Дзякуй за наведванне Nature.com.Версія браўзера, якую вы выкарыстоўваеце, мае абмежаваную падтрымку CSS.Для найлепшага вопыту мы рэкамендуем вам выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer).Тым часам, каб забяспечыць бесперапынную падтрымку, мы будзем візуалізаваць сайт без стыляў і JavaScript.
Існуе неабходнасць у надзейнай сістэме in vitro, якая можа дакладна прайграваць фізіялагічнае асяроддзе сэрца для тэставання лекаў.Абмежаваная даступнасць сістэм культывавання тканак сэрца чалавека прывяла да недакладнай інтэрпрэтацыі эфектаў лекаў на сэрца.Тут мы распрацавалі мадэль культуры сардэчнай тканіны (CTCM), якая электрамеханічна стымулюе зрэзы сэрца і падвяргаецца фізіялагічнаму расцяжэнню падчас сісталічнай і дыясталічнай фаз сардэчнага цыклу.Пасля 12 дзён культывавання гэты падыход часткова палепшыў жыццяздольнасць аддзелаў сэрца, але не цалкам захаваў іх структурную цэласнасць.Такім чынам, пасля скрынінга невялікіх малекул мы выявілі, што даданне 100 нМ трійодтіроніна (T3) і 1 мкМ дексаметазона (Dex) у наша асяроддзе падтрымлівае мікраструктуру зрэзаў на працягу 12 дзён.У спалучэнні з лячэннем T3/Dex сістэма CTCM падтрымлівала профілі транскрыпцыі, жыццяздольнасць, метабалічную актыўнасць і структурную цэласнасць на тым жа ўзроўні, што і свежая тканіна сэрца на працягу 12 дзён.Акрамя таго, празмернае расцяжэнне сардэчнай тканіны ў культуры выклікае гіпертрафічную сардэчную сігналізацыю, што сведчыць аб здольнасці CTCM імітаваць гіпертрафічныя стану, выкліканыя сардэчным расцяжэннем.У заключэнне, CTCM можа мадэляваць фізіялогію і патафізіялогію сэрца ў культуры на працягу працяглых перыядаў часу, што дазваляе надзейны скрынінг лекаў.
Перад клінічнымі даследаваннямі неабходныя надзейныя сістэмы in vitro, якія могуць дакладна прайграваць фізіялагічнае асяроддзе чалавечага сэрца.Такія сістэмы павінны імітаваць змененае механічнае расцяжэнне, частату сардэчных скарачэнняў і электрафізіялагічныя ўласцівасці.Мадэлі на жывёл звычайна выкарыстоўваюцца ў якасці скрынінгавай платформы для фізіялогіі сэрца з абмежаванай надзейнасцю ў адлюстраванні ўздзеяння лекаў на сэрца чалавека1,2.У канчатковым рахунку, эксперыментальная мадэль культуры сардэчнай тканіны (CTCM) - гэта мадэль, якая з'яўляецца вельмі адчувальнай і спецыфічнай для розных тэрапеўтычных і фармакалагічных умяшанняў, дакладна прайграваючы фізіялогію і патафізіялогію чалавечага сэрца3.Адсутнасць такой сістэмы абмяжоўвае адкрыццё новых метадаў лячэння сардэчнай недастатковасці4,5 і прывяло да таго, што кардыятаксічнасць прэпарата з'яўляецца асноўнай прычынай сыходу з рынку6.
За апошняе дзесяцігоддзе восем лекаў, якія не адносяцца да сардэчна-сасудзістай сістэмы, былі выведзены з клінічнага выкарыстання, таму што яны выклікаюць падаўжэнне інтэрвалу QT, што прыводзіць да жалудачкавай арытміі і раптоўнай смерці7.Такім чынам, узрастае патрэба ў надзейных даклінічных стратэгіях скрынінга для ацэнкі сардэчна-сасудзістай эфектыўнасці і таксічнасці.Нядаўняе выкарыстанне індукаваных чалавекам плюрыпатэнтных кардыяміяцытаў, атрыманых з ствалавых клетак (hiPS-CM), у скрынінгу лекаў і тэставанні на таксічнасць забяспечвае частковае рашэнне гэтай праблемы.Аднак няспелая прырода hiPS-CMs і адсутнасць мнагаклетачнай складанасці сардэчнай тканіны з'яўляюцца асноўнымі абмежаваннямі гэтага метаду.Нядаўнія даследаванні паказалі, што гэта абмежаванне можна часткова пераадолець, выкарыстоўваючы ранні hiPS-CM для фарміравання гідрагеляў сардэчнай тканіны неўзабаве пасля пачатку спантанных скарачэнняў і паступова павялічваючы электрычную стымуляцыю з цягам часу.Аднак гэтыя мікратканіны hiPS-CM не маюць спелых электрафізіялагічных і скарачальных уласцівасцей міякарда дарослага чалавека.Акрамя таго, сардэчная тканіна чалавека мае больш складаную структуру, якая складаецца з гетэрагеннай сумесі розных тыпаў клетак, у тым ліку эндотелиальных клетак, нейронаў і стромальных фібрабластаў, злучаных паміж сабой спецыфічнымі наборамі бялкоў пазаклеткавага матрікса.Гэтая гетэрагеннасць папуляцый некардыяміяцытаў11,12,13 у сэрцы дарослых млекакормячых з'яўляецца галоўнай перашкодай для мадэлявання сардэчнай тканіны з выкарыстаннем асобных тыпаў клетак.Гэтыя асноўныя абмежаванні падкрэсліваюць важнасць распрацоўкі метадаў культывавання непашкоджанай тканіны міякарда ў фізіялагічных і паталагічных умовах.
Культываванне тонкіх (300 мкм) зрэзаў чалавечага сэрца апынулася перспектыўнай мадэллю непашкоджанага міякарда чалавека.Гэты метад забяспечвае доступ да поўнай трохмернай мнагаклетачнай сістэмы, падобнай да тканіны сэрца чалавека.Аднак да 2019 г. выкарыстанне культывавання зрэзаў сэрца было абмежавана кароткай (24 гадзіны) выжывальнасцю культуры.Гэта адбываецца з-за шэрагу фактараў, уключаючы адсутнасць фізіка-механічнага расцяжэння, межы паветра-вадкасці і выкарыстанне простых асяроддзяў, якія не падтрымліваюць патрэбы сардэчнай тканіны.У 2019 годзе некалькі даследчых груп прадэманстравалі, што ўключэнне механічных фактараў у сістэмы культуры сардэчнай тканіны можа падоўжыць жыццё культуры, палепшыць сардэчную экспрэсію і імітаваць сардэчную паталогію.Два элегантных даследаванні 17 і 18 паказваюць, што аднавосевая механічная нагрузка аказвае станоўчы ўплыў на сардэчны фенатып падчас культуры.Аднак у гэтых даследаваннях не выкарыстоўвалася дынамічная трохмерная фізіка-механічная нагрузка сардэчнага цыклу, паколькі аддзелы сэрца нагружаліся альбо ізаметрычнымі сіламі расцяжэння 17, альбо лінейнай аўксатанічнай нагрузкай 18.Гэтыя метады расцяжэння тканіны прывялі да падаўлення многіх сардэчных генаў або празмернай экспрэсіі генаў, звязаных з анамальнай рэакцыяй на расцяжэнне.У прыватнасці, Pitoulis і соавт.19 распрацавалі дынамічную культуральную ванну для зрэзу сэрца для рэканструкцыі сардэчнага цыклу з выкарыстаннем зваротнай сувязі датчыка сілы і прывадаў напружання.Хоць гэтая сістэма дазваляе больш дакладна мадэляваць сардэчны цыкл in vitro, складанасць і нізкая прадукцыйнасць метаду абмяжоўвае прымяненне гэтай сістэмы.Наша лабараторыя нядаўна распрацавала спрошчаную сістэму культывавання з выкарыстаннем электрастымуляцыі і аптымізаванай асяроддзя для падтрымання жыццяздольнасці зрэзаў тканін сэрца свінні і чалавека на працягу да 6 дзён20,21.
У бягучай рукапісы мы апісваем мадэль культуры сардэчнай тканіны (CTCM) з выкарыстаннем секцый свінога сэрца, якія ўключаюць гумаральныя сігналы для паўтарэння трохмернай фізіялогіі сэрца і патафізіялагічнага расцяжэння падчас сардэчнага цыклу.Гэты CTCM можа павысіць дакладнасць даклінічнага прагназавання лекаў да ўзроўню, які ніколі раней не дасягаўся, забяспечваючы эканамічна эфектыўную сардэчную сістэму сярэдняй прапускной здольнасці, якая імітуе фізіялогію/патафізіялогію сэрца млекакормячых для даклінічных выпрабаванняў лекаў.
Гемадынамічныя механічныя сігналы гуляюць вырашальную ролю ў падтрыманні функцыі кардыяміяцытаў in vitro 22,23,24.У бягучай манускрыпце мы распрацавалі CTCM (малюнак 1а), які можа імітаваць сардэчную сераду дарослых, выклікаючы як электрычную, так і механічную стымуляцыю на фізіялагічных частотах (1,2 Гц, 72 удары ў хвіліну).Каб пазбегнуць празмернага расцяжэння тканіны падчас дыясталы, прылада 3D-друку выкарыстоўвалася для павелічэння памеру тканіны на 25% (мал. 1b).Электрычная стымуляцыя, выкліканая сістэмай C-PACE, была прымеркавана да пачатку за 100 мс да сістолы з дапамогай сістэмы збору даных для поўнага прайгравання сардэчнага цыклу.Сістэма культуры тканін выкарыстоўвае праграмуемы пнеўматычны прывад (LB Engineering, Германія) для цыклічнага пашырэння гнуткай сіліконавай мембраны, каб выклікаць пашырэнне зрэзаў сэрца ў верхняй камеры.Сістэма была падключана да вонкавай паветраводу праз датчык ціску, што дазваляла дакладна рэгуляваць ціск (± 1 мм рт. сл.) і час (± 1 мс) (мал. 1в).
a Прымацуеце ўчастак тканіны да 7-мм апорнага кольцы, паказанага сінім колерам, у культуральнай камеры прылады.Культуральная камера аддзеленая ад паветранай тонкай гнуткай сіліконавай мембранай.Змесціце пракладку паміж кожнай камерай, каб прадухіліць уцечкі.Вечка прыбора змяшчае графітавыя электроды, якія забяспечваюць электрастымуляцыю.b Схематычнае ўяўленне аб вялікім прыборы для тканак, накіроўвалым і апорным кольцы.Зрэзы тканіны (карычневыя) размяшчаюцца на прыладзе вялікага памеру з накіроўвалым кольцам, размешчаным у канаўцы на вонкавым краі прылады.Выкарыстоўваючы накіроўвалую, асцярожна размесціце апорнае кольца, пакрытае тканкавым акрылавым клеем, на ўчастак сардэчнай тканіны.c Графік, які паказвае час электрычнай стымуляцыі ў залежнасці ад ціску ў паветранай камеры, які кіруецца праграмуемым пнеўматычным прывадам (PPD).Для сінхранізацыі электрастымуляцыі з дапамогай датчыкаў ціску выкарыстоўвалася прылада збору дадзеных.Калі ціск у культуральнай камеры дасягае зададзенага парога, на C-PACE-EM пасылаецца імпульсны сігнал для запуску электрастымуляцыі.d Відарыс чатырох CTCM, размешчаных на паліцы інкубатара.Чатыры прылады падключаюцца да аднаго PPD праз пнеўматычны контур, а датчыкі ціску ўстаўляюцца ў кровоостанаўліваюшчым клапан для кантролю ціску ў пнеўматычным контуры.Кожны прыбор змяшчае шэсць зрэзаў тканіны.
Выкарыстоўваючы адзін пнеўматычны прывад, мы змаглі кіраваць 4 прыладамі CTCM, кожнае з якіх магло ўтрымліваць 6 зрэзаў тканін (мал. 1d).У CTCM ціск паветра ў паветранай камеры пераўтворыцца ў сінхронны ціск у вадкаснай камеры і выклікае фізіялагічнае пашырэнне зрэзу сэрца (малюнак 2а і дадатковы фільм 1).Ацэнка расцяжэння тканін пры 80 мм рт.арт.паказалі расцяжэнне зрэзаў тканіны на 25% (мал. 2б).Было паказана, што гэты працэнт расцяжэння адпавядае фізіялагічнай даўжыні саркомера 2,2-2,3 мкм для нармальнай скарачальнасці аддзела сэрца17,19,25.Рух тканіны ацэньвалі з дапамогай карыстацкіх налад камеры (дадатковы малюнак 1).Амплітуда і хуткасць руху тканін (мал. 2в, г) адпавядалі расцяжэння падчас сардэчнага цыклу і часу падчас сістолы і дыясталы (мал. 2б).Расцяжэнне і хуткасць сардэчнай тканіны падчас скарачэння і паслаблення заставаліся нязменнымі на працягу 12 дзён у культуры (мал. 2f).Каб ацаніць уплыў электрычнай стымуляцыі на скарачальную здольнасць падчас культывавання, мы распрацавалі метад вызначэння актыўнай дэфармацыі з выкарыстаннем алгарытму зацянення (дадатковы мал. 2a, b) і змаглі адрозніць дэфармацыі з электрычнай стымуляцыяй і без яе.Такі ж разрэз сэрца (мал. 2f).У рухомай вобласці разрэзу (R6-9) напружанне пры электрастымуляцыі было на 20% вышэй, чым пры адсутнасці электрастымуляцыі, што паказвае на ўклад электрастымуляцыі ў скарачальную функцыю.
Рэпрэзентатыўныя сляды вымярэнняў ціску ў паветранай камеры, ціску ў вадкаснай камеры і руху тканіны пацвярджаюць, што ціск у камеры змяняе ціск у вадкаснай камеры, выклікаючы адпаведны рух зрэзу тканіны.b Рэпрэзентатыўныя сляды працэнта расцяжэння (сіні) зрэзаў тканіны, якія адпавядаюць працэнту расцяжэння (аранжавы).c Вымеранае рух зрэзу сэрца адпавядае вымеранай хуткасці руху.(D) Рэпрэзентатыўныя траекторыі цыклічнага руху (сіняя лінія) і хуткасці (аранжавая пункцірная лінія) у зрэзе сэрца.e Колькасная ацэнка часу цыклу (n = 19 зрэзаў на групу, ад розных свіней), часу скарачэння (n = 19 зрэзаў на групу), часу рэлаксацыі (n = 19 зрэзаў на групу, з розных свіней), руху тканін (n = 25).зрэзы)/група ад розных свіней), пікавая сісталічны хуткасць (n = 24(D0), 25(D12) зрэзаў/група з розных свіней) і пікавая хуткасць рэлаксацыі (n=24(D0), 25(D12) зрэзаў/група з розных свіней).Двухбаковы t-крытэр Ст'юдэнта не паказаў істотнай розніцы ні ў адным з параметраў.f Рэпрэзентатыўны аналіз дэфармацыі слядоў зрэзаў тканіны з (чырвоным) і без (сінім) электрастымуляцыяй, дзесяць рэгіянальных участкаў зрэзаў тканіны з таго ж зрэзу.Ніжнія панэлі паказваюць колькасную ацэнку працэнтнай розніцы ў дэфармацыі ў зрэзах тканін з электрычнай стымуляцыяй і без яе ў дзесяці абласцях розных зрэзаў. (n = 8 зрэзаў/групу ад розных свіней, выконваецца двухбаковы t-крытэрый Ст'юдэнта; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 зрэзаў/групу ад розных свіней, выконваецца двухбаковы t-крытэрый Ст'юдэнта; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 зрэзаў/групу ад розных свіней, праводзіцца двухбаковы t-крытэрый Сцюдэнта; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 секцый/група з розных свіней, двухбаковы t-крытэрый Ст'юдэнта; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0,0001，**p<0,01，*p<0,05）. （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0,0001，**p<0,01，*p<0,05）. (n = 8 срэзаў/групу, ад розных свіней, двухбаковы крытэрый Сцюдэнта; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 секцый/група, ад розных свіней, двухбаковы t-крытэрый Ст'юдэнта; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Слупкі памылак прадстаўляюць сярэдняе ± стандартнае адхіленне.
У нашай папярэдняй статычнай біяміметычнай сістэме культуры зрэзаў сэрца [20, 21] мы падтрымлівалі жыццяздольнасць, функцыю і структурную цэласнасць зрэзаў сэрца на працягу 6 дзён шляхам прымянення электрычнай стымуляцыі і аптымізацыі складу асяроддзя.Аднак праз 10 дзён гэтыя лічбы рэзка знізіліся.Мы будзем спасылацца на раздзелы, культываваныя ў нашай папярэдняй статычнай біяміметычнай сістэме культуры 20, 21 з кантрольнымі ўмовамі (Ctrl), і мы будзем выкарыстоўваць нашу раней аптымізаваную сераду ў якасці ўмоў MC і культуры пры адначасовай механічнай і электрычнай стымуляцыі (CTCM).называецца .Па-першае, мы вызначылі, што механічнай стымуляцыі без электрычнай стымуляцыі было недастаткова для падтрымання жыццяздольнасці тканіны на працягу 6 дзён (дадатковая мал. 3a, b).Цікава, што з увядзеннем фізія-механічнай і электрычнай стымуляцыі з дапамогай STCM жыццяздольнасць 12-дзённых зрэзаў сэрца заставалася такой жа, як і ў свежых зрэзах сэрца ва ўмовах РС, але не ва ўмовах Ctrl, як паказаў МТТ-аналіз (мал. 1).3а).Гэта сведчыць аб тым, што механічная стымуляцыя і мадэляванне сардэчнага цыклу могуць падтрымліваць жыццяздольнасць зрэзаў тканін удвая даўжэй, чым паведамлялася ў нашай папярэдняй сістэме статычнай культуры.Аднак ацэнка структурнай цэласнасці зрэзаў тканін шляхам імуннай маркіроўкі сардэчнага тропонина Т і коннексина 43 паказала, што экспрэсія коннексина 43 была значна вышэй у тканінах MC на 12 дзень, чым у кантрольнай групе ў той жа дзень.Аднак раўнамерная экспрэсія коннексина 43 і фарміраванне Z-дыска не падтрымліваліся цалкам (мал. 3b).Мы выкарыстоўваем структуру штучнага інтэлекту (AI) для колькаснай ацэнкі структурнай цэласнасці тканіны26, канвеер глыбокага навучання на аснове малюнкаў, заснаваны на афарбоўванні трапанін-Т і каннексінам43 для аўтаматычнай колькаснай ацэнкі структурнай цэласнасці і флуарэсцэнцыі зрэзаў сэрца з пункту гледжання сілы лакалізацыі.У гэтым метадзе выкарыстоўваецца згорткавая нейронавая сетка (CNN) і структура глыбокага навучання для надзейнай колькаснай ацэнкі структурнай цэласнасці сардэчнай тканіны аўтаматызаваным і бесстароннім спосабам, як апісана ў даведцы.26. Тканіна MC паказала большае структурнае падабенства да дня 0 у параўнанні са статычнымі кантрольнымі зрэзамі.Акрамя таго, трыхромнае афарбоўванне па Масане паказала значна меншы працэнт фіброзу ва ўмовах РС у параўнанні з кантрольнымі ўмовамі на 12-ы дзень культуры (мал. 3с).У той час як CTCM павялічвала жыццяздольнасць зрэзаў тканіны сэрца на 12-ы дзень да ўзроўню, аналагічнага ўзроўню свежай тканіны сэрца, яна істотна не паляпшала структурную цэласнасць зрэзаў сэрца.
гістаграма паказвае колькасную ацэнку жыццяздольнасці МТТ свежых зрэзаў сэрца (D0) або культуры зрэзаў сэрца на працягу 12 дзён альбо ў статычнай культуры (D12 Ctrl), альбо ў CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) зрэзаў/групу ад розных свіней, праводзіцца аднабаковы тэст ANOVA; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0 і **p <0,01 у параўнанні з D12 Ctrl). гістаграма паказвае колькасную ацэнку жыццяздольнасці МТТ свежых зрэзаў сэрца (D0) або культывавання зрэзаў сэрца на працягу 12 дзён альбо ў статычнай культуры (D12 Ctrl), альбо ў CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) зрэзаў/групу ад розных свіней, праводзіцца аднабаковы тэст ANOVA; ####p < 0,0001 у параўнанні да D0 і **p <0,01 у параўнанні з D12 Ctrl).гістаграма паказвае колькасную ацэнку жыццяздольнасці МТТ свежых зрэзаў сэрца (D0) або культуры зрэзаў сэрца на працягу 12 дзён альбо ў статычнай культуры (кантроль D12), альбо CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 кантроль). ), 12 (D12 MC) зрэзаў/груп ад розных свіней, выконваецца аднабаковы тэст ANOVA;####p < 0,0001 у параўнанні з D0 і **p < 0,01 у параўнанні з D12 Ctrl). ####p <0,0001 у параўнанні з D0 і **p <0,01 у параўнанні з D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) 或心脏切片培养12天的MTT 活力的量化), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向 ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001 ，与D12 Ctrl 相比，**p <0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向 ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)гістаграма, якая паказвае колькасную ацэнку жыццяздольнасці МТТ у свежых зрэзах сэрца (D0) або зрэзах сэрца, культываваных на працягу 12 дзён у статычнай культуры (кантроль D12) або CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 кантроль)), 12 (D12 MC) зрэзаў/груп ад розных свіней, аднабаковы тэст ANOVA;####p < 0,0001 у параўнанні з D0, **p < 0,01 у параўнанні з D12 Ctrl). ####p <0,0001 у параўнанні з D0, **p <0,01 у параўнанні з D12 Ctrl).b Трапанін-Т (зялёны), каннексін 43 (чырвоны) і DAPI (сіні) у толькі што ізаляваных зрэзах сэрца (D0) або зрэзах сэрца, культываваных у статычных умовах (Ctrl) або ва ўмовах CTCM (MC) на працягу 12 дзён) рэпрэзентатыўных імунафлюарэсцэнтных малюнкаў (пустая шкала = 100 мкм). Колькасная ацэнка структурнай цэласнасці сардэчнай тканіны з дапамогай штучнага інтэлекту (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) зрэзаў/група кожны з розных свіней, выконваецца аднабаковы тэст ANOVA; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0 і ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). Колькасная ацэнка структурнай цэласнасці сардэчнай тканіны з дапамогай штучнага інтэлекту (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) зрэзаў/група кожны з розных свіней, выконваецца аднабаковы тэст ANOVA; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0 і ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). Количественная ацэнка структурнай цэласнасці сардэчнай тканіны штучным інтэлектам (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) зрэзаў/груп ад розных свіней, праводзіцца аднафактарны тэст ANOVA; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0 і ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). Колькасная ацэнка структурнай цэласнасці сардэчнай тканіны з дапамогай штучнага інтэлекту (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) зрэзаў/груп ад розных свіней, праведзены аднабаковы тэст ANOVA; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0 і ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) зрэзаў/група кожнай з розных свіней, аднабаковы тэст ANOVA;####p < 0,0001 与D0 相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) зрэзаў/груп кожны з розных свіней, аднабаковы тэст ANOVA;####p < 0,0001 与D0相比， ****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный інтэлект для колькаснай ацэнкі структурнай цэласнасці сардэчнай тканіны (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срэзаў/групу кожнай з розных свіней, аднабаковы тэст ANOVA; ####p <0,0001 супраць D0 Для параўнання ****p <0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). Штучны інтэлект для колькаснай ацэнкі структурнай цэласнасці сардэчнай тканіны (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) раздзелаў/груп у кожнай з розных свіней, аднабаковы тэст ANOVA; ####p<0,0001 супраць .D0 Для параўнання ****p <0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). c Рэпрэзентатыўныя выявы (злева) і колькасная ацэнка (справа) для зрэзаў сэрца, афарбаваных троххромнай афарбоўкай Масана (аголеная луска = 500 мкм) (n = 10 зрэзаў/групу кожны з розных свіней, праводзіцца аднабаковы тэст ANOVA; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0 і ***p < 0,001 у параўнанні з D12 Ctrl). c Рэпрэзентатыўныя выявы (злева) і колькасная ацэнка (справа) для зрэзаў сэрца, афарбаваных троххромнай плямай па Масане (аголеная луска = 500 мкм) (n = 10 зрэзаў/групу кожны з розных свіней, выконваецца аднабаковы тэст ANOVA; #### p < 0,0001 у параўнанні з D0 і ***p < 0,001 у параўнанні з D12 Ctrl). c Рэпрэзентатыўныя выявы (слева) і колькасная ацэнка (справа) зрэзу сэрца, афарбаванага троххромным красіцелем Массона (масштаб без пакрыцця = 500 мкм) (n = 10 срэзаў/групу ад розных свіней, выконваецца аднабаковы тэст ANOVA; #### p < 0,0001 у параўнанні з D0 і ***p < 0,001 у параўнанні з D12 Ctrl). c Рэпрэзентатыўныя выявы (злева) і колькасная ацэнка (справа) зрэзаў сэрца, афарбаваных троххромнай плямай Масана (шкала без пакрыцця = 500 мкм) (n = 10 зрэзаў/група ад розных свіней, выкананы аднабаковы тэст ANOVA; #### p <0,0001 у параўнанні з D0 і ***p <0,001 у параўнанні з D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 мкм）（n = 10个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比） . C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 = 500 мкм） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0,0001 与D0相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Рэпрэзентатыўныя выявы (слева) і колькасны аналіз (справа) зрэзаў сэрца, афарбаваных троххромным красіцелем Массона (чыстая шкала = 500 мкм) (n = 10 срэзаў/група, кожная ад іншай свіні, пратэставана з дапамогай аднафактарнага дысперсійнага аналізу ;### #p < 0,0001 у параўнанні з D0, ***p < 0,001 у параўнанні з D12 Ctrl). c Рэпрэзентатыўныя выявы (злева) і колькасная ацэнка (справа) зрэзаў сэрца, афарбаваных троххромнай плямай па Масане (пусты = 500 мкм) (n = 10 зрэзаў/група, кожны з розных свіней, правераны з дапамогай аднабаковага дысперсійнага аналізу;### # p <0,0001 у параўнанні з D0, ***p <0,001 у параўнанні з D12 Ctrl).Слупкі памылак прадстаўляюць сярэдняе ± стандартнае адхіленне.
Мы выказалі здагадку, што шляхам дадання невялікіх малекул у культуральную сераду можна палепшыць цэласнасць кардыяміяцытаў і паменшыць развіццё фіброзу падчас культуры CTCM.Таму мы правялі скрынінг на малыя малекулы, выкарыстоўваючы нашы статычныя кантрольныя культуры 20, 21 з-за невялікай колькасці змешваючых фактараў.Для гэтага скрынінга былі выбраны дэксаметазон (Dex), трійодтіроніна (T3) і SB431542 (SB).Гэтыя невялікія малекулы раней выкарыстоўваліся ў культурах hiPSC-CM для індукцыі паспявання кардыяміяцытаў шляхам павелічэння даўжыні саркомера, Т-канальцаў і хуткасці правядзення.Акрамя таго, і Dex (глюкакартыкоід), і SB, як вядома, душаць запаленне29,30.Такім чынам, мы праверылі, ці палепшыць структурную цэласнасць аддзелаў сэрца ўключэнне адной або камбінацыі гэтых невялікіх малекул.Для першапачатковага скрынінга доза кожнага злучэння была абраная на аснове канцэнтрацый, якія звычайна выкарыстоўваюцца ў мадэлях культуры клетак (1 мкМ Dex27, 100 нМ T327 і 2,5 мкМ SB31).Пасля 12 дзён культывавання камбінацыя T3 і Dex прывяла да аптымальнай структурнай цэласнасці кардыяміяцытаў і мінімальнага фібрознага рэканструкцыі (дадатковыя малюнкі 4 і 5).Акрамя таго, выкарыстанне двайных або двайных гэтых канцэнтрацый T3 і Dex выклікала шкодныя эфекты ў параўнанні са звычайнымі канцэнтрацыямі (дадатковы мал. 6a, b).
Пасля першапачатковага скрынінга мы правялі непасрэднае параўнанне 4 умоў культывавання (малюнак 4а): Ctrl: зрэзы сэрца, культываваныя ў нашай раней апісанай статычнай культуры з выкарыстаннем нашай аптымізаванай асяроддзя;20.21 TD: T3 і Ctrl дададзены Dex у сераду;MC: зрэзы сэрца, культываваныя ў CTCM з выкарыстаннем нашай раней аптымізаванай асяроддзя;і MT: CTCM з T3 і Dex, дададзенымі ў сераду.Пасля 12 дзён культывавання жыццяздольнасць MS і MT тканін заставалася такой жа, як і ў свежых тканінах, ацэненых з дапамогай аналізу MTT (мал. 4b).Цікава, што даданне T3 і Dex да трансвелловых культур (TD) не прывяло да значнага паляпшэння жыццяздольнасці ў параўнанні з умовамі Ctrl, што паказвае на важную ролю механічнай стымуляцыі ў падтрыманні жыццяздольнасці аддзелаў сэрца.
Дыяграма эксперыментальнага дызайну, якая адлюстроўвае чатыры ўмовы культывавання, якія выкарыстоўваюцца для ацэнкі эфектаў механічнай стымуляцыі і дабаўкі T3/Dex на сераду на працягу 12 дзён. b Слупковы графік паказвае колькасную ацэнку жыццяздольнасці праз 12 дзён пасля культывавання ва ўсіх 4 умовах культывавання (Ctrl, TD, MC і MT) у параўнанні са свежымі кавалачкамі сэрца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD і D12 MT), 12 (D12 MC) зрэзаў/групу ад розных свіней, праводзіцца аднабаковы тэст ANOVA; ####p < 0,0001 , ###p < 0,001 у параўнанні з D0 і **p < 0,01 у параўнанні з D12 Ctrl). b Слупковы графік паказвае колькасную ацэнку жыццяздольнасці праз 12 дзён пасля культывавання ва ўсіх 4 умовах культывавання (Ctrl, TD, MC і MT) у параўнанні са свежымі кавалачкамі сэрца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD і D12 MT), 12 (D12 MC) зрэзаў/групу ад розных свіней, праводзіцца аднабаковы тэст ANOVA; ####p < 0,0001 , ###p <0,001 у параўнанні з D0 і **p <0,01 у параўнанні з D12 ctrl). b Гістаграма паказвае дастатковую ацэнку працаздольнасці праз 12 дзён пасля культывавання ва ўсіх 4 умовах культывавання (кантроль, TD, MC і MT) у параўнанні са свежымі зрэзамі сэрца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD і D12 MT), 12 (D12 MC) зрэзаў/групы ад розных свіней, праводзіцца аднабаковы тэст ANOVA ; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 у параўнанні з D0 і **p < 0,01 у параўнанні з D12 Ctrl). b Дыяграма паказвае колькасную ацэнку жыццяздольнасці праз 12 дзён пасля культывавання ва ўсіх 4 умовах культывавання (кантроль, TD, MC і MT) у параўнанні са свежымі зрэзамі сэрца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD і D12 MT), 12 (D12 MC) зрэзаў/груп ад розных свіней, аднабаковы тэст ANOVA; ####p < 0,0 001, ###p <0,001 у параўнанні з D0 і **p <0,01 у параўнанні з D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和D12) MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向 ANOVA 测试；####p < 0,0001，###p < 0,001 与D0 相比，**p < 0,01与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гістаграма, якая паказвае ўсе 4 умовы культывавання (кантроль, TD, MC і MT) у параўнанні са свежымі зрэзамі сэрца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD і D12 MT), ад розных свіней 12 (D12 MC) срэзы/група, аднабаковы тэст ANOVA; ####p <0,0001, ###p < 0,001 у параўнанні з D0, **p <0,01 у параўнанні з кантролем D12). b Гістаграма, якая паказвае ўсе 4 умовы культывавання (кантроль, TD, MC і MT) у параўнанні са свежымі зрэзамі сэрца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD і D12 MT), ад розных свіней 12 (D12 MC) зрэзаў/групы, аднабаковы тэст ANOVA; ####p<0,0001, ###p<0,001 у параўнанні з D0 , **p<0,01 супраць кантролю D12). c Гістограма паказвае колькасную ацэнку патоку глюкозы праз 12 дзён пасля культывавання ва ўсіх 4 умовах культывавання (Ctrl, TD, MC і MT) у параўнанні са свежымі кавалачкамі сэрца (D0) (n = 6 зрэзаў/групу ад розных свіней, праводзіцца аднабаковы тэст ANOVA; ###p <0,001, у параўнанні з D0 і ***p <0,001 у параўнанні з D12 Ctrl). c Гістограма паказвае колькасную ацэнку патоку глюкозы праз 12 дзён пасля культывавання ва ўсіх 4 умовах культывавання (Ctrl, TD, MC і MT) у параўнанні са свежымі кавалачкамі сэрца (D0) (n = 6 зрэзаў/групу ад розных свіней, праводзіцца аднабаковы тэст ANOVA; ###p <0,001, у параўнанні з D0 і ***p <0,001 у параўнанні з D12 Ctrl). c Гістаграма паказвае дастатковую ацэнку патоку глюкозы праз 12 дзён пасля культывавання ва ўсіх 4 умовах культывавання (кантроль, TD, MC і MT) у параўнанні са свежымі зрэзамі сэрца (D0) (n = 6 зрэзаў/групу ад розных свіней, аднабаковы Выконваецца тэст ANOVA; ###p < 0,001 у параўнанні з D0 і ***p < 0,001 у параўнанні з D12 Ctrl). c Гістаграма паказвае колькасную ацэнку патоку глюкозы праз 12 дзён пасля культывавання пры ўсіх 4 умовах культывавання (кантроль, TD, MC і MT) у параўнанні са свежымі зрэзамі сэрца (D0) (n = 6 зрэзаў/групу ад розных свіней, выкананы аднабаковы ANOVA тэст; ###p <0,001 у параўнанні з D0 і ***p <0,001 у параўнанні з D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12 天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ， 培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гістаграма, якая паказвае колькасную ацэнку патоку глюкозы праз 12 дзён пасля культывавання для ўсіх 4 умоў культывавання (кантроль, TD, MC і MT) у параўнанні са свежымі зрэзамі сэрца (D0) (n = 6 зрэзаў/група, ад розных свіней, аднабаковы Былі праведзены аналізы ANOVA; ###p < 0,001 у параўнанні з D0, ***p < 0,001 у параўнанні з D12 (кантроль). c Гістаграма, якая паказвае колькасную ацэнку патоку глюкозы праз 12 дзён пасля культывавання для ўсіх 4 умоў культывавання (кантроль, TD, MC і MT) у параўнанні са свежымі зрэзамі сэрца (D0) (n = 6 зрэзаў/групу, ад розных свіней, аднабаковы. Калі праводзіліся ANOVA-тэсты, ###p <0,001 у параўнанні з D0, ***p <0,001 у параўнанні з D12 (кантроль).d Дыяграмы дэфармацыйнага аналізу свежых (сіні), 12 дзень MC (зялёны) і 12 дзень MT (чырвоны) тканін у дзесяці рэгіянальных кропках разрэзу тканіны (n = 4 зрэзы/група, аднабаковы тэст ANOVA; істотнай розніцы паміж групамі не было).e Графік вулкана, які паказвае дыферэнцыраваную экспрэсію генаў у свежых зрэзах сэрца (D0) у параўнанні з зрэзамі сэрца, культываванымі ў статычных умовах (Ctrl) або ва ўмовах МТ (MT) на працягу 10-12 дзён.f Цеплавая карта генаў саркомера для зрэзаў сэрца, культываваных у кожным з умоў культуры.Слупкі памылак прадстаўляюць сярэдняе ± стандартнае адхіленне.
Метабалічная залежнасць ад пераключэння ад акіслення тоўстых кіслот да гліколізу з'яўляецца адметнай рысай дедифференцировки кардыяміяцытаў.Няспелыя кардыяміяцыты ў асноўным выкарыстоўваюць глюкозу для вытворчасці АТФ і маюць гіпапластычныя мітахондрыі з невялікай колькасцю крыст5,32.Аналіз выкарыстання глюкозы паказаў, што ва ўмовах MC і MT выкарыстанне глюкозы было аналагічным утылізацыі глюкозы ў тканінах дня 0 (малюнак 4c).Аднак узоры Ctrl паказалі значнае павелічэнне выкарыстання глюкозы ў параўнанні са свежай тканінай.Гэта паказвае на тое, што камбінацыя CTCM і T3/Dex павышае жыццяздольнасць тканін і захоўвае метабалічны фенатып 12-дзённых культывуемых зрэзаў сэрца.Акрамя таго, аналіз дэфармацыі паказаў, што ўзроўні дэфармацыі заставаліся такімі ж, як і ў свежай тканіны сэрца на працягу 12 дзён ва ўмовах МТ і МС (мал. 4d).
Каб прааналізаваць агульны ўплыў CTCM і T3/Dex на глабальны ландшафт транскрыпцыі сардэчнай тканіны зрэзу, мы правялі RNAseq на сардэчных зрэзах з усіх чатырох розных умоў культуры (дадатковыя дадзеныя 1).Цікава, што зрэзы МТ паказалі высокае падабенства транскрыпцыі са свежай тканінай сэрца, толькі з 16 дыферэнцыяльна экспрэсіраванымі з 13 642 генаў.Аднак, як мы паказалі раней, Ctrl зрэзаў адлюстроўваецца 1229 дыферэнцыяльна экспрессируемых генаў пасля 10-12 дзён у культуры (мал. 4e).Гэтыя дадзеныя былі пацверджаны qRT-PCR генаў сэрца і фібрабластаў (дадатковы малюнак 7a-c).Цікава, што раздзелы Ctrl паказалі зніжэнне рэгуляцыі генаў сардэчнага і клеткавага цыклу і актывацыю праграм генаў запалення.Гэтыя дадзеныя сведчаць аб тым, што дэдыферэнцыяцыя, якая звычайна адбываецца пасля доўгатэрміновага культывавання, цалкам аслабляецца ва ўмовах МТ (дадатковы мал. 8a,b).Уважлівае вывучэнне генаў саркомера паказала, што толькі ва ўмовах МТ захоўваюцца гены, якія кадуюць саркамер (мал. 4f) і іённы канал (дадатковая мал. 9), абараняючы іх ад падаўлення ва ўмовах Ctrl, TD і MC.Гэтыя дадзеныя дэманструюць, што пры спалучэнні механічнай і гумаральнай стымуляцыі (T3/Dex) транскрыптом зрэзу сэрца можа заставацца падобным на свежыя зрэзы сэрца пасля 12 дзён культывавання.
Гэтыя вынікі транскрыпцыі пацвярджаюцца тым фактам, што структурная цэласнасць кардыяміяцытаў у зрэзах сэрца лепш за ўсё захоўваецца ва ўмовах МТ на працягу 12 дзён, як паказана непашкоджаным і лакалізаваным коннексином 43 (мал. 5а).Акрамя таго, фіброз у зрэзах сэрца ва ўмовах МТ быў значна паменшаны ў параўнанні з Ctrl і падобнымі на свежыя зрэзы сэрца (мал. 5b).Гэтыя дадзеныя дэманструюць, што спалучэнне механічнай стымуляцыі і лячэння T3/Dex эфектыўна захоўвае структуру сэрца ў зрэзах сэрца ў культуры.
Рэпрэзентатыўныя імунафлюарэсцэнтныя выявы трапоніна-Т (зялёны), коннексина 43 (чырвоны) і DAPI (сіні) у толькі што ізаляваных зрэзах сэрца (D0) або культывавалі на працягу 12 дзён ва ўсіх чатырох умовах культывавання зрэзаў сэрца (шкала = 100 мкм).). Колькасная ацэнка структурнай цэласнасці сардэчнай тканіны з дапамогай штучнага інтэлекту (n = 7 (D0 і D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC і D12 MT) зрэзаў/група ад розных свіней, выконваецца аднабаковы тэст ANOVA; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0 і *p < 0,05, або ****p < 0,0001 у параўнанні з D 12 Ctrl). Колькасная ацэнка структурнай цэласнасці сардэчнай тканіны з дапамогай штучнага інтэлекту (n = 7 (D0 і D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC і D12 MT) зрэзаў/група ад розных свіней, выконваецца аднабаковы тэст ANOVA; #### p < 0,0001 у параўнанні з D0 і *p < 0,05, або ****p < 0,0001 у параўнанні з D 12 Ctrl). Количественная ацэнка структурнай цэласнасці тканіны сэрца з дапамогай штучнага інтэлекту (n = 7 (D0 і D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC і D12 MT) зрэзаў/групы ад розных свіней, праведзена аднафактарным тэстам ANOVA; #### p < 0,0001 у параўнанні з D0 і *p < 0,05 або ****p < 0,0001 у параўнанні з D1 2 Ctrl). Колькасная ацэнка структурнай цэласнасці сардэчнай тканіны з выкарыстаннем штучнага інтэлекту (n = 7 (D0 і D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC і D12 MT) зрэзаў/груп ад розных свіней, выкананы аднабаковы ANOVA-тэст; #### p < 0,0001 у параўнанні з D0 і *p < 0,05 або ****p < 0,0001 у параўнанні з D1 2 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） 人工智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl相比）.Колькасная ацэнка структурнай цэласнасці сардэчнай тканіны з выкарыстаннем штучнага інтэлекту ў розных свіней (n = 7 (D0 і D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC і D12 MT) секцый/груп) з аднабаковым тэстам ANOVA;#### p < 0,0001 у параўнанні з D0 і *p < 0,05 або ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). #### p < 0,0001 у параўнанні з D0 і *p < 0,05 або ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). b Рэпрэзентатыўныя выявы і колькасная ацэнка зрэзаў сэрца, афарбаваных троххромнай плямай па Масане (маштаб = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD і D12 MC), 9 (D12 MT) зрэзаў/групу ад розных свіней, праводзіцца аднабаковы тэст ANOVA; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0 і ***p < 0,001 або ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). b Рэпрэзентатыўныя выявы і колькасная ацэнка зрэзаў сэрца, афарбаваных троххромнай плямай па Масане (маштаб = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD і D12 MC), 9 (D12 MT) зрэзаў/групу ад розных свіней, праводзіцца аднабаковы тэст ANOVA; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0 і ***p < 0,001 або ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). b Рэпрэзентатыўныя выявы і колькасная ацэнка зрэзаў сэрца, упрыгожаных троххромным красіцелем Массона (масштабная лінія = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD і D12 MC), 9 (D12 MT) зрэзаў/групы ад розных свіней, выконваецца аднабаковы тэст ANOVA; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0 і ***p < 0,001 або ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). b Рэпрэзентатыўныя выявы і колькасная ацэнка зрэзаў сэрца, афарбаваных троххромнай афарбоўкай па Масане (шкала = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD і D12 MC), 9 (D12 MT) зрэзаў/група ад розных свіней, выкананы аднабаковы ANOVA; ####p < 0,0001 супраць D0 і ***p < 0,00 1 або ****p <0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 мкм）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 mason 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 мкм） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001 与D0 相比， ***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Рэпрэзентатыўныя выявы і колькасная ацэнка зрэзаў сэрца, упрыгожаных трыхромам Массона (масштабная лінія = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD і D12 MC), 9 (D12 MT) зрэзаў ад розных свіней / групы, адзін- спосаб ANOVA; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0, ***p < 0, 001 або ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). b Рэпрэзентатыўныя выявы і колькасная ацэнка зрэзаў сэрца, афарбаваных трыхромам Масана (шкала = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD і D12 MC), 9 (D12 MT) зрэзаў ад розных свіней/групы, адзін метад ANOVA; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0, ***p < 0,001 або ****p <0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl).Слупкі памылак прадстаўляюць сярэдняе ± стандартнае адхіленне.
Нарэшце, здольнасць CTCM імітаваць гіпертрафію сэрца ацэньвалася па павелічэнні расцяжэння сардэчнай тканіны.У CTCM пікавы ціск у паветранай камеры павялічыўся з 80 мм рт. сл. да 80 мм рт.арт.(нармальнае расцяжэнне) да 140 мм рт.(Мал. 6а).Гэта адпавядае павелічэнню расцяжэння на 32% (мал. 6b), якое раней было паказана як адпаведны працэнт расцяжэння, неабходны аддзелам сэрца для дасягнення даўжыні саркомера, аналагічнай той, якая назіраецца пры гіпертрафіі.Расцяжэнне і хуткасць сардэчнай тканіны падчас скарачэння і паслаблення заставаліся нязменнымі на працягу шасці дзён культуры (мал. 6c).Сардэчную тканіну з умоў МТ падвяргалі нармальнаму расцяжэння (МТ (нармальны)) або ўмовам празмернага расцяжэння (МТ (OS)) на працягу шасці дзён.Ужо пасля чатырох дзён культывавання гіпертрафічны біямаркер NT-ProBNP быў значна павышаны ў асяроддзі ва ўмовах MT (OS) у параўнанні з MT (нармальнымі) умовамі (мал. 7a).Акрамя таго, пасля шасці дзён культывавання, памер клетак у MT (OS) (мал. 7b) значна павялічыўся ў параўнанні з раздзеламі MT сэрца (у норме).Акрамя таго, ядзерная транслокация NFATC4 была значна павялічана ў перанапружаных тканінах (мал. 7c).Гэтыя вынікі паказваюць прагрэсавальнае развіццё паталагічнага перабудовы пасля гіпердыстанзіі і пацвярджаюць канцэпцыю таго, што прылада CTCM можа быць выкарыстана ў якасці платформы для вывучэння сігналізацыі аб гіпертрафіі сэрца, выкліканай расцяжэннем.
Рэпрэзентатыўныя сляды вымярэнняў ціску ў паветранай камеры, ціску ў вадкаснай камеры і руху тканіны пацвярджаюць, што ціск у камеры змяняе ціск у вадкаснай камеры, выклікаючы адпаведны рух зрэзу тканіны.b Рэпрэзентатыўныя крывыя працэнта расцяжэння і хуткасці расцяжэння для нармальна расцягнутых (аранжавы) і празмерна расцягнутых (сіні) зрэзаў тканіны.c Гістограма, якая паказвае час цыклу (n = 19 зрэзаў на групу, ад розных свіней), час скарачэння (n = 18-19 зрэзаў на групу, ад розных свіней), час рэлаксацыі (n = 19 зрэзаў на групу, ад розных свіней)), амплітуду руху тканіны (n = 14 зрэзаў/групу, ад розных свіней), пікавую сісталічны хуткасць (n = 14 зрэзаў/групу, ад розных свіней) і пік рэлаксацыі (n = 14 (D0), 15 (D6) секцый/груп) ад розных свіней), двухбаковы t-крытэрый Ст'юдэнта не паказаў істотнай розніцы ні ў адным з параметраў, што паказвае на тое, што гэтыя параметры заставаліся сталымі на працягу 6 дзён культывавання з перанапружаннем.Слупкі памылак прадстаўляюць сярэдняе ± стандартнае адхіленне.
Колькаснае вызначэнне гістаграмы канцэнтрацыі NT-ProBNP у культуральных асяроддзях са зрэзаў сэрца, культываваных ва ўмовах МТ нармальнага расцяжэння (Norm) або празмернага расцяжэння (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm і D4 MTOS) зрэзы/група ад розных свіней, выконваецца двухбаковы ANOVA; **p <0,01 у параўнанні з нармальным расцяжэннем). Колькаснае вызначэнне гістаграмы канцэнтрацыі NT-ProBNP у культуральных асяроддзях са зрэзаў сэрца, культываваных ва ўмовах МТ нармальнага расцяжэння (Norm) або празмернага расцяжэння (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm і D4 MTOS) зрэзы/група ад розных свіней, выконваецца двухбаковы ANOVA; **p <0,01 у параўнанні з нармальным расцяжэннем).Колькасная гістаграма канцэнтрацыі NT-ProBNP у культуральным асяроддзі са зрэзаў сэрца, культываваных ва ўмовах нармальнага расцяжэння МТ (норма) або перанапружання (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm і D4).MTOS) зрэзаў / групу ад розных свіней, праводзіцца двухфактарны дысперсійны аналіз;**p <0,01 у параўнанні з нармальным расцяжэннем). **p <0,01 у параўнанні са звычайным расцяжэннем). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p <0,01）. Колькасная ацэнка канцэнтрацыі NT-ProBNP у зрэзах сэрца, культываваных ва ўмовах МТ нармальнага расцяжэння (Norm) або празмернага расцяжэння (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTNorm, D4 MTNorm和D4 MTOS) з розных 猪的切片/组，可以双向方方发发动; **у параўнанні з нармальным расцяжэннем, р <0,01).гістаграма Колькасная ацэнка канцэнтрацый NT-ProBNP у зрэзах сэрца, культывуемых ва ўмовах нармальнага расцяжэння МТ (норма) або перанапружання (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) і D4 MTOS) зрэзы/групы ад розных свіней, двухбаковы дысперсійны аналіз;**p <0,01 у параўнанні з нармальным расцяжэннем). **p <0,01 у параўнанні са звычайным расцяжэннем). b Рэпрэзентатыўныя выявы для зрэзаў сэрца, афарбаваных трапанінам-Т і WGA (злева), і колькаснага вызначэння памеру клетак (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетак/групу з 10 розных зрэзаў ад розных свіней, выконваецца двухбаковы t-тэст Ст'юдэнта; ****p <0,0001 у параўнанні з нармальным расцяжэннем). b Рэпрэзентатыўныя выявы для зрэзаў сэрца, афарбаваных трапанінам-Т і WGA (злева), і колькаснага вызначэння памеру клетак (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетак/групу з 10 розных зрэзаў ад розных свіней, выконваецца двухбаковы t-тэст Ст'юдэнта; ****p <0,0001 у параўнанні з нармальным расцяжэннем). b Рэпрэзентатыўныя выявы зрэзаў сэрца, афарбаваных тропонином-Т і АЗП (злева) і колькаснага вызначэння памеру клетак (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетак/групу з 10 розных зрэзаў ад розных свіней, два- праводзіцца хваставой t-крытэрый Сцюдэнта; ****p < 0,0001 у параўнанні з нармальным расцяжэннем ). b Рэпрэзентатыўныя выявы зрэзаў сэрца, афарбаваных трапанін-Т і AZP (злева), і колькаснае вызначэнне памеру клетак (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетак/групу з 10 розных зрэзаў ад розных свіней, быў выкананы двухбаковы t-крытэрый Ст'юдэнта; ****p <0,0001 у параўнанні з нармальнай лініяй). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS ），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p <0,0001）. b Рэпрэзентатыўныя выявы зрэзаў сэрца, афарбаваных кальцарэінам-Т і WGA (злева), і памер клетак (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 з 10 розных зрэзаў (D6 MTNorm)) Клеткі/тэст 组，两方法有尾学生t； у параўнанні з нармальным расцяжэннем，****p <0,00 01). b Рэпрэзентатыўныя малюнкі зрэзаў сэрца, афарбаваных трапаніны-Т і АЗП (злева) і колькасная ацэнка памеру клетак (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) з 10 розных зрэзаў ад розных свіней Клеткі/групы, двухбаковыя крытэрыі Сцюдэнта; ****p < 0,0001 у параўнанні з нармальным размеркаваннем). b Рэпрэзентатыўныя выявы зрэзаў сэрца, афарбаваных трапонін-Т і AZP (злева) і колькаснае вызначэнне памеру клетак (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) з 10 розных зрэзаў ад розных свіней) Клеткі/група, двухбаковы крытэрый Ст'юдэнта t;****p <0,0001 у параўнанні з нармальным штамам). c Рэпрэзентатыўныя выявы для 0-га і 6-га дзён зрэзаў сэрца MTOS, імунна пазначаных для трапонін-Т і NFATC4, і колькасная ацэнка транслакацыі NFATC4 да ядраў CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) зрэзы/групу ад розных свіней, выконваецца двухбаковы t-крытэрый Ст'юдэнта; *p <0,05). c Рэпрэзентатыўныя выявы для 0-га і 6-га дзён зрэзаў сэрца MTOS, імунна пазначаных для трапаніну-Т і NFATC4, і колькасная ацэнка транслакацыі NFATC4 да ядраў CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) зрэзы/група ад розных свіней, выконваецца двухбаковы t-крытэр Ст'юдэнта; *p <0,05). c Рэпрэзентатыўныя выявы для зрэзаў сэрца 0 і 6 дзён MTOS, імунамедзеных для трапоніна-Т і NFATC4, і колькасная адзнака транслакацыі NFATC4 у ядра кавернозных клетак (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) зрэзаў/групу ад розных свіней, выконваецца двухбаковы t-крытэрый Сцюдэнта; *p <0,05). c Рэпрэзентатыўныя выявы для зрэзаў сэрца на 0 і 6 дзень MTOS, імунна пазначаных для тропонина-Т і NFATC4, і колькаснага вызначэння транслокации NFATC4 ў ядры кавернозных клетак (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) зрэзы/група ад розных свіней) выкананы двухбаковы t-крытэр Ст'юдэнта;*р <0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Рэпрэзентатыўныя выявы імуннай маркіроўкі кальканін-Т і NFATC4 第0天和第6天MTOS зрэзаў сэрца і NFATC4 з розных NFATC4 易位至ядра клетак CM 的колькасць化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组, 时间双尾学生et 电影；*p <0,05). c Рэпрэзентатыўныя малюнкі зрэзаў сэрца MTOS на 0 і 6 дзён для імунамаркіроўкі тропонином-Т і NFATC4 і колькасная ацэнка транслакацыі NFATC4 у ядра CM ад розных свіней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) зрэз/група, два хвастатыя t-крытэрыі Сцюдэнта; *p <0,05). c Рэпрэзентатыўныя выявы зрэзаў сэрца MTOS на 0-ы і 6-ы дзень для імуннай маркіроўкі трапоніна-Т і NFATC4 і колькаснага вызначэння транслокации NFATC4 у ядры CM ад розных свіней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) зрэзы/група, двухбаковы t -крытэрый Студэнта; *p <0,05).Слупкі памылак прадстаўляюць сярэдняе ± стандартнае адхіленне.
Паступальнае сардэчна-сасудзістае даследаванне патрабуе клеткавых мадэляў, якія дакладна прайграваюць сардэчнае асяроддзе.У гэтым даследаванні было распрацавана і ахарактарызавана прылада CTCM, якое можа стымуляваць ультратонкія зрэзы сэрца.Сістэма CTCM ўключае фізіялагічна сінхранізаваную электрамеханічную стымуляцыю і ўзбагачэнне вадкасцю T3 і Dex.Калі зрэзы сэрца свінні падвяргаліся ўздзеянню гэтых фактараў, іх жыццяздольнасць, структурная цэласнасць, метабалічная актыўнасць і экспрэсія транскрыпцыі заставаліся такімі ж, як у свежай тканіны сэрца пасля 12 дзён культывавання.Акрамя таго, празмернае расцяжэнне сардэчнай тканіны можа выклікаць гіпертрафію сэрца, выкліканую гиперэкстензией.У цэлым гэтыя вынікі пацвярджаюць важную ролю фізіялагічных умоў культуры ў падтрыманні нармальнага сардэчнага фенатыпу і забяспечваюць платформу для скрынінга лекаў.
Многія фактары спрыяюць стварэнню аптымальных умоў для функцыянавання і выжывання кардиомиоцитов.Найбольш відавочныя з гэтых фактараў звязаны з (1) міжклеткавым узаемадзеяннем, (2) электрамеханічнай стымуляцыяй, (3) гумаральнымі фактарамі і (4) метабалічнымі субстратамі.Фізіялагічныя ўзаемадзеяння паміж клеткамі патрабуюць складаных трохмерных сетак з некалькіх тыпаў клетак, якія падтрымліваюцца пазаклеткавым матріксам.Такія складаныя клеткавыя ўзаемадзеяння цяжка рэканструяваць in vitro шляхам сумеснага культывавання асобных тыпаў клетак, але іх можна лёгка дасягнуць, выкарыстоўваючы арганатыпічную прыроду зрэзаў сэрца.
Механічнае расцяжэнне і электрычная стымуляцыя кардыяміяцытаў маюць вырашальнае значэнне для падтрымання фенатыпу сэрца33,34,35.У той час як механічная стымуляцыя шырока выкарыстоўваецца для кандыцыянавання і паспявання hiPSC-CM, у некалькіх элегантных даследаваннях нядаўна была зроблена спроба механічнай стымуляцыі зрэзаў сэрца ў культуры з выкарыстаннем аднавосевай нагрузкі.Гэтыя даследаванні паказваюць, што двухмерная аднавосевая механічная нагрузка станоўча ўплывае на фенатып сэрца падчас культуры.У гэтых даследаваннях аддзелы сэрца альбо нагружаліся ізаметрычнай сілай расцяжэння 17, лінейнай аўксатанічнай нагрузкай 18, альбо сардэчны цыкл аднаўляўся з выкарыстаннем зваротнай сувязі датчыка сілы і прывадаў напружання.Аднак у гэтых метадах выкарыстоўваецца аднавосевае расцяжэнне тканіны без аптымізацыі навакольнага асяроддзя, што прыводзіць да падаўлення многіх сардэчных генаў або празмернай экспрэсіі генаў, звязаных з ненармальнымі рэакцыямі на расцяжэнне.CTCM, апісаны тут, забяспечвае трохмерны электрамеханічны стымул, які імітуе натуральны сардэчны цыкл з пункту гледжання часу цыкла і фізіялагічнага расцяжэння (25% расцяжэння, 40% сістолы, 60% дыясталы і 72 удары ў хвіліну).Хоць адной гэтай трохмернай механічнай стымуляцыі недастаткова для падтрымання цэласнасці тканіны, для адэкватнага падтрымання жыццяздольнасці, функцыі і цэласнасці тканін патрабуецца спалучэнне гумаральнай і механічнай стымуляцыі з выкарыстаннем T3/Dex.
Гумаральныя фактары гуляюць важную ролю ў мадуляцыі фенатыпу сэрца дарослага чалавека.Гэта было падкрэслена ў даследаваннях HiPS-CM, у якіх T3 і Dex дадаваліся ў культуральныя асяроддзя для паскарэння паспявання клетак.T3 можа ўплываць на транспарт амінакіслот, цукру і кальцыя праз клеткавыя мембраны36.Акрамя таго, T3 спрыяе экспрэсіі MHC-α і паніжальнай рэгуляцыі MHC-β, спрыяючы адукацыі хуткіх міяфібрыл у спелых кардыяміяцытах у параўнанні з міяфібрылламі павольнага пакарачэння ў фетальнай CM.Дэфіцыт Т3 у пацыентаў з гіпатырэёзам прыводзіць да страты миофибриллярных палос і зніжэння хуткасці развіцця тонусу37.Dex дзейнічае на рэцэптары глюкакартыкоідаў і, як было паказана, павялічвае скарачальнасці міякарда ў ізаляваных сэрцах з перфузией;38 Мяркуецца, што гэта паляпшэнне звязана з уплывам на адклады кальцыя (SOCE) 39,40.Акрамя таго, Dex звязваецца са сваімі рэцэптарамі, выклікаючы шырокі ўнутрыклетачны адказ, які душыць імунную функцыю і запаленне30.
Нашы вынікі паказваюць, што фізічная механічная стымуляцыя (MS) палепшыла агульную прадукцыйнасць культуры ў параўнанні з Ctrl, але не змагла захаваць жыццяздольнасць, структурную цэласнасць і сардэчную экспрэсію на працягу 12 дзён у культуры.У параўнанні з Ctrl, даданне T3 і Dex да культур CTCM (MT) палепшыла жыццяздольнасць і захавала падобныя профілі транскрыпцыі, структурную цэласнасць і метабалічную актыўнасць са свежай тканінай сэрца на працягу 12 дзён.Акрамя таго, кантралюючы ступень расцяжэння тканіны, была створана мадэль гіпертрафіі сэрца, выкліканая гиперэкстензией, з выкарыстаннем STCM, што ілюструе ўніверсальнасць сістэмы STCM.Варта адзначыць, што хоць перабудова сэрца і фіброз звычайна закранаюць непашкоджаныя органы, цыркулюючыя клеткі якіх могуць забяспечваць адпаведныя цітокіны, а таксама фагацытоз і іншыя фактары рэканструкцыі, аддзелы сэрца ўсё яшчэ могуць імітаваць фіброзны працэс у адказ на стрэс і траўму.у миофибробласты.Раней гэта было ацэнена ў гэтай мадэлі зрэзу сэрца.Варта адзначыць, што параметры CTCM можна мадуляваць шляхам змены ціску/электрычнай амплітуды і частоты для мадэлявання многіх станаў, такіх як тахікардыя, брадыкардыя і механічная падтрымка кровазвароту (механічная разгрузка сэрца).Гэта робіць сістэму сярэдняй прапускной здольнасці для тэставання на наркотыкі.Здольнасць CTCM мадэляваць гіпертрафію сэрца, выкліканую перанапружаннем, адкрывае шлях для тэставання гэтай сістэмы для персаналізаванай тэрапіі.У заключэнне, дадзенае даследаванне дэманструе, што механічнае расцяжэнне і гумаральная стымуляцыя маюць вырашальнае значэнне для падтрымання культуры зрэзаў сардэчнай тканіны.
Хоць дадзеныя, прадстаўленыя тут, сведчаць аб тым, што CTCM з'яўляецца вельмі перспектыўнай платформай для мадэлявання непашкоджанага міякарда, гэты метад культуры мае некаторыя абмежаванні.Асноўнае абмежаванне культуры CTCM заключаецца ў тым, што яна стварае бесперапынныя дынамічныя механічныя нагрузкі на зрэзы, што выключае магчымасць актыўнага кантролю сардэчных скарачэнняў на працягу кожнага цыклу.Акрамя таго, з-за малога памеру аддзелаў сэрца (7 мм), магчымасць ацэнкі сісталічны функцыі па-за культуральных сістэм з выкарыстаннем традыцыйных датчыкаў сілы абмежаваная.У бягучай рукапісы мы часткова пераадольваем гэтае абмежаванне, ацэньваючы аптычнае напружанне як паказчык скарачальнай функцыі.Аднак гэтае абмежаванне запатрабуе далейшай працы і можа быць вырашана ў будучыні шляхам укаранення метадаў аптычнага маніторынгу функцыі зрэзаў сэрца ў культуры, такіх як аптычнае адлюстраванне з выкарыстаннем кальцыя і адчувальных да напружання фарбавальнікаў.Іншым абмежаваннем CTCM з'яўляецца тое, што рабочая мадэль не маніпулюе фізіялагічным стрэсам (папярэдняя і постнагрузка).У CTCM ціск ствараўся ў процілеглых напрамках для прайгравання 25% фізіялагічнага расцяжэння ў дыясталы (поўнае расцяжэнне) і сістолы (працягласць скарачэння падчас электрычнай стымуляцыі) у вельмі вялікіх тканінах.Гэта абмежаванне павінна быць ліквідавана ў будучых канструкцыях CTCM шляхам адэкватнага ціску на сардэчную тканіну з абодвух бакоў і шляхам прымянення дакладных суадносін ціску і аб'ёму, якія ўзнікаюць у камерах сэрца.
Рэканструкцыя, выкліканая празмерным расцяжэннем, пра якую паведамляецца ў гэтай рукапісе, абмяжоўваецца імітацыяй сігналаў гіпертрафічнага гіперрасцяжэння.Такім чынам, гэтая мадэль можа дапамагчы ў вывучэнні выкліканай расцяжэннем гіпертрафічнай сігналізацыі без неабходнасці гумаральных або нервовых фактараў (якія не існуюць у гэтай сістэме).Неабходныя далейшыя даследаванні для павелічэння множнасці CTCM, напрыклад, сумеснае культываванне з імуннымі клеткамі, цыркулявалымі плазменнымі гумаральнымі фактарамі і інервацыяй, калі сумеснае культываванне з нейрональнымі клеткамі палепшыць магчымасці мадэлявання захворвання з дапамогай CTCM.
У гэтым даследаванні было выкарыстана трынаццаць свіней.Усе працэдуры з жывёламі праводзіліся ў адпаведнасці з рэкамендацыямі ўстановы і былі зацверджаны Інстытуцыйным камітэтам па доглядзе і выкарыстанні жывёл Універсітэта Луісвілля.Дугу аорты пераціскалі і сэрца перфузировали 1 л стэрыльнай кардиоплегии (110 ммоль NaCl, 1,2 ммоль CaCl2, 16 ммоль KCl, 16 ммоль MgCl2, 10 ммоль NaHCO3, 5 ЕД/мл гепарыну, рн да 7,4); сэрца захоўвалі ў ледзяным кардиоплегическом растворы да дастаўкі ў лабараторыю на лёдзе, што звычайна складае <10 хвілін. сэрца захоўвалі ў ледзяным кардиоплегическом растворы да дастаўкі ў лабараторыю на лёдзе, што звычайна складае <10 хвілін. сэрца захоўвалі ў ледзяным кардиоплегическом растворы да транспарціроўкі ў лабараторыю на льду, што звычайна займае <10 мін. сэрца захоўвалі ў ледзяным кардиоплегическом растворы да транспарціроўкі ў лабараторыю на лёдзе, што звычайна займае <10 хвілін.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Трымаеце сэрца ў лядзяной кардыяплегіі да транспарціроўкі ў лабараторыю на льду, звычайна <10 мін. Трымайце сэрца на лёдзе пры кардыяплегіі да транспарціроўкі ў лабараторыю на лёдзе, звычайна <10 хвілін.
Прылада CTCM была распрацавана ў праграмным забеспячэнні сістэмы аўтаматызаванага праектавання (CAD) SolidWorks.Культуральныя камеры, перагародкі і паветраныя камеры зроблены з празрыстага акрылавага пластыка з ЧПУ.Апорнае кольца дыяметрам 7 мм зроблена з поліэтылену высокай шчыльнасці (HDPE) у цэнтры і мае канаўку ўшчыльняльнага кольца для размяшчэння сіліконавага ўшчыльняльнага кольца, якое выкарыстоўваецца для ўшчыльнення носьбіта знізу.Тонкая кремнеземная мембрана аддзяляе культуральную камеру ад раздзяляльнай пласціны.Сіліконавая мембрана выразана лазерам з сіліконавага ліста таўшчынёй 0,02 цалі і мае цвёрдасць 35A.Ніжняя і верхняя сіліконавыя пракладкі выразаны лазерам з сіліконавага ліста таўшчынёй 1/16″ і маюць цвёрдасць 50A.Шрубы з нержавеючай сталі 316L і гайкі-барашкі выкарыстоўваюцца для мацавання блока і стварэння герметычнага ўшчыльнення.
Спецыяльная друкаваная плата (PCB) прызначана для інтэграцыі з сістэмай C-PACE-EM.Разеткі швейцарскага машыннага раздыма на друкаванай плаце злучаны з графітавымі электродамі з дапамогай пасярэбраных медных правадоў і бронзавых шруб 0-60, укручаных у электроды.Друкаваная плата змяшчаецца ў вечку 3D-прынтара.
Прылада CTCM кіруецца праграмуемым пнеўматычным прывадам (PPD), які стварае кантраляванае цыркуляцыйнае ціск, падобнае на сардэчны цыкл.Калі ціск унутры паветранай камеры павялічваецца, гнуткая сіліконавая мембрана пашыраецца ўверх, прасоўваючы сераду пад тканіну.Плошча тканіны будзе расцягвацца гэтым выкідам вадкасці, імітуючы фізіялагічнае пашырэнне сэрца падчас дыясталы.На піку рэлаксацыі прымянялася электрастымуляцыя праз графітавыя электроды, якія зніжалі ціск у паветранай камеры і выклікалі скарачэнне зрэзаў тканін.Унутры трубы знаходзіцца кровоостанаўліваюшчым клапан з датчыкам ціску для вызначэння ціску ў паветранай сістэме.Ціск, які адчувае датчык ціску, падаецца на зборшчык дадзеных, падлучаны да ноўтбука.Гэта дазваляе пастаянна кантраляваць ціск у газавай камеры.Калі быў дасягнуты максімальны ціск у камеры (стандарт 80 мм рт. сл., 140 мм рт. сл. OS), прыладзе збору даных было загадана адправіць сігнал у сістэму C-PACE-EM для стварэння двухфазнага сігналу напружання на працягу 2 мс, усталяванага на 4 В.
Былі атрыманы зрэзы сэрца і ўмовы культывавання ў 6 лунках былі выкананы наступным чынам: перанясіце сабраныя сэрцы з ёмістасці для перадачы ў латок, які змяшчае халодную (4°C) кардыяплегію.Левы страўнічак вылучаюць стэрыльным лязом і разразаюць на кавалачкі па 1-2 см3.Гэтыя тканкавыя блокі былі прымацаваны да тканкавых апор з дапамогай тканкавага клею і змешчаны ў вібрацыйную тканкавую ванну з мікратомам, якая змяшчае раствор Тайрода і бесперапынна насычаецца кіслародам (3 г/л 2,3-бутандионмонооксима (BDM), 140 мм NaCl (8,18 г), 6 мм KCl (0,447 г), 10 мм D-глюкозы (1,86 г), 1 0 мм HEPES (2,38 г), 1 мм MgCl2 (1 мл 1 М раствора), 1,8 мм CaCl2 (1,8 мл 1 М раствора), да 1 л ddH2O).Вібрацыйны мікратом быў усталяваны для нарэзкі лустачак таўшчынёй 300 мкм з частатой 80 Гц, амплітудай гарызантальнай вібрацыі 2 мм і хуткасцю прасоўвання 0,03 мм/с.Тканкавую ванну акружалі лёдам, каб раствор быў прахалодным, а тэмпературу падтрымлівалі на ўзроўні 4°C.Перанясіце зрэзы тканін з мікратомнай ванны ў інкубацыйную ванну, якая змяшчае бесперапынна насычаны кіслародам раствор Тырода на лёдзе, пакуль не будзе атрымана дастаткова зрэзаў для адной культуральнай пласціны.Для пасева праз лункі зрэзы тканіны прымацоўвалі да стэрыльных паліурэтанавых падстаўак шырынёй 6 мм і змяшчалі ў 6 мл аптымізаванай асяроддзя (асяроддзе 199, 1x дадатак ITS, 10% FBS, 5 нг/мл VEGF, 10 нг/мл FGF-шчолачны і 2X антыбіётык-супрацьгрыбковы).Электрастымуляцыя (10 В, частата 1,2 Гц) была нанесена на зрэзы тканін праз C-Pace.Для ўмоў TD свежыя T3 і Dex дадавалі пры 100 нМ і 1 мкМ пры кожнай змене асяроддзя.Асяроддзе насычаюць кіслародам перад заменай 3 разы на суткі.Зрэзы тканін культывавалі ў інкубатары пры 37 ° С і 5% CO2.
Для культур CTCM зрэзы тканін размяшчалі на спецыяльна вырабленым 3D-прынтары ў чашцы Петры, якая змяшчае мадыфікаваны раствор Тайрода.Апарат прызначаны для павелічэння памеру зрэзу сэрца на 25% ад плошчы апорнага кольцы.Гэта робіцца для таго, каб аддзелы сэрца не расцягваліся пасля пераносу з раствора Тирода ў асяроддзе і падчас дыясталы.З дапамогай гистоакрилового клею зрэзы таўшчынёй 300 мкм фіксавалі на апорным кольцы дыяметрам 7 мм.Пасля прымацавання зрэзаў тканіны да апорнага кольца адрэжце лішнія зрэзы тканіны і пакладзеце прымацаваныя зрэзы тканіны назад у ванну з растворам Tyrode на лёдзе (4°C), пакуль не будзе падрыхтавана дастаткова зрэзаў для адной прылады.Агульны час апрацоўкі для ўсіх прылад не павінен перавышаць 2 гадзін.Пасля таго, як 6 зрэзаў тканіны былі прымацаваны да іх апорных кольцаў, прылада CTCM была сабрана.Культуральную камеру CTCM папярэдне запаўняюць 21 мл асяроддзя, насычанай кіслародам.Перанясіце зрэзы тканіны ў культуральную камеру і піпеткай асцярожна выдаліце ​​бурбалкі паветра.Затым зрэз тканіны накіроўваецца ў адтуліну і акуратна прыціскаецца да месца.Нарэшце, пастаўце каўпачок электрода на прыладу і перанясіце прыладу ў інкубатар.Затым падключыце CTCM да паветраправоднай трубкі і сістэмы C-PACE-EM.Пнеўматычны прывад адкрываецца, а паветраны клапан адкрывае CTCM.Сістэма C-PACE-EM была сканфігуравана для падачы 4 В пры 1,2 Гц падчас двухфазнай стымуляцыі на працягу 2 мс.Асяроддзе мянялі два разы на дзень, а электроды мянялі адзін раз на дзень, каб пазбегнуць назапашвання графіту на электродах.Пры неабходнасці зрэзы тканін можна выдаліць з культуральных лунак, каб выгнаць усе бурбалкі паветра, якія маглі патрапіць пад іх.Для ўмоў лячэння МТ T3/Dex дадаваўся свежым пры кожнай змене асяроддзя з 100 нМ T3 і 1 мкМ Dex.Прылады CTCM культывавалі ў інкубатары пры 37 ° C і 5% CO2.
Для атрымання расцягнутых траекторый зрэзаў сэрца была распрацавана спецыяльная сістэма камер.Люстраная камера (Canon Rebel T7i, Canon, Токіо, Японія) выкарыстоўвалася з макрааб'ектывам Navitar Zoom 7000 18-108 мм (Navitar, Сан-Францыска, Каліфорнія).Візуалізацыю праводзілі пры пакаёвай тэмпературы пасля замены асяроддзя на свежую.Камера размешчана пад вуглом 51°, а відэа запісваецца з хуткасцю 30 кадраў у секунду.Спачатку праграмнае забеспячэнне з адкрытым зыходным кодам (MUSCLEMOTION43) выкарыстоўвалася з Image-J для колькаснай ацэнкі руху зрэзаў сэрца.Маска была створана з дапамогай MATLAB (MathWorks, Натык, Масачусэтс, ЗША) для вызначэння рэгіёнаў, якія ўяўляюць цікавасць для зрэзаў сэрцабіцця, каб пазбегнуць шуму.Сегментаваныя ўручную маскі прымяняюцца да ўсіх відарысаў у паслядоўнасці кадраў, а затым перадаюцца плагіну MUSCLEMOTION.Muscle Motion выкарыстоўвае сярэднюю інтэнсіўнасць пікселяў у кожным кадры для колькаснай ацэнкі яго руху адносна эталоннага кадра.Дадзеныя запісваліся, фільтраваліся і выкарыстоўваліся для колькаснага вызначэння часу цыкла і ацэнкі расцяжэння тканін падчас сардэчнага цыклу.Запісанае відэа было апрацавана з дапамогай лічбавага фільтра нулявой фазы першага парадку.Для колькаснай ацэнкі расцяжэння тканіны (ад піку да піку) быў праведзены аналіз ад піку да піку, каб адрозніць пікі і спады ў запісаным сігнале.Акрамя таго, дэтрэндаванне выконваецца з выкарыстаннем палінома 6-га парадку для ліквідацыі дрэйфу сігналу.Праграмны код быў распрацаваны ў MATLAB для вызначэння глабальнага руху тканіны, часу цыклу, часу рэлаксацыі і часу скарачэння (дадатковы код праграмы 44).
Для аналізу дэфармацыі, выкарыстоўваючы тыя ж відэа, створаныя для ацэнкі механічнага расцяжэння, мы спачатку прасачылі два выявы, якія прадстаўляюць пікі руху (самую высокую (верхнюю) і самую ніжнюю (ніжнюю) кропкі руху) у адпаведнасці з праграмным забеспячэннем MUSCLEMOTION.Затым мы сегментавалі вобласці тканіны і ўжылі форму алгарытму зацянення да сегментаванай тканіны (дадатковы мал. 2а).Затым сегментаваная тканіна была падзелена на дзесяць субпаверхняў, і напружанне на кожнай паверхні было разлічана з дапамогай наступнага ўраўнення: дэфармацыя = (Sup-Sdown)/Sdown, дзе Sup і Sdown - гэта адлегласці фігуры ад верхняга і ніжняга ценяў тканіны адпаведна (дадатковы малюнак .2b).
Зрэзы сэрца фіксавалі ў 4% параформальдегиде на працягу 48 гадзін.Фіксаваныя тканіны абязводжвалі ў 10% і 20% цукрозе на працягу 1 ч, затым у 30% цукрозе на працягу ночы.Затым зрэзы залівалі ў злучэнне з аптымальнай тэмпературай рэзання (злучэнне OCT) і паступова замарожвалі ў ванне з ізапентанам/сухім лёдам.Захоўвайце ўкладныя блокі OCT пры -80 °C да аддзялення.Слайды былі падрыхтаваны ў выглядзе секцый таўшчынёй 8 мкм.
Каб выдаліць ОКТ са зрэзаў сэрца, нагрэйце прадметныя шкла на награвальным блоку пры 95 °C на працягу 5 хвілін.Дадайце 1 мл PBS на кожнае прадметнае шкло і інкубуйце 30 хвілін пры пакаёвай тэмпературы, затым прахарчуйце зрэзы, усталяваўшы 0,1% Triton-X у PBS на 15 хвілін пры пакаёвай тэмпературы.Каб прадухіліць звязванне неспецыфічных антыцелаў з узорам, дадайце 1 мл 3% раствора BSA на прадметныя шкла і інкубуйце 1 гадзіну пры пакаёвай тэмпературы.Затым BSA выдалілі, а прадметныя шкла прамылі PBS.Адзначце кожны ўзор алоўкам.Першасныя антыцелы (разведзеныя 1:200 у 1% BSA) (канексін 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) і трапонін-Т (Thermo Scientific; #MA5-12960) былі дададзены на працягу 90 хвілін, затым другасныя антыцелы (разведзеныя 1:200 у 1% BSA) супраць мышы Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), супраць труса Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) на працягу дадатковых 90 хвілін. Прамываюць 3 разы PBS. Каб адрозніць мэтавае афарбоўванне ад фону, мы выкарыстоўвалі толькі другасныя антыцелы ў якасці кантролю. Нарэшце, дадалі ядзерную афарбоўку DAPI і прадметныя шкла змясцілі ў vectashield (Vector Laboratories) і запячатаны лакам для пазногцяў. -x павелічэнне) і мікраскоп Keyence з 40-кратным павелічэннем.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) у канцэнтрацыі 5 мкг/мл у PBS выкарыстоўвалі для афарбоўвання WGA і наносілі на фіксаваныя зрэзы на 30 хвілін пры пакаёвай тэмпературы.Затым прадметныя шкла прамывалі PBS і на кожнае прадметнае шкло дадавалі суданскі чорны колер і інкубавалі на працягу 30 хвілін.Затым прадметныя шкла прамывалі PBS і дабаўлялі асяроддзе для ўбудавання vectashield.Слайды візуалізавалі на мікраскопе Keyence пры 40-кратным павелічэнні.
OCT быў выдалены з узораў, як апісана вышэй.Пасля выдалення ОКТ пагрузіце прадметныя шкла ў раствор Буэна на ноч.Затым прадметныя шкла прамывалі дыстыляванай вадой на працягу 1 гадзіны, а затым змяшчалі ў раствор Bibrich алоэ кіслаты фуксіну на 10 хвілін.Затым прадметныя шкла прамывалі дыстыляванай вадой і змяшчалі ў раствор 5% фосфомолибдена/5% фосфовольфрамовой кіслаты на 10 хвілін.Не змываючы, перанясіце прадметныя шкла непасрэдна ў раствор анілінавага сіняга на 15 хвілін.Затым прадметныя шкла промывают дыстыляванай вадой і змяшчаюць у 1% раствор воцатнай кіслаты на 2 хвіліны.Прэзентацыі сушылі ў 200 N этаноле і пераносілі ў ксілол.Афарбаваныя слайды візуалізавалі з дапамогай мікраскопа Keyence з 10-кратным аб'ектывам.Працэнт плошчы фіброзу вызначалі колькасна з дапамогай праграмнага забеспячэння Keyence Analyzer.
Аналіз жыццяздольнасці клетак CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія), нумар па каталогу V13154, згодна з пратаколам вытворцы з некаторымі мадыфікацыямі.У прыватнасці, хірургічны пуансон дыяметрам 6 мм выкарыстоўваўся для забеспячэння аднастайнага памеру тканіны пры аналізе МТТ.Тканіны асобна высейваюць у лункі 12-лункавага пласціны, які змяшчае субстрат МТТ, у адпаведнасці з пратаколам вытворцы.Зрэзы інкубуюць пры 37°C на працягу 3 гадзін, і жывая тканіна метабалізуе субстрат МТТ з адукацыяй фіялетавага фармазана.Заменіце раствор MTT 1 мл ДМСО і інкубуйце пры 37 °C на працягу 15 хвілін, каб атрымаць фіялетавы фармазан з аддзелаў сэрца.Узоры разбаўлялі 1:10 у ДМСО ў 96-лункавых пласцінах з празрыстым дном і вымяралі інтэнсіўнасць фіялетавага колеру пры 570 нм з дапамогай прылады для чытання пласцін Cytation (BioTek).Паказанні нармалізаваліся па вазе кожнага кавалачка сэрца.
Асяроддзе зрэзу сэрца было заменена асяроддзем, якое змяшчае 1 мкКі/мл [5-3H]-глюкозы (Moravek Biochemicals, Брэа, Каліфорнія, ЗША) для аналізу выкарыстання глюкозы, як апісана раней.Пасля 4 гадзін інкубацыі дадайце 100 мкл асяроддзя ў адкрытую микроцентрифужную прабірку, якая змяшчае 100 мкл 0,2 N HCl.Затым прабірку змясцілі ў сцынтыляцыйную прабірку, якая змяшчае 500 мкл dH2O для выпарвання [3H]2O на 72 гадзіны пры 37°C.Затым выміце прабірку мікрацэнтрыфугі са сцынтыляцыйнай трубкі і дадайце 10 мл сцынтыляцыйнай вадкасці.Сцинтилляционный падлік праводзіўся з дапамогай вадкаснага сцинтилляционного аналізатара Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).Затым разлічвалі ўтылізацыю глюкозы з улікам удзельнай актыўнасці [5-3H]-глюкозы, няпоўнага раўнавагі і фону, развядзення [5-3H]-немеченой глюкозы і эфектыўнасці сцинтилляционного лічыльніка.Дадзеныя нармалізуюцца на масу аддзелаў сэрца.
Пасля гамагенізацыі тканіны ў Trizol РНК была вылучана са зрэзаў сэрца з выкарыстаннем Qiagen miRNeasy Micro Kit № 210874 у адпаведнасці з пратаколам вытворцы.Падрыхтоўка бібліятэкі RNAsec, секвенирование і аналіз дадзеных праводзіліся наступным чынам:
У якасці зыходнага матэрыялу для падрыхтоўкі бібліятэкі РНК выкарыстоўвалі 1 мкг РНК на ўзор.Бібліятэкі секвенирования былі створаны з дапамогай NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit для Illumina (NEB, ЗША) у адпаведнасці з рэкамендацыямі вытворцы, і індэксныя коды былі дададзены да паслядоўнасцяў атрыбутаў для кожнага ўзору.Карацей кажучы, мРНК ачышчалі ад агульнай РНК з дапамогай магнітных шарыкаў, прымацаваных полі-Т-алігануклеатыдамі.Фрагментацыя праводзіцца з выкарыстаннем двухвалентных катыёнаў пры высокай тэмпературы ў буферы рэакцыі сінтэзу першага ланцуга NEBNext (5X).Першы ланцуг кДНК быў сінтэзаваны з выкарыстаннем выпадковых гексамерных праймераў і зваротнай транскрыптазы M-MuLV (RNase H-).Затым другі ланцуг кДНК сінтэзуецца з дапамогай ДНК-палімеразы I і РНКазы H. Астатнія выступы пераўтвараюцца ў тупыя канцы з дапамогай экзануклеазнай/палімеразнай актыўнасці.Пасля аденілавання 3'-канца фрагмента ДНК да яго прымацоўваюць адаптар NEBNext са структурай пятлістай шпількі, каб падрыхтаваць яго да гібрыдызацыі.Для адбору фрагментаў кДНК пераважная даўжыня 150-200 п.н.фрагменты бібліятэкі ачышчалі з дапамогай сістэмы AMPure XP (Beckman Coulter, Беверлі, ЗША).Затым выкарыстоўвалі 3 мкл фермента USER (NEB, ЗША) з абранай па памеры кДНК, лигированной адаптарам, на працягу 15 хвілін пры 37 °C, а затым на працягу 5 хвілін пры 95 °C перад ПЦР.Затым была праведзена ПЦР з выкарыстаннем ДНК-палімеразы Phusion High-Fidelity, універсальных праймераў ПЦР і праймераў Index (X).Нарэшце, прадукты ПЦР ачышчалі (сістэма AMPure XP), а якасць бібліятэкі ацэньвалі на сістэме Agilent Bioanalyzer 2100.Затым бібліятэку кДНК секвенировали з дапамогай секвенсора Novaseq.Неапрацаваныя файлы малюнкаў з Illumina былі пераўтвораны ў неапрацаваныя чытанні з дапамогай CASAVA Base Calling.Неапрацаваныя даныя захоўваюцца ў файлах фармату FASTQ(fq), якія змяшчаюць паслядоўнасці чытання і адпаведныя базавыя якасці.Выберыце HISAT2, каб супаставіць адфільтраваныя чытанні паслядоўнасці з эталонным геномам Sscrofa11.1.Увогуле, HISAT2 падтрымлівае геномы любога памеру, уключаючы геномы памерам больш за 4 мільярды падстаў, і для большасці параметраў устаноўлены значэнні па змаўчанні.Зрошчванне счытванняў з дадзеных RNA Seq можа быць эфектыўна ўзгоднена з дапамогай HISAT2, самай хуткай даступнай у цяперашні час сістэмы, з такой жа або лепшай дакладнасцю, чым любы іншы метад.
Багацце транскрыптаў напрамую адлюстроўвае ўзровень экспрэсіі генаў.Узроўні экспрэсіі генаў ацэньваюцца па колькасці транскрыптаў (падлік паслядоўнасці), звязаных з геномам або экзонамі.Колькасць чытанняў прапарцыйная ўзроўню экспрэсіі генаў, даўжыні гена і глыбіні секвенирования.Былі разлічаны FPKM (фрагменты на тысячу пар асноў стэнаграмы, секвенированные на мільён пар асноў), і P-значэнні дыферэнцыяльнай экспрэсіі былі вызначаны з дапамогай пакета DESeq2.Затым мы разлічылі частату ілжывых адкрыццяў (FDR) для кожнага значэння P, выкарыстоўваючы метад Бенджаміні-Хохберга9 на аснове ўбудаванай R-функцыі «p.adjust».
РНК, выдзеленую з зрэзаў сэрца, пераўтваралі ў кДНК у канцэнтрацыі 200 НГ/мкл з дапамогай сумесі SuperScript IV Vilo Master ад Thermo (Thermo, кат. № 11756050).Колькасная RT-PCR была праведзена з выкарыстаннем празрыстага рэакцыйнага пласціны Applied Biosystems Endura Plate Microamp з 384 лункамі (Thermo, кат. № 4483319) і аптычнага клею microamp (Thermo, кат. № 4311971).Рэакцыйная сумесь складалася з 5 мкл сумесі Taqman Fast Advanced Master (Thermo, кат. № 4444557), 0,5 мкл Taqman Primer і 3,5 мкл H2O, змешаных на лунку.Былі праведзены стандартныя цыклы кПЦР і вымераны значэнні КТ з дапамогай прыбора ПЦР у рэальным часе Applied Biosystems Quantstudio 5 (384-лункавы модуль; нумар прадукту A28135).Праймеры Taqman былі набыты ў Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_m). H), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1).
Вызваленне NT-ProBNP у СМІ ацэньвалася з дапамогай набору NT-ProBNP (свіння) (Кат. № MBS2086979, MyBioSource) у адпаведнасці з пратаколам вытворцы.Карацей кажучы, 250 мкл кожнага ўзору і стандарту дадавалі ў двух экземплярах у кожную лунку.Адразу пасля дадання ўзору дадайце 50 мкл рэагента для аналізу А ў кожную лунку.Акуратна падтрасіце пласціну і зачыніце герметыкам.Затым таблеткі інкубавалі пры 37 ° С на працягу 1 гадзіны.Затым аспіруйце раствор і прамыйце лункі 4 разы 350 мкл 1X раствора для прамывання, інкубуючы раствор для прамывання на працягу 1-2 хвілін кожны раз.Затым дадайце 100 мкл аналітычнага рэагента B на лунку і зачыніце герметыкам для пласцін.Планшэт асцярожна боўталі і інкубавалі пры 37°C на працягу 30 хвілін.Аспіруйце раствор і прамыйце лункі 5 разоў 350 мкл 1X раствора для прамывання.Дадайце 90 мкл раствора субстрата ў кожную лунку і зачыніце пласціну.Інкубуйце пласціну пры 37°C на працягу 10-20 хвілін.Дадайце 50 мкл стоп-раствора ў кожную лунку.Пласціна была неадкладна вымераная з дапамогай прылады для чытання пласцін Cytation (BioTek), усталяванай на 450 нм.
Быў праведзены аналіз магутнасці, каб выбраць памеры груп, якія будуць забяспечваць >80% магутнасці для выяўлення 10% абсалютнай змены параметру з 5% частатой памылак тыпу I. Быў праведзены аналіз магутнасці, каб выбраць памеры груп, якія будуць забяспечваць >80% магутнасці для выяўлення 10% абсалютнай змены параметру з 5% частатой памылак тыпу I. Аналіз магутнасці быў выкананы для выбару памераў групы, якія забяспечваюць >80% магутнасці для выяўленага змены 10% абсалютнага параметра з 5% частатой памылкі тыпу I. Аналіз магутнасці быў праведзены для выбару памераў груп, якія забяспечваюць >80% магутнасці для выяўлення 10% абсалютнага змены параметра з 5% частатой памылак тыпу I.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Быў праведзены аналіз магутнасці для выбару памеру групы, які забяспечваў > 80% магутнасці для выяўлення змяненняў 10% абсалютнага параметра і 5% частаты памылак тыпу I. Быў праведзены аналіз магутнасці для выбару памеру групы, які забяспечваў бы >80% магутнасці для выяўлення 10% абсалютнага змены параметра і 5% частаты памылак тыпу I.Зрэзы тканін перад эксперыментам выбіраліся выпадковым чынам.Усе аналізы былі сляпымі, і ўзоры былі расшыфраваны толькі пасля таго, як усе дадзеныя былі прааналізаваны.Праграмнае забеспячэнне GraphPad Prism (Сан-Дыега, Каліфорнія) выкарыстоўвалася для правядзення ўсіх статыстычных аналізаў. Для ўсіх статыстычных дадзеных р-значэнні лічыліся значнымі пры значэннях <0,05. Для ўсіх статыстычных дадзеных р-значэнні лічыліся значнымі пры значэннях <0,05. Для ўсёй статыстыкі p-значэнні лічыліся значнымі пры значэннях <0,05. Для ўсіх статыстычных дадзеных р-значэнні лічыліся значнымі пры значэннях <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Для ўсёй статыстыкі p-значэнні лічыліся значнымі пры значэннях <0,05. Для ўсіх статыстычных дадзеных р-значэнні лічыліся значнымі пры значэннях <0,05.Двухбаковы t-крытэрый Ст'юдэнта быў выкананы на дадзеных толькі з 2 параўнаннямі.Аднабаковы або двухбаковы ANOVA выкарыстоўваўся для вызначэння значнасці паміж некалькімі групамі.Пры выкананні постспецыальных тэстаў была ўжытая папраўка Тьюкі для ўліку некалькіх параўнанняў.Даныя RNAsec маюць асаблівыя статыстычныя меркаванні пры разліку FDR і p.adjust, як апісана ў раздзеле "Метады".
Для атрымання дадатковай інфармацыі аб дызайне даследавання глядзіце анатацыю да справаздачы аб даследаваннях прыроды, спасылка на якую спасылаецца на гэты артыкул.