Дзякуй за наведванне сайта Nature.com. Версія браўзера, якой вы карыстаецеся, мае абмежаваную падтрымку CSS. Для найлепшага карыстання рэкамендуем выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Тым часам, каб забяспечыць бесперапынную падтрымку, мы будзем адлюстроўваць сайт без стыляў і JavaScript.
Люпін вузкалісты (NLL, Lupinus angustifolius L.) — бабовая расліна, якая выкарыстоўваецца для вытворчасці прадуктаў харчавання і паляпшэння глебы. Глабальнае пашырэнне NLL як культуры прыцягнула мноства патагенных грыбоў, у тым ліку антракноз люпіну, які выклікае разбуральную хваробу антракноз. У селекцыі NLL выкарыстоўваліся два алелі, Lanr1 і AnMan, якія надаюць павышаную ўстойлівасць, але асноўныя малекулярныя механізмы застаюцца невядомымі. У гэтым даследаванні маркеры Lanr1 і AnMan былі выкарыстаны для скрынінга еўрапейскіх узораў NLL. Тэставанне вакцыны ў кантраляваным асяроддзі пацвердзіла эфектыўнасць абодвух рэзістэнтных донараў. Дыферэнцыяльнае прафіляванне экспрэсіі генаў было праведзена на рэпрэзентатыўных рэзістэнтных і ўспрымальных лініях. Рэзістэнтнасць да антракнозу была звязана з празмернай экспрэсіяй тэрмінаў геннай анталогіі «GO:0006952 Defense Response», «GO:0055114 Redox Process» і «GO:0015979 Photosynthesis». Акрамя таго, лінія Lanr1(83A:476) прадэманстравала значнае хуткае перапраграмаванне транскрыптомаў пасля інакуляцыі, у той час як іншыя лініі паказалі затрымку ў гэтай рэакцыі прыкладна на 42 гадзіны. Абаронныя рэакцыі звязаны з генамі TIR-NBS, CC-NBS-LRR і NBS-LRR, 10 бялкамі, якія ўдзельнічаюць у патагенезе, бялкамі пераносу ліпідаў, эндаглюкан-1,3-β-глюказідазай, багатымі на гліцын бялкамі клеткавай сценкі і генамі рэактыўнага шляху кіслароду. Раннія рэакцыі на 83A:476, у тым ліку стараннае падаўленне генаў, звязаных з фотасінтэзам, супалі з паспяховай абаронай падчас вегетатыўнай фазы росту грыбковай біялогіі, што сведчыць аб тым, што эфектар запускае імунітэт. Рэакцыя Мандэлупа запавольваецца, як і агульнае гарызантальнае супраціўленне.
Вузкалісты люпін (НЛЛ, Lupinus angustifolius L.) — гэта высокабялковая злаковая культура, якая паходзіць з заходняга Міжземнамор'я1,2. У цяперашні час яго вырошчваюць у якасці харчовай культуры для жывёл і людзей. Ён таксама лічыцца зялёным угнаеннем у сістэмах севазвароту дзякуючы фіксацыі азоту сімбіятычнымі азотфіксуючымі бактэрыямі і агульнаму паляпшэнню структуры глебы. НЛЛ хутка перажыла працэс адамашнення за апошняе стагоддзе і да гэтага часу знаходзіцца пад высокім ціскам селекцыі3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. З шырока распаўсюджаным вырошчваннем НЛЛ, сукцэсія патагенных грыбоў распрацавала новыя сельскагаспадарчыя нішы і выклікала новыя хваробы, якія знішчаюць ураджай. Найбольш характэрнай падзеяй для фермераў і селекцыянераў люпіну стала з'яўленне антракнозу, выкліканага патагенным грыбком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Найбольш характэрнай падзеяй для фермераў і селекцыянераў люпіну стала з'яўленне антракнозу, выкліканага патагенным грыбком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Найбольш прыкметным для фермераў і селекцыянераў люпіна было з'яўленне антракноза, выкліканага патагенным грыбком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Найбольш прыкметнай для фермераў і селекцыянераў люпіну стала з'яўленне антракнозу, выкліканага патагенным грыбком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Бондар) Нірэнберг, Фейлер і Хагедорн13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Бондар)嵵Валасаты。1 Найбольш паразлівым для фермераў і селекцыянераў люпіны з'яўляецца выяўленне антракноза, выкліканага патогенным грыбком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Найбольш уражвае фермераў і селекцыянераў люпіну з'яўленне антракнозу, выкліканага патагенным грыбком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Самыя раннія паведамленні пра хваробу паступілі з Бразіліі і ЗША, тыповыя сімптомы з'явіліся адпаведна ў 1912 і 1929 гадах. Аднак прыкладна праз 30 гадоў узбуджальнік быў пазначаны як Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., тэлеаморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., тэлеаморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., тэлеаморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld у Целенакіраванай марфалогіі. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld у мэтавай марфалогіі. & Г. Шрэнк,. & Г. Шрэнк,.і Х. Шрэнк. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。і Г. Шленк,.Папярэдняе фенатыпаванне хваробы, праведзенае ў сярэдзіне 20-га стагоддзя, паказала некаторую ўстойлівасць у асобнікаў NLL і жоўтага люпіну (L. luteus L.), але ўсе правераныя асобнікі белага люпіну (L. albus L.) былі вельмі ўспрымальнымі15,16. Даследаванні паказалі, што развіццё антракнозу звязана з павелічэннем колькасці ападкаў (вільготнасці паветра) і тэмпературы (у дыяпазоне 12-28°C), што прыводзіць да парушэння ўстойлівасці пры больш высокіх тэмпературах17,18. Фактычна, час, неабходны для прарастання канідый і пачатку захворвання, быў у чатыры разы карацейшым пры 24°C (4 гадзіны), чым пры 12°C (16 гадзін) ва ўмовах высокай вільготнасці19. Такім чынам, бягучае глабальнае пацяпленне прывяло да распаўсюджвання антракнозу. Аднак хвароба назіралася ў Францыі (1982) і Украіне (1983) як прадвеснік непазбежнай пагрозы, але, відавочна, у той час была праігнаравана люпінавай прамысловасцю20,21. Праз некалькі гадоў гэтая разбуральная хвароба распаўсюдзілася па ўсім свеце і таксама закранула буйныя краіны-вытворцы люпіну, такія як Аўстралія, Польшча і Германія22,23,24. Пасля ўспышкі антракнозу ў сярэдзіне 1990-х гадоў шырокі скрынінг прывёў да выяўлення некалькіх рэзістэнтных донараў ва ўзорах NLL19. Рэзістэнтнасць NLL да антракнозу кантралюецца двума асобнымі дамінантнымі алелямі, якія сустракаюцца ў розных крыніцах зародкавай плазмы: Lanr1 у гатунках Tanjil і Wonga і AnMan у гатунках Mandalay25,26. Гэтыя алелі дапаўняюць малекулярныя маркеры, якія падтрымліваюць адбор рэзістэнтнай зародкавай плазмы ў селекцыйных праграмах25,26,27,28,29,30. Устойлівая селекцыйная лінія 83A:476, якая нясе алель Lanr1, была скрыжавана з успрымальнай дзікай лініяй P27255 для атрымання папуляцыі RIL, якая сегрэгуе па ўстойлівасці да антракнозу, што дазволіла аднесці локус Lanr1 да храмасомы NLL-1131, 32, 33. Выраўноўванне маркераў карты зчэплення ад фланкіруючых локусаў устойлівасці да антракнозу з геномным каркасам, NLL выявіла размяшчэнне ўсіх трох алеляў на адной храмасоме (NLL-11), але ў розных пазіцыях29,34,35. Аднак з-за невялікай колькасці RIL і вялікай генетычнай адлегласці паміж маркерамі і адпаведнымі алелямі нельга зрабіць надзейных высноў аб іх асноўных генах. З іншага боку, выкарыстанне зваротнай генетыкі ў люпінаў складанае з-за іх вельмі нізкага патэнцыялу рэгенерацыі, што робіць генетычныя маніпуляцыі грувасткімі37.
Распрацоўка акультуранай зародкавай плазмы, якая нясе патрэбны алель у гамазіготным стане, напрыклад, 83A:476 (Lanr1) і Mandelup (AnMan), адкрыла дзверы для вывучэння ўстойлівасці да антракнозу ва ўмовах наяўнасці супрацьлеглых камбінацый алеляў у дзікіх папуляцыях. Магчымасці малекулярных механізмаў. Параўнанне ахоўных рэакцый, якія генеруюцца пэўнымі генатыпамі. У гэтым даследаванні ацэньваўся ранні транскрыптомны адказ NLL на вакцынацыю супраць C. lupini. Спачатку была праведзена скрынінг еўрапейскай панэлі зародкавай плазмы NLL, якая змяшчае 215 ліній, з выкарыстаннем малекулярных маркераў, якія пазначаюць алелі Lanr1 і AnMan. Затым было праведзена фенатыпаванне антракнозу на 50 лініях NLL, папярэдне адабраных па малекулярных маркерах, у кантраляваных умовах. На падставе гэтых эксперыментаў былі адабраны чатыры лініі, якія адрозніваюцца ўстойлівасцю да антракнозу і алельным складам Lanr1/AnMan, для дыферэнцыяльнага прафілявання экспрэсіі генаў абароны з выкарыстаннем двух дапаўняльных падыходаў: высокапрадукцыйнага секвенавання РНК і колькаснага вызначэння ПЦР у рэжыме рэальнага часу.
Скрынінг набору зародкавай плазмы NLL (N = 215) з маркерамі Lanr1 (Anseq3 і Anseq4) і AnMan (Anseq4) і AnMan (AnManM1) паказаў, што толькі адна лінія (95726, каля Salamanca-b) ампліфікуе алель «рэзістэнтнасці» для ўсіх маркераў, у той час як «Наяўнасць «ўспрымальных» алеляў» выявіла долю ўсіх маркераў у 158 (~73,5%) лініях. Трынаццаць ліній далі два «рэзістэнтныя» алелі маркера Lanr1, а 8 ліній далі «рэзістэнтныя» алелі маркера Lanr1. Алель «рэзістэнтнасці» маркера AnMan (Дадатковая табліца S1). Дзве лініі былі гетэразіготнымі па маркеру Anseq3 і адна гетэразіготная па маркеру AnManM1. 42 лініі (19,5%) мелі процілеглыя фазы алеляў Anseq3 і Anseq4, што сведчыць аб высокай частаце рэкамбінацыі паміж гэтымі двума локусамі. Фенатыпы антракнозу ў кантраляваных умовах (Дадатковая табліца S2) выявілі зменлівасць устойлівасці правераных генатыпаў, што адлюстравалася ў ступені цяжкасці антракнозу. Розніца ў сярэдніх балах вагалася ад 1,8 (умерана ўстойлівы) да 6,9 (адчувальны), а розніца ў вазе раслін — ад 0,62 (адчувальны) да 4,45 г (устойлівы). Існавала значная карэляцыя паміж значэннямі, якія назіраліся ў двух паўторах эксперыменту (0,51 для балаў цяжкасці захворвання, P = 0,00017 і 0,61 для масы расліны, P < 0,0001), а таксама паміж гэтымі двума параметрамі (−0,59 і −0,77, P < 0,0001). Існавала значная карэляцыя паміж значэннямі, якія назіраліся ў двух паўторах эксперыменту (0,51 для балаў цяжкасці захворвання, P = 0,00017 і 0,61 для масы расліны, P < 0,0001), а таксама паміж гэтымі двума параметрамі (−0,59 і −0,77, P < 0,0001). Выяўлена сапраўдная карэляцыя паміж значэннямі, назіранымі ў двух паўторах эксперыменту (0,51 для балаў цяжару хваробы, P = 0,00017 і 0,61 для масы расліны, P < 0,0001), а таксама паміж гэтымі двума параметрамі (-0,59 і -0,77, R < 0,0001) 0,0001). Выяўлена значная карэляцыя паміж значэннямі, якія назіраліся ў двух паўторах эксперыменту (0,51 для балаў цяжкасці захворвання, P = 0,00017 і 0,61 для масы раслін, P < 0,0001), а таксама паміж гэтымі двума параметрамі (-0,59 і -0,77, P < 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0,51，P = 0,00017，植物重量为0,61，P <0,0001）以及这两个参数之间，(- 0,59 和-0,77，P <0,0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0,59 和– 0,59 和 – 0,59 和– 0,59 和-0,77，P <0,0001). Назіралася значная карэляцыя паміж значэннямі, назіранымі ў двух паўторах (ацэнка цяжару захворвання 0,51, P = 0,00017 і маса расліны 0,61, P <0,0001), і паміж гэтымі двума параметрамі (-0,59 і -0,0001) 0,77, P <0,0001. Існавала значная карэляцыя паміж значэннямі, якія назіраліся ў паўторным доследзе (шкала цяжкасці захворвання 0,51, P = 0,00017 і маса расліны 0,61, P < 0,0001), і паміж гэтымі двума параметрамі (-0,59 і -0,0001) 0,77, P < 0,0001. ).Тыповыя сімптомы, якія назіраюцца ў адчувальных раслін, ўключаюць выгібы і скручванне сцябла, якія нагадваюць структуру «пастуховага лука», а затым авальныя паражэнні з аранжавымі/ружовымі спаразоітамі (дадатковы мал. 1). Аўстралійскія ўзоры, якія нясуць гены Lanr1 (83A:476 і Tanjil) і AnMan (Mandelup), маюць умераную ўстойлівасць, 0,0331 і 0,0036). Некаторыя лініі, якія таксама нясуць «ўстойлівыя» алелі Lanr1 і/або AnMan, праяўляюць сімптомы хваробы.
Цікава, што некалькі ліній NLL, у якіх адсутнічаў які-небудзь «рэзістэнтны» маркерны алель, прадэманстравалі высокі ўзровень устойлівасці да антракнозу (параўнальны або вышэйшы, чым для генатыпаў Lanr1 або AnMan), такія як Boregine (значэнне P < 0,0001 для абодвух параметраў), Bojar (значэнне P < 0,0001 для бала і 0,001 для вагі расліны) і папуляцыя B-549/79b (значэнне P < 0,0001 для бала і нязначнае для вагі). Цікава, што некалькі ліній NLL, у якіх адсутнічаў які-небудзь «рэзістэнтны» маркерны алель, прадэманстравалі высокі ўзровень устойлівасці да антракнозу (параўнальны або вышэйшы, чым для генатыпаў Lanr1 або AnMan), такія як Boregine (значэнне P < 0,0001 для абодвух параметраў), Bojar (значэнне P < 0,0001 для бала і 0,001 для вагі расліны) і папуляцыя B-549/79b (значэнне P < 0,0001 для бала і нязначнае для вагі). Цікава, што некалькі ліній NLL, пазбаўленых якога-небудзь «рэзістэнтнага» маркернага алеля, паказалі высокі ўзровень устойлівасці да антракнозу (сумяшчальны або больш высокі, чым для генатыпаў Lanr1 або AnMan), такіх як Boregine (значэнне P <0,0001 для ўсіх параметраў), Bojar (значэнне P < 0,0001 для ацэнак і 0,001 для масы раслін) і папуляцыі. B-549/79b (значэнне P <0,0001 для ацэнкі і нязначна для масы). Цікава, што некалькі ліній NLL, якія не мелі якога-небудзь «рэзістэнтнага» маркернага алеля, прадэманстравалі высокі ўзровень устойлівасці да антракнозу (параўнальны або вышэйшы, чым для генатыпаў Lanr1 або AnMan), такія як Boregine (значэнне P < 0,0001 для абодвух параметраў), Bojar (значэнне P < 0,0001 для ацэнкі і 0,001 для масы расліны) і папуляцыя B-549/79b (значэнне P < 0,0001 для ацэнкі і неістотнае для масы).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0,0001，植物重量为0,001）和种群B-549/79b（得分P 值<0,0001，重量不显着）。 Цікава, што некаторыя сістэмы NLL, якія не маюць ніякіх «антыгенных» маркераў, дэманструюць высокую гарызантальную ўстойлівасць (эквівалентную генам Lanr1 або AnMan або вышэй), такія як Boregine (абодва параметры P < 0,0001), Bojar (значэнне P < 0,0001, маса расліны 0,001) і штам B-549/79b (значэнне P < 0,0001, вага неістотная). Цікава, што некаторыя лініі NLL, пазбаўленыя якіх-небудзь маркерных алеляў «рэзістэнтнасці», паказалі высокую ступень устойлівасці да антракнозу (супастаўныя або вышэй, чым у генатыпаў Lanr1 або AnMan), такія як Boregine (значэнне P для ўсіх параметраў <0,0001), Bojar (значэнне P <0,0001, маса расліны 0,001) і папуляцыі. B-549/79b (ацэнка P-значэнне <0,0001, маса нязначная). Цікава, што некаторыя лініі NLL, у якіх адсутнічалі якія-небудзь алелі маркераў «рэзістэнтнасці», прадэманстравалі высокі ўзровень устойлівасці да антракнозу (параўнальны з генатыпамі Lanr1 або AnMan або вышэйшы за іх), такія як Boregine (значэнне P для абодвух параметраў <0,0001), Bojar (значэнне P <0,0001, маса расліны 0,001) і папуляцыя B-549/79b (значэнне P <0,0001, вага неістотная).Гэтая з'ява сведчыць аб магчымасці новай генетычнай крыніцы ўстойлівасці, што тлумачыць назіраную адсутнасць карэляцыі паміж маркернымі генатыпамі і фенатыпамі хваробы (значэнні P ад ~0,42 да ~0,98). Такім чынам, тэст Колмагорава-Смірнова паказаў, што дадзеныя па ўстойлівасці да антракнозу былі прыблізна нармальна размеркаваны для балаў (значэнні P 0,25 і 0,11) і масы раслін (значэнні P 0,47 і 0,55), што сведчыць аб маёй гіпотэзе, што ў працэс уцягнуты больш алеляў, чым Lanr1 і AnMan.
На падставе вынікаў скрынінга на ўстойлівасць да антракнозу для транскрыптомнага аналізу былі адабраны 4 лініі: 83A:476, Boregine, Mandelup і папуляцыя 22660. Гэтыя лініі былі паўторна правераны на ўстойлівасць да антраксозу ў эксперыментах па інакуляцыі метадам секвенавання РНК, пры ўмове, што яны былі такімі ж, як і ў папярэднім тэсце. Значэнні балаў былі наступнымі: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) і папуляцыя 22660 (6,11 ± 1,29).
Пратакол Illumina NovaSeq 6000 дазволіў атрымаць у сярэднім 40,5 пар Mread на ўзор (ад 29,7 да 54,4 Mread) (Дадатковая табліца S3). Паказчыкі выраўноўвання ў эталоннай паслядоўнасці вагаліся ад 75,5% да 88,6%. Сярэдняя карэляцыя дадзеных колькасці прачытанняў паміж эксперыментальнымі варыянтамі і біялагічнымі паўторамі вагалася ад 0,812 да 0,997 (сярэдняе значэнне 0,959). З 35 170 прааналізаваных генаў 2917 не прадэманстравалі ніякай экспрэсіі, а астатнія 4785 генаў экспрэсаваліся на нязначным узроўні (сярэдняе базавае значэнне < 5). З 35 170 прааналізаваных генаў 2917 не прадэманстравалі ніякай экспрэсіі, а астатнія 4785 генаў экспрэсаваліся на нязначным узроўні (сярэдняе базавае значэнне < 5). З 35 170 прааналізаваных генаў 2917 не выявілі экспрэсіі, а астатнія 4785 генаў экспрэсіраваліся на незначным узроўні (базавае сярэдняе <5). З 35 170 прааналізаваных генаў 2917 не прадэманстравалі ніякай экспрэсіі, а астатнія 4785 генаў экспрэсаваліся на нязначным узроўні (сярэдняе базавае значэнне <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达＾, 其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。.35 170 З 35 170 прааналізаваных генаў 2917 не экспрессировались, а астатнія 4785 генаў мелі незначительную экспрэсію (базавае сярэдняе значэнне <5). З 35 170 прааналізаваных генаў 2917 не экспрэсаваліся, а астатнія 4785 генаў мелі нязначную экспрэсію (сярэдняе базавае значэнне <5).Такім чынам, колькасць генаў, якія лічыліся экспрэсаванымі (сярэдняе базавае значэнне ≥ 5) падчас эксперыменту, склала 27 468 (78,1%) (Дадатковая табліца S4).
З першага моманту часу ўсе лініі NLL адрэагавалі на інакуляцыю C. lupini (штам Col-08) перапраграмаваннем транскрыптома (табліца 1), аднак паміж лініямі назіраліся значныя адрозненні. Так, лінія рэзістэнтнасці 83A:476 (якая нясе ген Lanr1) прадэманстравала значнае перапраграмаванне транскрыптома ў першы момант часу (6 hpi) з 31-69-кратным павелічэннем колькасці ізаляваных ап- і down-генаў у параўнанні з іншымі момантамі часу ў гэты момант часу. Акрамя таго, гэты пік быў кароткачасовым, бо экспрэсія толькі некалькіх генаў заставалася значна змененай у другі момант часу (12 hpi). Цікава, што Boregine, які таксама прадэманстраваў высокі ўзровень рэзістэнтнасці ў тэсце прышчэпак, не зведаў такога масіўнага транскрыпцыйнага перапраграмавання падчас эксперыменту. Аднак колькасць дыферэнцыяльна экспрэсаваных генаў (DEG) была аднолькавай для Boregine і 83A:476 пры 12 HPI. Як у папуляцыі Мандэлуп, так і ў папуляцыі 22660 пікі дыферэнцыяльнага ступенчатага разраду (DEG) былі выяўлены ў апошні момант часу (48 л/с), што сведчыць аб адноснай затрымцы абарончых рэакцый.
Паколькі 83A:476 зведала масіўнае перапраграмаванне транскрыптома ў адказ на C. lupini пры 6 HPI ў параўнанні з усімі іншымі лініямі, ~91% назіраных у гэты момант часу дыферэнцыяльных генаў (DEG) былі спецыфічнымі для лініі (мал. 1). Аднак назіралася некаторае перакрыццё ў ранніх рэакцыях паміж даследаванымі лініямі, паколькі 68,5%, 50,9% і 52,6% DEG у Boregine, Mandelup і папуляцыі 22660 адпаведна перакрываліся з тымі, што былі выяўлены ў 83A:476 у пэўныя моманты часу. Аднак гэтыя DEG складалі толькі невялікую частку (0,97–1,70%) усіх DEG, выяўленых у цяперашні час з дапамогай 83A:476. Акрамя таго, 11 дыферэнцыяльных генаў (DEG) з усіх ліній былі кагерэнтнымі ў гэты час (дадатковыя табліцы S4-S6), уключаючы агульныя кампаненты ахоўных рэакцый раслін: бялок пераносу ліпідаў (TanjilG_32225), фермент эндаглюкан-1,3-β-глюказід (TanjilG_23384), два бялкі, індуцыруемыя стрэсам, такія як SAM22 (TanjilG_31528 і TanjilG_31531), асноўны латексны бялок (TanjilG_32352) і два багатыя на гліцын структурныя бялкі клеткавай сценкі (TanjilG_19701 і TanjilG_19702). Таксама назіралася адносна высокае перакрыццё ў транскрыптомных рэакцыях паміж 83A:476 і Boregine пры 24 HPI (усяго 16-38% DEG) і паміж Mandelup і папуляцыяй 22660 пры 48 HPI (усяго 14-20% DEG).
Дыяграма Вена, якая паказвае колькасць дыферэнцыяльна экспрэсаваных генаў (DEG) у лініях вузкалістых люпінаў (NLL), інакуляваных Colletotrichum lupini (штам Col-08, атрыманы з люпінавых палёў у Вежэніцы, Польшча, 1999 г.). Аналізаваныя лініі NLL былі наступнымі: 83A:476 (устойлівая, з алелем Lanr1), Boregine (устойлівая, генетычны фон невядомы), Mandelup (умерана ўстойлівая, з алелем AnMan) і папуляцыя 22660 (вельмі ўспрымальная). Скарачэнне hpi азначае колькасць гадзін пасля вакцынацыі. Нулявыя значэнні былі выдалены для спрашчэння графіка.
Набор генаў з падвышанай экспрэсіяй пры 6 hpi быў прааналізаваны на наяўнасць кананічных даменаў гена R (Дадатковая табліца S7). Гэта даследаванне паказала індукцыю транскрыптомаў класічных генаў устойлівасці да хвароб толькі з даменамі NBS-LRR у 83A:476. Гэты набор складаўся з аднаго гена TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), пяці генаў CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 і tanjilg_16162), чатырох NBS-LR (Tanjilg_16162) і чатырох NBS-LRRE (tanjilg_16162), а таксама чатырох NBS-Lrr (tanjilg_16162) і чатырох NBS-LRR (TANJILG_16162). Усе гэтыя гены маюць кананічныя дамены, размешчаныя ў кансерватыўных паслядоўнасцях. Акрамя генаў дамена NBS-LRR, пры 6 hpi былі актываваныя некалькі RLL-кіназ, а менавіта адна ў Boregine (TanjilG_19877), дзве ў Mandelup (TanjilG_07141 і TanjilG_19877) і ў папуляцыі 22660 (TanjilG_09014 і TanjilG_10361) і дзве ў 83A 27:476.
Гены са значна змененай экспрэсіяй у адказ на інакуляцыю C. lupini (штам Col-08) былі падвергнуты аналізу ўзбагачэння Gene Ontology (GO) (Дадатковая табліца S8). Найбольш часта сустракаемым тэрмінам біялагічнага працэсу быў «абарончы адказ GO:0006952», які з'явіўся ў 6 з 16 камбінацый (час × лінія) з высокай значнасцю (значэнне P < 0,001) (мал. 2). Найбольш часта сустракаемым тэрмінам біялагічнага працэсу быў «абарончы адказ GO:0006952», які з'явіўся ў 6 з 16 камбінацый (час × лінія) з высокай значнасцю (значэнне P < 0,001) (мал. 2). Найбольш часта празмерна прадстаўленым тэрмінам біялагічнага працэсу быў «GO: 0006952 абарончы адказ», які з'явіўся ў 6 з 16 (час × лінія) камбінацыі з высокай значнасцю (значэнне P <0,001) (рыс. 2). Найбольш часта сустракаемым тэрмінам біялагічнага працэсу быў «абарончы адказ GO:0006952», які з'явіўся ў 6 з 16 камбінацый (час × радавод) з высокай значнасцю (значэнне P < 0,001) (мал. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”,它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。. Найбольш рэпрэзентатыўным тэрмінам біялагічнага працэсу з'яўляецца «абарончая рэакцыя GO:0006952», які з'яўляецца ў 6 з 16 камбінацый (时间×线) з высокай значнасцю (значэнне P < 0,001) (图2). Найбольш часта празмерна прадстаўленым тэрмінам біялагічнага працэсу быў «GO: 0006952 Defense Response», які з'явіўся ў 6 з 16 камбінацый (час × лінія) з высокай значнасцю (значэнне P <0,001) (рыс. 2). Найбольш часта сустракаемым тэрмінам біялагічнага працэсу быў «GO:0006952 Defense Response», які з'явіўся ў 6 з 16 камбінацый (час × лінія) з высокай значнасцю (значэнне P < 0,001) (мал. 2).Гэты тэрмін быў залішне прадстаўлены ў двух момантах часу ў 83A: 476 і Boregine (6 і 24 hpi) і ў адзін момант часу ў Mandelup і папуляцыі 22660 (12 і 6 hpi адпаведна). Гэта чаканы вынік, які падкрэслівае супрацьгрыбковую рэакцыю рэзістэнтных ліній. Акрамя таго, 83A:476 адрэагаваў на C. lupini, хутка індукуючы гены, звязаныя з акісляльным выбухам, прадстаўленым тэрмінам «GO:0055114 redox process», што сведчыць аб спецыфічнай ахоўнай рэакцыі, у той час як Boregine праявіў спецыфічныя ахоўныя рэакцыі, звязаныя з тэрмінам «GO». :0006950 Рэакцыя на стрэсы». Папуляцыя 22660 актывавала гарызантальную рэакцыю рэзістэнтнасці, якая ўключае другасныя метабаліты, што падкрэслівае празмерную колькасць тэрмінаў «GO:0016104 Працэс біясінтэзу трытэрпенаў» і «GO:0006722 Працэс метабалізму трытэрпенаў» (абодва тэрміны належаць да аднаго набору генаў). Улічваючы вынікі аналізу ўзбагачэння тэрмінаў GO, стабільнасць рэакцыі Мандэлупа была паміж Boregine і папуляцыяй 22660. Акрамя таго, ранняя рэакцыя 83A:476 (6 hpi) і запаволеная рэакцыя Мандэлупа і папуляцыя 22660 ўключаюць тэрмін GO:0015979 «фатасінтэз» і іншыя звязаныя з ім біялагічныя працэсы.
Тэрміны геннай онталогіі біяпрацэсаў, выбраныя ў анатацыі дыферэнцыяльна экспрэсаваных генаў падчас транскрыптомных рэакцый вузкалістых люпінаў (NLL), інакуляваных люпінам з сібірскай язвай (штам Col-08, атрыманы з люпінавых палёў у Вежэніцы, Польшча, у 1999 г.), значна перабольшаныя. Аналізаваныя лініі NLL былі наступнымі: 83A:476 (рэзістэнтная, з гамазіготным алелем Lanr1), Boregine (рэзістэнтная, невядомы генетычны фон), Mandelup (умерана ўстойлівая, з гамазіготным алелем AnMan) і папуляцыя 22660 (адчувальная).
Паколькі мэтай гэтага даследавання было вызначэнне генаў, якія спрыяюць устойлівасці да антракнозу, гены, аднесеныя да тэрмінаў GO «GO: 0006952 Абарончыя рэакцыі» і «GO: 0055114 Акісляльна-аднаўленчыя працэсы», былі прааналізаваны з парогавымі значэннямі, пачынаючы з базавых значэнняў ≥ 30 з прынамсі адной лініяй. × момант часу, які аб'ядноўвае статыстычна значныя значэнні log2 (кратнае змяненне). Колькасць генаў, якія адпавядаюць гэтым крытэрыям, склала 65 для GO:0006952 і 524 для GO:0055114.
У працы 83A:476 выяўлены два пікі DEG, пазначаныя тэрмінам GO:0006952: першы — 6 генаў на цалю (64 гены, рэгуляцыя ўверх і ўніз), а другі — 24 гены на цалю (15 генаў, толькі рэгуляцыя ўверх). У працы Boregine таксама паказана, што GO:0006952 дасягаў піку ў той жа момант часу, але з меншай колькасцю DEG (11 і 8) і пераважнай актывацыяй. У працы Mandeloop выяўлены два пікі GO:0006952 на 12 і 48 HPI, абодва з якіх нясуць па 12 генаў (першы з актывуючымі генамі, а другі — толькі з супрэсіўнымі генамі), у той час як папуляцыя 22660 на 6 HPI (13 генаў) мела большую перавагу піка павелічэння рэгуляцыі. Варта адзначыць, што 96,4% DEG GO:0006952 у гэтых піках мелі аднолькавы тып рэакцыі (уверх або ўніз), што сведчыць аб значным перакрыцці абарончых рэакцый, нягледзячы на ​​адрозненні ў колькасці задзейнічаных генаў. Найбуйнейшая група паслядоўнасцей, звязаных з тэрмінам GO:0006952, кадуе бялок 22, звязаны з галаданнем і стрэсам (SAM22-like), які належыць да бялковай клады PR-10 (патагенез-асацыяваны бялок) класа 10 і да асноўнага бялку латексу. Дзве групы адрозніваліся характарам экспрэсіі і кірункам рэакцыі. Гены, якія кадуюць бялкі, падобныя на SAM22, праяўлялі паслядоўную і значную індукцыю ў раннія моманты часу (6 або 12 гадзін пасля інфікавання) і ў цэлым не рэагавалі ў канцы эксперыменту (48 гадзін пасля інфікавання), у той час як бялкі, падобныя на MLP, праяўлялі каардынацыю пры 6 гадзін пасля інфікавання (hpi 83A:476 і Mandelup пры 48 гадзін пасля інфікавання), амаль усе астатнія кропкі дадзеных не рэагавалі. Акрамя таго, адрозненні ў профілях экспрэсіі генаў бялкоў, падобных на SAM22, адпавядалі назіранай зменлівасці ўстойлівасці да антракнозу, паколькі больш устойлівыя лініі мелі больш часовых кропак, якія значна індуцыравалі гэтыя гены, чым больш адчувальныя гены. Іншы ген PR-10, падобны да LlR18A/B, прадэманстраваў вельмі падобны характар ​​экспрэсіі да гена бялку, падобнага да SAM22.
Былі вызначаны асноўныя кампаненты тэрміна біялагічнага працэсу «GO:0006952 Defense Response» і характары экспрэсіі кандыдатных генаў алеляў Lanr1 і AnMan. Шкала Log2 прадстаўляе значэнні log2 (змена ў кратнасці) паміж інакуляванымі (Colletotrichum lupini, штам Col-08, атрыманы з люпінавых палёў, Віжэніца, Польшча, 1999 г.) і кантрольнымі (фіктыўна інакуляванымі) раслінамі ў адзін і той жа момант часу. Былі прааналізаваны наступныя лініі вузкалістых люпінаў: 83A:476 (устойлівая, з гамазіготным алелем Lanr1), Boregine (устойлівая, генетычны фон невядомы), Mandelup (умерана ўстойлівая, з гамазіготным алелем AnMan) і папуляцыя 22660 (адчувальная).
Акрамя таго, былі ацэнены профілі экспрэсіі генаў-кандыдатаў РНК-секвенавання Lanr1 (TanjilG_05042) і AnMan (TanjilG_12861) (мал. 3). Ген TanjilG_05042 прадэманстраваў значны адказ (актывацыю) толькі ў 83A:476 у першы момант часу (6 hpi), у той час як TanjilG_12861 быў значным у Mandeloop толькі ў два моманты часу: 6 hpi (паніжальная рэгуляцыя) і 24 hpi (6 hpi). З.). рэгуляванай) ).
Найбольш экспрэсаванымі генамі ў тэрміне GO:0055114 «акісляльна-аднаўленчы працэс» былі гены, якія кадуюць бялкі цытахрому P450 і пераксідазу (мал. 4). Для ўзораў, выдзеленых з 83A:476 пры 6 HPI, максімальныя або мінімальныя значэнні log2 (змена ў кратнасць) (для 86,6% генаў) звычайна назіраліся паміж інакуляванымі і кантрольнымі раслінамі, што сведчыць аб высокай рэакцыі гэтага генатыпу на інакуляцыю полу. 83A:476 паказаў найбольш значны GO:0055114 DEG пры 6 hpi (503 гены), у той час як астатнія лініі пры 48 hpi (Boregine, 31 ген; Mandelup, 85 генаў; і Population 22660, 78 генаў)). У большасці генаў сямейства GO:0055114 назіраліся два тыпы рэакцый на вакцынацыю (актывацыя і інгібіраванне). Цікава, што да 97,6% дыферэнцыяльных генаў (DEG) былі ідэнтыфікаваны для тэрміна GO: 0055114 у Mandelupe пры 48 к.с. Гэтыя назіранні сведчаць аб тым, што, нягледзячы на ​​значна меншы маштаб (г.зн. колькасць мутаваных рэдокс-генаў, 85 супраць 503), карціна адкладзеных транскрыптомных рэакцый Mandelupe на антракнозу падобная да ранняй рэакцыі 83A:476. У Boregine і папуляцыі 22660 гэтая канвергенцыя ніжэйшая і складае 51,6% і 75,6% адпаведна.
Былі выяўлены заканамернасці экспрэсіі асноўных кампанентаў тэрміна біялагічнага працэсу «GO:0055114 Redox process». Шкала Log2 прадстаўляе значэнні log2 (кратнае змяненне) паміж інакуляванымі (Colletotrichum lupini, штам Col-08, атрыманы з люпінавых палёў, Віжэніца, Польшча, 1999 г.) і кантрольнымі (фіктыўна інакуляванымі) раслінамі ў адзін і той жа момант часу. Былі прааналізаваны наступныя лініі вузкалістага люпіну: 83A:476 (устойлівая, з гамазіготным алелем Lanr1), Boregine (устойлівая, генетычны фон невядомы), Mandelup (умерана ўстойлівая, з гамазіготным алелем AnMan) і папуляцыя 22660 (адчувальная).
83A:476 Транскрыптомныя рэакцыі на інакуляцыю C. lupini (штам Col-08) таксама ўключалі каардынаванае заглушэнне генаў, якія адносяцца да тэрміна GO:0015979 «фатасінтэз» і іншых звязаных з ім біялагічных працэсаў (мал. 5). Гэты набор DEG GO:0015979 утрымліваў 105 генаў, якія былі значна рэпрэсаваны пры 6-м HPI пры 83A:476. У гэтым падмностве 37 генаў таксама былі паніжаныя ў Mandelup пры 48-м HPI і 35 у той жа момант часу ў папуляцыі 22660, у тым ліку 19 DEG, агульных для абодвух генатыпаў. Ніякія DEG, звязаныя з тэрмінам GO: 0015979, не былі значна актываваны ні ў адной камбінацыі (лінія х час).
Былі выяўлены заканамернасці экспрэсіі асноўных кампанентаў тэрміна біялагічнага працэсу «GO:0015979 Фотасінтэз». Шкала Log2 прадстаўляе значэнні log2 (кратнае змяненне) паміж інакуляванымі (Colletotrichum lupini, штам Col-08, атрыманы з люпінавых палёў, Віжэніца, Польшча, 1999 г.) і кантрольнымі (фіктыўна інакуляванымі) раслінамі ў адзін і той жа момант часу. Былі прааналізаваны наступныя лініі вузкалістага люпіну: 83A:476 (устойлівая, з гамазіготным алелем Lanr1), Boregine (устойлівая, генетычны фон невядомы), Mandelup (умерана ўстойлівая, з гамазіготным алелем AnMan) і папуляцыя 22660 (адчувальная).
Зыходзячы з вынікаў дыферэнцыяльнага аналізу экспрэсіі і, як мяркуецца, удзельнічаючы ў ахоўных рэакцыях супраць патагенных грыбоў, гэты набор з сямі генаў быў абраны для колькаснай ацэнкі профіляў экспрэсіі з дапамогай ПЦР у рэжыме рэальнага часу (Дадатковая табліца S9).
Меркаваны ген бялку TanjilG_10657 быў значна індукаваны ва ўсіх даследаваных лініях і часовых кропках у параўнанні з кантрольнымі (імітацыямі) раслінамі (дадатковыя табліцы S10, S11). Акрамя таго, профіль экспрэсіі TanjilG_10657 прадэманстраваў тэндэнцыю да павелічэння на працягу эксперыменту для ўсіх ліній. Папуляцыя 22660 прадэманстравала найвышэйшую адчувальнасць TanjilG_10657 да інакуляцыі з 114-кратнай актывацыяй і найвышэйшым адносным узроўнем экспрэсіі (4,4 ± 0,4) пры 24 HPI (мал. 6a). Ген бялку PR10 LlR18A TanjilG_27015 таксама прадэманстраваў актывацыю ва ўсіх лініях і часовых кропках са статыстычнай значнасцю ў большасці кропак дадзеных (мал. 6b). Падобна TanjilG_10657, найвышэйшы адносны ўзровень экспрэсіі TanjilG_27015 назіраўся ў інакуляванай папуляцыі 22660 пры 24 HPI (19,5 ± 2,4). Ген кіслотнай эндахітыназы TanjilG_04706 быў значна павышаны ва ўсіх лініях і ва ўсе часовыя кропкі, акрамя Boregine 6 hpi (мал. 6c). Ён быў моцна індукаваны ў першую часовую кропку (6 HPI) пры 83A:476 (у 10,5 раза) і ўмерана павялічаны ў іншых лініях (у 6,6-7,5 раза). Падчас эксперыменту экспрэсія TanjilG_04706 заставалася на падобным узроўні ў 83A:476 і Boregine, у той час як у Mandelup і папуляцыі 22660 яна значна павялічылася, дасягнуўшы адносна высокіх значэнняў (5,9 ± 1,5 і 6,2 ± 1,5 адпаведна). Ген эндаглюкан-1,3-β-глюказідаза-падобны TanjilG_23384 прадэманстраваў высокую актывацыю ў першыя дзве часовыя кропкі (6 і 12 hpi) ва ўсіх лініях, акрамя папуляцыі 22660 (мал. 6d). Найвышэйшыя адносныя ўзроўні экспрэсіі TanjilG_23384 назіраліся ў другі момант часу (12 HPI) у Mandelup (2,7 ± 0,3) і 83A:476 (1,5 ± 0,1). Пры 24 HPI экспрэсія TanjilG_23384 была адносна нізкай ва ўсіх даследаваных лініях (ад 0,04 ± 0,009 да 0,44 ± 0,12).
Профілі экспрэсіі выбраных генаў (ag), выяўленыя з дапамогай колькаснай ПЦР. Лічбы 6, 12 і 24 азначаюць гадзіны пасля вакцынацыі. Гены LanDExH7 і LanTUB6 выкарыстоўваліся для нармалізацыі, а LanTUB6 — для міжсерыйнай каліброўкі. Палоскі памылак прадстаўляюць стандартнае адхіленне на аснове трох біялагічных паўтораў, кожны з якіх з'яўляецца сярэднім значэннем трох тэхнічных паўтораў. Статыстычная значнасць адрозненняў ва ўзроўнях экспрэсіі паміж інакуляванымі (Colletotrichum lupini, штам Col-08, атрыманы ў 1999 г. з люпінавага поля ў Вежэніцы, Польшча) і кантрольнымі (фіктыўна інакуляванымі) раслінамі пазначана вышэй у кропках дадзеных (*значэнне P < 0,05, **значэнне P ≤ 0,01, ***значэнне P ≤ 0,001). Статыстычная значнасць адрозненняў ва ўзроўнях экспрэсіі паміж інакуляванымі (Colletotrichum lupini, штам Col-08, атрыманы ў 1999 г. з люпінавага поля ў Вежэніцы, Польшча) і кантрольнымі (фіктыўна інакуляванымі) раслінамі пазначана вышэй у кропках дадзеных (*значэнне P < 0,05, **значэнне P ≤ 0,01, ***значэнне P ≤ 0,001). Статыстычная значнасць адрозненняў ва ўзроўні экспрэсій паміж інакуліраванымі (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, атрыманы ў 1999 г. з поля люпіна ў Вержэніцэ, Польшча) і кантрольнымі (ложна інакуліраванымі) раслінамі, адзначанымі над кропкамі дадзеных (*значэнне P < 0,05, **значэнне P ≤ 0,01, ***значэнне P ≤ 0,001). Статыстычна значныя адрозненні ў ўзроўнях экспрэсіі паміж інакуляванымі (Colletotrichum lupini, штам Col-08, атрыманы ў 1999 г. з люпінавага поля ў Вежэніцы, Польшча) і кантрольнымі (фіктыўна інакуляванымі) раслінамі адзначаны над кропкамі дадзеных (*P-значэнне < 0,05, **P-значэнне ≤ 0,01, ***P-значэнне ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini, Col-08株, 1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Статыстычна значныя адрозненні ва ўзроўні экспрэсіі паміж інакуліраванымі (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, атрыманы з поля люпіна ў Вержэніцэ, Польшча, у 1999 г.) і кантрольнымі (ложна інакуліраванымі) раслінамі, адзначанымі над кропкамі дадзеных (* значэнне P < 0,05, ** P-значэнне ≤ 0,01, ***P-значэнне ≤ 0,001). Статыстычна значныя адрозненні ў ўзроўнях экспрэсіі паміж інакуляванымі (Colletotrichum lupini, штам Col-08, атрыманы з люпінавых палёў у Вержэніцы, Польшча, у 1999 г.) і кантрольнымі (фіктыўна інакуляванымі) раслінамі адзначаны над кропкамі дадзеных (*P-значэнне < 0,05, **P-значэнне ≤ 0,01, ***P-значэнне ≤ 0,001).Аналізаваныя лініі NLL былі наступнымі: 83A:476 (рэзістэнтная, з гамазіготным алелем Lanr1), Mandelup (умерана ўстойлівая, з гамазіготным алелем AnMan), Boregine (рэзістэнтная, генетычны фон невядомы) і папуляцыя 22660 (адчувальная).
Ген-кандыдат TanjilG_05042 у локусе Lanr1 прадэманстраваў значна адрозны характар ​​экспрэсіі ў параўнанні з профілямі, атрыманымі з даследаванняў РНК-секвенавання (мал. 6e). Значная актывацыя гэтага гена назіралася ў папуляцыі Mandelup і 22660 (да 39,7 і 11,7 разоў адпаведна), што прывяло да адносна высокіх узроўняў экспрэсіі (да 1,4 ± 0,14 і 7,2 ± 1,3 адпаведна). 83A:476 таксама выявіў некаторае павышэнне рэгуляцыі гена TanjilG_05042 (да 3,8 разоў), аднак дасягнутыя адносныя ўзроўні экспрэсіі (0,044 ± 0,002) былі больш чым у 30 разоў ніжэйшымі за тыя, што назіраліся ў Mandelup і папуляцыі 22660. Аналіз з дапамогай ПЛР паказаў значныя адрозненні ў ўзроўнях экспрэсіі паміж генатыпамі ў кантрольных (плацежаздольных) варыянтах, дасягнуўшы 58-кратнай розніцы паміж папуляцыямі 22660 і 83A:476, а таксама паміж папуляцыямі 22660 і 22660. Двухразовая розніца была дасягнута паміж Boregine і Mandalup.
Ген-кандыдат у локусе AnMan, TanjilG_12861, быў актываваны ў адказ на вакцынацыю ў 83A:476 і Mandelup, быў нейтральным у папуляцыі 22660 і быў паніжаны ў Boregine (мал. 6f). Адносная экспрэсія гена TanjilG_12861 была найвышэйшай у інакуляваным 83A:476 (0,14±0,01). Ген бялку цеплавога шоку класа I TanjilG_05080 HSP17.4 з масай 17,4 кДа паказаў больш нізкія адносныя ўзроўні экспрэсіі ва ўсіх даследаваных штамах і ў любыя моманты часу (мал. 6g). Найвышэйшае значэнне назіралася пры 24 HPI ў папуляцыі 22660 (0,14±0,02, васьмікратнае павелічэнне ў адказ на вакцынацыю).
Параўнанне профіляў экспрэсіі генаў (мал. 7) выявіла высокую карэляцыю паміж TanjilG_10657 і чатырма іншымі генамі: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) і TanjilG_04706 (r = 0,79). Такія вынікі могуць сведчыць аб сумеснай рэгуляцыі гэтых генаў падчас абарончых рэакцый. Гены TanjilG_12861 і TanjilG_23384 прадэманстравалі розныя профілі экспрэсіі з больш нізкімі значэннямі каэфіцыента карэляцыі Пірсана (ад 0,08 да 0,43 і ад -0,19 да 0,28 адпаведна) у параўнанні з іншымі генамі.
Карэляцыі паміж профілямі экспрэсіі генаў былі выяўлены з дапамогай колькаснай ПЦР. Былі прааналізаваны наступныя лініі люпіну вузкалістых: 83A:476 (устойлівая, з гамазіготным алелем Lanr1), Mandelup (умерана ўстойлівая, з гамазіготным алелем AnMan), Boregine (устойлівая, генетычны фон невядомы) і папуляцыя 22660 (адчувальная). Былі разлічаны тры часовыя кропкі (6, 12 і 24 гадзіны пасля інакуляцыі), уключаючы інакуляваныя (Colletotrichum lupini, штам Col-08, атрыманы з люпінавых палёў у Вежэніцы, Польшча, у 1999 г.) і кантрольныя (фіктыўна інакуляваныя) расліны. Шкала паказвае значэнне каэфіцыента карэляцыі Пірсана.
На падставе дадзеных, атрыманых пры магутнасці 6 конскіх сіл на цалю, быў праведзены WGCNA на 9981 DEG, ідэнтыфікаваных шляхам параўнання інакуляваных і кантрольных раслін, каб засяродзіцца на ранніх ахоўных рэакцыях (Дадатковая табліца S12). Былі выяўлены дваццаць два генныя модулі (кластары) з карэляванымі (станоўчымі або адмоўнымі) профілямі экспрэсіі паміж генатыпамі і эксперыментальнымі варыянтамі. У сярэднім, узроўні экспрэсіі генаў змяншаліся ў парадку 83A:476 > Mandelup > Boregine > Папуляцыя 22660 (аднак у абодвух варыянтах гэтая тэндэнцыя была мацнейшай у кантрольных раслін). У сярэднім, узроўні экспрэсіі генаў змяншаліся ў парадку 83A:476 > Mandelup > Boregine > Папуляцыя 22660 (аднак у абодвух варыянтах гэтая тэндэнцыя была мацнейшай у кантрольных раслін). У сярэднім узроўні экспрэсіі генаў зніжаліся ў парадку 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (у абодвух варыянтах, аднак, гэтая тэндэнцыя была большай у кантрольных расценняў). У сярэднім, узровень экспрэсіі генаў зніжаўся ў парадку 83A:476 > Mandelup > Boregine > Папуляцыя 22660 (аднак у абодвух варыянтах гэтая тэндэнцыя была мацнейшай у кантрольных раслін).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Насельніцтва 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> насельніцтва 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种在 在 植物 中 更). У сярэднім узроўні экспрэсіі генаў зніжаліся ў шэрагу 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (аднак у абодвух варыянтах гэтая тэндэнцыя была большай у кантрольных расценняў). У сярэднім узровень экспрэсіі генаў знізіўся ў серыі 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (аднак у абодвух варыянтах гэтая тэндэнцыя была мацнейшай у кантрольных раслін).Вакцынацыя прывяла да павышэння экспрэсіі генаў, асабліва ў модулях 18, 19, 14, 6 і 1 (у парадку змяншэння эфекту), адмоўнай рэгуляцыі (напрыклад, модулі 9 і 20) або нейтральных эфектаў (напрыклад, модулі 11, 22, 8 і 13). Аналіз узбагачэння GO-тэрмінаў (Дадатковая табліца S13) выявіў «GO: 0006952 Protective Responses» для інакуляванага модуля (18) з максімальнай актывацыяй, уключаючы гены, прааналізаваныя з дапамогай кПЛР (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 і TanjilG_27015), а таксама многія модулі фотасінтэзу, найбольш падаўленыя інакуляванымі прэпаратамі (9). Канцэнтратар модуля 18 (мал. 8) быў ідэнтыфікаваны як ген TanjilG_26536, які кадуе бялок PR-10-падобны на LlR18B, а канцэнтратар модуля 9 быў ідэнтыфікаваны як ген TanjilG_28955, які кадуе бялок фотасістэмы II PsbQ. Ген-кандыдат устойлівасці да антракнозу Lanr1, TanjilG_05042, быў знойдзены ў модулі 22 (мал. 9) і звязаны з тэрмінамі «GO:0044260 Клетачныя макрамалекулярныя метабалічныя працэсы» і «GO:0006355 Рэгуляцыя транскрыпцыі, шаблоны ДНК», якія нясуць хаб TanjilG_01212. Ген кадуе транскрыпцыйны фактар ​​цеплавога стрэсу A-4a (HSFA4a).
Узважаны сеткавы аналіз сумеснай экспрэсіі генаў модуляў з празмерна прадстаўленымі тэрмінамі біялагічных працэсаў «GO: 0006952 Defense responses». Лігаванне было спрашчана, каб вылучыць чатыры гены, прааналізаваныя з дапамогай кПЛР (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 і TanjilG_27015).
Вагавы сеткавы аналіз сумеснай экспрэсіі генаў модуля з празмерна прадстаўленым тэрмінам біялагічнага працэсу «GO: 0006355: Рэгуляцыя транскрыпцыі, шаблоны ДНК» і які нясе кандыдатны ген рэзістэнтнасці да антракнозу Lanr1 TanjilG_05042. Лігаванне было спрашчана для вылучэння гена TanjilG_05042 і цэнтральнага гена TanjilG_01212.
Скрынінг на ўстойлівасць да антракнозу, сабраны ў Аўстраліі, паказаў, што большасць ранніх выпушчаных гатункаў былі ўспрымальнымі; Kalya, Coromup і Mandelup былі апісаны як умерана ўстойлівыя, у той час як Wonga, Tanjil і 83A:476 былі апісаны як высокаўстойлівыя26,27,31. мелі адзін і той жа алель устойлівасці, які пазначаўся Lanr1, а Coromup і Mandelup мелі іншы алель, які пазначаўся AnMan10,26,39, у той час як Kalya перадала іншы алель, Lanr2. Скрынінг на ўстойлівасць да антракнозу ў Германіі прывёў да ідэнтыфікацыі ўстойлівай лініі Bo7212 з кандыдатным алелем, адрозным ад Lanr1, які пазначаўся LanrBo36.
Наша даследаванне выявіла вельмі нізкую частату (каля 6%) алеля Lanr1 у праверанай зародкавай плазме. Гэта назіранне адпавядае вынікам скрынінга ўсходнееўрапейскай зародкавай плазмы з выкарыстаннем маркераў Anseq3 і Anseq4, якія паказалі, што алель Lanr1 прысутнічае толькі ў дзвюх беларускіх лініях. Гэта сведчыць аб тым, што алель Lanr1 пакуль не шырока выкарыстоўваецца мясцовымі селекцыйнымі праграмамі, у адрозненне ад Аўстраліі, дзе ён з'яўляецца адным з ключавых алеляў для маркер-асіставанай селекцыі. Гэта можа быць звязана з больш нізкім узроўнем устойлівасці, які забяспечвае алель Lanr1 у еўрапейскіх палявых умовах у параўнанні з аўстралійскім дакладам. Акрамя таго, даследаванні антракнозу ў раёнах з вялікай колькасцю ападкаў у Аўстраліі паказалі, што рэакцыі рэзістэнтнасці, апасродкаваныя алелем Lanr1, могуць быць неэфектыўнымі ва ўмовах надвор'я, якія спрыяюць росту і хуткаму развіццю патагена19,42. Фактычна, у дадзеным даследаванні некаторыя сімптомы антракнозу таксама назіраліся ў генатыпаў, якія нясуць алель Lanr1, што сведчыць аб тым, што рэзістэнтнасць можа знікнуць пры аптымальных умовах для развіцця C. lupini. Акрамя таго, магчымыя ілжывапазітыўныя інтэрпрэтацыі наяўнасці маркераў Anseq3 і Anseq4, якія знаходзяцца прыблізна на адлегласці 1 сМ ад локуса Lanr1 [28,30,43].
Наша даследаванне паказала, што 83A:476, які нясе алель Lanr1, адрэагаваў на інакуляцыю C. lupini маштабным перапраграмаваннем транскрыптома ў першы аналізаваны момант часу (6 хвілін пасля інфікавання), у той час як у Mandelup, які нясе алель AnMan, транскрыптомныя адказы назіраліся значна пазней (ад 24 да 48 хвілін пасля інфікавання). Гэтыя часовыя варыяцыі ахоўных рэакцый звязаны з адрозненнямі ў сімптомах хваробы, што падкрэслівае важнасць ранняга распазнавання патагена для паспяховага адказу на рэзістэнтнасць. Каб заразіць раслінную тканіну, споры сібірскай язвы павінны прайсці некалькі стадый развіцця на паверхні гаспадара, уключаючы прарастанне, дзяленне клетак і ўтварэнне апрэсорыума. Прыдатак - гэта інфекцыйная структура, якая прымацоўваецца да паверхні гаспадара і спрыяе пранікненню ў тканіны гаспадара. Такім чынам, споры C. gloeosporioides у экстракце гароху прадэманстравалі першае дзяленне ядра праз 75-90 хвілін інкубацыі, утварэнне зародкавай трубкі праз 90-120 хвілін і падаўленне праз 4 гадзіны 45. Мангавая C. gloeosporioides прадэманстравала больш за 40% прарастання конідый пасля 3 гадзін інкубацыі і каля 20% утварэння апрэсараў праз 4 гадзіны. Ген CAP20, звязаны з вірулентнасцю CAP20 C. gloeosporioides, прадэманстраваў транскрыпцыйную актыўнасць у конідыях, якія ўтвараюць эпіфіты, пасля 3,5 гадзін інкубацыі ў паверхневым воску авакада з высокімі канцэнтрацыямі бялку CAP20 праз 4 гадзіны 46 хвілін. Падобным чынам, актыўнасць генаў біясінтэзу меланіну ў C. trifolii была індукавана падчас 2-гадзіннай інкубацыі з наступным утварэннем апрэсорыума праз 1 гадзіну. Даследаванні тканін лісця паказалі, што клубніцы, інакуляваныя C. acutatum, маюць першае падаўленне праз 8 гадзін пасля інфікавання, у той час як памідоры, інакуляваныя C. coccodes, маюць першае падаўленне праз 4 гадзіны пасля інфікавання48,49. Гэта ў значнай ступені адпавядае часовай шкале інфекцыйнага працэсу, выкліканага Colletotrichum spp. Хуткія ахоўныя рэакцыі на 83A:476 сведчаць аб удзеле ў гэтай лініі генаў рэзістэнтнасці раслін і эфектар-трыгераванага імунітэту (ETI), у той час як адкладзеныя рэакцыі Мандэлупа пацвярджаюць гіпотэзу мікраасацыяванага малекулярнага імунітэту, трыгераванага па структуры (MTI) 50. Раннія рэакцыі на 83A: 476 і Мандэлупа. Частковае перакрыццё паміж генамі з павышанай або паніжанай рэгуляцыяй у адкладзенай рэакцыі таксама пацвярджае гэтую канцэпцыю, паколькі ETI часта лічыцца паскоранай і ўзмоцненай рэакцыяй MTI, якая завяршаецца праграмаванай гібеллю клетак у месцы інфекцыі, вядомай як анафілактычны шок 51,52.
Большасць генаў, якія адносяцца да празмерна прадстаўленага тэрміна Gene Ontology GO:0006952 «Абарончая рэакцыя», — гэта 11 гамолагаў бялку SAM22, выкліканага стрэсам (падобнага да SAM22), і сем асноўных падобных да латексных бялкоў (MLP) бялкоў 31, 34, 43 і 423, якія паказалі падабенства паслядоўнасці. Гены, падобныя да SAM22, прадэманстравалі значную актывацыю, якая працягвалася даўжэй, паказваючы павышаны ўзровень устойлівасці да антракнозу (83A:476 і Boregine). Аднак гены, падобныя да MLP, былі паніжаны толькі ў лініях, якія нясуць алель-кандыдат устойлівасці (83A:476/Lanr1 пры 6 hpi і Mandelup/AnMan пры 24 hpi). Варта адзначыць, што ўсе ідэнтыфікаваныя гамолагі, падобныя да SAM22, паходзяць з геннага кластара памерам прыблізна 105 kb, у той час як гены, падобныя да MLP, паходзяць з асобных абласцей геному. Каардынаваная актывацыя такіх SAM22-падобных генаў была таксама выяўлена ў нашым папярэднім даследаванні ўстойлівасці NLL да інакуляцыі Diaporthetoxica, што сведчыць аб іх удзеле ў гарызантальных кампанентах ахоўнай рэакцыі. Гэтая выснова таксама пацвярджаецца паведамленнямі аб станоўчай рэакцыі SAM22-падобных генаў на пашкоджанне або лячэнне саліцылавай кіслатой, грыбковымі індуктарамі або перакісам вадароду.
Было паказана, што MLP-падобныя гены рэагуюць на розныя абіятычныя і біятычныя стрэсы, у тым ліку бактэрыяльныя, вірусныя і патагенныя грыбковыя інфекцыі ў многіх відах раслін55. Кірункі рэакцыі на пэўныя ўзаемадзеянні паміж раслінамі і патагенамі вар'іраваліся ад моцнага павелічэння (г.зн. падчас заражэння бавоўны Verticillium dahliae) да значнага зніжэння (г.зн. пасля заражэння яблыні Alternaria spp.)56,57. Значнае паніжэнне рэгуляцыі MLP-падобнага гена 423 назіралася падчас абароны авакада ад інфекцыі F. niger і падчас заражэння яблыні Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola і Alternaria alternata з'яўляюцца пататыпамі яблыні58,59. Акрамя таго, калюсы яблыні з падвышанай экспрэсіяй MLP-падобнага гена 423 мелі ніжэйшую экспрэсію генаў, звязаных з рэзістэнтнасцю, і былі больш успрымальныя да грыбковай інфекцыі59. Пасля Fusarium oxysporum f, MLP-падобны ген 423 таксама быў падаўлены ў рэзістэнтнай зародкавай плазме звычайнай фасолі. cn. Інфекцыя фасолі 60.
Іншымі членамі сямейства PR-10, выяўленымі ў нашым даследаванні РНК-секвенавання, былі гены LlR18A і LlR18B у адказ на павышэнне рэгуляцыі, а таксама ген бялку пераносу ліпідаў DIR1 з павышанай (1 ген) або паніжанай рэгуляцыяй (3 гены). Акрамя таго, WGCNA вылучае ген LlR18B як цэнтр у гэтым модулі, які вельмі адчувальны да вакцынацыі і нясе некалькі генаў ахоўнага адказу. Гены LlR18A і LlR18B былі індукаваны ў лісці жоўтага люпіну ў адказ на патагенныя бактэрыі, а таксама ў сцеблах NLL пасля інакуляцыі D. toxica, у той час як рысавы гомолог гэтых генаў, RSOsPR10, быў хутка індукаваны грыбковай інфекцыяй, верагодна, якая ўдзельнічае ў сігнальным шляху жасманавай кіслаты53,61,62. Ген DIR1 кадуе неспецыфічныя бялкі транспарту ліпідаў, якія неабходныя для ўзнікнення сістэмнай набытай рэзістэнтнасці (SAR). Па меры развіцця ахоўных рэакцый бялок DIR1 транспартуецца з ачага інфекцыі праз флаэму, каб выклікаць SAR у аддаленых органах. Цікава, што ген DIR1 TanjilG_02313 быў значна індукаваны ў першы момант часу ў лініях 84A:476 і папуляцыі 22660, але ўстойлівасць да антракнозу паспяхова развілася толькі ў лініі 84A:476. Гэта можа сведчыць аб некаторай субфункцыяналізацыі гена DIR1 пры NLL, паколькі астатнія тры гомолагі адрэагавалі на інакуляцыю толькі ў лініі 83A:476 пры 6 hpi, і гэтая рэакцыя была накіравана ўніз.
У нашым даследаванні найбольш распаўсюджанымі кампанентамі, якія адпавядаюць біялагічнаму працэсу пад назвай «GO:0055114 Redox process», былі бялок цытахрому P450, пераксідаза, 9S-/13S-ліпаксігеназа лінолевая кіслата і аксідаза 1-амінацыклапрапан-1-карбанільнай кіслаты. Акрамя таго, наша WGCNA вызначае гомолаг HSFA4a як цэнтр, які нясе модулі, такія як кандыдат гена рэзістэнтнасці Lanr1 TanjilG_05042. HSFA4a з'яўляецца кампанентам акісляльна-аднаўленчай рэгуляцыі ядзернай транскрыпцыі ў раслін.
Бялкі цытахрому P450 — гэта аксідарэдуктазы, якія каталізуюць рэакцыі гідраксілявання, залежныя ад NADPH і/або O2, у першасным і другасным метабалізме, у тым ліку ў метабалізме ксенабіётыкаў, а таксама гармонаў, тоўстых кіслот, стэролаў, кампанентаў клеткавай сценкі, біяпалімераў і біясінтэзе ахоўных злучэнняў 69. У нашым даследаванні зменлівасць функцыі цытахрому P450 у раслін знізілася з -10,6 log2 (змена ў кратнасці) да 5,7 з-за вялікай колькасці змененых гамолагаў (37) і адрозненняў у характарах рэакцыі паміж канкрэтнымі генамі, што адлюстроўвае перагляд у бок павышэння. Выкарыстанне толькі дадзеных РНК-секвенавання для высвятлення меркаванай біялагічнай функцыі генаў NLL у такой вялікай надсямействе бялкоў было б вельмі спекулятыўным. Аднак варта адзначыць, што некаторыя гены цытахрому P450 звязаны з падвышанай устойлівасцю да патагенных грыбоў або бактэрый, у тым ліку ўносяць свой уклад у алергічныя рэакцыі 69,70,71.
Пераксідазы III класа — гэта шматфункцыянальныя раслінныя ферменты, якія ўдзельнічаюць у шырокім дыяпазоне метабалічных працэсаў падчас росту і развіцця раслін, а таксама ў рэакцыі на стрэсавыя фактары навакольнага асяроддзя, такія як засоленасць, засуха, высокая інтэнсіўнасць асвятлення і атака патагенаў72. Пераксідазы ўдзельнічаюць ва ўзаемадзеянні некалькіх відаў раслін з сібірскай язвай (Anthracis), у тым ліку Stylosanthes humilis і C. gloeosporioides, Lens culinaris і C. truncatum, Phaseolus vulgaris і C. lindemuthianum, Cucumis sativus і C. lagenarium73,74,75,76. Рэакцыя вельмі хуткая, часам нават пры 4 HPI, да таго, як грыбок пранікае ў раслінную тканіну73. Ген пераксідазы таксама адрэагаваў на інакуляцыю D. toxica NLL. Акрамя сваіх тыповых функцый рэгулявання акісляльнага выбуху або ліквідацыі акісляльнага стрэсу, пераксідазы могуць перашкаджаць росту патагенаў, ствараючы фізічныя бар'еры, заснаваныя на ўмацаванні клеткавай сценкі падчас лігніфікацыі, субадзінак або зшывання пэўных злучэнняў. Гэтую функцыю можна in silico аднесці да гена TanjilG_03329, які кадуе меркаваную лігнін-ўтваральную аніён-пераксідазу, узровень якой у нашым даследаванні быў значна павышаны ў рэзістэнтнай лініі 83A:476 пры 6 HPI, але не ў іншых штамах і ў пэўныя моманты часу, якія не адрэагавалі.
9S-/13S-ліпаксігеназа лінолевая кіслаты з'яўляецца першым этапам акісляльнага шляху біясінтэзу ліпідаў78. Прадукты гэтага шляху выконваюць мноства функцый у абароне раслін, у тым ліку ўмацоўваюць клеткавую сценку праз утварэнне адкладаў калозы і пекціну, а таксама рэгуляваюць акісляльны стрэс праз выпрацоўку актыўных формаў кіслароду79,80,81,82,83. У дадзеным даследаванні экспрэсія 9S-/13S-ліпаксігеназы лінолевая кіслаты была змененая ва ўсіх штамах, але ў успрымальнай папуляцыі 22660 пераважала павышэнне экспрэсіі ў розныя моманты часу, у той час як у штамах, якія нясуць рэзістэнтны Lanr1 і алель AnMan, гэта падкрэслівае дыверсіфікацыю аксіліпінавага пласта ў ахоўных рэакцыях сібірскай язвы паміж гэтымі генатыпамі.
Гамолаг 1-амінацыклапрапан-1-карбаксілатаксідазы (ACO) пры інакуляцыі люпінам значна павышаўся (9 генаў) або паніжаўся (2 гены). За двума выключэннямі, усе гэтыя рэакцыі адбываліся пры 6 hp у 83A:476. Ферментатыўная рэакцыя, апасродкаваная бялкамі ACO, з'яўляецца этапам, які лімітуе хуткасць вытворчасці этылену, і таму з'яўляецца высокарэгуляванай84. Этылен - гэта раслінны гармон, які адыгрывае розныя ролі ў рэгуляцыі развіцця раслін і рэакцыі на абіятычныя і біятычныя стрэсавыя ўмовы. Індукцыя транскрыпцыі ACO і актывацыя сігнальнага шляху этылену ўдзельнічаюць у павышэнні ўстойлівасці рысу да гемібіятрофнага грыба oryzae oryzae шляхам рэгулявання вытворчасці актыўных формаў кіслароду і фітаалексінаў. Вельмі падобны працэс інфекцыі лісця, выяўлены ў M. oryzae і C. lupini88,89, на фоне значнага павышэння рэгуляцыі гомолагаў ACO ў лініі 83A:476, пра што паведамляецца ў гэтым даследаванні, змяняе магчымасць надання ўстойлівасці да этылену антракнозы NLL як цэнтральнага сігнальнага этапу ў малекулярных шляхах.
У дадзеным даследаванні назіралася маштабнае падаўленне многіх генаў, звязаных з фотасінтэзам, пры 6-м HPI ў папуляцыі 83A:476 і пры 48-м HPI ў папуляцыі Мандэлуп і 22660. Ступень і прагрэсаванне гэтых змен прапарцыйныя ўзроўню. У гэтым эксперыменце назіралася ўстойлівасць да антракнозу. Нядаўна ў некалькіх мадэлях узаемадзеяння раслін з патагенамі, у тым ліку патагеннымі бактэрыямі і грыбамі, паведамлялася пра моцнае і ранняе падаўленне транскрыптаў, звязаных з фотасінтэзам. Паспешлівасць (ад 2 HPI ў некаторых узаемадзеяннях) і глабальнае падаўленне генаў, звязаных з фотасінтэзам, у адказ на інфекцыю могуць выклікаць імунітэт раслін, заснаваны на разгортванні актыўных формаў кіслароду і іх узаемадзеянні са шляхам саліцылавай кіслаты для апасродкавання алергічных рэакцый 90,94.
У заключэнне, механізмы ахоўнай рэакцыі, прапанаваныя для найбольш устойлівай лініі (83A:476), уключаюць хуткае распазнаванне патагена генам R (верагодна, TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) і сігналізацыю саліцылавай кіслаты і этылену, апасродкаваную алергічнай рэакцыяй, з наступным усталяваннем доўгатэрміновага SAR. Дзеянне падтрымліваецца бялком DIR-1. Варта адзначыць, што біятрофны перыяд для інфекцыі C. lupini вельмі кароткі (прыблізна 2 дні), пасля чаго адбываецца некратычны рост95. Пераход паміж гэтымі стадыямі можа быць звязаны з некрозам і экспрэсіяй этылен-індуцыруемых бялкоў, якія дзейнічаюць як трыгеры для рэакцый гіперчувствітельносці ў раслін-гаспадароў. Такім чынам, часовае акно для паспяховага захопу C. lupini на біятрофнай стадыі вельмі вузкае. Перапраграмаванне генаў, звязаных з акісляльна-аднаўленчымі працэсамі і фотасінтэзам, якое назіраецца ў 83A:476 пры 6 hpi, адпавядае прагрэсаванню грыбковых гіф і прадвесціць развіццё паспяховай ахоўнай рэакцыі на біятрофнай стадыі. Транскрыптомныя рэакцыі Mandelup і папуляцыі 22660 могуць быць занадта запозненымі, каб захапіць грыбок да пераключэння да некратычнага росту, аднак Mandelup можа быць больш эфектыўным, чым папуляцыя 22660, паколькі адносна хуткая рэгуляцыя бялку PR-10 спрыяе гарызантальнай рэзістэнтнасці.
ЭТІ, выкліканы кананічным генам R, відаць, з'яўляецца распаўсюджаным механізмам устойлівасці фасолі да антракнозу. Такім чынам, у мадэльнай бабовай расліны Medicago truncatula ўстойлівасць да антракнозу забяспечваецца генам RCT1, які ўваходзіць у клас генаў R расліны TIR-NBS-LRR97. Гэты ген таксама забяспечвае шырокаспектральную ўстойлівасць да антракнозу ў люцэрны пры пераносе на ўспрымальныя расліны. У звычайнай фасолі (P. vulgaris) на сённяшні дзень выяўлена больш за два дзясяткі генаў устойлівасці да антракнозу. Некаторыя з гэтых генаў знаходзяцца ў рэгіёнах, дзе адсутнічаюць якія-небудзь кананічныя гены R, аднак многія іншыя размешчаны на краях храмасом, якія нясуць кластар генаў NBS-LRR, у тым ліку TIR-NBS-LRRs99. Даследаванне SSR па ўсім геноме таксама пацвердзіла сувязь гена NBS-LRR з устойлівасцю да антракнозу ў звычайнай фасолі. Кананічны ген R быў таксама знойдзены ў геномным рэгіёне, які нясе асноўны локус устойлівасці да антракнозу ў белага люпіну 101.
Наша праца паказвае, што рэакцыя неадкладнай рэзістэнтнасці, актываваная на ранняй стадыі інфекцыі раслін (пажадана не пазней за 12 гадзін пасля нараджэння), эфектыўна абараняе вузкалісты люпін ад антракнозу, выкліканага патагенным грыбком Collelotrichum lupini. Выкарыстоўваючы высокапрапускное секвенаванне, мы прадэманстравалі дыферэнцыяльныя профілі экспрэсіі генаў рэзістэнтнасці да антракнозу ў раслінах NLL, апасродкаваных генамі рэзістэнтнасці Lanr1 і AnMan. Паспяховая абарона прадугледжвае стараннае праектаванне генаў бялкоў, якія ўдзельнічаюць у акісляльна-аднаўленчых працэсах, фотасінтэзе і патагенезе, на працягу некалькіх гадзін пасля першага кантакту расліны з патагенам. Падобныя ахоўныя рэакцыі, але адкладзеныя ў часе, значна менш эфектыўныя ў абароне раслін ад хвароб. Рэзістэнтнасць да сібірскай язвы, апасродкаваная генам Lanr1, нагадвае тыповы хуткі адказ гена R (імунітэт, выкліканы эфектарам), у той час як ген AnMan, хутчэй за ўсё, забяспечвае гарызантальны адказ (імунітэт, выкліканы малекулярным патэрнам, звязаным з мікробам), забяспечваючы ўмераны ўзровень устойлівасці.
215 ліній NLL, якія выкарыстоўваліся для скрынінгу на наяўнасць маркераў антракнозу, складаліся з 74 гатункаў, 60 ліній, атрыманых шляхам скрыжавання або селекцыі, 5 мутантаў і 76 дзікіх або зыходных зародкавых плазм. Лініі паходзілі з 17 краін, галоўным чынам з Польшчы (58), Іспаніі (47), Германіі (27), Аўстраліі (26), Расіі (19), Беларусі (7), Італіі (5) і іншых ліній з 10 краін. Набор таксама ўключае эталонныя ўстойлівыя лініі: 83A:476, Tanjil, Wonga з алелем Lanr1 і Mandelup з алелем AnMan. Лініі былі атрыманы з Еўрапейскай базы дадзеных генетычных рэсурсаў люпіну, якая падтрымліваецца Poznań Plant Breeding Ltd., Вятрова, Польшча (Дадатковая табліца S1).
Расліны вырошчвалі ў кантраляваных умовах (фотаперыяд 16 гадзін, тэмпература 25°C днём і 18°C ​​ноччу). Былі прааналізаваны дзве біялагічныя паўторы. ДНК была выдзелена з трохтыднёвага лісця з выкарыстаннем набору DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Хільдэн, Германія) згодна з пратаколам. Якасць і канцэнтрацыя выдзеленай ДНК ацэньваліся спектрафатаметрычнымі метадамі (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Уолтэм, Масачусэтс, ЗША). Былі прааналізаваны маркер AnManM1, які маркіруе ген устойлівасці да антракнозу AnMan (атрыманы ад гатунку Mandelup), і маркеры Anseq3 і Anseq4, якія фланкіруюць ген Lanr1 (атрыманы ад гатунку Tanjil) 11,26,28. Гамазіготы па ўстойлівым алелі ацэньваліся як «1», успрымальныя — як «0», а гетэразіготы — як 0,5.
На падставе вынікаў скрынінга на маркеры AnManM1, AnSeq3 і AnSeq4, а таксама наяўнасці насення для канчатковых наступных эксперыментаў, для фенатыпавання ўстойлівасці да антракнозу было адабрана 50 ліній NLL. Аналіз праводзіўся ў двух экзэмплярах у камп'ютэрна-кіраванай цяпліцы з 14-гадзінным фотаперыядам і тэмпературным дыяпазонам 22°C днём і 19°C уначы. Насенне перад пасевам драпаюць (зразаючы насенную абалонку з процілеглага боку зародка вострым лязом), каб прадухіліць перыяд спакою насення з-за занадта цвёрдай насеннай абалонкі і забяспечыць раўнамернае прарастанне. Расліны вырошчвалі ў гаршках (11 × 11 × 21 см) са стэрыльнай глебай (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Варшава, Польшча). Інакуляцыя праводзілася штамам Colletotrichum lupini Col-08, выгадаваным у 1999 годзе са сцеблаў вузкалістых раслін люпіну, якія растуць у полі ў Вержэніцы, Вялікапольскае ўсходняе рэгіён (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Атрымайце плошчу. Ізаляты культывавалі ў асяроддзі SNA пры тэмпературы 20°C пад чорным святлом на працягу 21 дня для стымуляцыі спаруляцыі. Праз чатыры тыдні пасля пасеву, калі расліны дасягнулі стадыі 4-6 лістоў, праводзілі інакуляцыю шляхам апырсквання суспензіяй канідый у канцэнтрацыі 0,5 x 10⁶ канідый на мл. Пасля інакуляцыі расліны трымалі ў цемры на працягу 24 гадзін пры вільготнасці каля 98% і тэмпературы 25°C, каб палегчыць прарастанне канідый і працэс заражэння. Затым расліны вырошчвалі пры 14-гадзінным фотаперыядзе пры тэмпературы 22°C днём/19°C ноччу і вільготнасці 70%. Ацэнка хваробы была зроблена праз 22 дні пасля інакуляцыі і вагалася ад 0 (імунны) да 9 (вельмі ўспрымальны) у залежнасці ад наяўнасці або адсутнасці некратычных паражэнняў на сцеблах і лісці. Акрамя таго, пасля ацэнкі вымяралася вага раслін. Сувязь паміж маркернымі генатыпамі і фенатыпамі хваробы была разлічана як двухкропкавая карэляцыя (адсутнасць гетэразіготных маркераў у наборы ліній для аналізу фенатыпу ўстойлівасці да антракнозу).