Благодарим ви, че посетихте Nature.com.Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка на CSS.За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer).Междувременно, за да осигурим постоянна поддръжка, ние ще визуализираме сайта без стилове и JavaScript.
Течната биопсия (LB) е концепция, която бързо набира популярност в областта на биомедицината.Концепцията се основава главно на откриването на фрагменти от циркулираща извънклетъчна ДНК (ccfDNA), които се освобождават главно като малки фрагменти след клетъчна смърт в различни тъкани.Малка част от тези фрагменти произхождат от чужди (чужди) тъкани или организми.В текущата работа ние приложихме тази концепция към миди, стражеви видове, известни с високия си капацитет за филтриране на морска вода.Използваме способността на мидите да действат като естествени филтри за улавяне на ДНК фрагменти от околната среда от различни източници, за да предоставим информация за биоразнообразието на морските крайбрежни екосистеми.Нашите резултати показват, че хемолимфата на мидите съдържа ДНК фрагменти, които варират значително по размер, от 1 до 5 kb.Секвенирането на пушка показа, че голям брой ДНК фрагменти са от чужд микробен произход.Сред тях открихме ДНК фрагменти от бактерии, археи и вируси, включително вируси, за които е известно, че заразяват различни гостоприемници, често срещани в крайбрежните морски екосистеми.В заключение, нашето проучване показва, че концепцията за LB, приложена към мидите, представлява богат, но все още неизследван източник на знания за микробното разнообразие в морските крайбрежни екосистеми.
Въздействието на изменението на климата (CC) върху биоразнообразието на морските екосистеми е бързо развиваща се област на изследване.Глобалното затопляне не само причинява важен физиологичен стрес, но също така разширява еволюционните граници на термичната стабилност на морските организми, засягайки местообитанията на редица видове, като ги подтиква да търсят по-благоприятни условия [1, 2].В допълнение към въздействието върху биоразнообразието на метазоите, CC нарушава деликатния баланс на взаимодействията гостоприемник-микроб.Тази микробна дисбактериоза представлява сериозна заплаха за морските екосистеми, тъй като прави морските организми по-податливи на инфекциозни патогени [3, 4].Смята се, че SS играят важна роля в масовата смърт, което е сериозен проблем за управлението на глобалните морски екосистеми [5, 6].Това е важен въпрос предвид икономическото, екологичното и хранителното въздействие на много морски видове.Това е особено вярно за двучерупчестите, живеещи в полярните региони, където ефектите от СК са по-незабавни и тежки [6, 7].Всъщност двучерупчести като Mytilus spp.се използват широко за наблюдение на ефектите от CC върху морските екосистеми.Не е изненадващо, че сравнително голям брой биомаркери са разработени за наблюдение на тяхното здраве, често използвайки двуслоен подход, включващ функционални биомаркери, базирани на ензимна активност или клетъчни функции, като клетъчна жизнеспособност и фагоцитна активност [8].Тези методи включват също измерване на концентрацията на специфични индикатори за налягане, които се натрупват в меките тъкани след абсорбирането на големи количества морска вода.Въпреки това, високият капацитет на филтриране и полуотворената циркулационна система на двучерупчестите предоставят възможност за разработване на нови хемолимфни биомаркери, използвайки концепцията за течна биопсия (LB), прост и минимално инвазивен подход за лечение на пациенти.кръвни проби [9, 10].Въпреки че няколко вида циркулиращи молекули могат да бъдат намерени в човешки LB, тази концепция се основава предимно на анализ на ДНК секвениране на циркулиращи извънклетъчни ДНК (ccfDNA) фрагменти в плазмата.Всъщност наличието на циркулираща ДНК в човешката плазма е известно от средата на 20-ти век [11], но едва през последните години появата на високопроизводителни методи за секвениране доведе до клинична диагноза, базирана на ccfDNA.Наличието на тези циркулиращи ДНК фрагменти се дължи отчасти на пасивното освобождаване на геномна ДНК (ядрена и митохондриална) след клетъчна смърт. При здрави индивиди концентрацията на ccfDNA обикновено е ниска (<10 ng/mL), но може да бъде повишена 5–10 пъти при пациенти, страдащи от различни патологии или подложени на стрес, което води до увреждане на тъканите. При здрави индивиди концентрацията на ccfDNA обикновено е ниска (<10 ng/mL), но може да бъде повишена 5–10 пъти при пациенти, страдащи от различни патологии или подложени на стрес, което води до увреждане на тъканите. При здрави хора концентрацията на vkkDNK е в ниска норма (<10 ng/ml), но може да се повиши 5–10 пъти при болни с различна патология или подложени на стрес, предизвикващ увреждане на тъканите. При здрави хора концентрацията на cccDNA обикновено е ниска (<10 ng/mL), но може да се увеличи 5–10 пъти при пациенти с различни патологии или при стрес, водещ до увреждане на тъканите.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低．(<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрациите на ccfDNA обикновено са ниски (<10 ng/ml) при здрави хора, но могат да бъдат увеличени с 5-10 пъти при пациенти с различни патологии или стрес, което води до увреждане на тъканите. Концентрациите на ccfDNA обикновено са ниски (<10 ng/ml) при здрави индивиди, но могат да бъдат увеличени 5-10 пъти при пациенти с различни патологии или стрес, което води до увреждане на тъканите.Размерът на ccfDNA фрагментите варира в широки граници, но обикновено варира от 150 до 200 bp.[12].Анализът на самостоятелно получена ccfDNA, т.е. ccfDNA от нормални или трансформирани гостоприемни клетки, може да се използва за откриване на генетични и епигенетични промени, присъстващи в ядрения и/или митохондриален геном, като по този начин помага на клиницистите да изберат специфични молекулярно-насочени терапии [13] .Въпреки това, ccfDNA може да бъде получена от чужди източници като ccfDNA от фетални клетки по време на бременност или от трансплантирани органи [14,15,16,17].ccfDNA също е важен източник на информация за откриване на наличието на нуклеинови киселини на инфекциозен агент (чужд), което позволява неинвазивно откриване на широко разпространени инфекции, които не са идентифицирани чрез хемокултури, като се избягва инвазивна биопсия на заразена тъкан [18].Скорошни проучвания наистина показват, че човешката кръв съдържа богат източник на информация, която може да се използва за идентифициране на вирусни и бактериални патогени, и че около 1% от ccfDNA, открита в човешката плазма, е от чужд произход [19].Тези проучвания показват, че биоразнообразието на циркулиращия микробиом на даден организъм може да бъде оценено с помощта на ccfDNA анализ.Въпреки това, доскоро тази концепция се използваше изключително при хора и в по-малка степен при други гръбначни [20, 21].
В настоящата статия ние използваме потенциала на LB, за да анализираме ccfDNA на Aulacomya atra, южен вид, често срещан в субантарктическите острови Кергелен, група острови на върха на голямо плато, образувано преди 35 милиона години.вулканично изригване.Използвайки експериментална система in vitro, открихме, че ДНК фрагментите в морската вода бързо се поемат от мидите и навлизат в хемолимфното отделение.Секвенирането на пушка показа, че ccfDNA на хемолимфата на миди съдържа ДНК фрагменти от собствен и несобствен произход, включително симбиотични бактерии и ДНК фрагменти от биоми, типични за студените вулканични морски крайбрежни екосистеми.Хемолимфната ccfDNA също съдържа вирусни последователности, получени от вируси с различни диапазони на гостоприемници.Открихме и ДНК фрагменти от многоклетъчни животни като костни риби, морски анемонии, водорасли и насекоми.В заключение, нашето проучване показва, че концепцията LB може да бъде успешно приложена към морски безгръбначни, за да се генерира богат геномен репертоар в морските екосистеми.
Възрастни (55-70 mm дълги) Mytilus platensis (M. platensis) и Aulacomya atra (A. atra) бяха събрани от приливните скалисти брегове на Порт-о-Франс (049°21.235 S, 070°13.490 E.).Острови Кергелен през декември 2018 г. Други възрастни сини миди (Mytilus spp.) бяха получени от търговски доставчик (PEI Mussel King Inc., остров Принц Едуард, Канада) и поставени в аериран резервоар с контролирана температура (4°C), съдържащ 10–20 L 32‰ изкуствена саламура.(изкуствена морска сол Reef Crystal, Instant Ocean, Вирджиния, САЩ).За всеки експеримент бяха измерени дължината и теглото на отделните черупки.
Безплатен протокол за отворен достъп за тази програма е достъпен онлайн (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Накратко, хемолимфата на LB се събира от абдукторните мускули, както е описано [22].Хемолимфата се избистря чрез центрофугиране при 1200×g за 3 минути, супернатантата се замразява (-20°C) до употреба.За изолиране и пречистване на cfDNA, пробите (1.5-2.0 ml) се размразяват и обработват с помощта на комплекта NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) съгласно инструкциите на производителя.ccfDNA се съхранява при -80°C до по-нататъшен анализ.В някои експерименти ccfDNA беше изолирана и пречистена с помощта на QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Торонто, Онтарио, Канада).Пречистената ДНК се определя количествено с помощта на стандартен анализ PicoGreen.Разпределението на фрагментите на изолираната ccfDNA се анализира чрез капилярна електрофореза, използвайки биоанализатор Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Санта Клара, Калифорния), използвайки високочувствителен ДНК комплект.Анализът се извършва с помощта на 1 µl от ccfDNA проба съгласно инструкциите на производителя.
За секвениране на хемолимфни ccfDNA фрагменти, Génome Québec (Монреал, Квебек, Канада) подготви библиотеки с пушки, използвайки комплекта Illumina DNA Mix от комплекта Illumina MiSeq PE75.Използван е стандартен адаптер (BioO).Файловете с необработени данни са достъпни от NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 и SRR8924809).Базовото качество на четене беше оценено с помощта на FastQC [23].Trimmomatic [24] е използван за клипс адаптери и лошо качество на четене.Четенията от пушка със сдвоени краища бяха FLASH обединени в по-дълги единични четения с минимално припокриване от 20 bp, за да се избегнат несъответствия [25]. Обединените четения бяха анотирани с BLASTN, използвайки двучерупчеста NCBI таксономична база данни (e стойност <1e-3 и 90% хомология), а маскирането на последователности с ниска сложност беше извършено с помощта на DUST [26]. Обединените четения бяха анотирани с BLASTN, използвайки двучерупчеста NCBI таксономична база данни (e стойност <1e-3 и 90% хомология), а маскирането на последователности с ниска сложност беше извършено с помощта на DUST [26]. Обединените чтения бяха анотирани с помощта на BLASTN с използване на база данни за таксономия на двусъздадени моллюски NCBI (значение e < 1e-3 и 90% хомология), а маскирането на последователни нива на ниска сложност беше извършено с помощта на DUST [26]. Обединените показания бяха анотирани с BLASTN, използвайки базата данни за таксономия на двучерупчести NCBI (e стойност < 1e-3 и 90% хомология), а маскирането на последователности с ниска сложност беше извършено с помощта на DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26] 行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 прах [26] 行复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Обединените чтения бяха анотирани с помощта на BLASTN с използване на таксономична база данни за двусъздадени молюски NCBI (значение <1e-3 и 90% хомология), а маскирането на последователни нива на ниска сложност беше извършено с DUST [26]. Обединените показания бяха анотирани с BLASTN, като се използва таксономичната база данни на NCBI за двучерупчести (e стойност <1e-3 и 90% хомология), а маскирането на последователности с ниска сложност беше извършено с помощта на DUST [26].Четенията бяха разделени на две групи: свързани с двучерупчести последователности (тук наречени самочетения) и несвързани (несамочетени).Две групи бяха отделно събрани с помощта на MEGAHIT за генериране на контиги [27].Междувременно таксономичното разпределение на показанията на извънземни микробиоми беше класифицирано с помощта на Kraken2 [28] и графично представено от кръгова диаграма на Krona на Galaxy [29, 30].Оптималните kmers бяха определени като kmers-59 от нашите предварителни експерименти. След това собствените контиги бяха идентифицирани чрез подравняване с BLASTN (база данни NCBI на двучерупчести, e стойност <1e-10 и 60% хомология) за окончателна анотация. След това собствените контиги бяха идентифицирани чрез подравняване с BLASTN (база данни NCBI на двучерупчести, e стойност <1e-10 и 60% хомология) за окончателна анотация. След това собствените контиги бяха идентифицирани чрез съпоставяне с BLASTN (база данни на двусъздадени молюски NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) за окончателна анотация. След това самоконтигите бяха идентифицирани чрез съпоставяне с BLASTN (NCBI база данни за двучерупчести животни, e стойност <1e-10 и 60% хомология) за окончателна анотация.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% След това бяха идентифицирани собствените контиги за окончателна анотация чрез съпоставяне с BLASTN (база данни NCBI за двусъздадени молюски, значение e <1e-10 и гомология 60%). След това самоконтигите бяха идентифицирани за окончателна анотация чрез съпоставяне с BLASTN (база данни за двучерупчести NCBI, e стойност <1e-10 и 60% хомология). Успоредно с това, контигите на несамостоятелна група бяха анотирани с BLASTN (база данни nt NCBI, e стойност <1e-10 и 60% хомология). Успоредно с това, контигите на несамостоятелна група бяха анотирани с BLASTN (база данни nt NCBI, e стойност <1e-10 и 60% хомология). Паралелно чуждеродните групови контиги бяха анотирани с помощта на BLASTN (база данни nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Успоредно с това, контигите на чужда група бяха анотирани с BLASTN (NT NCBI база данни, e стойност <1e-10 и 60% хомология).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Паралелно контиги, които не се отнасят към собствената група, са анотирани с помощта на BLASTN (база данни nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Успоредно с това, контигите на несамостоятелна група бяха анотирани с BLASTN (база данни nt NCBI, e стойност <1e-10 и 60% хомология). BLASTX също беше проведен върху несамостоятелни контиги, използвайки nr и RefSeq протеинови NCBI бази данни (e стойност <1e-10 и 60% хомология). BLASTX също беше проведен върху несамостоятелни контиги, използвайки nr и RefSeq протеинови NCBI бази данни (e стойност <1e-10 и 60% хомология). BLASTX също беше проведен на несамостоятелни контигахи с използване на база данни белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX се извършва и върху несамостоятелни контиги, като се използват nr и RefSeq NCBI протеинови бази данни (e стойност <1e-10 и 60% хомология).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX също изпълняваше несамостоятелни контигами с използване на база данни белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX се извършва и върху несамостоятелни контиги, като се използват nr и RefSeq NCBI протеинови бази данни (e стойност <1e-10 и 60% хомология).Пуловете BLASTN и BLASTX от несамостоятелни контиги представляват крайните контиги (вижте Допълнителен файл).
Праймерите, използвани за PCR, са изброени в Таблица S1.Taq ДНК полимераза (Bio Basic Canada, Markham, ON) се използва за амплифициране на ccfDNA целевите гени.Бяха използвани следните реакционни условия: денатурация при 95°С за 3 минути, 95°С за 1 минута, зададена температура на отгряване за 1 минута, удължаване при 72°С за 1 минута, 35 цикъла и накрая 72°С в рамките на 10 минути..PCR продуктите се разделят чрез електрофореза в агарозни гелове (1, 5%), съдържащи SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Канада) при 95 V.
Мидите (Mytilus spp.) се аклиматизират в 500 ml кислородна морска вода (32 PSU) за 24 часа при 4°C.Плазмидна ДНК, съдържаща вмъкване, кодиращо човешката галектин-7 cDNA последователност (NCBI номер за достъп L07769), се добавя към флакона при крайна концентрация от 190 μg/μl.Мидите, инкубирани при същите условия без добавяне на ДНК, бяха контролата.Третият контролен резервоар съдържа ДНК без миди.За да се наблюдава качеството на ДНК в морската вода, бяха взети проби от морска вода (20 μl; три повторения) от всеки резервоар в указаното време.За проследимост на плазмидна ДНК, LB мидите бяха събрани в посочените времена и анализирани чрез qPCR и ddPCR.Поради високото съдържание на сол в морската вода, аликвотните части се разреждат във вода с PCR качество (1:10) преди всички PCR анализи.
Дигитална капкова PCR (ddPCR) се извършва с помощта на протокола BioRad QX200 (Мисисауга, Онтарио, Канада).Използвайте температурния профил, за да определите оптималната температура (Таблица S1).Капките се генерират с помощта на генератор на капки QX200 (BioRad).ddPCR се провежда, както следва: 95°C за 5 min, 50 цикъла от 95°C за 30 s и дадена температура на отгряване за 1 min и 72°C за 30 s, 4°C за 5 min и 90°C в рамките на 5 минути.Броят на капките и положителните реакции (брой копия/µl) бяха измерени с помощта на четец за капки QX200 (BioRad).Проби с по-малко от 10 000 капчици бяха отхвърлени.Контролът на модела не се извършва всеки път, когато се изпълнява ddPCR.
qPCR се извършва с помощта на Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Сидни, Австралия) и LGALS7 специфични праймери.Всички количествени PCR бяха извършени в 20 µl с помощта на QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).qPCR беше започнат с 15 минути инкубиране при 95°C, последвано от 40 цикъла при 95°C за 10 секунди и при 60°C за 60 секунди с едно събиране на данни.Кривите на топене бяха генерирани чрез последователни измервания при 95°C за 5 s, 65°C за 60 s и 97°C в края на qPCR.Всеки qPCR се извършва в три екземпляра, с изключение на контролните проби.
Тъй като мидите са известни с високата си скорост на филтриране, първо проучихме дали могат да филтрират и задържат ДНК фрагменти, присъстващи в морската вода.Интересувахме се също дали тези фрагменти се натрупват в тяхната полуотворена лимфна система.Разрешихме този проблем експериментално, като проследихме съдбата на разтворими ДНК фрагменти, добавени в аквариуми със сини миди.За да улесним проследяването на ДНК фрагменти, ние използвахме чужда (не собствена) плазмидна ДНК, съдържаща човешкия галектин-7 ген.ddPCR проследява плазмидни ДНК фрагменти в морска вода и миди.Нашите резултати показват, че ако количеството ДНК фрагменти в морската вода остава относително постоянно във времето (до 7 дни) в отсъствието на миди, то в присъствието на миди това ниво почти напълно изчезва в рамките на 8 часа (фиг. 1a,b).Фрагменти от екзогенна ДНК лесно се откриват в рамките на 15 минути в интравалвуларна течност и хемолимфа (фиг. 1в).Тези фрагменти все още могат да бъдат открити до 4 часа след експозицията.Тази филтрираща активност по отношение на ДНК фрагменти е сравнима с филтриращата активност на бактерии и водорасли [31].Тези резултати предполагат, че мидите могат да филтрират и натрупват чужда ДНК в своите течни отделения.
Относителни концентрации на плазмидна ДНК в морска вода в присъствие (A) или отсъствие (B) на миди, измерени чрез ddPCR.В A резултатите са изразени като проценти, като границите на полетата представляват 75-ия и 25-ия персентил.Напасната логаритмична крива е показана в червено, а областта, оцветена в сиво, представлява 95% доверителен интервал.В B червената линия представлява средната стойност, а синята линия представлява 95% доверителен интервал за концентрацията.C Натрупване на плазмидна ДНК в хемолимфата и клапната течност на миди по различно време след добавянето на плазмидна ДНК.Резултатите са представени като абсолютни открити копия/mL (±SE).
След това изследвахме произхода на ccfDNA в миди, събрани от мидени легла на островите Кергелен, отдалечена група острови с ограничено антропогенно влияние.За тази цел cccDNA от хемолимфи на миди беше изолирана и пречистена чрез методи, използвани обикновено за пречистване на човешка cccDNA [32, 33].Открихме, че средните концентрации на ccfDNA на хемолимфа в мидите са в ниския диапазон на микрограма на ml хемолимфа (вижте Таблица S2, Допълнителна информация).Този диапазон от концентрации е много по-голям, отколкото при здрави хора (ниски нанограма на милилитър), но в редки случаи, при пациенти с рак, нивото на ccfDNA може да достигне няколко микрограма на милилитър [34, 35].Анализът на разпределението на размера на хемолимфната ccfDNA показа, че тези фрагменти варират значително по размер, вариращи от 1000 bp до 1000 bp.до 5000 bp (фиг. 2).Подобни резултати бяха получени с помощта на QIAamp Investigator Kit, базиран на силициев диоксид, метод, който обикновено се използва в съдебната медицина за бързо изолиране и пречистване на геномна ДНК от ДНК проби с ниска концентрация, включително ccfDNA [36].
Представителна ccfDNA електрофореграма на мидена хемолимфа.Екстрахирано с NucleoSnap Plasma Kit (отгоре) и QIAamp DNA Investigator Kit.B Диаграма на цигулка, показваща разпределението на концентрациите на ccfDNA на хемолимфа (±SE) в миди.Черните и червените линии представляват съответно медианата и първия и третия квартил.
Приблизително 1% от ccfDNA при хора и примати има чужд източник [21, 37].Като се има предвид полуотворената кръвоносна система на двучерупчестите, богатата на микроби морска вода и разпределението на размера на ccfDNA на миди, предположихме, че ccfDNA на мидена хемолимфа може да съдържа богат и разнообразен набор от микробна ДНК.За да тестваме тази хипотеза, ние секвенирахме ccfDNA на хемолимфа от проби на Aulacomya atra, събрани от островите Kerguelen, давайки над 10 милиона прочитания, 97,6% от които преминаха контрол на качеството.След това показанията бяха класифицирани според собствени и несобствени източници, използвайки базите данни за двучерупчести BLASTN и NCBI (фиг. S1, допълнителна информация).
При хората както ядрената, така и митохондриалната ДНК могат да бъдат освободени в кръвния поток [38].Въпреки това, в настоящото изследване не беше възможно да се опише в детайли ядрената геномна ДНК на мидите, като се има предвид, че геномът на A. atra не е секвениран или описан.Въпреки това, ние успяхме да идентифицираме редица ccfDNA фрагменти от нашия собствен произход, използвайки двучерупчеста библиотека (фиг. S2, допълнителна информация).Ние също така потвърдихме наличието на ДНК фрагменти от нашия собствен произход чрез насочена PCR амплификация на онези A. atra гени, които бяха секвенирани (фиг. 3).По същия начин, като се има предвид, че митохондриалният геном на A. atra е достъпен в публични бази данни, може да се намери доказателство за наличието на митохондриални ccfDNA фрагменти в хемолимфата на A. atra.Наличието на митохондриални ДНК фрагменти се потвърждава чрез PCR амплификация (фиг. 3).
Различни митохондриални гени присъстваха в хемолимфата на A. atra (червени точки – запасен номер: SRX5705969) и M. platensis (сини точки – запасен номер: SRX5705968), амплифицирани чрез PCR.Фигура, адаптирана от Breton et al., 2011 B Амплификация на хемолимфен супернатант от A. atra Съхраняван на FTA хартия.Използвайте 3 mm перфоратор, за да добавите директно към PCR епруветката, съдържаща PCR сместа.
Като се има предвид изобилието от микробно съдържание в морската вода, ние първоначално се фокусирахме върху характеризирането на микробните ДНК последователности в хемолимфата.За целта използваме две различни стратегии.Първата стратегия използва Kraken2, базирана на алгоритъм програма за класификация на последователности, която може да идентифицира микробни последователности с точност, сравнима с BLAST и други инструменти [28].Установено е, че повече от 6719 показания са с бактериален произход, докато 124 и 64 са съответно от археи и вируси (фиг. 4).Най-разпространените бактериални ДНК фрагменти са Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) и Bacteroidetes (17%) (фиг. 4а).Това разпределение е в съответствие с предишни изследвания на микробиома на морската синя мида [39, 40].Гамапротеобактериите са основният клас протеобактерии (44%), включително много Vibrionales (фиг. 4b).Методът ddPCR потвърди наличието на Vibrio ДНК фрагменти в ccfDNA на A. atra хемолимфа (фиг. 4c) [41].За да се получи повече информация за бактериалния произход на ccfDNA, беше предприет допълнителен подход (фиг. S2, допълнителна информация). В този случай четенията, които се припокриваха, бяха събрани като четения от сдвоен край и бяха класифицирани като собствени (двучерупчести) или несамостоятелни произход, използвайки BLASTN и e стойност от 1e-3 и прекъсване с> 90% хомология. В този случай четенията, които се припокриваха, бяха събрани като четения от сдвоен край и бяха класифицирани като собствени (двучерупчести) или несамостоятелни произход, използвайки BLASTN и e стойност от 1e-3 и прекъсване с> 90% хомология. В този случай прекриващите се чтения бяха събрани като чтения с парни краища и бяха класифицирани като собствени (двутворчати моллюски) или чужди по произход с използване на BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомология> 90%. В този случай припокриващите се четения бяха събрани като четения с двоен край и бяха класифицирани като естествени (двучерупчести) или неоригинални, използвайки BLASTN и e стойност от 1e-3 и прекъсване с >90% хомология.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90% 同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的 值和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В този случай прекриващите се чтения бяха събрани като чтения с парни краища и класифицирани като собствени (двустворчати моллюски) или несобствени по произход с използване на стойности e BLASTN и 1e-3 и порога гомология> 90%. В този случай припокриващите се четения бяха събрани като четения с двоен край и класифицирани като собствени (двучерупчести) или неоригинални, използвайки e BLASTN и 1e-3 стойности и праг на хомоложност >90%.Тъй като геномът на A. atra все още не е секвениран, ние използвахме стратегията за сглобяване de novo на асемблера MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).Общо 147 188 контига са идентифицирани като зависими (двучерупчести) по произход.След това тези контиги бяха експлодирани с e-стойности от 1e-10 с помощта на BLASTN и BLASTX.Тази стратегия ни позволи да идентифицираме 482 недвучерупчести фрагмента, присъстващи в ccfDNA на A. atra.Повече от половината (57%) от тези ДНК фрагменти са получени от бактерии, главно от хрилни симбионти, включително сулфотрофни симбионти, и от хрилни симбионти Solemya velum (фиг. 5).
Относително изобилие на типово ниво.B Микробно разнообразие на два основни типа (Firmicutes и Proteobacteria).Представителна амплификация на ddPCR C Vibrio spp.A. Фрагменти от гена 16S rRNA (синьо) в три атра хемолимфи.
Бяха анализирани общо 482 събрани контига.Общ профил на таксономичното разпределение на метагеномни контиг анотации (прокариоти и еукариоти).B Подробно разпределение на бактериални ДНК фрагменти, идентифицирани от BLASTN и BLASTX.
Анализът на Kraken2 също показа, че ccfDNA на миди съдържа археални ДНК фрагменти, включително ДНК фрагменти на Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) и Thaurmarcheota (11%) (фиг. 6а).Наличието на ДНК фрагменти, получени от Euryarchaeota и Crenarchaeota, открити преди това в микробната общност на калифорнийските миди, не трябва да е изненада [42].Въпреки че Euryarchaeota често се свързва с екстремни условия, сега се признава, че Euryarchaeota и Crenarcheota са сред най-често срещаните прокариоти в морската криогенна среда [43, 44].Наличието на метаногенни микроорганизми в мидите не е изненадващо, като се имат предвид последните доклади за обширни течове на метан от дънни течове на платото Кергелен [45] и възможно микробно производство на метан, наблюдавано край бреговете на островите Кергелен [46].
След това вниманието ни се насочи към показания от ДНК вируси.Доколкото ни е известно, това е първото нецелево изследване на съдържанието на вируси в мидите.Както се очакваше, открихме ДНК фрагменти от бактериофаги (Caudovirales) (фиг. 6b).Въпреки това, най-често срещаната вирусна ДНК идва от тип нуклеоцитовируси, известен също като ядрено цитоплазмен голям ДНК вирус (NCLDV), който има най-големия геном от всички вируси.В рамките на този тип повечето ДНК последователности принадлежат към семействата Mimimidoviridae (58%) и Poxviridae (21%), чиито естествени гостоприемници включват гръбначни животни и членестоноги, докато малка част от тези ДНК последователности принадлежат на известни вирусологични водорасли.Инфектира морските еукариотни водорасли.Последователностите също са получени от вируса Pandora, гигантският вирус с най-голям размер на генома от всички известни вирусни родове.Интересно е, че диапазонът от гостоприемници, за които е известно, че са заразени с вируса, както е определено чрез секвениране на ccfDNA на хемолимфа, е относително голям (Фигура S3, Допълнителна информация).Той включва вируси, които заразяват насекоми като Baculoviridae и Iridoviridae, както и вируси, които заразяват амеба, водорасли и гръбначни животни.Открихме също последователности, съответстващи на генома на Pithovirus sibericum.Питовирусите (известни също като „зомби вируси“) са изолирани за първи път от 30 000-годишна вечна замръзналост в Сибир [47].По този начин нашите резултати са в съответствие с предишни доклади, показващи, че не всички съвременни видове от тези вируси са изчезнали [48] и че тези вируси може да присъстват в отдалечени субарктически морски екосистеми.
Накрая тествахме дали можем да намерим ДНК фрагменти от други многоклетъчни животни.Общо 482 чужди контига бяха идентифицирани от BLASTN и BLASTX с библиотеки nt, nr и RefSeq (геномни и протеинови).Нашите резултати показват, че сред чуждите фрагменти на ccfDNA на многоклетъчни животни преобладава ДНК на костни кости (фиг. 5).Намерени са и ДНК фрагменти от насекоми и други видове.Сравнително голяма част от ДНК фрагментите не са идентифицирани, вероятно поради недостатъчното представяне на голям брой морски видове в геномните бази данни в сравнение с сухоземните видове [49].
В настоящата статия ние прилагаме концепцията на LB към мидите, като твърдим, че секвенирането на ccfDNA изстрел на хемолимфа може да даде представа за състава на морските крайбрежни екосистеми.По-специално, ние открихме, че 1) хемолимфата на мидите съдържа относително високи концентрации (микрограмови нива) на относително големи (~1-5 kb) циркулиращи ДНК фрагменти;2) тези ДНК фрагменти са както независими, така и ненезависими 3) Сред чуждите източници на тези ДНК фрагменти открихме бактериална, археална и вирусна ДНК, както и ДНК на други многоклетъчни животни;4) Натрупването на тези чужди ccfDNA фрагменти в хемолимфата става бързо и допринася за вътрешната филтрираща активност на мидите.В заключение, нашето проучване показва, че концепцията за LB, която досега е била прилагана главно в областта на биомедицината, кодира богат, но неизследван източник на знания, който може да се използва за по-добро разбиране на взаимодействието между контролните видове и тяхната среда.
В допълнение към примати, изолиране на ccfDNA се съобщава при бозайници, включително мишки, кучета, котки и коне [50, 51, 52].Въпреки това, доколкото ни е известно, нашето изследване е първото, което съобщава за откриване и секвениране на ccfDNA в морски видове с отворена циркулационна система.Тази анатомична характеристика и филтрираща способност на мидите може, поне отчасти, да обясни различните характеристики на размера на циркулиращите ДНК фрагменти в сравнение с други видове.При хората повечето ДНК фрагменти, циркулиращи в кръвта, са малки фрагменти с размер от 150 до 200 bp.с максимален пик от 167 bp [34, 53].Малка, но значителна част от ДНК фрагментите са с размер между 300 и 500 bp, а около 5% са по-дълги от 900 bp.[54].Причината за това разпределение на размера е, че основният източник на ccfDNA в плазмата възниква в резултат на клетъчна смърт, поради клетъчна смърт или поради некроза на циркулиращи хемопоетични клетки при здрави индивиди или поради апоптоза на туморни клетки при пациенти с рак (известна като циркулираща туморна ДНК)., ctDNA).Разпределението на размера на ccfDNA на хемолимфата, което открихме в мидите, варира от 1000 до 5000 bp, което предполага, че ccfDNA на мидите има различен произход.Това е логична хипотеза, тъй като мидите имат полуотворена съдова система и живеят в морска водна среда, съдържаща високи концентрации на микробна геномна ДНК.Всъщност нашите лабораторни експерименти, използващи екзогенна ДНК, показаха, че мидите натрупват ДНК фрагменти в морската вода, поне след няколко часа те се разграждат след клетъчно поглъщане и/или освобождават и/или съхраняват в различни организации.Като се има предвид рядкостта на клетките (както прокариотни, така и еукариотни), използването на интравалвуларни отделения ще намали количеството ccfDNA от собствени източници, както и от чужди източници.Като се има предвид значението на вродения имунитет на двучерупчестите и големия брой циркулиращи фагоцити, ние допълнително предположихме, че дори чуждата ccfDNA е обогатена с циркулиращи фагоцити, които натрупват чужда ДНК при поглъщане на микроорганизми и/или клетъчни остатъци.Взети заедно, нашите резултати показват, че ccfDNA на двучерупчеста хемолимфа е уникално хранилище на молекулярна информация и укрепва техния статут на стражеви видове.
Нашите данни показват, че секвенирането и анализът на ccfDNA фрагменти от хемолимфа, получени от бактерии, може да предостави ключова информация за бактериалната флора на гостоприемника и бактериите, присъстващи в околната морска екосистема.Техниките за секвениране на изстрели разкриха последователности на коменсалната бактерия A. atra gill, които биха били пропуснати, ако бяха използвани конвенционалните методи за идентификация на 16S rRNA, отчасти поради отклонение от референтната библиотека.Всъщност нашето използване на LB данни, събрани от M. platensis в същия миден слой в Kerguelen, показа, че съставът на свързаните с хрилете бактериални симбионти е еднакъв и за двата вида миди (фиг. S4, допълнителна информация).Това сходство на две генетично различни миди може да отразява състава на бактериалните общности в студените, серни и вулканични отлагания на Kerguelen [55, 56, 57, 58].По-високите нива на редуциращи сярата микроорганизми са добре описани при събиране на миди от биотурбирани крайбрежни зони [59], като крайбрежието на Порт-о-Франс.Друга възможност е коменсалната флора на мидите да бъде засегната от хоризонтално предаване [60, 61].Необходими са повече изследвания, за да се определи връзката между морската среда, повърхността на морското дъно и състава на симбиотичните бактерии в мидите.Тези проучвания в момента продължават.
Дължината и концентрацията на хемолимфната ccfDNA, нейната лекота на пречистване и високото качество, което позволява бързо секвениране на пушка, са някои от многото предимства на използването на ccfDNA на миди за оценка на биоразнообразието в морските крайбрежни екосистеми.Този подход е особено ефективен за характеризиране на вирусни общности (вироми) в дадена екосистема [62, 63].За разлика от бактериите, археите и еукариотите, вирусните геноми не съдържат филогенетично запазени гени като 16S последователности.Нашите резултати показват, че течни биопсии от индикаторни видове като миди могат да се използват за идентифициране на относително голям брой ccfDNA вирусни фрагменти, за които е известно, че заразяват гостоприемници, които обикновено обитават крайбрежни морски екосистеми.Това включва вируси, за които е известно, че заразяват протозои, членестоноги, насекоми, растения и бактериални вируси (напр. бактериофаги).Подобно разпределение беше открито, когато изследвахме хемолимфния ccfDNA виром на сини миди (M. platensis), събрани в същия миден слой в Kerguelen (Таблица S2, Допълнителна информация).Секвенирането на пушка на ccfDNA наистина е нов подход, набиращ скорост в изследването на вирома на хора или други видове [21, 37, 64].Този подход е особено полезен за изучаване на двойноверижни ДНК вируси, тъй като нито един ген не е запазен сред всички двойноверижни ДНК вируси, представляващи най-разнообразния и широк клас вируси в Балтимор [65].Въпреки че повечето от тези вируси остават некласифицирани и могат да включват вируси от напълно непозната част от вирусния свят [66], ние открихме, че виромите и диапазоните на гостоприемниците на мидите A. atra и M. platensis попадат между двата вида.по подобен начин (вижте фигура S3, допълнителна информация).Това сходство не е изненадващо, тъй като може да отразява липсата на селективност в усвояването на ДНК, присъстваща в околната среда.В момента са необходими бъдещи изследвания, използващи пречистена РНК, за да се характеризира РНК вирома.
В нашето изследване ние използвахме много строг тръбопровод, адаптиран от работата на Kowarski и колегите [37], които използваха двуетапно изтриване на обединени четения и контиги преди и след сглобяване на нативна ccfDNA, което води до голям дял некартографирани четения.Следователно не можем да изключим, че някои от тези некартографирани показания може все още да имат собствен произход, главно защото нямаме референтен геном за този вид миди.Използвахме също този тръбопровод, защото бяхме загрижени за химерите между собствените и несамостоятелните четения и дължините на четене, генерирани от Illumina MiSeq PE75.Друга причина за повечето неизследвани показания е, че голяма част от морските микроби, особено в отдалечени райони като Кергелен, не са анотирани.Използвахме Illumina MiSeq PE75, приемайки дължини на ccfDNA фрагменти, подобни на човешката ccfDNA.За бъдещи проучвания, като се имат предвид нашите резултати, показващи, че ccfDNA на хемолимфата има по-дълги четения от хора и/или бозайници, препоръчваме да се използва платформа за секвениране, по-подходяща за по-дълги ccfDNA фрагменти.Тази практика ще направи много по-лесно идентифицирането на повече индикации за по-задълбочен анализ.Получаването на понастоящем недостъпната пълна последователност на ядрения геном на A. atra също би улеснило значително разграничаването на ccfDNA от собствени и несобствени източници.Като се има предвид, че нашето изследване се фокусира върху възможността за прилагане на концепцията за течна биопсия към миди, ние се надяваме, че тъй като тази концепция се използва в бъдещи изследвания, ще бъдат разработени нови инструменти и тръбопроводи за увеличаване на потенциала на този метод за изследване на микробното разнообразие на мидите.морска екосистема.
Като неинвазивен клиничен биомаркер, повишените човешки плазмени нива на ccfDNA са свързани с различни заболявания, тъканни увреждания и стресови състояния [67,68,69].Това увеличение е свързано с освобождаването на ДНК фрагменти от собствен произход след увреждане на тъканите.Разгледахме този проблем, използвайки остър топлинен стрес, при който мидите бяха изложени за кратко на температура от 30 °C.Извършихме този анализ на три различни вида миди в три независими експеримента.Въпреки това, не открихме никаква промяна в нивата на ccfDNA след остър топлинен стрес (вижте Фигура S5, допълнителна информация).Това откритие може да обясни, поне отчасти, факта, че мидите имат полуотворена кръвоносна система и натрупват големи количества чужда ДНК поради високата си филтрираща активност.От друга страна, мидите, подобно на много безгръбначни, може да са по-устойчиви на увреждане на тъканите, причинено от стрес, като по този начин ограничават освобождаването на ccfDNA в тяхната хемолимфа [70, 71].
Към днешна дата ДНК анализът на биоразнообразието във водните екосистеми се фокусира главно върху метабаркодирането на ДНК на околната среда (еДНК).Въпреки това, този метод обикновено е ограничен при анализа на биоразнообразието, когато се използват праймери.Използването на секвениране с пушка заобикаля ограниченията на PCR и предубедения подбор на комплекти праймери.По този начин, в известен смисъл, нашият метод е по-близо до наскоро използвания високопроизводителен метод за секвениране на eDNA Shotgun, който е в състояние директно да секвенира фрагментирана ДНК и да анализира почти всички организми [72, 73].Съществуват обаче редица фундаментални проблеми, които отличават LB от стандартните eDNA методи.Разбира се, основната разлика между eDNA и LB е използването на естествени филтърни гостоприемници.Съобщава се за използването на морски видове като гъби и двучерупчести (Dresseina spp.) като естествен филтър за изследване на eDNA [74, 75].Изследването на Драйсена обаче използва тъканни биопсии, от които е извлечена ДНК.Анализът на ccfDNA от LB не изисква тъканна биопсия, специализирано и понякога скъпо оборудване и логистика, свързани с eDNA или тъканна биопсия.Всъщност наскоро съобщихме, че ccfDNA от LB може да се съхранява и анализира с поддръжка на FTA, без да се поддържа студена верига, което е основно предизвикателство за изследвания в отдалечени райони [76].Екстракцията на ccfDNA от течни биопсии също е проста и осигурява висококачествена ДНК за секвениране на пушка и PCR анализ.Това е голямо предимство предвид някои от техническите ограничения, свързани с eDNA анализа [77].Простотата и ниската цена на метода за вземане на проби също е особено подходящ за дългосрочни програми за мониторинг.В допълнение към тяхната висока способност за филтриране, друга добре известна характеристика на двучерупчестите е химическият мукополизахаридния състав на тяхната слуз, който насърчава абсорбцията на вируси [78, 79].Това прави двучерупчестите идеален естествен филтър за характеризиране на биоразнообразието и въздействието на изменението на климата в дадена водна екосистема.Въпреки че наличието на ДНК фрагменти, получени от гостоприемника, може да се разглежда като ограничение на метода в сравнение с eDNA, цената, свързана с наличието на такава естествена ccfDNA в сравнение с eDNA, е едновременно разбираема за огромното количество налична информация за здравни изследвания.компенсиран хост.Това включва наличието на вирусни последователности, интегрирани в генома на гостоприемника.Това е особено важно за мидите, като се има предвид наличието на хоризонтално предавани левкемични ретровируси в двучерупчести [80, 81].Друго предимство на LB пред eDNA е, че той използва фагоцитната активност на циркулиращите кръвни клетки в хемолимфата, която поглъща микроорганизмите (и техните геноми).Фагоцитозата е основната функция на кръвните клетки в двучерупчестите [82].И накрая, методът се възползва от високия капацитет на филтриране на мидите (средно 1,5 l/h морска вода) и двудневната циркулация, които увеличават смесването на различни слоеве морска вода, което позволява улавянето на хетероложна еДНК.[83, 84].По този начин анализът на ccfDNA на миди е интересен път предвид хранителните, икономическите и екологичните въздействия на мидите.Подобно на анализа на LB, събран от хора, този метод също отваря възможността за измерване на генетични и епигенетични промени в ДНК на гостоприемника в отговор на екзогенни вещества.Например, могат да се предвидят технологии за секвениране от трето поколение за извършване на анализ на метилиране в целия геном в нативна ccfDNA, използвайки секвениране на нанопори.Този процес трябва да бъде улеснен от факта, че дължината на ccfDNA фрагментите на мидите е идеално съвместима с отдавна прочетени платформи за секвениране, които позволяват анализ на метилиране на ДНК в целия геном от едно секвениране без необходимост от химически трансформации. 85,86] Това е интересна възможност, тъй като е показано, че моделите на метилиране на ДНК отразяват отговор на стреса от околната среда и продължават в продължение на много поколения.Следователно, той може да предостави ценна представа за основните механизми, управляващи реакцията след излагане на изменение на климата или замърсители [87].Използването на LB обаче не е без ограничения.Излишно е да казвам, че това изисква наличието на индикаторни видове в екосистемата.Както бе споменато по-горе, използването на LB за оценка на биоразнообразието на дадена екосистема също изисква строг биоинформатичен тръбопровод, който отчита наличието на ДНК фрагменти от източника.Друг основен проблем е наличието на референтни геноми за морски видове.Надяваме се, че инициативи като проекта за геноми на морски бозайници и наскоро създадения проект Fish10k [88] ще улеснят подобен анализ в бъдеще.Прилагането на концепцията LB към морски организми, хранещи се с филтри, също е съвместимо с най-новите постижения в технологията за секвениране, което я прави много подходяща за разработването на мулти-омови биомаркери за предоставяне на важна информация за здравето на морските местообитания в отговор на екологичния стрес.
Данните за секвениране на генома са депозирани в NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 под Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Въздействие на изменението на климата върху морския живот и екосистемите.Коул Биология.2009 г.;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Помислете за комбинираното въздействие на изменението на климата и други местни стресови фактори върху морската среда.обща научна среда.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Наука за първи март.2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Намалена устойчивост на топлина при повтарящи се условия на топлинен стрес обяснява високата летна смъртност на сините миди.Научен доклад 2019 г.;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Скорошни промени в честотата, причините и степента на смъртта на животните.Proc Natl Acad Sci САЩ.2015; 112: 1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S и др.Множество патогени, които не са специфични за вида, може да са причинили масова смъртност на Pinna nobilis.живот.2020; 10: 238.
Брадли М, Коутс С. Дж., Дженкинс Е, О'Хара TM.Потенциално въздействие на изменението на климата върху арктическите зоонози.Int J Циркумполярно здраве.2005 г.;64:468-77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Сините миди (Mytilus edulis spp.) като сигнални организми при мониторинг на замърсяването на крайбрежието: преглед.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Интегриране на течна биопсия при лечение на рак.Nat Rev Clean Oncol.2017 г.;14: 531-48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C и др.Съзряване на течна биопсия: позволява на туморната ДНК да циркулира.Nat Rev рак.2017; 17: 223-38.
Mandel P., Metais P. Нуклеинови киселини в човешка плазма.Протоколи от заседанията на дъщерните дружества на Soc Biol.1948 г.;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Нова роля на безклетъчната ДНК като молекулярен маркер за лечение на рак.Количествено определяне на биомоларен анализ.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Течната биопсия навлиза в клиниката – проблеми с прилагането и бъдещи предизвикателства.Nat Rev Clin Oncol.2021 г.;18: 297-312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW и други.Феталната ДНК присъства в майчината плазма и серум.Ланцет.1997 г.;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Изследване на хода на бременността и нейните усложнения с помощта на циркулираща извънклетъчна РНК в кръвта на жени по време на бременност.Допедиатрия.2020; 8: 605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Течна биопсия: безклетъчна ДНК на донор се използва за откриване на алогенни лезии в бъбречна присадка.Nat Rev Nephrol.2021 г.;17: 591-603.
Juan FC, Lo YM Иновации в пренаталната диагностика: секвениране на майчиния плазмен геном.Анна MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D и др.Бързо откриване на патогени с следващо поколение метагеномно секвениране на заразени телесни течности.Nat Medicine.2021; 27: 115-24.