Благодарим ви, че посетихте Nature.com.Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка на CSS.За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer).Междувременно, за да осигурим постоянна поддръжка, ние ще визуализираме сайта без стилове и JavaScript.
Еволюцията на микробните паразити включва противодействие между естествения подбор, който кара паразитите да се подобряват, и генетичния дрейф, който кара паразитите да губят гени и да натрупват вредни мутации.Тук, за да разберем как това противодействие възниква в мащаба на една макромолекула, ние описваме крио-ЕМ структурата на рибозомата на Encephalitozoon cuniculi, еукариотен организъм с един от най-малките геноми в природата.Екстремното намаляване на рРНК в рибозомите на E. cuniculi е придружено от безпрецедентни структурни промени, като еволюцията на неизвестни досега слети рРНК линкери и рРНК без издутини.В допълнение, рибозомата на E. cuniculi оцелява след загубата на rRNA фрагменти и протеини, като развива способността да използва малки молекули като структурни имитатори на разградени rRNA фрагменти и протеини.Като цяло, ние показваме, че молекулярните структури, за които отдавна се смята, че са намалени, изродени и подложени на инвалидизиращи мутации, имат редица компенсаторни механизми, които ги поддържат активни въпреки екстремните молекулярни контракции.
Тъй като повечето групи микробни паразити имат уникални молекулярни инструменти, за да използват своите гостоприемници, често трябва да разработим различни терапевтични средства за различни групи паразити1,2.Въпреки това, нови доказателства сочат, че някои аспекти на еволюцията на паразитите са конвергентни и до голяма степен предвидими, което показва потенциална основа за широки терапевтични интервенции при микробни паразити 3,4,5,6,7,8,9.
Предишна работа идентифицира обща еволюционна тенденция при микробните паразити, наречена намаляване на генома или разпад на генома 10,11,12,13.Настоящите изследвания показват, че когато микроорганизмите се откажат от свободния си начин на живот и станат вътреклетъчни паразити (или ендосимбионти), техните геноми претърпяват бавни, но удивителни метаморфози в продължение на милиони години9,11.В процес, известен като гниене на генома, микробните паразити натрупват вредни мутации, които превръщат много важни преди това гени в псевдогени, което води до постепенна загуба на гени и мутационен колапс14,15.Този колапс може да унищожи до 95% от гените в най-старите вътреклетъчни организми в сравнение с тясно свързани свободно живеещи видове.По този начин еволюцията на вътреклетъчните паразити е дърпане на въже между две противоположни сили: Дарвинов естествен подбор, водещ до подобряване на паразитите, и колапс на генома, хвърлящ паразитите в забрава.Как паразитът успява да излезе от това дърпане на въже и да запази активността на своята молекулярна структура остава неясно.
Въпреки че механизмът на разпадане на генома не е напълно разбран, изглежда, че се случва главно поради честия генетичен дрейф.Тъй като паразитите живеят в малки, асексуални и генетично ограничени популации, те не могат ефективно да елиминират вредните мутации, които понякога възникват по време на репликацията на ДНК.Това води до необратимо натрупване на вредни мутации и намаляване на генома на паразита.В резултат на това паразитът не само губи гени, които вече не са необходими за неговото оцеляване във вътреклетъчната среда.Това е неспособността на паразитните популации да елиминират ефективно спорадични вредни мутации, което кара тези мутации да се натрупват в целия геном, включително техните най-важни гени.
Голяма част от настоящото ни разбиране за намаляване на генома се основава единствено на сравнения на геномни последователности, с по-малко внимание към промените в действителните молекули, които изпълняват домакински функции и служат като потенциални мишени за лекарства.Сравнителни проучвания показват, че тежестта на вредните вътреклетъчни микробни мутации изглежда предразполага протеините и нуклеиновите киселини към неправилно нагъване и агрегиране, което ги прави по-зависими от шаперона и свръхчувствителни към топлина19,20,21,22,23.В допълнение, различни паразити - независима еволюция, понякога разделени от цели 2,5 милиарда години - претърпяха подобна загуба на центрове за контрол на качеството в техния протеинов синтез5,6 и механизми за възстановяване на ДНК24.Въпреки това, малко се знае за въздействието на вътреклетъчния начин на живот върху всички други свойства на клетъчните макромолекули, включително молекулярната адаптация към нарастващото бреме от вредни мутации.
В тази работа, за да разберем по-добре еволюцията на протеините и нуклеиновите киселини на вътреклетъчните микроорганизми, ние определихме структурата на рибозомите на вътреклетъчния паразит Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi е подобен на гъбички организъм, принадлежащ към група паразитни микроспоридии, които имат необичайно малки еукариотни геноми и следователно се използват като моделни организми за изследване на разпадането на генома 25, 26, 27, 28, 29, 30.Наскоро беше определена cryo-EM рибозомна структура за умерено редуцирани геноми на Microsporidia, Paranosema locustae и Vairimorpha necatrix 31, 32 (~ 3.2 Mb геном).Тези структури предполагат, че известна загуба на рРНК амплификация се компенсира от развитието на нови контакти между съседни рибозомни протеини или придобиването на нови msL131,32 рибозомни протеини.Видовете Encephalitozoon (геном ~2,5 милиона bp), заедно с техния най-близък роднина Ordospora, демонстрират крайната степен на редукция на генома при еукариотите – те имат по-малко от 2000 гена, кодиращи протеини, и се очаква, че техните рибозоми не само са лишени от фрагменти за разширяване на рРНК (фрагменти на рРНК, които разграничават еукариотните рибозоми от бактериалните рибозоми), но имат и четири ребра осомални протеини поради липсата им на хомолози в генома на E. cuniculi26,27,28.Следователно заключихме, че рибозомата на E. cuniculi може да разкрие неизвестни досега стратегии за молекулярна адаптация към разпадане на генома.
Нашата cryo-EM структура представлява най-малката еукариотна цитоплазмена рибозома, която трябва да бъде характеризирана, и дава представа за това как крайната степен на намаляване на генома влияе върху структурата, сглобяването и еволюцията на молекулярната машина, която е неразделна част от клетката.Открихме, че рибозомата на E. cuniculi нарушава много от широко запазените принципи на сгъване на РНК и сглобяване на рибозоми и открихме нов, неизвестен досега рибозомен протеин.Съвсем неочаквано ние показваме, че рибозомите на микроспоридиите са развили способността да свързват малки молекули и предполагаме, че съкращенията в рРНК и протеините предизвикват еволюционни иновации, които в крайна сметка могат да придадат полезни качества на рибозомата.
За да подобрим разбирането си за еволюцията на протеините и нуклеиновите киселини във вътреклетъчните организми, решихме да изолираме спорите на E. cuniculi от култури на заразени клетки на бозайници, за да пречистим техните рибозоми и да определим структурата на тези рибозоми.Трудно е да се получи голям брой паразитни микроспоридии, тъй като микроспоридиите не могат да бъдат култивирани в хранителна среда.Вместо това те растат и се възпроизвеждат само в клетката гостоприемник.Следователно, за да получим биомаса от E. cuniculi за пречистване на рибозома, ние заразихме клетъчната линия на бъбреците на бозайниците RK13 със спори на E. cuniculi и култивирахме тези заразени клетки в продължение на няколко седмици, за да позволим на E. cuniculi да расте и да се размножава.Използвайки инфектиран клетъчен монослой от около половин квадратен метър, успяхме да пречистим около 300 mg спори на Microsporidia и да ги използваме за изолиране на рибозоми.След това разрушихме пречистените спори със стъклени перли и изолирахме суровите рибозоми, като използвахме поетапно полиетиленгликолово фракциониране на лизатите.Това ни позволи да получим приблизително 300 µg сурови рибозоми на E. cuniculi за структурен анализ.
След това събрахме крио-ЕМ изображения, използвайки получените проби от рибозоми и обработихме тези изображения, използвайки маски, съответстващи на голямата рибозомна субединица, малка глава на субединица и малка субединица.По време на този процес събрахме изображения на около 108 000 рибозомни частици и изчислихме крио-ЕМ изображения с разделителна способност 2,7 Å (допълнителни фигури 1-3).След това използвахме cryoEM изображения за моделиране на rRNA, рибозомален протеин и фактор на хибернация Mdf1, свързан с рибозомите на E. cuniculi (фиг. 1a, b).
a Структура на рибозомата на E. cuniculi в комплекс с фактора на хибернация Mdf1 (pdb id 7QEP).b Карта на фактора на хибернация Mdf1, свързан с рибозомата на E. cuniculi.c Карта на вторична структура, сравняваща възстановената рРНК в видовете Microsporidian с известни рибозомни структури.Панелите показват местоположението на амплифицираните рРНК фрагменти (ES) и рибозомните активни места, включително мястото на декодиране (DC), сарцинициновата бримка (SRL) и пептидил трансферазния център (PTC).d Електронната плътност, съответстваща на пептидил трансферазния център на рибозомата на E. cuniculi, предполага, че това каталитично място има същата структура в паразита E. cuniculi и неговите гостоприемници, включително H. sapiens.e, f Съответстващата електронна плътност на декодиращия център (e) и схематичната структура на декодиращия център (f) показват, че E. cuniculi има остатъци U1491 вместо A1491 (номериране на E. coli) в много други еукариоти.Тази промяна предполага, че E. cuniculi може да е чувствителен към антибиотици, насочени към това активно място.
За разлика от установените по-рано структури на рибозомите на V. necatrix и P. locustae (и двете структури представляват едно и също семейство микроспоридии Nosematidae и са много сходни една с друга), 31,32 рибозомите на E. cuniculi претърпяват множество процеси на рРНК и протеинова фрагментация.Допълнителна денатурация (допълнителни фигури 4-6).В rRNA най-забележителните промени включват пълна загуба на амплифицирания 25S rRNA фрагмент ES12L и частична дегенерация на h39, h41 и H18 спирали (фиг. 1c, допълнителна фигура 4).Сред рибозомните протеини най-забележителните промени включват пълна загуба на протеина eS30 и скъсяване на протеините eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 и eS7 (допълнителни фигури 4, 5).
По този начин екстремното намаляване на геномите на видовете Encephalotozoon/Ordospora се отразява в тяхната рибозомна структура: рибозомите на E. cuniculi изпитват най-драматичната загуба на протеиново съдържание в еукариотните цитоплазмени рибозоми, предмет на структурна характеристика, и те дори нямат тези рРНК и протеинови фрагменти, които са широко запазени не само в еукариотите, но и в трите области на живота.Структурата на рибозомата на E. cuniculi предоставя първия молекулярен модел за тези промени и разкрива еволюционни събития, които са били пренебрегнати както от сравнителната геномика, така и от изследванията на вътреклетъчната биомолекулна структура (допълнителна фигура 7).По-долу описваме всяко от тези събития заедно с вероятния им еволюционен произход и потенциалното им въздействие върху функцията на рибозомите.
След това открихме, че в допълнение към големите рРНК съкращения, рибозомите на E. cuniculi имат рРНК вариации в едно от техните активни места.Въпреки че пептидил трансферазният център на рибозомата на E. cuniculi има същата структура като другите еукариотни рибозоми (фиг. 1d), декодиращият център се различава поради вариация на последователността при нуклеотид 1491 (номериране на E. coli, фиг. 1e, f).Това наблюдение е важно, тъй като мястото на декодиране на еукариотни рибозоми обикновено съдържа остатъци G1408 и A1491 в сравнение с остатъци от бактериален тип A1408 и G1491.Тази вариация е в основата на различната чувствителност на бактериалните и еукариотните рибозоми към аминогликозидното семейство на рибозомни антибиотици и други малки молекули, които са насочени към мястото на декодиране.В мястото на декодиране на рибозомата на E. cuniculi, остатъкът A1491 беше заменен с U1491, потенциално създавайки уникален свързващ интерфейс за малки молекули, насочени към това активно място.Същият вариант A14901 присъства и в други микроспоридии като P. locustae и V. necatrix, което предполага, че е широко разпространен сред видовете микроспоридии (фиг. 1f).
Тъй като нашите проби от рибозома E. cuniculi бяха изолирани от метаболитно неактивни спори, тествахме крио-ЕМ картата на E. cuniculi за описаното по-рано свързване на рибозома при условия на стрес или глад.Фактори на хибернация 31, 32, 36, 37, 38. Съпоставихме установената преди това структура на хиберниращата рибозома с крио-ЕМ картата на рибозомата на E. cuniculi.За докинг бяха използвани рибозоми на S. cerevisiae в комплекс с фактор на хибернация Stm138, рибозоми на скакалец в комплекс с фактор Lso232 и рибозоми на V. necatrix в комплекс с фактори Mdf1 и Mdf231.В същото време открихме крио-ЕМ плътността, съответстваща на фактора на почивка Mdf1.Подобно на Mdf1, свързващ се с рибозомата на V. necatrix, Mdf1 също се свързва с рибозомата на E. cuniculi, където блокира E мястото на рибозомата, като вероятно помага да се направят рибозомите достъпни, когато спорите на паразита станат метаболитно неактивни при инактивиране на тялото (Фигура 2).).
Mdf1 блокира E мястото на рибозомата, което изглежда помага за инактивирането на рибозомата, когато паразитните спори станат метаболитно неактивни.В структурата на рибозомата на E. cuniculi открихме, че Mdf1 образува неизвестен досега контакт със стъблото на рибозомата L1, частта от рибозомата, която улеснява освобождаването на деацилирана тРНК от рибозомата по време на протеинов синтез.Тези контакти предполагат, че Mdf1 се дисоциира от рибозомата, използвайки същия механизъм като деацетилираната тРНК, предоставяйки възможно обяснение за това как рибозомата премахва Mdf1, за да реактивира протеиновия синтез.
Въпреки това, нашата структура разкри неизвестен контакт между Mdf1 и крака на рибозомата L1 (частта от рибозомата, която помага за освобождаването на деацилирана tRNA от рибозомата по време на протеиновия синтез).По-специално, Mdf1 използва същите контакти като сегмента на лакътя на деацилираната tRNA молекула (фиг. 2).Това неизвестно преди това молекулярно моделиране показа, че Mdf1 се дисоциира от рибозомата, използвайки същия механизъм като деацетилираната тРНК, което обяснява как рибозомата премахва този фактор на хибернация, за да реактивира протеиновия синтез.
Когато конструирахме модела на рРНК, открихме, че рибозомата на E. cuniculi има необичайно нагънати фрагменти на рРНК, които нарекохме слята рРНК (фиг. 3).В рибозомите, които обхващат трите домена на живота, рРНК се сгъва в структури, в които повечето рРНК бази се сдвояват или сгъват една с друга или взаимодействат с рибозомни протеини 38,39,40.Въпреки това, в рибозомите на E. cuniculi, rRNAs изглежда нарушават този принцип на сгъване, като превръщат някои от техните спирали в разгънати rRNA региони.
Структура на спиралата на H18 25S rRNA в S. cerevisiae, V. necatrix и E. cuniculi.Обикновено в рибозомите, обхващащи трите жизнени домена, този линкер се навива в РНК спирала, която съдържа 24 до 34 остатъка.В Microsporidia, напротив, този rRNA линкер постепенно се редуцира до два едноверижни богати на уридин линкера, съдържащи само 12 остатъка.Повечето от тези остатъци са изложени на разтворители.Фигурата показва, че изглежда, че паразитните микроспоридии нарушават общите принципи на сгъване на рРНК, където рРНК базите обикновено се свързват с други бази или участват във взаимодействията на рРНК-протеин.В микроспоридиите някои фрагменти на рРНК придобиват неблагоприятна гънка, при която предишната спирала на рРНК се превръща в едноверижен фрагмент, удължен почти в права линия.Наличието на тези необичайни региони позволява на рРНК на микроспоридиите да свързва отдалечени фрагменти на рРНК, използвайки минимален брой РНК бази.
Най-яркият пример за този еволюционен преход може да се наблюдава в спиралата H18 25S rRNA (фиг. 3).При видовете от E. coli до хората, основите на тази рРНК спирала съдържат 24-32 нуклеотида, образувайки леко неправилна спирала.В предварително идентифицирани рибозомни структури от V. necatrix и P. locustae, 31, 32 основите на H18 спиралата са частично развити, но сдвояването на нуклеотидните бази е запазено.Въпреки това, в E. cuniculi този рРНК фрагмент става най-късите линкери 228UUUGU232 и 301UUUUUUUUU307.За разлика от типичните рРНК фрагменти, тези богати на уридин линкери не се навиват или осъществяват обширен контакт с рибозомни протеини.Вместо това те приемат отворени за разтворител и напълно разгънати структури, в които нишките на рРНК са удължени почти прави.Тази разтегната конформация обяснява как E. cuniculi използва само 12 РНК бази, за да запълни празнината от 33 Å между H16 и H18 рРНК спиралите, докато други видове изискват поне два пъти повече рРНК бази, за да запълнят празнината.
По този начин можем да демонстрираме, че чрез енергийно неблагоприятно сгъване паразитните микроспоридии са разработили стратегия за свиване дори на тези сегменти на рРНК, които остават широко запазени сред видовете в трите области на живота.Очевидно, чрез натрупване на мутации, които трансформират рРНК спиралите в къси поли-U линкери, Е. cuniculi може да образува необичайни рРНК фрагменти, съдържащи възможно най-малко нуклеотиди за лигиране на дистални рРНК фрагменти.Това помага да се обясни как микроспоридията е постигнала драматично намаляване на основната си молекулярна структура, без да губи своята структурна и функционална цялост.
Друга необичайна характеристика на рРНК на E. cuniculi е появата на рРНК без удебеления (фиг. 4).Издутините са нуклеотиди без базови двойки, които се извиват от спиралата на РНК, вместо да се крият в нея.Повечето рРНК издатини действат като молекулярни адхезиви, помагайки за свързването на съседни рибозомни протеини или други рРНК фрагменти.Някои от издатините действат като панти, позволявайки на rRNA спиралата да се огъва и сгъва оптимално за продуктивен протеинов синтез 41 .
a Изпъкналост на рРНК (номерация на S. cerevisiae) липсва в структурата на рибозомата на E. cuniculi, но присъства в повечето други еукариоти b Е. coli, S. cerevisiae, H. sapiens и вътрешни рибозоми на E. cuniculi.паразитите нямат много от древните, силно запазени рРНК издутини.Тези удебеления стабилизират рибозомната структура;следователно тяхното отсъствие в микроспоридиите показва намалена стабилност на нагъването на рРНК в микроспоридиалните паразити.Сравнението с P стъбла (L7/L12 стъбла при бактерии) показва, че загубата на рРНК издатини понякога съвпада с появата на нови издутини до изгубените издутини.Спиралата H42 в 23S/28S rRNA има древна издутина (U1206 в Saccharomyces cerevisiae), която се оценява на възраст най-малко 3,5 милиарда години поради защитата си в три области на живота.При микроспория тази издутина се елиминира.Въпреки това, нова издутина се появи до изгубената издутина (A1306 в E. cuniculi).
Учудващо, ние открихме, че на рибозомите на E. cuniculi липсват повечето от рРНК издутини, открити при други видове, включително повече от 30 издутини, запазени в други еукариоти (фиг. 4а).Тази загуба елиминира много контакти между рибозомните субединици и съседните рРНК спирали, понякога създавайки големи кухи кухини в рибозомата, което прави рибозомата E. cuniculi по-порьозна в сравнение с по-традиционните рибозоми (фиг. 4b).Трябва да се отбележи, че открихме, че повечето от тези издутини също са изгубени в предварително идентифицираните рибозомни структури на V. necatrix и P. locustae, които са пренебрегнати от предишни структурни анализи 31, 32.
Понякога загубата на рРНК издатини е придружена от развитието на нови издатини до изгубената издатина.Например, рибозомното P-стъбло съдържа изпъкналост U1208 (в Saccharomyces cerevisiae), която е оцеляла от Е. coli до хората и следователно се оценява на 3,5 милиарда години.По време на протеиновия синтез тази издутина помага на стеблото на P да се движи между отворена и затворена конформации, така че рибозомата да може да набира транслационни фактори и да ги доставя до активното място.В рибозомите на E. cuniculi това удебеляване отсъства;обаче, ново удебеляване (G883), разположено само в три базови двойки, може да допринесе за възстановяването на оптималната гъвкавост на стеблото P (фиг. 4в).
Нашите данни за rRNA без издутини предполагат, че минимизирането на rRNA не се ограничава до загубата на rRNA елементи на повърхността на рибозомата, но може също да включва ядрото на рибозомата, създавайки специфичен за паразита молекулярен дефект, който не е описан в свободно живеещи клетки.се наблюдават живи видове.
След моделиране на канонични рибозомни протеини и рРНК, открихме, че конвенционалните рибозомни компоненти не могат да обяснят трите части на крио-ЕМ изображението.Два от тези фрагменти са с малки молекули по размер (фиг. 5, допълнителна фигура 8).Първият сегмент е притиснат между рибозомните протеини uL15 и eL18 в позиция, обикновено заета от С-края на eL18, който е скъсен в E. cuniculi.Въпреки че не можем да определим идентичността на тази молекула, размерът и формата на този остров на плътност се обясняват добре с наличието на спермидинови молекули.Свързването му с рибозомата се стабилизира от специфични за микроспоридиите мутации в протеините uL15 (Asp51 и Arg56), които изглежда увеличават афинитета на рибозомата към тази малка молекула, тъй като позволяват на uL15 да обвие малката молекула в рибозомна структура.Допълнителна фигура 2).8, допълнителни данни 1, 2).
Крио-ЕМ изображения, показващи наличието на нуклеотиди извън рибозата, свързана с рибозомата на E. cuniculi.В рибозомата на E. cuniculi този нуклеотид заема същото място като нуклеотида 25S rRNA A3186 (номерация на Saccharomyces cerevisiae) в повечето други еукариотни рибозоми.b В рибозомната структура на E. cuniculi този нуклеотид е разположен между рибозомните протеини uL9 и eL20, като по този начин стабилизира контакта между двата протеина.Анализ на запазване на последователността на cd eL20 сред видовете микроспоридия.Филогенетичното дърво на видовете Microsporidia (c) и множественото подравняване на последователностите на протеина eL20 (d) показват, че нуклеотид-свързващите остатъци F170 и K172 са запазени в повечето типични Microsporidia, с изключение на S. lophii, с изключение на ранните разклонени Microsporidia, които запазват разширението на ES39L rRNA.e Тази фигура показва, че нуклеотид-свързващите остатъци F170 и K172 присъстват само в eL20 на силно редуцирания геном на микроспоридиите, но не и в други еукариоти.Като цяло, тези данни предполагат, че рибозомите на Microsporidian са развили място за свързване на нуклеотиди, което изглежда свързва AMP молекули и ги използва за стабилизиране на протеин-протеинови взаимодействия в рибозомната структура.Високото запазване на това място на свързване в Microsporidia и липсата му в други еукариоти предполага, че това място може да осигури селективно предимство за оцеляване на Microsporidia.По този начин нуклеотид-свързващият джоб в рибозомата на микроспоридиите не изглежда като дегенерирана характеристика или крайна форма на разграждане на рРНК, както беше описано по-рано, а по-скоро полезна еволюционна иновация, която позволява на рибозомата на микроспоридиите да свързва директно малки молекули, използвайки ги като молекулярни градивни елементи.градивни елементи за рибозоми.Това откритие прави рибозомата на микроспоридията единствената рибозома, за която е известно, че използва един нуклеотид като свой структурен градивен елемент.f Хипотетичен еволюционен път, получен от нуклеотидно свързване.
Втората плътност с ниско молекулно тегло е разположена на интерфейса между рибозомните протеини uL9 и eL30 (фиг. 5а).Този интерфейс беше описан по-рано в структурата на рибозомата на Saccharomyces cerevisiae като място на свързване за 25S нуклеотида на rRNA A3186 (част от разширението на ES39L rRNA)38.Беше показано, че в дегенерирани P. locustae ES39L рибозоми, този интерфейс свързва неизвестен единичен нуклеотид 31 и се предполага, че този нуклеотид е редуцирана крайна форма на rRNA, в която дължината на rRNA е ~130-230 бази.ES39L се редуцира до единичен нуклеотид 32.43.Нашите крио-ЕМ изображения подкрепят идеята, че плътността може да се обясни с нуклеотиди.Въпреки това, по-високата разделителна способност на нашата структура показа, че този нуклеотид е екстрарибозомна молекула, вероятно AMP (фиг. 5a, b).
След това попитахме дали нуклеотидното свързващо място се появява в рибозомата на E. cuniculi или е съществувало преди това.Тъй като нуклеотидното свързване се медиира главно от остатъците Phe170 и Lys172 в рибозомния протеин eL30, ние оценихме запазването на тези остатъци в 4396 представителни еукариоти.Както в случая с uL15 по-горе, ние открихме, че остатъците Phe170 и Lys172 са силно запазени само в типични Microsporidia, но липсват в други еукариоти, включително атипични Microsporidia Mitosporidium и Amphiamblys, в които ES39L rRNA фрагментът не е редуциран 44, 45, 46 (фиг. 5c).-д).
Взети заедно, тези данни подкрепят идеята, че E. cuniculi и вероятно други канонични микроспоридии са развили способността за ефективно улавяне на голям брой малки метаболити в структурата на рибозомата, за да компенсират спада в рРНК и протеиновите нива.По този начин те са развили уникална способност да свързват нуклеотиди извън рибозомата, показвайки, че паразитните молекулярни структури компенсират чрез улавяне на изобилие от малки метаболити и използването им като структурни имитатори на разградени РНК и протеинови фрагменти..
Третата несимулирана част от нашата крио-ЕМ карта, намерена в голямата рибозомна субединица.Относително високата разделителна способност (2,6 Å) на нашата карта предполага, че тази плътност принадлежи на протеини с уникални комбинации от големи остатъци от странична верига, което ни позволи да идентифицираме тази плътност като неизвестен досега рибозомален протеин, който идентифицирахме като Беше наречен msL2 (микроспоридиален специфичен протеин L2) (методи, фигура 6).Нашето търсене на хомология показа, че msL2 се запазва в кладата на Microsporidia от рода Encephaliter и Orosporidium, но липсва в други видове, включително други Microsporidia.В рибозомната структура msL2 заема празнина, образувана от загубата на удължената ES31L rRNA.В тази празнота msL2 помага за стабилизиране на сгъването на rRNA и може да компенсира загубата на ES31L (Фигура 6).
Електронна плътност и модел на специфичния за Microsporidia рибозомен протеин msL2, открит в рибозомите на E. cuniculi.b Повечето еукариотни рибозоми, включително 80S рибозомата на Saccharomyces cerevisiae, имат ES19L рРНК амплификация, загубена в повечето видове Microsporidian.Установената по-рано структура на рибозомата на V. necatrix microsporidia предполага, че загубата на ES19L в тези паразити се компенсира от еволюцията на новия рибозомален протеин msL1.В това проучване открихме, че рибозомата на E. cuniculi също е развила допълнителен рибозомален РНК мимичен протеин като очевидна компенсация за загубата на ES19L.Въпреки това, msL2 (понастоящем анотиран като хипотетичен протеин ECU06_1135) и msL1 имат различен структурен и еволюционен произход.c Това откритие на генерирането на еволюционно несвързани msL1 и msL2 рибозомни протеини предполага, че ако рибозомите натрупват вредни мутации в тяхната rRNA, те могат да постигнат безпрецедентни нива на композиционно разнообразие дори в малка подгрупа от тясно свързани видове.Това откритие може да помогне за изясняване на произхода и еволюцията на митохондриалната рибозома, която е известна със своята силно намалена рРНК и необичайна вариабилност в протеиновия състав между видовете.
След това сравнихме протеина msL2 с описания по-рано протеин msL1, единственият известен рибозомален протеин, специфичен за микроспоридиите, открит в рибозомата на V. necatrix.Искахме да проверим дали msL1 и msL2 са еволюционно свързани.Нашият анализ показа, че msL1 и msL2 заемат една и съща кухина в рибозомната структура, но имат различни първични и третични структури, което показва техния независим еволюционен произход (фиг. 6).По този начин нашето откритие на msL2 предоставя доказателство, че групи от компактни еукариотни видове могат независимо да развият структурно различни рибозомни протеини, за да компенсират загубата на рРНК фрагменти.Това откритие е забележително с това, че повечето цитоплазмени еукариотни рибозоми съдържат инвариантен протеин, включително същото семейство от 81 рибозомни протеини.Появата на msL1 и msL2 в различни клонове на микроспоридия в отговор на загубата на разширени рРНК сегменти предполага, че деградацията на молекулярната архитектура на паразита кара паразитите да търсят компенсаторни мутации, което в крайна сметка може да доведе до тяхното придобиване в различни паразитни популации.структури.
Накрая, когато нашият модел беше завършен, сравнихме състава на рибозомата на E. cuniculi с този, предвиден от последователността на генома.Няколко рибозомни протеини, включително eL14, eL38, eL41 и eS30, преди това се смяташе, че липсват от генома на E. cuniculi поради очевидното отсъствие на техните хомолози от генома на E. cuniculi.Загубата на много рибозомни протеини също се предвижда в повечето други силно намалени вътреклетъчни паразити и ендосимбионти.Например, въпреки че повечето свободно живеещи бактерии съдържат едно и също семейство от 54 рибозомни протеини, само 11 от тези протеинови семейства имат откриваеми хомолози във всеки анализиран геном на бактерии с ограничен гостоприемник.В подкрепа на това схващане е експериментално наблюдавана загуба на рибозомни протеини във V. necatrix и P. locustae microsporidia, на които липсват протеините eL38 и eL4131,32.
Нашите структури обаче показват, че само eL38, eL41 и eS30 всъщност се губят в рибозомата на E. cuniculi.Протеинът eL14 беше запазен и нашата структура показа защо този протеин не може да бъде намерен при търсенето на хомология (фиг. 7).В рибозомите на E. cuniculi по-голямата част от мястото на свързване на eL14 се губи поради разграждане на рРНК-амплифицирания ES39L.В отсъствието на ES39L, eL14 губи по-голямата част от своята вторична структура и само 18% от последователността на eL14 е идентична в E. cuniculi и S. cerevisiae.Това лошо запазване на последователността е забележително, защото дори Saccharomyces cerevisiae и Homo sapiens - организми, еволюирали на 1,5 милиарда години един от друг - споделят повече от 51% от същите остатъци в eL14.Тази аномална загуба на консервация обяснява защо E. cuniculi eL14 в момента е анотиран като предполагаемия протеин M970_061160, а не като рибозомния протеин eL1427.
и Рибозомата на Microsporidia загуби разширението на ES39L rRNA, което частично елиминира мястото на свързване на рибозомния протеин eL14.В отсъствието на ES39L, протеинът на микроспорите eL14 претърпява загуба на вторична структура, при която бившата рРНК-свързваща α-спирала се дегенерира в бримка с минимална дължина.b Подравняването на множество последователности показва, че протеинът eL14 е силно консервативен в еукариотни видове (57% идентичност на последователността между дрожди и човешки хомолози), но слабо запазен и различен в микроспоридии (в които не повече от 24% от остатъците са идентични с eL14 хомолога).от S. cerevisiae или H. sapiens).Това лошо запазване на последователността и вариабилност на вторичната структура обяснява защо eL14 хомологът никога не е бил открит в E. cuniculi и защо се смята, че този протеин е изгубен в E. cuniculi.За разлика от това, E. cuniculi eL14 преди това беше анотиран като предполагаем протеин M970_061160.Това наблюдение предполага, че геномното разнообразие на микроспоридиите в момента е надценено: някои гени, които понастоящем се смятат за изгубени в микроспоридиите, всъщност са запазени, макар и в силно диференцирани форми;вместо това се смята, че някои кодират гени на микроспоридия за специфични за червеи протеини (напр. хипотетичният протеин M970_061160) всъщност кодират много разнообразни протеини, открити в други еукариоти.
Това откритие предполага, че денатурацията на рРНК може да доведе до драматична загуба на запазване на последователността в съседни рибозомни протеини, което прави тези протеини неоткриваеми за търсене на хомология.По този начин можем да надценим действителната степен на молекулярно разграждане в организми с малък геном, тъй като някои протеини, за които се смята, че са изгубени, всъщност продължават да съществуват, макар и в силно променени форми.
Как могат паразитите да запазят функцията на своите молекулярни машини при условия на екстремно намаляване на генома?Нашето изследване отговаря на този въпрос, като описва сложната молекулярна структура (рибозома) на E. cuniculi, организъм с един от най-малките еукариотни геноми.
От почти две десетилетия е известно, че протеиновите и РНК молекулите в микробните паразити често се различават от техните хомоложни молекули в свободно живеещите видове, защото им липсват центрове за контрол на качеството, намалени са до 50% от техния размер в свободно живеещите микроби и т.н.много инвалидизиращи мутации, които нарушават сгъването и функционирането.Например, рибозомите на малки геномни организми, включително много вътреклетъчни паразити и ендосимбионти, се очаква да нямат няколко рибозомни протеини и до една трета от rRNA нуклеотиди в сравнение със свободно живеещите видове 27, 29, 30, 49. Въпреки това, начинът, по който тези молекули функционират в паразита, остава до голяма степен мистерия, изследвана главно чрез сравнителна геномика.
Нашето проучване показва, че структурата на макромолекулите може да разкрие много аспекти на еволюцията, които са трудни за извличане от традиционните сравнителни геномни изследвания на вътреклетъчни паразити и други организми с ограничен гостоприемник (допълнителна фигура 7).Например, примерът с протеина eL14 показва, че можем да надценим действителната степен на разграждане на молекулярния апарат при паразитните видове.Сега се смята, че енцефалитните паразити имат стотици гени, специфични за микроспоридиите.Нашите резултати обаче показват, че някои от тези привидно специфични гени всъщност са просто много различни варианти на гени, които са често срещани в други еукариоти.Освен това примерът с протеина msL2 показва как пренебрегваме новите рибозомни протеини и подценяваме съдържанието на паразитни молекулярни машини.Примерът с малките молекули показва как можем да пренебрегнем най-гениалните иновации в паразитните молекулярни структури, които могат да им дадат нова биологична активност.
Взети заедно, тези резултати подобряват разбирането ни за разликите между молекулярните структури на организми с ограничен гостоприемник и техните двойници в свободно живеещи организми.Ние показваме, че молекулярните машини, за които дълго време се смяташе, че са редуцирани, дегенерирали и подложени на различни инвалидизиращи мутации, вместо това имат набор от систематично пренебрегвани необичайни структурни характеристики.
От друга страна, не-обемистите рРНК фрагменти и слетите фрагменти, които открихме в рибозомите на E. cuniculi предполагат, че намаляването на генома може да промени дори онези части от основната молекулярна машина, които са запазени в трите области на живота – след почти 3,5 милиарда години.независима еволюция на видовете.
Свободните от изпъкналост и слети рРНК фрагменти в рибозомите на E. cuniculi са от особен интерес в светлината на предишни изследвания на РНК молекули в ендосимбиотични бактерии.Например, в ендосимбионта на листната въшка Buchnera aphidicola, рРНК и тРНК молекулите са показали, че имат чувствителни към температурата структури, дължащи се на отклонение на състава на A+T и висок дял на неканонични базови двойки 20, 50.Тези промени в РНК, както и промените в протеиновите молекули, сега се смятат за отговорни за свръхзависимостта на ендосимбионтите от партньорите и неспособността на ендосимбионтите да пренасят топлина 21, 23.Въпреки че рРНК на паразитната микроспоридия има структурно различни промени, естеството на тези промени предполага, че намалената термична стабилност и по-високата зависимост от шапероновите протеини могат да бъдат общи характеристики на РНК молекулите в организми с намалени геноми.
От друга страна, нашите структури показват, че паразитните микроспоридии са развили уникална способност да се противопоставят на широко запазени рРНК и протеинови фрагменти, развивайки способността да използват изобилни и лесно достъпни малки метаболити като структурни имитатори на дегенерирана рРНК и протеинови фрагменти.Деградация на молекулярната структура..Това мнение се подкрепя от факта, че малки молекули, които компенсират загубата на протеинови фрагменти в рРНК и рибозомите на E. cuniculi, се свързват със специфични за микроспоридиите остатъци в протеините uL15 и eL30.Това предполага, че свързването на малки молекули с рибозоми може да бъде продукт на положителна селекция, при която специфичните за Microsporidia мутации в рибозомните протеини са избрани заради тяхната способност да увеличат афинитета на рибозомите към малки молекули, което може да доведе до по-ефективни рибозомни организми.Откритието разкрива интелигентна иновация в молекулярната структура на микробните паразити и ни дава по-добро разбиране за това как молекулярните структури на паразитите поддържат своята функция въпреки редуктивната еволюция.
Понастоящем идентификацията на тези малки молекули остава неясна.Не е ясно защо появата на тези малки молекули в рибозомната структура се различава между видовете микроспоридия.По-специално, не е ясно защо нуклеотидно свързване се наблюдава в рибозомите на E. cuniculi и P. locustae, а не в рибозомите на V. necatrix, въпреки наличието на F170 остатък в протеините eL20 и K172 на V. necatrix.Тази делеция може да бъде причинена от остатък 43 uL6 (намиращ се в съседство с джоба за свързване на нуклеотид), който е тирозин във V. necatrix, а не треонин в E. cuniculi и P. locustae.Обемната ароматна странична верига на Tyr43 може да попречи на нуклеотидното свързване поради пространствено припокриване.Алтернативно, очевидното заличаване на нуклеотиди може да се дължи на ниската разделителна способност на крио-ЕМ изображения, което възпрепятства моделирането на V. necatrix рибозомни фрагменти.
От друга страна, нашата работа предполага, че процесът на разпадане на генома може да бъде изобретателска сила.По-специално, структурата на рибозомата на E. cuniculi предполага, че загубата на рРНК и протеинови фрагменти в рибозомата на микроспоридията създава еволюционен натиск, който насърчава промени в структурата на рибозомата.Тези варианти се появяват далеч от активното място на рибозомата и изглежда помагат за поддържане (или възстановяване) на оптимално сглобяване на рибозома, което иначе би било нарушено от намалена рРНК.Това предполага, че голяма иновация на рибозомата на микроспоридиите изглежда се е превърнала в необходимост от буфериране на дрейфа на гените.
Може би това е най-добре илюстрирано чрез нуклеотидно свързване, което досега не е наблюдавано в други организми.Фактът, че нуклеотид-свързващите остатъци присъстват в типичните микроспоридии, но не и в други еукариоти, предполага, че нуклеотид-свързващите места не са просто реликви, чакащи да изчезнат, или крайното място за рРНК, което трябва да бъде възстановено до формата на отделни нуклеотиди.Вместо това този сайт изглежда като полезна функция, която би могла да се развие в продължение на няколко кръга на положителна селекция.Местата за свързване на нуклеотиди може да са страничен продукт на естествения подбор: след като ES39L се разгради, микроспоридиите са принудени да търсят компенсация за възстановяване на оптималната рибозомна биогенеза в отсъствието на ES39L.Тъй като този нуклеотид може да имитира молекулярните контакти на нуклеотида A3186 в ES39L, нуклеотидната молекула се превръща в градивен елемент на рибозомата, чието свързване е допълнително подобрено чрез мутация на последователността eL30.
По отношение на молекулярната еволюция на вътреклетъчните паразити, нашето изследване показва, че силите на дарвиновия естествен подбор и генетичния дрейф на разпадането на генома не действат паралелно, а осцилират.Първо, генетичният дрейф елиминира важни характеристики на биомолекулите, което прави компенсацията изключително необходима.Само когато паразитите задоволят тази нужда чрез дарвиновия естествен подбор, техните макромолекули ще имат шанс да развият своите най-впечатляващи и иновативни черти.Важно е, че еволюцията на местата за свързване на нуклеотиди в рибозомата на E. cuniculi предполага, че този модел на молекулярна еволюция от загуба към печалба не само амортизира вредните мутации, но понякога придава напълно нови функции на паразитните макромолекули.
Тази идея е в съответствие с теорията за подвижното равновесие на Сюел Райт, която гласи, че строгата система на естествен подбор ограничава способността на организмите да правят иновации51,52,53.Въпреки това, ако генетичният дрейф наруши естествения подбор, тези дрейфи могат да доведат до промени, които сами по себе си не са адаптивни (или дори вредни), но водят до допълнителни промени, които осигуряват по-висока годност или нова биологична активност.Нашата рамка подкрепя тази идея, като илюстрира, че същият тип мутация, която намалява гънката и функцията на биомолекула, изглежда е основният стимул за нейното подобрение.В съответствие с печелившия еволюционен модел, нашето проучване показва, че разпадането на генома, традиционно разглеждано като дегенеративен процес, също е основен двигател на иновациите, понякога и може би дори често позволявайки на макромолекулите да придобият нови паразитни дейности.може да ги използва.