Придобиването и разпределението на хранителни вещества интегрира характеристиките на търсенето на храна от насекомите и жизнения цикъл. За да компенсират недостига на специфични хранителни вещества в различните етапи от живота, насекомите могат да ги получат чрез допълнително хранене, например чрез хранене със секрети на гръбначни животни в процес, известен като локви. Комарът Anopheles arabiani изглежда е недохранен и следователно се нуждае от хранителни вещества както за метаболизъм, така и за размножаване. Целта на това проучване беше да се оцени дали разбъркването на An. arabiensis върху кравешка урина за придобиване на хранителни вещества подобрява характеристиките на жизнения цикъл.
Уверете се, че е безопасно. arabiensis е бил привлечен от миризмата на прясна, 24-часова, 72-часова и 168-часова кравешка урина, а женските, търсещи гостоприемник и хранени с кръв (48 часа след хранене с кръв), са били измерени в Y-образен олфактометър, а бременните женски са били оценени за тест за хвърляне на хайвера. След това е използван комбиниран химичен и електрофизиологичен анализ за идентифициране на биоактивни съединения в кравешката урина във всичките четири възрастови групи. Синтетични смеси от биоактивни съединения са били оценени в Y-образни и полеви опити. За да се изследва кравешката урина и нейното основно азотсъдържащо съединение урея като потенциални допълнителни диети за маларийни вектори, са били измерени параметрите на хранене и характеристиките на жизнения цикъл. Оценени са делът на женските комари и количеството абсорбирана кравешка урина и урея. След хранене женските са били оценени за оцеляване, вързан полет и размножаване.
Търсят кръвта и храната на гостоприемника. В лабораторни и полеви изследвания арабите са били привлечени от естествения и синтетичен аромат на прясна и отлежала кравешка урина. Бременните женски са били безразлични към реакциите на кравешката урина в местата за хвърляне на хайвера. Женските, търсещи гостоприемник и кръвосмучещи, активно абсорбират кравешка урина и урея и разпределят тези ресурси според компромисите в жизнения цикъл като функция на физиологичното състояние за полет, оцеляване или размножаване.
Придобиване и разпространение на кравешка урина от Anopheles arabinis за подобрени характеристики на жизнения цикъл. Допълнителното хранене с кравешка урина влияе пряко върху капацитета на векторите чрез увеличаване на дневната преживяемост и плътността на векторите, и косвено чрез промяна на летателната активност и следователно трябва да се вземе предвид в бъдещи модели.
Придобиването и разпределението на хранителни вещества интегрира характеристиките на търсенето на храна от насекомите и жизнения цикъл [1,2,3]. Насекомите са способни да избират и придобиват храна и да извършват компенсаторно хранене въз основа на наличността на храна и нуждите от хранителни вещества [1, 3]. Разпределението на хранителните вещества зависи от жизнения цикъл и може да доведе до различни изисквания за качество и количество на диетата в различните жизнени етапи на насекомите [1, 2]. За да компенсират недостига на специфични хранителни вещества, насекомите могат да ги получат чрез допълнително хранене, например с кал, различни екскременти и секрети на гръбначни животни и мърша, процес, известен като локви [2]. Въпреки че са описани предимно различни видове пеперуди и молци, водопои се срещат и в други разреди насекоми, а привличането и храненето с тези видове ресурси може да има значително въздействие върху здравето и други характеристики на жизнения цикъл [2, 4, 5, 6],7]. Маларийният комар Anopheles gambiae sensu lato (sl) се появява като „недохранен“ възрастен [8], така че поливането може да играе важна роля в характеристиките на жизнения му цикъл, но това поведение досега е било пренебрегвано. Използването на възбуда като средство за увеличаване на приема на хранителни вещества в този важен фактор заслужава внимание, тъй като може да има важни епидемиологични последици.
Приемът на азот при възрастни женски комари Anopheles е ограничен поради ниските калорийни резерви, носени от ларвния стадий, и неефективното използване на кръвното брашно [9]. Женските Ann.gambiae sl обикновено компенсират това чрез допълване с допълнителни кръвни хранения [10, 11], като по този начин излагат повече хора на риск от заразяване с болестта и комарите на по-голям риск от хищничество. Алтернативно, комарите могат да използват допълнително хранене с екскременти на гръбначни, за да придобият азотни съединения, които подобряват адаптацията и маневреността на полета, както е демонстрирано от други насекоми [2]. В тази връзка, силното и отчетливо привличане на един от видовете-братя в рамките на гамбийския видов комплекс Anopheles arabinis, прясна и отлежала кравешка урина [12,13,14], е интересно. Anopheles arabinis е опортюнистичен в предпочитанията си за гостоприемник и е известно, че се свързва и се храни с говеда. Кравешката урина е ресурс, богат на азотни съединения, като уреята представлява 50-95% от общия азот в прясната урина [15, 16]. С напредване на възрастта на кравешката урина, Микроорганизмите използват тези ресурси, за да намалят сложността на азотните съединения в рамките на 24 часа [15]. С бързото увеличаване на амоняка, свързано с намаляване на органичния азот, алкалофилните микроорганизми (много от които произвеждат съединения, токсични за комарите) процъфтяват [15], което може да се дължи на факта, че женските Ann.arabiensis са преференциално привлечени от урина на възраст 24 часа или по-малко [13, 14].
В това проучване са търсени гостоприемници и хранени с кръв An. По време на първия си цикъл на гонадотропин, arabiensis е оценен за усвояване на азотни съединения, включително урея, чрез смесване на урина. След това е проведена серия от експерименти, за да се оцени как женските комари разпределят този потенциален хранителен ресурс за подобрено оцеляване, размножаване и по-нататъшно търсене на храна. Накрая е оценена миризмата на прясна и отлежала кравешка урина, за да се определи дали те предоставят надеждни улики за гостоприемник и хранени с кръв An. В търсене на този потенциален хранителен ресурс, arabiensis открива химични корелации зад наблюдаваната различна привлекателност. Синтетични смеси от миризми на летливи органични съединения (ЛОС), идентифицирани в 24-часова отлежала урина, са допълнително оценени в полеви условия, разширявайки резултатите, получени в лабораторни условия, и демонстрирайки ефекта на миризмата на говежда урина върху различни физиологични състояния. Привличане на комари. Получените резултати потвърждават, че An. arabiensis усвоява и разпределя азотни съединения, открити в урината на гръбначните, за да повлияе на характеристиките на жизнения цикъл. Тези резултати са обсъдени в контекста на потенциалните епидемиологични последици и как те могат да бъдат използвани за наблюдение и контрол на векторите.
Anopheles arabicans (щам Dongola) са били поддържани при 25 ± 2 °C, 65 ± 5% относителна влажност и цикъл светлина:тъмнина 12:12 часа. Ларвите са били отглеждани в пластмасови тарелки (20 cm × 18 cm × 7 cm), пълни с дестилирана вода и хранени с храна за риби Tetramin® (Tetra Werke, Melle, DE). Какавидите са били събирани в 30 ml чашки (Nolato Hertila, Åstorp, SE) и след това прехвърляни в клетки Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan), за да се позволи появата на възрастни индивиди. Възрастните са били снабдявани с 10% разтвор на захароза ad libitum до 4 дни след поникването (dpe), като в този момент на женските, търсещи гостоприемник, е била предлагана диета непосредствено преди експеримента или са били оставени да гладуват за една нощ с дестилирана вода преди експеримента, както е описано по-долу. Женските, използвани за експерименти с летателни тръби, са били оставени да гладуват само 4-6 дни. часа с вода ad libitum. За да се подготвят кръвосмучещи комари за последващи биологични анализи, на 4 женски комари dpe е дадена дефиброзна овча кръв (Håtunalab, Bro, SE), използвайки мембранна система за хранене (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK). Напълно претоварените женски след това са прехвърлени в индивидуални клетки и са им осигурена директна диета, както е описано по-долу, или 10% захароза ad libitum в продължение на 3 дни преди описаните по-долу експерименти. Последните женски са използвани за биологични анализи в епруветки за полет и са прехвърлени в лабораторията, след което са получавали дестилирана вода ad libitum в продължение на 4-6 часа преди експеримента.
За количествено определяне на консумацията на урина и урея при възрастни женски от породата An.Arab бяха използвани хранителни анализи. Женските, търсещи гостоприемник и хранени с кръв, получиха диета, съдържаща 1% разредена прясна и отлежала кравешка урина, различни концентрации на урея и две контроли (10% захароза и вода) в продължение на 48 часа. Освен това към диетата беше добавен хранителен оцветител (1 mg ml-1 ксилен цианид FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Стокхолм, Швеция) и се доставяше в матрица 4 × 4 в микроцентрифужни епруветки от 250 µl (Axygen Scientific, Union City, CA, US; Фигура 1A). Напълнете до ръба (~300 µl). За да се избегне конкуренцията между комарите и потенциалните ефекти на оцветителя, поставете 10 комара в голяма петриева паничка (12 cm в диаметър и 6 cm височина; Semadeni, Ostermundigen, CH; Фигура 1A) в пълен мрак при 25 ± 2 cm °C и 65 ± 5% относителна влажност. Тези експерименти... бяха повторени 5 до 10 пъти. След излагане на диета, комарите бяха поставени при -20°C до по-нататъшен анализ.
Търсете говежда урина и урея, абсорбирани от гостоприемника и кръвосмучещата женска Anopheles arabianus. В опит с хранене (A), женските комари са били хранени с диета, състояща се от прясна и отлежала кравешка урина, различни концентрации на урея, захароза (10%) и дестилирана вода (H2O). Женските, търсещи гостоприемник (B) и хранени с кръв (C), са абсорбирали повече захароза от всяка друга тествана диета. Обърнете внимание, че женските, търсещи гостоприемник, са абсорбирали 72-часова кравешка урина по-малко от 168-часова кравешка урина (B). Средното общо съдържание на азот (± стандартно отклонение) в урината е представено на вложката. Женските, търсещи гостоприемник (D, F) и кръвосмучещи (E, G), поемат урея по дозозависим начин. Средните инхалирани обеми (D, E) с различни буквени имена се различават значително един от друг (еднофакторен ANOVA, използващ post hoc анализ на Tukey; p < 0,05). Грешките представляват стандартна грешка на средната стойност (BE). Правата пунктирана линия представлява логаритмично-линейната регресионна линия (F, G).
За да се освободи абсорбираната храна, комарите бяха поставени поотделно в 1,5 ml микроцентрифужни епруветки, съдържащи 230 µl дестилирана вода, и тъканта беше разрушена с помощта на пестик за еднократна употреба и безжичен мотор (VWR International, Lund, SE), последвано от центрофугиране при 10 krpm за 10 минути. Супернатантът (200 µl) беше прехвърлен в 96-ямкова микроплака (Sigma-Aldrich) и абсорбцията (λ620) беше определена с помощта на спектрофотометърен четец за микроплаки (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm. Алтернативно, комарите бяха смлени в 1 ml дестилирана вода, 900 µl от която бяха прехвърлени в кювета за спектрофотометричен анализ (λ620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). За количествено определяне на приема с храната беше изготвена стандартна крива чрез серийно разреждане, за да се получат от 0,2 µl до 2,4 µl 1 mg ml-1 ксилен. цианид. След това оптичната плътност на известни концентрации на багрило е използвана за определяне на количеството храна, погълнато от всеки комар.
Данните за обема бяха анализирани с помощта на еднофакторен дисперсионен анализ (ANOVA), последван от post hoc двойни сравнения на Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, US, 1989–2007). Линейните регресионни анализи описаха зависимия от концентрацията прием на урея и сравниха отговорите между търсещи гостоприемник и кръвосмучещи комари (GraphPad Prism v8.0.0 за Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, US).
Приблизително 20 µl проби от урина от всяка възрастова група бяха свързани с Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) и капсулирани в калаени капсули (8 mm × 5 mm). Капсулите бяха поставени в горивната камера на CHNS/O анализатор (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, US), за да се определи съдържанието на азот в прясна и отлежала урина съгласно протокола на производителя. Общият азот (g N l-1) беше количествено определен въз основа на известни концентрации на урея, използвани като стандарт.
За да се оцени ефектът от диетата върху оцеляването на женските, търсещи гостоприемник и кръвосмучещи, комарите бяха поставени поотделно в големи петриеви панички (12 см в диаметър и 6 см височина; Semadeni) с отвор в капака, покрит с мрежа (3 см в диаметър), с вентилация и снабдяване с храна. Диетите бяха осигурени директно след 4 дни след отваряне и включваха 1% разредена прясна и отлежала кравешка урина, четири концентрации на урея и две контроли, 10% захароза и вода. Всяка диета беше пипетирана върху зъбен тампон (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE), поставен в 5 ml спринцовка (Thermo Fisher Scientific, Gothenburg, SE), буталото беше отстранено и поставено върху петриева паничка (фигура 1).1A). Сменяйте диетата си всеки ден. Поддържайте лабораторията, както е описано по-горе. Оцелелите комари бяха преброявани два пъти дневно, докато мъртвите комари бяха изхвърляни, докато последният комар не умре (n = 40 на третиране). Оцеляването на комарите, хранени с различни диети, беше анализирано статистически с помощта на криви на оцеляване на Kaplan-Meyer и log-rank тестове. да се сравнят разпределението на преживяемостта между диетите (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Летяща мелница за комари по поръчка, базирана на Attisano et al.[17], изработена от 5 мм дебели прозрачни акрилни панели (10 см ширина x 10 см дължина x 10 см височина) без преден и заден панел (фиг. 3: горе). Шарнирен възел с вертикална тръба, изработена от колона за газова хроматография (0,25 мм вътрешен диаметър; 7,5 см дължина) с краища, залепени за игла за насекоми, окачена между чифт неодимови магнити, разположени на 9 см един от друг. Хоризонтална тръба, изработена от същия материал (6,5 см дължина), разделя вертикалната тръба, за да образува привързано рамо и рамо, носещо малко парче алуминиево фолио като сигнал за прекъсване на светлината.
На женски комари, гладуващи 24 часа, е дадена гореспоменатата диета в продължение на 30 минути преди фиксиране. Напълно нахранените женски комари след това са анестезирани индивидуално върху лед за 2-3 минути и са прикрепени към карфици за насекоми с пчелен восък (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) и след това са завързани за рамената на хоризонталните тръби. Летяща мелница. Оборотите на полет са записани от специално създаден за записване на данни, след което са съхранени и показани с помощта на софтуера PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Летящата мелница е поставена в климатизирано помещение (12 часа:12 часа, светло:тъмно, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% относителна влажност).
За да се визуализира моделът на летателната активност, общото прелитано разстояние (м) и общият брой последователни летателни дейности бяха изчислени на час за период от 24 часа. Освен това, средните прелитани разстояния от отделните женски екземпляри бяха сравнени между различните лечения и анализирани с помощта на еднофакторен ANOVA и post hoc анализ на Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), където средното разстояние се счита за зависима променлива, докато лечението е независим фактор. Освен това, средният брой кръгове се изчислява на 10-минутни стъпки.
За да се оцени ефектът от диетата върху репродуктивните показатели на An.arabiensis, шест женски (4 dpe) бяха прехвърлени директно в клетки Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) след вземане на кръв и след това им беше осигурена експерименталната диета за 48 часа, както е описано по-горе. След това диетите бяха отстранени и на третия ден бяха осигурени чашки за хвърляне на хайвера (30 ml; Nolato Hertila), напълнени с 20 ml дестилирана вода, за 48 часа, като се сменяха на всеки 24 часа. Всеки диетичен режим се повтаря 20-50 пъти. Яйцата бяха преброени и записани за всяка експериментална клетка. Подпроби от яйца бяха използвани за оценка на средния размер и вариациите в дължината на отделните яйца (n ≥ 200 на диета), използвайки микроскоп Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE), оборудван с камера Leica (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., Германия). Останалите яйца бяха държани в климатизирано помещение при стандартни условия на отглеждане в продължение на 24 часа и беше измерена подпроба от наскоро появили се ларви от първи стадий (n ≥ 200 на диета), както е описано по-горе. Броят на яйцата и размерът на яйцата и ларвите бяха сравнени между третиранията, като беше използван еднофакторен ANOVA и post hoc анализ на Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Летливи вещества в хедспара от прясна (1 час след вземане на пробата), 24 часа, 72 часа и 168 часа отлежала урина са събрани от проби, събрани от говеда от породата Зебу и Арси. За удобство пробите от урина са събрани рано сутрин, докато кравите все още са в обора. Пробите от урина са събрани от 10 индивида и 100-200 ml от всяка проба са прехвърлени в индивидуални полиамидни торбички за печене (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, DE) в 3-литрови полиамидни торбички с капак във винилхлоридни пластмасови варели. Летливите вещества в хедспара от всяка проба от говежда урина са събрани или директно (прясна), или след отлежаване при стайна температура в продължение на 24 часа, 72 часа и 168 часа, т.е. всяка проба от урина е представителна за всяка възрастова група.
За събиране на летливи вещества в горната част на абсорбционната фаза (headspace) е използвана система със затворен контур за циркулация на газов поток, филтриран с активен въглен (100 ml min-1), през полиамидна торба към адсорбционната колона в продължение на 2,5 часа, като се използва диафрагмена вакуумна помпа (KNF Neuberger, Freiburg, DE). Като контрола, събирането в горната част на фазата е извършено от празна полиамидна торба. Адсорбционната колона е изработена от тефлонова тръба (5,5 cm x 3 mm вътрешен диаметър), съдържаща 35 mg Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, US) между запушалки от стъклена вата. Преди употреба колоната е промита с 1 ml редестилиран n-хексан (Merck, Darmstadt, DE) и 1 ml пентан (99,0% чист разтворител, GC grade, Sigma Aldrich). Адсорбираните летливи вещества са елуирани с 400 μl пентан. Събраните вещества в горната част на фазата са обединени и след това съхранявани при -20°C, докато се използват за по-нататъшен анализ.
Поведенчески реакции на търсещи гостоприемник и хранещи се с кръв An. Летливи екстракти от Headspace, събрани от прясна, 24-часова, 72-часова и 168-часова урина, бяха анализирани за летливи екстракти от комари Arabidopsis с помощта на олфактометър с права стъклена тръба [18]. Експериментите бяха проведени по време на ZT 13-15, пиковия период на активността на An в търсене на дом. Arab [19]. Олфактометър със стъклена тръба (80 cm × 9,5 cm вътрешен диаметър) беше осветен с 3 ± 1 lx червена светлина отгоре. Филтриран с въглен и овлажнен въздушен поток (25 ± 2 °C, 65 ± 2% относителна влажност) премина биоанализа със скорост 30 cm s-1. Въздухът се прекарва през серия от мрежести сита от неръждаема стомана, създавайки ламинарен поток и равномерна структура на шлейфа. Диспенсър за зъбни тампони (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), окачен на 5 cm серпентина на наветрения край на олфактометър, със смяна на стимулатора на всеки 5 минути. За анализ, 10 μl от всеки екстракт от пространството над водата, разреден 1:10, беше използван като стимул. Равно количество пентан беше използвано като контрола. Индивидуални комари, търсещи гостоприемник или кръвосмучещи комари, бяха поставени в индивидуални клетки за освобождаване 2-3 часа преди началото на експеримента. Клетката за освобождаване беше поставена от страната на олфактометъра, насочена към вятъра, и комарите бяха оставени да се аклиматизират за 1 минута, след което дроселната клапа на клетката беше отворена за освобождаване. Привличането към третиране или контрола беше анализирано като делът на комарите, които влязоха в контакт с източника в рамките на 5 минути след освобождаването. Всеки летлив екстракт от пространството над водата и контролата бяха репликирани поне 30 пъти и за да се избегнат ефектите на който и да е ден, един и същ брой третирания и контроли бяха тествани на всеки експериментален ден. Отговорите на търсене от гостоприемник и хранени с кръв Ans. Арабски спрямо headspace комплекти бяха анализирани с помощта на номинална логистична регресия, последвана от двойни сравнения за коефициенти на нечетност (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Реакция на хвърляне на хайвера на An. Екстракти от фазово пространство (headspace) от прясна и отлежала кравешка урина бяха анализирани в клетки Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Пластмасови чашки (30 mL; Nolato Hertila), напълнени с 20 mL дестилирана вода, осигуриха субстрата за хвърляне на хайвера и бяха поставени в противоположните ъгли на клетката, на разстояние 24 cm една от друга. Чашките за третиране бяха регулирани с 10 μl от всеки екстракт от фазово пространство при разреждане 1:10. За регулиране на контролната чашка беше използвано равно количество пентан. Чашките за третиране и контролните чашки бяха разменяни между всеки експеримент, за да се контролират ефектите от позицията. Десет женски, хранени с кръв, бяха пуснати в експериментални клетки на ZT 9-11 и яйцата в чашките бяха преброени 24 часа по-късно. Формулата за изчисляване на индекса на хвърляне на хайвера е: (броят на яйцата, снесени в чашката за третиране – броят на яйцата, снесени в контролната чашка)/(общият брой снесени яйца). Всяко третиране беше повторено 8 пъти.
Газово-хроматографски анализ и анализ с детекция на електронна антенна диаграма (GC-EAD) на женски An.arabiensis беше извършен както е описано по-рано [20]. Накратко, пресни летливи екстракти от парното пространство бяха разделени с помощта на Agilent Technologies 6890 GC (Санта Клара, Калифорния, САЩ), оборудван с HP-5 колона (30 m × 0.25 mm вътрешен диаметър, дебелина на филма 0.25 μm, Agilent Technologies). и стареене на урината. Водородът е използван като мобилна фаза със среден линеен дебит от 45 cm s-1. Всяка проба (2 μl) е инжектирана за 30 секунди в режим без разделяне с входна температура от 225 °C. Температурата на GC пещта е програмирана от 35 °C (3 минути задържане) до 300 °C (10 минути задържане) при 10 °C min-1. В разделителя на отпадъчния поток от GC е добавен 4 psi азот и е разделен 1:1 в Gerstel 3D/2 нисък мъртъв обем (Gerstel, Mülheim, DE) между пламъчно-йонизационния детектор и EAD. Капилярата на отпадъчния поток от GC за EAD е прекарана през Gerstel ODP-2 трансферна линия, която следи температурата на GC пещта плюс 5 °C, в стъклена тръба (10 cm × 8 mm), където е смесена с въглеродно филтриран, овлажнен въздух (1,5 l min-1). Антената е поставена на 0,5 cm от изхода на тръбата. Всеки отделен комар представляваше едно повторение, а за комарите, търсещи гостоприемник, бяха извършени поне три повторения върху проби от урина от всяка възраст.
Идентифициране на биоактивни съединения в колекции от прясна и отлежала говежда урина в хедспайс колекции, използващи комбиниран газов хроматограф и масспектрометър (GC-MS; 6890 GC и 5975 MS; Agilent Technologies), за да се предизвикат антенни отговори при GC-EAD анализ, работещ в режим на йонизация с електронен удар при 70 eV. GC е оборудван с капилярна колона от силициев диоксид с покритие HP-5MS UI (вътрешен диаметър 60 m × 0,25 mm, дебелина на филма 0,25 μm), използваща хелий като мобилна фаза със среден линеен дебит от 35 cm s-1. 2 μl проба е инжектирана, използвайки същите настройки на инжектора и температура на пещта, както за GC-EAD анализа. Съединенията са идентифицирани въз основа на тяхното време на задържане (индекс на Коват) и масспектри в сравнение с персонализираната библиотека и библиотеката NIST14 (Agilent). Идентифицираните съединения са потвърдени чрез инжектиране на автентични стандарти (Допълнителен файл 1: Таблица S2). За количествено определяне е използван хептил ацетат (10 ng, 99,8% химическа чистота, Aldrich) беше инжектиран като външен стандарт.
Оценка на ефикасността на синтетична смес от миризми, състояща се от биоактивни съединения, идентифицирани в прясна и отлежала урина Ans.arabiensis, за привличане на търсещи гостоприемник и кръвосмучещи Ans.arabiensis, като се използва същият олфактометър и протокол, както по-горе. Синтетичните смеси имитираха състава и пропорциите на съединенията в смесени летливи екстракти от прясна, 24-часова, 48-часова, 72-часова и 168-часова отлежала урина (Фигура 5D-G; Допълнителен файл 1: Таблица S2). За анализ се използват 10 μl разреждане 1:100 на напълно синтетичната смес, с обща скорост на освобождаване, варираща от приблизително 140-2400 ng h-1, за оценка на привлекателността за гостоприемника и кръвосмучещите комари. След това тестът се провежда върху пълни смеси, при които се отстраняват субтрактивни смеси от единични съединения от пълната смес. Търсещите отговори от гостоприемника и хранените с кръв Ans. Arab спрямо синтетични и субтрактивни смеси бяха анализирани с помощта на номинална логистична регресия, последвана от двойни сравнения за коефициенти на нечетност (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
За да се оцени дали кравешката урина може да служи като сигнал за местообитание на гостоприемник за маларийни комари, прясна и отлежала кравешка урина, събрана както е описано по-горе, и вода бяха поставени в мрежести кофи от 3 литра (100 мл) и поставени в капани за стръв за гостоприемник. (BG-HDT версия; BioGents, Регенсбург, Германия). Десет капана бяха поставени на 50 м един от друг в пасище, ​​на 400 м от селската общност (Силай, Етиопия, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) и без добитък, на постоянни места за размножаване и в села. Пет капана бяха нагрявани, за да се симулира наличието на гостоприемник, докато пет капана бяха оставени неотопляеми. Всяко място за третиране се редува всяка вечер в продължение на общо пет нощи. Броят на комарите, уловени в капани, напълнени с стръв с урина от различна възраст, беше сравнен с помощта на логистична регресия с бета биномиално разпределение (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
В ендемично за малария село близо до град Маки, регион Оромия, Етиопия (8° 11′ 08″ с.ш., 38° 81′ 70″ и.д.; Фигура 6А). Проучването е проведено между средата на август и средата на септември преди ежегодното пръскане с остатъчни вещества на закрито, заедно с дълъг дъждовен сезон. За проучването са избрани пет двойки къщи (на разстояние 20–50 м една от друга), разположени в покрайнините на селото (Фиг. 6А). Критериите, използвани за избор на къщите, са: не се допускат животни в къщата, не се допуска готвене на закрито (дърва за огрев или дървени въглища) (поне през пробния период) и къщи с максимум двама жители, спящи в неинсектицидни помещения. под третираната мрежа против комари. Етично одобрение е предоставено от Комисията за преглед на институционалната етика на научните изследвания (IRB/022/2016) на Факултета по естествени науки (CNS-IRB) към Университета в Адис Абеба, в съответствие с насоките, установени от Декларацията на Световната медицинска асоциация от Хелзинки. Съгласието от всеки глава на домакинство е получено с помощта на здравен персонал. Целият процес е одобрен от местните администрации на ниво район и район („кебеле“). Експерименталният дизайн е следвал латински квадрат 2 × 2, при който синтетични смеси и контроли са били разпределени в сдвоени къщи през първата нощ и са били разменяни между къщите през следващата експериментална нощ. Този процес е повторен десет пъти. Освен това, за да се оцени активността на комарите в избрани къщи, капаните на CDC са били настроени да работят пет последователни нощи в началото, средата и края на полевото изпитване по едно и също време на деня.
Синтетична смес, съдържаща шест биоактивни съединения, беше разтворена в хептан (97,0% разтворител, GC клас, Sigma Aldrich) и освободена при 140 ng h-1 с помощта на дозатор с памучен фитил [20]. Дозаторът с фитил позволяваше всички съединения да се освобождават в постоянни пропорции през целия 12-часов експеримент. Хептанът беше използван като контрола. Флаконът беше окачен до входната точка на светлинния капан на Центровете за контрол и превенция на заболяванията (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, US; Фигура 6A). Капаните бяха окачени на 0,8 – 1 м над земята, близо до долния край на леглото, а доброволец спеше под необработена мрежа против комари и работеше между 18:00 и 06:30 часа. Комарите, уловени по пол и физиологичен статус (нехранени, хранени, полубременни и бременни [21]), впоследствие бяха скринирани с помощта на полимеразна верижна реакция (PCR), за да се идентифицират видовете, морфологично идентифицирани като A. gambiae sl. Членове на комплекса [23]. В полеви условия В едно проучване, улавянето на сдвоени къщи чрез капани беше анализирано с помощта на номинален логистичен модел на съответствие, където привличането беше зависимата променлива, а третирането (синтетична смес срещу контрола) беше фиксираният ефект (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Тук представяме χ2 и p-стойностите от теста за съотношение на вероятност.
Оценете дали е безопасно. arabiensis е успял да получи урина, основния си източник на азот, урея, чрез директно хранене, в рамките на 48 часа след прилагане в продължение на 4 дни след (dpe) опити за хранене на женски, търсещи гостоприемник, и хранени с кръв (фиг. 1A). Както женските, търсещи гостоприемник, така и тези, които смучат кръв, абсорбират значително повече захароза от всяка друга диета или вода (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 и F(5,299) = 56,00, p < 0,0001, съответно; фиг. 1B,C). Освен това, женските, търсещи гостоприемник, са консумирали по-малко урина на 72-ия час в сравнение с урина на 168-ия час (фиг. 1B). Когато им е предложена диета, съдържаща урея, женските, търсещи гостоприемник, абсорбират значително по-голямо количество урея при 2,69 mM в сравнение с всички други концентрации и вода, докато са неразличими от 10% захароза (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Фигура 1D). Това е в контраст с отговора на женски, хранени с кръв, които обикновено абсорбират значително повече урея, съдържаща диети, отколкото вода, макар и значително по-малко от 10% захароза (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Фигура 1).1E). Освен това, при сравнение между двете физиологични състояния, флеботомизираните женски абсорбират повече урея от женските, търсещи гостоприемник, при най-ниски концентрации, а тези женски абсорбират подобни количества урея при по-високи концентрации (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; Фиг. 1F, G). Докато приемът от диета, съдържаща урея, изглежда има оптимални стойности (Фиг. 1D, E), женските и в двете физиологични състояния са способни да модулират количеството на абсорбираната урея в целия диапазон от концентрации на урея по логаритмично-линеен начин (Фиг. 1F, G). ). По подобен начин, комарите изглежда контролират усвояването на азот чрез регулиране на количеството абсорбирана урина, тъй като количеството азот в урината се отразява в абсорбираното количество (вмъкнати фигури 1B, C и B).
За да се оцени влиянието на урината и уреята върху оцеляването на комарите, търсещи гостоприемник, и на кръвосмучещите комари, женските са били хранени с урина от всички четири възрасти (прясна, 24 часа, 72 часа и 168 часа след отлагането), като за контрола са били използвани различни концентрации на урея, както и дестилирана вода и 10% захароза (Фигура 2А). Този анализ на оцеляването показа, че диетата има значителен ефект върху общата преживяемост при женските, търсещи гостоприемник (урина: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; урея: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Фиг. 2B, C), и женските, хранени с кръв (урина: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; урея: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001;). Фигура 2D,E). Във всички експерименти, женските, хранени с диета от урина, урея и вода, са имали значително по-ниски нива на оцеляване в сравнение с женските, хранени със захарозна диета (Фигура 2B-E). Женските, търсещи гостоприемник, хранени с прясна и застояла урина, са показали различни нива на оцеляване, като тези, хранени с 72-часова застояла урина (p = 0,016), са имали най-ниска вероятност за оцеляване (Фиг. 2B). Освен това, женските, търсещи гостоприемник, хранени с 135 mM урея, са оцелели по-дълго от контролните, хранени с вода (p < 0,04) (Фиг. 2C). В сравнение с вода, жените, хранени с прясна урина и 24-часова урина, са оцелели по-дълго (съответно p = 0,001 и p = 0,012; Фигура 2D), докато жените, хранени със 72-часова урина, са оцелели по-дълго от тези, хранени с малко прясна урина и 24-часова отлежала урина (съответно p < 0,0001 и p = 0,013; Фигура 2D). Когато са били хранени със 135 mM урея, Женските, хранени с кръв, са оцелели по-дълго от всички други концентрации на урея и вода (p < 0,013; Фигура 2E).
Оцеляване на гостоприемника и кръвосмучещите женски Anopheles arabinis, хранещи се с кравешка урина и урея. В биологичния анализ (A) на женските комари е предоставена диета, състояща се от прясна и отлежала кравешка урина, различни концентрации на урея, захароза (10%) и дестилирана вода (H2O). Оцеляването на комарите, търсещи гостоприемник (B, C), и кръвосмучещите (D, E) комари, е регистрирано на всеки 12 часа, докато всички женски, хранени с урина (B, D) и урея (C, E), и контролните, захароза и вода, умрат.
Общото разстояние и броят на обиколките, определени в теста за летателна мелница за период от 24 часа, се различаваха между комарите, търсещи гостоприемник, и кръвосмучещите комари, които показаха по-малка летяща активност като цяло (фиг. 3). Комарите, търсещи гостоприемник, които осигуриха прясна и отлежала урина или захароза и вода, показаха различни модели на летене (фиг. 3), като женските, хранещи се с прясна урина, бяха по-активни на разсъмване, докато тези, хранени с 24- и 168-часова урина. Комарите, хранени с урина, показаха различни модели на летене и бяха предимно дневни. Женските комари, които осигуриха захароза или 72-часова урина, показаха активност през целия 24-часов период, докато женските, които осигуриха вода, бяха по-активни през средата на периода. Комарите, хранени със захароза, показаха най-високи нива на активност късно през нощта и рано сутринта, докато тези, които погълнаха 72-часова урина, отбелязаха постоянен спад в активността си в продължение на 24 часа (фиг. 3).
Полетни характеристики на търсеща гостоприемник женска Anopheles arabinis, хранеща се с кравешка урина и урея. В теста с летателна мелница, женски комари, хранени с прясна и отлежала кравешка урина, различни концентрации на урея, захароза (10%) и дестилирана вода (H2O), бяха завързани за хоризонтални, свободно въртящи се рамена (по-горе). За женските, търсещи гостоприемник (вляво), и кръвосмучещи (вдясно), бяха записани общото разстояние и броят на полетите на час за всяка диета за период от 24 часа (тъмно: сиво; светло: бяло). Средното разстояние и средният брой полети са показани вдясно от графиката на циркадната активност. Грешките представляват стандартна грешка на средната стойност. Статистически анализ вижте текста.
Като цяло, общата летателна активност на женските, търсещи гостоприемник, следва модел, подобен на този на разстоянието на полета за период от 24 часа. Средното разстояние на полета е значително повлияно от приетата диета (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), а женските, търсещи гостоприемник, погълнали 72 часа урина, са прелетяли значително по-дълги разстояния в сравнение с всички други диети (p < 0,0001), а комарите, хранени със захароза, са летели по-дълго от комарите, хранени с прясна (p = 0,022) и 24-часова урина (p = 0,022). За разлика от модела на летателна активност, описан от диетата с урина, женските, търсещи гостоприемник, хранени с урея, показват постоянна летателна активност за период от 24 часа, достигайки пик през втората половина на тъмната фаза (фиг. 3). Въпреки че моделите на активност са сходни, женските, търсещи гостоприемник, хранени с урея, значително увеличават средното разстояние на полета в зависимост от абсорбираната концентрация (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Женските, търсещи гостоприемник, хранени с каквато и да е концентрация на урея, летяха по-дълго от женските, хранени с вода или захароза (p < 0,03).
Общата летателна активност на кръвосмучещите комари е била стабилна и се е поддържала в продължение на 24 часа при всички диети, с повишена активност на урината през втората половина на тъмния период при женските, хранени с вода, както и при женските, хранени с прясна вода и на 24 часа (изображение 3). Докато диетата с урина е повлияла значително на средното разстояние на полета при женските, хранени с кръв (F(5, 138) = 4.83, p = 0.0004), диетата с урея не е повлияла (F(5, 138) = 1.36, p = 0.24) при друга урина и контролна диета (прясна, p = 0.0091; 72 часа, p = 0.0022; 168 часа, p = 0.001; захароза, p = 0.0017; dH2O, p = 0.036).
Ефектите от храненето с урина и урея върху репродуктивните параметри бяха оценени в биологични тестове за снасяне на яйца (Фигура 4А) и бяха изследвани според броя на яйцата, снесени от всяка женска, размера на яйцата и новоизлюпените ларви в първи стадий. Броят на снесените яйца. Хранените с урина арабски женски варираха в зависимост от диетата (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; Фиг. 4B). Женските, хранени с 24-часова урина и кръвно брашно, снасяха значително повече яйца от женските, хранени с други диети с урина, и бяха подобни на тези, хранени със захароза (Фиг. 4B). По подобен начин размерът на яйцата, снесени от женски, хранени с урина, варираше в зависимост от диетата (F(5,209) = 12,85, p < 0,0001), като женските, хранени с 24-часова урина и захароза, снасяха значително по-големи яйца от женските, хранени с вода, докато яйцата на женските, хранени със 168 часа урина, бяха значително по-малки (Фиг. 4C). Освен това, диетата с урина значително повлия на размера на ларвите (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), като значително по-големи ларви се появяват от яйца, снесени от 24- и 72-часови женски, хранени с урина, отколкото от яйца, снесени от ларви на яйца. Женски, хранени с вода и 168-часови женски, хранени с урина (Фигура 4D).
Репродуктивна способност на женски Anopheles arabinis, хранещи се с кравешка урина и урея. Хранени с кръв женски комари са били хранени с диети, състоящи се от прясна и отлежала кравешка урина, различни концентрации на урея, захароза (10%) и дестилирана вода (H2O) в продължение на 48 часа, преди да бъдат поставени в биологични анализи и да се получат субстрати за снасяне на яйца (A). Броят на яйцата (B, E), размерът на яйцата (C, F) и размерът на ларвите (D, G) са били значително повлияни от предоставената диета (кравешка урина: BD; урея: EG). Средните стойности за всеки параметър, измерен с помощта на различни буквени имена, са били значително различни една от друга (еднофакторен ANOVA, използващ post hoc анализ на Tukey; p < 0,05). Грешките представляват стандартна грешка на средната стойност.
Като основен азотен компонент на урината, уреята, когато е била предоставяна като диета на женски, хранени с кръв, е повлияла значително на репродуктивните параметри във всички проучвания. Броят на яйцата, снесени от женски, хранени с урея, след хранене с кръв, в зависимост от концентрацията на урея (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), женските, хранени с концентрации на урея между 134 µM и 1,34 mM, са снесли повече яйца (Фигура 4E). Женските, хранени с концентрации на урея от 134 µM или по-високи, са снесли по-големи яйца от женските, хранени с вода (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Фигура 4F), а размерът на ларвите, въпреки че е повлиян от подобни концентрации на урея при майките (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001), е бил по-променлив (Фиг. 4G).
Общо привличане към летливи екстракти от търсеща гостоприемник говежда урина от пространството над водата. Arabiensis, оценен в олфактометър със стъклена тръба (фиг. 5А), е значително повлиян от възрастта на урината (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; фиг. 5B). Post hoc анализът показва, че миризмата на застояла урина на 24 часа причинява значително по-високи нива на привлекателност в сравнение с всички други третирания (72 часа: p = 0,0060, 168 часа: p = 0,012, пентан: p = 0,00070), с изключение на миризмата на прясна урина (p = 0,13; Фигура 5B). Въпреки че общото привличане на кръвосмучещите комари към миризмата на урина не е значително различно (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; фиг. 5C), тези женски са установени като значително по-привлекателни към летливи екстракти от пространството над водата в сравнение с 72-часова урина в сравнение с контролите (p = 0,0066; Фигура 5C).
Поведенчески реакции към миризми на естествена и синтетична кравешка урина при търсене на гостоприемник и хранени с кръв Anopheles arabianus. Схема на олфактометъра със стъклена тръба (A). Привличане на летливи екстракти от горното пространство от прясна и отлежала кравешка урина към гостоприемника (B) и кръвосмучещите (C) комари. Намерете реакцията на пипалата на Lord An. Показани са екстракти от горното пространство, изолирани от прясна (D), 24-часова (E), 72-часова (F) и 168-часова (G) отлежала кравешка урина. Следите от електронно-антенно детектиране (EAD) показват промени в напрежението в отговор на биоактивни съединения в горното пространство, елуирани от газовия хроматограф и открити от пламъчно-йонизационен детектор (FID). Скалата представлява амплитудата на отговора (mV) спрямо времето на задържане (s). Показани са свойствата и скоростите на освобождаване (µg h-1) на биологично активните съединения. Единична звездичка (*) показва постоянен отговор с ниска амплитуда. Двойни звездички (**) показват невъзпроизводими отговори. Намерете гостоприемника (H) и кръвосмучещия комари. (I) An.arabiensis има различна привлекателност към синтетични смеси от миризми на прясна и отлежала кравешка урина. Средните пропорции на комарите, привлечени от различни буквени имена, се различават значително един от друг (еднофакторен ANOVA, използващ post hoc анализ на Tukey; p < 0,05). Грешките на скалата представляват стандартната грешка на скалата.
Женска Ann.arabiensis, 72 часа и 120 часа след кръвно хранене, по време на хвърляне на хайвера, не е показано предпочитание към летливи екстракти от прясна и отлежала кравешка урина в сравнение с контролите с пентан (χ2 = 3.07, p > 0.05; Допълнителен файл 1: Фиг. S1).
За женските Ann.arabiensis, GC-EAD и GC-MS анализите идентифицираха осем, шест, три и три биоактивни съединения (Фигура 5D-G). Въпреки че бяха наблюдавани разлики в броя на съединенията, които предизвикаха електрофизиологични реакции, повечето от тези съединения присъстваха във всеки летлив екстракт от горното пространство, събран от прясна и отлежала урина. Следователно, за всеки екстракт, в по-нататъшни анализи бяха включени само съединения, които предизвикаха физиологичен отговор от женските антени над прага.
Общата скорост на освобождаване на летливи биоактивни съединения в хедспейс колекцията се е увеличила от 29 µg h-1 в прясна урина до 242 µg h-1 в 168-часова урина, главно поради увеличаване на p-крезола и m-формалдехида. Фенолът се увеличава, както и фенолът. За разлика от това, скоростите на освобождаване на други съединения, като 2-циклохексен-1-он и деканал, са намалели с увеличаване на възрастта на урината, което е корелирало с наблюдаваното намаляване на интензитета (изобилие) на сигнала в хроматограмата (фиг. 5D)-G ляв панел) и физиологичните реакции към тези съединения (фиг. 5D-G десен панел).
Като цяло, синтетичната смес имаше подобно естествено съотношение на биоактивни съединения, идентифицирани в летливи екстракти от прясна и отлежала урина (фиг. 5D–G) и не изглеждаше да предизвиква значителна привлекателност при търсенето на гостоприемник (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; фиг. 5H) или кръвосмучещи комари (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; фиг. 5I). Въпреки това, post hoc двойни сравнения между третиранията показаха, че комарите, търсещи гостоприемник, бяха значително привлекателни за синтетичната смес от 24-часова отлежала урина в сравнение с контролите с пентан (p = 0,0086; Фигура 5H).
За да се оцени ролята на отделните компоненти в синтетични смеси от 24-часова урина, шест субтрактивни смеси бяха оценени спрямо пълни смеси в Y-образен анализ, при който отделните съединения бяха отстранени. При комарите, търсещи гостоприемник, изваждането на отделни съединения от пълната смес имаше значителен ефект върху поведенческите реакции (χ2 = 19.63, df = 6, p = 0.0032; Допълнителен файл 1: Фигура S2A), като всички субтрактивни смеси бяха по-привлекателни от напълно смесените. За разлика от това, отстраняването на отделни съединения от напълно синтетичната смес не повлия на поведенческите реакции на кръвосмучещите комари (χ2 = 11.38, df = 6, p = 0.077), с изключение на деканала, който доведе до по-ниски нива на привличане в сравнение с пълната смес (p = 0.022; Допълнителен файл 1: Фигура S2B).
В ендемично за малария село в Етиопия е оценена ефикасността на синтетична смес от 24-часова кравешка урина за привличане на комари в полеви условия в продължение на десет нощи (фиг. 6А). Общо 4861 комара са били уловени и идентифицирани, от които 45,7% са Anthropus.gambiae sl, 18,9% са Anopheles pharoensis и 35,4% са Culex spp. (Допълнителен файл 1: Таблица S1). Anopheles arabinis е единственият член на видовия комплекс An.Gambian, идентифициран чрез PCR анализ. Средно са били уловени 320 комара на нощ, като през това време капани със синтетична смес от примамки са уловили повече комари, отколкото сдвоени капани без смес (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Капани без примамка са били поставени във всяка от петте контролни нощи в началото, средата и края на опита. Подобен брой комари са били уловени във всяка двойка капани, което показва... Няма отклонение между къщите (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) и няма намаляване на популацията по време на периода на изследване. В сравнение с контролните капани, броят на комарите, уловени в капаните, съдържащи синтетичната смес, е значително увеличен: търсене на гостоприемник (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), скорошно кръвосмучене (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) и бременност (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Допълнителен файл 1: Таблица S1). Това се отразява и в общия брой уловени комари: търсещи гостоприемник > кръвосмучещи > бременни > полубременни > мъжки.
Полева оценка на ефикасността на 24-часова синтетична смес с миризма на кравешка урина. Полевите опити са проведени в южно-централна Етиопия (карта), близо до град Маки (вмъкване), като е използван светлинен капан на Центровете за контрол на заболяванията (CDC) (вдясно) в сдвоени къщи, с латински квадратен дизайн (въздушно изображение) (A). Синтетичните фотокапани на CDC с миризма привличат и улавят женски Anopheles arabesques (B), но не и Anopheles farroes (C), по различен начин, зависим от физиологичното състояние. Освен това, тези капани улавят значително увеличен брой комари гостоприемници Culex. (D) В сравнение с контролата. Стълбовете отляво представляват средния индекс на селекция на комари, уловени в двойки капани с миризма (зелени) и контролни (отворени) капани (N = 10), докато стълбовете отдясно представляват средния индекс на селекция в двойки контролни капани (отворени; N = 5). Звездичките показват нива на статистическа значимост (*p = 0,01 и ***p < 0,0001).
Трите вида бяха уловени по различен начин в капани, съдържащи синтетични смеси. При търсене на гостоприемник (χ2(1, 1345) = 71.7, p < 0.0001), хранене с кръв (χ2(1, 517) = 16.7, p < 0.0001) и бременност (χ2(1, 180) = 6.11, p = 0.0134) .arabiensis беше хванат в капана, освобождавайки синтетичната смес (фиг. 6B), докато количеството на An не се различаваше. Открити бяха Pharoensis в различни физиологични състояния (фиг. 6C). При Culex беше установено само значително увеличение на броя на комарите, търсещи гостоприемници, в капани, заредени със синтетичната смес (χ2(1, 1319) = 12.6, p = 0.0004; фиг. 6D), в сравнение с контролните капани.
Капани за примамки на гостоприемници, разположени извън потенциални гостоприемници между местата за размножаване и селските общности в Етиопия, бяха използвани, за да се оцени дали маларийните комари използват миризмата на кравешка урина като сигнал за местообитанието на гостоприемника. При липса на сигнали за гостоприемника, топлина и със или без наличие на миризма на кравешка урина, не бяха уловени комари (Допълнителен файл 1: Фигура S3). Въпреки това, при наличие на висока температура и миризма на кравешка урина, женските маларийни комари бяха привлечени и уловени, макар и в малък брой, независимо от възрастта на урината (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Допълнителен файл 1: Фигура S3). За разлика от това, контролните групи с вода не уловиха маларийни комари при високи температури (Допълнителен файл 1: Фигура S3).
Маларийните комари придобиват и разпространяват азотсъдържащи съединения чрез компенсаторно хранене с кравешка урина (т.е. локви), за да подобрят характеристиките на жизнения цикъл, подобно на други насекоми [2, 4, 24, 25, 26]. Кравешката урина е леснодостъпен възобновяем ресурс, тясно свързан с места за почивка на маларийните вектори, като например обори и висока растителност близо до селски домове и места за хвърляне на хайвера. Женските комари локализират този ресурс чрез обоняние и са способни да регулират усвояването на азотни съединения в урината, включително урея, основният азотен компонент в урината [15, 16]. В зависимост от физиологичното състояние на женския комар, хранителните вещества в урината се разпределят, за да се подобри летателната активност и оцеляването на женските комари, търсещи гостоприемник, както и оцеляването и репродуктивните характеристики на кръвоснабдените индивиди по време на първия гонадотропен цикъл. Следователно, смесването на урината играе важна хранителна роля за маларийните вектори, които са затворени като недохранените възрастни [8], тъй като предоставя на женските комари способността да придобиват важни азотни съединения, като се занимават с хранене с нисък риск. Това откритие има значителни епидемиологични последици, тъй като женските увеличават продължителността на живота си, активност и репродуктивна продукция, всички от които влияят върху капацитета на векторите. Освен това, това поведение може да бъде целта на бъдещи програми за управление на векторите.