Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка за CSS. За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да изключите режима на съвместимост в Internet Explorer). Междувременно, за да осигурим непрекъсната поддръжка, ще показваме сайта без стилове и JavaScript.
Морфогенезата на човешките черва установява характеристики на крипто-вилусите с 3D епителна микроархитектура и пространствена организация. Тази уникална структура е необходима за поддържане на чревната хомеостаза чрез защита на нишата на стволовите клетки в базалната крипта от екзогенни микробни антигени и техните метаболити. В допълнение, чревните вили и секретиращата слуз представят функционално диференцирани епителни клетки със защитна бариера върху повърхността на чревната лигавица. Следователно, пресъздаването на 3D епителни структури е от решаващо значение за изграждането на in vitro модели на червата. Важно е да се отбележи, че органичният миметичен черво върху чип може да индуцира спонтанна 3D морфогенеза на чревния епител с подобрени физиологични функции и биомеханика. Тук ние предоставяме възпроизводим протокол за стабилно индуциране на чревна морфогенеза в червата върху микрофлуиден чип, както и в вграден хибриден чип Transwell. Описваме подробни методи за изработване на устройства, култивиране на Caco-2 или чревни органоидни епителни клетки в конвенционални условия, както и върху микрофлуидна платформа, индуциране на 3D морфогенеза и характеризиране на установен 3D епител, използвайки множество методи за изобразяване. Този протокол постига регенерация на функционалната чревна микроархитектура чрез контролиране на базолатералния поток на течности в продължение на 5 дни. Нашият метод за in vitro морфогенеза използва физиологично релевантно напрежение на срязване и механично движение и не изисква сложно клетъчно инженерство или манипулация, което може да превъзхожда други съществуващи техники. Предвиждаме, че предложеният от нас протокол би могъл да има широки последици за биомедицинската изследователска общност, предоставяйки метод за регенериране на 3D чревни епителни слоеве in vitro за биомедицински, клинични и фармацевтични приложения.
Експерименти показват, че чревните епителни Caco-2 клетки, култивирани в чревна микрофлуидна микроструктура (чревна микроструктура върху чип)1,2,3,4,5 или двуслойни микрофлуидни устройства6,7, могат да претърпят спонтанна 3D морфогенеза in vitro без ясно разбиране на основния механизъм. В нашето скорошно проучване открихме, че отстраняването на базолатерално секретирани морфогенни антагонисти от културалните устройства е необходимо и достатъчно, за да се индуцира 3D епителна морфогенеза in vitro, което е демонстрирано чрез Caco-2 и чревни органоиди, получени от пациента. Епителните клетки бяха валидирани. В това проучване ние се фокусирахме специално върху клетъчното производство и разпределението на концентрацията на мощен Wnt антагонист, Dickkopf-1 (DKK-1), в чревно-на-чип и модифицирани микрофлуидни устройства, съдържащи Transwell вложки, наречени „Хибриден чип“. Демонстрираме, че добавянето на екзогенни Wnt антагонисти (като DKK-1, Wnt репресор 1, секретиран frizzled-related protein 1 или Soggy-1) към чревното-на-чип устройство инхибира морфогенезата или нарушава предварително структурирания 3D епителен слой, което предполага, че антагонистичният стрес по време на култивиране е отговорен за чревната морфогенеза in vitro. Следователно, практичен подход за постигане на стабилна морфогенеза на епителния интерфейс е да се премахнат или минимално да се поддържат нивата на Wnt антагонисти в базолатералния компартмент чрез активно промиване (напр. в чревно-на-чип или хибридно-на-чип платформи) или дифузия в базолатерална среда (напр. от Transwell вложки в големи базолатерални резервоари в ямки).
В този протокол ние предоставяме подробен метод за изработване на микроустройства тип „чрево върху чип“ и хибридни чипове, които могат да се вмъкват в Transwell (стъпки 1-5), за да се култивират чревни епителни клетки върху порести мембрани на базата на полидиметилсилоксан (PDMS) (стъпки 6А, 7А, 8, 9) или полиестерни мембрани от вложки Transwell (стъпки 6В, 7В, 8, 9) и да се индуцира 3D морфогенеза in vitro (стъпка 10). Също така идентифицирахме клетъчни и молекулярни характеристики, показателни за тъканно-специфична хистогенеза и клетъчна диференциация, зависима от клетъчната линия, чрез прилагане на множество методи за изобразяване (стъпки 11-24). Индуцираме морфогенеза, използвайки човешки чревни епителни клетки, като Caco-2 или чревни органоиди, в два формата на култура с технически подробности, включително модификация на повърхността на порести мембрани, създаване на 2D монослоеве и чревна биохимична и репродукционна активност на биомеханичната микросреда in vitro. За да индуцираме 3D морфогенеза от 2D епителни монослоеве, отстранихме антагонистите на морфогените и в двете култивирани форми чрез протичане. средата в базолатералния компартмент на културата. Накрая, ние предоставяме представяне на полезността на регенерируем 3D епителен слой, който може да се използва за моделиране на морфоген-зависим епителен растеж, надлъжни ко-култури гостоприемник-микробиом, патогенна инфекция, възпалително увреждане, дисфункция на епителната бариера и терапии на базата на пробиотици. Пример.влияния.
Нашият протокол може да бъде полезен за широк кръг учени в областта на фундаменталните (напр. чревна лигавична биология, биология на стволовите клетки и биология на развитието) и приложните изследвания (напр. предклинично тестване на лекарства, моделиране на заболявания, тъканно инженерство и гастроентерология) с широко въздействие. Поради възпроизводимостта и надеждността на нашия протокол за индуциране на 3D морфогенеза на чревния епител in vitro, ние предвиждаме, че нашата техническа стратегия може да бъде разпространена сред аудитории, изучаващи динамиката на клетъчната сигнализация по време на чревното развитие, регенерация или хомеостаза. Освен това, нашият протокол е полезен за изследване на инфекции при различни инфекциозни агенти като норовирус 8, коронавирус 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 или Vibrio cholerae. Полезни са и аудиториите на патологията и патогенезата на заболяванията. Използването на система за чревна микрофизиология на чип може да позволи надлъжно ко-културиране 10 и последваща оценка на защитата на гостоприемника, имунните отговори и възстановяването на свързаните с патогените увреждания в стомашно-чревния (GI) тракт 11. Други GI нарушения, свързани със синдром на пропускливи черва, цьолиакия, болест на Crohn, улцерозен колит, поухит или синдром на раздразнените черва, могат да бъдат симулирани, когато 3D чревни епителни слоеве се приготвят с помощта на 3D чревните епителни слоеве на пациента. Тези заболявания включват атрофия на въси, скъсяване на криптите, увреждане на лигавицата или нарушена епителна бариера. Биопсия или чревни органоиди, получени от стволови клетки 12,13. За да се моделира по-добре по-високата сложност на болестната среда, читателите могат да обмислят добавяне на клетъчни типове, свързани със заболяването, като например мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMC) на пациента, към модели, съдържащи 3D микроархитектури на чревни въси и крипти. тъканно-специфични имунни клетки, 5.
Тъй като 3D епителната микроструктура може да бъде фиксирана и визуализирана без процеса на секциониране, зрителите, работещи върху пространствена транскриптомика и изображения с висока или супер резолюция, може да се интересуват от нашето картографиране на пространствено-времевата динамика на гени и протеини върху епителни ниши. Интересува се от технологии. Реакция на микробни или имунни стимули. Освен това, надлъжни взаимовръзки между гостоприемника и микробиома 10, 14, които координират чревната хомеостаза, могат да бъдат установени в 3D чревния лигавичен слой чрез съвместно култивиране на различни микробни видове, микробни общности или фекална микробиота, особено в червата върху чип. в платформата. Този подход е особено привлекателен за аудитории, изучаващи мукозна имунология, гастроентерология, човешки микробиом, културомика и клинична микробиология, които се стремят да култивират преди това некултивирана чревна микробиота в лабораторията. Ако нашият протокол за in vitro морфогенеза може да бъде адаптиран към мащабируеми формати за култивиране, като например многоямкови вложки в 24, 96 или 384-ямкови плаки, които непрекъснато попълват базолатералните отделения, протоколът може да бъде разпространен и сред тези, които разработват фармацевтични, биомедицински или високопроизводителни платформи за скрининг или валидиране за хранителната промишленост. Като доказателство за принципа, наскоро демонстрирахме осъществимостта на мултиплексна високопроизводителна система за морфогенеза, мащабируема до 24-ямков формат на плака. Освен това, множество продукти „орган върху чип“ са комерсиализирани16,17,18. Следователно, валидирането на нашия метод за in vitro морфогенеза може да бъде ускорено и потенциално възприето от много изследователски лаборатории, индустрия или правителствени и регулаторни агенции, за да се разбере клетъчното препрограмиране на in vitro чревната морфогенеза на транскриптомно ниво за тестване на лекарства или биотерапевтични средства. Абсорбцията и Транспортът на кандидати за лекарства беше оценен с помощта на 3D чревни сурогати или с помощта на персонализирани или търговски модели „орган върху чип“, за да се оцени възпроизводимостта на процеса на чревна морфогенеза.
Ограничен брой експериментални модели, релевантни за човека, са използвани за изследване на чревната епителна морфогенеза, главно поради липсата на приложими протоколи за индуциране на 3D морфогенеза in vitro. Всъщност, голяма част от настоящите знания за чревната морфогенеза се основават на изследвания върху животни (напр. зебра риба20, мишки21 или пилета22). Те обаче са трудоемки и скъпоструващи, могат да бъдат етично съмнителни и най-важното е, че не определят точно процесите на човешкото развитие. Тези модели също са много ограничени в способността си да бъдат тествани по многопосочен мащабируем начин. Следователно, нашият протокол за регенериране на 3D тъканни структури in vitro превъзхожда in vivo животинските модели, както и други традиционни статични 2D модели на клетъчни култури. Както беше описано по-рано, използването на 3D епителни структури ни позволи да изследваме пространствената локализация на диференцираните клетки в оста крипта-вилус в отговор на различни мукозни или имунни стимули. 3D епителните слоеве могат да предоставят пространство за изследване на това как микробните клетки се конкурират за образуване на пространствени ниши и екологична еволюция в отговор на фактори на гостоприемника (напр. вътрешни спрямо външни слоеве на слуз, секреция на IgA и антимикробни пептиди). Освен това, 3D епителната морфология може да ни позволи да разберем как чревната микробиота структурира своите общности и синергично произвежда микробни метаболити (напр. късоверижни мастни киселини), които оформят клетъчната организация и нишите на стволовите клетки в базалните крипти. Тези характеристики могат да бъдат демонстрирани само когато 3D епителни слоеве са установени in vitro.
В допълнение към нашия метод за създаване на 3D чревни епителни структури, съществуват няколко in vitro метода. Чревната органоидна култура е съвременна техника за тъканно инженерство, базирана на култивирането на чревни стволови клетки при специфични морфогенни условия23,24,25. Използването на 3D органоидни модели за транспортен анализ или съвместни култури гостоприемник-микробиом обаче често е предизвикателство, тъй като чревният лумен е затворен в органоида и следователно въвеждането на луминални компоненти като микробни клетки или екзогенни антигени е ограничено. Достъпът до органоидните лумени може да се подобри с помощта на микроинжектор26,27, но този метод е инвазивен и трудоемък и изисква специализирани знания за изпълнение. Освен това, традиционните органоидни култури, поддържани в хидрогелни скелета при статични условия, не отразяват точно активната in vivo биомеханика.
Други подходи, използвани от няколко изследователски групи, използват предварително структурирани 3D хидрогелни скелета, за да имитират чревната епителна структура чрез култивиране на изолирани човешки чревни клетки върху повърхността на гела. Изработете хидрогелни скелета, използвайки 3D-принтирани, микро-фрезовани или литографски изработени форми. Този метод показва самоорганизираното подреждане на изолирани епителни клетки in vitro с физиологично релевантни морфогенни градиенти, установявайки епителна структура с високо съотношение на страните и строма-епителни взаимовръзки чрез включване на стромални клетки в скелета. Въпреки това, природата на предварително структурираните скелета може да попречи на показването на самия спонтанен морфогенетичен процес. Тези модели също не осигуряват динамичен луминален или интерстициален поток, липсва им напрежението на срязване на течността, от което чревните клетки се нуждаят, за да претърпят морфогенеза и да получат физиологична функция. Друго скорошно проучване използва хидрогелни скелета в микрофлуидна платформа и моделирани чревни епителни структури, използвайки техники за лазерно ецване. Миши чревни органоиди следват ецвани модели, за да образуват чревни тръбни структури, а интралуминалният поток на течността може да бъде рекапитулиран с помощта на микрофлуиден модул. Този модел обаче не показва нито спонтанен, нито... морфогенетичните процеси, нито включва механобиологични движения на червата. Техниките за 3D печат от същата група успяха да създадат миниатюрни чревни тръби със спонтанни морфогенетични процеси. Въпреки сложното изработване на различни чревни сегменти в тръбата, на този модел липсва и поток на луминална течност и механична деформация. Освен това, оперативността на модела може да бъде ограничена, особено след завършване на процеса на биопечат, което нарушава експерименталните условия или взаимодействията между клетките. Вместо това, предложеният от нас протокол осигурява спонтанна чревна морфогенеза, физиологично значимо напрежение на срязване, биомеханика, която имитира чревната подвижност, достъпност на независими апикални и базолатерални отделения и пресъздаване на сложни биологични микросреди с модулност. Следователно, нашият in vitro 3D протокол за морфогенеза може да осигури допълнителен подход за преодоляване на предизвикателствата на съществуващите методи.
Нашият протокол е изцяло фокусиран върху 3D епителна морфогенеза, като в културата се използват само епителни клетки и никакви други видове околни клетки, като мезенхимни клетки, ендотелни клетки и имунни клетки. Както беше описано по-рано, ядрото на нашия протокол е индуцирането на епителна морфогенеза чрез премахване на инхибитори на морфогени, секретирани от базолатералната страна на въведената среда. Докато стабилната модулност на нашите черва върху чип и хибрид върху чип ни позволява да пресъздадем вълнообразния 3D епителен слой, допълнителни биологични сложности, като епително-мезенхимни взаимодействия33,34, отлагане на извънклетъчен матрикс (ECM)35 и, в нашия модел, характеристики на крипта-вълни, които предават ниши на стволови клетки в базалните крипти, остават да бъдат разгледани допълнително. Стромалните клетки (напр. фибробласти) в мезенхима играят ключова роля в производството на ECM протеини и регулирането на чревната морфогенеза in vivo35,37,38. Добавянето на мезенхимни клетки към нашия модел подобри морфогенетичния процес и клетъчното прикрепване. ефективност. Ендотелният слой (т.е. капиляри или лимфни съдове) играе важна роля в регулирането на молекулярния транспорт39 и набирането на имунни клетки40 в чревната микросреда. Освен това, компонентите на васкулатурата, които могат да бъдат свързани между тъканните модели, са предпоставка, когато тъканните модели са проектирани да демонстрират взаимодействия между множество органи. Следователно, може да се наложи включване на ендотелни клетки, за да се моделират по-точни физиологични характеристики с резолюция на органно ниво. Имунните клетки, получени от пациента, също са от съществено значение за показване на вродени имунни отговори, представяне на антигени, вродено адаптивно имунно взаимодействие и тъканно-специфичен имунитет в контекста на имитиране на чревни заболявания.
Използването на хибридни чипове е по-лесно от „чрева върху чип“, тъй като настройката на устройството е по-проста и използването на Transwell вложки позволява мащабируема култура на чревния епител. Въпреки това, предлаганите в търговската мрежа Transwell вложки с полиестерни мембрани не са еластични и не могат да симулират перисталтични движения. Освен това, апикалното отделение на Transwell вложката, поставена в хибридния чип, остава неподвижно, без напрежение на срязване от апикалната страна. Очевидно е, че статичните свойства в апикалното отделение рядко позволяват дългосрочна бактериална ко-култура в хибридни чипове. Въпреки че можем да индуцираме стабилно 3D морфогенеза в Transwell вложки, когато използваме хибридни чипове, недостигът на физиологично значима биомеханика и апикален поток на течности може да ограничи осъществимостта на хибридните чип платформи за потенциални приложения.
Пълномащабните реконструкции на човешката крипто-вилусова ос в култури тип „чрево върху чип“ и „хибрид върху чип“ не са напълно установени. Тъй като морфогенезата започва от епителен монослой, 3D микроархитектурите не осигуряват непременно морфологично сходство с криптите in vivo. Въпреки че характеризирахме пролифериращата клетъчна популация близо до базалния криптен домейн в микроинженерния 3D епител, криптните и вилусните области не бяха ясно разграничени. Въпреки че по-високите горни канали на чипа водят до увеличена височина на микроинженерния епител, максималната височина все още е ограничена до ~300–400 µm. Действителната дълбочина на човешките чревни крипти в тънките и дебелите черва е съответно ~135 µm и ~400 µm, а височината на тънките чревни вили е ~600 µm41.
От гледна точка на образната диагностика, in situ свръхрезолюционното изобразяване на 3D микроархитектури може да бъде ограничено до червата върху чип, тъй като необходимото работно разстояние от обектива до епителния слой е от порядъка на няколко милиметра. За да се преодолее този проблем, може да е необходим отдалечен обектив. Освен това, правенето на тънки срези за подготовка на образеца за изобразяване е предизвикателство поради високата еластичност на PDMS. Освен това, тъй като микрофабрикуването слой по слой на червата върху чип включва постоянно сцепление между всеки слой, е изключително трудно да се отвори или отстрани горният слой, за да се изследва повърхностната структура на епителния слой. Например, чрез използване на сканиращ електронен микроскоп (SEM).
Хидрофобността на PDMS е ограничаващ фактор в микрофлуидните изследвания, занимаващи се с хидрофобни малки молекули, тъй като PDMS може неспецифично да адсорбира такива хидрофобни молекули. Могат да се разглеждат алтернативи на PDMS с други полимерни материали. Алтернативно, може да се обмисли модификация на повърхността на PDMS (напр. покритие с липофилни материали 42 или поли(етилен гликол) 43), за да се сведе до минимум адсорбцията на хидрофобни молекули.
И накрая, нашият метод не е добре характеризиран по отношение на осигуряването на високопроизводителен скрининг или „универсална“ лесна за употреба експериментална платформа. Настоящият протокол изисква спринцовка помпа на микроустройство, което заема място в CO2 инкубатор и предотвратява мащабни експерименти. Това ограничение може да бъде значително подобрено чрез мащабируемостта на иновативните формати за култивиране (напр. 24-ямкови, 96-ямкови или 384-ямкови порести вложки, които позволяват непрекъснато попълване и отстраняване на базолатерална среда).
За да индуцираме 3D морфогенеза на човешки чревен епител in vitro, използвахме микрофлуидно чип чревно устройство, съдържащо два паралелни микроканала и еластична пореста мембрана между тях, за да създадем лумен-капилярен интерфейс. Също така демонстрираме използването на едноканално микрофлуидно устройство (хибриден чип), което осигурява непрекъснат базолатерален поток под поляризирани епителни слоеве, отгледани върху Transwell вложки. И в двете платформи, морфогенезата на различни човешки чревни епителни клетки може да бъде демонстрирана чрез прилагане на насочена манипулация на потока за отстраняване на морфогенните антагонисти от базолатералния компартмент. Цялата експериментална процедура (Фигура 1) се състои от пет части: (i) микрофабрикуване на чревния чип или вложковия хибриден чип Transwell (стъпки 1-5; Каре 1), (ii) подготовка на чревни епителни клетки (Caco-2 клетки) или човешки чревни органоиди; кутии 2-5), (iii) култивиране на чревни епителни клетки върху чревни чипове или хибридни чипове (стъпки 6-9), (iv) индуциране на 3D морфогенеза in vitro (стъпка 10) и (v)) за характеризиране на 3D епителната микроструктура (стъпки 11-24). Накрая, подходяща контролна група (обсъдена по-долу) беше създадена, за да се валидира ефективността на in vitro морфогенезата чрез сравняване на епителната морфогенеза с пространствени, времеви, условни или процедурни контроли.
Използвахме две различни платформи за култивиране: черва върху чип с прави канали или нелинейни извити канали, или хибридни чипове, съдържащи Transwell (TW) вложки в микрофлуидно устройство, изработени както е описано в Каре 1, и стъпка 1-5. „Изработване на устройство“ показва основните стъпки при изработването на единичен чип или хибриден чип. „Културиране на човешки чревни епителни клетки“ обяснява клетъчния източник (Caco-2 или човешки чревни органоиди) и процедурата за култивиране, използвани в този протокол. „In vitro морфогенеза“ показва общите стъпки, при които Caco-2 или епителни клетки, получени от органоиди, се култивират върху чревен чип или върху Transwell вложки на хибриден чип, последвано от индуциране на 3D морфогенеза и образуване на характеризирана епителна структура. Номерът на стъпката или номерът на полето на програмата се показва под всяка стрелка. Приложението предоставя примери за това как установените чревни епителни слоеве могат да се използват, например, при характеризиране на клетъчната диференциация, изследвания на чревната физиология, установяване на екосистеми гостоприемник-микробиом и моделиране на заболявания. Имунофлуоресцентни изображения в „Клетъчна диференциация“ показващи ядра, F-актин и MUC2, експресирани в 3D Caco-2 епителния слой, генериран върху чревния чип. MUC2 сигнализацията присъства в бокални клетки и слуз, секретирана от лигавичните повърхности. Флуоресцентни изображения в Gut Physiology показват слуз, получена чрез оцветяване за сиалова киселина и N-ацетилглюкозамин остатъци с помощта на флуоресцентен аглутинин от пшеничен зародиш. Двете припокриващи се изображения в „Host-Microbe Co-Cultures“ показват представителни ко-култури гостоприемник-микробиом в червата върху чип. Левият панел показва ко-културата на E. coli, експресираща зелен флуоресцентен протеин (GFP), с микроинженерни 3D Caco-2 епителни клетки. Десният панел показва локализацията на GFP E. coli, ко-култивирана с 3D Caco-2 епителни клетки, последвано от имунофлуоресцентно оцветяване с F-актин (червено) и ядра (синьо). Моделирането на заболявания илюстрира здрави спрямо пропускливи черва в чипове с чревно възпаление при физиологично предизвикателство с бактериални антигени (напр. липополизахарид, LPS) и имунни клетки (напр. PBMC; зелено). Caco-2 клетки бяха култивирани, за да се установи 3D епителен слой. Мащабна лента, 50 µm. Изображения в долния ред: „Диференциация на клетките“, адаптирано с разрешение от референция.2. Oxford University Press; Възпроизведено с разрешение от реф.5. NAS; „Съвместна култура на гостоприемник-микроб“, адаптирано с разрешение от реф.3. NAS; „Моделиране на заболявания“, адаптирано с разрешение от реф.5. NAS.
Както червата върху чип, така и хибридните чипове са изработени с помощта на PDMS реплики, които са били извадени от силициеви форми чрез мека литография1,44 и са били моделирани със SU-8. Дизайнът на микроканалите във всеки чип се определя, като се вземат предвид хидродинамиката, като напрежение на срязване и хидродинамично налягане1,4,12. Оригиналният дизайн на червата върху чип (Разширени данни, фиг. 1a), който се е състоял от два съпоставени успоредни прави микроканала, се е развил в сложен черва върху чип (Разширени данни, фиг. 1b), който включва двойка извити микроканали, за да се индуцира увеличено време на престой на флуида, нелинейни модели на потока и многоосна деформация на култивираните клетки (фиг. 2a–f)12. Когато е необходимо да се пресъздаде по-сложна чревна биомеханика, могат да се изберат сложни черва върху чипове. Демонстрирахме, че извитият черва-чип също силно индуцира 3D морфогенеза в подобен период от време с подобна степен на епителен растеж в сравнение с оригиналния черва-чип, независимо от типа култивирани клетки. Следователно, за да се индуцира 3D морфогенеза, линейните и сложните дизайни на червата върху чип са взаимозаменяеми. PDMS реплики, втвърдени върху силициеви форми с SU-8 модели, осигуряват негативни характеристики след разформването (фиг. 2a). За да се изработи червото върху чип, подготвеният горен PDMS слой е последователно свързан с порест PDMS филм и след това е подравнен с долния PDMS слой чрез необратимо свързване с помощта на корона обработчик (фиг. 2b-f). За да се изработят хибридни чипове, втвърдените PDMS реплики са свързани със стъклени слайдове, за да се създадат едноканални микрофлуидни устройства, които могат да поберат Transwell вложки (фиг. 2h и разширени данни фиг. 2). Процесът на свързване се извършва чрез третиране на повърхностите на PDMS репликата и стъклото с кислородна плазма или корона обработка. След стерилизация на микрофабрикуваното устройство, прикрепено към силиконовата тръба, настройката на устройството е готова за извършване на 3D морфогенеза на чревния епител (фиг. 2g).
a, Схематична илюстрация на приготвянето на PDMS части от силициеви форми с SU-8. Невтвърденият PDMS разтвор се излива върху силициева форма (вляво), втвърдява се при 60 °C (в средата) и се изважда от формата (вдясно). Изваденият PDMS се нарязва на парчета и се почиства за по-нататъшна употреба.b, Снимка на силициевата форма, използвана за приготвяне на горния слой на PDMS.c, Снимка на силициевата форма, използвана за изработване на порестата мембрана на PDMS.d, Серия от снимки на горните и долните PDMS компоненти и сглобеното чревно устройство върху чип.e, Схема на подравняването на горните, мембранните и долните PDMS компоненти. Всеки слой е необратимо свързан чрез плазмена или коронарна обработка.f, Схема на изработеното устройство „чрево върху чип“ с наслагвани извити микроканали и вакуумни камери.g, Настройка на „чрево върху чип“ за микрофлуидна клетъчна култура. Изработеното „чрево върху чип“, сглобено със силиконова тръба и спринцовка, се поставя върху покривно стъкло. Устройството с чип се поставя върху капака на 150 mm Петриева сонда. съд за обработка. Свързващото вещество се използва за затваряне на силиконовата тръба.h, Визуални снимки на производството на хибриден чип и 3D морфогенеза с помощта на хибридни чипове. В хибридния чип са вмъкнати Transwell вложки, приготвени независимо за култивиране на 2D монослоеве от чревни епителни клетки, за да се индуцира чревна 3D морфогенеза. Средата се перфузира през микроканали под клетъчния слой, установен върху Transwell вложката. Мащабна лента, 1 см.h Препечатано с разрешение от препратката.4. Elsevier.
В този протокол, клетъчната линия Caco-2 и чревните органоиди бяха използвани като епителни източници (Фиг. 3а). И двата типа клетки бяха култивирани независимо (Каре 2 и Каре 5) и използвани за посяване на покритите с ECM микроканали на чип черва или Transwell вложки. Когато клетките са конфлуентни (>95% покритие в колби), рутинно култивираните Caco-2 клетки (между пасажи 10 и 50) в Т-колби се събират, за да се приготвят дисоциирани клетъчни суспензии чрез трипсинизираща течност (каре 2). Човешки чревни органоиди от чревни биопсии или хирургични резекции се култивират в Matrigel скелетни куполи в 24-ямкови плаки, за да се поддържа структурната микросреда. Среда, съдържаща есенциални морфогени (като Wnt, R-спондин и Noggin) и растежни фактори, приготвени както е описано в Каре 3, се допълваше през ден, докато органоидите нараснат до ~500 µm в диаметър. Напълно порасналите органоиди се събират и дисоциират на единични клетки за посяване върху черва или Вложки Transwell върху чип (Каре 5). Както вече съобщихме, той може да бъде диференциран според вида на заболяването12,13 (напр. улцерозен колит, болест на Crohn, колоректален рак или нормален донор), мястото на лезията (напр. лезия спрямо незасегната област) и стомашно-чревното местоположение в тракта (напр. дванадесетопръстник, йеюнум, илеум, цекум, дебело черво или ректум). В Каре 5 предоставяме оптимизиран протокол за култивиране на колонни органоиди (колоиди), които обикновено изискват по-високи концентрации на морфогени от органоидите на тънките черва.
a, Работен процес за индуциране на чревна морфогенеза в чревния чип. В този протокол се използват човешки чревен епител Caco-2 и чревни органоиди за демонстриране на 3D морфогенеза. Изолираните епителни клетки са посяти в подготвеното устройство „чреве върху чип“ (подготовка на чип). След като клетките са посяти (посяти) и прикрепени (прикрепени) към порестата мембрана на PDMS на ден 0 (D0), се инициира апикален (AP) поток и се поддържа през първите 2 дни (поток, AP, D0-D2). Базолатерален (BL) поток също се инициира заедно с циклични движения на разтягане (разтягане, поток, AP и BL), когато се образува пълен 2D монослой. Чревната 3D морфогенеза се е случила спонтанно след 5 дни микрофлуидна култура (морфогенеза, D5). Фазово-контрастните изображения показват представителна морфология на Caco-2 клетките във всяка експериментална стъпка или времева точка (стълбовидна диаграма, 100 µm). Четири схематични диаграми, илюстриращи съответните каскади на чревна морфогенеза (горе вдясно). Пунктираните стрелки На схематичното изображение е показана посоката на потока на флуида.b, SEM изображение, показващо повърхностната топология на установения 3D Caco-2 епител (вляво). Вложката, подчертаваща увеличената област (бяла пунктирана кутия), показва регенерираните микроворси върху 3D Caco-2 слоя (вдясно).c, Хоризонтален фронтален изглед на установения Caco-2 3D, клаудин (ZO-1, червено) и непрекъснати мембрани с четковидна граница, обозначени като F-актин (зелено) и ядра (синьо). Имунофлуоресцентна конфокална визуализация на епителни клетки върху чревни чипове. Стрелките, сочещи към средната схема, показват местоположението на фокалната равнина за всеки конфокален изглед.d, Времеви ход на морфологичните промени в органоиди, култивирани върху чип, получени чрез фазово-контрастна микроскопия на 3, 7, 9, 11 и 13 ден. Вложката (горе вдясно) показва голямото увеличение на предоставеното изображение.e, DIC фотомикрография на органоиден 3D епител, установен в червата, върху срез, взет на 7 ден.f, Наслагвани имунофлуоресцентни изображения, показващи маркери за стволови клетки. (LGR5; магента), бокални клетки (MUC2; зелено), F-актин (сив) и ядра (циан), отглеждани върху чревни чипове съответно в продължение на 3 дни (вляво) и 13-дневни (в средата) органоиди върху епителния слой. Вижте също Фигура 3 с разширени данни, която подчертава LGR5 сигнализацията без MUC2 сигнализация. Флуоресцентни изображения, показващи епителната микроструктура (вдясно) на 3D органоиден епител, установен в червата върху чип чрез оцветяване на плазмената мембрана с багрило CellMask (вдясно) на 13-ия ден от култивирането. Мащабната лента е 50 μm, освен ако не е посочено друго.b Препечатано с разрешение от препратка.2. Oxford University Press; c Адаптирано с разрешение от препратка.2. Oxford University Press; e и f адаптирани с разрешение чрез препратка.12 Под Creative Commons License CC BY 4.0.
В червата върху чип е необходимо да се модифицира хидрофобната повърхност на порестата PDMS мембрана за успешно ECM покритие. В този протокол прилагаме два различни метода за модифициране на хидрофобността на PDMS мембраните. За култивиране на Caco-2 клетки, повърхностната активация само чрез UV/озонова обработка беше достатъчна, за да намали хидрофобността на PDMS повърхността, да покрие ECM и да прикрепи Caco-2 клетките към PDMS мембраната. Микрофлуидната култура на органоиден епител обаче изисква химическа повърхностна функционализация, за да се постигне ефективно отлагане на ECM протеини чрез последователно прилагане на полиетиленимин (PEI) и глутаралдехид към PDMS микроканали. След модификация на повърхността, ECM протеините се отлагат, за да покрият функционализираната PDMS повърхност и след това се въвеждат в изолирания органоиден епител. След като клетките са прикрепени, микрофлуидната клетъчна култура започва с перфузия само на средата в горния микроканал, докато клетките образуват пълен монослой, докато долният микроканал поддържа статични условия. Този оптимизиран метод за повърхностна активация и ECM покритие позволява прикрепването на органоиден епител, за да се индуцира 3D морфогенеза върху PDMS повърхността.
Културите Transwell също изискват покритие с ECM преди посяване на клетките; въпреки това, културите Transwell не изискват сложни стъпки на предварителна обработка за активиране на повърхността на порестите вложки. За отглеждане на Caco-2 клетки върху вложки Transwell, покритието с ECM върху порести вложки ускорява прикрепването на дисоциираните Caco-2 клетки (<1 час) и образуването на плътна бариера (<1-2 дни). За култивиране на органоиди върху вложки Transwell, изолирани органоиди се посяват върху покрити с ECM вложки, прикрепват се към повърхността на мембраната (<3 часа) и се поддържат, докато органоидите образуват пълен монослой с бариерна цялост. Култивирането на Transwell се извършва в 24-ямкови плаки без използването на хибридни чипове.
In vitro 3D морфогенезата може да бъде инициирана чрез прилагане на флуиден поток към базолатералната страна на установен епителен слой. В червата върху чип, епителната морфогенеза започва, когато средата се перфузира в горния и долния микроканал (фиг. 3а). Както беше описано по-рано, е изключително важно да се въведе флуиден поток в долното (базолатерално) отделение за непрекъснато отстраняване на насочено секретирани морфогенни инхибитори. За да се осигурят достатъчно хранителни вещества и серум за клетките, свързани с порести мембрани, и да се генерира луминално напрежение на срязване, обикновено прилагаме двоен поток в червата върху чип. В хибридните чипове, Transwell вложки, съдържащи епителни монослоеве, са вмъкнати в хибридните чипове. След това средата е приложена под базолатералната страна на порестата Transwell вложка през микроканала. Чревната морфогенеза настъпва 3-5 дни след започване на базолатералния поток и в двете културални платформи.
Морфологичните характеристики на микроинженерните 3D епителни слоеве могат да бъдат анализирани чрез прилагане на различни методи за изобразяване, включително фазово-контрастна микроскопия, диференциално-интерферентен контраст (DIC) микроскопия, SEM или имунофлуоресцентна конфокална микроскопия (Фигури 3 и 4). Фазово-контрастното или DIC изобразяване може лесно да се извърши по всяко време по време на култивирането, за да се наблюдава формата и изпъкналостта на 3D епителните слоеве. Благодарение на оптичната прозрачност на PDMS и полиестерните филми, както платформите тип „чрево върху чип“, така и хибридните чипове могат да осигурят in situ изобразяване в реално време, без да е необходимо секциониране или разглобяване на устройството. При извършване на имунофлуоресцентно изобразяване (Фигури 1, 3c, f и 4b, c), клетките обикновено се фиксират с 4% (тегл./об.) параформалдехид (PFA), последван от Triton X-100 и 2% (тегл./об.) говежди серумен албумин (BSA), по ред. В зависимост от типа на клетката могат да се използват различни фиксатори, пермеабилизатори и блокиращи агенти. Първични антитела, насочени към клетка или регион, зависими от линията. Маркери се използват за маркиране на клетки, имобилизирани in situ върху чипа, последвани от вторични антитела, заедно с контрастно багрило, насочено или към ядрото (напр. 4′,6-диамидино-2-фенилен)индол, DAPI) или F-актина (напр. флуоресцентно белязан фалоидин). Флуоресцентно-базирано изобразяване на живо може да се извърши и in situ за откриване на производство на слуз (фиг. 1, „Клетъчна диференциация“ и „Физиология на червата“), произволна колонизация на микробни клетки (фиг. 1, „Съвместна култура на гостоприемник-микроб“), набиране на имунни клетки (фиг. 1, „Моделиране на заболявания“) или контурите на 3D епителна морфология (фиг. 3c,f и 4b,c). При модифициране на червата върху чипа, за да се отдели горният слой от долния микроканален слой, както е описано в ref. Както е показано на фиг. 2, 3D епителната морфология, както и микроворсите на апикалната четкова граница, могат да бъдат визуализирани чрез SEM (фиг. 3b). Експресията на Маркерите за диференциация могат да бъдат оценени чрез извършване на количествена PCR5 или секвениране на РНК на единични клетки. В този случай, 3D слоеве от епителни клетки, отглеждани в чревни чипове или хибридни чипове, се събират чрез трипсинизация и след това се използват за молекулярен или генетичен анализ.
a, Работен процес за индуциране на чревна морфогенеза в хибриден чип. Caco-2 и чревни органоиди се използват в този протокол за демонстриране на 3D морфогенеза в хибридна чип платформа. Дисоциирани епителни клетки бяха посяти в подготвени Transwell вложки (TW prep; вижте фигурата по-долу). След като клетките бяха посяти (посяти) и прикрепени към полиестерни мембрани в Transwell вложки, всички клетки бяха култивирани при статични условия (TW култура). След 7 дни, единична Transwell вложка, съдържаща 2D монослой от епителни клетки, беше интегрирана в хибриден чип, за да се въведе базолатерален поток (Flow, BL), което в крайна сметка доведе до генериране на 3D епителен слой (морфогенеза). Фазово-контрастни микрографии, показващи морфологични характеристики на човешки органни епителни клетки, получени от възходящ колон на нормален донор (линия C103) във всяка експериментална стъпка или времева точка. Схемите в горните слоеве илюстрират експерименталната конфигурация за всяка стъпка.b, Хибридните чипове (лява схема) могат да доведат до 3D морфогенеза на органоидни епителни клетки с изгледи отгоре надолу от конфокална микроскопия, направени при различни... Z позиции (горна, средна и долна; вижте дясната схема и съответните пунктирани линии). показват очевидни морфологични характеристики. F-актин (циан), ядро ​​(сиво).c, Флуоресцентни конфокални микрографии (3D ъглов изглед) на епителни клетки, получени от органоиди, култивирани в статичен Transwell (TW; вмъкната част в бялата пунктирана кутия) спрямо хибриден чип (най-големият пълен кадър), сравняващи съответно 2D спрямо 3D морфология. Чифт 2D вертикални напречни изгледи (вмъкната част в горния десен ъгъл; „XZ“) също показват 2D и 3D характеристики. Мащабна лента, 100 µm.c Препечатано с разрешение от препратката.4. Elsevier.
Контролите могат да бъдат приготвени чрез култивиране на същите клетки (Caco-2 или чревни органоидни епителни клетки) в двуизмерни монослоеве при конвенционални статични условия на култивиране. Важно е да се отбележи, че изчерпването на хранителните вещества може да се дължи на ограничения обемен капацитет на микроканалите (т.е. ~4 µL в горния канал на оригиналния дизайн на чревния чип). Следователно, епителната морфология преди и след прилагане на базолатерален поток също може да бъде сравнена.
Процесът на мека литография трябва да се извършва в чисто помещение. За всеки слой върху чипа (горен и долен слой и мембрани) и хибридните чипове са използвани различни фотомаски, изработени върху отделни силициеви пластини, тъй като височините на микроканалите са различни. Целевите височини на горните и долните микроканали на червата на чипа са съответно 500 µm и 200 µm. Целевата височина на канала на хибридния чип е 200 µm.
Поставете 3-инчова силициева пластина в чиния с ацетон. Внимателно разклатете пластината за 30 секунди, след което изсушете пластината на въздух. Прехвърлете пластината в чиния с IPA, след което завъртете пластината за 30 секунди, за да я почистите.
Разтвор на пираня (смес от водороден пероксид и концентрирана сярна киселина, 1:3 (обем/обем)) може по избор да се използва за максимално отстраняване на органични остатъци от повърхността на силициевата пластина.
Разтворът Piranha е изключително корозивен и генерира топлина. Необходими са допълнителни предпазни мерки. За изхвърляне на отпадъци, оставете разтвора да се охлади и го прехвърлете в чист, сух контейнер за отпадъци. Използвайте вторични контейнери и етикетирайте правилно контейнерите за отпадъци. Моля, следвайте указанията за безопасност на съоръжението за по-подробни процедури.
Дехидратирайте вафлите, като ги поставите на котлон с температура 200°C за 10 минути. След дехидратация, вафлата се разклаща пет пъти на въздух, за да се охлади.
Изсипете ~10 g фоторезист SU-8 2100 върху центъра на почистената силициева пластина. Използвайте пинсети, за да разпределите фоторезиста равномерно върху пластината. От време на време поставяйте пластината върху гореща плоча с температура 65°C, за да направите фоторезиста по-малко лепкав и по-лесен за разнасяне. Не поставяйте пластината директно върху горещата плоча.
SU-8 беше равномерно разпределен върху пластината чрез центрофугиране. Програмирайте входящо въртене на SU-8 за 5–10 s, за да се разпространява при 500 rpm и ускорение от 100 rpm/s. Задайте основното въртене за моделиране с дебелина 200 µm при 1500 rpm или постигнете дебелина от 250 µm (като направите височина 500 µm за горния слой на червата на чипа; вижте „Критични стъпки“ по-долу), зададено при ускорение от 300 rpm/s за 30 секунди при 1200 rpm.
Основната скорост на въртене може да се регулира според целевата дебелина на SU-8 шаблона върху силициевата пластина.
За да се изработят SU-8 модели с височина 500 µm за горния слой на червата върху чипа, стъпките на центрофугиране и меко печене на тази кутия (стъпки 7 и 8) бяха последователно повторени (вижте стъпка 9), за да се получат два слоя SU-8 с дебелина 250 µm, които могат да бъдат наслоени и съединени чрез UV облъчване в стъпка 12 на тази кутия, което прави слой с височина 500 µm.
Изпечете меко покритите с SU-8 вафли, като внимателно ги поставите върху гореща плоча при 65 °C за 5 минути, след което превключете настройката на 95 °C и инкубирате за допълнителни 40 минути.
За да се постигне височина от 500 μm на SU-8 шаблона в горния микроканал, повторете стъпки 7 и 8, за да генерирате два SU-8 слоя с дебелина 250 μm.
Използвайки UV Mask Aligner, извършете тест с лампа съгласно инструкциите на производителя, за да изчислите времето на експозиция на пластината. (време на експозиция, ms) = (доза на експозиция, mJ/cm2)/(мощност на лампата, mW/cm2).
След определяне на времето за експозиция, поставете фотомаската върху държача за маска на UV подравняващото устройство за маска и поставете фотомаската върху покритата с SU-8 пластина.
Поставете отпечатаната повърхност на фотошаблона директно върху покритата със SU-8 страна на силициевата пластина, за да сведете до минимум UV дисперсията.
Експонирайте покритата със SU-8 пластина и фотомаска вертикално на 260 mJ/cm2 UV светлина за предварително определеното време на експозиция (вижте стъпка 10 на това поле).
След UV облъчване, силициевите пластини, покрити със SU-8, бяха изпечени при 65°C за 5 минути и 95°C за 15 минути на всяка гореща плоча, за да се изработят модели с височина 200 μm. Времето за последващо изпичане при 95°C беше удължено до 30 минути, за да се изработят модели с височина 500 µm.
Проявителят се излива в стъклена чиния и изпечената вафла се поставя в чиния. Обемът на проявителя SU-8 може да варира в зависимост от размера на стъклената плоча. Уверете се, че използвате достатъчно проявител SU-8, за да отстраните напълно неекспонирания SU-8. Например, когато използвате стъклена чиния с диаметър 150 mm и вместимост 1 L, използвайте ~300 mL проявител SU-8. Проявявайте формата в продължение на 25 минути с периодично леко завъртане.
Изплакнете проявената форма с ~10 mL пресен проявител, последвано от IPA чрез напръскване на разтвора с пипета.
Поставете пластината в плазмен почистващ препарат и я изложете на кислородна плазма (атмосферен газ, целево налягане 1 × 10−5 Torr, мощност 125 W) за 1,5 минути.
Поставете пластината във вакуумен ексикатор със стъклен предмет вътре. Пластините и слайдовете могат да се поставят един до друг. Ако вакуумният ексикатор е разделен на няколко слоя с пластина, поставете слайдовете в долната камера, а пластините - в горната камера. Капнете 100 μL разтвор на трихлоро(1H, 1H, 2H, 2H-перфлуорооктил)силан върху стъклен предмет и приложете вакуум за силанизиране.
Размразете флакон със замразени Caco-2 клетки във водна баня с температура 37°C, след което прехвърлете размразените клетки в колба T75, съдържаща 15 mL предварително загрята до 37°C Caco-2 среда.
За да преминат Caco-2 клетки при ~90% конфлуентност, първо затоплете Caco-2 среда, PBS и 0,25% трипсин/1 mM EDTA във водна баня с температура 37°C.
Аспирирайте средата чрез вакуумна аспирация. Измийте клетките два пъти с 5 mL топъл PBS, като повторите вакуумната аспирация и добавите пресен PBS.