Някои теми за отстраняване на неизправности с LC никога не са остарели, тъй като има проблеми в практиката на LC, дори когато технологията на инструмента се подобрява с течение на времето. Има много начини, по които могат да възникнат проблеми в LC система и да се окажат в лоша форма на пика. Когато възникнат проблеми, свързани с формата на пика, кратък списък с възможни причини за тези резултати помага да се опрости нашия опит при отстраняване на неизправности.
Беше забавно да пишем тази колона „LC Troubleshooting“ и да мислим за теми всеки месец, защото някои теми никога не излизат от мода. Докато в областта на хроматографските изследвания определени теми или идеи стават остарели, тъй като са заменени от по-нови и по-добри идеи, в областта на отстраняването на неизправности, откакто първата статия за отстраняване на неизправности се появи в това списание (LC Journal по това време), тъй като някои теми все още са актуални) през 1983 г.(1 ). През последните няколко години съсредоточих няколко раздела за отстраняване на неизправности при LC върху съвременните тенденции, засягащи течната хроматография (LC) (например относителното сравнение на нашето разбиране за ефекта от натиска върху задържането [2] Нови постижения) Нашата интерпретация на резултатите от LC и как да отстранявате неизправности с модерни LC инструменти. В частта от този месец продължавам моята поредица (3), която започна през декември 2021 г. и която се фокусира върху някои от темите за „живот и смърт“ при отстраняване на неизправности с LC — елементи, които са чудесни за всеки инструмент за отстраняване на неизправности, са от съществено значение, независимо от възрастта на системата, която използваме. Основната тема на тази поредица е много подходяща за известната стенна диаграма на LCGC „LC Troubleshooting Guide“ (4), висяща в много лаборатории. За третата част от тази поредица избрах да се съсредоточа върху проблеми, свързани с формата на пика или характеристиките на пика. Невероятно, стенната диаграма изброява 44 различни потенциални причини за лоша пикова форма! Не можем да разгледаме всички тези проблеми подробно в една статия, така че в тази първа част по темата ще се съсредоточа върху някои от тези, които виждам най-често. Надявам се, че младите и старите потребители на LC ще намерят някои полезни съвети и напомняния по тази важна тема.
Откривам, че все по-често отговарям на въпроси за отстраняване на неизправности с „всичко е възможно“. Този отговор може да изглежда лесен, когато разглеждаме наблюдения, които са трудни за тълкуване, но го намирам често за уместен. При много възможни причини за лоша пикова форма е важно да останете непредубедени, когато обмисляте какъв може да е проблемът, и да можете да приоритизирате потенциалните причини, за да започнем усилията си за отстраняване на неизправности, като се фокусираме върху тези най-често срещани възможности, тази точка е много важна.възможно.
Ключова стъпка във всяко упражнение за отстраняване на неизправности – но такава, която според мен е подценена – е признаването, че има проблем, който трябва да бъде решен. Признаването, че има проблем, често означава признаване, че това, което се случва с инструмента, е различно от нашите очаквания, които са оформени от теория, емпирични знания и опит (5). „Формата на върха“, спомената тук, всъщност се отнася не само до формата на върха (симетрична, асиметрична, гладка , пухкав, водещ ръб, опашка и т.н.), но също и към ширината. Нашите очаквания за действителната форма на пиковете са прости. Теорията (6) добре подкрепя очакванията на учебника, че в повечето случаи хроматографските пикове трябва да са симетрични и да отговарят на формата на Гаусово разпределение, както е показано на Фигура 1а. Какво очакваме от ширините на пиковете е по-сложен въпрос и ще обсъдим тази тема в бъдеща статия. Другата пикова форма s на фигура 1 показват някои от другите възможности, които могат да бъдат наблюдавани - с други думи, някои от начините, по които нещата могат да се объркат. В останалата част от тази част ще отделим време за обсъждане на някои конкретни примери за ситуации, които могат да доведат до тези типове форми.
Понякога пикове изобщо не се наблюдават в хроматограмата, където се очаква да бъдат елуирани. Горната диаграма на стената показва, че липсата на пик (ако приемем, че пробата действително съдържа целевия аналит в концентрация, която трябва да направи реакцията на детектора достатъчна, за да се види над шума) обикновено е свързано с някакъв проблем с инструмента или неправилни условия на подвижната фаза (ако изобщо се наблюдава).пикове, обикновено твърде „слаби“). Кратък списък с потенциални проблеми и решения в тази категория може да се намери в таблица I.
Както бе споменато по-горе, въпросът колко разширяване на пика трябва да се толерира, преди да се обърне внимание и да се опитаме да го поправим, е сложна тема, която ще обсъдя в бъдеща статия. Моят опит показва, че значителното разширяване на пика често е придружено от значителна промяна във формата на пика, а изоставането на пика е по-често срещано от преди пика или разделянето. Номинално симетричните пикове обаче също са разширени, което може да бъде причинено от няколко различни причини:
Всеки от тези проблеми беше обсъден подробно в предишни броеве на Troubleshooting LC и читателите, които се интересуват от тези теми, могат да се обърнат към тези предишни статии за информация относно първопричините и потенциалните решения на тези проблеми.Повече информация.
Пиковите опашки, пиковите фронтове и разделянето могат да бъдат причинени от химични или физични явления и списъкът с потенциални решения на тези проблеми варира значително в зависимост от това дали имаме работа с химичен или физически проблем. Често, като сравнявате различните пикове в хроматограма, можете да намерите важни улики за това кой е виновникът. Ако всички пикове в хроматограмата показват подобни форми, причината най-вероятно не е физическа .Ако са засегнати само един или няколко върха, но останалите изглеждат добре, причината най-вероятно е химическа.
Химическите причини за пиковото изоставане са твърде сложни, за да се обсъдят накратко тук. Заинтересованият читател се насочва към скорошния брой на „LC Troubleshooting“ за по-задълбочена дискусия (10). Лесно нещо обаче, което можете да опитате, е да намалите масата на инжектирания аналит и да видите дали формата на пика се подобрява. Ако е така, тогава това е добра индикация, че проблемът е „масово претоварване“. В този случай методът трябва да бъде ограничен до инжектиране малки аналитични маси или хроматографските условия трябва да се променят, така че да могат да се получат добри пикови форми дори при инжектирани по-големи маси.
Има и много потенциални физически причини за пиковото изоставане. Читателите, които се интересуват от подробно обсъждане на възможностите, се насочват към друг скорошен брой на „LC Troubleshooting“ (11). Една от по-честите физически причини за пиковото изоставане е лоша връзка в точка между инжектора и детектора (12). Екстремен пример е показан на Фигура 1d, получена в моята лаборатория преди няколко седмици. В този случай изградихме система с нова инжекция клапан, който не бяхме използвали преди, и инсталирахме инжекционен контур с малък обем с накрайник, който беше формован върху капиляра от неръждаема стомана. След някои първоначални експерименти за отстраняване на неизправности осъзнахме, че дълбочината на порта в статора на инжекционния клапан е много по-дълбока, отколкото бяхме свикнали, което води до голям мъртъв обем в долната част на порта. Този проблем лесно се решава чрез замяна на инжекционния контур с друга тръба, можем да регулираме желязото преместете в правилната позиция, за да премахнете мъртвия обем в долната част на порта.
Пикови фронтове като тези, показани на Фигура 1e, също могат да бъдат причинени от физически или химични проблеми. Често срещана физическа причина за водещия ръб е, че леглото на частиците на колоната не е добре опаковано или че частиците са се реорганизирали с течение на времето. Както при пиковите опашки, причинени от това физическо явление, най-добрият начин да се коригира това е да се замени колоната и да се продължи. По същество пиковите форми на водещия ръб с химически произход често възникват от това, което наричаме „не- линейни” условия на задържане. При идеални (линейни) условия количеството аналит, задържано от стационарната фаза (следователно факторът на задържане), е линейно свързано с концентрацията на аналита в колоната. Хроматографски това означава, че с увеличаване на масата на аналита, инжектиран в колоната, пикът става по-висок, но не по-широк. Тази връзка се нарушава, когато поведението на задържане е нелинейно и пиковете не само стават ta по-малък, но и по-широк, тъй като се инжектира повече маса. В допълнение, нелинейните форми определят формата на хроматографските пикове, което води до водещи или задни ръбове. Както при масовото претоварване, което причинява изоставане на пика (10), изпреварването на пика, причинено от нелинейно задържане, може също да бъде диагностицирано чрез намаляване на инжектираната маса на аналита. Ако формата на пика се подобри, методът трябва да бъде модифициран, за да не надвишава качеството на инжектиране, което причинява водещия ръб, или хроматографските условия трябва да се променят, за да се сведе до минимум това поведение.
Понякога наблюдаваме нещо, което изглежда като „раздвоен“ пик, както е показано на Фигура 1f. Първата стъпка в решаването на този проблем е да се определи дали формата на пика се дължи на частично съвместно елуиране (т.е. наличието на две различни, но близко елуиращи се съединения). Ако действително има два различни аналита, елуиращи се близо един до друг, тогава е въпрос на подобряване на разделителната им способност (например чрез увеличаване на селективността, задържането или броя на плаките) и видимото „разделените“ пикове са свързани с физическата производителност. Производителността няма нищо общо със самата колона. Често най-важната улика за това решение е дали всички пикове в хроматограмата показват раздвоени форми, или само един или два. Ако са само един или два, вероятно е проблем със съвместното елуиране;ако всички пикове са разделени, това вероятно е физически проблем, най-вероятно свързан със самата колона.
Разделените пикове, свързани с физическите свойства на самата колона, обикновено се дължат на частично блокирани входни или изходни фрити или реорганизация на частиците в колоната, което позволява на подвижната фаза да тече по-бързо от подвижната фаза в определени области на формирането на канала на колоната в други региони (11). Частично запушената фрита понякога може да бъде изчистена чрез обръщане на потока през колоната;обаче според моя опит това обикновено е краткосрочно, а не дългосрочно решение. Това често е фатално при съвременните колони, ако частиците се рекомбинират в колоната. В този момент е най-добре да смените колоната и да продължите.
Пикът на Фигура 1g, също от скорошен случай в моята собствена лаборатория, обикновено показва, че сигналът е толкова висок, че е достигнал горния край на обхвата на реакция. За детектори за оптична абсорбция (UV-vis в този случай), когато концентрацията на аналита е много висока, аналитът абсорбира по-голямата част от светлината, преминаваща през проточната клетка на детектора, оставяйки много малко светлина за откриване. При тези условия електрическият сигнал от фотодетектора е силно повлиян от различни източници на шум, като разсеяна светлина и „тъмен ток“, което прави сигнала много „размит“ на вид и независим от концентрацията на аналита.Когато това се случи, проблемът често може лесно да бъде разрешен чрез намаляване на обема на инжектиране на аналита – намаляване на обема на инжектиране, разреждане на пробата или и двете.
В училището за хроматография използваме сигнала на детектора (т.е. Y-оста в хроматограмата) като индикатор за концентрацията на аналита в пробата. Така че изглежда странно да се види хроматограма със сигнал под нулата, тъй като простата интерпретация е, че това показва отрицателна концентрация на аналита-кое курс не е физически възможен. В опит, отрицателните пикове са най-често наблюдавани, когато се използва офетично.
В този случай отрицателен пик просто означава, че молекулите, елуиращи от колоната, абсорбират по-малко светлина от самата подвижна фаза непосредствено преди и след пика. Това може да се случи, например, когато се използват относително ниски дължини на вълната на откриване (<230 nm) и добавки за подвижна фаза, които абсорбират по-голямата част от светлината при тези дължини на вълната. Такива добавки могат да бъдат компоненти на разтворителя на подвижната фаза като метанол или буферни компоненти като ацетат или формиат. Човек всъщност може да използва отрицателни пикове, за да подготвим калибрационна крива и да получим точна количествена информация, така че няма основна причина да ги избягваме сами по себе си (този метод понякога се нарича „индиректно UV откриване“) (13). Въпреки това, ако наистина искаме да избегнем напълно отрицателните пикове, в случай на откриване на абсорбция, най-доброто решение е да използваме различна дължина на вълната на откриване, така че аналита да абсорбира повече от подвижната фаза или да променим състава на подвижната фаза, така че че те абсорбират по-малко светлина от аналитите.
Отрицателни пикове могат да се появят и при използване на откриване на индекс на пречупване (RI), когато индексът на пречупване на компоненти, различни от аналита в пробата, като например матрицата на разтворителя, е различен от индекса на пречупване на подвижната фаза. Това също се случва с UV-vis откриване, но този ефект има тенденция да бъде отслабен спрямо откриването на RI. И в двата случая отрицателните пикове могат да бъдат сведени до минимум чрез по-тясно съответствие на състава на матрицата на пробата към тази на подвижната фаза.
В част трета относно основната тема за отстраняване на неизправности при LC обсъдих ситуации, при които наблюдаваната пикова форма се различава от очакваната или нормална пикова форма. Ефективното отстраняване на неизправности при такива проблеми започва с познаване на очакваните пикови форми (на базата на теория или предишен опит със съществуващи методи), така че отклоненията от тези очаквания са очевидни. Проблемите с пиковата форма имат много различни потенциални причини (твърде широки, опашка, преден ръб и т.н.). В тази част обсъждам подробно някои от причините Виждам най-често. Познаването на тези подробности осигурява добро място за започване на отстраняване на неизправности, но не обхваща всички възможности. Читателите, които се интересуват от по-задълбочен списък с причини и решения, могат да се обърнат към стенната диаграма на LCGC „LC Troubleshooting Guide“.
(4) LCGC „Ръководство за отстраняване на проблеми с LC“ стенна диаграма. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Анализ на данни и обработка на сигнали в хроматографията (Elsevier, Ню Йорк, Ню Йорк, 1998), стр. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF и Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.