Дзякуй за наведванне сайта Nature.com. Версія браўзера, якой вы карыстаецеся, мае абмежаваную падтрымку CSS. Для найлепшага карыстання рэкамендуем выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Тым часам, каб забяспечыць бесперапынную падтрымку, мы будзем адлюстроўваць сайт без стыляў і JavaScript.
Новыя імуналагічныя і мас-спектрометрычныя метады для комплекснага аналізу ўстойлівых алігацукрыдаў у кукурузных слаях, папярэдне апрацаваных AFEX. Лігнацэлюлозная біямаса з'яўляецца ўстойлівай альтэрнатывай выкапнёваму паліву і шырока выкарыстоўваецца для распрацоўкі біятэхналогій вытворчасці такіх прадуктаў, як прадукты харчавання, корм, паліва і хімікаты. Ключом да гэтых тэхналогій з'яўляецца распрацоўка канкурэнтаздольных па кошту працэсаў пераўтварэння складаных вугляводаў, якія прысутнічаюць у клеткавых сценках раслін, у простыя цукры, такія як глюкоза, ксілоза і арабіноза. Паколькі лігнацэлюлозная біямаса вельмі ўстойлівая, яна павінна падвяргацца тэрмахімічнай апрацоўцы (напрыклад, эксфаліяцыя аміячных валокнаў (AFEX), разведзеныя кіслоты (DA), іонныя вадкасці (IL)) і біялагічнай апрацоўцы (напрыклад, ферментатыўны гідроліз і мікробная ферментацыя) у спалучэнні для атрымання патрэбнага прадукту. Аднак, калі ў працэсе гідролізу выкарыстоўваюцца камерцыйныя грыбковыя ферменты, толькі 75-85% утвораных растваральных цукроў з'яўляюцца монацукрыдамі, а астатнія 15-25% - растваральныя, непаддаючыяся растварэнню алігацукрыды, якія не заўсёды даступныя для мікраарганізмаў. Раней мы паспяхова вылучылі і ачысцілі растваральныя ўстойлівыя алігацукрыды, выкарыстоўваючы камбінацыю падзелу на вугляродзе і дыатамітавай зямлі і выключальнай храматаграфіі, а таксама даследавалі іх інгібіруючыя ўласцівасці ў дачыненні да ферментаў. Мы выявілі, што алігацукрыды, якія змяшчаюць метыляваныя ўронавыя кіслоты з больш высокай ступенню палімерызацыі (DP), цяжэй апрацоўваць камерцыйнымі сумесямі ферментаў, чым алігацукрыды з нізкай DP і нейтральныя. Тут мы паведамляем аб выкарыстанні некалькіх дадатковых метадаў, у тым ліку прафілявання гліканаў з выкарыстаннем моноклональных антыцелаў (mAb), спецыфічных да гліканаў расліннай біямасы, для характарыстыкі гліканавых сувязей у клеткавых сценках раслін і ферментатыўных гідралізатах, матрычна-асіставанай лазернай дэсорбцыйнай іанізацыі, часпралётнай мас-спектрометрыі. MALDI-TOF-MS) выкарыстоўвае структурна-інфарматыўныя дыягнастычныя пікі, атрыманыя спектраскапіяй пасля другаснага распаду адмоўных іонаў, газавай храматаграфіі і мас-спектрометрыі (GC-MS) для характарыстыкі алігацукрыдных сувязей з дэрыватызацыяй і без яе. З-за малога памеру алігацукрыдаў (DP 4-20) гэтыя малекулы цяжка выкарыстоўваць для звязвання і характарыстыкі mAb. Каб пераадолець гэтую праблему, мы ўжылі новы метад імабілізацыі алігацукрыдаў на аснове кан'югацыі біятыну, які паспяхова пазначыў большасць нізкарастваральных алігацукрыдаў на паверхні мікрапланшэта, якія затым былі выкарыстаны ў высокапрадукцыйнай сістэме mAb для спецыфічнага лігацыйнага аналізу. Гэты новы метад будзе спрыяць распрацоўцы больш прасунутых высокапрадукцыйных глікамавых аналізаў у будучыні, якія можна будзе выкарыстоўваць для вылучэння і характарыстыкі алігацукрыдаў, прысутных у біямаркерах, у дыягнастычных мэтах.
Лігнацэлюлозная біямаса, якая складаецца з сельскагаспадарчых, лясных, травяных і драўняных матэрыялаў, з'яўляецца патэнцыйнай сыравінай для вытворчасці біяпрадуктаў, у тым ліку прадуктаў харчавання, кармоў, паліва і хімічных папярэднікаў для атрымання больш каштоўнай прадукцыі1. Вугляводы (напрыклад, цэлюлоза і геміцэлюлоза), якія прысутнічаюць у клеткавых сценках раслін, дэпалімерызуюцца ў монацукрыды шляхам хімічнай апрацоўкі і біятрансфармацыі (напрыклад, ферментатыўнага гідролізу і мікробнай ферментацыі). Звычайныя папярэднія апрацоўкі ўключаюць пашырэнне аміячных валокнаў (AFEX), разведзеную кіслату (DA), іонную вадкасць (IL) і паравы выбух (SE), якія выкарыстоўваюць камбінацыю хімічных рэчываў і цяпла для зніжэння вытворчасці лігнацэлюлозы шляхам адкрыцця клеткавых сценак раслін3,4. упартасць рэчыва,5. Ферментатыўны гідроліз праводзіцца пры высокай нагрузцы цвёрдых рэчываў з выкарыстаннем камерцыйных ферментаў, якія змяшчаюць актыўныя вугляводы (CAZymes), і мікробнай ферментацыі з выкарыстаннем трансгенных дрожджаў або бактэрый для вытворчасці біяпаліва і хімічных рэчываў6.
CAZymes у камерцыйных ферментах складаюцца са складанай сумесі ферментаў, якія сінергічна расшчапляюць складаныя вугляводна-цукровыя сувязі з утварэннем монацукрыдаў2,7. Як мы паведамлялі раней, складаная сетка араматычных палімераў лігніну з вугляводамі робіць іх вельмі непаддатлівымі для пераўтварэння, што прыводзіць да няпоўнага пераўтварэння цукру, назапашваючы 15-25% палавых алігацукрыдаў, якія не ўтвараюцца падчас ферментатыўнага гідролізу папярэдне апрацаванай біямасы. Гэта распаўсюджаная праблема з рознымі метадамі папярэдняй апрацоўкі біямасы. Некаторыя прычыны гэтага вузкага месца ўключаюць інгібіраванне ферментаў падчас гідролізу, або адсутнасць або нізкі ўзровень неабходных ферментаў, якія неабходныя для разрыву цукровых сувязей у расліннай біямасе. Разуменне складу і структурных характарыстык цукроў, такіх як цукровыя сувязі ў алігацукрыдах, дапаможа нам палепшыць пераўтварэнне цукру падчас гідролізу, што зробіць біятэхналагічныя працэсы канкурэнтаздольнымі па кошту з прадуктамі, атрыманымі з нафты.
Вызначэнне структуры вугляводаў з'яўляецца складанай задачай і патрабуе камбінацыі такіх метадаў, як вадкасная храматаграфія (ВХ)11,12, ядзерна-магнітна-рэзанансная спектраскапія (ЯМР)13, капілярны электрафарэз (КЭ)14,15,16 і мас-спектрометрыя (МС)17. ,васямнаццаць. Метады МС, такія як часапалётная мас-спектрометрыя з лазернай дэсорбцыяй і іанізацыяй з выкарыстаннем матрыцы (MALDI-TOF-MS), з'яўляюцца універсальным метадам ідэнтыфікацыі вугляводных структур. Апошнім часам для ідэнтыфікацыі адбіткаў пальцаў, якія адпавядаюць пазіцыям прымацавання алігацукрыдаў, анамерным канфігурацыям, паслядоўнасцям і пазіцыям разгалінавання 20, 21, найбольш шырока выкарыстоўваецца тандемная МС з індукаванай сутыкненнямі (CID) аддуктаў іонаў натрыю.
Аналіз гліканаў — выдатны інструмент для паглыбленай ідэнтыфікацыі вугляводных сувязей22. Гэты метад выкарыстоўвае моноклональные антыцелы (mAb), накіраваныя на глікан клеткавай сценкі раслін, у якасці зондаў для разумення складаных вугляводных сувязяў. У свеце даступна больш за 250 mAb, распрацаваных супраць розных лінейных і разгалінаваных алігацукрыдаў з выкарыстаннем розных цукрыдаў24. Некалькі mAb шырока выкарыстоўваюцца для характарыстыкі структуры, складу і мадыфікацый клеткавай сценкі раслін, паколькі існуюць значныя адрозненні ў залежнасці ад тыпу расліннай клеткі, органа, узросту, стадыі развіцця і асяроддзя росту25,26. Зусім нядаўна гэты метад выкарыстоўваецца для разумення папуляцый везікул у раслінных і жывёльных сістэмах і іх адпаведнай ролі ў транспарце гліканаў, якая вызначаецца субклеткавымі маркерамі, стадыямі развіцця або стымуламі навакольнага асяроддзя, а таксама для вызначэння ферментатыўнай актыўнасці. Сярод ідэнтыфікаваных розных структур гліканаў і ксіланаў можна назваць пекцін (P), ксіланы (X), манан (M), ксілаглюканы (XylG), глюканы са змешанымі сувязямі (MLG), арабінаксілан (ArbX), галактаманан (GalG), глюкуронавую кіслату-арабінаксілан (GArbX) і арабіна-галактан (ArbG)29.
Аднак, нягледзячы на ​​ўсе гэтыя даследчыя намаганні, толькі некалькі даследаванняў былі сканцэнтраваны на характары назапашвання алігацукрыдаў падчас гідролізу з высокай нагрузкай цвёрдых рэчываў (HSL), уключаючы вызваленне алігацукрыдаў, змены даўжыні алігамернага ланцуга падчас гідролізу, розныя палімеры з нізкім утрыманнем цвёрдых рэчываў і іх крывыя размеркавання 30, 31, 32. Тым часам, хоць аналіз гліканаў аказаўся карысным інструментам для ўсебаковага аналізу структуры гліканаў, цяжка ацаніць водарастваральныя алігацукрыды з нізкім утрыманнем цвёрдых рэчываў з выкарыстаннем метадаў антыцелаў. Меншыя алігацукрыды DP з малекулярнай масай менш за 5-10 кДа не звязваюцца з пласцінамі ELISA 33, 34 і змываюцца перад даданнем антыцелаў.
Тут мы ўпершыню дэманструем аналіз ELISA на пакрытых авідынам пласцінах з выкарыстаннем моноклональных антыцелаў, які спалучае аднаэтапную працэдуру біятынілявання для растваральных вогнетрывалых алігацукрыдаў з аналізам глікома. Наш падыход да аналізу глікома быў пацверджаны з дапамогай аналізу камплементарных алігацукрыдных сувязяў на аснове MALDI-TOF-MS і GC-MS з выкарыстаннем трыметылсілільнай (TMS) дэрыватызацыі гідралізаваных цукровых кампазіцый. Гэты інавацыйны падыход можа быць распрацаваны як высокапрадукцыйны метад у будучыні і знайсці больш шырокае прымяненне ў біямедыцынскіх даследаваннях35.
Посттрансляцыйныя мадыфікацыі ферментаў і антыцелаў, такія як гліказіляванне,36 уплываюць на іх біялагічную актыўнасць. Напрыклад, змены ў гліказіляванні сыроватачных бялкоў адыгрываюць важную ролю ў запаленчым артрыце, і змены ў гліказіляванні выкарыстоўваюцца ў якасці дыягнастычных маркераў37. У літаратуры паведамлялася, што розныя гліканы лёгка з'яўляюцца пры розных захворваннях, у тым ліку хранічных запаленчых захворваннях страўнікава-кішачнага тракту і печані, вірусных інфекцыях, раку яечнікаў, малочнай залозы і прастаты38,39,40. Разуменне структуры гліканаў з выкарыстаннем метадаў ІФА на аснове антыцелаў забяспечыць дадатковую ўпэўненасць у дыягностыцы захворванняў без выкарыстання складаных метадаў МС.
Наша папярэдняе даследаванне паказала, што ўстойлівыя алігацукрыды застаюцца негідралізаванымі пасля папярэдняй апрацоўкі і ферментатыўнага гідролізу (Малюнак 1). У нашай раней апублікаванай працы мы распрацавалі метад цвёрдафазнай экстракцыі актываваным вуглём для вылучэння алігацукрыдаў з гідралізату кукурузнай стружкі (ACSH)8, папярэдне апрацаванага AFEX. Пасля першапачатковай экстракцыі і падзелу алігацукрыды былі дадаткова фракцыянаваны з дапамогай эксклюзіўнай храматаграфіі (SEC) і сабраны ў парадку малекулярнай масы. Цукровыя манамеры і алігамеры, вызваленыя з розных папярэдніх апрацоўак, былі прааналізаваны з дапамогай аналізу складу цукру. Пры параўнанні ўтрымання цукровых алігамераў, атрыманых рознымі метадамі папярэдняй апрацоўкі, наяўнасць устойлівых алігацукрыдаў з'яўляецца распаўсюджанай праблемай пры пераўтварэнні біямасы ў монацукрыды і можа прывесці да зніжэння выхаду цукру як мінімум на 10-15% і нават да 18%. ЗША. Гэты метад выкарыстоўваецца для далейшай буйнамаштабнай вытворчасці фракцый алігацукрыдаў. Атрыманы ACH і яго наступныя фракцыі з рознымі малекулярнымі масамі былі выкарыстаны ў якасці эксперыментальнага матэрыялу для характарыстыкі алігацукрыдаў у гэтай працы.
Пасля папярэдняй апрацоўкі і ферментатыўнага гідролізу ўстойлівыя алігацукрыды заставаліся негідралізаванымі. Тут (А) — метад падзелу алігацукрыдаў, пры якім алігацукрыды вылучаюцца з папярэдне апрацаванага AFEX гідралізату кукурузных слаёў (ACSH) з выкарыстаннем ушчыльненага слоя актываванага вугалю і дыятомавай зямлі; (Б) Спосаб падзелу алігацукрыдаў. Алігацукрыды былі дадаткова падзеленыя з дапамогай эксклюзіўнай храматаграфіі (SEC); (В) Цукровыя манамеры і алігамеры, вызваленыя з розных папярэдніх апрацовак (разведзеная кіслата: DA, іённая вадкасць: IL і AFEX). Умовы ферментатыўнага гідролізу: высокая загрузка цвёрдых рэчываў 25% (мас./мас.) (прыблізна 8% загрузка глюкана), 96 гадзін гідролізу, загрузка камерцыйнага фермента 20 мг/г (суадносіны Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) і (Г) Цукровыя манамеры і алігамеры глюкозы, ксілозы і арабінозы, вызваленыя з папярэдне апрацаванага AFEX кукурузных слаёў (ACS).
Аналіз гліканаў аказаўся карысным інструментам для комплекснага структурнага аналізу гліканаў у экстрактах, выдзеленых з рэшткаў цвёрдай біямасы. Аднак водарастваральныя цукрыды недастаткова прадстаўлены пры выкарыстанні гэтага традыцыйнага метаду41, паколькі нізкамалекулярныя алігацукрыды цяжка імабілізаваць на пласцінах ELISA і вымываюцца перад даданнем антыцелаў. Таму для звязвання і характарыстыкі антыцелаў быў выкарыстаны аднаэтапны метад біятынілявання для пакрыцця растваральных, неадпаведных алігацукрыдаў на пакрытых авідынам пласцінах ELISA. Гэты метад быў пратэставаны з выкарыстаннем нашага раней вырабленага ACSH і фракцыі на аснове яго малекулярнай масы (або ступені палімерызацыі, DP). Аднаэтапнае біятыніляванне было выкарыстана для павышэння афіннасці звязвання алігацукрыдаў шляхам дадання біятын-LC-гідразіду да аднаўляльнага канца вуглявода (мал. 2). У растворы геміацэтальная група на аднаўляльным канцы рэагуе з гідразіднай групай біятын-LC-гідразіду з утварэннем гідразонавай сувязі. У прысутнасці аднаўляльніка NaCNBH3 гідразонавая сувязь аднаўляецца да стабільнага біятыніляванага канчатковага прадукту. Дзякуючы мадыфікацыі канца, які змяншае цукар, стала магчымым звязванне алігацукрыдаў з нізкім DP з пласцінамі ELISA, і ў нашым даследаванні гэта было зроблена на пласцінах, пакрытых авідынам, з выкарыстаннем глікан-мэтаваных манаклональных антыцелаў.
Скрынінг моноклональных антыцелаў на аснове ELISA на наяўнасць біятыніляваных алігацукрыдаў. Тут (A) камбінаванае біятыніляванне алігацукрыдаў і наступны скрынінг ELISA з дапамогай глікан-мэтаваных манаклональных антыцелаў на пласцінах, пакрытых NeutrAvidin, а (B) паказана аднаэтапная працэдура біятынілявання прадуктаў рэакцыі.
Затым да першасных і другасных антыцелаў дадавалі пласціны, пакрытыя авідынам, з алігацукрыдна-кан'югаванымі антыцеламі і прамывалі ў святло- і час-адчувальным асяроддзі. Пасля завяршэння звязвання антыцелаў дадавалі субстрат TMB для інкубацыі пласціны. Рэакцыю канчаткова спынялі сернай кіслатой. Інкубаваныя пласціны аналізавалі з дапамогай ELISA-рыдэра для вызначэння сілы звязвання кожнага антыцелы і выяўлення спецыфічнага для антыцелаў зшывання. Падрабязную інфармацыю і параметры эксперыменту гл. у адпаведным раздзеле «Матэрыялы і метады».
Мы дэманструем карыснасць гэтага нядаўна распрацаванага метаду для канкрэтных ужыванняў, характарызуючы растваральныя алігацукрыды, якія прысутнічаюць у ACSH, а таксама ў неачышчаных і ачышчаных фракцыях алігацукрыдаў, выдзеленых з лігнацэлюлозных гідралізатаў. Як паказана на малюнку 3, найбольш распаўсюджанымі эпітоп-замешчанымі ксіланамі, ідэнтыфікаванымі ў ACSH з выкарыстаннем метадаў аналізу біяацыляванага глікома, звычайна з'яўляюцца уронавая (U) або метылуронавая (MeU) і пектынавыя арабінагалактаны. Большасць з іх таксама былі знойдзены ў нашым папярэднім даследаванні па аналізе гліканаў негідралізаваных цвёрдых рэчываў (UHS)43.
Выяўленне ўстойлівых алігацукрыдных эпітопаў з выкарыстаннем моноклональных антыцелаў, накіраваных на глікан клеткавай сценкі. «Нейтральная» фракцыя — гэта фракцыя ACN, а «кіслая» фракцыя — фракцыя FA. Больш яркія чырвоныя колеры на цеплавой карце паказваюць больш высокае ўтрыманне эпітопаў, а больш яркія сінія — пусты фон. Значэнні колераў на шкале заснаваны на неапрацаваных значэннях аптычнай шчыльнасці для прэпаратаў N=2. Асноўныя эпітопы, якія распазнаюцца антыцеламі, паказаны справа.
Гэтыя нецэлюлозныя структуры не маглі быць расшчаплены найбольш распаўсюджанымі цэлюлазамі і геміцэлюлазамі ў праверанай камерцыйнай сумесі ферментаў, якая ўключае найбольш часта выкарыстоўваныя камерцыйныя ферменты. Такім чынам, для іх гідролізу патрабуюцца новыя дапаможныя ферменты. Без неабходных нецэлюлозных дапаможных ферментаў гэтыя нецэлюлозныя сувязі перашкаджаюць поўнаму ператварэнню ў монацукрыды, нават калі іх зыходныя цукровыя палімеры інтэнсіўна гідралізуюцца на больш кароткія фрагменты і раствараюцца з выкарыстаннем камерцыйных сумесяў ферментаў.
Далейшае вывучэнне размеркавання сігналу і яго сілы звязвання паказала, што колькасць эпітопаў звязвання была ніжэйшай у фракцыях цукроў з высокім DP (A, B, C, DP да 20+), чым у фракцыях з нізкім DP (D, E, F, DP) у дымерах (мал. 1). Кіслотныя фрагменты часцей сустракаюцца ў нецэлюлозных эпітопах, чым у нейтральных фрагментах. Гэтыя з'явы адпавядаюць заканамернасці, якая назіралася ў нашым папярэднім даследаванні, дзе высокі DP і кіслотныя фрагменты былі больш устойлівыя да ферментатыўнага гідролізу. Такім чынам, прысутнасць нецэлюлозных гліканавых эпітопаў і замен U і MeU можа значна спрыяць стабільнасці алігацукрыдаў. Варта адзначыць, што эфектыўнасць звязвання і дэтэктавання можа быць праблематычнай для алігацукрыдаў з нізкім DP, асабліва калі эпітоп з'яўляецца дымерным або трымерным алігацукрыдам. Гэта можна праверыць з выкарыстаннем камерцыйных алігацукрыдаў рознай даўжыні, кожны з якіх змяшчае толькі адзін эпітоп, які звязваецца са спецыфічным mAb.
Такім чынам, выкарыстанне структурна-спецыфічных антыцелаў выявіла пэўныя тыпы ўстойлівых сувязяў. У залежнасці ад тыпу выкарыстоўванага антыцелы, адпаведнага шаблону лігавання і сілы сігналу, які ён стварае (найбольш і найменш распаўсюджаны), новыя ферменты можна ідэнтыфікаваць і паўколькасна дадаваць да сумесі ферментаў для больш поўнай глікаканверсіі. Узяўшы ў якасці прыкладу аналіз алігацукрыдаў ACSH, мы можам стварыць базу дадзеных гліканавых сувязяў для кожнага біямасавага матэрыялу. Тут варта адзначыць, што варта ўлічваць розную афіннасць антыцелаў, і калі іх афіннасць невядомая, гэта створыць пэўныя цяжкасці пры параўнанні сігналаў розных антыцелаў. Акрамя таго, параўнанне гліканавых сувязяў можа найлепшым чынам працаваць паміж узорамі для аднаго і таго ж антыцелы. Гэтыя ўстойлівыя сувязі можна затым звязаць з базай дадзеных CAZyme, з якой мы можам ідэнтыфікаваць ферменты, выбіраць ферменты-кандыдаты і тэставаць на ферменты, якія разрываюць сувязі, або распрацоўваць мікробныя сістэмы для экспрэсіі гэтых ферментаў для выкарыстання ў біяперапрацоўчых заводах44.
Каб ацаніць, як імуналагічныя метады дапаўняюць альтэрнатыўныя метады характарыстыкі нізкамалекулярных алігацукрыдаў, якія прысутнічаюць у лігнацэлюлозных гідралізатах, мы правялі MALDI (мал. 4, S1-S8) і аналіз цукрыдаў, атрыманых з дапамогай TMS, на аснове ГХ-МС на той жа панэлі (мал. 5) алігацукрыднай часткі. MALDI выкарыстоўваецца для параўнання таго, ці адпавядае размеркаванне малекул алігацукрыдаў па масе меркаванай структуры. На мал. 4 паказана МС нейтральных кампанентаў ACN-A і ACN-B. Аналіз ACN-A пацвердзіў дыяпазон пентозных цукроў ад DP 4-8 (мал. 4) да DP 22 (мал. S1), вагі якіх адпавядаюць алігацукрыдам MeU-ксілана. Аналіз ACN-B пацвердзіў шэраг пентоз і глюкаксілана з DP 8-15. У дадатковых матэрыялах, такіх як малюнак S3, карты размеркавання масы кіслотных фрагментаў FA-C паказваюць шэраг пентозных цукроў, замешчаных (Me)U, з DP 8-15, што адпавядае замешчаным ксіланам, выяўленым пры скрынінгу mAb на аснове ELISA. Эпітопы адпавядаюць.
Спектр MALDI-MS растваральных неадпаведных алігацукрыдаў, якія прысутнічаюць у ACS. Тут (A) фракцыі ACN-A з нізкім дыяпазонам вагі, якія змяшчаюць метыляваную ўронавую кіслату (DP 4-8), замешчаныя глюкураксіланавымі алігацукрыдамі, і (B) ксілан ACN-B і метыляваныя ўронавыя алігацукрыды, замешчаныя глюкураксіланам (DP 8-15).
Аналіз складу гліканавых рэшткаў тугаплаўкіх алігацукрыдаў. Тут (A) Склад цукроў ТМС розных фракцый алігацукрыдаў, атрыманых з дапамогай ГХ-МС-аналізу. (B) Структуры розных цукроў, атрыманых з ТМС, якія прысутнічаюць у алігацукрыдах. ACN – фракцыя ацэтанітрылу, якая змяшчае нейтральныя алігацукрыды, і FA – фракцыя ферулавай кіслаты, якая змяшчае кіслыя алігацукрыды.
Яшчэ адна цікавая выснова была зроблена з аналізу вадкаснай хроматографіі-мас-спектрометрыі (LC-MS) фракцыі алігацукрыдаў, як паказана на малюнку S9 (метады можна ўбачыць у дадатковых электронных матэрыялах). Фрагменты гексозных і -OAc-груп неаднаразова назіраліся падчас лігавання фракцыі ACN-B. Гэта адкрыццё не толькі пацвярджае фрагментацыю, якая назіраецца пры аналізе глікома і MALDI-TOF, але і дае новую інфармацыю аб патэнцыйных вугляводных вытворных у папярэдне апрацаванай лігнацэлюлознай біямасе.
Мы таксама правялі аналіз складу гліканавых фракцый алігацукрыдаў з выкарыстаннем ТМС-дэрыватызацыі гліканавых рэчываў. З дапамогай ГХ-МС мы вызначылі склад нейронных (невытворных) і кіслых цукроў (GluA і GalA) у фракцыі алігацукрыдаў (мал. 5). Глюкуроновая кіслата знаходзіцца ў кіслых кампанентах C і D, а галактуроновая кіслата — у кіслых кампанентах A і B, якія з'яўляюцца кампанентамі з высокім DP кіслых цукроў. Гэтыя вынікі не толькі пацвярджаюць нашы дадзеныя ELISA і MALDI, але і адпавядаюць нашым папярэднім даследаванням назапашвання алігацукрыдаў. Такім чынам, мы лічым, што сучасныя імуналагічныя метады з выкарыстаннем біятынілявання алігацукрыдаў і наступнага скрынінга ELISA дастатковыя для выяўлення растваральных устойлівых алігацукрыдаў у розных біялагічных узорах.
Паколькі метады скрынінга мАт на аснове ELISA былі правераны некалькімі рознымі метадамі, мы хацелі далей вывучыць патэнцыял гэтага новага колькаснага метаду. Два камерцыйныя алігацукрыды, ксілагексацукрыдны алігацукрыд (XHE) і 23-α-L-арабінафураназіл-ксілатрыёза (A2XX), былі набыты і пратэставаны з выкарыстаннем новага падыходу да мАт, накіраванага на глікан клеткавай сценкі. На малюнку 6 паказана лінейная карэляцыя паміж сігналам біятыніляванага звязвання і лагарыфмічнай канцэнтрацыяй алігацукрыду, што сведчыць аб магчымай мадэлі адсорбцыі Ленгмюра. Сярод мАт CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 і CCRC-M151 карэлявалі з XHE, а CCRC-M108, CCRC-M109 і LM11 карэлявалі з A2XX у дыяпазоне ад 1 нм да 100 нана. З-за абмежаванай даступнасці антыцелаў падчас эксперыменту з кожнай канцэнтрацыяй алігацукрыду была праведзена абмежаваная колькасць эксперыментаў. Варта адзначыць, што некаторыя антыцелы вельмі па-рознаму рэагуюць на адзін і той жа алігацукрыд у якасці субстрата, верагодна, таму, што яны звязваюцца з некалькі рознымі эпітопамі і могуць мець вельмі розную афіннасць звязвання. Механізмы і наступствы дакладнай ідэнтыфікацыі эпітопаў будуць значна больш складанымі, калі новы падыход mAb будзе прыменены да рэальных узораў.
Для вызначэння дыяпазону выяўлення розных глікан-таргетынгавых манаклональных антыцелаў былі выкарыстаны два камерцыйныя алігацукрыды. Тут лінейныя карэляцыі з лагарыфмічнай канцэнтрацыяй алігацукрыду паказваюць на карціны адсорбцыі Ленгмюра для (A) XHE з манаклональным антыцелам і (B) A2XX з манаклональным антыцелам. Адпаведныя эпітопы паказваюць структуры камерцыйных алігацукрыдаў, якія выкарыстоўваліся ў якасці субстратаў у аналізе.
Выкарыстанне монакланальных антыцелаў, накіраваных на гліканы (глікакамічны аналіз або скрынінг мКАН на аснове ELISA), з'яўляецца магутным інструментам для паглыбленай характарыстыкі большасці асноўных гліканаў клеткавай сценкі, якія складаюць раслінную біямасу. Аднак класічны аналіз гліканаў характарызуе толькі больш буйныя гліканы клеткавай сценкі, паколькі большасць алігацукрыдаў неэфектыўна імабілізуюцца на пласцінах ELISA. У гэтым даследаванні папярэдне апрацаваная AFEX кукурузная стружка была ферментатыўна гідралізавана пры высокім утрыманні цвёрдых рэчываў. Аналіз цукру выкарыстоўваўся для вызначэння складу ўстойлівых вугляводаў клеткавай сценкі ў гідралізаце. Аднак аналіз мКАН меншых алігацукрыдаў у гідралізатах недаацэнены, і для эфектыўнай імабілізацыі алігацукрыдаў на пласцінах ELISA неабходныя дадатковыя інструменты.
Тут мы паведамляем пра новы і эфектыўны метад імабілізацыі алігацукрыдаў для скрынінга mAb, які спалучае біятыніляванне алігацукрыдаў з наступным скрынінгам ELISA на пласцінах, пакрытых NeutrAvidin™. Імабілізаваныя біятыніляваныя алігацукрыды прадэманстравалі дастатковую афіннасць да антыцелаў, каб забяспечыць хуткае і эфектыўнае выяўленне ўстойлівых алігацукрыдаў. Аналіз складу гэтых устойлівых алігацукрыдаў на аснове мас-спектрометрыі пацвердзіў вынікі гэтага новага падыходу да імунаскрынінгу. Такім чынам, гэтыя даследаванні паказваюць, што спалучэнне біятынілявання алігацукрыдаў і скрынінга ELISA з глікан-мэтавымі манаклональнымі антыцеламі можа быць выкарыстана для выяўлення зшыванняў у алігацукрыдах і можа шырока ўжывацца ў іншых біяхімічных даследаваннях, якія характарызуюць структуру алігацукрыдаў.
Гэты метад прафілявання гліканаў на аснове біятыну — першы даклад, які дазваляе даследаваць устойлівыя вугляводныя сувязі растваральных алігацукрыдаў у расліннай біямасе. Гэта дапамагае зразумець, чаму некаторыя часткі біямасы настолькі ўстойлівыя, калі гаворка ідзе пра вытворчасць біяпаліва. Гэты метад запаўняе важны прабел у метадах аналізу глікаму і пашырае яго прымяненне на больш шырокі спектр субстратаў, акрамя раслінных алігацукрыдаў. У будучыні мы можам выкарыстоўваць робататэхніку для біятынілявання і выкарыстоўваць распрацаваны намі метад для высокапрадукцыйнага аналізу ўзораў з дапамогай ELISA.
Кукурузная салома (КС), вырашчаная з гібрыднага насення Pioneer 33A14, была сабрана ў 2010 годзе на ферме Kramer у горадзе Рэй, штат Каларада. З дазволу землеўладальніка гэтая біямаса можа быць выкарыстана для даследаванняў. Узоры захоўваліся сухімі пры вільготнасці < 6% у пакетах з зашпількай-маланкай пры пакаёвай тэмпературы. Узоры захоўваліся сухімі пры вільготнасці < 6% у пакетах з зашпількай-маланкай пры пакаёвай тэмпературы. Абразцы захоўваліся сухімі пры вільготнасці < 6% у пакетах з засцежкай-молнией пры пакаёвай тэмпературы. Узоры захоўваліся ў сухім месцы пры вільготнасці <6% у пакетах з маланкай пры пакаёвай тэмпературы.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Абразцы хранят у пакетах з засцежкай-молнием пры пакаёвай тэмпературы з вільготнасцю < 6%. Узоры захоўваюцца ў пакетах з зашпількай-маланкай пры пакаёвай тэмпературы з вільготнасцю < 6%.Даследаванне адпавядала мясцовым і нацыянальным рэкамендацыям. Аналіз складу быў праведзены з выкарыстаннем пратаколу NREL. Было ўстаноўлена, што склад утрымлівае 31,4% глюкана, 18,7% ксілана, 3,3% арабінану, 1,2% галактану, 2,2% ацэтылу, 14,3% лігніну, 1,7% бялку і 13,4% попелу.
Cellic® CTec2 (138 мг бялку/мл, серыя VCNI 0001) — гэта складаная сумесь цэлюлазы, β-глюказідазы і Cellic® HTec2 (157 мг бялку/мл, серыя VHN00001) ад Novozymes (Франклінтан, Паўночная Караліна, ЗША). Multifect Pectinase® (72 мг бялку/мл), складаная сумесь ферментаў, якія расшчапляюць пекцін, была прадастаўлена DuPont Industrial Biosciences (Пала-Альта, Каліфорнія, ЗША). Канцэнтрацыі бялку ў ферментах вызначаліся шляхам ацэнкі ўтрымання бялку (і аднімання ўкладу небялковага азоту) з выкарыстаннем аналізу азоту па К'ельдалю (метад AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ітака, Нью-Ёрк, ЗША). Дыатамітавая зямля 545 была набыта ў EMD Millipore (Білерыка, Масачусэтс). Актываваны вугаль (DARCO, гранулы 100 меш), Avicel (PH-101), букавы ксілан і ўсе іншыя хімікаты былі набыты ў Sigma-Aldrich (Сэнт-Луіс, штат Місуры).
Папярэдняя апрацоўка AFEX праводзілася ў GLBRC (Лабараторыя даследаванняў канверсіі біямасы, MSU, Лансінг, Мічыган, ЗША). Папярэдняя апрацоўка праводзілася пры тэмпературы 140°C на працягу 15 хвілін. Час знаходжання - 46 хвілін пры суадносінах бязводнага аміяку да біямасы 1:1 і загрузцы 60% (мас./мас.) у настольным рэактары перыядычнай працы з нержавеючай сталі (Parr Instruments Company). Гэта заняло 30 хвілін. Рэактар ​​награвалі да 140°C, і аміяк хутка вызваліўся, што дазволіла біямасе хутка вярнуцца да пакаёвай тэмпературы. Склад папярэдне апрацаванай AFEX кукурузнай сцяблоў (ACS) быў падобны да складу неапрацаванай кукурузнай сцяблоў (UT-CS).
Высокатрывалы ACSH 25% (мас./мас.) (прыблізна 8% дэкстранавая загрузка) быў падрыхтаваны ў якасці зыходнага матэрыялу для маштабнай вытворчасці алігацукрыдаў. Ферментатыўны гідроліз ACS быў праведзены з выкарыстаннем камерцыйнай сумесі ферментаў, якая ўключае Cellic® Ctec2 10 мг бялку/г глюкана (у папярэдне апрацаванай біямасе), Htec2 (Novozymes, Франклінтан, Паўночная Караліна), 5 мг бялку/г глюкана, і Multifect Pectinase (Genencor Inc, ЗША). ), 5 мг бялку/г дэкстрана. Ферментатыўны гідроліз праводзілі ў 5-літровым біярэактары з рабочым аб'ёмам 3 літры, pH 4,8, 50°C і 250 абаротаў у хвіліну. Пасля гідролізу на працягу 96 гадзін гідралізат збіралі цэнтрыфугаваннем пры 6000 абаротаў у хвіліну на працягу 30 хвілін, а затым пры 14000 абаротаў у хвіліну на працягу 30 хвілін для выдалення негідралізаваных цвёрдых рэчываў. Затым гідралізат падвяргалі стэрыльнай фільтрацыі праз фільтравальную шклянку з памерам адтуліны 0,22 мм. Адфільтраваны гідралізат захоўвалі ў стэрыльных бутэльках пры тэмпературы 4°C, а затым фракцыянавалі на вугле.
Аналіз складу ўзораў біямасы на аснове экстрактаў у адпаведнасці з працэдурамі лабараторнага аналізу NREL: падрыхтоўка ўзораў для аналізу складу (NREL/TP-510-42620) і вызначэнне структурных вугляводаў і лігніну ў біямасе (NREL/TP-510 – 42618)47.
Аналіз алігацукрыдаў гідралізату праводзілі ў маштабе 2 мл з выкарыстаннем метаду кіслотнага гідролізу ў аўтаклаве. Змяшалі ўзор гідралізату з 69,7 мкл 72% сернай кіслаты ў 10-мілілітровай прабірцы для культур з закручвальнай вечкам і інкубавалі на працягу 1 гадзіны на стале пры тэмпературы 121 °C, астудзілі на лёдзе і адфільтравалі ў флакон для высокаэфектыўнай вадкаснай храматаграфіі (ВЭЖХ). Канцэнтрацыю алігацукрыдаў вызначалі шляхам аднімання канцэнтрацыі монацукрыдаў у негідралізаваным узоры ад агульнай канцэнтрацыі цукру ў кіслотна-гідралізаваным узоры.
Канцэнтрацыі глюкозы, ксілазы і арабінозы ў кіслотна гідралізаванай біямасе аналізавалі з дапамогай сістэмы ВЭЖХ Shimadzu, абсталяванай аўтасамплерам, награвальнікам калонкі, ізакратычным помпай і дэтэктарам паказчыка праламлення на калонцы Bio-Rad Aminex HPX-87H. Калонка падтрымлівалася пры тэмпературы 50°C і элюіравалася патокам 5 мМ H2SO4 у вадзе з хуткасцю 0,6 мл/мін.
Супернатант гідралізату разводзілі і аналізавалі на ўтрыманне манамераў і алігацукрыдаў. Манамерныя цукры, атрыманыя пасля ферментатыўнага гідролізу, аналізавалі з дапамогай ВЭЖХ, абсталяванай калонкай Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P і калонкай з попелам. Тэмпература калонкі падтрымлівалася на ўзроўні 80°C, вада выкарыстоўвалася ў якасці рухомай фазы з хуткасцю патоку 0,6 мл/мін. Алігацукрыды вызначалі шляхам гідролізу ў разведзенай кіслаце пры тэмпературы 121°C у адпаведнасці з метадамі, апісанымі ў спасылках 41, 48, 49.
Аналіз цукроў праводзілі на неапрацаваных, папярэдне апрацаваных AFEX і ўсіх негідралізаваных рэштках біямасы (у тым ліку атрыманне серыйных экстрактаў клеткавых сценак і іх скрынінг на mAb) з выкарыстаннем раней апісаных працэдур 27, 43, 50, 51. Для аналізу глікома нерастваральныя ў спірце рэшткі матэрыялу раслінных клеткавых сценак атрымліваюць з рэшткаў біямасы і падвяргаюць паслядоўнай экстракцыі з усё больш агрэсіўнымі рэагентамі, такімі як аксалат амонія (50 мМ), карбанат натрыю (50 мМ і 0,5% w/v), CON. (1M і 4M, абодва з 1% w/v боргідрыду натрыю) і кіслы хларыт, як апісана раней 52,53. Затым экстракты падвяргалі ELISA супраць складанай панэлі mAb50, накіраваных на глікан клеткавай сценкі, і рэакцыі звязвання mAb былі прадстаўлены ў выглядзе цеплавой карты. mAb, накіраваныя на глікан раслінных клеткавых сценак, былі набыты з лабараторных запасаў (серыя CCRC, JIM і MAC).
Аднаступенчатае біятыніляванне алігацукрыдаў. Кан'югацыя вугляводаў з біятын-LC-гідразідам праводзілася па наступнай працэдуры. Біятын-LC-гідразід (4,6 мг/12 мкмоль) растваралі ў дыметылсульфаксідзе (ДМСО, 70 мкл) шляхам інтэнсіўнага памешвання і награвання пры тэмпературы 65°C на працягу 1 хвіліны. Дадавалі ледзяную воцатную кіслату (30 мкл), і сумесь вылівалі на цыянаборагідрыд натрыю (6,4 мг/100 мкмоль) і цалкам растваралі пасля награвання пры тэмпературы 65°C на працягу каля 1 хвіліны. Затым да высушанага алігацукрыду (1-100 нмоль) дадавалі ад 5 да 8 мкл рэакцыйнай сумесі, каб атрымаць 10-кратны або большы малярны лішак меткі над аднаўляльным канцом. Рэакцыю праводзілі пры тэмпературы 65°C на працягу 2 гадзін, пасля чаго ўзоры неадкладна ачышчалі. У эксперыментах па маркіроўцы без аднаўлення не выкарыстоўваўся цыянаборагідрыд натрыю, і ўзоры рэагавалі пры тэмпературы 65°C на працягу 2,5 гадзін.
Пакрыццё для ІФА і прамыванне ўзораў біятыніляваных алігацукрыдаў. У кожную лунку пакрытага авідынам пласціны дадавалі 25 мкл біятыніляваных узораў (па 100 мкл кожнага канцэнтраванага ўзору, разведзенага ў 5 мл 0,1 М буфернага раствора Tris (TBS)). Кантрольныя лункі пакрывалі 50 мкл біятыну ў канцэнтрацыі 10 мкг/мл у 0,1 М TBS. Дэіянізаваная вада выкарыстоўвалася ў якасці пакрыцця для холастых вымярэнняў. Планшэт інкубавалі на працягу 2 гадзін пры пакаёвай тэмпературы ў цемры. Прамывалі пласціну 3 разы 0,1% абястлушчаным малаком у 0,1 М TBS, выкарыстоўваючы праграму № 11 для пласціны Grenier flat 3A.
Даданне і прамыванне першасных антыцелаў. Дадайце па 40 мкл першасных антыцелаў у кожную лунку. Інкубуйце мікрапланшэт на працягу 1 гадзіны пры пакаёвай тэмпературы ў цемры. Затым планшэты прамывалі 3 разы 0,1% малаком у 0,1 М TBS, выкарыстоўваючы праграму прамывання № 11 для Grenier Flat 3A.
Дадайце другасныя антыцелы і прамыйце. Дадайце па 50 мкл другасных антыцелаў мышы/пацука (разведзеных 1:5000 у 0,1% малацэ ў 0,1 М TBS) у кожную лунку. Інкубуйце мікрапланшэт на працягу 1 гадзіны пры пакаёвай тэмпературы ў цемры. Затым мікрапланшэты прамывалі 5 разоў 0,1% малаком у 0,1 М TBS, выкарыстоўваючы праграму прамывання планшэтаў Grenier Flat 5A № 12.
Даданне субстрата. Дадайце 50 мкл 3,3′,5,5′-тэтраметылбензідыну (ТМБ) да асноўнага субстрата (дадаўшы 2 кроплі буфера, 3 кроплі ТМБ, 2 кроплі перакісу вадароду да 15 мл дэіянізаванай вады). Падрыхтуйце субстрат ТМБ і змяшайце на вортэксе перад выкарыстаннем. Інкубуйце мікрапланшэт пры пакаёвай тэмпературы на працягу 30 хвілін. У цемры.
Выканайце крок і прачытайце планшэт. Дадайце 50 мкл 1 N сернай кіслаты ў кожную лунку і запішыце паглынанне ад 450 да 655 нм з дапамогай рыдэра ELISA.
Прыгатуйце растворы наступных аналітаў з канцэнтрацыяй 1 мг/мл у дэіянізаванай вадзе: арабіноза, рамноза, фукоза, ксілоза, галактуроновая кіслата (GalA), глюкуроновая кіслата (GlcA), маноза, глюкоза, галактоза, лактоза, N-ацэтылманазамін (manNAc), N-ацэтылглюказамін (glcNAc), N-ацэтылгалактазамін (galNAc), іназітол (унутраны стандарт). Два стандарты былі падрыхтаваны шляхам дадання раствораў цукру з канцэнтрацыяй 1 мг/мл, паказаных у Табліцы 1. Узоры замарожваюць і ліяфілізуюць пры тэмпературы -80°C да выдалення ўсёй вады (звычайна каля 12-18 гадзін).
Дадайце 100–500 мкг узору ў прабіркі з закручваемымі вечкамі на аналітычных вагах. Запішыце дададзенае колькасць. Лепш за ўсё растварыць узор у пэўнай канцэнтрацыі растваральніка і дадаць яго ў прабірку ў выглядзе вадкай аліквоты. Выкарыстоўвайце 20 мкл іназітолу з канцэнтрацыяй 1 мг/мл у якасці ўнутранага стандарту для кожнай прабіркі з узорам. Колькасць унутранага стандарту, дададзенага да ўзору, павінна быць такой жа, як колькасць унутранага стандарту, дададзенага ў стандартную прабірку.
Дадайце 8 мл бязводнага метанолу ў флакон з закручвальнай вечкам. Затым дадайце 4 мл 3 н. метанольнага раствора HCl, зачыніце вечкам і страсяніце. У гэтым працэсе вада не выкарыстоўваецца.
Дадайце 500 мкл 1 М раствора HCl у метаноле да ўзораў алігацукрыду і стандартных прабірак TMS. Узоры інкубавалі на працягу ночы (168 гадзін) пры тэмпературы 80°C у тэрмаблоку. Высушыце прадукт метанолізу пры пакаёвай тэмпературы з дапамогай сушыльнага калектара. Дадайце 200 мкл MeOH і зноў высушыце. Гэты працэс паўтараюць двойчы. Дадайце 200 мкл метанолу, 100 мкл пірыдыну і 100 мкл воцатнага ангідрыду да ўзору і добра змяшайце. Інкубуйце ўзоры пры пакаёвай тэмпературы на працягу 30 хвілін. Дадайце 200 мкл метанолу і зноў высушыце.
Дадайце 200 мкл Tri-Sil і награвайце прабірку з закаркаванай вечкам на працягу 20 хвілін. 80°C, затым астудзіце да пакаёвай тэмпературы. Выкарыстоўвайце сушыльны калектар для дадатковай сушкі ўзору да аб'ёму прыблізна 50 мкл. Важна адзначыць, што мы не дазвалялі ўзорам цалкам высахнуць.
Дадайце 2 мл гексану і добра змяшайце, перамешваючы на ​​віхравой хвалі. Напоўніце кончыкі піпетак Пастэра (5-8 мм) кавалачкам шкловаты, уставіўшы шкловату зверху піпеткі дыяметрам 5-3/4 цалі. Узоры цэнтрыфугавалі пры 3000 g на працягу 2 хвілін. Любыя нерастваральныя рэшткі выпадалі ў асадак. Высушыце ўзор да аб'ёму 100-150 мкл. Аб'ём прыблізна 1 мкл уводзілі ў ГХ-МС пры пачатковай тэмпературы 80 °C і пачатковым часе 2,0 хвіліны (табліца 2).