанолу (ρ = 0,7866) і хлараформу (ρ = 1,484). Агульная сітаватасць калонак SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 мм унутр. унутр.) 34 і C18-U rea калонкі 31, якія мы раней вывучалі, былі адпаведна 0,63 і 0,55. Гэта азначае, што прысутнасць лігандаў мачавіны зніжае пранікальнасць нерухомай фазы. З іншага боку, агульная сітаватасць калонкі PMP (100 × 1,8 мм унутр. унутр.) роўная 0,60. Пранікальнасць калонак PMP ніжэй, чым у калонак, напоўненых часціцамі дыяксіду крэмнія, звязанымі з C18, таму што ў тыпу C18 у стацыянарных фазах ліганды C18 прымацоўваюцца да часціц дыяксіду крэмнія ў выглядзе лінейных ланцужкоў, у той час як у стацыянарных фазах тыпу полістыролу вакол іх утворыцца адносна тоўсты палімерны пласт. У тыповым эксперыменце сітаватасць слупка разлічваецца як:
На малюнках 7A, B паказаны калонкі PMP (100 × 1,8 мм унутраным унутраным памерам) і калонка Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 мм унутраным дыяметрам) з выкарыстаннем тых жа ўмоў элюіравання (г.зн. 60/40 ACN/H2O і 0,1% TFA).) участку ван Дэемтэра.Выбраныя пептыдныя сумесі (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) былі падрыхтаваны ў 20 мкл / Мінімальная хуткасць патоку для абедзвюх калонак складае 800 мкл/мін. Мінімальныя значэнні HETP пры аптымальнай хуткасці патоку (80 мкл/мін) для калонкі PMP і калонка Ascentis Express RP-Amide складала 2,6 мкм і 3,9 мкм адпаведна. Значэнні HETP паказваюць, што эфектыўнасць падзелу калонкі PMP (100 × 1,8 мм унутраным унутраным унутраным унутраным унутраным унутраным дыяметрам) значна лепшая, чым камерцыйна даступная калонка Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 мм унутраны унутраны дыяметр). Графік Ван Дэемтэра на мал. 7 (A) паказвае, што памяншэнне значэння N з павелічэнне патоку не з'яўляецца значным у параўнанні з нашым папярэднім даследаваннем. Больш высокая эфектыўнасць падзелу калонкі PMP (100 × 1,8 мм унутр.) у параўнанні з калонкай Ascentis Express RP-Amide заснавана на паляпшэнні формы часціц, памеру і складаных працэдур упакоўкі калонкі, якія выкарыстоўваюцца ў бягучай працы34.
(A) графік Ван Дэемтэра (HETP у залежнасці ад лінейнай хуткасці рухомай фазы), атрыманы з выкарыстаннем калонкі PMP (100 × 1,8 мм унутраным унутраным унутраным унутраным унутраным унутраным унутрам) у 60/40 ACN/H2O з 0,1% TFA. (B) Графік Ван Дэемтэра (HETP у параўнанні з лінейнай хуткасцю рухомай фазы), атрыманы з выкарыстаннем калонкі Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 мм унутраным унутраным унутраным памерам) у 60/4 0 ACN/H2O з 0,1% TFA.
Стацыянарная фаза полістыролу з палярным убудаваннем была падрыхтавана і ацэненая для падзелу сінтэтычных пептыдных сумесяў і трыпсінавых перавараў сыроватачна альбуміна чалавека (HAS) у высокаэфектыўнай вадкаснай храматаграфіі. Храматаграфічныя характарыстыкі калонак PMP для пептыдных сумесяў выдатныя па эфектыўнасці падзелу і дазволе. Палепшаныя характарыстыкі падзелу калонак PMP абумоўлены рознымі прычынамі, такімі як памер часціц і памер пор si часціцы lica, кантраляваны сінтэз стацыянарнай фазы і складаная ўпакоўка калоны. У дадатак да высокай эфектыўнасці падзелу, нізкі зваротны ціск у калоне пры высокіх хуткасцях патоку з'яўляецца яшчэ адной перавагай гэтай стацыянарнай фазы. Калоны PMP дэманструюць добрую ўзнаўляльнасць і могуць быць выкарыстаны для аналізу пептыдных сумесяў і расшчаплення трыпсінамі розных бялкоў. Мы маем намер выкарыстоўваць гэтую калонку для падзелу натуральных прадуктаў, біяактыўных злучэнняў з лекавых раслін і экстрактаў грыбоў у вадкай каляровай гаме таграфія. У будучыні калонкі PMP таксама будуць ацэньвацца на прадмет падзелу бялкоў і моноклональных антыцелаў.
Поле, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Даследаванне сістэм падзелу пептыдаў з дапамогай храматаграфіі са зваротнай фазай. Частка I: Распрацоўка пратаколу характарыстыкі калонак.J.Храматаграфія.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Палепшаныя актыўныя пептыды, прызначаныя для лячэння інфекцыйных захворванняў. Biotechnology.Advanced.36 (2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synthetic therapeutic peptides: science and the market.drug discovery.15 (1-2) today, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J.Храматаграфія.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Удасканаленая вадкасная храматаграфія-мас-спектраметрыя дазваляе ўключаць метабаламіку і пратэёміку шырокага прызначэння. anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Роля UHPLC у распрацоўцы лекаў.J.Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Фундаментальныя і практычныя аспекты вадкаснай храматаграфіі звышвысокага ціску для хуткага падзелу.J.Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Прымяненне звышвысокаэфектыўнай вадкаснай храматаграфіі ў распрацоўцы лекаў.Храматаграфія.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Маналітныя макрапорістыя гідрагелі, прыгатаваныя з эмульсій алею ў вадзе з высокай унутранай фазай для эфектыўнай ачысткі энтэравірусаў. Chemical.Britain.J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Роля вадкаснай храматаграфіі ў пратэёміцы.Храматаграфія.A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Новыя тэндэнцыі ў зваротна-фазнай вадкаснай храматаграфіі падзелу тэрапеўтычных пептыдаў і бялкоў: тэорыя і прымяненне.J.Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC. Двухмернае падзел пептыдаў з выкарыстаннем сістэмы RP-RP-HPLC з выкарыстаннем розных значэнняў pH у першым і другім вымярэннях падзелу.Sep. Sci. 28 (14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al.The характарыстыкі пераносу масы і кінэтычныя характарыстыкі высокаэфектыўных храматаграфічных калонак, напоўненых C18 суб-2 мкм цалкам і павярхоўна порыстых часціц былі даследаваны.J.Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Апошнія тэндэнцыі і аналітычныя праблемы ў ізаляцыі, ідэнтыфікацыі і праверцы раслінных біялагічна актыўных пептыдаў. anus.biological anus.Chemical.410 (15), 3425–3444.
Мюлер, Дж. Б. і інш. Пратэамічны ландшафт царства жыцця. Прырода 582 (7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Далейшая апрацоўка тэрапеўтычных пептыдаў прэпаратнай вадкаснай храматаграфіяй. Малекула (Базель, Швейцарыя) 26 (15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Змешаная храматаграфія і яе прымяненне да біяпалімераў.Храматаграфія.A 1218 (49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Ліганды для бялковай храматаграфіі ў змешаным рэжыме: прынцып, характарыстыка і дызайн.J.Біятэхналогія.144 (1), 3-11 (2009).