Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Използвате версия на браузъра с ограничена поддръжка на CSS. За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer). Освен това, за да осигурим постоянна поддръжка, показваме сайта без стилове и JavaScript.
Показва карусел от три слайда едновременно. Използвайте бутоните „Предишна“ и „Следваща“, за да се придвижвате през три слайда едновременно, или използвайте плъзгачите в края, за да се придвижвате през три слайда едновременно.
Самоорганизиращите се невронни органели представляват обещаваща in vitro платформа за моделиране на човешкото развитие и заболявания. Органоидите обаче нямат свързаността, която съществува in vivo, което ограничава съзряването и предотвратява интеграцията с други вериги, които контролират поведението. Тук показваме, че кортикалните органоиди, получени от човешки стволови клетки, трансплантирани в соматосензорната кора на новородени голи плъхове, развиват зрели клетъчни типове, които се интегрират в сензорни и мотивационни вериги. Ядрено-магнитният резонанс (ЯМР) разкрива растеж на органоиди след трансплантация в няколко стволови клетъчни линии и животни, докато едноядрен анализ разкрива прогресия на кортикогенезата и появата на зависима от активността транскрипционна програма. Всъщност, трансплантираните кортикални неврони проявяват по-сложни морфологични, синаптични и вътрешни мембранни свойства от техните in vitro аналози, което позволява откриването на невронни дефекти при пациенти със синдром на Тимоти. Анатомичното и функционално проследяване показва, че трансплантираните органели получават таламокортикални и кортикокортикални входове, а in vivo записите на невронната активност показват, че тези входове могат да генерират сензорни отговори в човешките клетки. И накрая, кортикалните органоиди удължават аксони в целия мозък на плъхове и тяхната оптогенетична активация води до поведение, търсещо награда. По този начин, трансплантираните неврони на човешката кора узряват и участват в веригите на гостоприемника, които контролират поведението. Очакваме този подход да улесни откриването на фенотипове на ниво вериги в клетки, получени от пациента, които не могат да бъдат открити по друг начин.
Развиващият се човешки мозък е забележителен самоорганизиращ се процес, при който клетките пролиферират, диференцират се, мигрират и се свързват, за да образуват функционални невронни вериги, които се усъвършенстват допълнително чрез сензорния опит. Ключов проблем в разбирането на развитието на човешкия мозък, особено в контекста на болести, е липсата на достъп до мозъчна тъкан. Самоорганизиращите се органели, включително органоидите на човешката кора (hCO; известни също като сфера на човешката кора), могат да генерират 2,3,4,5,6. Няколко ограничения обаче ограничават по-широкото им приложение до разбиране на развитието и функционирането на невронните вериги. По-специално, не е ясно дали съзряването на hCO е ограничено от липсата на определени микроекологични и сензорни входове, присъстващи in vivo. Освен това, тъй като hCO не са интегрирани във вериги, които могат да генерират поведенчески резултати, тяхната полезност при моделиране на генетично сложни и поведенчески невропсихиатрични разстройства понастоящем е ограничена.
Трансплантацията на hCO в непокътнат жив мозък може да преодолее тези ограничения. Предишни проучвания показват, че човешките неврони, трансплантирани в кората на гризачи, са способни да оцелеят, да проектират и да комуникират с клетки на гризачи7,8,9,10,11,12. Тези експерименти обаче обикновено се провеждат върху възрастни животни, което може да ограничи синаптичната и аксоналната интеграция. Тук описваме трансплантационна парадигма, в която трансплантирахме 3D hCO, получен от hiPS клетки, в първичната соматосензорна кора (S1) на имунодефицитни плъхове в ранен етап на пластично развитие. Трансплантираните hCO (t-hCO) неврони претърпяват значително съзряване, получават таламокортикални и кортикално-кортикални входове, които предизвикват сензорни реакции, и разширяват аксонални проекции в мозъка на плъх, за да стимулират поведение, търсещо награда. Удълженото съзряване на t-hCO разкри невронни дефекти при пациенти със синдром на Тимоти (TS), тежко генетично заболяване, причинено от мутации във волтаж-чувствителния L-тип CaV1.2 калциев канал (кодиран от CACNA1C).
За да изследваме човешки кортикални неврони в електрически вериги in vivo, ние стереотактично трансплантирахме интактен 3D hCO в S1 на ранни постнатални атимични плъхове (дни 3-7 след раждането) (фиг. 1a и разширени данни от фиг. 1a-c). В този момент таламокортикалните и кортикокортикалните аксонални проекции все още не са завършили своята S1 инервация (реф. 13). По този начин, този подход е предназначен да максимизира интеграцията на t-hCO, като същевременно минимизира въздействието върху ендогенните вериги. За да визуализираме местоположението на t-hCO в живи животни, извършихме T2-претеглени ЯМР реконструкции на мозъка на плъхове 2–3 месеца след трансплантацията (фиг. 1b и разширени данни, фиг. 1d). t-hCO2 се наблюдаваха лесно и обемните измервания на t-hCO2 бяха подобни на тези, изчислени от фиксирани срезове (Разширени данни, Фиг. 1d,e; P > 0,05). t-hCO2 се наблюдаваха лесно и обемните измервания на t-hCO2 бяха подобни на тези, изчислени от фиксирани срезове (Разширени данни, Фиг. 1d,e; P > 0,05). t-hCO лесно се наблюдаваха, а обемните измерения на t-hCO бяха аналогични разчетени за фиксирани срезове (разширени данни, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO2 се наблюдаваха лесно, а обемните измервания на t-hCO2 бяха подобни на тези, изчислени за фиксирани секции (разширени данни, Фиг. 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0,05）。很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO лесно се наблюдава, а обемните измерения на t-hCO бяха аналогични разчетени за фиксирани срезове (разширени данни, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO2 се наблюдава лесно, а обемните измервания на t-hCO2 са подобни на тези, изчислени за фиксирани секции (разширени данни, Фиг. 1d, e; P > 0,05).Определихме t-hCO₂ при 81% от трансплантираните животни приблизително 2 месеца след трансплантацията (n = 72 животни; hCO₂ от 10 hiPS клетъчни линии; hiPS клетъчни линии в Допълнителна таблица 1). От тях 87% бяха разположени в мозъчната кора (фиг. 1в). Чрез извършване на серийни ЯМР сканирания в множество времеви точки при един и същ трансплантиран плъх, открихме деветкратно увеличение на обема на t-hCO₂ в рамките на 3 месеца (фиг. 1d и разширени данни, фиг. 1f). Трансплантираните животни имаха висок процент на преживяемост (74%) 12 месеца след трансплантацията (разширени данни, фиг. 1g и Допълнителна таблица 2) и не бяха открити явни двигателни или паметови нарушения, глиоза или електроенцефалограма (ЕЕГ). Данни фиг. 1g и допълнителна таблица 2). 1h–m и 3e).
a, Схема на експерименталния дизайн. hCO2, получен от hiPS клетки, е трансплантиран в S1 на новородени голи плъхове на 30-60-ия ден от диференциацията. b, T2-претеглени коронални и хоризонтални ЯМР изображения, показващи t-hCO2 в S1 2 месеца след трансплантацията. Скала, 2 mm. c, Количествено определяне на процентите на успех на присаждане, показани за всяка hiPS клетъчна линия (n = 108, числата в лентите показват количеството t-hCO2 на hIPS клетъчна линия) и кортикално или субкортикално местоположение (n = 88). d, ЯМР изображение на коронарна артерия (вляво; скала, 3 mm) и съответната 3D обемна реконструкция (скала, 3 mm), показваща увеличение на t-hCO2 за 3 месеца. e, Преглед на t-hCO2 моделите в мозъчната кора на плъхове. Скала, 1 mm. f, Представителни имуноцитохимични изображения на t-hCO, показани от горе ляво надясно (по време на диференциация): PPP1R17 (4 месеца), NeuN (8 месеца), SOX9 и GFAP (8 месеца), PDGFRα; (8 месеца), MAP2 (8 месеца) и IBA1 (8 месеца). Скала, 20 µm. Коекспресията на HNA показва клетки от човешки произход. g, snRNA-seq: Обобщено многообразие и проекция (UMAP) с намаляване на размерността на всички висококачествени t-hCO ядра след интеграция на Seurat (n=3 t-hCO проби, n=2 hiPS клетъчни линии). Астроцити, клетки от астроцитната линия; cyc prog, циркулиращи прогенитори; GluN DL, дълбоки глутаматергични неврони; GluN DL/SP, дълбоки и субламеларни глутаматергични неврони; GluN UL, глутаматергични неврони от горния слой; олигодендроцити, олигодендроцити; OPC, олигодендроцитни прогениторни клетки; RELN, рилинови неврони. h, Анализ на обогатяването с термина Gene Ontology (GO) на гени, значително повишени (коригирано P <0,05, промяна в пъти > 2, експресирани в поне 10% от ядрата) в t-hCO глутаматергични неврони в сравнение с hCO глутаматергични неврони. h, Анализ на обогатяването с термина Gene Ontology (GO) на гени, значително повишени (коригирано P <0,05, промяна в пъти > 2, експресирани в поне 10% от ядрата) в t-hCO глутаматергични неврони в сравнение с hCO глутаматергични неврони. h, обогатяване на термините на генната онтология (GO) за гени със значителна активация (коригиран P <0,05, кратност на промените > 2, експресия на крайната мярка в 10% ядрено) в глутаматергичните неврони t-hCO в сравнение с глутаматергичните неврони hCO. h, Анализ на обогатяване с термини от Gene Ontology (GO) за гени със значително активиране (коригирано P <0,05, промяна в пъти >2, експресия в поне 10% ядра) в t-hCO глутаматергични неврони в сравнение с hCO глутаматергични неврони. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P < 0,05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 p <0,05 ，变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гените са значително активирани (коригиран P <0,05, кратност на изменение> 2, експресиран крайно при 10% ядрено ниво) в глутаматергичните неврони t-hCO в сравнение с глутаматергичните неврони hCO Онтологичен (GO) анализ на термина на обогатяване. h, гените бяха значително повишени (коригирано P <0,05, промяна в пъти > 2, експресирани в поне 10% от ядрата) в t-hCO глутаматергични неврони в сравнение с hCO глутаматергични неврони Онтологичен (GO) анализ на термина на обогатяване.Пунктираната линия показва aq стойност от 0,05. i, UMAP изобразяване на GluN клетъчни типове в t-hCO₂, използвайки трансфер на маркери от референтен набор от данни за двигателна кора на възрастни 22 snRNA-seq. CT — кортикоталамични клетки, ET — екстрацеребрални клетки, IT — вътрешни теленцефални клетки, NP — близка проекция.
След това оценихме цитоархитектурата и общия клетъчен състав на t-hCO. Оцветяването с антитела на ендотелни клетки от плъх разкри васкуларизация с t-hCO, докато оцветяването с IBA1 разкри наличието на микроглия от плъх в целия трансплантат (фиг. 1f и разширени данни, фиг. 3c,d). Имунооцветяването разкри човешки ядрен антиген (HNA) позитивни клетки, коекспресиращи PPP1R17 (кортикални прогенитори), NeuN (неврони), SOX9 и GFAP (глиални клетки) или PDGFRα (олигодендроцитни прогенитори) (Фигура 1f). За да изследваме клетъчния състав на t-hCO при единична клетъчна резолюция, извършихме едноядрено РНК секвениране (snRNA-seq) след приблизително 8 месеца диференциация. Обемната филтрация и отстраняването на ядра от плъхове дадоха 21 500 висококачествени човешки мононуклеарни карти (фиг. 1g и разширени данни, фиг. 4a,b). Моделите на експресия на типични маркери от клетъчен тип идентифицираха клъстери от основни класове кортикални клетки, включително дълбоки и повърхностни глутаматергични неврони, циркулиращи прогениторни клетки, олигодендроцити и астроцитна линия (фиг. 1g, разширени данни, фиг. 4c и допълнителна таблица 3). Имунооцветяването за SATB2 и CTIP2 показа, че въпреки наличието на кортикални подтипове, t-hCO не показва ясна анатомична стратификация (разширени данни, фиг. 3a). snRNA-seq hCO, съответстващ на стадий, произвежда широко сходни клетъчни класове, с няколко изключения, включително липсата на олигодендроцити и наличието на GABAергични неврони, което може да отразява предварително съобщените благоприятни in vitro условия за латерални прогениторни клетки15 (разширени данни, фиг. 4f-i и допълнителна таблица 4). Диференциалният анализ на генната експресия разкри значителни разлики в глутаматергичните неврони между t-hCO и hCO (Допълнителна таблица 5), включително активиране на набори от гени, свързани с невроналното съзряване, като синаптична сигнализация, дендритна локализация и активност на волтажно-зависимите канали (Фигура 1h и Допълнителна таблица 5, таблица 6). Съответно, кортикалните глутаматергични t-hCO неврони показват ускорено транскрипционно съзряване.
За да изясним дали тези транскрипционни промени в t-hCO са свързани с морфологични разлики между hCO in vitro и t-hCO in vivo, реконструирахме hCO и hCO, запълнени с биоцитин, със съответстващ стадий в остри срези след 7–8 месеца диференциация. hCO неврони (фиг. 2a). t-hCO невроните бяха значително по-големи, имаха 1,5 пъти по-голям диаметър на сомата, два пъти повече дендрити и общо шесткратно увеличение на общата дължина на дендритите в сравнение с in vitro hCO (фиг. 2b). Освен това наблюдавахме значително по-висока плътност на дендритни бодли в t-hCO невроните, отколкото в hCO невроните (фиг. 2c). Това предполага, че t-hCO невроните претърпяват обширно дендритно удължаване и разклоняване, което в комбинация с продължителна клетъчна пролиферация може да допринесе за интензивния растеж на t-hCO след трансплантация (фиг. 1d и разширени данни фиг. 1f). Това ни подтикна да изследваме електрофизиологичните свойства. Мембранният капацитет беше осем пъти по-висок (разширени данни, Фиг. 8d), мембранният потенциал в състояние на покой беше по-хиперполяризиран (приблизително 20 mV), а инжектирането на ток индуцира по-висока максимална скорост на възбуждане в t-hCO неврони, отколкото в hCO неврони. in vitro (Фиг. 2d), e), което е в съответствие с по-големите и по-сложни морфологични характеристики на t-hCO. Освен това, честотата на спонтанните възбуждащи постсинаптични токови събития (EPSC) беше значително по-висока в t-hCO неврони (Фиг. 2f), което предполага, че повишената плътност на дендритни бодли, наблюдавани в t-hCO неврони, е свързана с функционална възбудимост. сексуален синапс. Потвърдихме незрелия характер на hCO невроните in vitro чрез записване на белязани глутаматергични неврони (разширени данни, Фиг. 6a-c).
a, 3D реконструкция на биоцитин-запълнени hCO и t-hCO неврони след 8 месеца диференциация. b, Количествено определяне на морфологичните характеристики (n = 8 hCO неврони, n = 6 t-hCO неврони; **P = 0,0084, *P = 0,0179 и ***P < 0,0001). b, Количествено определяне на морфологичните характеристики (n = 8 hCO неврони, n = 6 t-hCO неврони; **P = 0,0084, *P = 0,0179 и ***P < 0,0001). б, количествена оценка на морфологическите признаци (n = 8 неврона hCO, n = 6 неврона t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). b, количествено определяне на морфологичните характеристики (n=8 hCO неврони, n=6 t-hCO неврони; **P=0,0084, *P=0,0179 и ***P<0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0179 和***P < 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0179 和***P < 0,0001). б, количествена оценка на морфологическите признаци (n = 8 неврона hCO, n = 6 неврона t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). b, количествено определяне на морфологичните характеристики (n=8 hCO неврони, n=6 t-hCO неврони; **P=0,0084, *P=0,0179 и ***P<0,0001).c, 3D реконструкция на дендритни клони на hCO и t-hCO след 8 месеца диференциация. Червените звездички показват предполагаеми дендритни шипове. Количествено определяне на плътността на дендритните шипове (n = 8 hCO неврони, n = 6 t-hCO неврони; **P = 0,0092). d, Количествено определяне на потенциала на мембраната в покой (n = 25 hCO неврони, n = 16 t-hCO неврони; ***P < 0,0001). d, Количествено определяне на потенциала на мембраната в покой (n = 25 hCO неврони, n = 16 t-hCO неврони; ***P < 0,0001). d, количествена оценка на мембранния потенциал на покоя (n = 25 неврона hCO, n = 16 неврона t-hCO; *** P <0,0001). d, количествено определяне на мембранния потенциал в покой (n = 25 hCO неврони, n = 16 t-hCO неврони; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元, n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元, n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. d, количествена оценка на мембранния потенциал на покоя (n = 25 неврона hCO, n = 16 неврона t-hCO; *** P <0,0001). d, количествено определяне на мембранния потенциал в покой (n = 25 hCO неврони, n = 16 t-hCO неврони; ***P < 0,0001). e, Повтарящо се задействане на потенциал на действие в hCO и t-hCO, индуцирано от увеличаване на инжекциите с ток, и количествено определяне на максималната скорост на задействане (n = 25 hCO неврони, n = 16 t-hCO неврони; ***P < 0,0001). e, Повтарящо се задействане на потенциал на действие в hCO и t-hCO, индуцирано от увеличаване на инжекциите с ток, и количествено определяне на максималната скорост на задействане (n = 25 hCO неврони, n = 16 t-hCO неврони; ***P < 0,0001). e, повторно възбуждащо потенциално действие в hCO и t-hCO, предизвикано увеличение на тока, и количествена оценка на максималната скорост на възбуждане (n = 25 неврона hCO, n = 16 неврона t-hCO; *** P <0,0001). e, повторно възпламеняване на акционен потенциал в hCO и t-hCO, индуцирано от увеличаване на тока и количествено определяне на максималната скорост на възпламеняване (n = 25 hCO неврони, n = 16 t-hCO неврони; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量化（n = 25个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量化 （（n = 25个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, повтарящото се възбуждащо потенциално действие на hCO и t-hCO, предизвикано увеличение на подачи на тока, и количествена оценка на максималната скорост на възбуждане (n = 25 неврона hCO, n = 16 неврона t-hCO; *** P <0,0001). e, повтарящо се изстрелване на акционни потенциали на hCO и t-hCO, индуцирано от увеличено подаване на ток и количествено определяне на максималната скорост на изстрелване (n = 25 hCO неврони, n = 16 t-hCO неврони; *** P < 0,0001). f, Спонтанни EPSCs (sEPSCs) в hCO и t-hCO неврони на 8 месеца диференциация и количествено определяне на честотата на синаптичните събития (n = 25 hCO неврони, n = 17 t-hCO неврони; ***P < 0,0001). f, Спонтанни EPSCs (sEPSCs) в hCO и t-hCO неврони на 8 месеца диференциация и количествено определяне на честотата на синаптичните събития (n = 25 hCO неврони, n = 17 t-hCO неврони; ***P < 0,0001). f, спонтанни EPSC (sEPSC) в невроните hCO и t-hCO през 8 месеца диференциация и количествена оценка на честотата на синаптичните събития (n = 25 неврона hCO, n = 17 неврона t-hCO; *** P <0,0001). f, Спонтанни EPSCs (sEPSCs) в hCO и t-hCO неврони на 8 месеца диференциация и количествено определяне на честотата на синаптичните събития (n=25 hCO неврони, n=17 t-hCO неврони; ***P<0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化（n = 25 hCO神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼（n = 25 hCO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . f, спонтанни EPSC (sEPSC) в невроните hCO и t-hCO през 8 месеца диференциация и количествена оценка на честотата на синаптичните събития (n = 25 неврона hCO, n = 17 неврона t-hCO; *** P <0,0001). f, Спонтанни EPSCs (sEPSCs) в hCO и t-hCO неврони на 8 месеца диференциация и количествено определяне на честотата на синаптичните събития (n = 25 hCO неврони, n = 17 t-hCO неврони; *** P <0,0001).За bf, hCO и t-hCO в линия 1208-2 бяха взети от същата партида за диференциация, поддържана паралелно. g, Анализ на обогатяване на генния набор (едностранен точен тест на Фишър) на гени, значително повишени (коригирано P < 0,05, промяна в пъти > 2, експресирани в поне 10% от ядрата) в t-hCO глутаматергични неврони в сравнение с hCO глутаматергични неврони с генни набори както на ранно-отговарящи (ERG), така и на късно-отговарящи (LRG) гени, идентифицирани от in vivo проучване върху мишки16 и човешки-специфични LRG от in vitro неврони17. g, Анализ на обогатяване на генния набор (едностранен точен тест на Фишър) на гени, значително повишени (коригирано P < 0,05, промяна в пъти > 2, експресирани в поне 10% от ядрата) в t-hCO глутаматергични неврони в сравнение с hCO глутаматергични неврони с генни набори както на ранно-отговарящи (ERG), така и на късно-отговарящи (LRG) гени, идентифицирани от in vivo проучване върху мишки16 и човешки-специфични LRG от in vitro неврони17. g, анализ на обогатяването на набора от гени (отностранен точен критерий на Фишера) гени със значителна активация (коригиран P <0,05, кратност на промените > 2, експресия при по-малко измерване в 10% ядрено) в глутаматергичните неврони t-hCO в сравнение с глутаматергичните неврони hCO набори от гени като ранни (ERG), като и последни (LRG) гени, зависещи от активности, идентифицирани в изследванията на мишите in vivo16, и специфични за човека LRG от неврони in vitro17. g, анализ на обогатяването на генния набор (едностранен точен тест на Фишър) на гени със значителна активация (коригирано P <0,05, промяна в пъти >2, експресия в поне 10% от ядрата) в t-hCO глутаматергични неврони в сравнение с hCO глутаматергични невронни набори както от ранни (ERG), така и от късни (LRG) зависими от активността гени, идентифицирани в in vivo мишки16 и човешки специфични LRG от неврони in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0,05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达＾)的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 （调整 后 p <0,05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 fisher 精确）)体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 和神经元 神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, глутаматергичните неврони t-hCO са значително активирани в сравнение с глутаматергичните неврони hCO (коригиран P<0,05, кратност на промените> 2, не по-малко от 10% Анализ на обогатения набор от гени (отностранен точен тест на Фишера) ранен отговор (ERG) и предни гени, зависими от отговора на активността (LRG), идентифицирани в изследванията мишах in vivo16 и нейроните in vitro17, специфични за човека. g, t-hCO глутаматергичните неврони са значително повишени в сравнение с hCO глутаматергичните неврони (коригирано P <0,05, промяна в пъти >2, поне 10% анализ на обогатяването на гени за ранен отговор (ERG) и късен отговор (едностранен точен тест на Фишър), гени, зависими от активността на отговора (LRG), идентифицирани при in vivo мишки16 и in vitro неврони.17 Човешки специфични LRG.Пунктираната линия показва коригирана по Bonferroni P стойност от 0,05. h, експресията на GluN гена (псевдопакет и мащабиране на всеки ген) е значително повишена в snRNA-seq реплики на LRG гени в t-hCO глутаматергични неврони. i, имунооцветяване, показващо експресия на SCG2 в t-hCO (горен) и hCO (долен) неврони. Белите стрелки сочат към SCG2+ клетки. Мащабна лента, 25 µm. Данните са изразени като средна стойност ± стандартно отклонение.
Въз основа на повишената активност на t-hCO, наблюдавана в ex vivo срезове, snRNA-seq разкрива зависима от активността повишена регулация на генните транскрипти в t-hCO в сравнение с hCO in vitro. Глутаматергичните t-hCO неврони експресират по-високи нива на гени, регулиращи активността на късния отговор (фиг. 2g,h), които са открити в предишни изследвания при миши и човешки неврони16,17. Например, BDNF18, SCG2 и OSTN, специфичен за примати ген, регулиращ активността, показват повишена експресия в t-hCO неврони в сравнение с hCO неврони (фиг. 2g-i). По този начин, t-hCO невроните показват подобрени характеристики на зреене в сравнение с hCO невроните чрез транскрипционни, морфологични и функционални анализи.
За да оценим допълнително връзката между съзряването на t-hCO и развитието на човешкия мозък, извършихме транскриптомни сравнения на фетални и възрастни типове кортикални клетки19,20 и възрастни21,22, както и обширни данни за експресията на кортикални гени23 по време на развитието (разширени данни, Фиг. 5). С предишна работа24, глобалният статус на зреене на hCO и t-hCO транскриптомите на 7–8 месеца диференциация е в общи линии съвместим с времето за развитие in vivo и е най-еквивалентен на късния фетален живот (Разширени данни, Фиг. 5a). Забележително е, че наблюдавахме повишена зрялост на транскриптомите в t-hCO в сравнение с hCO, съответстващ на възрастта, както и активиране на транскриптомите, свързано със синаптогенезата, астрогенезата и миелинизацията (разширени данни, Фиг. 5b-d). На клетъчно ниво открихме доказателства за по-тънък подтип на кората в t-hCO, с клъстери от глутаматергични неврони, припокриващи се с възрастни невронни подтипове L2/3, L5 и L6 (Фигура 1i). За разлика от това, припокриването на клъстери между глутаматергичните t-hCO неврони и феталните кортикални неврони е по-ограничено в средата на бременността (разширени данни, Фигура 5e-j). За да определим дали t-hCO невроните са функционално подобни на човешките постнатални неокортикални неврони, извършихме електрофизиологични записи и анатомични реконструкции на човешки L2/3 пирамидални неврони в остри участъци на човешката постнатална кора (разширени данни, Фиг. 7a). Електрофизиологичните свойства на L2/3 пирамидалните неврони са подобни на тези на t-hCO пирамидалните неврони (разширени данни, Фиг. 7e). Морфологично, L2/3 невроните от постнатални човешки проби са по-подобни на t-hCO, отколкото на hCO, въпреки че L2/3 клетките са по-дълги, съдържат повече разклонения като цяло и имат по-висока плътност на шиповете (Фиг. 3g и разширени данни, Фиг. 7b-). G).
а, трансплантация на hCO, произведен от контролни и TS hiPS клетъчни линии, в новородени плъхове. б, 3D реконструкция на биоцитин-запълнени t-hCO неврони след 8 месеца диференциация. в, количествено определяне на средната дължина на дендритите (n = 19 контролни неврона, n = 21 TS неврона; **P = 0,0041). d, 3D-реконструирани дендритни клони от контрола и TS t-hCO на 8 месеца диференциация и количествено определяне на плътността на дендритните шипове (n = 16 контролни неврона, n = 21 TS неврона, ***P < 0,0001). d, 3D-реконструирани дендритни клони от контрола и TS t-hCO на 8 месеца диференциация и количествено определяне на плътността на дендритните шипове (n = 16 контролни неврона, n = 21 TS неврона, ***P < 0,0001). d, 3D-реконструкция на дендритни ветрове от контрол и TS t-hCO през 8 месеца диференциация и количествена оценка на плътността на дендритните шипове (n = 16 контролни неврона, n = 21 TS неврона, *** P <0,0001). d, 3D реконструкция на дендритни клони от контрола и t-hCO TS на 8 месеца диференциация и количествено определяне на плътността на дендритните шипове (n=16 контролни неврони, n=21 TS неврони, ***P<0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16个对照神经元, n = 21 个TS 神经元, ***P < 0,0001). d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 （n = 16 个神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）. d, 3D-реконструкция на контрола на дендритните ветрове и TS t-hCO през 8 месеца диференциация и количествена оценка на плътността на дендритните шипове (n = 16 контролни неврона, n = 21 TS неврона, *** P <0,0001). d, 3D реконструкция на контролни дендритни клони и TS t-hCO на 8 месеца диференциация и количествено определяне на плътността на дендритните шипове (n=16 контролни неврони, n=21 TS неврони, ***P<0,0001).Червените звездички показват предполагаеми дендритни бодли. e, спонтанни EPSC в контролни и TS t-hCO неврони след 8 месеца диференциация. f, графика на кумулативната честота и количествено определяне на честотата и амплитудата на синаптичните събития (n=32 контролни неврона, n=26 TS неврони; **P=0,0076 и P=0,8102). g, Scholl анализ на TS и контролни неврони в hCO и t-hCO. Пунктираните линии показват човешки L2/3 постнатални пирамидални неврони за сравнение (n = 24 контролни t-hCO неврони, n = 21 TS t-hCO неврони, n = 8 контролни hCO неврони и n = 7 TS hCO неврони). Данните са изразени като средна стойност ± стандартно отклонение.
Способността на t-hCO да възпроизвежда морфологичните и функционалните характеристики на невроните в човешката кора на високо ниво ни подтикна да проучим дали t-hCO може да се използва за откриване на болестни фенотипове. Фокусирахме се върху синдрома на Стюарт, тежко невроразвойно разстройство, причинено от мутации с усилване на функцията в гена, кодиращ CaV1.2, който инициира зависима от активността генна транскрипция в невроните. Получихме hCO от трима пациенти с синдром на Стюарт, носещи най-често срещаната субституция (p.G406R) и три контролни групи (фиг. 3a). След трансплантацията установихме, че дендритната морфология е променена в невроните на синдрома на Стюарт в сравнение с контролните групи (фиг. 3b и разширени данни, фиг. 8a,b), с двукратно увеличение на броя на първичните дендрити и общо увеличение на средното и общо намаление на дължината на дендритите (фиг. 3c и разширени данни, фиг. 8c). Това беше свързано с повишена плътност на бодли и повишена честота на спонтанни EPSC в невроните на Стюарт в сравнение с контролните неврони (фиг. 3d–f и разширени данни, фиг. 8g). По-нататъшен анализ разкри модели на анормално дендритно разклоняване в t-hCO TS в сравнение с контролите, но не и в in vitro TS hCO на подобен етап на диференциация (фиг. 3g). Това е в съответствие с предишните ни доклади за зависимо от активността дендритно свиване в TS и подчертава способността на тази трансплантационна платформа да открива болестни фенотипове in vivo.
След това попитахме до каква степен t-hCO клетките са функционално интегрирани в S1 на плъх. S1 при гризачи получава силни синаптични входове от ипсилатералните вентрални базални и задни таламични ядра, както и от ипсилатералните двигателни и вторични соматосензорни кортекси и контралатералния S1 (фиг. 4а). За да възстановим инервационния модел, инфектирахме hCO с вирус на бяс-dG-GFP/AAV-G и трансплантирахме hCO в S1 плъх 3 дни по-късно. Наблюдавахме плътна експресия на GFP в невроните на ипсилатералния S1 и вентралните базални ганглии 7–14 дни след трансплантацията (фиг. 4b, c). Освен това, оцветяването с антитела на таламичния маркер нетрин G1 разкри наличието на таламични окончания в t-hCO (фиг. 4d, e). За да оценим дали тези аферентни проекции могат да предизвикат синаптични отговори в t-hCO клетки, извършихме записи на цели клетки от човешки клетки в остри участъци от таламокортикалния слой. Електрическа стимулация на S1 на плъх, вътрешна капсула, бяло вещество, влакна близо до t-hCO или оптогенетична активация на опсин-експресиращи таламични окончания в t-hCO индуцира кратколатентни EPSCs в t-hCO неврони, изложени на AMPA рецепторния антагонист NBQX. (Фиг. 4f, g и разширени данни, Фиг. 9a-g). Тези данни показват, че t-hCO е анатомично интегриран в мозъка на плъх и може да бъде активиран от тъканта на гостоприемника на плъх.
a, Схематична диаграма на експеримент за проследяване на бяс. b, GFP и човешка специфична експресия на STEM121 между t-hCO и мозъчна кора на плъх (горен панел). Показана е също експресията на GFP в ипсилатералното вентрално базално ядро ​​(VB) на плъх (долу вляво) и ипсилатералния S1 (долу вдясно). Мащабна лента, 50 µm. Червените квадрати представляват областите на мозъка, където са направени изображенията. c, количествено определяне на клетки, експресиращи GFP (n = 4 плъха). d, e — Netrin G1+ таламични терминали в t-hCO. d показва коронален разрез, съдържащ t-hCO и VB ядра. Мащабна лента, 2 mm. e показва експресията на Netrin G1 и STEM121 в t-hCO (ляво) и VB (дясно) неврони. Мащабна лента, 50 µm. Оранжевата пунктирана линия показва границата на t-hCO. f, g, Текущи следи от t-hCO неврони след електрическа стимулация в S1 плъх (f) или вътрешна капсула (g), с (лилаво) или без (черно) NBQX (вляво). EPSC амплитуди със и без NBQX (n = 6 S1 неврона, *P = 0.0119; и n = 6 вътрешни капсулни неврона, **P = 0.0022) (в центъра). Процент на t-hCO неврони, показващи EPSC в отговор на електрическа стимулация на S1 плъх (f) или вътрешна капсула (g) (вдясно). aCSF, изкуствена цереброспинална течност. h, схематична диаграма на 2P образния експеримент (вляво). Експресия на GCaMP6s в t-hCO (в средата). Мащабна лента, 100 µm. Флуоресцентен времеви интервал на GCaMP6s (вдясно). i, Z-оценка на спонтанната активност на флуоресценцията. j, схематична илюстрация на стимулация на мустаци. k, z-оценени 2P флуоресцентни траектории в едно изпитване, подравнени с отклонението на нишките във време нула (пунктирана линия) в примерните клетки. l, осреднени за популацията z-скор отговори на всички клетки, подравнени с отклонението на нишките във време нула (пунктирана линия) (червено) или произволно генерирани времеви марки (сиво). m. Схематична диаграма на експеримента върху оптично маркиране. n, Сурови криви на напрежението от примерна t-hCO клетка по време на стимулация със синя лазер или отклонение на нишките. Червените стрелки показват първите пикове, причинени от светлина (горе) или причинени от отклонение на нишките (долу). Сивото оцветяване показва периоди на отклонение на нишките. o, Пикови светлинни вълнови форми и отговори на отклонение на нишките. p, пикове от един опит, подравнени с отклонението на нишките в клетките от примера. 0 показва отклонение на нишките (пунктирана линия). q, осреднена за популацията z-скор честота на задействане за всички фоточувствителни клетки, подравнена с отклонението на нишките във време нула (пунктирана линия) (червено) или произволно генерирани времеви марки (сиво). r, Дял на фоточувствителните единици, значително модулирани от отклонението на мустаците (n = 3 плъха) (вляво). Латентност на пика на z-скора (n = 3 плъха; n = 5 (светлозелено), n = 4 (тъмнозелено) и n = 4 (циан) модулационни единици на отклонение на мустаците на плъх) (вдясно). Данните са изразени като средна стойност ± стандартно отклонение.
След това попитахме дали t-hCO може да се активира от сензорни стимули in vivo. Трансплантирахме hCO, експресиращ генетично кодираните калциеви индикатори GCaMP6, в S1 плъхове. След 150 дни извършихме фибърна фотометрия или двуфотонно калциево изобразяване (фиг. 4h и разширени данни, фиг. 10a). Установихме, че t-hCO клетките показват синхронизирана ритмична активност (фиг. 4i, разширени данни, фиг. 10b и допълнително видео 1). За да характеризираме пиковата t-hCO активност, извършихме извънклетъчни електрофизиологични записи при анестезирани трансплантирани плъхове (разширени данни, фиг. 10c-f). Генерирахме стереотаксични координати от ЯМР изображения; по този начин тези записани единици представляват предполагаеми човешки неврони, въпреки че само електрофизиологията не позволява да се определи видовият произход. Наблюдавахме синхронизирани изблици на активност (разширени данни, фиг. 10d). Избликовете продължиха около 460 ms и бяха разделени от периоди на тишина от около 2 s (разширени данни, фиг. 10d, e). Отделните единици изстрелваха средно около три изстрела на импулс, което е приблизително 73% от регистрираните единици на импулс. Активността на отделните единици беше силно корелирана и тези корелации бяха по-високи от тези на единиците, идентифицирани при неваксинирани животни, регистрирани при същите условия (разширени данни, Фиг. 10f). За да характеризираме по-нататък пиковите отговори на идентифицирани неврони, получени от човек, проведохме експерименти със светлинно маркиране върху анестезирани плъхове, трансплантирани с hCO, експресиращи светлочувствителния катионен канал родопсин 2 (hChR2), чрез който t-hCO невроните разпознават с кратка латентност (по-малко от 10 ms) в отговор на стимули със синя светлина (Фиг. 4m–o). t-hCO невроните показаха изблици на спонтанна активност при честоти, подобни на наблюдаваните при калциево изобразяване, както и електрофизиологични записи, извършени в t-hCO при липса на светлинно маркиране (разширени данни, Фиг. 10c-g). Не е наблюдавана спонтанна активност в съответните етапи на hCO, регистрирани in vitro. За да оценим дали t-hCO може да се активира от сензорни стимули, за кратко отклонихме мустаците на плъховете далеч от t-hCO (фиг. 4j,m и разширени данни, фиг. 10h,k). Според предишни проучвания8,10, подгрупа от t-hCO клетки показа повишена активност в отговор на отклонението на мустаците, което не се наблюдава, когато данните бяха сравнени със случайни времеви печати (фиг. 4k–q и разширени данни, фиг. 10h–q). Всъщност, около 54% ​​от опто-маркираните единични единици показаха значително повишена скорост на възбуждане след стимулация на мустаците, достигайки пик при около 650 ms (фиг. 4r). Взети заедно, тези данни показват, че t-hCO получава подходящи функционални входове и може да се активира от стимули от околната среда.
След това изследвахме дали t-hCO може да активира вериги при плъхове, за да контролира поведението. Първо изследвахме дали аксоните на t-hCO невроните се проектират в околните тъкани на плъха. Инфектирахме hCO с лентивирус, кодиращ hChR2, слят с EYFP (hChR2-EYFP). След 110 дни наблюдавахме експресия на EYFP в ипсилатералните кортикални области, включително слуховите, двигателните и соматосензорните кортекси, както и в субкортикалните области, включително стриатума, хипокампуса и таламуса (фиг. 5а). За да оценим дали тези еферентни проекции могат да предизвикат синаптични отговори в клетки на плъхове, оптически активирахме t-hCO клетки, експресиращи hChR2-EYFP, като записвахме клетки от мозъчната кора на плъхове в остри мозъчни срези. Активирането на t-hCO аксони със синя светлина индуцира кратколатентни EPSCs в неврони на пирамидалната кора на плъхове, които бяха блокирани от NBQX (фиг. 5b-g). Освен това, тези реакции могат да бъдат блокирани от тетродотоксин (TTX) и възстановени от 4-аминопиридин (4-AP), което предполага, че са причинени от моносинаптични връзки (фиг. 5д).
a, Схематична диаграма на проследяване на аксони (вляво). t-hCO EYFP експресия (вдясно). Мащабна лента, 100 µm. A1, слухова кора, ACC, предна цингуларна кора, d. striatum, дорзален стриатум, HPC, хипокампус; Диафрагма, латерална преграда, mPFC, медиална префронтална кора, пири, пириформна кора, v. striatum, вентрален стриатум, VPM, вентропостомедиално ядро ​​на таламуса, VTA, вентрална тегментална област. Червените квадрати представляват областите на мозъка, където са направени изображенията. b, Схематична диаграма на стимулационния експеримент. c, d, Примери за реакцията на индуциран от синя светлина фототок (горе) и напрежение (долу) в човешки (c) EYFP+ t-hCO или плъши (d) EYFP- клетки. e, f, Текущи следи от неврони на плъхове след стимулация със синя светлина на t-hCO аксони с TTX и 4-AR (зелено), TTX (сиво) или aCSF (черно) (e), с (виолетово) или без (черно) ) ) NBQX (e). g, латентност на отговорите, индуцирани от синя светлина в клетки на плъхове (n = 16 клетки); хоризонталните ленти показват средна латентност (7,13 ms) (вляво). Амплитуда на светлинно-предизвикани EPSC, записани със или без NBQX (n = 7 клетки; ***P < 0,0001) (в средата). Амплитуда на светлинно-предизвикани EPSC, записани със или без NBQX (n = 7 клетки; ***P < 0,0001) (в средата). Амплитуда, получена от световен EPSC, регистрирана с или без NBQX (n = 7 клетки; ***P <0,0001) (в центъра). Амплитуда на индуцираните от светлина EPSC, записани със или без NBQX (n = 7 клетки; ***P < 0,0001) (център).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。 Амплитуда, получена от световен EPSC, регистрирана с или без NBQX (n = 7 клетки; ***P <0,0001) (в центъра). Амплитуда на индуцираните от светлина EPSC, записани със или без NBQX (n = 7 клетки; ***P < 0,0001) (център).Процент на плъши клетки, показващи EPSC, които реагират на синя светлина (вдясно). h, Схематична диаграма на поведенческа задача. d0, ден 0. i. Представяне на примерни животни на ден 1 (вляво) или ден 15 (вдясно) от обучението. Средният брой близания, извършени на ден 1 (вляво) или ден 15 (вдясно в центъра) (n = 150 опита със синя светлина, n = 150 опита с червена светлина; ***P < 0,0001). Средният брой близания, извършени на ден 1 (вляво) или ден 15 (вдясно в центъра) (n = 150 опита със синя светлина, n = 150 опита с червена светлина; ***P < 0,0001). Средният брой облицовки, изпълнени в ден 1 (слева) или ден 15 (в центъра на делото) (n = 150 теста със синия свят, n = 150 теста с червен свет; ***P <0,0001). Среден брой близания, извършени на ден 1 (вляво) или ден 15 (в центъра вдясно) (n = 150 опита със синя светлина, n = 150 опита с червена светлина; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0,0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0,001 Средният брой облицовки, изпълнени в ден 1 (слева) или ден 15 (в центъра на делото) (n = 150 теста със синия свят, n = 150 теста с червен свет; ***P <0,0001). Среден брой близания, извършени на ден 1 (вляво) или ден 15 (в центъра вдясно) (n = 150 опита със синя светлина, n = 150 опита с червена светлина; ***P < 0,0001).Кумулативни близвания за опити с червена и синя светлина на ден 1 (вляво в центъра) или ден 15 (вдясно). NS, не е значимо. j,k, Поведенчески характеристики на всички животни, трансплантирани с t-hCO експресиращ hChR2-EYFP (j) или контролен флуорофор (k) на ден 1 или 15 (hChR2-EYFP: n = 9 плъха, ** P = 0,0049; контрола: n = 9, P = 0,1497). l, Еволюция на предпочитателния резултат (n = 9 hChR2, n = 9 контрола; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Еволюция на предпочитателния резултат (n = 9 hChR2, n = 9 контрола; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Еволюция показателя на предпочитанията (n = 9 hChR2, n = 9 контролни; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Еволюция на предпочитателния резултат (n = 9 hChR2, n = 9 контроли; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变８(n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）). l，偏好评分的演变８(n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）). l, Еволюция на показателите на предпочитанията (n = 9 hChR2, n = 9 контроли; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Еволюция на предпочитателните резултати (n = 9 hChR2, n = 9 контроли; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, FOS експресия в отговор на оптогенетично активиране на t-hCO в S1. Показани са изображения на експресията на FOS (вляво) и количественото определяне (n = 3 на група; *P < 0,05, **P < 0,01 и ***P < 0,001) (вдясно). Показани са изображения на експресията на FOS (вляво) и количественото определяне (n = 3 на група; *P < 0,05, **P < 0,01 и ***P < 0,001) (вдясно). Показани изображения на експресия на FOS (слева) и количествени определения (n = 3 в групата; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справка). Показани са изображения на експресията на FOS (вляво) и количественото определяне (n = 3 на група; *P<0,05, **P<0,01 и ***P<0,001) (вдясно).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（右）的图像。显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（右）的图像。 Показани изображения на експресия на FOS (слева) и количествени определения (n = 3 в групата; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справка). Показани са изображения на експресията на FOS (вляво) и количественото определяне (n = 3 на група; *P<0,05, **P<0,01 и ***P<0,001) (вдясно).Скала, 100 µm. Данните са изразени като средна стойност ± стандартна грешка на BLA, базолатерална сливица, MDT, дорсомедиално таламично ядро, PAG, периакуедуктално сиво.
Накрая, попитахме дали t-hCO може да модулира поведението на плъховете. За да тестваме това, трансплантирахме hChR2-EYFP-експресиращ hCO в S1 и 90 дни по-късно имплантирахме оптични влакна в t-hCO за доставяне на светлина. След това обучихме плъховете с модифицирана парадигма на оперантно кондициониране (фиг. 5h). Поставихме животните в камера за поведенчески тест и произволно приложихме 5-секундни сини (473 nm) и червени (635 nm) лазерни стимули. Животните получиха водна награда, ако облизват по време на стимулация със синя светлина, но не облизват по време на стимулация с червена светлина. В първия ден от обучението животните не показаха разлика в облизването, когато бяха стимулирани със синя или червена светлина. Въпреки това, на 15-ия ден животните, трансплантирани с hCO, експресиращ hChR2-EYFP, показаха по-активно облизване, когато бяха стимулирани със синя светлина, в сравнение със стимулация с червена светлина. Тези промени в поведението на облизване не са наблюдавани при контролни животни, трансплантирани с hCO, експресиращи контролния флуорофор (процент на успех в обучението: hChR2 89%, EYFP 0%, Фигура 5i-1 и Допълнително видео 2). Тези данни показват, че t-hCO клетките могат да активират невроните на плъхове, за да стимулират поведение, търсещо награда. За да разберем кои t-hCO невронни вериги на плъхове може да са включени в тези поведенчески промени, ние оптогенетично активирахме t-hCO в обучени животни и събрахме тъкани 90 минути по-късно. Имунохистохимията разкри експресия на зависимия от активността FOS протеин в няколко мозъчни области, участващи в мотивираното поведение, включително медиалния префронтален кортекс, медиалния таламус и периакуедукталното сиво вещество, което се експресира или при нестимулирани контролни животни, или при животни. (ориз. 5m). Взети заедно, тези данни показват, че t-hCO може да модулира невронната активност на плъхове, за да стимулира поведението.
Невронните органоиди представляват обещаваща система за изучаване на човешкото развитие и заболявания in vitro, но те са ограничени от липсата на връзки между веригите, които съществуват in vivo. Разработихме нова платформа, в която трансплантирахме hCO в S1 на имунокомпрометирани ранни постнатални плъхове, за да изследваме развитието и функцията на човешките клетки in vivo. Показахме, че t-hCO развива зрели клетъчни типове, които не се наблюдават in vitro28, и че t-hCO е анатомично и функционално интегриран в мозъка на гризачи. Интегрирането на t-hCO в невронните вериги на гризачи ни позволи да установим връзка между клетъчната активност на човека и изследваното поведение на животните, показвайки, че t-hCO невроните могат да модулират невронната активност на плъхове, за да стимулират поведенчески реакции.
Платформата, която описваме, има няколко предимства пред предишни изследвания за трансплантиране на човешки клетки в мозъци на гризачи. Първо, трансплантирахме hCO₂ в развиващата се кора на ранни постнатални плъхове, което може да улесни анатомичната и функционалната интеграция. Второ, t-hCO₂ ЯМР мониторингът ни позволи да изследваме позицията и растежа на присадката при живи животни, което ни позволи да проведем дългосрочни изследвания върху множество животни и да установим надеждността на няколко hiPS клетъчни линии. Накрая, трансплантирахме непокътнати органоиди, а не изолирани суспензии от единични клетки, които са по-малко разрушителни за човешките клетки и могат да насърчат интеграцията и генерирането на неврони в човешката кора в мозъците на плъхове.
Признаваме, че въпреки напредъка в тази платформа, времевите, пространствените и междувидовите ограничения предотвратяват формирането на човешки невронни вериги с висока прецизност, дори след трансплантация в ранен етап на развитие. Например, не е ясно дали спонтанната активност, наблюдавана в t-hCO, представлява фенотип на развитие, подобен на ритмичната активност, наблюдавана по време на кортикалното развитие, или се дължи на липсата на супресивни клетъчни типове, присъстващи в t-hCO. По подобен начин не е ясно до каква степен липсата на ламиниране в t-hCO влияе върху свързаността на веригата30. Бъдещата работа ще се фокусира върху интегрирането на други клетъчни типове, като човешка микроглия, човешки ендотелни клетки и различни пропорции на GABAergic интерневрони, както е показано с помощта на асемблиране 6 in vitro, както и върху разбирането как невронната интеграция и обработка могат да се осъществят в променени t-hCO транскрипционни, синаптични и поведенчески нива в клетки, получени от пациенти.
Като цяло, тази in vivo платформа представлява мощен ресурс, който може да допълни in vitro изследванията на развитието на човешкия мозък и заболяванията. Очакваме, че тази платформа ще ни позволи да открием нови фенотипове на ниво вериги в иначе неуловими клетки, получени от пациенти, и да тестваме нови терапевтични стратегии.
Генерирахме hCO2.5 от HiPS клетки, както е описано по-рано. За да се инициира производството на hCO от hiPS клетки, култивирани върху захранващи слоеве, непокътнати колонии от hiPS клетки бяха отстранени от културалните блюда с помощта на диспаза (0.35 mg/mL) и прехвърлени в пластмасови култури с ултраниско прикрепване, съдържащи блюда с hiPS клетъчна културална среда. (Corning), допълнена с два SMAD инхибитора дорзоморфин (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) и SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) и ROCK инхибитор Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). През първите 5 дни, hiPS клетъчната среда се сменяше ежедневно и бяха добавени дорзоморфин и SB-431542. На шестия ден от суспензията, невронните сфероиди бяха прехвърлени в невронна среда, съдържаща невробазал-А (10888, Life Technologies), добавка B-27 без витамин А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пеницилин и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и допълнени с епидермален растежен фактор (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) и фибробластен растежен фактор 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) до 24-ия ден. От 25-ия до 42-ия ден средата беше допълнена с мозъчно-деривен невротрофичен фактор (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) и невротрофин 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) със смяна на средата през ден. На шестия ден от суспензията, невронните сфероиди бяха прехвърлени в невронна среда, съдържаща невробазал-А (10888, Life Technologies), добавка B-27 без витамин А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пеницилин и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и допълнени с епидермален растежен фактор (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) и фибробластен растежен фактор 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) до 24-ия ден. От 25-ия до 42-ия ден средата беше допълнена с мозъчно-деривен невротрофичен фактор (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) и невротрофин 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) със смяна на средата през ден.На шестия ден от суспензията, невронните сфероиди бяха прехвърлени в невронна среда, съдържаща Neurobasal-A (10888, Life Technologies), добавка B-27 без витамин А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) и пеницилин.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и допълнен епидермален фактор на растеж (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) и фактор на растеж на фибробластите 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) до 24 дни. и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и допълнен с епидермален растежен фактор (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) и фибробластен растежен фактор 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) до 24-ия ден.От 25-ия до 42-ия ден към средата бяха добавени мозъчно-извлечен невротрофичен фактор (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) и невротрофин 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech), като средата се сменяше през ден.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素A 的B-27补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉素（1:100，Life Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Системи）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies） 不 含 维生素 a的 b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素（（1: 100 ， Life Technologies） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； R&D Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml-1；R&D Системи) 直至第24天. На 6-ия ден суспензиите на невросферите бяха прехвърлени към добавка, съдържаща невробазал-А (10888, Life Technologies), добавка В-27 без витамин А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пеницилин-неутрализиран стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавяне на епидермален фактор на растеж (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) и фактор на растеж на фибробластите 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; На 6-ия ден, суспензиите от невросфери бяха заменени с добавка, съдържаща невробазал-А (10888, Life Technologies), добавка B-27 без витамин А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), стрептомицин, неутрализиран с пеницилин (1:100, Life Technologies), допълнен с епидермален растежен фактор (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) и фибробластен растежен фактор 2 (FGF2; 20 ng ml-1)1; R&D системи) до 24-го дни. Системи за научноизследователска и развойна дейност) до 24-ия ден.От 25-ия до 42-ия ден, мозъчно-извлечен невротрофичен фактор (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) и невротрофичен фактор 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) бяха добавяни към културалната среда през ден. Средата се сменя веднъж.Започвайки от 43-ия ден, hCO₂ се поддържаше в недобавена невробазална-А среда (NM; 1088022, Thermo Fisher) със смяна на средата на всеки 4–6 дни. За да се получи hCO₂ от hiPS клетки, култивирани в условия без захранване, hiPS клетките се инкубираха с Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) при 37°C в продължение на 7 минути, дисоциираха се на единични клетки и се посяваха върху AggreWell 800 плаки (34815, STEMCELL Technologies) при плътност от 3 × 10⁶ единични клетки на ямка в Essential 8 среда, допълнена с ROCK инхибитора Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). След 24 часа, средата в ямките беше пипетирана нагоре и надолу в среда, съдържаща Essential 6 среда (A1516401, Life Technologies), допълнена с дорзоморфин (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) и SB-431542 (10 μM; 1614). (Tocrida). От 2-ри до 6-ти ден, Essential 6 среда беше заменяна ежедневно с дорзоморфин и добавка SB-431542. От шестия ден, суспензиите от невросфери бяха прехвърлени в невробазалната среда и поддържани, както е описано по-горе.
Всички процедури с животни бяха извършени в съответствие с насоките за грижа за животните, одобрени от Административния комитет за грижа за лабораторните животни на Станфордския университет (APLAC). Бременни еутимични RNU (rnu/+) плъхове бяха закупени (Charles River Laboratories) или настанени. Животните бяха държани на 12-часов цикъл светлина-тъмнина с храна и вода ad libitum. Новородени голи (FOXN1–/–) плъхове на възраст от три до седем дни бяха идентифицирани по растежа на незрели мустаци преди умъртвяване. Кученцата (мъжки и женски) бяха анестезирани с 2-3% изофлуран и поставени върху стереотаксична рамка. Извършена е трепанация на черепа с диаметър приблизително 2-3 mm над S1, като се запазва целостта на твърдата мозъчна обвивка. След това се използва игла 30-G (приблизително 0,3 mm) точно извън краниотомията, за да се пробие твърдата мозъчна обвивка. След това се нанася HCO3 върху тънък парафилм 3×3 cm и се отстранява излишната среда. С помощта на спринцовка Hamilton, прикрепена към игла 23 G, 45°, внимателно изтеглете hCO₃ в най-дисталния край на иглата. След това поставете спринцовката върху спринцовъчната помпа, свързана със стереотаксичното устройство. Поставете върха на иглата върху предварително направен отвор за пункция с ширина 0,3 mm в твърдата мозъчна обвивка (z = 0 mm) и стеснете спринцовката с 1–2 mm (z = приблизително –1,5 mm), докато иглата се окаже между твърдата мозъчна обвивка A. Не се образува плътно запечатване. След това повдигнете спринцовката до центъра на кортикалната повърхност при z = -0,5 mm и инжектирайте hCO₃ със скорост 1-2 µl в минута. След завършване на инжектирането на hCO₃, иглата се изтегля със скорост 0,2-0,5 mm в минута, кожата се зашива и кученцето незабавно се поставя върху топла нагревателна подложка до пълно възстановяване. Някои животни са трансплантирани двустранно.
Всички процедури с животни бяха извършени в съответствие с одобрените от APLAC насоки за грижа за животните в Станфордския университет. Плъховете (повече от 60 дни след трансплантацията) бяха индуцирани с 5% изофлуранова анестезия и анестезирани с 1-3% изофлуран по време на образната диагностика. За визуализация беше използван 7 Tesla активно екраниран хоризонтален сондажен скенер Bruker (Bruker Corp.) с градиентно задвижване на International Electric Company (IECO), екранирана градиентна вложка с вътрешен диаметър 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s), използвайки AVANCE.III, осемканална многобобинна RF и многоядрени възможности, и съпътстващата платформа Paravision 6.0.1. Записът беше извършен с помощта на активно развързана обемна RF бобина с вътрешен диаметър 86 mm и четириканална криогенно охлаждана RF бобина само за приемане. Аксиален 2D Turbo-RARE (време на повторение = 2500 ms, време на ехо = 33 ms, 2 осреднявания) с 16 заснемания на срезове, дебелина на среза 0.6–0.8 mm, съдържащ 256 × 256 семпла. Сигналите са получени с помощта на квадратурна приемо-предавателна обемна RF бобина с вътрешен диаметър 2 cm (Rapid MR International, LLC). Накрая, използвайте вградените функции за оценка на повърхността на Imaris (BitPlane) за 3D рендиране и обемен анализ. Успешна трансплантация се определя като такава, при която в трансплантираното полукълбо са се образували области с непрекъснат T2-претеглен ЯМР сигнал. Отхвърлянето на присадката се определя като присадка, която не е произвела области с непрекъснат T2-претеглен ЯМР сигнал в трансплантираното полукълбо. Субкортикален t-hCO2 е изключен от последващия анализ.
За стабилна експресия на GCaMP6s в hCO2 за двуфотонно калциево изобразяване, hiPS клетките бяха инфектирани с pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro, последвано от селекция от антибиотици. Накратко, клетките бяха дисоциирани с EDTA и суспендирани в 1 ml среда Essential 8 при плътност от приблизително 300 000 клетки в присъствието на полибрен (5 μg/ml) и 15 μl вирус. След това клетките бяха инкубирани в суспензия за 60 минути и посяти при плътност от 50 000 клетки на ямка. След сливането, клетките бяха третирани с 5-10 μg ml-1 пуромицин за 5-10 дни или докато се появят стабилни колонии. Острата hCO инфекция беше извършена както е описано по-рано5 с някои модификации. Накратко, hCO2 се прехвърля на 30-45-ия ден в 1,5 ml микроцентрифужни епруветки Eppendorf, съдържащи 100 µl нервна среда. След това приблизително 90 µl от средата се отстраняват, 3-6 µl лентивирус с висок титър (от 0,5 x 108 до 1,2 x 109) се добавят към епруветката и hCO3 се прехвърля в инкубатора за 30 минути. След това се добавят 90–100 µl от средата към всяка епруветка и епруветките се връщат в инкубатора за една нощ. На следващия ден hCO3 се прехвърля в прясна нервна среда в плаки с ниско прикрепване. След 7 дни hCO3 се прехвърля в 24-ямкови плаки със стъклено дъно за визуализация и оценка на качеството на инфекцията. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE и pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE са генерирани от VectorBuilder. Лентивирусът се използва в повечето експерименти, защото е интегриран в генома на гостоприемника, което позволява експресия на репортерен ген в инфектирани клетъчни линии. За проследяване на бяс, на 30-45-ия ден hCO е коинфектиран с rabies-ΔG-eGFP и AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (плазмид #67528, Addgene), промит обилно в продължение на 3 дни и трансплантиран в плъхове в S1 и поддържан in vivo в продължение на 7-14 дни.
За имуноцитохимия, животните бяха анестезирани и транскардиално перфузирани с PBS, последвано от 4% параформалдехид (PFA в PBS; Electron Microscopy Sciences). Мозъците бяха фиксирани в 4% PFA за 2 часа или за една нощ при 4°C, криоконсервирани в 30% захароза в PBS за 48-72 часа и вградени в 1:1, 30% захароза:OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) и бяха направени коронални срези с дебелина 30 µm с помощта на криостат (Leica). За имунохистохимия на дебели срези, животните бяха перфузирани с PBS, а мозъкът беше дисектиран и секциониран коронално с дебелина 300–400 µm с помощта на вибратом (Leica) и срезите бяха фиксирани с 4% PFA за 30 минути. След това криосекциите или дебелите срези бяха промити с PBS, блокирани за 1 час при стайна температура (10% нормален магарешки серум (NDS) и 0,3% Triton X-100, разреден в PBS) и блокирани с блокиращ разтвор при 4°C. – Инкубация Криосекциите бяха инкубирани за една нощ, а дебелите срези – за 5 дни. Използваните първични антитела бяха: анти-NeuN (мишка, 1:500; ab104224, abcam) анти-CTIP2 (плъх, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (заек, 1:1000; Z0334, Dako), анти-GFP (пилешко, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мишка, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (заек, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (заек, 1:200; sc-338, Santa Cruz), анти-PPP1R17 (заек, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мишка, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (заек, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мишка, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мишка, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (заек, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; ab5076, abcam). Използваните първични антитела бяха: анти-NeuN (мишка, 1:500; ab104224, abcam) анти-CTIP2 (плъх, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (заек, 1:1000; Z0334, Dako), анти-GFP (пилешко, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мишка, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (заек, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (заек, 1:200; sc-338, Santa Cruz), анти-PPP1R17 (заек, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мишка, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (заек, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мишка, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мишка, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (заек, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; ab5076, abcam). Използваха се следните първични антитела: анти-NeuN (мишини, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крисини, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мишиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). Основните използвани антитела бяха: анти-NeuN (мишка, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (плъх, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (заек, 1:1000; Z0334, Dako), анти-GFP (пилешко, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мишка, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (заек, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (заек, 1:200; sc-338, Santa Cruz), анти-PPP1R17 (заек, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мишка, 1:50; ab9774). abcam), анти-SCG2 (заек, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мишка, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мишка, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (заек, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Атлас抗体），抗RECA-1(小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2(兔）), 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊＊1:500；AF3075，R&D Systems，Netrin G1a（山羊＊,1:100；AF1166，R&D Systems），抗STEM121＠(小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP(兔，1:1000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN４(兔，1:500；ABN78，Millipore％弔４,抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Атлас抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems，Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Системи）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мишка, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (заек, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; ab5076, abcam).Основните използвани антитела бяха: анти-NeuN (мишка, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (плъх, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (заек, 1:1000; Z0334, Dako). , анти-GFP (пилешко, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мишка, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (заек, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (заек, 1:200; sc-338, Santa Cruz), анти-PPP1R17 (заек, 1:200; HPA047819, Atlas антитяло), анти-RECA-1 (мишка, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (заек), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121 (мышь, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мишка, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мишка, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (заек, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; ab5076, abkam).След това срезите бяха промити с PBS и инкубирани с вторично антитяло за 1 час при стайна температура (замразени срези) или за една нощ при 4°C (дебели срези). Използвано е вторично антитяло Alexa Fluor (Life Technologies), разредено 1:1000 в блокиращ разтвор. След промиване с PBS, ядрата бяха визуализирани с Hoechst 33258 (Life Technologies). Накрая, препаратите бяха поставени върху микроскоп с покривни стъкла (Fisher Scientific), използвайки Aquamount (Polysciences), и анализирани на флуоресцентен микроскоп Keyence (BZ-X анализатор) или конфокален микроскоп Leica TCS SP8 (Las-X) върху изображението. Изображенията бяха обработени с помощта на програмата ImageJ (Fiji). За да се определи количествено делът на човешките неврони в t-hCO₂ и кората на плъх, бяха направени правоъгълни изображения с ширина 387,5 μm в центъра на t-hCO₂, на или близо до ръба на кората на плъх. Границите на присадката бяха определени чрез оценка на промените в прозрачността на тъканта, HNA+ ядрата и/или наличието на тъканна автофлуоресценция. Във всяко изображение общият брой NeuN+ и HNA+ клетки беше разделен на общия брой NeuN+ клетки в същата област. За да се гарантира, че се броят само клетки с ядра в равнината на изображението, в изчислението са включени само клетки, които също са Hoechst+. Две изображения, разделени от поне 1 mm, бяха осреднени, за да се намали статистическата грешка.
Една седмица преди събирането на пробите, животните с трансплантация на hCO₃ (приблизително 8 месеца диференциация) се поставят в тъмна стая с подрязани мустаци, за да се сведе до минимум сензорната стимулация. Изолирането на ядрата е извършено както е описано по-рано, с някои модификации. Накратко, t-hCO₃ и hCO₃ бяха разрушени с помощта на детергентно-механична клетъчна лиза и 2 ml стъклена тъканна мелница (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Суровите ядра след това бяха филтрирани с помощта на 40 µm филтър и центрофугирани при 320 g за 10 минути при 4°C, преди да се извърши градиент на плътност със захароза. След стъпката на центрофугиране (320 g за 20 минути при 4°C), пробите бяха ресуспендирани в 0,04% BSA/PBS с добавяне на 0,2 единици µl-1 RNase инхибитор (40 u µl-1, AM2682, Ambion) и прекарани през 40 µm проточен филтър. Дисоциираните ядра след това бяха ресуспендирани в PBS, съдържащ 0,02% BSA и заредени върху чип Chromium Single Cell 3′ (очаквано възстановяване на 8000 клетки на лента). snRNA-seq библиотеките бяха приготвени с Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq библиотеките бяха приготвени с Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеките snRNA-seq са приготвени с помощта на Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеките snRNA-seq бяха приготвени с помощта на Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеката snRNA-seq беше готова с помощта на Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеката snRNA-seq беше приготвена с помощта на Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Библиотеки от различни проби бяха обединени и секвенирани от Admera Health на NovaSeq S4 (Illumina).
Нивата на генна експресия за всеки предполагаем ядрен баркод бяха количествено определени с помощта на софтуерния пакет за анализ 10x Genomics CellRanger (версия 6.1.2). По-конкретно, показанията бяха съпоставени с комбинация от човешки (GRCh38, Ensemble, версия 98) и плъши (Rnor_6.0, Ensemble, версия 100) референтни геноми, създадени с командата mkref и използвайки count с командата –include-introns=TRUE за количествено определяне на показанията, картографирани към интронни региони. За t-hCO проби, човешките ядра бяха идентифицирани въз основа на консервативното изискване поне 95% от всички картографирани показания да съвпадат с човешкия геном. Всички последващи анализи бяха извършени върху филтриран изходен масив от баркодове от CellRanger, използвайки пакета R (версия 4.1.2) Seurat (версия 4.1.1)32.
За да се гарантира, че в последващия анализ са включени само висококачествени ядра, за всяка проба е приложен итеративен процес на филтриране. Първо, нискокачествените ядра с по-малко от 1000 открити уникални гена и повече от 20% от общия брой митохондрии са идентифицирани и отстранени. Впоследствие, матрицата на суровите генни числа беше нормализирана чрез регуларизирана отрицателна биномна регресия, използвайки функцията sctransform(vst.flavor=”v2″), която също идентифицира 3000-те най-променливи гена, използвайки параметри по подразбиране. Намаляването на размерите беше извършено върху горните променливи гени, използвайки анализ на главните компоненти (PCA) с параметри по подразбиране, използвайки размер на набора от данни от 30 (dims = 30 беше избран въз основа на визуална проверка на местата на коляното и се използва за всички проби и ансамбъл анализи). След това извършихме няколко кръга на итеративно клъстериране (резолюция = 1), за да класифицираме гени въз основа на анормално нисък брой гени (медиана под 10-ия персентил), анормално висок брой митохондриални гени (медиана над 95-ия персентил), за да идентифицираме и премахнем предполагаеми клетки с ниско качество, клъстери и/или висок дял на предполагаеми близнаци, идентифицирани с помощта на пакета DoubletFinder33 (среден резултат на DoubletFinder над 95-ия персентил). t-hCO проби (n=3) и hCO проби (n=3) бяха интегрирани отделно, използвайки функцията IntegrateData с горните параметри. След това Беше извършен още един кръг от качествено филтриране на интегрирания набор от данни, както е описано по-горе.
След премахване на нискокачествените ядра, интегрираният набор от данни беше групиран (резолюция = 0.5) и вграден за целите на визуализацията на UMAP34. Маркерните гени за всеки клъстер бяха определени с помощта на функцията FindMarkers с параметри по подразбиране, изчислени от нормализирани данни за генна експресия. Ние идентифицираме и класифицираме основните клетъчни класове, като комбинираме референтни набори от данни за фетална и възрастна кора с експресия на маркерни гени 19,20,21,35 и анотация. По-специално, циркулиращите прекурсори бяха идентифицирани чрез експресията на MKI67 и TOP2A. Прогениторните клъстери бяха дефинирани чрез липсата на митотични транскрипти, високо припокриване с мултипотентни глиални прогениторни клъстери, описани в късна метафаза на феталната кора, и експресия на EGFR и OLIG1. Използваме термина астроцит, за да обхванем няколко състояния на астроцитна диференциация, от късна радиална глия до съзряване на астроцитите. Астроцитните клъстери експресират високи нива на SLC1A3 и AQP4 и е доказано, че се картографират с подтипове на фетална радиална глия и/или възрастни астроцити. OPC експресират PDGFRA и SOX10, докато олигодендроцитите експресират миелинационни маркери (MOG и MYRF). Глутаматергичните неврони бяха идентифицирани чрез наличието на невронни транскрипти (SYT1 и SNAP25), отсъствието на GABAергични маркери (GAD2) и експресията на NEUROD6, SLC17A7, BCL11B или SATB2. GluN невроните бяха допълнително разделени на горни (експресия на SATB2 и загуба на BCL11B) и дълбоки (експресия на BCL11B) подкласове. Предполагаемите подплосковидни (SP) неврони експресират известни SP18 маркери като ST18 и SORCS1 в допълнение към дълбоките GluN маркери. Клетки, подобни на хороидния плексус, бяха идентифицирани чрез TTR експресия, а менингеално-подобни клетки експресират гени, свързани с фибробласти, и картографират пиални/съдови клетки от референтния набор от данни.
Диференциалният анализ на генната експресия между t-hCO и hCO подкласовете беше извършен с помощта на новоразработен псевдо-партиден метод, възпроизведен в проби, имплементиран с помощта на пакета Libra R (версия 1.0.0). По-конкретно, edgeR log-likelihood тестове (версия 3.36.0, пакет R) бяха извършени за групи чрез сумиране на броя на гените в клетките за даден клетъчен клас за всяка репликация на пробата. За визуализация на топлинна карта, нормализираните стойности на милион (CPM) бяха изчислени с помощта на edgeR (функция cpm()) и мащабирани (за постигане на средна стойност = 0, стандартно отклонение = 1). Беше извършен анализ на обогатяване с Gene Ontology (GO) на значително повишени t-hCO GluN гени (коригирана по Бенджамини-Хохберг P стойност по-малка от 0,05, експресирана в поне 10% от t-hCO GluN клетките и с кратно увеличение на промяната от поне 2 пъти), извършен с помощта на ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Използваме приложението ToppFun с параметри по подразбиране и докладваме P-стойности, коригирани с Бенджамини-Хохберг, изчислени от хипергеометрични тестове, анотирани с GO.
За да съпоставим нашите snRNA-seq клъстери с анотирани клетъчни клъстери от референтни изследвания на първична RNA-seq на единични клетки или snRNA-seq на възрастни 19,20,21,22, приложихме подход за интегриране на сдвоени набори от данни. Използвахме работния процес за нормализиране SCTransform (v2) в Seurat, за да интегрираме и сравним припокриванията на клъстери между наборите от данни (използвайки същите параметри, както по-горе). Отделните набори от данни бяха подмножествани на случаен принцип до 500 клетки или ядра на оригинален клъстер за изчислителна ефективност. Използвайки подобен подход, както е описан по-рано, припокриването на клъстери беше дефинирано като пропорцията на клетките или ядрата във всеки обединен клъстер, които се припокриват с етикета на референтния клъстер. За да класифицираме по-нататък GluN, използвахме работния процес TransferData на Seurat за данни от подмножество GluN, за да присвоим етикети на референтните набори от данни на нашите GluN клетки.
За да оценим статуса на зреене на глобалния транскриптом на t-hCO и hCO проби, сравнихме нашите псевдо-насипни проби с BrainSpan/psychENCODE23, който се състои от голяма РНК последователност, обхващаща развитието на човешкия мозък. Извършихме PCA върху комбинирана матрица за генна експресия, нормализирана по модел, от кортикални проби 10 седмици след зачеването и по-късно, в 5567 гена (заедно с нашите данни), които преди това бяха идентифицирани като активни в кортикални проби на BrainSpan (дефинирани като повече от 50% в вариацията на развитието, обяснена с възрастта, използвайки кубичен модел)38. В допълнение, ние получихме гени, свързани с основните транскриптомни сигнатури на невроразвитието, използвайки неотрицателна матрична факторизация, както е описано по-рано. Теглата на пробите, изчислени с помощта на процедурата за неотрицателна матрична факторизация, са показани на Фиг. 5b с разширени данни за всяка от петте сигнатури, описани от Zhu et al.38. Отново, транскрипционните маркери, зависим от активността, са получени от публикувани по-рано проучвания. В частност, ERG и LRG бяха значително повишени в глутаматергичните неврони, идентифицирани чрез колекцията от snRNA-seq на зрителната кора на мишката след визуална стимулация от Допълнителна таблица 3 Hrvatin et al.16. LRG, обогатени с хора, бяха получени от активирани с KCl култури на човешки фетален мозък и събрани 6 часа след стимулация, а филтрираните гени бяха значително повишени при хора, но не и при гризачи (Допълнителна таблица 4). Анализът на обогатяването на генните набори с помощта на тези генни набори беше извършен с помощта на еднопосочен точен тест на Fisher.
Анестезирайте плъховете с изофлуран, отстранете мозъците и ги поставете в студен (приблизително 4°C) оксигениран (95% O2 и 5% CO2) разтвор на захароза за срези, съдържащи: 234 mM захароза, 11 mM глюкоза, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 и 0.5 mM CaCl2 (около 310 mOsm). Коронарните срези от мозъка на плъх (300–400 µm), съдържащи t-hCO2, бяха направени с помощта на вибратом Leica VT1200, както е описано по-рано39. След това срезите бяха прехвърлени в камера за срезиране с непрекъсната оксигенация при стайна температура, съдържаща aCSF, приготвен от: 10 mM глюкоза, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 и 126 mM NaCl (298 mOsm). поне 45 минути преди записа. Срезите бяха записани в потопена камера, където бяха непрекъснато перфузирани с aCSF (95% O2 и 5% CO2 флакон). Всички данни бяха записани при стайна температура. t-hCO невроните бяха терминирани с боросиликатна стъклена пипета, напълнена с разтвор, съдържащ 127 mM калиев глюконат, 8 mM NaCl, 4 mM магнезиев ATP, 0.3 mM натриев GTP, 10 mM HEPES и 0.6 mM EGTA, pH 7.2, вътрешен разтвор, регулиран с KOH (290 mOsm). За да се възстанови, към записващия разтвор беше добавен биоцитин (0.2%).
Данните са получени с помощта на усилвател MultiClamp 700B (Molecular Devices) и дигитайзер Digidata 1550B (Molecular Devices), нискочестотен филтър при 2 kHz, дигитализирани при 20 kHz и анализирани с помощта на Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). и персонализирани MATLAB функции (Mathworks). Потенциалът на прехода е изчислен с помощта на JPCalc и записите са коригирани до изчислената стойност от -14 mV. Операция IV се състои от серия от токови стъпки в стъпки от 10-25 pA, от -250 до 750 pA.
Таламусът, бялото вещество и S1 аферентните влакна бяха електрически стимулирани в таламокортикални срезове по време на patch-clamp запис на hCO неврони, както е описано по-рано. Накратко, мозъкът беше поставен върху 3D печатаща маса, наклонена под ъгъл 10°, а предната част на мозъка беше отрязана под ъгъл 35°. След това мозъкът беше залепен към отрязаната повърхност и нарязан на срези, като се запазиха таламокортикалните изпъкнали аксони. Биполярни волфрамови електроди (0,5 MΩ) бяха монтирани на втори микроманипулатор и стратегически позиционирани, за да стимулират четири области на клетка (вътрешна капсула, бяло вещество, S1 и hCO). Запишете синаптичните отговори след фазова стимулация от 300 µA при 0,03–0,1 Hz.
hChR2-експресиращи hCO неврони бяха активирани при 480 nm и светлинни импулси, генерирани от LED (Prizmatix), бяха приложени през обектив ×40 (0.9 NA; Olympus), за да се запише експресията на hChR2 в близост до клетките. Диаметърът на осветеното поле е приблизително 0.5 mm, а общата мощност е 10-20 mW. Ширината на импулса беше зададена на 10 ms, което съответства на импулса, подаван по време на експеримента за поведенческо обучение. Използвани са различни честоти на стимулация, от 1 до 20 Hz, но само първият импулс от серията е използван за количествено определяне. Интервалите между сериите обикновено са по-дълги от 30 s, за да се сведе до минимум ефектът върху синаптичните инхибиторни или улесняващи пътища. За да проверим дали hChR2 отговорът е моносинаптичен, приложихме TTX (1 μM) към ваната, докато EPSC реакцията изчезне, след което приложихме 4-аминопиридин (4-AP; 100 μM). Обикновено отговорът се връща в рамките на няколко минути, с малко по-дълго забавяне между задействането на LED и генерирането на EPSC. NBQX (10 μM) беше използван за тестване дали отговорът се задвижва от AMPA рецептори.
Остри hCO срези бяха създадени както е описано по-рано. Накратко, hCO срезите бяха вградени в 4% агароза и прехвърлени в клетки, съдържащи 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 и 10 mM d-(+)-глюкоза. Срезите бяха нарязани на 200–300 µm при стайна температура с помощта на вибратор Leica VT1200 и съхранявани в ASF при стайна температура. След това беше извършен patch-camp запис на цели клетки върху hCO срези под директен микроскоп SliceScope (Scientifica). Срезите бяха перфузирани с aCSF (95% O2 и 5% CO2) и клетъчните сигнали бяха записани при стайна температура. hCO невроните бяха приложени с помощта на боросиликатна стъклена пипета, напълнена с разтвор, съдържащ 127 mM калиев глюконат, 8 mM NaCl, 4 mM магнезиев АТФ, 0,3 mM натриев GTP, 10 mM HEPES и 0,6 mM EGTA, вътрешно pH 7,2, коригирано с KOH (осмоларност 290). За целите на възстановяването, към вътрешния разтвор беше добавен 0,2% биоцитин.
Данните са получени от Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices), използвайки усилвател MultiClamp 700B (Molecular Devices) и дигитайзер Digidata 1550B (Molecular Devices), нискочестотен филтър при 2 kHz, дигитализирани при 20 kHz и анализирани с помощта на Clampfit (версия 10.6) за анализ (molecular devices) и персонализирани MATLAB функции (MATLAB 2019b, Mathworks). Потенциалът на прехода е изчислен с помощта на JPCalc и записите са коригирани към изчисления потенциал на прехода от -14 mV. Операция IV се състои от серия от токови стъпки в стъпки от 5-10 pA от -50 до 250 pA.
За морфологична реконструкция на притиснати неврони, към вътрешния разтвор е добавен 0,2% биоцитин (Sigma-Aldrich). Клетките се грундират поне 15 минути след хакването. След това пипетата се изтегля бавно за 1-2 минути, докато регистрираната мембрана се запечата напълно. Следвайки процедурата по физиология на срезите, срезите са фиксирани за една нощ при 4°C в 4% PFA, промити с PBS X3 и разредени 1:1000 със стрептавидин-конюгиран DyLight 549 или DyLight 405 (Vector Labs). Клетките, напълнени с биоцитин (2%; Sigma-Aldrich), са маркирани по време на запис с patch clamp при стайна температура в продължение на 2 часа. След това срезите са монтирани върху микроскопски предметни стъкла с помощта на Aquamount (Thermo Scientific) и визуализирани на следващия ден на конфокален микроскоп Leica TCS SP8, използвайки маслено-иммерсионен обектив с числена апертура ×40 1,3, увеличение ×0,9–1,0, xy. Честотата на дискретизация е приблизително 7 пиксела на микрон. Z-стекове на интервали от 1 µm бяха получени серийно и бяха извършени z-стекови мозайки и автоматично сшиване, базирано на Leica, за да се покрие цялото дендритно дърво на всеки неврон. След това невроните бяха проследени полуръчно, използвайки интерфейса neuTube 40, и бяха генерирани SWC файлове. След това файловете бяха качени в плъгина SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, версия 2.1.0; NIH).
Човешка кортикална тъкан е получена с информирано съгласие съгласно протокол, одобрен от Институционалния съвет за преглед на Станфордския университет. Две проби от човешка тъкан след раждане (на 3 и 18 години) са получени чрез резекция на фронталния кортекс (среден фронтален гирус) като част от операция за рефракторна епилепсия. След резекция, тъканта е взета в леденостуден NMDG-aCSF, съдържащ: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM глюкоза, 2 mM тиоурея, 5 mM натриев аскорбат, 3 mM натриев пируват, 0.5 mM CaCl2 4H2O и 10 mM MgSO4 7H2O. Титрува се до pH 7.3-7.4 с концентрирана солна киселина. Тъканите са доставени в лабораторията в рамките на 30 минути и коронарните срези са взети съгласно описаната по-горе процедура.
Всички процедури с животни бяха извършени в съответствие с одобрените от APLAC насоки за грижа за животните в Станфордския университет. Плъховете (повече от 140 дни след трансплантацията) бяха индуцирани с 5% изофлуранова анестезия и анестезирани с 1-3% изофлуран интраоперативно. Животните бяха поставени в стереотаксична рамка (Kopf) и подкожно беше инжектиран бупренорфин с удължено освобождаване (SR). Черепът беше оголен, почистен и бяха поставени 3-5 костни винта. За да се насочим към t-hCO₂, генерирахме стереотаксични координати от ЯМР изображения. На мястото на интерес беше пробит отвор с бормашина и влакна (400 µm диаметър, NA 0.48, Doric) бяха спуснати 100 µm под повърхността на hCO₂ и закрепени към черепа с UV-втвърдяващ се дентален цимент (Relyx).
Фиброфотометричните записи бяха извършени както е описано по-рано42. За да се запише спонтанната активност, плъховете бяха поставени в чиста клетка и към имплантирания оптичен кабел беше свързан оптичен пач кабел с диаметър 400 µm (Doric), свързан към система за събиране на оптични фотометрични данни. По време на 10-минутното записване на двигателната активност животните бяха свободни да изследват клетката. За да се запише предизвиканата активност, плъховете (повече от 140 дни след трансплантацията) бяха анестезирани с 5% изофлуран за индукция и 1-3% изофлуран за поддържане. Животното беше поставено в стереотактична рамка (Kopf) и мустаците от противоположната страна на t-hCO₂ бяха подрязани до около 2 cm и прекарани през мрежа, свързана с пиезоелектричен актуатор (PI). 400 µm оптичен пач кабел (Doric) беше свързан към имплантираното влакно и към системата за събиране на данни. Мустаците от противоположната страна на t-hCO₂ бяха отклонени 50 пъти (2 mm при 20 Hz, 2 s на представяне) на случаен принцип от пиезоелектрическо задвижване в продължение на 20 минути. Използвайте Arduino MATLAB Support Package, за да контролирате времето на отклонение с персонализиран MATLAB код. Събитията се синхронизират със софтуера за събиране на данни, използвайки импулси от транзистор-транзисторна логика (TTL).
Плъховете (повече от 140 дни след трансплантацията) са индуцирани с 5% изофлуранова анестезия и са анестезирани с 1-3% изофлуран интраоперативно. Животните са поставени в стереотаксична рамка (Kopf) и бупренорфин SR и дексаметазон са инжектирани подкожно. Черепът е оголен, почистен и са поставени 3-5 костни винта. За да се насочим към t-hCO₂, генерирахме стереотаксични координати от ЯМР изображения. Извършена е кръгова краниотомия (с диаметър приблизително 1 см) с високоскоростна бормашина директно върху трансплантирания hCO₂. След като костта е възможно най-тънка, но преди да се пробие през цялата кост, се използват форцепс за отстраняване на останалия непокътнат тазов диск, за да се разкрие подлежащият t-hCO₂. Краниотомията е запълнена със стерилен физиологичен разтвор, а покривно стъкло и специален щифт за глава са прикрепени към черепа с UV-втвърден дентален цимент (Relyx).
Двуфотонното изобразяване е извършено с помощта на многофотонен микроскоп Bruker с обектив Nikon LWD (×16, 0.8 NA). GCaMP6 изобразяването е извършено при 920 nm с 1.4x увеличение на единичната z-равнина и 8x средно от 7.5 fps. Плъховете са индуцирани с 5% изофлуранова анестезия и са поддържани с 1-3% изофлуран. Плъховете са поставени в специално изработено приспособление за глава и са позиционирани под лещата. Беше постигнат 3-минутен фонов запис на двигателната активност. В течение на 20 минути запис, 50 ​​всмуквания (всяко представяне с продължителност 100 ms) са били доставени на случаен принцип към подложката за мустаци срещу t-hCO₂ с помощта на пикосприцер. Използвайте Arduino MATLAB Support Package, за да контролирате времето за импулс с персонализиран MATLAB код. Синхронизирайте събитията със софтуер за събиране на данни (PrairieView 5.5), използвайки TTL импулси. За анализ изображенията са коригирани за xy движение, използвайки афинна корекция в програмата MoCo, стартирана във Фиджи. Екстракция на флуоресцентни следи от отделни клетки с помощта на CNMF-E43. Флуоресценцията е екстрахирана за всяка област от интерес, превърната в dF/F криви и след това превърната в z-стойности.
Плъховете (повече от 140 дни след трансплантацията) са индуцирани с 5% изофлуранова анестезия и са анестезирани с 1-3% изофлуран интраоперативно. Животните са поставени в стереотаксична рамка (Kopf) и бупренорфин SR и дексаметазон са инжектирани подкожно. Мустаците от противоположната страна на t-hCO2 са отрязани до около 2 cm и са прокарани през мрежа, свързана с пиезоелектричен задвижващ механизъм. Черепът е оголен и почистен. Към черепа е прикрепен заземителен винт от неръждаема стомана. За да се насочим към t-hCO2, генерирахме стереотаксични координати от ЯМР изображения. Извършете кръгова краниотомия (с диаметър приблизително 1 cm) с високоскоростна бормашина точно над t-hCO2. След като костта е възможно най-тънка, но преди да пробиете през цялата кост, използвайте форцепс, за да отстраните останалия непокътнат тазов диск, за да разкриете подлежащия t-hCO2. Отделните клетки бяха записани с помощта на 32-канални или 64-канални силициеви сонди с висока плътност (Cambridge Neurotech), заземени към заземителни винтове и предварително усилени с RHD усилватели (Intan). Използвайте манипулатора, за да спуснете електродите до целевото място през краниотомията, която е запълнена със стерилен физиологичен разтвор. Събирането на данни беше извършено с честота 30 kHz, използвайки системата за събиране на данни Open Ephys. Записът продължи само когато открихме силно корелирана ритмична спонтанна активност в повече от 10 канала, което предполага, че електродите са разположени в присадката (въз основа на данни от двуфотонно калциево изобразяване). Беше получен 10-минутен фонов запис на двигателната активност. След това мустаците от противоположната страна на t-hCO₂ бяха отклонени 50 пъти (2 mm при 20 Hz, 2 s на представяне) на случаен принцип от пиезоелектрическо задвижване за 20-минутен период на запис. Използвайки MATLAB Support Package за Arduino (MATLAB 2019b), контролирайте времето на отклонение с персонализиран MATLAB код. Използвайте TTL импулси за синхронизиране на събития със софтуера за събиране на данни.
За експерименти с оптично маркиране, 200 µm оптичен пач корд (Doric), свързан с 473 nm лазер (Omicron), беше свързан към 200 µm оптично влакно, поставено върху краниотомията. Непосредствено преди това, настройте мощността на джъмпера на 20 mW. Използвайте манипулатора, за да спуснете електродите до целевото място през краниотомията, която е напълнена със стерилен физиологичен разтвор. В началото на записа бяха излъчени десет светлинни импулса 473 nm (честота 2 Hz, продължителност на импулса 10 ms). Фоточувствителните клетки бяха определени като клетки, които показаха пиков отговор в рамките на 10 ms светлина в 70% или повече от опитите.