Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка на CSS. За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer). Междувременно, за да осигурим непрекъсната поддръжка, ще рендираме сайта без стилове и JavaScript.
Въртележка, показваща три слайда едновременно. Използвайте бутоните „Предишна“ и „Следваща“, за да се придвижвате през три слайда едновременно, или използвайте плъзгачите в края, за да се придвижвате през три слайда едновременно.
Наскоро беше разработена безхимична антимикробна платформа, базирана на нанотехнологии, използваща изкуствени водни наноструктури (EWNS). EWNS имат висок повърхностен заряд и са наситени с реактивни кислородни видове (ROS), които могат да взаимодействат и да инактивират редица микроорганизми, включително хранителни патогени. Тук е показано, че техните свойства по време на синтез могат да бъдат фино настроени и оптимизирани, за да се подобри допълнително антибактериалният им потенциал. Лабораторната платформа EWNS е проектирана за фина настройка на свойствата на EWNS чрез промяна на параметрите на синтез. Характеризиране на свойствата на EWNS (заряд, размер и съдържание на ROS) с помощта на съвременни аналитични методи. Освен това, те бяха оценени за техния потенциал за микробна инактивация срещу хранителни микроорганизми като Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum и Saccharomyces cerevisiae. Представените тук резултати показват, че свойствата на EWNS могат да бъдат фино настроени по време на синтеза, което води до експоненциално увеличение на ефективността на инактивиране. По-специално, повърхностният заряд се е увеличил четири пъти, а реактивните кислородни видове са се увеличили. Скоростта на отстраняване на микробите е зависима от микробите и варира от 1,0 до 3,8 log след 45-минутно излагане на аерозолна доза от 40 000 #/cc EWNS.
Микробното замърсяване е основната причина за хранителни заболявания, причинени от поглъщане на патогени или техни токсини. Само в Съединените щати хранителните заболявания причиняват около 76 милиона заболявания, 325 000 хоспитализации и 5000 смъртни случая всяка година1. Освен това Министерството на земеделието на Съединените щати (USDA) изчислява, че увеличената консумация на пресни продукти е причина за 48% от всички докладвани хранителни заболявания в Съединените щати2. Цената на заболяванията и смъртните случаи, причинени от хранителни патогени в Съединените щати, е много висока, като Центровете за контрол и превенция на заболяванията (CDC) я оценяват на повече от 15,6 милиарда щатски долара годишно3.
Понастоящем химичните4, радиационни5 и термични6 антимикробни интервенции за гарантиране на безопасността на храните се извършват най-вече в ограничени критични контролни точки (ККТ) по производствената верига (обикновено след прибиране на реколтата и/или по време на опаковане), а не непрекъснато. По този начин те са склонни към кръстосано замърсяване. 7. По-добрият контрол върху хранителните заболявания и развалянето на храните изисква антимикробни интервенции, които потенциално могат да се прилагат в целия континуум „от фермата до трапезата“, като същевременно се намалява въздействието върху околната среда и разходите.
Наскоро беше разработена антимикробна платформа, базирана на нанотехнологии, без химикали, която може да инактивира повърхностни и въздушно-капсулирани бактерии, използвайки изкуствени водни наноструктури (EWNS). EWNS бяха синтезирани с помощта на два паралелни процеса, електроспрей и йонизация на водата (фиг. 1а). Предишни проучвания показват, че EWNS имат уникален набор от физични и биологични свойства8,9,10. EWNS имат средно 10 електрона на структура и среден наномащабен размер от 25 nm (фиг. 1b,c)8,9,10. Освен това, електронният спинов резонанс (ESR) показа, че EWNS съдържа голямо количество реактивни кислородни видове (ROS), главно хидроксилни (OH•) и супероксидни (O2-) радикали (фиг. 1c)8. EVNS се намират във въздуха дълго време и могат да се сблъскат с микроорганизми, суспендирани във въздуха и присъстващи на повърхността, доставяйки своя ROS полезен товар и причинявайки инактивиране на микроорганизми (фиг. 1d). Тези ранни проучвания също така показват, че EWNS могат да взаимодействат и да инактивират различни грам-отрицателни и грам-положителни бактерии, включително микобактерии, върху повърхности и във въздуха. Трансмисионната електронна микроскопия показа, че инактивирането е причинено от разрушаване на клетъчната мембрана. Освен това, проучвания при остра инхалация показват, че високите дози EWNS не причиняват увреждане на белите дробове или възпаление8.
(а) Електроспрей се получава, когато се приложи високо напрежение между капилярна тръба, съдържаща течност, и противоелектрод. (б) Прилагането на високо налягане води до две различни явления: (i) електроспрей на вода и (ii) образуване на реактивни кислородни видове (йони), уловени в EWNS. (в) Уникалната структура на EWNS. (г) Поради наномащабния си характер, EWNS са силно мобилни и могат да взаимодействат с патогени, пренасяни по въздушно-капков път.
Наскоро беше демонстрирана и способността на антимикробната платформа EWNS да инактивира хранителни микроорганизми по повърхността на пресни храни. Показано е също, че повърхностният заряд на EWNS в комбинация с електрическо поле може да се използва за постигане на целенасочено доставяне. Освен това, предварителните резултати за биологични домати след 90-минутно излагане при EWNS от около 50 000 #/cm3 бяха окуражаващи, като бяха наблюдавани различни хранителни микроорганизми, като E. coli и Listeria 11. Освен това, предварителните органолептични тестове не показаха сензорни ефекти в сравнение с контролните домати. Въпреки че тези първоначални резултати от инактивирането са окуражаващи за приложения за безопасност на храните дори при много ниски дози EWNS от 50 000#/cc.see, ясно е, че по-висок потенциал за инактивиране би бил по-полезен за по-нататъшно намаляване на риска от инфекция и разваляне.
Тук ще съсредоточим нашите изследвания върху разработването на платформа за генериране на EWNS, която да позволи фина настройка на параметрите на синтез и оптимизиране на физикохимичните свойства на EWNS, за да се подобри техният антибактериален потенциал. По-специално, оптимизацията е фокусирана върху увеличаване на повърхностния им заряд (за подобряване на целенасоченото доставяне) и съдържанието на ROS (за подобряване на ефективността на инактивиране). Ще характеризираме оптимизираните физикохимични свойства (размер, заряд и съдържание на ROS), използвайки съвременни аналитични методи и използвайки често срещани хранителни микроорганизми като E. .
EVNS е синтезиран чрез едновременно електропръскване и йонизация на вода с висока чистота (18 MΩ cm–1). Електрическият небулизатор 12 обикновено се използва за атомизиране на течности и синтез на полимерни и керамични частици 13 и влакна 14 с контролиран размер.
Както е описано подробно в предишни публикации 8, 9, 10, 11, в типичен експеримент, високо напрежение е приложено между метален капиляр и заземен противоелектрод. По време на този процес протичат два различни явления: i) електроспрей и ii) йонизация на водата. Силно електрическо поле между двата електрода причинява натрупване на отрицателни заряди върху повърхността на кондензираната вода, което води до образуването на конуси на Тейлър. В резултат на това се образуват силно заредени водни капчици, които продължават да се разпадат на по-малки частици, както в теорията на Рейли16. В същото време, силните електрически полета карат някои водни молекули да се разделят и да отделят електрони (йонизират), което води до образуването на голямо количество реактивни кислородни видове (ROS)17. Едновременно генерираният ROS18 е капсулиран в EWNS (фиг. 1в).
На фиг. 2а е показана системата за генериране на EWNS, разработена и използвана в EWNS синтеза в това изследване. Пречистена вода, съхранявана в затворена бутилка, е подадена през тефлонова тръба (2 mm вътрешен диаметър) в игла от неръждаема стомана 30G (метална капилярка). Потокът от вода се контролира от налягането на въздуха вътре в бутилката, както е показано на Фигура 2б. Иглата е монтирана на тефлонова конзола и може ръчно да се регулира на определено разстояние от противоелектрода. Противоелектродът е полиран алуминиев диск с отвор в центъра за вземане на проби. Под противоелектрода се намира алуминиева фуния за вземане на проби, която е свързана с останалата част от експерименталната установка чрез отвор за вземане на проби (фиг. 2б). За да се избегне натрупване на заряд, който би могъл да наруши работата на пробоотборника, всички компоненти на пробоотборника са електрически заземени.
(а) Система за генериране на инженерни водни наноструктури (EWNS). (б) Напречно сечение на пробоотборника и електроспрей, показващо най-важните параметри. (в) Експериментална установка за инактивиране на бактерии.
Системата за генериране на EWNS, описана по-горе, е способна да променя ключови работни параметри, за да улесни фината настройка на свойствата на EWNS. Регулирайте приложеното напрежение (V), разстоянието между иглата и противоелектрода (L) и водния поток (φ) през капиляра, за да регулирате фино характеристиките на EWNS. Символ, използван за представяне на различни комбинации: [V (kV), L (cm)]. Регулирайте водния поток, за да получите стабилен конус на Тейлър с определен набор [V, L]. За целите на това изследване диаметърът на отвора на противоелектрода (D) е поддържан на 0,5 инча (1,29 cm).
Поради ограничената геометрия и асиметрията, силата на електрическото поле не може да бъде изчислена от първи принципи. Вместо това, за изчисляване на електрическото поле е използван софтуерът QuickField™ (Свендборг, Дания)19. Електрическото поле не е равномерно, така че стойността на електрическото поле на върха на капиляра е използвана като референтна стойност за различни конфигурации.
По време на изследването бяха оценени няколко комбинации от напрежение и разстояние между иглата и противоелектрода по отношение на образуването на конус на Тейлър, стабилността на конуса на Тейлър, стабилността на производството на EWNS и възпроизводимостта. Различните комбинации са показани в Допълнителна таблица S1.
Изходът на системата за генериране на EWNS беше свързан директно към анализатор на размера на частиците Scanning Mobility Particle Size Analyzer (SMPS, модел 3936, TSI, Shoreview, MN) за измерване на концентрацията на броя частици, както и към аерозолен фарадеев електрометър (TSI, модел 3068B, Shoreview, MN). Аерозолните токове бяха измерени, както е описано в предишната ни публикация. Както SMPS, така и аерозолният електрометър вземаха проби при дебит 0,5 L/min (общ дебит на пробата 1 L/min). Концентрацията на броя частици и аерозолният поток бяха измерени в продължение на 120 секунди. Измерването се повтаря 30 пъти. Въз основа на измерванията на тока се изчислява общият аерозолен заряд и се оценява средният EWNS заряд за даден общ брой избрани EWNS частици. Средната цена на EWNS може да се изчисли с помощта на уравнение (1):
където IEl е измереният ток, NSMPS е цифровата концентрация, измерена със SMPS, а φEl е дебитът на електрометър.
Тъй като относителната влажност (RH) влияе върху повърхностния заряд, температурата и (RH) се поддържаха постоянни по време на експеримента съответно на 21°C и 45%.
За измерване на размера и времето на живот на EWNS бяха използвани атомно-силова микроскопия (АСМ), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Санта Барбара, Калифорния) и сонда AC260T (Olympus, Токио, Япония). Честотата на сканиране на АСМ беше 1 Hz, площта на сканиране беше 5 μm × 5 μm и 256 линии на сканиране. Всички изображения бяха подложени на подравняване на изображения от 1-ви ред, използвайки софтуера Asylum (диапазон на маската 100 nm, праг 100 pm).
Тестовата фуния беше отстранена и повърхността на слюдата беше поставена на разстояние 2,0 см от противоелектрода за време на осредняване от 120 секунди, за да се избегне агломерация на частици и образуване на неправилни капчици върху повърхността на слюдата. EWNS (електронно разпръснати напречни дифузионни частици) беше напръскан директно върху повърхността на прясно нарязана слюда (Тед Пела, Рединг, Калифорния). Изображение на повърхността на слюдата веднага след AFM разпрашване. Ъгълът на контакт на повърхността на прясно нарязана немодифицирана слюда е близо до 0°, така че EVNS (електронно разпръснати напречни дифузионни частици) е разпределен върху повърхността на слюдата под формата на купол. Диаметърът (a) и височината (h) на дифузиращите капчици бяха измерени директно от AFM топографията и използвани за изчисляване на куполовия дифузионен обем на EWNS, използвайки нашия предварително валидиран метод. Ако приемем, че вградените EWNS имат същия обем, еквивалентният диаметър може да се изчисли с помощта на уравнение (2):
Въз основа на нашия предварително разработен метод, за откриване на наличието на краткоживеещи радикалови междинни продукти в EWNS беше използван спинов капан с електронен спинов резонанс (ESR). Аерозоли бяха пропускани през 650 μm Midget барботер (Ace Glass, Vineland, NJ), съдържащ 235 mM разтвор на DEPMPO(5-(диетоксифосфорил)-5-метил-1-пиролин-N-оксид) (Oxis International Inc.). Портланд, Орегон. Всички ESR измервания бяха извършени с помощта на Bruker EMX спектрометър (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, САЩ) и плосък панел. За събиране и анализ на данните беше използван софтуерът Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, САЩ). Определянето на характеристиките на ROS беше извършено само за набор от работни условия [-6.5 kV, 4.0 cm]. Концентрациите на EWNS бяха измерени с помощта на SMPS след отчитане на загубите на EWNS в импактора.
Нивата на озон бяха наблюдавани с помощта на 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Боулдър, Колорадо)8,9,10.
За всички EWNS свойства, средната стойност се използва като стойност на измерване, а стандартното отклонение се използва като грешка на измерване. Проведени са t-тестове за сравняване на стойностите на оптимизираните EWNS атрибути със съответните стойности на базовите EWNS.
Фигура 2в показва предварително разработена и характеризирана система за „издърпване“ с електростатично утаяване (EPES), която може да се използва за целенасочено доставяне на EWNS на повърхността. EPES използва EVNS заряди, които могат да бъдат „насочвани“ директно към повърхността на целта под въздействието на силно електрическо поле. Подробности за EPES системата са представени в скорошна публикация на Pyrgiotakis et al. 11. По този начин, EPES се състои от 3D-отпечатана PVC камера със заострени краища и съдържа две успоредни метални плочи от неръждаема стомана (304 неръждаема стомана, огледално покритие) в центъра, разположени на разстояние 15,24 cm една от друга. Платките са свързани към външен източник на високо напрежение (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), долната плоча винаги е свързана към положително напрежение, а горната плоча винаги е свързана към земя (плаваща земя). Стените на камерата са покрити с алуминиево фолио, което е електрически заземено, за да се предотврати загубата на частици. Камерата има запечатана предна врата за зареждане, която позволява поставянето на тестовите повърхности върху пластмасови стойки, които ги повдигат над долната метална плоча, за да се избегнат смущения от високо напрежение.
Ефективността на отлагане на EWNS в EPES е изчислена съгласно предварително разработен протокол, подробно описан в Допълнителна фигура S111.
Като контролна камера, втора цилиндрична проточна камера беше свързана последователно към EPES системата, в която беше използван междинен HEPA филтър за отстраняване на EWNS. Както е показано на Фигура 2в, аерозолът EWNS беше изпомпван през две вградени камери. Филтърът между контролната зала и EPES премахва всички останали EWNS, което води до една и съща температура (T), относителна влажност (RH) и нива на озон.
Установено е, че важни хранителни микроорганизми замърсяват пресни храни, като например E. coli (ATCC #27325), фекален индикатор, Salmonella enterica (ATCC #53647), хранителен патоген, Listeria innorganic (ATCC #33090), заместител на патогенната Listeria monocytogenes, получена от ATCC (Манасас, Вирджиния) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), заместител на развалящите дрожди, и по-устойчива инактивирана бактерия, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Купете произволни кутии с био домати от местния пазар и ги съхранявайте в хладилник при 4°C до употреба (до 3 дни). Експерименталните домати бяха с еднакъв размер, около 1,25 см в диаметър.
Протоколите за култивиране, инокулация, експозиция и преброяване на колониите са подробно описани в предишната ни публикация и в допълнителните данни. Ефективността на EWNS беше оценена чрез излагане на инокулираните домати на 40 000 #/cm3 за 45 минути. Накратко, три домата бяха използвани за оценка на оцелелите микроорганизми във време t = 0 min. Три домата бяха поставени в EPES и изложени на EWNS при 40 000 #/cc (домати, изложени на EWNS), а останалите три бяха поставени в контролната камера (контролни домати). Допълнителна обработка на доматите и в двете групи не беше извършена. Доматите, изложени на EWNS, и контролните домати бяха отстранени след 45 минути, за да се оцени ефектът на EWNS.
Всеки експеримент е проведен в три екземпляра. Анализът на данните е извършен съгласно протокола, описан в допълнителните данни.
Механизмите на инактивиране бяха оценени чрез утаяване на експонирани проби от EWNS (45 минути при концентрация на аерозоли EWNS 40 000 #/cm3) и необлъчени проби от безвредни бактерии E. coli, Salmonella enterica и Lactobacillus. Частиците бяха фиксирани в 2,5% глутаралдехид, 1,25% параформалдехид и 0,03% пикринова киселина в 0,1 M буфер натриев какодилат (pH 7,4) в продължение на 2 часа при стайна температура. След измиване, последващата фиксиране с 1% осмиев тетроксид (OsO4)/1,5% калиев фероцианид (KFeCN6) в продължение на 2 часа, измиване 3 пъти във вода и инкубиране в 1% уранилацетат в продължение на 1 час, след което измиване два пъти във вода, след което дехидратиране в продължение на 10 минути в 50%, 70%, 90%, 100% алкохол. След това пробите бяха поставени в пропиленоксид за 1 час и импрегнирани със смес 1:1 от пропиленоксид и TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Пробите бяха вградени в TAAB Epon и полимеризирани при 60°C за 48 часа. Втвърдената гранулирана смола беше нарязана и визуализирана чрез TEM, използвайки конвенционален трансмисионен електронен микроскоп JEOL 1200EX (JEOL, Токио, Япония), оборудван с AMT 2k CCD камера (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Масачузетс, САЩ).
Всички експерименти бяха проведени в три екземпляра. За всяка времева точка, бактериалните промивки бяха посяти в три екземпляра, което доведе до общо девет точки данни на точка, чиято средна стойност беше използвана като бактериална концентрация за съответния микроорганизъм. Стандартното отклонение беше използвано като грешка на измерване. Всички точки се броят.
Логаритъмът на намалението на концентрацията на бактериите в сравнение с t = 0 min е изчислен по следната формула:
където C0 е концентрацията на бактерии в контролната проба в момент 0 (т.е. след като повърхността е изсъхнала, но преди да бъде поставена в камерата), а Cn е концентрацията на бактерии върху повърхността след n минути експозиция.
За да се отчете естественото разграждане на бактериите по време на 45-минутната експозиция, логаритмичното намаление в сравнение с контролата след 45 минути също беше изчислено, както следва:
където Cn е концентрацията на бактерии в контролната проба във времето n, а Cn-Control е концентрацията на контролните бактерии във времето n. Данните са представени като логаритмично намаление в сравнение с контролата (без експозиция на EWNS).
По време на проучването бяха оценени няколко комбинации от напрежение и разстояние между иглата и противоелектрода по отношение на образуването на конус на Тейлър, стабилността на конуса на Тейлър, стабилността на производството на EWNS и възпроизводимостта. Различни комбинации са показани в Допълнителна таблица S1. За цялостно проучване бяха избрани два случая, показващи стабилни и възпроизводими свойства (конус на Тейлър, генериране на EWNS и стабилност във времето). На фиг. Фигура 3 показва резултатите за заряда, размера и съдържанието на ROS и в двата случая. Резултатите са показани и в Таблица 1. За справка, както Фигура 3, така и Таблица 1 включват свойствата на предварително синтезираните неоптимизирани EWNS8, 9, 10, 11 (базови EWNS). Изчисленията на статистическата значимост, използващи двустранен t-тест, са публикувани отново в Допълнителна таблица S2. В допълнение, допълнителни данни включват проучвания на ефекта от диаметъра на отвора за вземане на проби на противоелектрода (D) и разстоянието между заземяващия електрод и върха (L) (Допълнителни фигури S2 и S3).
(ac) Разпределение на размерите, измерено чрез AFM. (df) Характеристика на повърхностния заряд. (g) ROS характеристика на EPR.
Важно е също да се отбележи, че за всички горепосочени условия измереният йонизационен ток е бил между 2 и 6 μA, а напрежението между -3,8 и -6,5 kV, което води до консумация на енергия по-малка от 50 mW за този единичен контактен модул за генериране на EWNS. Въпреки че EWNS е синтезиран под високо налягане, нивата на озон са били много ниски, като никога не са надвишавали 60 ppb.
Допълнителна фигура S4 показва симулираните електрически полета съответно за сценариите [-6,5 kV, 4,0 cm] и [-3,8 kV, 0,5 cm]. За сценариите [-6,5 kV, 4,0 cm] и [-3,8 kV, 0,5 cm], изчисленията на полето са съответно 2 × 10⁶ V/m и 4,7 × 10⁶ V/m. Това е очаквано, тъй като във втория случай съотношението напрежение-разстояние е много по-високо.
На фиг. 3a,b е показан диаметърът на EWNS, измерен с AFM8. Изчислените средни диаметри на EWNS са 27 nm и 19 nm съответно за схемите [-6.5 kV, 4.0 cm] и [-3.8 kV, 0.5 cm]. За сценариите [-6.5 kV, 4.0 cm] и [-3.8 kV, 0.5 cm], геометричните стандартни отклонения на разпределенията са съответно 1.41 и 1.45, което показва тясно разпределение на размерите. Както средният размер, така и геометричното стандартно отклонение са много близки до базовите EWNS, съответно 25 nm и 1.41. На фиг. 3c е показано разпределението на размерите на базовите EWNS, измерени с помощта на същия метод при същите условия.
На фиг. 3d,e са показани резултатите от характеризирането на заряда. Данните са средни стойности от 30 едновременни измервания на концентрация (#/cm3) и ток (I). Анализът показва, че средният заряд на EWNS е 22 ± 6 e- и 44 ± 6 e- съответно за [-6.5 kV, 4.0 cm] и [-3.8 kV, 0.5 cm]. Те имат значително по-високи повърхностни заряди в сравнение с базовия EWNS (10 ± 2 e-), два пъти по-големи от сценария [-6.5 kV, 4.0 cm] и четири пъти по-големи от сценария [-3.8 kV, 0.5 cm]. Фигура 3f показва данните за заряда за базовия EWNS.
От картите на концентрацията на броя EWNS (допълнителни фигури S5 и S6) може да се види, че сценарият [-6,5 kV, 4,0 cm] има значително повече частици от сценария [-3,8 kV, 0,5 cm]. Заслужава да се отбележи също, че концентрацията на броя EWNS е била наблюдавана до 4 часа (допълнителни фигури S5 и S6), където стабилността на генериране на EWNS показва едни и същи нива на концентрация на броя на частиците и в двата случая.
На фиг. 3g е показан EPR спектърът след изваждане на оптимизирания EWNS контрол (фон) при [-6.5 kV, 4.0 cm]. ROS спектрите бяха сравнени и със сценария Baseline-EWNS в публикувана по-рано работа. Броят на EWNS, реагиращи със спинови капани, беше изчислен на 7.5 × 104 EWNS/s, което е подобно на публикувания по-рано Baseline-EWNS8. EPR спектрите ясно показаха наличието на два вида ROS, като O2- е преобладаващият вид, а OH• е по-малко изобилен. Освен това, директно сравнение на интензитета на пиковете показа, че оптимизираните EWNS имат значително по-високо съдържание на ROS в сравнение с изходните EWNS.
На фиг. 4 е показана ефективността на отлагане на EWNS в EPES. Данните са обобщени в Таблица I и сравнени с оригиналните данни за EWNS. И за двата случая на EUNS, отлагането е близо до 100% дори при ниско напрежение от 3.0 kV. Обикновено 3.0 kV е достатъчно за 100% отлагане, независимо от промяната на повърхностния заряд. При същите условия, ефективността на отлагане на Baseline-EWNS е само 56% поради по-ниския им заряд (средно 10 електрона на EWNS).
На фиг. 5 и в таблица 2 е обобщена стойността на инактивиране на микроорганизми, инокулирани върху повърхността на доматите след излагане на около 40 000 #/cm3 EWNS за 45 минути при оптимален режим [-6,5 kV, 4,0 cm]. Инокулираните E. coli и Lactobacillus innocuous показват значително намаление от 3,8 log по време на 45-минутното излагане. При същите условия, S. enterica има намаление от 2,2 log, докато S. cerevisiae и M. parafortutum имат намаление от 1,0 log.
Електронните микрографии (Фигура 6) изобразяват физическите промени, предизвикани от EWNS върху безвредни клетки на Escherichia coli, Streptococcus и Lactobacillus, водещи до тяхното инактивиране. Контролните бактерии са имали непокътнати клетъчни мембрани, докато откритите бактерии са имали увредени външни мембрани.
Електронно-микроскопското изобразяване на контролни и открити бактерии разкри увреждане на мембраната.
Данните за физикохимичните свойства на оптимизираните EWNS показват, че свойствата (повърхностен заряд и съдържание на ROS) на EWNS са значително подобрени в сравнение с публикуваните по-рано базови данни за EWNS8,9,10,11. От друга страна, размерът им остава в нанометровия диапазон, много подобно на резултатите, докладвани по-рано, което им позволява да останат във въздуха за дълги периоди от време. Наблюдаваната полидисперсност може да се обясни с промени в повърхностния заряд, които определят размера на EWNS, случайността на ефекта на Рейли и потенциалната коалесценция. Въпреки това, както е подробно описано от Nielsen et al.22, високият повърхностен заряд намалява изпарението чрез ефективно увеличаване на повърхностната енергия/напрежение на водната капка. В предишната ни публикация8 тази теория беше експериментално потвърдена за микрокапчици22 и EWNS. Загубата на заряд по време на продължително време също може да повлияе на размера и да допринесе за наблюдаваното разпределение на размера.