Благодарим ви, че посетихте Nature.com.Използвате версия на браузър с ограничена поддръжка на CSS.За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer).Освен това, за да осигурим постоянна поддръжка, показваме сайта без стилове и JavaScript.
Показва въртележка от три слайда наведнъж.Използвайте бутоните Предишен и Следващ, за да преминете през три слайда наведнъж, или използвайте бутоните на плъзгача в края, за да преминете през три слайда наведнъж.
Кръвно-мозъчната бариера и кръвно-мозъчната бариера пречат на биотерапевтичните агенти да достигнат своите цели в централната нервна система, като по този начин възпрепятстват ефективното лечение на неврологични заболявания.За да открием нови мозъчни транспортери in vivo, ние въведохме T7 фагова пептидна библиотека и серийно събрахме кръв и гръбначно-мозъчна течност (CSF), използвайки канюлиран модел на голям басейн в съзнание на плъхове.Специфични фагови клонове бяха силно обогатени в CSF след четири кръга на селекция.Тестването на отделни кандидат-пептиди разкри повече от 1000-кратно обогатяване на CSF.Биоактивността на пептидно-медиираното доставяне до мозъка се потвърждава от 40% намаление на нивото на амилоид-β в гръбначно-мозъчната течност, като се използва BACE1 пептиден инхибитор, свързан с идентифицирания нов транзитен пептид.Тези резултати предполагат, че пептидите, идентифицирани чрез in vivo методи за селекция на фаги, могат да бъдат полезни средства за системно доставяне на макромолекули до мозъка с терапевтичен ефект.
Изследванията на таргетната терапия на централната нервна система (ЦНС) до голяма степен се фокусират върху идентифицирането на оптимизирани лекарства и агенти, които проявяват свойства, насочени към ЦНС, с по-малко усилия за откриване на механизмите, които управляват активното доставяне на лекарства в мозъка.Това започва да се променя сега, тъй като доставянето на лекарства, особено на големи молекули, е неразделна част от съвременното разработване на лекарства в областта на неврологията.Околната среда на централната нервна система е добре защитена от мозъчно-съдовата бариерна система, състояща се от кръвно-мозъчната бариера (BBB) ​​и кръвно-мозъчната бариера (BCBB)1, което прави доставянето на лекарства в мозъка предизвикателство1,2.Изчислено е, че почти всички лекарства с големи молекули и повече от 98% от лекарствата с малки молекули се елиминират от мозъка3.Ето защо е много важно да се идентифицират нови мозъчни транспортни системи, които осигуряват ефективно и специфично доставяне на терапевтични лекарства до ЦНС 4,5.Въпреки това, BBB и BCSFB също така представляват отлична възможност за доставка на лекарства, тъй като те проникват и навлизат във всички структури на мозъка чрез неговата обширна васкулатура.По този начин настоящите усилия за използване на неинвазивни методи за доставяне до мозъка до голяма степен се основават на механизма на рецептор-медииран транспорт (PMT), използвайки ендогенния BBB6 рецептор.Въпреки скорошния ключов напредък, използващ пътя на рецептора на трансферин 7, 8, е необходимо по-нататъшно разработване на нови системи за доставяне с подобрени свойства.За тази цел нашата цел беше да идентифицираме пептиди, способни да медиират транспорта на CSF, тъй като те по принцип могат да бъдат използвани за доставяне на макромолекули до ЦНС или за отваряне на нови рецепторни пътища.По-специално, специфични рецептори и транспортери на цереброваскуларната система (BBB и BSCFB) могат да служат като потенциални мишени за активно и специфично доставяне на биотерапевтични лекарства.Цереброспиналната течност (CSF) е секреторен продукт на хороидния плексус (CS) и е в пряк контакт с интерстициалната течност на мозъка през субарахноидалното пространство и камерното пространство4.Наскоро беше показано, че субарахноидалната цереброспинална течност дифундира прекомерно в интерстициума на мозъка9.Надяваме се да имаме достъп до паренхимното пространство, използвайки този субарахноиден входящ тракт или директно през BBB.За да постигнем това, внедрихме стабилна in vivo стратегия за селекция на фаги, която идеално идентифицира пептиди, транспортирани по някой от тези два различни пътя.
Сега описваме последователен метод за скрининг на фагов дисплей in vivo с вземане на проби от CSF, съчетано със секвениране с висока пропускателна способност (HTS), за да наблюдаваме първоначалните кръгове на селекция с най-голямото разнообразие на библиотеката.Скринингът беше извършен на плъхове в съзнание с трайно имплантирана голяма цистерна (CM) канюла, за да се избегне замърсяване на кръвта.Важно е, че този подход избира както насочени към мозъка, така и пептиди с транспортна активност през цереброваскуларната бариера.Използвахме Т7 фаги поради малкия им размер (~60 nm)10 и предположихме, че те са подходящи за транспортиране на везикули, които позволяват трансцелуларно преминаване на ендотелната и/или епително-медуларната бариера.След четири кръга на паниране бяха изолирани фагови популации, показващи силно in vivo обогатяване на CSF и асоцииране на церебрални микросъдове.Важно е, че успяхме да потвърдим нашите открития, като демонстрирахме, че предпочитаните и химически синтезирани най-добри кандидат-пептиди са в състояние да транспортират протеинов товар в цереброспиналната течност.Първо, фармакодинамичните ефекти на ЦНС бяха установени чрез комбиниране на водещ транзитен пептид с инхибитор на BACE1 пептида.В допълнение към демонстрирането, че стратегиите за функционален скрининг in vivo могат да идентифицират нови мозъчни транспортни пептиди като ефективни носители на протеинов товар, ние очакваме подобни подходи за функционална селекция също да станат важни при идентифицирането на нови пътища за мозъчен транспорт.
На базата на плакообразуващи единици (PFU), след етапа на опаковане на фаги, беше проектирана и създадена библиотека от произволни 12-мерни линейни Т7 фагови пептиди с разнообразие от приблизително 109 (вижте Материали и методи).Важно е да се отбележи, че внимателно анализирахме тази библиотека преди in vivo панорамиране.PCR амплификация на проби от фагова библиотека, използвайки модифицирани праймери, генерира ампликони, които са директно приложими към HTS (допълнителна фигура 1а).Поради a) грешки в секвенирането на HTS11, b) въздействие върху качеството на праймерите (NNK) 1-12 и c) наличието на фаг от див тип (wt) (скелетни вмъквания) в библиотеката в режим на готовност, беше приложена процедура за филтриране на последователност за извличане само на проверена информация за последователността (допълнителна фигура 1b).Тези стъпки за филтриране се прилагат за всички библиотеки за последователност на HTS.За стандартната библиотека бяха получени общо 233 868 прочитания, от които 39% преминаха критериите за филтриране и бяха използвани за анализ на библиотеката и избор за следващи кръгове (допълнителна фигура 1c–e).Отчитанията бяха предимно кратни на 3 базови двойки по дължина с пик при 36 нуклеотида (допълнителна фигура 1с), потвърждавайки дизайна на библиотеката (NNK) 1-12.Трябва да се отбележи, че приблизително 11% от членовете на библиотеката съдържат 12-измерен гръбнак PAGISRELVDKL вмъкване от див тип (wt) и почти половината от последователностите (49%) съдържат вмъквания или заличавания.HTS на библиотеката на библиотеката потвърди голямото разнообразие от пептиди в библиотеката: повече от 81% от пептидните последователности бяха открити само веднъж и само 1, 5% се появиха в ≥4 копия (допълнителна фигура 2а).Честотите на аминокиселините (aa) на всичките 12 позиции в репертоара корелират добре с честотите, очаквани за броя на кодоните, генерирани от дегенерирания NKK репертоар (допълнителна фигура 2b).Наблюдаваната честота на аа остатъци, кодирани от тези вложки, корелира добре с изчислената честота (r = 0.893) (допълнителна фигура 2с).Подготовката на фагови библиотеки за инжектиране включва етапите на амплификация и отстраняване на ендотоксина.По-рано е показано, че това потенциално намалява разнообразието от фагови библиотеки 12, 13.Ето защо, ние секвенирахме фагова библиотека с амплифицирана плака, която е претърпяла отстраняване на ендотоксин и я сравнихме с оригиналната библиотека, за да оценим честотата на АА.Наблюдава се силна корелация (r = 0.995) между оригиналния пул и амплифицирания и пречистен пул (допълнителна фигура 2d), което показва, че конкуренцията между клонове, амплифицирани върху плаки с помощта на Т7 фаг, не е причинила голямо отклонение.Това сравнение се основава на честотата на трипептидните мотиви във всяка библиотека, тъй като разнообразието от библиотеки (~ 109) не може да бъде напълно уловено дори с HTS.Честотният анализ на aa на всяка позиция разкри малко зависимо от позицията отклонение в последните три позиции на въведения репертоар (допълнителна фигура 2е).В заключение заключихме, че качеството и разнообразието на библиотеката са приемливи и се наблюдават само незначителни промени в разнообразието поради амплификация и подготовка на фагови библиотеки между няколко кръга на селекция.
Серийно вземане на проби от цереброспинална течност може да се извърши чрез хирургично имплантиране на канюла в CM на плъхове в съзнание, за да се улесни идентифицирането на Т7 фаг, инжектиран интравенозно (iv) през BBB и/или BCSFB (фиг. 1a-b).Използвахме две независими рамена за селекция (рамена A и B) в първите три кръга на in vivo селекция (фиг. 1c).Постепенно увеличихме строгостта на селекцията чрез намаляване на общото количество фаги, въведени в първите три кръга на селекция.За четвъртия кръг на панорамиране комбинирахме проби от клонове A и B и извършихме три допълнителни независими селекции.За да се изследват in vivo свойствата на Т7 фаговите частици в този модел, фаг от див тип (PAGISRELVDKL master insert) се инжектира в плъхове през опашната вена.Възстановяването на фаги от цереброспиналната течност и кръвта в различни моменти от време показа, че сравнително малки T7 икосаедрични фаги имат бърза начална фаза на изчистване от кръвното отделение (допълнителна фигура 3).Въз основа на приложените титри и кръвния обем на плъховете, ние изчислихме, че само приблизително 1% тегл.фаг от приложената доза се открива в кръвта 10 минути след интравенозно инжектиране.След този първоначален бърз спад е измерен по-бавен първичен клирънс с полуживот от 27,7 минути.Важно е, че само много малко фаги бяха извлечени от отделението на CSF, което показва нисък фон за миграция на фаги от див тип в отделението на CSF (допълнителна фигура 3).Средно само около 1 х 10-3% титри на Т7 фаг в кръвта и 4 х 10-8% от първоначално инфузираните фаги бяха открити в цереброспиналната течност през целия период на вземане на проби (0-250 минути).Трябва да се отбележи, че полуживотът (25,7 минути) на фаг от див тип в цереброспиналната течност е подобен на този, наблюдаван в кръвта.Тези данни показват, че бариерата, разделяща отделението на CSF от кръвта, е непокътната при плъхове с CM канюла, което позволява in vivo селекция на фагови библиотеки за идентифициране на клонове, които лесно се транспортират от кръвта в отделението на CSF.
(a) Създаване на метод за повторно вземане на проби от цереброспинална течност (CSF) от голям басейн.(b) Диаграма, показваща клетъчното местоположение на бариерата на централната нервна система (ЦНС) и стратегията за избор, използвана за идентифициране на пептиди, които преминават кръвно-мозъчната бариера (BBB) ​​и кръвно-мозъчната бариера.(c) Блок-схема за скрининг на in vivo фагов дисплей.Във всеки кръг на селекция, фаги (идентификатори на животни вътре в стрелките) бяха инжектирани интравенозно.Два независими алтернативни клона (A, B) се държат отделно до 4-ия кръг на подбор.За селекционни кръгове 3 и 4, всеки фагов клон, извлечен от CSF, беше ръчно секвениран.(d) Кинетика на фаг, изолиран от кръв (червени кръгове) и цереброспинална течност (зелени триъгълници) по време на първия кръг на селекция в два канюлирани плъха след интравенозно инжектиране на Т7 пептидна библиотека (2 х 1012 фага/животно).Сините квадрати показват средната първоначална концентрация на фаг в кръвта, изчислена от количеството инжектиран фаг, като се вземе предвид общият кръвен обем.Черните квадратчета показват точката на пресичане на линията y, екстраполирана от концентрациите на кръвни фаги.(e,f) Представете относителната честота и разпределение на всички възможни припокриващи се трипептидни мотиви, намерени в пептида.Показан е броят на мотивите, открити при 1000 четения.Значително (p <0.001) обогатените мотиви са маркирани с червени точки.(e) Корелационна диаграма на разсейване, сравняваща относителната честота на трипептидния мотив на инжектираната библиотека с фаг, получен от кръв от животни #1.1 и #1.2.(f) Диаграма на разсейване на корелация, сравняваща относителните честоти на трипептидни мотиви #1.1 и #1.2 на животински фаги, изолирани в кръв и цереброспинална течност.(g, h) ID представяне на последователност на фаг, обогатен в кръв (g) спрямо инжектирани библиотеки и фаг, обогатен в CSF (h) спрямо кръв след кръг от in vivo селекция при двете животни.Размерът на еднобуквения код показва колко често тази аминокиселина се среща на тази позиция.Зелено = полярни, лилаво = неутрални, синьо = основни, червено = киселинни и черни = хидрофобни аминокиселини.Фигура 1a, b е проектирана и произведена от Eduard Urich.
Ние инжектирахме фагова пептидна библиотека в два CM инструментални плъха (клади A и B) и изолирахме фаг от цереброспинална течност и кръв (Фигура 1d).Първоначалното бързо изчистване на библиотеката е по-слабо изразено в сравнение с фага от див тип.Средният полуживот на инжектираната библиотека и при двете животни е 24,8 минути в кръвта, подобно на фаг от див тип, и 38,5 минути в CSF.Проби от фаги от кръв и цереброспинална течност от всяко животно бяха подложени на HTS и всички идентифицирани пептиди бяха анализирани за наличието на къс трипептиден мотив.Трипептидните мотиви бяха избрани, защото те осигуряват минимална основа за образуване на структура и взаимодействия пептид-протеин 14, 15.Открихме добра корелация в разпределението на мотивите между инжектираната фагова библиотека и клоновете, извлечени от кръвта на двете животни (фиг. 1е).Данните показват, че съставът на библиотеката е само незначително обогатен в отделението за кръв.Честотите на аминокиселините и консенсусните последователности бяха допълнително анализирани на всяка позиция с помощта на адаптация на софтуера Weblogo16.Интересното е, че открихме силно обогатяване на остатъците от глицин в кръвта (фиг. 1g).Когато кръвта се сравнява с клонинги, избрани от CSF, се наблюдава силна селекция и известна деселекция на мотиви (Фиг. 1f) и някои аминокиселини присъстват за предпочитане в предварително определени позиции в 12-членния (Фиг. 1h).По-специално, отделните животни се различават значително в цереброспиналната течност, докато обогатяването на кръвта с глицин се наблюдава и при двете животни (допълнителна фигура 4a-j).След строго филтриране на данни за последователности в цереброспиналната течност на животни # 1.1 и # 1.2, бяха получени общо 964 и 420 уникални 12-мерни пептида (допълнителна фигура 1d-e).Изолираните фагови клонове бяха амплифицирани и подложени на втори кръг от in vivo селекция.Фаги, извлечени от втория кръг на селекция, бяха подложени на HTS във всяко животно и всички идентифицирани пептиди бяха използвани като вход към програма за разпознаване на мотиви, за да се анализира появата на трипептидни мотиви (Фиг. 2a, b, ef).В сравнение с първия цикъл на фага, възстановен от CSF, ние наблюдавахме по-нататъшна селекция и деселекция на много мотиви в CSF в клонове A и B (фиг. 2).Беше приложен алгоритъм за идентификация на мрежата, за да се определи дали те представляват различни модели на последователна последователност.Наблюдава се ясно сходство между 12-измерните последователности, възстановени от CSF в алтернативен клад A (Фиг. 2c, d) и клад B (Фиг. 2g, h).Обединеният анализ във всеки клон разкри различни профили на селекция за 12-mer пептиди (допълнителна фигура 5c, d) и увеличение на съотношението титър на CSF/кръв с течение на времето за обединени клонове след втория кръг на селекция в сравнение с първия кръг на селекция (допълнителна фигура 5e).).
Обогатяване на мотиви и пептиди в цереброспиналната течност чрез два последователни кръга на in vivo селекция на функционален фагов дисплей.
Всички фаги на цереброспиналната течност, възстановени от първия цикъл на всяко животно (животни #1.1 и #1.2) бяха събрани, амплифицирани, НТ-секвенирани и повторно инжектирани заедно (2 х 1010 фаги/животно) 2 SM канюлирани плъхове (#1.1 → #).2.1 и 2.2, 1.2 → 2.3 и 2.4).(a, b, e, f) Диаграми на корелационно разсейване, сравняващи относителната честота на трипептидните мотиви на всички получени от CSF фаги в първия и втория кръг на селекция.Относителна честота и разпределение на мотиви, представляващи всички възможни припокриващи се трипептиди, открити в пептиди в двете ориентации.Показан е броят на мотивите, открити при 1000 четения.Мотиви, които са били значително (p <0.001) избрани или изключени в една от сравняваните библиотеки, са подчертани с червени точки.(c, d, g, h) Представяне на лого на последователност на всички богати на CSF последователности с дължина 12 аминокиселини, базирани на кръгове 2 и 1 на in vivo селекция.Размерът на еднобуквения код показва колко често тази аминокиселина се среща на тази позиция.За да се представи логото, честотата на последователностите на CSF, извлечени от отделни животни между два кръга на селекция, се сравнява и се показват обогатените последователности във втория кръг: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 и (h) #1.2–#2.4.Най-обогатените аминокиселини на дадена позиция в (c, d) животни не.2.1 и бр.2.2 или (g, h) при животни бр.2.3 и бр.2.4 са показани в цвят.Зелено = полярни, лилаво = неутрални, синьо = основни, червено = киселинни и черни = хидрофобни аминокиселини.
След третия кръг на селекция, ние идентифицирахме 124 уникални пептидни последователности (#3.1 и #3.2) от 332 CSF-реконституирани фагови клона, изолирани от две животни (допълнителна фигура 6а).Последователността LGSVS (18,7%) има най-висок относителен дял, последвана от вложките от див тип PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) и SARGSWREIVSLS (2,2%).В последния четвърти кръг събрахме два независимо избрани клона от три отделни животни (фиг. 1в).От 925 секвенирани фагови клонинги, възстановени от CSF, в четвъртия кръг открихме 64 уникални пептидни последователности (допълнителна фигура 6b), сред които относителният дял на фаг от див тип спадна до 0,8%.Най-често срещаните CSF клонове в четвъртия кръг бяха LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) и RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Диапазонът на дължината на избраните пептиди се дължи на нуклеотидни вмъквания/заличавания или преждевременни стоп кодони в праймерите на библиотеката, когато се използват изродени кодони за дизайн на NNK библиотека.Преждевременните стоп кодони генерират по-къси пептиди и са избрани, защото съдържат благоприятния аа мотив.По-дългите пептиди могат да бъдат резултат от вмъквания/изтривания в праймерите на синтетичните библиотеки.Това позиционира проектирания стоп кодон извън рамката и го чете, докато се появи нов стоп кодон надолу по веригата.Като цяло изчислихме коефициентите на обогатяване за всичките четири кръга на подбор чрез сравняване на входните данни с изходните данни на извадката.За първия кръг от скрининга използвахме титри на фаги от див тип като неспецифична фонова референция.Интересното е, че отрицателната фагова селекция е много силна в първия цикъл на CSF, но не и в кръвта (фиг. 3a), което може да се дължи на ниската вероятност за пасивна дифузия на повечето членове на пептидната библиотека в отделението на CSF или относителните фаги са склонни да бъдат по-ефективно задържани или отстранени от кръвния поток, отколкото бактериофагите.Въпреки това, във втория кръг на панорамиране, се наблюдава силна селекция на фаги в CSF и в двата класа, което предполага, че предишният кръг е обогатен с фаги, показващи пептиди, които насърчават усвояването на CSF (фиг. 3a).Отново без значително обогатяване на кръвта.Също така в третия и четвъртия кръг, фаговите клонове бяха значително обогатени в CSF.Сравнявайки относителната честота на всяка уникална пептидна последователност между последните два кръга на селекция, открихме, че последователностите са още по-обогатени в четвъртия кръг на селекция (фиг. 3b).Общо 931 трипептидни мотива бяха извлечени от всичките 64 уникални пептидни последователности, като се използваха и двете пептидни ориентации.Най-обогатените мотиви в четвъртия кръг бяха по-внимателно изследвани за техните профили на обогатяване във всички кръгове в сравнение с инжектираната библиотека (прекъсване: 10% обогатяване) (допълнителна фигура 6c).Общите модели на селекция показват, че повечето от изследваните мотиви са обогатени във всички предишни кръгове на двата клона на селекция.Въпреки това, някои мотиви (напр. SGL, VSG, LGS GSV) са предимно от алтернативен клад A, докато други (напр. FGW, RTN, WGF, NTR) са обогатени с алтернативен клад B.
Валидиране на транспорта на CSF на обогатени с CSF фагово показани пептиди и биотинилирани лидерни пептиди, конюгирани към стрептавидинови полезни товари.
(a) Коефициенти на обогатяване, изчислени във всичките четири кръга (R1-R4) на базата на инжектирани (вход = I) титри на фаги (PFU) и определени титри на фаги в CSF (изход = O).Коефициентите на обогатяване за последните три кръга (R2-R4) бяха изчислени чрез сравнение с предишния кръг и първия кръг (R1) с данни за теглото.Отворените ленти са цереброспинална течност, щрихите ленти са плазма.(***p<0,001, базирано на t-теста на Student).(b) Списък на най-разпространените фагови пептиди, класирани според тяхното относително съотношение към всички фаги, събрани в CSF след кръг 4 на селекция.Шестте най-често срещани фагови клона са подчертани с цвят, номерирани и техните фактори на обогатяване между кръгове 3 и 4 на селекцията (вмъквания).(c, d) Шестте най-обогатени фагови клонинги, празни фагови и родителски фагови пептидни библиотеки от кръг 4 бяха анализирани индивидуално в модел за вземане на проби от CSF.CSF и кръвни проби бяха събрани в посочените времеви точки.(c) Равни количества от 6 кандидат фагови клонинга (2 x 1010 фаги/животни), празни фаги (#1779) (2 x 1010 фаги/животни) и фагови пептидни библиотеки (2 x 1012 фаги/животни) Инжектирайте най-малко 3 CM се прилагат на канюлираното животно отделно през опашната вена.Показана е фармакокинетиката на CSF на всеки инжектиран фагов клонинг и фагова пептидна библиотека с течение на времето.(d) показва средното съотношение CSF/кръв за всички възстановени фаги/mL за времето за вземане на проби.(e) Четири синтетични водещи пептида и един разбъркан контрол се свързват с биотин към стрептавидин чрез техния N-край (тетрамерен дисплей), последвано от инжектиране (вена на опашката iv, 10 mg стрептавидин/kg).Най-малко три интубирани плъха (N = 3).).Пробите от CSF бяха събрани в посочените времеви точки и концентрациите на стрептавидин бяха измерени чрез CSF анти-стрептавидин ELISA (nd = не е открит).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, базирано на ANOVA тест).(f) Сравнение на аминокиселинната последователност на най-обогатения фагов пептиден клон #2002 (лилав) с други избрани фагови пептидни клонове от 4-тия кръг на селекция.Идентични и подобни аминокиселинни фрагменти са цветно кодирани.
От всички обогатени фаги в четвъртия кръг (фиг. 3b), шест кандидат клона бяха избрани за по-нататъшен индивидуален анализ в модела за вземане на проби от CSF.Равни количества от шест кандидат фаги, празни фаги (без вмъкване) и профаг пептидни библиотеки бяха инжектирани в три канюлирани CM животни и фармакокинетиката беше определена в CSF (Фиг. 3c) и кръв (Допълнителна Фигура 7).Всички тествани фагови клонове са насочени към отделението на CSF на ниво 10-1000 пъти по-високо от това на празния контролен фаг (#1779).Например, клонове #2020 и #2077 имат около 1000 пъти по-високи титри на CSF от контролния фаг.Фармакокинетичният профил на всеки избран пептид е различен, но всички те имат висока способност за насочване на CSF.Наблюдавахме постоянно намаляване във времето за клонове #1903 и #2011, докато за клонове #2077, #2002 и #2009 увеличение през първите 10 минути може да означава активен транспорт, но трябва да бъде потвърдено.Клонове #2020, #2002 и #2077 се стабилизираха на високи нива, докато концентрацията на CSF на клон #2009 бавно намалява след първоначалното увеличение.След това сравнихме относителната честота на всеки кандидат за CSF с концентрацията му в кръвта (фиг. 3d).Корелацията на средния титър на всеки кандидат CSF с неговия кръвен титър през всички моменти на вземане на проби показа, че трима от шестте кандидати са значително обогатени с кръв CSF.Интересното е, че клон #2077 показва по-висока стабилност на кръвта (допълнителна фигура 7).За да потвърдим, че самите пептиди са способни активно да транспортират товари, различни от фагови частици, в отделението на CSF, ние синтезирахме четири водещи пептида, дериватизирани с биотин в N-края, където пептидите се прикрепят към фаговата частица.Биотинилираните пептиди (№ 2002, 2009, 2020 и 2077) бяха конюгирани със стрептавидин (SA), за да се получат мултимерни форми, имитиращи донякъде геометрията на фага.Този формат също ни позволи да измерим експозицията на SA в кръвта и цереброспиналната течност като протеинови пептиди, транспортиращи товара.Важно е, че фаговите данни често могат да бъдат възпроизведени, когато синтетичните пептиди се прилагат в този SA-конюгиран формат (Фиг. 3е).Разбърканите пептиди имат по-малка първоначална експозиция и по-бързо изчистване на CSF с неоткриваеми нива в рамките на 48 часа.За да придобием представа за пътищата на доставяне на тези пептидни фагови клонинги в CSF пространството, ние анализирахме локализацията на отделните фагови пептидни удари, използвайки имунохистохимия (IHC) за директно откриване на фагови частици 1 час след интравенозно инжектиране in vivo.По-специално, клонове #2002, #2077 и #2009 могат да бъдат открити чрез силно оцветяване в мозъчните капиляри, докато контролният фаг (#1779) и клонинг #2020 не са открити (допълнителна фигура 8).Това предполага, че тези пептиди допринасят за ефекта върху мозъка именно чрез пресичане на BBB.Необходим е допълнителен подробен анализ, за ​​да се тества тази хипотеза, тъй като маршрутът на BSCFB също може да бъде включен.При сравняване на аминокиселинната последователност на най-обогатения клонинг (#2002) с други избрани пептиди, беше отбелязано, че някои от тях имат подобни аминокиселинни разширения, което може да показва подобен транспортен механизъм (фиг. 3f).
Благодарение на своя уникален плазмен профил и значително увеличение на CSF с течение на времето, клонинг на фагов дисплей #2077 беше допълнително изследван за по-дълъг период от 48 часа и успя да възпроизведе бързото нарастване на CSF, наблюдавано във връзка с устойчиви нива на SA (фиг. 4a).По отношение на други идентифицирани фагови клонове, #2077 се оцвети силно за мозъчни капиляри и показа значителна колокализация с лектин на капилярен маркер, когато се гледа при по-висока разделителна способност и вероятно известно оцветяване в паренхимното пространство (Фигура 4b).За да изследваме дали медиираните от пептиди фармакологични ефекти могат да бъдат получени в ЦНС, ние проведохме експеримент, в който биотинилирани версии на i) #2077 транзитния пептид и ii) BACE1 инхибиторния пептид бяха смесени със SA в две различни съотношения.За една комбинация използвахме само BACE1 пептиден инхибитор, а за другата използвахме съотношение 1:3 на BACE1 пептиден инхибитор към #2077 пептид.И двете проби бяха приложени интравенозно и нивата на бета-амилоиден пептид 40 (Abeta40) в кръвта и цереброспиналната течност бяха измерени във времето.Abeta40 се измерва в CSF, тъй като отразява BACE1 инхибирането в мозъчния паренхим.Както се очаква, и двата комплекса значително намаляват кръвните нива на Abeta40 (фиг. 4c, d).Въпреки това, само проби, съдържащи смес от пептиди №.2077 и инхибитор на пептида BACE1, конюгиран към SA, причиняват значително намаляване на Abeta40 в цереброспиналната течност (фиг. 4с).Данните показват, че пептид No.2077 е в състояние да транспортира 60 kDa SA протеин в ЦНС и също така предизвиква фармакологични ефекти със SA-конюгирани инхибитори на BACE1 пептида.
(a) Клонално инжектиране (2 × 10 фаги/животно) на Т7 фаг, показващ дългосрочни фармакокинетични профили на CSF пептид #2077 (RLSSVDSDLSGC) и неинжектиран контролен фаг (#1779) в най-малко три CM-интубирани плъха.( b ) Конфокално микроскопско изображение на представителни кортикални микросъдове в плъхове, инжектирани с фаг (2 × 10 10 фаги/животно), показващо обратно оцветяване на пептид # 2077 и съдове (лектин).Тези фагови клонове се прилагат на 3 плъха и се оставят да циркулират в продължение на 1 час преди перфузия.Мозъците бяха разрязани и оцветени с поликлонални FITC-белязани антитела срещу Т7 фаговия капсид.Десет минути преди перфузията и последващата фиксация, DyLight594-маркиран лектин се прилага интравенозно.Флуоресцентни изображения, показващи оцветяване с лектин (червено) на луминалната страна на микросъдове и фаги (зелено) в лумена на капилярите и периваскуларната мозъчна тъкан.Лентата на скалата съответства на 10 µm.(c, d) Биотинилиран BACE1 инхибиторен пептид самостоятелно или в комбинация с биотинилиран транзитен пептид #2077 се свързва със стрептавидин, последвано от интравенозно инжектиране на най-малко три канюлирани CM плъха (10 mg стрептавидин/kg).Медиираната от BACE1 пептид инхибитор редукция на Ар40 се измерва чрез Ар1-40 ELISA в кръв (червено) и цереброспинална течност (оранжево) в посочените времеви точки.За по-голяма яснота на графиката е начертана пунктирана линия в мащаб 100%.(c) Процентно намаление на Aβ40 в кръвта (червени триъгълници) и цереброспиналната течност (оранжеви триъгълници) при плъхове, третирани със стрептавидин, конюгиран с транзитен пептид #2077 и BACE1 инхибиторен пептид в съотношение 3:1.(d) Процентно намаление в кръвта Aβ40 (червени кръгове) и цереброспиналната течност (оранжеви кръгове) на плъхове, третирани със стрептавидин, свързан само с BACE1 инхибиторен пептид.Концентрацията на Ар в контролата е 420 pg/ml (стандартно отклонение = 101 pg/ml).
Фаговият дисплей се прилага успешно в няколко области на биомедицинските изследвания17.Този метод е използван за in vivo изследвания на васкуларното разнообразие 18, 19, както и проучвания, насочени към церебрални съдове 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26.В това проучване ние разширихме приложението на този метод за подбор не само за директната идентификация на пептиди, насочени към мозъчните съдове, но и за откриването на кандидати с активни транспортни свойства за преминаване на кръвно-мозъчната бариера.Сега описваме разработването на in vivo процедура за селекция в CM интубирани плъхове и демонстрираме нейния потенциал за идентифициране на пептиди със свойства на насочване на CSF.Използвайки Т7 фага, показващ библиотека от 12-мерни произволни пептиди, успяхме да демонстрираме, че Т7 фагът е достатъчно малък (приблизително 60 nm в диаметър)10, за да бъде адаптиран към кръвно-мозъчната бариера, като по този начин директно пресича кръвно-мозъчната бариера или хороидния сплит.Ние наблюдавахме, че събирането на CSF от канюлирани CM плъхове е добре контролиран метод за функционален скрининг in vivo и че екстрахираният фаг не само се свързва с васкулатурата, но също така функционира като транспортер през кръвно-мозъчната бариера.Освен това, чрез едновременно събиране на кръв и прилагане на HTS към CSF ​​и фаги, получени от кръв, ние потвърдихме, че нашият избор на CSF не е повлиян от обогатяване на кръвта или годност за разширяване между кръговете на селекция.Кръвният компартмент обаче е част от процедурата за подбор, тъй като фагите, способни да достигнат до CSF компартмента, трябва да оцелеят и да циркулират в кръвния поток достатъчно дълго, за да се обогатят в мозъка.За да извлечем надеждна информация за последователността от необработените HTS данни, внедрихме филтри, адаптирани към специфични за платформата грешки в последователността в работния процес на анализа.Чрез включване на кинетични параметри в метода за скрининг, ние потвърдихме бързата фармакокинетика на фаги от див тип Т7 (t½ ~ 28 минути) в кръвта 24, 27, 28 и също така определихме техния полуживот в цереброспиналната течност (t½ ~ 26 минути) на минута).Въпреки сходните фармакокинетични профили в кръвта и CSF, само 0,001% от кръвната концентрация на фаг може да бъде открита в CSF, което показва ниска фонова мобилност на фаг от див тип T7 през кръвно-мозъчната бариера.Тази работа подчертава значението на първия кръг на селекция при използване на in vivo стратегии за панорамиране, особено за фагови системи, които бързо се изчистват от циркулацията, тъй като малко клонове са в състояние да достигнат отделението на ЦНС.По този начин, в първия кръг, намаляването на библиотечното разнообразие беше много голямо, тъй като само ограничен брой клонинги в крайна сметка бяха събрани в този много строг CSF модел.Тази in vivo стратегия за панорамиране включва няколко стъпки за селекция, като активно натрупване в отделението на CSF, оцеляване на клонинга в отделението за кръв и бързо отстраняване на клонове на T7 фаг от кръвта в рамките на първите 10 минути (Фигура 1d и Допълнителна фигура 4M).).По този начин, след първия кръг, различни фагови клонове бяха идентифицирани в CSF, въпреки че същият първоначален пул беше използван за отделни животни.Това предполага, че множеството стриктни стъпки за подбор за библиотеки източници с голям брой членове на библиотеката водят до значително намаляване на разнообразието.Следователно случайните събития ще станат неразделна част от първоначалния процес на подбор, оказвайки значително влияние върху резултата.Вероятно много от клонингите в оригиналната библиотека са имали много подобна склонност към обогатяване на CSF.Въпреки това, дори при едни и същи експериментални условия, резултатите от селекцията могат да се различават поради малкия брой на всеки отделен клонинг в първоначалния пул.
Мотивите, обогатени с CSF, се различават от тези в кръвта.Интересното е, че отбелязахме първата промяна към богати на глицин пептиди в кръвта на отделни животни.(Фиг. 1g, допълнителни фигури 4e, 4f).Фаги, съдържащи глицинови пептиди, може да са по-стабилни и е по-малко вероятно да бъдат извадени от циркулация.Въпреки това, тези богати на глицин пептиди не са открити в пробите от гръбначно-мозъчната течност, което предполага, че подбраните библиотеки са преминали през две различни стъпки на селекция: една в кръвта и друга е оставена да се натрупа в цереброспиналната течност.Обогатените с CSF клонинги, получени в резултат на четвъртия кръг на селекция, са обстойно тествани.Потвърдено е, че почти всички индивидуално тествани клонове са обогатени с CSF в сравнение с празния контролен фаг.Едно пептидно попадение (#2077) беше изследвано по-подробно.Той показа по-дълъг плазмен полуживот в сравнение с други попадения (Фигура 3d и Допълнителна фигура 7) и интересното е, че този пептид съдържа цистеинов остатък в С-края.Наскоро беше показано, че добавянето на цистеин към пептидите може да подобри техните фармакокинетични свойства чрез свързване с албумин 29.Понастоящем това е неизвестно за пептид #2077 и изисква допълнително проучване.Някои пептиди показват зависимост от валентност в обогатяването на CSF (данните не са показани), което може да е свързано с показаната повърхностна геометрия на Т7 капсида.Системата T7, която използвахме, показа 5-15 копия на всеки пептид на фагова частица.IHC се извършва върху кандидат-олово фагови клонове, инжектирани интравенозно в мозъчната кора на плъхове (допълнителна фигура 8).Данните показват, че най-малко три клонинга (№ 2002, № 2009 и № 2077) са взаимодействали с BBB.Остава да се определи дали това взаимодействие на BBB води до натрупване на CSF или движението на тези клонове директно към BCSFB.Важно е, че ние показваме, че избраните пептиди запазват своя капацитет за транспортиране на CSF, когато се синтезират и се свързват с протеиновия товар.Свързването на N-терминални биотинилирани пептиди към SA по същество повтаря резултатите, получени с техните съответни фагови клонинги в кръвта и цереброспиналната течност (фиг. 3е).И накрая, ние показваме, че водещият пептид #2077 е в състояние да насърчи мозъчното действие на биотинилиран пептиден инхибитор на BACE1, конюгиран към SA, причинявайки изразени фармакодинамични ефекти в ЦНС чрез значително намаляване на нивата на Abeta40 в CSF (фиг. 4).Не успяхме да идентифицираме никакви хомолози в базата данни чрез извършване на търсене на хомоложност на пептидна последователност на всички попадения.Важно е да се отбележи, че размерът на библиотеката T7 е приблизително 109, докато теоретичният размер на библиотеката за 12-mers е 4 x 1015. Следователно, ние избрахме само малка част от пространството на разнообразието на 12-mer пептидната библиотека, което може да означава, че по-оптимизирани пептиди могат да бъдат идентифицирани чрез оценка на съседното пространство на последователността на тези идентифицирани хитове.Хипотетично, една от причините, поради които не сме открили естествени хомолози на тези пептиди, може да бъде деселекция по време на еволюцията, за да се предотврати неконтролираното навлизане на определени пептидни мотиви в мозъка.
Взети заедно, нашите резултати осигуряват основа за бъдеща работа за идентифициране и характеризиране на транспортните системи на цереброваскуларната бариера in vivo по-подробно.Основната настройка на този метод се основава на стратегия за функционална селекция, която не само идентифицира клонинги със свойства на мозъчно-съдово свързване, но също така включва критична стъпка, в която успешните клонинги имат присъща активност за преминаване на биологични бариери in vivo в отделението на ЦНС.е да се изясни механизмът на транспортиране на тези пептиди и тяхното предпочитание за свързване към микроваскулатурата, специфична за мозъчната област.Това може да доведе до откриването на нови пътища за транспорт на BBB и рецептори.Очакваме, че идентифицираните пептиди могат директно да се свържат с цереброваскуларни рецептори или с циркулиращи лиганди, транспортирани през BBB или BCSFB.Пептидните вектори с CSF транспортна активност, открити в тази работа, ще бъдат допълнително изследвани.В момента изследваме мозъчната специфика на тези пептиди за тяхната способност да преминават през BBB и/или BCSFB.Тези нови пептиди ще бъдат изключително ценни инструменти за потенциалното откриване на нови рецептори или пътища и за разработването на нови високоефективни платформи за доставяне на макромолекули, като биологични, до мозъка.
Канюлирайте голямата цистерна (CM), като използвате модификация на описания по-горе метод.Анестезирани плъхове Wistar (200-350 g) се монтират на стереотаксичен апарат и се прави среден разрез върху обръснатия и асептично подготвен скалп, за да се разкрие черепът.Пробийте два отвора в областта на горното крило и завийте фиксиращите винтове в отворите.Беше пробит допълнителен отвор в страничния тилен гребен за стереотактично насочване на канюла от неръждаема стомана в CM.Нанесете дентален цимент около канюлата и я закрепете с винтове.След фотовтвърдяване и втвърдяване на цимента, кожната рана беше затворена с 4/0 супрамиден шев.Правилното поставяне на канюлата се потвърждава от спонтанно изтичане на цереброспинална течност (CSF).Отстранете плъха от стереотаксичния апарат, получете подходяща следоперативна грижа и лечение на болката и го оставете да се възстанови поне една седмица, докато се наблюдават признаци на кръв в цереброспиналната течност.Плъхове Wistar (Crl:WI/Han) са получени от Charles River (Франция).Всички плъхове бяха държани при специфични условия без патогени.Всички експерименти с животни бяха одобрени от Ветеринарната служба на град Базел, Швейцария, и бяха извършени в съответствие с Лиценз за животни № 2474 (Оценка на активния мозъчен транспорт чрез измерване на нивата на терапевтични кандидати в цереброспиналната течност и мозъка на плъх).
Внимателно поддържайте плъха в съзнание с CM канюлата в ръка.Отстранете Datura от канюлата и вземете 10 µl спонтанно течаща цереброспинална течност.Тъй като проходимостта на канюлата в крайна сметка беше компрометирана, в това изследване бяха включени само проби от прозрачна цереброспинална течност без доказателства за замърсяване на кръвта или обезцветяване.Успоредно с това се вземат приблизително 10–20 μl кръв от малък разрез на върха на опашката в епруветки с хепарин (Sigma-Aldrich).CSF и кръв се събират в различни моменти от време след интравенозно инжектиране на Т7 фаг.Приблизително 5-10 μl течност се изхвърлят преди всяка проба от CSF да бъде събрана, което съответства на мъртвия обем на катетъра.
Библиотеките бяха генерирани с помощта на вектора T7Select 10-3b, както е описано в ръководството на системата T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Накратко, произволна 12-мерна ДНК вложка беше синтезирана в следния формат:
NNK кодонът се използва, за да се избегнат двойни стоп кодони и свръхекспресия на аминокиселини във вмъкването.N е ръчно смесено еквимоларно съотношение на всеки нуклеотид, а K е ръчно смесено еквимоларно съотношение на аденинови и цитозинови нуклеотиди.Едноверижни региони се превръщат в двойноверижна ДНК чрез допълнително инкубиране с dNTP (Novagen) и ензим Klenow (New England Biolabs) в буфер Klenow (New England Biolabs) в продължение на 3 часа при 37°C.След реакцията, двойноверижната ДНК се възстановява чрез утаяване с EtOH.Получената ДНК се усвоява с рестрикционни ензими EcoRI и HindIII (и двата от Roche).Разцепената и пречистена (QIAquick, Qiagen) инсерция (Т4 лигаза, New England Biolabs) след това се лигира в рамка в предварително разцепен Т7 вектор след аминокиселина 348 на 10В капсидния ген.Реакциите на лигиране се инкубират при 16°С в продължение на 18 часа преди in vitro опаковане.Фаговото опаковане in vitro се извършва съгласно инструкциите, доставени с комплекта за клониране T7Select 10-3b (Novagen) и опаковъчният разтвор се амплифицира веднъж до лизиране с помощта на Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Лизатите се центрофугират, титруват и замразяват при -80°С като изходен разтвор на глицерол.
Директно PCR амплифициране на променливи региони на фаг, амплифицирани в бульон или плоча, като се използват патентовани 454/Roche-amplicon слети праймери.Праймерът за предно сливане съдържа последователности, обграждащи променливата област (NNK) 12 (специфична за шаблона), GS FLX Titanium Adapter A и ключова последователност на библиотека с четири бази (TCAG) (допълнителна фигура 1a):
Праймерът за обратно сливане също съдържа биотин, прикрепен към улавящи перли и GS FLX Titanium Adapter B, необходим за клонова амплификация по време на емулсионна PCR:
След това ампликоните бяха подложени на 454/Roche пиросеквениране съгласно протокола 454 GS-FLX Titanium.За ръчно секвениране на Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), ДНК на T7 фаг се амплифицира чрез PCR и се секвенира със следните двойки праймери:
Вмъкванията от отделни плаки бяха подложени на PCR амплификация с помощта на Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (съгласно инструкциите на производителя).Извършете горещ старт (10 минути при 95 °C) и 35 цикъла на усилване (50 s при 95 °C, 1 минута при 50 °C и 1 минута при 72 °C).
Фаг от библиотеки, фаг от див тип, фаг, спасен от CSF и кръв, или индивидуални клонове бяха амплифицирани в Escherichia coli BL5615 в TB бульон (Sigma Aldrich) или в 500 cm2 блюда (Thermo Scientific) в продължение на 4 часа при 37°C.Фагите се екстрахират от плочите чрез изплакване на плочите с Tris-EDTA буфер (Fluka Analytical) или чрез събиране на плаките със стерилни върхове на пипети.Фагите се изолират от супернатантата на културата или екстракционния буфер с един кръг от утаяване с полиетилен гликол (PEG 8000) (Promega) и се ресуспендират в Tris-EDTA буфер.
Амплифицираният фаг беше подложен на 2-3 кръга на отстраняване на ендотоксин с помощта на гранули за отстраняване на ендотоксин (Miltenyi Biotec) преди интравенозно (IV) инжектиране (500 μl/животно).В първия кръг бяха въведени 2 × 1012 фага;във втория, 2 × 1010 фаги;в третия и четвъртия кръг на селекция, 2 × 109 фаги на животно.Съдържанието на фаги в CSF и кръвни проби, събрани в посочените времеви точки, се определя чрез преброяване на плаките съгласно инструкциите на производителя (T7Select system manual).Изборът на фаг се извършва чрез интравенозно инжектиране на пречистени библиотеки в опашната вена или чрез повторно инжектиране на фаг, извлечен от CSF от предишния кръг на селекция, и последващите събирания се извършват на 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min и 240 min съответно CSF и кръвни проби.Бяха проведени общо четири кръга на in vivo панорамиране, в които двата избрани клона бяха отделно съхранени и анализирани по време на първите три кръга на селекция.Всички фагови инсерти, извлечени от CSF от първите два кръга на селекция, бяха подложени на 454/Roche пиросеквениране, докато всички клонинги, извлечени от CSF от последните два кръга на селекция, бяха секвенирани ръчно.Всички кръвни фаги от първия кръг на селекция също бяха подложени на 454/Roche пиросеквениране.За инжектиране на фагови клонове избраните фаги се амплифицират в Е. coli (BL5615) върху 500 cm2 плаки при 37°С в продължение на 4 часа.Индивидуално избрани и ръчно секвенирани клонове се размножават в TB среда.След екстракция на фаги, пречистване и отстраняване на ендотоксин (както е описано по-горе), 2 × 1010 фаги/животно в 300 μl се инжектират интравенозно в една опашна вена.
Предварителна обработка и качествено филтриране на последователни данни.Необработените данни 454/Roche бяха преобразувани от двоичен стандартен формат на картата на потока (sff) в четим от човека формат на Pearson (fasta) с помощта на софтуер на доставчика.По-нататъшната обработка на нуклеотидната последователност беше извършена с помощта на патентовани C програми и скриптове (непубликуван софтуерен пакет), както е описано по-долу.Анализът на първичните данни включва строги многоетапни процедури за филтриране.За да се филтрират показанията, които не съдържат валидна 12-мерна вмъкната ДНК последователност, показанията бяха последователно подравнени към начален етикет (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), стоп етикет (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) и фоново вмъкване (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) с помощта на глобалния тест на Needleman-Wunsch.подравняване, позволяващо до 2 несъответствия на подравняване31.Следователно, четения без етикети за начало и спиране и четения, съдържащи фонови вмъквания, т.е. подравнявания, които надвишават разрешения брой несъответствия, бяха премахнати от библиотеката.Що се отнася до останалите четения, N-mer ДНК последователността, простираща се от началната маркировка и завършваща преди стоп маркировката, беше изрязана от оригиналната прочетена последователност и допълнително обработена (наричана по-нататък „вмъкване“).След транслация на вмъкването, частта след първия стоп кодон в 5' края на праймера се отстранява от вмъкването.В допълнение, нуклеотиди, водещи до непълни кодони в 3' края на праймера, също бяха отстранени.За да се изключат вмъквания, съдържащи само фонови последователности, преведените вмъквания, започващи с аминокиселинния модел "PAG", също бяха премахнати.Пептиди с пост-транслационна дължина по-малка от 3 аминокиселини бяха отстранени от библиотеката.Накрая премахнете излишъка в пула на вмъкванията и определете честотата на всяко уникално вмъкване.Резултатите от този анализ включват списък от нуклеотидни последователности (вмъквания) и техните (прочетени) честоти (допълнителни фигури 1с и 2).
Групирайте N-mer ДНК вмъквания по сходство на последователности: За да се елиминират 454/Roche-специфични грешки в секвенирането (като проблеми със секвенирането на хомополимерни разширения) и премахване на по-малко важни излишъци, предварително филтрираните N-mer ДНК вмъквания (вмъквания) се сортират по сходство.вмъквания (дозволени са до 2 несъвпадащи бази), като се използва итеративен алгоритъм, дефиниран по следния начин: вмъкванията се сортират първо по тяхната честота (от най-високата към най-ниската) и ако са еднакви, чрез тяхното вторично сортиране по дължина (от най-дългата към най-късата)).Така най-честите и най-дългите вмъквания определят първата „група“.Груповата честота е зададена на ключовата честота.След това всяко вмъкване, останало в сортирания списък, се опита да бъде добавено към групата чрез подравняване по двойки на Needleman-Wunsch.Ако броят на несъответствията, вмъкванията или изтриванията в едно подравняване не надвишава праг от 2, вмъкването се добавя към групата и общата честота на групата се увеличава с това колко често е добавяно вмъкването.Вложките, добавени към група, се маркират като използвани и се изключват от по-нататъшна обработка.Ако последователността на вмъкване не може да бъде добавена към вече съществуваща група, последователността на вмъкване се използва за създаване на нова група с подходящата честота на вмъкване и се маркира като използвана.Итерацията приключва, когато всяка последователност на вмъкване е била използвана за формиране на нова група или може да бъде включена във вече съществуваща група.В края на краищата групираните вложки, състоящи се от нуклеотиди, в крайна сметка се транслират в пептидни последователности (пептидни библиотеки).Резултатът от този анализ е набор от вмъквания и съответните им честоти, които съставляват броя на последователните четения (допълнителна фигура 2).
Генериране на мотиви: Въз основа на списък от уникални пептиди е създадена библиотека, съдържаща всички възможни модели на аминокиселини (aa), както е показано по-долу.Всеки възможен модел с дължина 3 беше извлечен от пептида и неговият обратен модел беше добавен заедно с обща библиотека с мотиви, съдържаща всички модели (трипептиди).Библиотеки от силно повтарящи се мотиви бяха подредени и излишъкът беше премахнат.След това, за всеки трипептид в библиотеката с мотиви, проверихме за присъствието му в библиотеката, използвайки изчислителни инструменти.В този случай честотата на пептида, съдържащ открития мотивен трипептид, се добавя и се присвоява на мотива в библиотеката с мотиви („брой мотиви“).Резултатът от генерирането на мотив е двуизмерен масив, съдържащ всички появявания на трипептиди (мотиви) и техните съответни стойности, които са броят на четенията на последователността, които водят до съответния мотив, когато четенията са филтрирани, групирани и транслирани.Метрики, както е описано подробно по-горе.
Нормализиране на броя на мотивите и съответните диаграми на разсейване: Броят на мотивите за всяка проба се нормализира с помощта на
където ni е броят прочитания, съдържащи тема i.По този начин, vi представлява процентната честота на четения (или пептиди), съдържащи мотив i в пробата.P-стойностите за ненормализирания брой мотиви бяха изчислени с помощта на точния тест на Fisher.По отношение на корелограмите на броя на мотивите, корелациите на Spearman бяха изчислени с помощта на нормализирания брой мотиви с R.
За да се визуализира съдържанието на аминокиселини във всяка позиция в пептидната библиотека, бяха създадени уеб логограми 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).Първо, съдържанието на аминокиселини във всяка позиция на 12-мерния пептид се съхранява в 20×12 матрица.След това набор от 1000 пептида, съдържащи същото относително аминокиселинно съдържание във всяка позиция, се генерира във формат на бърза последователност и се предоставя като вход към уеб лого 3, което генерира графично представяне на относителното аминокиселинно съдържание във всяка позиция.за дадена пептидна библиотека.За визуализиране на многоизмерни набори от данни бяха създадени топлинни карти с помощта на вътрешно разработен инструмент в R (biosHeatmap, пакет R, който все още не е пуснат).Дендрограмите, представени в топлинните карти, бяха изчислени с помощта на метода на йерархично групиране на Ward с метрика на евклидовото разстояние.За статистически анализ на данните за оценяване на мотиви, P стойностите за ненормализирано оценяване бяха изчислени с помощта на точния тест на Fisher.P-стойностите за други набори от данни бяха изчислени в R с помощта на t-теста на Student или ANOVA.
Избрани фагови клонове и фаги без вложки се инжектират интравенозно през опашната вена (2 × 1010 фаги/животно в 300 μl PBS).Десет минути преди перфузията и последващата фиксация, същите животни бяха интравенозно инжектирани със 100 μl DyLight594-белязан лектин (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 минути след инжектирането на фаг, плъховете се перфузират през сърцето с 50 ml PBS, последвано от 50 ml 4% PFA/PBS.Мозъчните проби бяха допълнително фиксирани за една нощ в 4% PFA/PBS и накиснати в 30% захароза за една нощ при 4°C.Пробите се замразяват бързо в OCT сместа.Имунохистохимичният анализ на замразени проби се извършва при стайна температура върху 30 µm криосекции, блокирани с 1% BSA и инкубирани с поликлонални FITC-белязани антитела срещу T7 фаг (Novus NB 600-376A) при 4 °C.Инкубирайте една нощ.Накрая срезовете се промиват 3 пъти с PBS и се изследват с конфокален лазерен микроскоп (Leica TCS SP5).
Всички пептиди с минимална чистота от 98% са синтезирани от GenScript USA, биотинилирани и лиофилизирани.Биотинът се свързва чрез допълнителен троен глицинов спейсер в N-края.Проверете всички пептиди с помощта на масспектрометрия.
Стрептавидин (Sigma S0677) се смесва с 5-кратен еквимоларен излишък от биотинилиран пептид, биотинилиран BACE1 инхибиторен пептид или комбинация (съотношение 3:1) от биотинилиран BACE1 инхибиторен пептид и BACE1 инхибиторен пептид в 5–10% DMSO/инкубиран в PBS.1 час на стайна температура преди инжектиране.Стрептавидин-конюгирани пептиди се инжектират интравенозно в доза от 10 mg/kg в една от опашните вени на плъхове с церебрална кухина.
Концентрацията на стрептавидин-пептидните комплекси се оценява чрез ELISA.Nunc Maxisorp микротитърни плаки (Sigma) бяха покрити за една нощ при 4°C с 1,5 μg/ml мише анти-стрептавидиново антитяло (Thermo, MA1-20011).След блокиране (блокиращ буфер: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% желатин, 1% BSA) при стайна температура за 2 часа, промийте плаката с 0,05% Tween-20/PBS (промивен буфер) за 3 секунди, CSF и плазмени проби бяха добавени към ямките, разредени с блокиращ буфер (плазма 1: 10 000, CSF 1:115).След това плочата се инкубира една нощ при 4°C с антитяло за откриване (1 μg/ml, анти-стрептавидин-HRP, Novus NB120-7239).След три стъпки на промиване, стрептавидин се открива чрез инкубиране в разтвор на субстрат на ТМВ (Roche) до 20 минути.След спиране на развитието на цвета с 1M H2SO4, измерете абсорбцията при 450 nm.
Функцията на инхибиторния комплекс стрептавидин-пептид-BACE1 се оценява чрез Ар(1-40) ELISA съгласно протокола на производителя (Wako, 294-64701).Накратко, CSF пробите се разреждат в стандартен разредител (1:23) и се инкубират за една нощ при 4°C в 96-ямкови плаки, покрити с антитяло за улавяне на BNT77.След пет етапа на промиване се добавя HRP-конюгирано BA27 антитяло и се инкубира в продължение на 2 часа при 4°С, последвано от пет етапа на промиване.Ар (1–40) се открива чрез инкубиране в разтвор на ТМВ в продължение на 30 минути при стайна температура.След спиране на развитието на цвета със стоп разтвор, измерете абсорбцията при 450 nm.Плазмените проби бяха подложени на твърдофазова екстракция преди Aβ(1–40) ELISA.Плазмата се добавя към 0.2% DEA (Sigma) в 96-ямкови плаки и се инкубира при стайна температура в продължение на 30 минути.След последователно промиване на SPE плаките (Oasis, 186000679) с вода и 100% метанол, плазмените проби се добавят към SPE плаките и цялата течност се отстранява.Пробите се промиват (първо с 5% метанол, след това с 30% метанол) и се елуират с 2% NH4OH/90% метанол.След изсушаване на елуата при 55 ° С в продължение на 99 минути при постоянен N2 ток, пробите се редуцират в стандартни разредители и Ар (1–40) се измерва, както е описано по-горе.
Как да цитирам тази статия: Urich, E. et al.Доставка на товари до мозъка с помощта на транзитни пептиди, идентифицирани in vivo.науката.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB и Moos T. Доставка на макромолекулни лекарства в мозъка с помощта на таргетна терапия.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. и Martinez-Martinez, P. Доставка на пептидни и протеинови лекарства през кръвно-мозъчната бариера.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Кръвно-мозъчната бариера: пречка в разработването на мозъчни лекарства.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG и Byrd, A. Перспективи за подобрено доставяне на лекарства и насочване към мозъка чрез пътя на хороидния плексус-CSF.Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Модернизация на биофармацевтични продукти с молекулярни троянски коне за доставка на мозъка.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, медииран от WM рецептор пептиден транспорт през кръвно-мозъчната бариера.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Увеличете проникването в мозъка и ефикасността на терапевтичните антитела с помощта на моновалентни молекулярни совалки.Неврон 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Транспортът на трансфериновия рецептор (TfR) определя мозъчното поемане на афинитетни варианти на TfR антитела.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).