Дзякуй за наведванне Nature.com.Версія браўзера, якую вы выкарыстоўваеце, мае абмежаваную падтрымку CSS.Для найлепшага вопыту мы рэкамендуем вам выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer).Тым часам, каб забяспечыць бесперапынную падтрымку, мы будзем візуалізаваць сайт без стыляў і JavaScript.
Лубін узколистный (NLL, Lupinus angustifolius L.) - бабовая расліна, якое выкарыстоўваецца для вытворчасці прадуктаў харчавання і паляпшэння глебы.Глабальнае пашырэнне NLL як культуры прыцягнула мноства патагенных грыбоў, у тым ліку антракноза лубіна, які выклікае разбуральнае антракноз.Два алелі, Lanr1 і AnMan, якія забяспечваюць павышаную ўстойлівасць, выкарыстоўваліся ў селекцыі NLL, але асноўныя малекулярныя механізмы застаюцца невядомымі.У гэтым даследаванні маркеры Lanr1 і AnMan выкарыстоўваліся для скрынінга еўрапейскіх узораў NLL.Тэставанне вакцыны ў кантраляваных умовах пацвердзіла эфектыўнасць абодвух устойлівых донараў.Прафіляванне дыферэнцыяльнай экспрэсіі генаў было праведзена на рэпрэзентатыўных устойлівых і адчувальных лініях.Устойлівасць да антракноза была звязана з празмернай экспрэсіяй тэрмінаў геннай анталогіі «GO: 0006952 Адказ абароны», «GO: 0055114 Акісляльна-аднаўленчы працэс» і «GO: 0015979 Фотасінтэз».Акрамя таго, лінія Lanr1(83A:476) паказала значнае хуткае перапраграмаванне транскрыптому пасля прышчэпкі, у той час як іншыя лініі паказалі затрымку гэтага адказу прыкладна на 42 гадзіны.Абарончыя рэакцыі звязаны з генамі TIR-NBS, CC-NBS-LRR і NBS-LRR, 10 вавёркамі, якія ўдзельнічаюць у патагенезе, вавёркамі пераносу ліпідаў, эндаглюкан-1,3-β-глюкозидазой, багатымі гліцынам вавёркамі клеткавай сценкі і генамі рэактыўнага шляху кіслароду.Раннія рэакцыі на 83A:476, уключаючы дбайнае падаўленне генаў, звязаных з фотасінтэзам, супалі з паспяховай абаронай падчас вегетатыўнай фазы росту грыбковай біялогіі, што сведчыць аб тым, што эфектар выклікае імунітэт.Рэакцыя Мандэлупа запавольваецца, як і агульнае гарызантальнае супраціўленне.
Лубін вузкалісты (NLL, Lupinus angustifolius L.) - збожжавая культура з высокім утрыманнем бялку, якая паходзіць з рэгіёна Заходняга Міжземнамор'я1,2.У цяперашні час яго вырошчваюць як харчовую культуру для жывёл і людзей.Ён таксама лічыцца зялёным угнаеннем у сістэмах севазвароту з-за фіксацыі азоту сімбіятычнымі азотфіксуючымі бактэрыямі і агульнага паляпшэння структуры глебы.NLL прайшоў хуткі працэс прыручэння ў мінулым стагоддзі і ўсё яшчэ знаходзіцца пад моцным селекцыйным ціскам3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.З шырокім культываваннем NLL паслядоўнасць патагенных грыбоў стварыла новыя сельскагаспадарчыя нішы і выклікала новыя хваробы, якія знішчаюць ураджай. Найбольш прыкметным для фермераў і селекцыянераў лубіна стала з'яўленне антракноза, выкліканага патагенным грыбком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Найбольш прыкметным для фермераў і селекцыянераў лубіна стала з'яўленне антракноза, выкліканага патагенным грыбком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Найбольш прыкметным для фермераў і селекцыянераў люпіна было выяўленне антракноза, выкліканага патагенным грыбком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Найбольш прыкметным для фермераў і селекцыянераў лубіна стала з'яўленне антракноза, выкліканага патагенным грыбом Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg , Feiler & Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Валасаты. 1 Найбольш паразлівым для фермераў і селекцыянераў люпіны з'яўляецца выяўленне антракноза, выкліканага патогенным грыбком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Найбольш уражвае фермераў і селекцыянераў лубіна з'яўленне антракноза, выкліканага патагенным грыбом Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Самыя раннія паведамленні пра хваробу паступілі з Бразіліі і ЗША, тыповыя сімптомы з'явіліся ў 1912 і 1929 гадах адпаведна.Аднак прыкладна праз 30 гадоў узбуджальнік быў пазначаны як Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., тэлеаморфа Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., тэлеаморфа Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., тэлеаморфа Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld у Целенакіраванай марфалогіі. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld у мэтавай марфалогіі. & Х. Шрэнк,. & Х. Шрэнк,.і Х.Шрэнк. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。і Х. Шленк,.Папярэдняе фенатыпаванне захворвання, праведзенае ў сярэдзіне 20-га стагоддзя, паказала некаторую ўстойлівасць у NLL і жоўтага лубіна (L. luteus L.), але ўсе правераныя ўзоры белага лубіна (L. albus L.) былі вельмі адчувальныя15,16.Даследаванні паказалі, што развіццё антракноза звязана з павелічэннем колькасці ападкаў (вільготнасці паветра) і тэмпературы (у дыяпазоне 12-28 °C), што прыводзіць да парушэння ўстойлівасці пры больш высокіх тэмпературах17, 18. Фактычна, час, неабходнае для прарастання канідый і пачатку захворвання, было ў чатыры разы карацей пры 24 °C (4 гадзіны), чым пры 12 °C (16 гадзін) ва ўмовах высокай вільготнасці19.Такім чынам, працягваецца глабальнае пацяпленне прывяло да распаўсюджвання антракноза.Тым не менш, хвароба назіралася ў Францыі (1982) і Украіне (1983) як прадвеснік надыходзячай пагрозы, але, відаць, была праігнараваная прамысловасцю па вытворчасці лубіна ў той час20,21.Праз некалькі гадоў гэтая разбуральная хвароба распаўсюдзілася па ўсім свеце, а таксама закранула буйныя краіны-вытворцы лубіна, такія як Аўстралія, Польшча і Германія22,23,24.Пасля ўспышкі антракноза ў сярэдзіне 1990-х гадоў шырокі скрынінг прывёў да ідэнтыфікацыі некалькіх устойлівых донараў у пробах NLL19.Устойлівасць NLL да антракнозу кантралюецца двума асобнымі дамінантнымі алелямі, знойдзенымі ў розных крыніцах зародкавай плазмы: Lanr1 у гатунку Tanjil і Wonga і AnMan у гатунку.Mandalay 25, 26. Гэтыя алелі дапаўняюць малекулярныя маркеры, якія падтрымліваюць адбор устойлівай зародкавай плазмы ў селекцыйных праграмах25,26,27,28,29,30.Устойлівую селекцыйную лінію 83A:476, якая нясе алель Lanr1, скрыжавалі з успрымальнай дзікай лініяй P27255, каб атрымаць папуляцыю RIL, якая аддзяляецца па ўстойлівасці да антракнозу, што дазволіла аднесці локус Lanr1 да храмасомы NLL-1131, 32, 33. Выраўноўванне маркераў карты сувязі ад фланкіруючых локусаў устойлівасці да антракнозу з геномам У рамках ic, NLL выявіла размяшчэнне ўсіх трох алеляў у адной храмасоме (NLL-11), але ў розных пазіцыях29,34,35.Аднак з-за невялікай колькасці RIL і вялікай генетычнай адлегласці паміж маркерамі і адпаведнымі алелямі немагчыма зрабіць надзейныя высновы аб іх асноўных генах.З іншага боку, выкарыстанне зваротнай генетыкі ў лубіна складана з-за вельмі нізкага патэнцыялу рэгенерацыі, што робіць генетычныя маніпуляцыі грувасткімі37.
Распрацоўка прыручанай зародкавай плазмы, якая нясе жаданы алель у гомазіготным стане, напрыклад 83A:476 (Lanr1) і Mandelup (AnMan), адкрыла шлях да вывучэння ўстойлівасці да антракнозу ў сувязі з прысутнасцю супрацьлеглых камбінацый алеляў у дзікіх папуляцыях.Магчымасці малекулярных механізмаў.Параўнайце ахоўныя рэакцыі, створаныя пэўнымі генатыпамі.Гэта даследаванне ацэньвала рэакцыю ранняй транскрыпцыі NLL на вакцынацыю C. lupini.Спачатку еўрапейская панэль зародкавай плазмы NLL, якая змяшчае 215 ліній, была прагледжана з выкарыстаннем малекулярных маркераў, якія пазначаюць алелі Lanr1 і AnMan.Затым фенатыпаванне антракноза было праведзена на 50 лініях NLL, папярэдне адабраных для малекулярных маркераў, у кантраляваных умовах.На падставе гэтых эксперыментаў чатыры лініі, якія адрозніваюцца ўстойлівасцю да антракнозу і алельным складам Lanr1/AnMan, былі выбраны для дыферэнцыяльнага прафілявання экспрэсіі генаў абароны з выкарыстаннем двух дадатковых падыходаў: высокапрадукцыйнага секвенирования РНК і колькаснага вызначэння ПЦР у рэальным часе.
Скрынінг набору зародкавай плазмы NLL (N = 215) з маркерамі Lanr1 (Anseq3 і Anseq4) і AnMan (Anseq4) і AnMan (AnManM1) паказаў, што толькі адна лінія (95726, каля Саламанкі-б) узмацняе алель «рэзістэнтнасці» для ўсіх маркераў, у той час як «Наяўнасць «успрымальных» алеляў» выявіла долю ўсіх знакаў у 158 (~73,5%) радках.Трынаццаць ліній далі два «ўстойлівыя» алелі маркера Lanr1, а 8 ліній далі «ўстойлівыя» алелі Lanr1.маркер.Алель «супраціў» маркера AnMan (дадатковая табліца S1).Дзве лініі былі гетерозиготными па маркеру Anseq3 і адна - па маркеру AnManM1.42 лініі (19,5%) неслі супрацьлеглыя фазы алеляў Anseq3 і Anseq4, што паказвае на высокую частату рэкамбінацыі паміж гэтымі двума локусов.Фенатыпы антракноза ў кантраляваных умовах (дадатковая табліца S2) выявілі зменлівасць устойлівасці правераных генатыпаў, што адбілася на ступені выяўленасці антракноза.Адрозненні ў сярэдніх балах вагаліся ад 1,8 (умерана ўстойлівы) да 6,9 (успрымальны), а розніца ў масе раслін вагалася ад 0,62 (успрымальны) да 4,45 г (устойлівы). Існавала значная карэляцыя паміж значэннямі, назіранымі ў двух паўторах эксперыменту (0,51 для балаў сур'ёзнасці захворвання, P = 0,00017 і 0,61 для масы расліны, P <0,0001), а таксама паміж гэтымі двума параметрамі (- 0,59 і - 0,77, P <0,0001). Была значная карэляцыя паміж значэннямі, якія назіраліся ў двух паўторах эксперыменту (0,51 для балаў сур'ёзнасці захворвання, P = 0,00017 і 0,61 для масы расліны, P <0,0001), а таксама паміж гэтымі двума параметрамі (- 0,59 і - 0,77, P <0,0001). Выяўлена сапраўдная карэляцыя паміж значэннямі, назіранымі ў двух паўторах эксперыменту (0,51 для балаў цяжару хваробы, P = 0,00017 і 0,61 для масы расліны, P < 0,0001), а таксама паміж гэтымі двума параметрамі (-0,59 і -0,77, R < 0,0001) 0,0001). Была выяўлена значная карэляцыя паміж значэннямі, якія назіраліся ў двух паўторах эксперыменту (0,51 для балаў сур'ёзнасці захворвання, P = 0,00017 і 0,61 для масы расліны, P <0,0001), а таксама паміж гэтымі двума параметрамі (- 0,59 і -0,77, P <0,0001) 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0,51，P = 0,00017，植物重量为0,61，P <0,0001）以及这两个参数之间Ｔ(- 0,59 和-0,77，P<0,0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为 分为 0,5 1, p = 0,00017, 植物 为 为 0,61, p <0,0001) 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0,59 和– 0,59 和– 0,59和– 0,59 和-0,77，P <0,0001). Назіралася значная карэляцыя паміж значэннямі, назіранымі ў двух паўторах (ацэнка цяжару захворвання 0,51, P = 0,00017 і маса расліны 0,61, P <0,0001), і паміж гэтымі двума параметрамі (-0,59 і -0,0001) 0,77, P <0,0001. Была значная карэляцыя паміж значэннямі, якія назіраліся ў дублікаце (ацэнка сур'ёзнасці захворвання 0,51, P = 0,00017 і маса расліны 0,61, P <0,0001) і паміж гэтымі двума параметрамі (-0,59 і -0,0001) 0,77, P <0,0001. ).Тыповыя сімптомы, якія назіраюцца ў адчувальных раслін, уключаюць скручванне і скручванне сцябла, якое нагадвае структуру «пастуховага лука», пасля чаго з'яўляюцца авальныя паразы з аранжавымі/ружовымі спаразоітамі (дадатковы мал. 1).Аўстралійскія асобнікі, якія нясуць гены Lanr1 (83A:476 і Tanjil) і AnMan (Mandelup), умерана ўстойлівыя, 0,0331 і 0,0036).Некаторыя лініі, якія таксама нясуць «ўстойлівыя» алелі Lanr1 і/або AnMan, дэманструюць сімптомы захворвання.
Цікава, што некалькі ліній NLL, у якіх адсутнічае «ўстойлівы» алель-маркер, паказалі высокі ўзровень устойлівасці да антракнозу (супастаўны або вышэйшы, чым у генатыпаў Lanr1 або AnMan), такіх як Boregine (значэнне P <0,0001 для абодвух параметраў), Bojar (значэнне P <0,0001 для ацэнкі і 0,001 для масы расліны) і папуляцыя B-549/79b (значэнне P <0. 0001 для ацэнкі і неістотны для вагі). Цікава, што некалькі ліній NLL, у якіх адсутнічае «ўстойлівы» алель-маркер, паказалі высокі ўзровень устойлівасці да антракнозу (супастаўны або вышэйшы, чым у генатыпаў Lanr1 або AnMan), такіх як Boregine (значэнне P <0,0001 для абодвух параметраў), Bojar (значэнне P <0,0001 для ацэнкі і 0,001 для масы расліны) і папуляцыя B-549/79b (значэнне P <0. 0001 для ацэнкі і неістотны для вагі). Цікава, што некалькі ліній NLL, пазбаўленых якога-небудзь «рэзістэнтнага» маркернага алеля, паказалі высокі ўзровень устойлівасці да антракнозу (спастаўляемы або больш высокі, чым для генатыпаў Lanr1 або AnMan), такіх як Boregine (значэнне P <0,0001 для ўсіх параметраў), Bojar (значэнне P < 0,0001 для ацэнак і 0,001 для масы раслін) і папуляцыі B-549/ 79b (значэнне P <0,0001 для ацэнкі і нязначна для масы). Цікава, што некалькі ліній NLL, у якіх адсутнічае «ўстойлівы» алель-маркер, паказалі высокі ўзровень устойлівасці да антракнозу (параўнальны або вышэйшы, чым у генатыпаў Lanr1 або AnMan), такіх як Boregine (значэнне P <0,0001 для абодвух параметраў), Bojar (значэнне P <0,0001 для ацэнкі і 0,001 для масы расліны) і папуляцыя B-549/79b (значэнне P <0. 0001 для ацэнкі і не мае значэння для вагі).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1 或AnM an 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0,0001，植物重量为0 .001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）。 Цікава, што некаторыя сістэмы NLL, якія не маюць ніякіх «антыгенных» маркераў, дэманструюць высокую гарызантальную ўстойлівасць (эквівалентную генам Lanr1 або AnMan або вышэй), такія як Boregine (абодва параметра P <0,0001), Bojar (значэнне P <0,0001, маса расліны 0,001) і штам B-549/79b (значэнне P <0,0001, вага неістотны). Цікава, што некаторыя лініі NLL, пазбаўленыя якіх-небудзь маркерных алеляў «ўстойлівасці», паказалі высокую ступень устойлівасці да антракнозу (супастаўныя або вышэй, чым у генатыпаў Lanr1 або AnMan), такія як Boregine (значэнне P для ўсіх параметраў <0,0001), Bojar (значэнне P <0,0001, маса расліны 0,001) і папуляцыі B-549/79b (ацэнка). ка P-значэнне <0,0001, маса нязначная). Цікава, што некаторыя лініі NLL, у якіх адсутнічаюць маркерныя алелі «ўстойлівасці», паказалі высокі ўзровень устойлівасці да антракнозу (супастаўны або вышэйшы за генатыпы Lanr1 або AnMan), такія як Boregine (значэнне P для абодвух параметраў <0,0001), Bojar (значэнне P <0,0001, маса расліны 0,001) і папуляцыя B-549/79b (значэнне P <0,0). 001, вага не істотная).Гэта з'ява сведчыць аб магчымасці новай генетычнай крыніцы ўстойлівасці, тлумачачы назіраную адсутнасць карэляцыі паміж генатыпамі маркераў і фенатыпамі захворвання (значэнне Р ад ~0,42 да ~0,98).Такім чынам, тэст Калмагорава-Смірнова паказаў, што дадзеныя аб устойлівасці да антракноза былі прыблізна нармальна размеркаваны для балаў (P-значэнні 0,25 і 0,11) і масы расліны (P-значэнні 0,47 і 0,55), мяркуючы, што я мяркую, што задзейнічана больш алеляў, чым Lanr1 і AnMan.
Па выніках скрынінга ўстойлівасці да сібірскай язвы былі адабраны 4 лініі для аналізу транскрыптаў: 83A:476, Boregine, Mandelup і Population 22660. Гэтыя лініі былі паўторна правераны на ўстойлівасць да сібірскай язвы ў эксперыментах па прышчэпцы шляхам секвенирования РНК пры ўмове, што яны былі такімі ж, як і ў папярэднім тэсце.Значэнні балаў былі наступнымі: Барэгін (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Мандэлуп (3,82 ± 1,42) і насельніцтва 22660 (6,11 ± 1,29).
Пратакол Illumina NovaSeq 6000 дасягнуў у сярэднім 40,5 пары Mread на ўзор (ад 29,7 да 54,4 Mread) (дадатковая табліца S3).Ацэнкі выраўноўвання ў эталоннай паслядоўнасці вагаліся ад 75,5% да 88,6%.Сярэдняя карэляцыя дадзеных падліку чытанняў паміж эксперыментальнымі варыянтамі паміж біялагічнымі паўторамі вагалася ад 0,812 да 0,997 (у сярэднім 0,959). З 35170 прааналізаваных генаў 2917 не выявілі экспрэсіі, а астатнія 4785 генаў экспрэсіраваліся на нязначным узроўні (базавае сярэдняе <5). З 35170 прааналізаваных генаў 2917 не выявілі экспрэсіі, а астатнія 4785 генаў экспрэсіраваліся на нязначным узроўні (базавае сярэдняе <5). З 35 170 прааналізаваных генаў 2917 не выявілі экспрэсіі, а астатнія 4785 генаў экспрэсіраваліся на незначным узроўні (базавае сярэдняе <5). З 35170 прааналізаваных генаў 2917 не выяўлялі экспрэсіі, а астатнія 4785 генаў экспрэсіраваліся на нязначным узроўні (базавае сярэдняе <5).在分析的35,170 个基因中, 2917 个没有表达, 其他他4785 个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5).35 170 З 35 170 прааналізаваных генаў 2917 не экспрэсіраваліся, а астатнія 4785 генаў мелі неістотную экспрэсію (базавае сярэдняе значэнне <5). З 35170 прааналізаваных генаў 2917 не экспрэсіраваліся, а астатнія 4785 генаў мелі нязначную экспрэсію (базавае сярэдняе <5).Такім чынам, колькасць генаў, якія лічацца экспрессированными (базавае сярэдняе ≥ 5) падчас эксперыменту склала 27 468 (78,1%) (дадатковая табліца S4).
З першага моманту ўсе лініі NLL адказалі на прышчэпку C. lupini (штам Col-08) перапраграмаваннем транскрыптому (табл. 1), аднак паміж лініямі назіраліся значныя адрозненні.Такім чынам, лінія рэзістэнтнасці 83A:476 (якая нясе ген Lanr1) паказала значнае перапраграмаванне транскрыптому ў першы момант часу (6 hpi) з 31-69-кратным павелічэннем колькасці ізаляваных генаў уверх і ўніз у параўнанні з іншымі момантамі часу ў гэты момант часу.Акрамя таго, гэты пік быў нядоўгім, паколькі экспрэсія толькі некалькіх генаў заставалася істотна змененай у другі момант часу (12 hpi).Цікава, што Boregine, які таксама прадэманстраваў высокі ўзровень рэзістэнтнасці ў цесцю трансплантацыі, не падвяргаўся такому масіўнаму перапраграмавання транскрыпцыі падчас эксперыменту.Аднак колькасць дыферэнцыяльна экспрэсіруемых генаў (DEG) было аднолькавым для Boregine і 83A:476 пры 12 HPI.І Мандэлуп, і папуляцыя 22660 паказалі пікі DEG у апошні час (48 л/с), што сведчыць аб адноснай затрымцы абарончых рэакцый.
Паколькі 83A:476 падвергнуўся масіўнаму перапраграмаванню транскрыптому ў адказ на C. lupini пры 6 HPI у параўнанні з усімі іншымі лініямі, ~91% DEG, якія назіраліся ў гэты момант часу, былі спецыфічнымі для лініі (мал. 1).Тым не менш, было некаторае супадзенне ў ранніх адказах паміж лініямі даследавання, так як 68,5%, 50,9% і 52,6% DEG у Boregine, Mandelup і папуляцыі 22660, адпаведна, перакрываліся з тымі, якія былі знойдзены ў 83A:476 у пэўныя моманты часу.Аднак гэтыя ДЭГ складаюць толькі невялікую долю (0,97–1,70%) усіх ДЭГ, выяўленых у цяперашні час з дапамогай 83A:476.Акрамя таго, 11 DEG з усіх радкоў былі кагерэнтнымі ў гэты час (дадатковыя табліцы S4-S6), уключаючы агульныя кампаненты ахоўных рэакцый раслін: бялок пераносу ліпідаў (TanjilG_32225), фермент эндаглюкан-1,3-β-глюказід (TanjilG_23384), два бялкі, выкліканыя стрэсам, такія як SAM22 (TanjilG_31528 і TanjilG_3). 1531), асноўны латексный бялок (TanjilG_32352) і два багатых гліцынам бялку структурнай клеткавай сценкі (TanjilG_19701 і TanjilG_19702).Было таксама адносна высокае супадзенне ў адказах транскрыптому паміж 83A:476 і Boregine пры 24 HPI (усяго 16-38% DEG) і паміж Mandelup і насельніцтвам 22660 пры 48 HPI (усяго 14-20% DEG).
Дыяграма Венна, якая паказвае колькасць генаў з дыферэнцыяльнай экспрэсіяй (DEG) у лініях вузкалістых лубінаў (NLL), прышчэпленых Colletotrichum lupini (штам Col-08, атрыманы з лубінавых палёў у Вержэніцах, Польшча, 1999 г.).Прааналізаваныя лініі NLL: 83A:476 (устойлівая, нясе алель Lanr1), Boregine (устойлівая, генетычны фон невядомы), Mandelup (умерана ўстойлівая, нясе алель AnMan) і папуляцыя 22660 (вельмі адчувальная).Абрэвіятура hpi расшыфроўваецца як гадзіны пасля вакцынацыі.Нулявыя значэнні былі выдалены, каб спрасціць графік.
Набор генаў з падвышанай экспрэсіяй пры 6 hpi быў прааналізаваны на наяўнасць кананічных даменаў гена R (дадатковая табліца S7).Гэта даследаванне паказала індукцыю транскрыптому класічных генаў устойлівасці да хвароб з даменамі NBS-LRR толькі ў 83A:476.Гэты набор складаўся з аднаго гена TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), пяці генаў CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 і tanjilg_16162) і чатырох NBS-LR, Tanjilg_16162) і чатырох NBS-LRRE (tanjilg_16162), а таксама чатыры NBS-Lrr (tanjilg_16162) і чатыры NBS-LRR (TANJILG_16162).Усе гэтыя гены маюць кананічныя дамены, размешчаныя ў захаваных паслядоўнасцях.У дадатак да генаў дамена NBS-LRR некалькі кіназ RLL былі актываваны пры 6 hpi, а менавіта адна ў Boregine (TanjilG_19877), дзве ў Mandelup (TanjilG_07141 і TanjilG_19877) і ў папуляцыі 22660 (TanjilG_09014 і TanjilG_10361) і дзве ў 83A 27:47 6.
Гены са значна змененай экспрэсіяй у адказ на інакуляцыю C. lupini (штам Col-08) былі падвергнуты аналізу ўзбагачэння геннай анталогіі (GO) (дадатковая табліца S8). Часцей за ўсё празмерна прадстаўлены тэрмін біялагічных працэсаў быў «GO:0006952 адказ абароны», які з'явіўся ў 6 з 16 (час × радок) камбінацый з высокай значнасцю (значэнне P <0,001) (мал. 2). Часцей за ўсё празмерна прадстаўлены тэрмін біялагічных працэсаў быў «GO:0006952 адказ абароны», які з'явіўся ў 6 з 16 (час × радок) камбінацый з высокай значнасцю (значэнне P <0,001) (мал. 2). Найбольш часта празмерна прадстаўленым тэрмінам біялагічнага працэсу быў «GO: 0006952 абарончы адказ», які з'явіўся ў 6 з 16 (час × лінія) камбінацыі з высокай значнасцю (значэнне P <0,001) (рыс. 2). Часцей за ўсё празмерна прадстаўлены тэрмін біялагічных працэсаў быў «GO:0006952 адказ абароны», які з'явіўся ў 6 з 16 (час × радавод) камбінацый з высокай значнасцю (P <0,001) (мал. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”,，它出现在16 个（时间×线）组合中的6个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 Найбольш рэпрэзентатыўным тэрмінам біялагічнага працэсу з'яўляецца «GO:0006952 абарончая рэакцыя», які сустракаецца ў 6 з 16 (时间×线) камбінацый з высокай значнасцю (значэнне P <0,001) (图2). Найбольш часта празмерна прадстаўленым тэрмінам біялагічнага працэсу быў «GO: 0006952 Defense Response», які з'явіўся ў 6 з 16 камбінацый (час × лінія) з высокай значнасцю (значэнне P <0,001) (рыс. 2). Найбольш часта празмерна прадстаўлены тэрмін біялагічных працэсаў быў «GO:0006952 Адказ абароны», які з'явіўся ў 6 з 16 камбінацый (час × радок) з высокай значнасцю (значэнне P <0,001) (мал. 2).Гэты тэрмін быў перапрадстаўлены ў два моманты часу ў 83A: 476 і Boregine (6 і 24 hpi) і ў адзін момант часу ў Mandelup і Population 22660 (12 і 6 hpi адпаведна).Гэта чаканы вынік, які падкрэслівае супрацьгрыбковы адказ устойлівых ліній.Акрамя таго, 83A:476 адказаў на C. lupini хуткай індукцыяй генаў, звязаных з акісляльным выбухам, прадстаўленым тэрмінам «GO:0055114 акісляльна-аднаўленчы працэс», што паказвае на спецыфічную ахоўную рэакцыю, у той час як Boregine выявіў спецыфічныя абарончыя рэакцыі, звязаныя з тэрмінам «GO».:0006950 Рэакцыя на стрэс».Папуляцыя 22660 актывавала рэакцыю гарызантальнай рэзістэнтнасці з удзелам другасных метабалітаў, падкрэсліваючы празмерную колькасць тэрмінаў «GO:0016104 Працэс біясінтэзу трыцерпенаў» і «GO:0006722 Працэс метабалізму трыцерпенаў» (абодва тэрміны належаць да аднаго і таго ж набору генаў), прымаючы пад увагу вынікі аналізу ўзбагачэння тэрмінаў GO, стабільнасць рэакцыі Мандэлупа была паміж Boregine і Population 22660. Акрамя таго, ранняя рэакцыя 83A:476 (6 hpi) і запаволеная рэакцыя Mandelup і Population 22660 уключаюць тэрмін GO:0015979 «фотасінтэз» і іншыя звязаныя біялагічныя працэсы.
Тэрміны анталогіі генаў біяпрацэсаў, абраныя ў анатацыі генаў з дыферэнцыяльнай экспрэсіяй падчас транскрыптамных рэакцый лубіна вузкалістага (NLL), прышчэпленага лубінам сібірскай язвы (штам Col-08, атрыманы з лубінавых палёў у Вержэніцах, Польшча, у 1999 г.), моцна перабольшаныя.Прааналізаваныя лініі NLL: 83A:476 (устойлівая, з гомазіготным алелем Lanr1), Boregine (устойлівая, невядомая генетычная паходжанне), Mandelup (умерана ўстойлівая, з гомазіготным алелем AnMan) і папуляцыя 22660 (успрымальная).
Паколькі гэта даследаванне было накіравана на ідэнтыфікацыю генаў, якія спрыяюць устойлівасці да антракнозу, гены, прысвоеныя тэрмінам GO «GO: 0006952 Абарончыя рэакцыі» і «GO: 0055114 Акісляльна-аднаўленчыя працэсы», былі прааналізаваны з адсячэннем, паколькі базавы ўзровень ≥ 30 з прынамсі адной лініяй.× момант часу, які аб'ядноўвае статыстычна значныя значэнні log2 (кратнае змяненне).Колькасць генаў, якія адпавядаюць гэтым крытэрам, склала 65 для GO:0006952 і 524 для GO:0055114.
83A:476 выявілі два пікі DEG, пазначаныя тэрмінам GO:0006952, першы пры 6 генах на цалю (64 гены, рэгуляцыя ўверх і ўніз), а другі пры 24 генах на цалю (15 генаў, толькі ўверх).Boregine таксама паказаў, што GO:0006952 дасягнуў піка ў той жа момант часу, але з меншым DEG (11 і 8) і пераважнай актывацыяй.Мандэлуп паказаў два пікі GO:0006952 пры 12 і 48 HPI, абодва з якіх нясуць 12 генаў (першы з актывуючымі генамі, а другі толькі з супрэсіўнымі генамі), у той час як папуляцыя 22660 пры 6 HPI (13 генаў) мела большае перавага піку павелічэння.рэгуляванне.Варта адзначыць, што 96,4% GO:0006952 DEG у гэтых піках мелі аднолькавы тып рэакцыі (уверх ці ўніз), што паказвае на значнае перакрыцце абарончых рэакцый, нягледзячы на ​​адрозненні ў колькасці задзейнічаных генаў.Самая вялікая група паслядоўнасцей, звязаных з тэрмінам GO: 0006952, кадуе звязаны з галодным стрэсам бялок паведамлення 22 (SAM22-падобны), які належыць да класа 10 бялку, звязанага з патагенезам (PR-10), і латексу асноўнага бялку.падобны (MLP-падобны) бялок) бялок (мал. 3).Абедзве групы адрозніваліся характарам выразаў і накіраванасцю адказу.Гены, якія кадуюць SAM22-падобныя вавёркі, дэманстравалі паслядоўную і значную індукцыю ў раннія моманты часу (6 або 12 hpi) і, як правіла, не рэагавалі ў канцы эксперыменту (48 hpi), у той час як MLP-падобныя вавёркі дэманстравалі каардынацыю пры 6 hpi.hpi.83A:476 і Mandelup пры 48 к.с./цаля, амаль усе іншыя кропкі даных не рэагавалі.Акрамя таго, адрозненні ў профілях экспрэсіі SAM22-падобных бялковых генаў рушылі ўслед за назіранай варыябельнасцю ўстойлівасці да антракноза, паколькі больш устойлівыя лініі мелі больш часовых кропак, якія істотна індукуюць гэтыя гены, чым больш успрымальныя гены.Іншы LlR18A/B-падобны ген PR-10 паказаў вельмі падобны ўзор экспрэсіі з SAM22-падобным генам бялку.
Былі вызначаны асноўныя кампаненты тэрміна біялагічных працэсаў «GO:0006952 Defense Response» і мадэлі экспрэсіі генаў-кандыдатаў алеляў Lanr1 і AnMan.Шкала Log2 прадстаўляе значэнні log2 (кратнае змяненне) паміж прышчэпленымі (Colletotrichum lupini, штам Col-08, атрыманы з лубінавых палёў, Віжэніца, Польшча, 1999) і кантрольнымі (фіктыўна прышчэпленымі) раслінамі ў адзін і той жа момант часу.Былі прааналізаваны наступныя лініі вузкалістых лубіну: 83A:476 (устойлівая, з гомазіготным алелем Lanr1), Boregine (устойлівая, генетычны фон невядомы), Mandelup (умерана ўстойлівы, з гомазіготным алелем AnMan) і папуляцыя 22660 (успрымальная).
Акрамя таго, былі ацэненыя профілі экспрэсіі генаў-кандыдатаў у РНК-seq Lanr1 (TanjilG_05042) і AnMan (TanjilG_12861) (мал. 3).Ген TanjilG_05042 паказаў значную рэакцыю (актывацыю) пры 83A:476 толькі ў першы момант часу (6 hpi), у той час як TanjilG_12861 быў значным у Mandeloop толькі ў два моманты часу: 6 hpi (паніжальная рэгуляцыя) і 24 hpi (6 hpi).З.).рэгулюецца)).
Гены з найбольшай экспрэсіяй у тэрміне GO:0055114 «акісляльна-аднаўленчы працэс» былі гены, якія кадуюць вавёркі цытахром Р450 і пероксидазу (мал. 4).Для ўзораў, ізаляваных з 83A:476 пры 6 HPI, максімальныя або мінімальныя значэнні log2 (кратнае змяненне) (для 86,6% генаў) звычайна назіраліся паміж прышчэпленымі і кантрольнымі раслінамі, што падкрэслівае высокую рэакцыю гэтага генатыпу на прышчэпку полу.83A:476 паказаў найбольш значны GO: 0055114 DEG пры 6 hpi (503 гены), а астатнія лініі пры 48 hpi (Boregine, 31 ген; Mandelup, 85 генаў; і Population 22660, 78 генаў)).У большасці генаў сямейства GO:0055114 назіраліся два тыпу рэакцыі на вакцынацыю (актывацыя і тармажэнне).Цікава, што да 97,6% DEG, ідэнтыфікаваных для тэрміна GO: 0055114 у Mandelupe пры 48 hp. Гэтыя назіранні сведчаць аб тым, што, нягледзячы на ​​значна меншы маштаб (г.зн. колькасць мутаваных акісляльна-аднаўленчых генаў, 85 супраць 503), мадэль рэакцыі запаволенага транскрыптому мандэлупа на антракноз падобная да ранняй рэакцыі 83A:4 76.У Boregine і Population 22660 гэта збліжэнне ніжэйшае і складае 51,6% і 75,6% адпаведна.
Выяўлены заканамернасці выражэння асноўных кампанентаў тэрміна біялагічнага працэсу “GO:0055114 Акісляльна-аднаўленчы працэс”.Шкала Log2 прадстаўляе значэнні log2 (кратнае змяненне) паміж прышчэпленымі (Colletotrichum lupini, штам Col-08, атрыманы з лубінавых палёў, Віжэніца, Польшча, 1999) і кантрольнымі (фіктыўна прышчэпленымі) раслінамі ў адзін і той жа момант часу.Былі прааналізаваны наступныя лініі вузкалістых лубіну: 83A:476 (устойлівая, з гомазіготным алелем Lanr1), Boregine (устойлівая, генетычны фон невядомы), Mandelup (умерана ўстойлівы, з гомазіготным алелем AnMan) і папуляцыя 22660 (успрымальная).
83A:476 Транскрыптамічныя адказы на прышчэпку C. lupini (штам Col-08) таксама ўключалі скаардынаванае замоўчванне генаў, якое прыпісваецца тэрміну GO:0015979 «фотасінтэз» і іншыя звязаныя з ім біялагічныя працэсы (мал. 5).Гэты набор GO:0015979 DEG утрымліваў 105 генаў, якія былі значна падаўлены пры 6 hpi пры 83A:476.У гэтай падгрупе 37 генаў таксама былі зніжаны ў Мандэлупа пры 48 HPI і 35 адначасова ў папуляцыі 22660, у тым ліку 19 DEG, агульных для абодвух генатыпаў.Ніякія DEG, звязаныя з тэрмінам GO: 0015979, не былі істотна актываваныя ў любой камбінацыі (радок х час).
Выяўлены заканамернасці выражэння асноўных кампанентаў тэрміна біялагічнага працэсу “GO:0015979 Фотасінтэз”.Шкала Log2 прадстаўляе значэнні log2 (кратнае змяненне) паміж прышчэпленымі (Colletotrichum lupini, штам Col-08, атрыманы з лубінавых палёў, Віжэніца, Польшча, 1999) і кантрольнымі (фіктыўна прышчэпленымі) раслінамі ў адзін і той жа момант часу.Былі прааналізаваны наступныя лініі вузкалістых лубіну: 83A:476 (устойлівая, з гомазіготным алелем Lanr1), Boregine (устойлівая, генетычны фон невядомы), Mandelup (умерана ўстойлівы, з гомазіготным алелем AnMan) і папуляцыя 22660 (успрымальная).
На аснове вынікаў дыферэнцыяльнага аналізу экспрэсіі і, як мяркуецца, удзельнічае ў ахоўных рэакцыях супраць патагенных грыбоў, гэты набор з сямі генаў быў абраны для колькаснай ацэнкі профіляў экспрэсіі з дапамогай ПЦР у рэальным часе (дадатковая табліца S9).
Меркаваны ген бялку TanjilG_10657 быў значна індукаваны ва ўсіх вывучаных лініях і часовых кропках у параўнанні з кантрольнымі (мімічнымі) раслінамі (дадатковыя табліцы S10, S11).Акрамя таго, профіль экспрэсіі TanjilG_10657 паказаў тэндэнцыю да росту на працягу эксперыменту для ўсіх ліній.Папуляцыя 22660 паказала найбольшую адчувальнасць TanjilG_10657 да прышчэпкі з 114-кратнай актывацыяй і самым высокім узроўнем адноснай экспрэсіі (4,4 ± 0,4) пры 24 HPI (мал. 6а).Ген бялку PR10 LlR18A TanjilG_27015 таксама паказаў актывацыю ва ўсіх лініях і часовых кропках са статыстычнай значнасцю ў большасці кропак дадзеных (мал. 6b).Падобна TanjilG_10657, самы высокі ўзровень адноснай экспрэсіі TanjilG_27015 назіраўся ў 22660 прышчэпленых папуляцыі пры 24 HPI (19,5 ± 2,4).Ген кіслаты эндахітыназы TanjilG_04706 быў значна павышаны ва ўсіх лініях і ва ўсе моманты часу, за выключэннем Boregine 6 hpi (мал. 6c).Ён быў моцна індукаваны ў першы момант часу (6 HPI) пры 83A:476 (у 10,5 разоў) і ўмерана павышаны ў іншых лініях (у 6,6-7,5 разоў).У ходзе эксперыменту экспрэсія TanjilG_04706 заставалася на аднолькавых узроўнях у 83A:476 і Boregine, у той час як у Mandelup і папуляцыі 22660 яна значна ўзрасла, дасягнуўшы адносна высокіх значэнняў (5,9 ± 1,5 і 6,2 ± 1,5 адпаведна).Эндоглюкан-1,3-β-глюкозидаза-падобны ген TanjilG_23384 паказаў высокую актывацыю ў першыя два моманты часу (6 і 12 hpi) ва ўсіх лініях, акрамя папуляцыі 22660 (мал. 6d).Самыя высокія адносныя ўзроўні экспрэсіі TanjilG_23384 назіраліся ў другі момант часу (12 hpi) у Mandelup (2,7 ± 0,3) і 83A:476 (1,5 ± 0,1).Пры 24 HPI экспрэсія TanjilG_23384 была адносна нізкай ва ўсіх вывучаных лініях (ад 0,04 ± 0,009 да 0,44 ± 0,12).
Профілі экспрэсіі выбраных генаў (ag), выяўленыя з дапамогай колькаснай ПЦР.Лічбы 6, 12 і 24 азначаюць гадзіны пасля вакцынацыі.Для нармалізацыі выкарыстоўваліся гены LanDExH7 і LanTUB6, а для міжсерыйнай каліброўкі - LanTUB6.Палоскі памылак прадстаўляюць стандартнае адхіленне на аснове трох біялагічных паўтораў, кожная з якіх з'яўляецца сярэднім трох тэхнічных паўтораў. Статыстычная значнасць адрозненняў у узроўнях экспрэсіі паміж прышчэпленымі (Colletotrichum lupini, штам Col-08, атрыманы ў 1999 г. з поля лубіна ў Вержэніцы, Польшча) і кантрольнымі (імітавана прышчэпленымі) раслінамі адзначаны вышэй кропак дадзеных (*P значэнне <0,05, **P значэнне ≤ 0,01, ***P значэнне ≤ 0,001). Статыстычная значнасць адрозненняў у узроўнях экспрэсіі паміж прышчэпленымі (Colletotrichum lupini, штам Col-08, атрыманы ў 1999 г. з поля лубіна ў Вержэніцы, Польшча) і кантрольнымі (імітавана прышчэпленымі) раслінамі адзначаны вышэй кропак дадзеных (*P значэнне <0,05, **P значэнне ≤ 0,01, ***P значэнне ≤ 0,001). Статыстычная значнасць адрозненняў ва ўзроўні экспрэсій паміж інакуліраванымі (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, атрыманы ў 1999 г. з поля люпіна ў Вержэніцэ, Польшча) і кантрольнымі (ложна інакуліраванымі) раслінамі, адзначанымі над кропкамі дадзеных (*значэнне P < 0,05, **значэнне P ≤ 0,01, ***значэнне P ≤ 0 ,001). Статыстычна значныя адрозненні ў узроўнях экспрэсіі паміж прышчэпленымі (Colletotrichum lupini, штам Col-08, атрыманы ў 1999 г. з поля лубіна ў Вержэніцах, Польшча) і кантрольнымі (фіктыўна прышчэпленымі) раслінамі адзначаны над кропкамі дадзеных (*P-значэнне <0,05, **P-значэнне ≤ 0,01, ***P-значэнне ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表辍水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001)。接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物 之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Статыстычна значныя адрозненні ва ўзроўні экспрэсіі паміж інакуліраванымі (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, атрыманы з полей люпіна ў Вержэніцэ, Польшча, у 1999 г.) і кантрольнымі (ложна інакуліраванымі) раслінамі, адзначанымі над кропкамі дадзеных (* значэнне P < 0,05, ** P-значэнне ≤ 0,01, ***P-значэнне ≤ 0,001). Статыстычна значныя адрозненні ў узроўнях экспрэсіі паміж прышчэпленымі (Colletotrichum lupini, штам Col-08, атрыманы з палёў лубіна ў Вержаніцах, Польшча, у 1999 г.) і кантрольнымі (фіктыўна прышчэпленымі) раслінамі адзначаны над кропкамі дадзеных (*P-значэнне <0,05, **P-значэнне ≤ 0,01, ***P-значэнне ≤ 0,001).Прааналізаваныя лініі NLL: 83A:476 (устойлівая, з гомазіготным алелем Lanr1), Mandelup (умерана ўстойлівая, з гомазіготным алелем AnMan), Boregine (устойлівая, невядомая генетычная паходжанне) і папуляцыя 22660 (успрымальная).
Ген-кандыдат TanjilG_05042 у локуса Lanr1 паказаў прыкметна адрозную карціну экспрэсіі ад профіляў, атрыманых з даследаванняў РНК-seq (мал. 6e).Значная актывацыя гэтага гена назіралася ў Мандэлупа і папуляцыі 22660 (да 39,7 і 11,7 разоў адпаведна), што прывяло да адносна высокіх узроўняў экспрэсіі (да 1,4 ± 0,14 і 7,2 ± 1,3 адпаведна).83A:476 таксама паказала некаторую рэгуляцыю гена TanjilG_05042 (да 3,8 разоў), аднак дасягнутыя адносныя ўзроўні экспрэсіі (0,044 ± 0,002) былі больш чым у 30 разоў ніжэй, чым тыя, што назіраліся ў Mandelup і папуляцыі 22660.прааналізаваныя з дапамогай qPCR паказалі значныя адрозненні ў узроўнях экспрэсіі паміж генатыпамі ў фіктыўна вакцынаваных (кантрольных) варыянтах, дасягнуўшы 58-кратнай розніцы паміж папуляцыямі 22660 і 83A:476, а таксама паміж папуляцыямі 22660 і 22660. Двухразовая розніца была дасягнута паміж Boregine і Mandalup.
Ген-кандыдат у локусе AnMan, TanjilG_12861, быў актываваны ў адказ на вакцынацыю ў 83A:476 і Mandelup, быў нейтральным у папуляцыі 22660 і быў зніжаны ў Boregine (мал. 6f).Адносная экспрэсія гена TanjilG_12861 была найбольшай у прышчэпленых 83А: 476 (0,14±0,01).Ген бялку цеплавога шоку 17,4 кДа класа I TanjilG_05080 HSP17.4 паказаў больш нізкія адносныя ўзроўні экспрэсіі ва ўсіх вывучаных штамах і ў кропках часу (мал. 6g).Найбольшае значэнне назіралася пры 24 HPI ў 22660 папуляцыі (0,14 ± 0,02, васьміразовае павелічэнне ў адказ на вакцынацыю).
Параўнанне профіляў экспрэсіі генаў (мал. 7) выявіла высокую карэляцыю паміж TanjilG_10657 і чатырма іншымі генамі: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) і TanjilG_04706 (r = 0,79).Такія вынікі могуць сведчыць аб сумеснай рэгуляцыі гэтых генаў падчас абарончых рэакцый.Гены TanjilG_12861 і TanjilG_23384 паказалі розныя профілі экспрэсіі з больш нізкімі значэннямі каэфіцыента карэляцыі Пірсана (ад 0,08 да 0,43 і -0,19 да 0,28 адпаведна) у параўнанні з іншымі генамі.
Карэляцыі паміж профілямі экспрэсіі генаў былі выяўлены з дапамогай колькаснай ПЦР.Былі прааналізаваны наступныя лініі вузкалістага лубіна: 83A:476 (устойлівы, з гомазіготным алелем Lanr1), Mandelup (умерана ўстойлівы, з гомазіготным алелем AnMan), Boregine (устойлівы, генетычны фон невядомы) і папуляцыя 22660 (успрымальны).Былі разлічаны тры моманты часу (6, 12 і 24 гадзіны пасля прышчэпкі), у тым ліку прышчэпленыя (Colletotrichum lupini, штам Col-08, атрыманы з лубінавых палёў у Вержэніцах, Польшча, у 1999 г.) і кантрольныя (фіктыўна прышчэпленыя) расліны.Шкала паказвае значэнне каэфіцыента карэляцыі Пірсана.
На аснове дадзеных, атрыманых пры магутнасці 6 конскіх сіл на цалю, WGCNA была праведзена на 9981 DEG, ідэнтыфікаванай шляхам параўнання прышчэпленых і кантрольных раслін, каб засяродзіць увагу на ранніх абарончых рэакцыях (дадатковая табліца S12).Дваццаць два генныя модулі (кластары) былі знойдзены з карэляванымі (станоўчымі або адмоўнымі) профілямі экспрэсіі паміж генатыпамі і эксперыментальнымі варыянтамі. У сярэднім узровень экспрэсіі генаў зніжаўся ў парадку 83A:476 > Mandelup > Boregine > Папуляцыя 22660 (аднак у абодвух варыянтах гэтая тэндэнцыя была больш моцнай у кантрольных раслін). У сярэднім узровень экспрэсіі генаў зніжаўся ў парадку 83A:476 > Mandelup > Boregine > Папуляцыя 22660 (аднак у абодвух варыянтах гэтая тэндэнцыя была больш моцнай у кантрольных раслін). У сярэднім узроўні экспрэсіі генаў зніжаліся ў парадку 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (у абодвух варыянтах, аднак, гэтая тэндэнцыя была большай у кантрольных расценняў). У сярэднім узровень экспрэсіі генаў зніжаўся ў парадку 83A:476> Mandelup> Boregine> Папуляцыя 22660 (аднак у абодвух варыянтах гэтая тэндэнцыя была больш моцнай у кантрольных раслін).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Насельніцтва 22660 的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强Ｚ)。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> насельніцтва 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种 在在 植物 中 更）...... У сярэднім узроўні экспрэсіі генаў зніжаліся ў шэрагу 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (аднак у абодвух варыянтах гэтая тэндэнцыя была большай у кантрольных расценняў). У сярэднім узровень экспрэсіі генаў знізіўся ў серыі 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (аднак у абодвух варыянтах гэтая тэндэнцыя была больш моцнай у кантрольных раслін).Вакцынацыя прывяла да павышэння рэгуляцыі экспрэсіі генаў, асабліва ў модулях 18, 19, 14, 6 і 1 (у парадку змяншэння эфекту), адмоўнай рэгуляцыі (напрыклад, модулі 9 і 20) або з нейтральным эфектам (напрыклад, модулі 11, 22, 8 і 13).Аналіз узбагачэння тэрмінаў GO (дадатковая табліца S13) выявіў «GO: 0006952 Ахоўныя рэакцыі» для прышчэпленага модуля (18) з максімальнай актывацыяй, уключаючы гены, прааналізаваныя з дапамогай кПЦР (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 і TanjilG_27015), а таксама многія прышчэпкі, найбольш падаўленыя модулі фотасінтэзу (9).Канцэнтратар модуля 18 (мал. 8) быў ідэнтыфікаваны як ген TanjilG_26536, які кадуе PR-10-падобны бялок LlR18B, а канцэнтратар модуля 9 быў ідэнтыфікаваны як ген TanjilG_28955, які кадуе бялок фотасістэмы II PsbQ.Кандыдат у ген устойлівасці да антракнозу Lanr1, TanjilG_05042, быў знойдзены ў модулі 22 (мал. 9) і звязаны з тэрмінамі «GO:0044260 Клеткавыя макрамалекулярныя метабалічныя працэсы» і «GO:0006355 Рэгуляцыя транскрыпцыі, стварэнне шаблонаў ДНК», які змяшчае канцэнтратар TanjilG_01212.ген кадуе фактар ​​транскрыпцыі цеплавога стрэсу A-4a (HSFA4a).
Узважаны сеткавы аналіз сумеснай экспрэсіі генаў модуляў з празмерна прадстаўленымі тэрмінамі біялагічных працэсаў «GO: 0006952 абарончыя рэакцыі».Перавязка была спрошчана, каб вылучыць чатыры гены, прааналізаваныя з дапамогай кПЦР (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 і TanjilG_27015).
Узважаны сеткавы аналіз сумеснай экспрэсіі генаў модуля з празмерна прадстаўленым тэрмінам біялагічнага працэсу «GO: 0006355: рэгуляцыя транскрыпцыі, стварэнне шаблонаў ДНК» і носьбітам кандыдата ў ген устойлівасці да антракнозу Lanr1 TanjilG_05042.Перавязка была спрошчана для ізаляцыі гена TanjilG_05042 і цэнтральнага гена TanjilG_01212.
Скрынінг устойлівасці да антракнозу, сабраны ў Аўстраліі, паказаў, што большасць раней выпушчаных гатункаў былі адчувальныя;Kalya, Coromup і Mandelup былі апісаны як умерана ўстойлівыя, у той час як Wonga, Tanjil і 83A:476 былі апісаны як вельмі ўстойлівыя26,27,31.меў аднолькавы алель устойлівасці, пазначаны Lanr1, а ў Coromup і Mandelup быў іншы алель, пазначаны AnMan10, 26, 39, у той час як Kalya перадаў іншы алель., Lanr2.Скрынінг на ўстойлівасць да антракнозу ў Германіі прывёў да ідэнтыфікацыі ўстойлівай лініі Bo7212 з алелем-кандыдатам, адрозным ад Lanr1, пазначаным LanrBo36.
Наша даследаванне паказала вельмі нізкую частату (каля 6%) алеляў Lanr1 у доследнай зародкавай плазме.Гэта назіранне супадае з вынікамі скрынінга ўсходнееўрапейскай зародкавай плазмы з выкарыстаннем маркераў Anseq3 і Anseq4, якія паказалі, што алель Lanr1 прысутнічае толькі ў дзвюх беларускіх лініях.Гэта сведчыць аб тым, што алель Lanr1 яшчэ не шырока выкарыстоўваецца ў мясцовых селекцыйных праграмах, у адрозненне ад Аўстраліі, дзе гэта адзін з ключавых алеляў для селекцыі з дапамогай маркераў.Гэта можа быць звязана з больш нізкім узроўнем устойлівасці, які забяспечваецца алелем Lanr1 у еўрапейскіх палявых умовах у параўнанні з аўстралійскім дакладам.Акрамя таго, даследаванні антракноза ў раёнах з вялікай колькасцю ападкаў у Аўстраліі паказалі, што рэакцыі ўстойлівасці, апасродкаваныя алелем Lanr1, могуць быць неэфектыўнымі ў умовах надвор'я, якія спрыяюць росту і хуткаму развіццю ўзбуджальніка19,42.Фактычна, у дадзеным даследаванні некаторыя сімптомы антракноза таксама назіраліся ў генатыпаў, якія нясуць алель Lanr1, што сведчыць аб тым, што ўстойлівасць можа знікнуць пры аптымальных умовах для развіцця C. lupini.Акрамя таго, магчымая ілжывададатная інтэрпрэтацыя прысутнасці маркераў Anseq3 і Anseq4, якія знаходзяцца прыблізна ў 1 сМ ад локуса Lanr1 28,30,43.
Наша даследаванне паказала, што 83A:476, нясучы алель Lanr1, адказаў на прышчэпку C. lupini буйнамаштабным перапраграмаваннем транскрыптамаў у першы аналізаваны момант часу (6 hpi), у той час як у Mandelup, які нясе алель AnMan, транскрыптамічныя адказы назіраліся значна пазней.(ад 24 да 48 л.з.).Гэтыя часовыя змены ў ахоўных рэакцыях звязаны з адрозненнямі ў сімптомах захворвання, што падкрэслівае важнасць ранняга распазнання ўзбуджальніка для паспяховай рэакцыі на рэзістэнтнасць.Каб заразіць раслінную тканіну, спрэчкі сібірскай язвы павінны прайсці некалькі стадый развіцця на паверхні гаспадара, уключаючы прарастанне, дзяленне клетак і фарміраванне апрэсорыя.Прыдатак - гэта інфекцыйная структура, якая прымацоўваецца да паверхні гаспадара і палягчае пранікненне ў тканіны гаспадара.Так, спрэчкі C. gloeosporioides у экстракце гароху паказалі першае дзяленне ядра пасля 75-90 хвілін інкубацыі, адукацыя зародкавай трубкі праз 90-120 хвілін і падаўленне праз 4 гадзіны 45 .Манга C. gloeosporioides прадэманстраваў больш за 40% прарастання канідыяў пасля 3 гадзін інкубацыі і каля 20% адукацыі апрэсараў праз 4 гадзіны.Звязаны з вірулентнасцю ген CAP20 C. gloeosporioides праявіў транскрыпцыйную актыўнасць у канідыях, якія ўтвараюць эпіфіты, пасля 3,5 гадзін інкубацыі ў паверхневым воску авакада з высокай канцэнтрацыяй бялку CAP20 праз 4 гадзіны 46 хвілін.Аналагічным чынам, актыўнасць генаў біясінтэзу меланіну ў C. trifolii індукавалі падчас 2-гадзіннай інкубацыі з наступным адукацыяй апрессориума праз 1 гадзіну.Даследаванні тканін лісця паказалі, што трускаўкі, прышчэпленыя C. acutatum, маюць першае падаўленне пры 8 hpi, у той час як памідоры, прышчэпленыя C. coccodes, маюць першае падаўленне пры 4 hpi48,49.у значнай ступені адпавядае часовай шкале Colletotrichum spp.інфекцыйны працэс.Хуткія ахоўныя рэакцыі на 83A:476 мяркуюць удзел генаў устойлівасці раслін і эфектарнага імунітэту (ETI) у гэтай лініі, у той час як запаволеныя рэакцыі Мандэлупа пацвярджаюць гіпотэзу 50 імунітэту, выкліканага мікраасацыяваным малекулярным шаблонам (MTI). Раннія рэакцыі на 83A: 476 і Мандэлупа.Частковае перакрыцце паміж рэгуляванымі ўверх і ўніз генамі ў адтэрмінаванай рэакцыі таксама падтрымлівае гэтую канцэпцыю, паколькі ETI часта разглядаецца як паскораны і ўзмоцнены адказ MTI, які завяршаецца запраграмаванай гібеллю клетак у месцы інфекцыі, вядомай як анафілактіческій шок 51,52.
Большасць генаў, звязаных з празмерна прадстаўленым тэрмінам Gene Ontology GO:0006952 «Абарона», з'яўляюцца 11 гамолагамі выкліканага стрэсам бялку галадання 22 (падобнага на SAM22) і сямі асноўных латексных бялкоў (MLP).-падобныя вавёркі 31, 34, 43 і 423 паказалі падабенства паслядоўнасці.Гены, падобныя на SAM22, прадэманстравалі значную актывацыю, якая працягвалася даўжэй, дэманструючы павышаны ўзровень устойлівасці да антракнозу (83A:476 і Boregine).Тым не менш, MLP-падобныя гены былі зніжаны толькі ў лініях, якія нясуць алель кандыдата ўстойлівасці (83A:476/Lanr1 пры 6 hpi і Mandelup/AnMan пры 24 hpi).Варта адзначыць, што ўсе ідэнтыфікаваныя SAM22-падобныя гамолагі адбываюцца з кластара генаў, які ахоплівае прыблізна 105 кб, у той час як MLP-падобныя гены адбываюцца з асобных абласцей геному.Скаардынаваная актывацыя такіх SAM22-падобных генаў была таксама выяўлена ў нашым папярэднім даследаванні ўстойлівасці NLL да прышчэпкі Diaporthetoxica, мяркуючы, што яны ўдзельнічаюць у гарызантальных кампанентах абарончага адказу.Гэтая выснова таксама пацвярджаецца паведамленнямі аб станоўчай рэакцыі SAM22-падобных генаў на пашкоджанне або лячэнне саліцылавай кіслатой, грыбковымі індуктарамі або перакісам вадароду.
MLP-падобныя гены, як было паказана, рэагуюць на розныя абіятычныя і біятычныя стрэсы, уключаючы бактэрыяльныя, вірусныя і патагенныя грыбковыя інфекцыі ў многіх відах раслін55.Напрамкі рэакцыі на пэўныя ўзаемадзеянні паміж раслінамі і патагенамі вар'іраваліся ад моцнага ўзмацнення (напрыклад, падчас заражэння бавоўніка Verticillium dahliae) да значнага зніжэння (напрыклад, пасля заражэння яблыні Alternaria spp.)56,57.Значнае паніжэнне рэгуляцыі MLP-падобнага гена 423 назіралася падчас абароны авакада ад інфекцыі F. niger і падчас заражэння яблыні Botryosphaeria berengeriana f.сп.piricola і Alternaria alternata - пататыпы яблыні58,59.Акрамя таго, яблычныя каллусы, у якіх празмерна экспрэсіруецца MLP-падобны ген 423, мелі меншую экспрэсію генаў, звязаных з устойлівасцю, і былі больш успрымальныя да грыбковай інфекцыі59.Пасля Fusarium oxysporum f ген MLP-падобны 423 таксама быў падаўлены ва ўстойлівай зародкавай плазме звычайнай фасолі.сп.Бабовая інфекцыя 60.
Іншымі членамі сямейства PR-10, ідэнтыфікаванымі ў нашым даследаванні RNA-seq, былі гены LlR18A і LlR18B у адказ на рэгуляцыю, а таксама ген з павышанай рэгуляцыяй (1 ген) або паніжанай рэгуляцыяй (3 гены) для бялку пераносу ліпідаў DIR1..Акрамя таго, WGCNA вылучае ген LlR18B як цэнтр у гэтым модулі, які вельмі ўспрымальны да вакцынацыі і нясе некалькі генаў ахоўнай рэакцыі.Гены LlR18A і LlR18B былі індукаваны ў лісці жоўтага лубіна ў адказ на патагенныя бактэрыі, а таксама ў сцеблах NLL пасля прышчэпкі D. toxica, у той час як рысавы гамолаг гэтых генаў, RSOsPR10, быў хутка індукаваны грыбковай інфекцыяй, якая, як мяркуецца, удзельнічае ў сігнальным шляху язмонавай кіслаты53,61,62. Ген DIR1 кадуе неспецыфічны li pid транспартныя вавёркі, якія неабходныя для ўзнікнення сістэмнай набытай рэзістэнтнасці (SAR).Пры развіцці ахоўных рэакцый бялок DIR1 транспартуецца з агменю інфекцыі праз флаэму для індукцыі САР ў аддаленых органах.Цікава, што ген TanjilG_02313 DIR1 быў значна індукаваны ў першы момант часу ў лініях 84A:476 і папуляцыі 22660, але ўстойлівасць да антракнозу паспяхова развілася толькі ў лініі 84A:476.Гэта можа сведчыць аб некаторай субфункционализации гена DIR1 у NLL, так як астатнія тры гамолагі адказалі на прышчэпку толькі ў лініі 83A:476 пры 6 hpi, і гэты адказ быў накіраваны ўніз.
У нашым даследаванні найбольш распаўсюджанымі кампанентамі, якія адпавядаюць біялагічнаму працэсу пад назвай «GO:0055114 Акісляльна-аднаўленчы працэс», былі бялок цытахром P450, пероксидаза, 9S-/13S-липоксигеназа лінолевай кіслаты і аксідаза 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кіслаты.Акрамя таго, наша WGCNA вызначае гамолаг HSFA4a як цэнтр, які нясе модулі, такія як кандыдат у ген рэзістэнтнасці Lanr1 TanjilG_05042.HSFA4a з'яўляецца кампанентам акісляльна-аднаўленчай рэгуляцыі ядзернай транскрыпцыі ў раслін.
Вавёркі цытахрому Р450 - гэта аксідарэдуктазы, якія каталізуюць NADPH і/або O2-залежныя рэакцыі гідраксілявання ў першасным і другасным метабалізме, уключаючы метабалізм ксенабіётыкаў, а таксама гармонаў, тоўстых кіслот, стэролаў, кампанентаў клеткавай сценкі, біяпалімераў і біясінтэз ахоўных злучэнняў 69. У нашым даследаванні варыябельнасць функцыі цытахром Р450 знізілася з -1 0,6 log2 (кратнае змяненне) да 5,7 з-за вялікай колькасці змененых гамолагаў (37) і адрозненняў у мадэлях адказу паміж пэўнымі генамі, што адлюстроўвае перагляд у бок павышэння..Выкарыстанне толькі дадзеных RNA-seq для высвятлення меркаванай біялагічнай функцыі генаў NLL у такой вялікай суперсямействе бялкоў было б вельмі спекулятыўным.Аднак варта адзначыць, што некаторыя гены цытахром Р450 звязаны з падвышанай устойлівасцю да патагенных грыбоў або бактэрый, уключаючы ўклад у алергічныя рэакцыі69,70,71.
Пероксидазы класа III - гэта шматфункцыянальныя раслінныя ферменты, якія ўдзельнічаюць у шырокім дыяпазоне метабалічных працэсаў падчас росту і развіцця раслін, а таксама ў адказ на стрэсы навакольнага асяроддзя, такія як салёнасць, засуха, высокая інтэнсіўнасць святла і атака патагенаў72.Пероксидазы ўдзельнічаюць ва ўзаемадзеянні некалькіх відаў раслін з Anthracis, у тым ліку Stylosanthes humilis і C. gloeosporioides, Lens culinaris і C. truncatum, Phaseolus vulgaris і C. lindemuthianum, Cucumis sativus і C. lagenarium73,74,75,76.Рэакцыя вельмі хуткая, часам нават пры 4 HPI, перш чым грыбок пранікае ў тканку расліны73.Ген пероксидазы таксама адрэагаваў на прышчэпку D. toxica NLL.У дадатак да сваіх тыповых функцый па рэгуляцыі акісляльнага выбуху або ліквідацыі акісляльнага стрэсу пероксидазы могуць перашкаджаць росту патагенаў шляхам стварэння фізічных бар'ераў на аснове ўмацавання клеткавай сценкі падчас лигнификации, субадзінак або сшывання пэўных злучэнняў.Гэтую функцыю in silico можна аднесці да гена TanjilG_03329, які кадуе меркаваную лігнін-утваральную аніён-пероксидазу, якая значна павышалася ў нашым даследаванні ў лініі, устойлівай да 83A:476 пры 6 HPI, але не ў іншых штамах і ў момантах часу, якія не адказалі.
9S-/13S-липоксигеназа лінолевая кіслаты з'яўляецца першым крокам у акісляльным шляху біясінтэзу ліпідаў78.Прадукты гэтага шляху выконваюць мноства функцый у абароне раслін, уключаючы ўмацаванне клеткавай сценкі за кошт адукацыі калозных і пекцінавых адкладаў і рэгуляцыю акісляльнага стрэсу за кошт вытворчасці актыўных формаў кіслароду79,80,81,82,83.У дадзеным даследаванні экспрэсія 9S-/13S-ліпаксігеназы лінолевай кіслаты была зменена ва ўсіх штамах, але ў адчувальнай папуляцыі 22660 у розныя моманты часу пераважала павышэнне рэгуляцыі, у той час як у штамах, якія нясуць устойлівы Lanr1 і алель AnMan, гэта падкрэслівае дыверсіфікацыю аксіліпінавага пласта ў ахоўных рэакцыях сібірскай язвы паміж гэтымі генатыпамі.
Гамолаг 1-амінацыклапрапан-1-карбаксілатаксідазы (ACO) быў значна павышаны (9 генаў) або зніжаны (2 гены) пры прышчэпцы лубінам.За двума выключэннямі, усе гэтыя адказы адбыліся пры магутнасці 6 к.с.на 83А:476.Ферментатыўная рэакцыя, апасродкаваная вавёркамі ACO, з'яўляецца этапам, які абмяжоўвае хуткасць у вытворчасці этылену, і таму вельмі рэгулюецца84.Этылен - гэта раслінны гармон, які выконвае розныя ролі ў рэгуляцыі развіцця раслін і рэакцыі на абіятычныя і біятычныя стрэсавыя ўмовы.Індукцыя транскрыпцыі ACO і актывацыя сігнальнага шляху этылену ўдзельнічаюць у павышэнні ўстойлівасці рысу да гемібіятрофнага грыба oryzae oryzae шляхам рэгуляцыі вытворчасці актыўных формаў кіслароду і фітаалексінаў.Вельмі падобны працэс заражэння лісця, выяўлены паміж M. oryzae і C. lupini88,89, на фоне значнага ўзмацнення рэгуляцыі гамолагаў ACO ў лініі 83A:476, пра што паведамляецца ў гэтым даследаванні, ссоўвае магчымасць надання ўстойлівасці да NLL антракнозу этылену як цэнтральны сігнальны этап у малекулярных шляхах.
У дадзеным даследаванні буйнамаштабнае падаўленне многіх генаў, звязаных з фотасінтэзам, назіралася пры 6 hpi у 83A:476 і пры 48 hpi у Мандэлупа і насельніцтва 22660.Ступень і прагрэсаванне гэтых змяненняў прапарцыйныя ўзроўню.У гэтым эксперыменце назіралася ўстойлівасць да антракноза.Нядаўна было зафіксавана моцнае і ранняе падаўленне транскрыптаў, звязаных з фотасінтэзам, у некалькіх мадэлях узаемадзеянняў раслін-патагенаў, у тым ліку патагенных бактэрый і грыбоў.Паспешлівасць (ад 2 HPI пры некаторых узаемадзеяннях) і глабальнае падаўленне генаў, звязаных з фотасінтэзам, у адказ на інфекцыю могуць выклікаць імунітэт раслін, заснаваны на разгортванні актыўных формаў кіслароду і іх узаемадзеянні са шляхам саліцылавай кіслаты для апасродкавання алергічных рэакцый 90,94.
У заключэнне, механізмы ахоўнага адказу, прапанаваныя для найбольш устойлівай лініі (83A:476), уключаюць хуткае распазнаванне ўзбуджальніка генам R (меркавана TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) і сігналізацыю саліцылавай кіслаты і этылену, апасродкаваную алергічнай рэакцыяй, з наступным усталяваннем SAR далёкага дзеяння.дзеянне падтрымліваецца бялком DIR-1.Варта адзначыць, што біятрофны перыяд для інфекцыі C. lupini вельмі кароткі (прыкладна 2 дні), пасля чаго адбываецца некратычны рост95.Пераход паміж гэтымі стадыямі можа быць звязаны з некрозам і экспрэсіяй этылен-індукаваных бялкоў, якія дзейнічаюць як трыгеры для рэакцый гіперчувствітельності ў раслінах-гаспадарах.Такім чынам, часовае акно для паспяховага адлову C. lupini на біятрофнай стадыі вельмі вузкае.Перапраграмаванне генаў, звязаных з акісляльна-аднаўленчым працэсам і фотасінтэзам, назіранае ў 83A:476 пры 6 hpi, адпавядае прагрэсуванню гіф грыба і прадвесціць развіццё паспяховай ахоўнай рэакцыі на біятрофнай стадыі.Транскрыптамічныя рэакцыі Mandelup і папуляцыі 22660 могуць быць занадта адтэрмінаванымі, каб захапіць грыб перад пераключэннем на некратычны рост, аднак Mandelup можа быць больш эфектыўным, чым папуляцыя 22660, таму што адносна хуткая рэгуляцыя бялку PR-10 спрыяе гарызантальнай рэзістэнтнасці.
ETI, абумоўлены кананічным генам R, здаецца, з'яўляецца агульным механізмам устойлівасці фасолі да антракноза.Такім чынам, у мадэльнай бабовай расліны Medicago truncatula ўстойлівасць да антракнозу забяспечваецца генам RCT1, членам класа R генаў раслін TIR-NBS-LRR97.Гэты ген таксама забяспечвае ўстойлівасць да антракноза шырокага спектру ў люцэрны пры пераносе на адчувальныя расліны.У звычайнай фасолі (P. vulgaris) на сённяшні дзень выяўлена больш за два дзясяткі генаў устойлівасці да антракноза.Некаторыя з гэтых генаў знаходзяцца ў рэгіёнах, дзе адсутнічаюць кананічныя гены R, аднак многія іншыя размешчаны па краях храмасом, якія нясуць кластар генаў NBS-LRR, у тым ліку TIR-NBS-LRRs99.Агульнагеномнае даследаванне SSR таксама пацвердзіла сувязь гена NBS-LRR з устойлівасцю да антракноза ў звычайнай фасолі.Кананічны ген R таксама быў знойдзены ў геномнай вобласці, якая нясе асноўны локус устойлівасці да антракнозу ў белага лубіна 101.
Наша праца паказвае, што неадкладная рэакцыя рэзістэнтнасці, якая актывуецца на ранняй стадыі заражэння расліны (пажадана не пазней за 12 hpi), эфектыўна абараняе лубін узколистный ад антракноза, выкліканага патагенным грыбом Collelotrichum lupini.Выкарыстоўваючы высокапрадукцыйнае секвенирование, мы прадэманстравалі дыферэнцыяльныя профілі экспрэсіі генаў устойлівасці да антракноза ў раслінах NLL, апасродкаваных генамі ўстойлівасці Lanr1 і AnMan.Паспяховая абарона прадугледжвае стараннае распрацоўку генаў для бялкоў, якія ўдзельнічаюць у акісляльна-аднаўленчым працэсе, фотасінтэзе і патагенезе на працягу некалькіх гадзін пасля першага кантакту расліны з узбуджальнікам.Падобныя ахоўныя рэакцыі, але адтэрмінаваныя ў часе, значна менш эфектыўныя ў абароне раслін ад хвароб.Устойлівасць да сібірскай язвы, апасродкаваная генам Lanr1, нагадвае тыповую хуткую рэакцыю гена R (імунітэт, выкліканы эфектарамі), у той час як ген AnMan, хутчэй за ўсё, забяспечвае гарызантальны адказ (імунітэт, выкліканы малекулярным патэрнам, звязаным з мікробамі), забяспечваючы ўмераны ўзровень устойлівасці.
215 ліній NLL, якія выкарыстоўваліся для скрынінга маркераў антракнозу, складаліся з 74 гатункаў, 60 ліній, атрыманых шляхам скрыжавання або селекцыі, 5 мутантаў і 76 дзікіх або арыгінальных зародкавых плазм.Лініі былі з 17 краін, у асноўным з Польшчы (58), Іспаніі (47), Германіі (27), Аўстраліі (26), Расіі (19), Беларусі (7), Італіі (5) і іншых ліній.з 10 краін.У набор таксама ўваходзяць эталонныя ўстойлівыя лініі: 83A:476, Tanjil, Wonga з алелем Lanr1 і Mandelup з алелем AnMan.Лініі былі атрыманы з Еўрапейскай базы дадзеных генетычных рэсурсаў лубіна, якую падтрымлівае Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Польшча (дадатковая табліца S1).
Расліны вырошчвалі ў кантраляваных умовах (светлавы перыяд 16 гадзін, тэмпература 25 ° C днём і 18 ° C ноччу).Былі прааналізаваны дзве біялагічныя паўторы.ДНК была вылучана з трохтыднёвых лісця з дапамогай DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германія) у адпаведнасці з пратаколам.Якасць і канцэнтрацыю вылучанай ДНК ацэньвалі спектрафатаметрычнымі метадамі (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).Маркер AnManM1, які пазначае ген устойлівасці да антракнозу AnMan (паходзіць з сорту Mandelup), і маркеры Anseq3 і Anseq4, фланкуючыя ген Lanr1 (паходзіць з сорту Tanjil), былі прааналізаваны 11,26,28.Гомозиготы па ўстойліваму алелю ацэньваліся як «1», успрымальныя - як «0», а гетерозиготы - як 0,5.
На падставе вынікаў скрынінга на маркеры AnManM1, AnSeq3 і AnSeq4 і наяўнасці насення для канчатковых наступных эксперыментаў было адабрана 50 ліній NLL для фенатыпавання ўстойлівасці да антракнозу.Аналіз праводзілі ў дублікаце ў аранжарэі з камп'ютэрным кіраваннем з 14-гадзінным фотаперыядам з дыяпазонам тэмператур 22°C днём і 19°C ноччу.Насенне праскрабаюць (зразаючы вострым лязом насенную абалонку з процілеглага боку зародка) перад пасевам, каб прадухіліць спакой насення з-за занадта цвёрдай абалонкі і забяспечыць раўнамернае прарастанне.Расліны вырошчвалі ў чыгунах (11 × 11 × 21 см) са стэрыльнай глебай (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Варшава, Польшча).Інакуляцыя была праведзена штамам Colletotrichum lupini Col-08, вырашчаным у 1999 г. са сцеблаў раслін вузкалістага лубіна, вырашчаных на полі ў Вержаніцы, Вялікая Польшча (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E ).Атрымаць плошчу.Ізаляты культывавалі ў асяроддзі SNA пры 20°C пры чорным святле на працягу 21 дня, каб выклікаць спорообразование.Праз чатыры тыдні пасля пасева, калі расліны дасягнулі стадыі 4-6 лісця, правялі інакуляцыю шляхам апырсквання завіссю конидий ў канцэнтрацыі 0,5 х 106 конидий на мл.Пасля прышчэпкі расліны вытрымлівалі ў цемры на працягу 24 гадзін пры вільготнасці каля 98% і тэмпературы 25 ° С для палягчэння прарастання конидий і працэсу заражэння.Затым расліны вырошчвалі ў 14-гадзінным светлавым перыядзе пры 22°C днём/19°C ноччу і 70% вільготнасці.Ацэнка захворвання была зроблена праз 22 дні пасля інакуляцыі і вагалася ад 0 (імуны) да 9 (вельмі адчувальны) у залежнасці ад наяўнасці або адсутнасці некратычных паражэнняў на сцеблах і лісці.Акрамя таго, пасля падліку балаў вымяралася маса раслін.Адносіны паміж генатыпамі маркераў і фенатыпамі захворвання разлічвалі як кропкавыя карэляцыі двух паслядоўнасцяў (адсутнасць гетерозиготных маркераў у наборы ліній для аналізу фенатыпу ўстойлівасці да антракнозу).