Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка за CSS. За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да изключите режима на съвместимост в Internet Explorer). Междувременно, за да осигурим непрекъсната поддръжка, ние ще показваме сайта без стилове и JavaScript.
Морфогенезата на човешките черва установява характеристики на крипта-вилус на 3D епителна микроархитектура и пространствена организация. Тази уникална структура е необходима за поддържане на чревната хомеостаза чрез защита на нишата на стволовите клетки в базалната крипта от екзогенни микробни антигени и техните метаболити. В допълнение, чревните власинки и секретиращата слуз представят функционално диференцирани епителни клетки със защитна бариера върху повърхността на чревната лигавица. Следователно, пресъздаването на 3D епителни структури е от решаващо значение за изграждането на in vitro модели на червата. По-специално, органичният миметичен черво върху чип може да индуцира спонтанна 3D морфогенеза на чревния епител с подобрени физиологични функции и биомеханика. Тук ние предоставяме възпроизводим протокол за стабилно индуциране на чревна морфогенеза в gu t на микрофлуиден чип, както и във вграден хибриден чип Transwell. Ние описваме подробни методи за производство на устройство, култивиране на Caco-2 или чревни органоидни епителни клетки в конвенционални настройки, както и на микрофлуидна платформа, индуциране на 3D морфогенеза и характеризиране на установен 3D епител с помощта на множество модалности за изобразяване. Този протокол постига регенерация на функционални черва микроархитектура чрез контролиране на базолатералния флуиден поток за 5 d. Нашият in vitro метод за морфогенеза използва физиологично релевантно напрежение на срязване и механично движение и не изисква сложно клетъчно инженерство или манипулация, което може да надмине други съществуващи техники. Ние предвиждаме, че предложеният от нас протокол може да има широко значение за общността на биомедицинските изследвания, предоставяйки метод за регенериране на 3D чревни епителни слоеве in vitro за биомедицински, клинични и фармацевтични приложения.
Експериментите показват, че чревни епителни Caco-2 клетки, култивирани в червата върху чип1,2,3,4,5 или двуслойни микрофлуидни устройства6,7, могат да претърпят спонтанна 3D морфогенеза in vitro без ясно разбиране на основния механизъм. В нашето скорошно проучване открихме, че отстраняването на базолатерално секретирани морфогенни антагонисти от устройствата за култура е необходимо и достатъчно за индуциране на 3D епителна смърт фогенеза in vitro, която е демонстрирана от Caco-2 и чревни органоиди, получени от пациенти.Епителните клетки бяха валидирани. В това проучване ние специално се съсредоточихме върху клетъчното производство и разпределението на концентрацията на мощен Wnt антагонист, Dickkopf-1 (DKK-1), в червата върху чип и модифицирани микрофлуидни устройства, съдържащи Transwell вложки, наречени „хибриден чип“. Ние демонстрираме, че добавянето на екзогенни Wnt антагонисти (като DKK-1, Wnt репресор 1, секретирани накъдрени -свързан протеин 1 или Soggy-1) към вътрешността на чипа инхибира морфогенезата или разрушава предварително структурирания 3D епителен слой, което предполага, че антагонистичният стрес по време на култивирането е отговорен за чревната морфогенеза in vitro. Следователно, практическият подход за постигане на стабилна морфогенеза в епителната повърхност е да се премахнат или минимално да се поддържат нивата на Wnt антагонисти в базолатералната част мент чрез активно промиване (напр. в червата на чип или хибридни платформи на чип) или дифузия. Базолатерална среда (напр. от вмъквания на Transwell в големи базолатерални резервоари в кладенци).
В този протокол ние предоставяме подробен метод за производство на микроустройства черва върху чип и хибридни чипове, вмъкнати от Transwell (стъпки 1-5) за култивиране на чревни епителни клетки върху базирани на полидиметилсилоксан (PDMS) порести мембрани (стъпки 6A, 7A, 8, 9) или полиестерни мембрани на вложки Transwell (стъпки 6B, 7B, 8, 9) и индуцирана 3D морфогенеза in vitro (стъпка 10). Ние също така идентифицирахме клетъчни и молекулярни характеристики, показателни за тъканно-специфична хистогенеза и зависима от линията клетъчна диференциация чрез прилагане на множество образни модалности (стъпки 11-24). Ние индуцираме морфогенеза, използвайки човешки чревни епителни клетки, като Caco-2 или чревни органоиди, в два формата на култура с технически подробности, включително повърхностни модове за индуциране на 3D морфогенеза от 2D епителни монослоеве, ние премахнахме морфогенните антагонисти и в двете култивирани форми чрез вливане на средата в базолатералното отделение на културата. И накрая, ние предоставяме представяне на полезността на регенерируем 3D епител телиален слой, който може да се използва за моделиране на морфоген-зависим епителен растеж, надлъжни ко-култури гостоприемник-микробиом, патогенна инфекция, възпалително увреждане, дисфункция на епителната бариера и базирани на пробиотици терапии Примерни влияния.
Нашият протокол може да бъде полезен за широк кръг учени в основни (напр. биология на чревната лигавица, биология на стволови клетки и биология на развитието) и приложни изследвания (напр. предклинични тестове на лекарства, моделиране на заболявания, тъканно инженерство и гастроентерология) с широко въздействие. Поради възпроизводимостта и устойчивостта на нашия протокол за индуциране на 3D морфогенеза на чревния епител in vitro, ние предвиждаме, че нашите техническата стратегия може да бъде разпространена сред аудитории, изучаващи динамиката на клетъчното сигнализиране по време на чревното развитие, регенерация или хомеостаза. В допълнение, нашият протокол е полезен за разпитване на инфекция при различни инфекциозни агенти като Norovirus 8, Коронавирус 2 на тежък остър респираторен синдром (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 или Vibrio cholerae.Аудиториите на патологията и патогенезата на заболяването също са полезни. Използването на микрофизиологична система на червата в чип може да позволи надлъжно съвместно култивиране 10 и последваща оценка на защитата на гостоприемника, имунните реакции и възстановяването на свързаните с патогени наранявания в стомашно-чревния (GI) тракт 11. Други стомашно-чревни нарушения, свързани със синдром на пропускливи черва, цьолиакия, болест на Crohn, улцерозен колит, паухит или Синдромът на раздразнените черва може да бъде симулиран, когато 3D чревни епителни слоеве се приготвят с помощта на 3D чревни епителни слоеве на пациента, тези заболявания включват атрофия на вилозите, скъсяване на криптите, увреждане на лигавицата или нарушена епителна бариера. Биопсия или получени от стволови клетки чревни органоиди 12,13. За по-добро моделиране на по-високата сложност на болестната среда, читателите може да обмисли добавянето на релевантни за заболяването клетъчни типове, като мононуклеарни клетки от периферна кръв на пациента (PBMCs), към модели, съдържащи 3D микроархитектури на чревни вили-крипти.тъканно-специфични имунни клетки, 5.
Тъй като 3D епителната микроструктура може да бъде фиксирана и визуализирана без процеса на разделяне, зрителите, работещи върху пространствена транскриптомия и изображения с висока или супер разделителна способност, може да се интересуват от нашето картографиране на пространствено-времевата динамика на гени и протеини в епителните ниши.Интересуват се от технология. Отговор на микробни или имунни стимули. Освен това, надлъжната връзка гостоприемник-микробиом 10, 14, която координира чревната хомеостаза, може да бъде установена в 3D слоя на чревната лигавица чрез съвместно култивиране на различни микробни видове, микробни общности или фекална микробиота, особено в червата върху чип.в платформата. Този подход е особено привлекателен за аудитории, изучаващи мукозна имунология, гастроентерология, човешка микробиома, културомика и клинична микробиология, които се стремят да култивират некултивирана преди това чревна микробиота в лабораторията. Ако нашият in vitro протокол за морфогенеза може да бъде адаптиран към мащабируеми формати на културата, като вмъкване на много ямки в 24, 96 или 384 ямкови плаки, които непрекъснато попълват базо странични отделения, протоколът може също да бъде разпространен до тези, които разработват фармацевтични, биомедицински или високопроизводителни платформи за скрининг или валидиране за хранително-вкусовата промишленост. Като доказателство за принципа, наскоро демонстрирахме осъществимостта на мултиплексна система за морфогенеза с висока производителност, мащабируема до формат на 24-ямкова плака. В допълнение, множество продукти на орган върху чип са комерсиализирани16,17,18. руда, валидирането на нашия метод за in vitro морфогенеза може да бъде ускорено и потенциално възприето от много изследователски лаборатории, индустрия или правителствени и регулаторни агенции, за да се разбере клетъчното препрограмиране на in vitro чревната морфогенеза на транскриптомно ниво за тестване на лекарства или биотерапевтици. Абсорбцията и транспортът на кандидатите за лекарства бяха оценени с помощта на 3D сурогати на червата или с използване на персонализирани или търговски модели орган върху чип за оценка на възпроизводимостта на процес на чревна морфогенеза.
Ограничен брой подходящи за човека експериментални модели са използвани за изследване на чревната епителна морфогенеза, главно поради липсата на приложими протоколи за индуциране на 3D морфогенеза in vitro. Всъщност голяма част от настоящите познания за чревната морфогенеза се основават на изследвания върху животни (напр. риба зебра20, мишки21 или пилета22). Въпреки това, те са трудоемки и разходоемки, могат да бъдат етично съмнителни и най-важното, не определят точно процесите на човешкото развитие. Тези модели също са много ограничени в способността си да бъдат тествани по многопосочен мащабируем начин. Следователно, нашият протокол за регенериране на 3D тъканни структури in vitro превъзхожда in vivo животински модели, както и други традиционни статични 2D модели на клетъчни култури. Както беше описано по-горе, използването на 3D епителни структури ни позволи да изследваме пространствените локализиране на диференцирани клетки в оста крипта-вила в отговор на различни мукозни или имунни стимули. 3D епителните слоеве могат да осигурят пространство за изследване на това как микробните клетки се конкурират за образуване на пространствени ниши и екологична еволюция в отговор на факторите на гостоприемника (напр. вътрешни спрямо външни слоеве на слуз, секреция на IgA и антимикробни пептиди). Освен това, 3D епителната морфология може да ни позволи да разберем как чревната микробиота структурира своите общности и синергично произвежда микробни метаболити (напр. късоверижни мастни киселини), които оформят клетъчната организация и нишите на стволовите клетки в базалните крипти. Тези характеристики могат да бъдат демонстрирани само когато 3D епителни слоеве са установени in vitro.
В допълнение към нашия метод за създаване на 3D чревни епителни структури има няколко in vitro метода. Чревната органоидна култура е най-съвременна техника за тъканно инженерство, базирана на култивирането на чревни стволови клетки при специфични морфогенни условия 23,24,25. Въпреки това, използването на 3D модели на органоиди за транспортен анализ или ко-култури гостоприемник-микробиом често е предизвикателство, тъй като чревният лумен е затворен в органоида и следователно въвеждането на луминални компоненти като микробни клетки или екзогенни антигени е ограничено.Достъпът до органоидни лумени може да бъде подобрен с помощта на микроинжектор, 26, 27, но този метод е инвазивен и трудоемък и изисква специализирани познания за изпълнение. Освен това традиционните органоидни култури, поддържани в хидрогелни скелета при статични условия, не отразяват точно активната in vivo биомеханика.
Други подходи, използвани от няколко изследователски групи, използват предварително структурирани 3D хидрогелни скелета за имитиране на чревната епителна структура чрез култивиране на изолирани човешки чревни клетки върху повърхността на гела. Изработете хидрогелни скелета с помощта на 3D-отпечатани, микросмлени или литографски произведени форми. Този метод показва самоорганизираното подреждане на изолирани епителни клетки in vitro с физиологично значими морфогенни градиенти , установявайки епителна структура с високо аспектно съотношение и кръстосано прекъсване на строма-епител чрез включване на стромални клетки в скелето. Естеството на преструктурираните скелета обаче може да попречи на показването на самия спонтанен морфогенетичен процес. Тези модели също така не осигуряват динамичен луминален или интерстициален поток, като им липсва напрежението на срязване на течността, от което чревните клетки се нуждаят, за да претърпят морфогенеза и да придобият физиологична функция. Друго скорошно проучване използва хидрогелни скелета в микрофлуидна платформа и шарени чревни епителни структури, използващи техники за лазерно ецване. Чревните органоиди на мишката следват гравирани модели, за да образуват чревни тубулни структури, а интралуминалният флуиден поток може да бъде рекапитулиран с помощта на микрофлуиден модул. Този модел обаче нито проявява спонтанни морфогенетични процеси, нито включва чревни механобиологични движения .3D техниките за принтиране от същата група успяха да създадат миниатюрни чревни тръби със спонтанни морфогенетични процеси. Въпреки сложното производство на различни чревни сегменти в тръбата, този модел също няма поток от луминална течност и механична деформация. В допълнение, работоспособността на модела може да бъде ограничена, особено след като процесът на биопринтиране е завършен, смущаващи експериментални условия или взаимодействия клетка-към-клетъчна. Вместо това предложеният от нас протокол осигурява спонтанен чревен морфоген esis, физиологично релевантен стрес на срязване, биомеханика, която имитира подвижността на червата, достъпност на независими апикални и базолатерални отделения и повторно създаване на сложни биологични микросреди на модулност. Следователно, нашият протокол за in vitro 3D морфогенеза може да осигури допълнителен подход за преодоляване на предизвикателствата на съществуващите методи.
Нашият протокол е изцяло фокусиран върху 3D епителна морфогенеза, само с епителни клетки в култура и без други видове околни клетки като мезенхимни клетки, ендотелни клетки и имунни клетки. Както беше описано по-горе, ядрото на нашия протокол е индуцирането на епителна морфогенеза чрез премахване на морфогенни инхибитори, секретирани от базолатералната страна на въведената среда. Докато стабилната модулност на нашите черва върху чип и хибрид върху чип ни позволяват да пресъздадем вълнообразния 3D епителен слой, допълнителни биологични сложности като епителни-мезенхимни взаимодействия33,34, отлагане на екстрацелуларен матрикс (ECM)35 и, в нашия модел, характеристики на крипта-вилус, които предават ниши на стволови клетки в базалните крипти, остава да бъдат разгледани допълнително. Стромални клетки (напр. фибро бласти) в мезенхима играят ключова роля в производството на ECM протеини и регулирането на чревната морфогенеза in vivo35,37,38. Добавянето на мезенхимни клетки към нашия модел засили морфогенетичния процес и ефективността на клетъчното прикрепване. Ендотелният слой (т.е. капиляри или лимфни пътища) играе важна роля в регулирането на молекулярния транспорт39 и набирането на имунни клетки40 в червата микросреда. Освен това компонентите на васкулатурата, които могат да бъдат свързани между тъканните модели, са предпоставка, когато тъканните модели са проектирани да демонстрират многоорганни взаимодействия. Следователно може да се наложи да се включат ендотелни клетки за моделиране на по-точни физиологични характеристики с разделителна способност на ниво орган. Имунните клетки, получени от пациента, също са от съществено значение за показване на вродени имунни отговори, представяне на антиген, вродено адаптивно имунно пресичане и тъканно-специфично взаимодействие c имунитет в контекста на имитиране на чревно заболяване.
Използването на хибридни чипове е по-лесно от червата върху чипа, тъй като настройката на устройството е по-опростена и използването на вложки Transwell позволява мащабируема култура на чревния епител. Въпреки това, наличните в търговската мрежа вложки Transwell с полиестерни мембрани не са еластични и не могат да симулират подобни на перисталтика движения. Освен това, апикалното отделение на вложката Transwell, поставено в хибридния чип, остава неподвижно без тя ar стрес от апикалната страна. Ясно е, че статичните свойства в апикалното отделение рядко позволяват дългосрочно бактериално съвместно култивиране в хибридни чипове. Въпреки че можем стабилно да индуцираме 3D морфогенеза в Transwell вложки, когато използваме хибридни чипове, недостигът на физиологично значима биомеханика и поток на апикална течност може да ограничи осъществимостта на хибридни платформи за чипове за потенциални приложения.
Пълномащабни реконструкции на оста на човешката крипта-вила в култури черва върху чип и хибриди върху чип не са напълно установени. Тъй като морфогенезата започва от епителен монослой, 3D микроархитектурите не осигуряват непременно морфологично сходство с криптите in vivo. Въпреки че характеризирахме пролифериращата клетъчна популация близо до домейна на базалната крипта в микродвигателя Въпреки че по-високите горни канали на чипа водят до увеличена височина на микроинженерния епител, максималната височина все още е ограничена до ~300–400 µm. Действителната дълбочина на човешките чревни крипти в тънките и дебелите черва е съответно ~135 µm и ~400 µm, а височината на тънките чревни въси са ~600 µm41.
От гледна точка на изображения, in situ изображения със супер разделителна способност на 3D микроархитектури може да бъдат ограничени до червата на чип, тъй като необходимото работно разстояние от лещата на обектива до епителния слой е от порядъка на няколко милиметра. За да се преодолее този проблем, може да е необходим отдалечен обектив. Освен това, правенето на тънки срезове за подготовка на образци за изображения е предизвикателство поради високата еластичност на PDMS. Освен това, тъй като послойното микроизработване на червата върху чип включва постоянна адхезия между всеки слой, е изключително трудно да се отвори или премахне горният слой, за да се изследва повърхностната структура на епителния слой. Например, чрез използване на сканиращ електронен микроскоп (SEM).
Хидрофобността на PDMS е ограничаващ фактор в микрофлуидни базирани проучвания, занимаващи се с хидрофобни малки молекули, тъй като PDMS може неспецифично да адсорбира такива хидрофобни молекули. Могат да се обмислят алтернативи на PDMS с други полимерни материали. Като алтернатива може да се счита, че повърхностната модификация на PDMS (напр. покритие с липофилни материали 42 или поли(етиленгликол) 43) намалява до минимум адсорбция на хидрофобни молекули.
И накрая, нашият метод не е добре характеризиран по отношение на осигуряването на скрининг с висока пропускателна способност или удобна за потребителя експериментална платформа „един размер за всички“. Настоящият протокол изисква помпа със спринцовка за всяко микроустройство, което заема място в CO2 инкубатор и предотвратява широкомащабни експерименти. Това ограничение може да бъде значително подобрено чрез скалируемостта на иновативни формати на култура (напр. 24-ямкови, 96-ямкови или 384- добре порести вложки, които позволяват непрекъснато попълване и отстраняване на базолатералната среда).
За да индуцираме 3D морфогенеза на човешки чревен епител in vitro, ние използвахме чревно устройство с микрофлуиден чип, съдържащо два успоредни микроканала и еластична пореста мембрана между тях, за да създадем интерфейс лумен-капиляр. Ние също така демонстрираме използването на едноканално микрофлуидно устройство (хибриден чип), което осигурява непрекъснат базолатерален поток под поляризирани епителни слоеве, отглеждани върху Transwell вложки. И в двете платформи морфогенезата на различни човешки чревни епителни клетки може да бъде демонстрирана чрез прилагане на насочена манипулация на потока за отстраняване на морфогенните антагонисти от базолатералния компартмент. Цялата експериментална процедура (Фигура 1) се състои от пет части: (i) микропроизводство на чревния чип или Transwell вмъкващ се хибриден чип (стъпки 1-5; кутия 1), (ii) подготовка на чревни епителни клетки (Caco-2 клетки) или човешки чревни органоиди;кутии 2-5), (iii) култура на чревни епителни клетки върху чревни чипове или хибридни чипове (стъпки 6-9), (iv) индуциране на 3D морфогенеза in vitro (стъпка 10) и (v) ) за характеризиране на 3D епителната микроструктура (стъпки 11-24). И накрая, подходяща контролна група (обсъдена по-долу) беше проектирана да валидира ефективността на in vitro морфогенезата чрез сравняване на епителната морфогенеза с пространствени, времеви, условни или процедурни контроли.
Използвахме две различни културни платформи: черва върху чип с прави канали или нелинейни извити канали, или хибридни чипове, съдържащи Transwell (TW) вложки в микрофлуидно устройство, произведени, както е описано в Каре 1, и стъпка 1 -5. „Производство на устройство“ показва основните стъпки в създаването на единичен чип или хибриден чип. „Култура на човешки чревни епителни клетки“ обяснява клетъчния източник (Caco-2 или човешки чревни органоиди) и процедурата за култивиране, използвана в този протокол. „In vitro морфогенеза“ показва общите стъпки, в които Caco-2 или извлечени от органоид епителни клетки се култивират върху чревен чип или върху Transwell вложки на хибриден чип, последвано от индуциране на 3D морфогенеза и образуване на характеризирана епителна структура. Номерът на стъпката на програмата или номерът на полето се показват по-долу всяка стрелка. Приложението предоставя примери за това как могат да се използват установени чревни епителни слоеве, например при характеризиране на клетъчната диференциация, физиологични изследвания на червата, установяване на екосистеми гостоприемник-микробиома и моделиране на заболяване. Имунофлуоресцентни изображения в „Диференциране на клетките“, показващи ядра, F-актин и MUC2, експресирани в 3D Caco-2 епителен слой, генериран в червата чип.MUC2 сигнализирането присъства в гоблетни клетки и слуз, секретирана от повърхностите на лигавицата. Флуоресцентни изображения в Gut Physiology показват слуз, произведена чрез оцветяване за сиалова киселина и остатъци от N-ацетилглюкозамин, използвайки флуоресцентен аглутинин от пшеничен зародиш. Двете припокриващи се изображения в „Съвместни култури гостоприемник-микроб“ показват представителни съвместни култури гостоприемник-микробиом в червата на чип. Левият панел показва съвместната култура на E. coli, експресираща зелен флуоресцентен протеин (GFP) с микроинженерни 3D Caco-2 епителни клетки. Десният панел показва локализацията на GFP E. coli, съвместно култивирана с 3D Caco-2 епителни клетки, последвано от имунофлуоресцентно оцветяване с F-актин (червено) и ядра (синьо). Моделирането на заболяването илюстрира здрави срещу пропускливи черва в чипове за възпаление на червата при физиологично предизвикателство с бактериални антигени (напр. липополизахарид, LPS) и имунни клетки (напр. PBMC;зелено). Клетките Caco-2 бяха култивирани, за да се създаде 3D епителен слой. Мащабна лента, 50 µm. Изображения в долния ред: „Диференциране на клетки“, адаптирано с разрешение от справка.2.Oxford University Press;Възпроизведено с разрешение от Ref.5.NAS;„Съвместна култура гостоприемник-микроб“, адаптирана с разрешение от реф.3.NAS;„Моделиране на болестта“ адаптиран с разрешение от reference.5.NAS.
Както червата върху чипа, така и хибридните чипове бяха произведени с помощта на PDMS реплики, които бяха извадени от силициеви форми чрез мека литография1,44 и шарени със SU-8. Дизайнът на микроканалите във всеки чип се определя чрез отчитане на хидродинамиката като напрежение на срязване и хидродинамично налягане1,4,12. Оригиналният дизайн черво върху чип (Разширени данни Фиг. 1а), който се състоеше от от два съпоставени паралелни прави микроканала, еволюира в сложен черво върху чип (Разширени данни Фиг. 1b), който включва двойка извити микроканали за индуциране на Увеличено време на престой на течността, нелинейни модели на потока и многоаксиална деформация на култивирани клетки (Фиг. 2a-f) 12. Когато трябва да се пресъздаде по-сложна чревна биомеханика, комплексът gu t-on-a-chips могат да бъдат избрани. Ние демонстрирахме, че сложният Gut-Chip също силно индуцира 3D морфогенеза в подобна времева рамка с подобна степен на епителен растеж в сравнение с оригиналния Gut-Chip, независимо от култивирания клетъчен тип. Следователно, за да се индуцира 3D морфогенеза, линейните и сложните дизайни на червата върху чипа са взаимозаменяеми. PDMS реплики, втвърдени върху силициев мол ds с шарки SU-8 предоставиха отрицателни характеристики след изваждане от формата (фиг.2a). За да се произведе червата върху чип, подготвеният горен PDMS слой беше последователно свързан към порест PDMS филм и след това подравнен с долния PDMS слой чрез необратимо свързване с помощта на корона третиране (Фиг. 2b-f). За производството на хибридни чипове, втвърдените PDMS реплики бяха свързани към стъклени предметни стъкла, за да се създадат едноканални микрофлуидни устройства, които могат да приемат модифицирани Transwell вложки (Фиг. 2h и Разширени данни Фиг. 2). Процесът на свързване се извършва чрез третиране на повърхностите на PDMS репликата и стъклото с кислородна плазма или коронна обработка. След стерилизация на микропроизведеното устройство, прикрепено към силиконовата тръба, настройката на устройството беше готова за извършване на 3D морфогенеза на чревния епител (Фигура 2g).
a, Схематична илюстрация на подготовката на PDMS части от моделирани силиконови форми SU-8. Невтвърденият разтвор на PDMS беше излят върху силиконова форма (вляво), втвърден при 60 °C (в средата) и изваден от формата (вдясно). Изваденият от формата PDMS беше нарязан на парчета и почистен за по-нататъшна употреба. b, Снимка на силиконовата форма, използвана за подготовка на горния слой на PDMS. c, Снимка на силициевия mold d, използвани за производството на порестата мембрана на PDMS.d, Серия от снимки на горните и долните компоненти на PDMS и сглобеното чревно устройство на чип.e, Схема на подравняването на горните, мембранните и долните компоненти на PDMS. Всеки слой е необратимо свързан чрез плазмена или коронна обработка.f, Схема на изработеното устройство черво върху чип с насложен извит микрокан nels и вакуумни камери.g, Настройка на червата върху чип за микрофлуидна клетъчна култура. Изработените черва върху чип, сглобени със силиконова тръба и спринцовка, бяха поставени върху покривно стъкло. Устройството с чип беше поставено върху капака на 150 mm петриево блюдо за обработка. Свързващото вещество се използва за затваряне на силиконовата тръба.h, Визуални моментни снимки на производството на хибридни чипове и 3D морфогенеза с помощта на хибридни чипове. Transwell вложки, подготвени независимо за култивиране на 2D монослоеве от чревни епителни клетки, бяха вмъкнати в хибридния чип, за да се индуцира чревна 3D морфогенеза. Средата се перфузира през микроканали под клетъчния слой, установен на вложката Transwell. Мащабна лента, 1 cm.h Препечатано с разрешение от справка.4.Elsevier.
В този протокол клетъчната линия Caco-2 и чревните органоиди бяха използвани като епителни източници (фиг. 3a). И двата вида клетки бяха култивирани независимо (кутия 2 и кутия 5) и използвани за посяване на покрити с ECM микроканали на червата върху чип или Transwell вложки. Когато клетките са конфлуентни (>95% покритие в колби), рутинно култивирани Caco-2 клетки (между пасажите) 10 и 50) в Т-колби се събират, за да се приготвят дисоциирани клетъчни суспензии чрез трипсинизираща течност (кутия 2). Човешки чревни органоиди от чревни биопсии или хирургични резекции се култивират в куполи на Matrigel в 24-ямкови плаки за поддържане на структурната микросреда. Среда, съдържаща основни морфогени (като Wnt, R-спондин и No ggin) и растежни фактори, приготвени, както е описано в Каре 3, се добавят през ден, докато органоидите нараснат до ~500 µm в диаметър. Напълно израсналите органоиди се събират и дисоциират на единични клетки за посяване върху червата или Transwell вмъквания върху чип (Каре 5). Както вече съобщихме, може да се диференцира според типа на заболяването12,13 (напр. улцерозен колит, болест на Крон, колоректален таличен рак или нормален донор), място на лезия (напр. лезия спрямо не-лезирана област) и стомашно-чревно местоположение в тракта (напр. дванадесетопръстник, йеюнум, илеум, сляпо черво, дебело черво или ректум). Предоставяме оптимизиран протокол в Каре 5 за култивиране на органоиди на дебелото черво (колоиди), които обикновено изискват по-високи концентрации на морфогени, отколкото органоиди на тънките черва.
a, Работен процес за индуциране на чревна морфогенеза в чревния чип. Caco-2 човешки чревен епител и чревни органоиди се използват в този протокол за демонстриране на 3D морфогенеза. Изолираните епителни клетки бяха посяти в подготвеното черво върху чип устройство (препарат за чип). След като клетките са посяти (посадени) и прикрепени (прикрепени) към PDMS пореста мембрана на ден 0 (D0), апикален (AP) поток се инициира и поддържа през първите 2 дни (поток, AP, D0-D2). Базолатерален (BL) поток също се инициира заедно с циклични разтягащи движения (разтягане, поток, AP и BL), когато се формира пълен 2D монослой. Чревната 3D морфогенеза възниква спонтанно след 5 дни микрофлуидна култура (морфогенеза, D 5). Изображенията с фазов контраст показват представителна морфология на Caco-2 клетки при всяка експериментална стъпка или времева точка (стълбовидна графика, 100 µm). Четири схематични диаграми, илюстриращи съответните каскади на чревната морфогенеза (горе вдясно). Прекъснатите стрелки в схемата представляват посоката на флуидния поток. b, SEM изображение, показващо топологията на повърхността на установения 3D Caco-2 епител (вляво). Вмъкнатото осветяване увеличената зона (бяла пунктирана кутия) показва регенерираните микровили на 3D Caco-2 слой (вдясно).c, Хоризонтален фронтален изглед на установени Caco-2 3D, клаудин (ZO-1, червено) и непрекъснати мембрани с четка, означени с F-актин (зелено) и ядра (синьо) Имунофлуоресцентна конфокална визуализация на епителни клетки върху чревни чипове. Сочещи стрелки към средната схема показва местоположението на фокалната равнина за всеки конфокален изглед. d, Времеви ход на морфологични промени в органоиди, култивирани върху чип, получен чрез фазово контрастна микроскопия на дни 3, 7, 9, 11 и 13. Вмъкването (горе вдясно) показва голямото увеличение на предоставеното изображение. e, DIC фотомикрография на органоиден 3D епител, установен в червата върху срез, направен на ден 7.f, Над положени имунофлуоресцентни изображения, показващи маркери за стволови клетки (LGR5;магента), гоблетни клетки (MUC2; зелено), F-актин (сив) и ядра (циан), отгледани върху чревни чипове за 3 дни, съответно (вляво) и 13-дневни (в средата) органоиди върху епителния слой. Вижте също Разширени данни Фигура 3, която подчертава LGR5 сигнализиране без MUC2 сигнализиране. Флуоресцентни изображения, показващи епителната микроструктура (вдясно) на 3D орган оиден епител, установен в червата върху чип чрез оцветяване на плазмената мембрана с багрило CellMask (вдясно) на 13-ия ден от културата. Лентата на мащаба е 50 μm, освен ако не е посочено друго. b Препечатано с разрешение от препратка.2.Oxford University Press;c Адаптирано с разрешение от Reference.2.Oxford University Press;e и f, адаптирани с разрешение чрез препратка.12 Под лиценз Creative Commons CC BY 4.0.
В червата върху чип е необходимо да се модифицира хидрофобната повърхност на PDMS порестата мембрана за успешно ECM покритие. В този протокол ние прилагаме два различни метода за модифициране на хидрофобността на PDMS мембраните. За култивиране на Caco-2 клетки повърхностното активиране само чрез UV/озоново третиране е достатъчно, за да се намали хидрофобността на PDMS повърхността, да се покрие ECM и да се прикрепят Caco-2 клетки към PDMS мембраната .Въпреки това, микрофлуидната култура на органоиден епител изисква повърхностна функционализация на химическа основа, за да се постигне ефективно отлагане на ECM протеини чрез последователно прилагане на полиетиленимин (PEI) и глутаралдехид към PDMS микроканали. След повърхностна модификация ECM протеините се отлагат, за да покрият функционализираната повърхност на PDMS и след това се въвеждат в изолирания органоиден епител. След като клетките се прикрепят, микрофлуидната клетъчна култура започва чрез перфузия само на средата в горния микроканал, докато клетките образуват пълен монослой, докато долният микроканал поддържа статични условия. Този оптимизиран метод за повърхностно активиране и ECM покритие позволява прикрепването на органоидния епител за индуциране на 3D морфогенеза върху повърхността на PDMS.
Transwell културите също изискват ECM покритие преди клетъчно засяване;Въпреки това, Transwell културите не изискват сложни стъпки на предварителна обработка за активиране на повърхността на порестите вложки. За отглеждане на Caco-2 клетки върху Transwell вложки, ECM покритието върху порестите вложки ускорява прикрепването на дисоциирани Caco-2 клетки (<1 час) и образуването на бариера за плътно свързване (<1-2 дни). За култивиране на органоиди върху Transwell вложки, изолирани органоиди се посяват върху покрити с ECM вложки, прикрепени към повърхността на мембраната (<3 h) и се поддържа, докато органоидите образуват пълен монослой с цялостна бариера. Transwell културите се извършват в 24-ямкови плаки без използването на хибридни чипове.
In vitro 3D морфогенеза може да бъде инициирана чрез прилагане на флуиден поток към базолатералния аспект на установен епителен слой. В червата върху чип епителната морфогенеза започва, когато средата се перфузира в горните и долните микроканали (Фиг. 3а). Както беше описано по-горе, критично е да се въведе флуиден поток в долното (базолатерално) отделение за непрекъснато отстраняване на насочени секретирани морфогенни инхибитори .За да осигурим достатъчно хранителни вещества и серум за клетките, свързани с порести мембрани, и да генерираме напрежение на срязване в луминала, ние обикновено прилагаме двоен поток в червата върху чип. В хибридните чипове Transwell вложки, съдържащи епителни монослоеве, бяха вмъкнати в хибридните чипове. След това средата беше приложена под базолатералната страна на порестата Transwell вложка през микроканала. Настъпи чревна морфогенеза 3 -5 дни след започване на базолатерален поток в двете културни платформи.
Морфологичните характеристики на микроинженерните 3D епителни слоеве могат да бъдат анализирани чрез прилагане на различни модалности за изобразяване, включително микроскопия с фазов контраст, микроскопия с диференциален интерферентен контраст (DIC), SEM или имунофлуоресцентна конфокална микроскопия (Фигури 3 и 4). Фазовият контраст или DIC изображения могат лесно да бъдат извършени по всяко време на култивирането, за да се наблюдава формата и издатината на 3D епителни слоеве.D Благодарение на оптичната прозрачност на PDMS и полиестерните филми, както червата върху чипа, така и платформите за хибридни чипове могат да осигурят in situ изображения в реално време без необходимост от разделяне или разглобяване на устройството. При извършване на имунофлуоресцентно изобразяване (фигури 1, 3c, f и 4b, c), клетките обикновено се фиксират с 4% (wt/vol) параформалдехид ( PFA), последван от Triton X-100 и 2% (wt/vol)) говежди серумен албумин (BSA), по ред. В зависимост от типа на клетката, могат да се използват различни фиксатори, пермеабилизатори и блокиращи агенти. Първичните антитела, насочени към клетъчни или регионални маркери, зависещи от линията, се използват за подчертаване на клетки, имобилизирани in situ върху чипа, последвани от вторични антитела заедно с контраоцветено багрило, насочено към едно от ядрата нас (напр. 4',6-диамидино-2-фенилен) индол, DAPI) или F-актин (напр. флуоресцентно белязан фалоидин). Въз основа на флуоресценция изображения на живо също могат да бъдат извършени in situ за откриване на производството на слуз (фиг.1, „Клетъчна диференциация“ и „Чревна физиология“), произволна колонизация на микробни клетки (Фиг. 1, „Съвместна култура гостоприемник-микроб“), набиране на имунни клетки (Фиг. 1, „Моделиране на заболяване“) или контурите на 3D епителна морфология (Фиг. 3c,f и 4b,c). При модифициране на червата на чип за отделяне на горния слой от долния слой на микроканала, както е описано в справка. Както е показано на Фиг. 2, 3D епителната морфология, както и микровилите на апикалната граница на четката могат да бъдат визуализирани чрез SEM (Фиг. 3b). Експресията на маркерите за диференциация може да бъде оценена чрез извършване на количествено PCR5 или едноклетъчно РНК секвениране. В този случай 3D слоеве от епителни клетки растат n в червата чипове или хибридни чипове се събират чрез трипсинизация и след това се използват за молекулярен или генетичен анализ.
a, Работен поток за индуциране на чревна морфогенеза в хибриден чип. Caco-2 и чревни органоиди се използват в този протокол за демонстриране на 3D морфогенеза в хибридна чипова платформа. Дисоциираните епителни клетки бяха посяти в подготвени Transwell вложки (TW prep; вижте фигурата по-долу). След като клетките бяха посяти (посадени) и прикрепени към полиестерни мембрани в Transwell вложки, всички клетки бяха култивирани при статични условия (TW култура). След 7 дни единична Transwell вложка, съдържаща 2D монослой от епителни клетки, беше интегрирана в хибриден чип за въвеждане на базолатерален поток (Flow, BL), което в крайна сметка доведе до генерирането на 3D епителен слой (морфогенеза). Микрографии с фазов контраст, показващи морфологични характеристики на епителните клетки на човешки органи, получени от нормален донор (линия C103) възходящо дебело черво при всяка експериментална стъпка или времева точка. Схемите в горните слоеве илюстрират експерименталната конфигурация за всяка стъпка. b, Хибридни чипове (лява схема) могат да доведат до 3D морфогенеза на органоидни епителни клетки с конфокални микроскопски изгледи отгоре надолу, взети на различни Z позиции (горна, средна и долна;вижте дясната схема и съответните пунктирани линии).показа очевидни морфологични характеристики. F-актин (циан), ядро ​​(сив).c, Флуоресцентни конфокални микрографии (3D ъглов изглед) на епителни клетки, получени от органоиди, култивирани в статичен Transwell (TW; вмъкване в бяла пунктирана кутия) срещу хибриден чип (най-големият пълен кадър), сравнявайки съответно 2D срещу 3D морфология. Двойка 2D вертикални кръстосани разрязани изгледи (вмъкнат в горния десен ъгъл; „XZ“) също показват 2D и 3D характеристики. Мащабна лента, 100 µm.c Препечатано с разрешение от справка.4.Elsevier.
Контролите могат да се приготвят чрез култивиране на същите клетки (Caco-2 или чревни органоидни епителни клетки) в двуизмерни монослоеве при конвенционални условия на статично култивиране. По-специално, изчерпването на хранителните вещества може да се получи поради ограничения обемен капацитет на микроканалите (т.е. ~4 µL в горния канал на оригиналния дизайн на чревния чип). Следователно, епителната морфология преди и след прилагане на базолатерален поток може също да бъде в сравнение.
Процесът на мека литография трябва да се извършва в чиста стая. За всеки слой на чипа (горни и долни слоеве и мембрани) и хибридни чипове са използвани различни фотомаски и са произведени върху отделни силиконови пластини, тъй като височините на микроканалите са различни. Целевите височини на горните и долните микроканали на червата на чипа са съответно 500 µm и 200 µm. Целта на канала височината на хибридния чип е 200 µm.
Поставете 3-инчова силиконова вафла в чиния с ацетон. Внимателно завъртете плочата за 30 секунди, след това изсушете вафлата на въздух. Прехвърлете вафлата в плоча с IPA, след което завъртете плочата за 30 секунди, за да почистите.
По избор може да се използва разтвор на пираня (смес от водороден пероксид и концентрирана сярна киселина, 1:3 (обем/обем)), за да се максимизира отстраняването на органични остатъци от повърхността на силиконовата пластина.
Разтворът на Piranha е изключително корозивен и генерира топлина. Необходими са допълнителни предпазни мерки. За изхвърляне на отпадъци, оставете разтвора да изстине и прехвърлете в чист, сух контейнер за отпадъци. Използвайте вторични контейнери и правилно етикетирайте контейнерите за отпадъци. Моля, следвайте указанията за безопасност на съоръжението за по-подробни процедури.
Дехидратирайте вафлите, като ги поставите на 200 °C котлон за 10 минути. След дехидратацията вафлата се разклаща пет пъти на въздух, за да се охлади.
Изсипете ~10 g фоторезист SU-8 2100 върху центъра на почистената силиконова пластина. Използвайте пинсети, за да разнесете равномерно фоторезиста върху пластината. От време на време поставяйте вафлата върху 65°C котлон, за да направите фоторезиста по-малко лепкав и по-лесен за разнасяне. Не поставяйте вафлата директно върху котлона.
SU-8 беше равномерно разпределен върху пластината чрез въртене на покритие. Програмирайте входящо въртене на SU-8 за 5–10 s, за да се разпространява при 500 rpm при ускорение от 100 rpm/s. Задайте основното въртене за моделиране с дебелина 200 µm при 1500 rpm или постигнете дебелина 250 µm (като направите височина от 500 µm за горния слой на червата на чипа; вижте „Критични стъпки“ по-долу), настроен на ускорение от 300 rpm/s 30 секунди при 1200 rpm.
Основната скорост на центрофугиране може да се регулира според целевата дебелина на модела SU-8 върху силиконовата пластина.
За да се изработят модели на SU-8 с височина 500 µm за горния слой на червата върху чипа, стъпките на центрофугиране и меко изпичане на тази кутия (стъпки 7 и 8) бяха последователно повторени (вижте стъпка 9), за да се получат два слоя от 250 µm Дебел слой SU-8, който може да бъде наслоен и съединен чрез UV излагане в стъпка 12 на тази кутия, което прави слой 500 µm височина.
Изпечете меко вафлите с покритие SU-8, като внимателно поставите вафлите върху котлон при 65 °C за 5 минути, след това превключете настройката на 95 °C и инкубирайте за още 40 минути.
За да постигнете височина от 500 μm на шаблона SU-8 в горния микроканал, повторете стъпки 7 и 8, за да генерирате два слоя SU-8 с дебелина 250 μm.
Като използвате UV Mask Aligner, извършете тест с лампа съгласно инструкциите на производителя, за да изчислите времето на експозиция на пластината. (време на експозиция, ms) = (доза на експозиция, mJ/cm2)/(мощност на лампата, mW/cm2).
След като определите времето на експозиция, поставете фотомаската върху държача на маската на UV маската за подравняване и поставете фотомаската върху вафлата с покритие SU-8.
Поставете отпечатаната повърхност на фотомаската директно върху страната с покритие SU-8 на силиконовата пластина, за да сведете до минимум UV дисперсията.
Изложете пластината с покритие SU-8 и фотомаската вертикално на 260 mJ/cm2 UV светлина за предварително определеното време на експозиция (вижте стъпка 10 от тази кутия).
След излагане на ултравиолетови лъчи силициевите вафли с покритие SU-8 бяха изпечени при 65°C за 5 минути и 95°C за 15 минути на всяка гореща плоча, за да се изработят шарки с височина 200 µm. Удължете времето след изпичане при 95°C до 30 минути, за да произведете модели с височина 500 µm.
Проявителят се изсипва в стъклен съд и изпечената вафла се поставя в съда. Обемът на SU-8 проявителя може да варира в зависимост от размера на стъклената плоча. Уверете се, че използвате достатъчно SU-8 проявител, за да отстраните напълно неекспонирания SU-8. Например, когато използвате стъклен съд с диаметър 150 mm и капацитет 1 L, използвайте ~300 ml SU-8 проявител. Развийте формата за 25 минути с от време на време леко въртене.
Изплакнете развитата форма с ~10 mL пресен проявител, последвано от IPA чрез пръскане на разтвора с помощта на пипета.
Поставете пластината в плазмен почистващ препарат и я изложете на кислородна плазма (атмосферен газ, целево налягане 1 × 10−5 Torr, мощност 125 W) за 1,5 минути.
Поставете вафлата във вакуумен ексикатор с предметно стъкло вътре. Вафлите и слайдовете могат да се поставят една до друга. Ако вакуумният ексикатор е разделен на няколко слоя с чиния, поставете слайдовете в долната камера, а вафлите в горната камера. Капнете 100 μL трихлоро(1Н, 1Н, 2Н, 2Н-перфлуорооктил)силан разтвор върху чаша плъзнете и приложете вакуум за силанизиране.
Размразете флакон със замразени Caco-2 клетки на 37°C водна баня, след това прехвърлете размразените клетки в T75 колба, съдържаща 15 mL от 37°C предварително затоплена Caco-2 среда.
За да преминете Caco-2 клетки при ~90% сливане, първо затоплете Caco-2 среда, PBS и 0,25% трипсин/1 mM EDTA във водна баня при 37°C.
Аспирирайте средата чрез вакуумна аспирация. Промийте клетките два пъти с 5 mL топъл PBS, като повторите вакуумната аспирация и добавите пресен PBS.