Благодарим ви, че посетихте Nature.com.Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка на CSS.За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer).Междувременно, за да осигурим постоянна поддръжка, ние ще визуализираме сайта без стилове и JavaScript.
Неконтролираното кървене е една от водещите причини за смърт.Постигането на бърза хемостаза гарантира оцеляването на субекта като първа помощ по време на битка, пътнотранспортни произшествия и операции за намаляване на смъртността.Подсилено с нанопорести влакна композитно скеле (NFRCS), получено от прост хемостатичен филмообразуващ състав (HFFC) като непрекъсната фаза, може да задейства и подобри хемостазата.Разработката на NFRCS се основава на дизайна на крилото на водното конче.Структурата на крилото на водното конче се състои от напречни и надлъжни крила, а мембраните на крилата са свързани една с друга, за да поддържат целостта на микроструктурата.HFFC равномерно покрива повърхността на влакното с филм с нанометрова дебелина и свързва произволно разпределената дебелина на памука (Ct) (дисперсна фаза), за да образува нанопореста структура.Комбинацията от непрекъснати и диспергирани фази намалява цената на продукта десет пъти в сравнение с предлаганите в търговската мрежа продукти.Модифицираните NFRCS (тампони или ленти за китки) могат да се използват в различни биомедицински приложения.Проучванията in vivo стигат до заключението, че разработеният Cp NFRCS задейства и засилва процеса на коагулация на мястото на приложение.NFRCS може да модулира микросредата и да действа на клетъчно ниво поради своята нанопореста структура, което води до по-добро заздравяване на рани в модела на ексцизионна рана.
Неконтролираното кървене по време на бойни, интраоперативни и спешни ситуации може да представлява сериозна заплаха за живота на ранения1.Тези състояния допълнително водят до цялостно повишаване на периферното съдово съпротивление, водещо до хеморагичен шок.Подходящите мерки за контролиране на кървенето по време и след операция се считат за потенциално животозастрашаващи2,3.Увреждането на големи съдове води до масивна загуба на кръв, което води до смъртност от ≤ 50% в битка и 31% по време на операция1.Масивната загуба на кръв води до намаляване на обема на тялото, което намалява сърдечния дебит.Увеличаването на общото периферно съдово съпротивление и прогресивното увреждане на микроциркулацията водят до хипоксия в животоподдържащите органи.Може да настъпи хеморагичен шок, ако състоянието продължава без ефективна намеса1,4,5.Други усложнения включват прогресиране на хипотермия и метаболитна ацидоза, както и нарушение на коагулацията, което възпрепятства процеса на коагулация.Тежкият хеморагичен шок е свързан с по-висок риск от смърт6,7,8.При шок III степен (прогресиращ) кръвопреливането е от съществено значение за оцеляването на пациента по време на интраоперативна и следоперативна заболеваемост и смъртност.За да преодолеем всички горепосочени животозастрашаващи ситуации, ние разработихме композитно скеле, подсилено с нанопорести влакна (NFRCS), което използва минимална концентрация на полимер (0,5%), използвайки комбинация от водоразтворими хемостатични полимери.
С използването на влакнеста армировка могат да се разработят рентабилни продукти.Безразборно подредените влакна наподобяват структурата на крилото на водно конче, балансирано от хоризонталните и вертикални ивици по крилата.Напречните и надлъжните вени на крилото комуникират с крилната мембрана (фиг. 1).NFRCS се състои от подсилен Ct като скеле система с по-добра физическа и механична якост (Фигура 1).Поради достъпността и майсторството на изработката, хирурзите предпочитат да използват измервателни уреди с памучен конец (Ct) по време на операции и превръзки. Следователно, като се имат предвид многобройните му предимства, включително > 90% кристална целулоза (придава засилване на хемостатичната активност), Ct беше използван като скелетна система на NFRCS9,10. Следователно, като се имат предвид многобройните му предимства, включително > 90% кристална целулоза (придава засилване на хемостатичната активност), Ct беше използван като скелетна система на NFRCS9,10. След това, като се вземат предвид неговите многобройни предимства, в това число > 90% кристална целулоза (участва в повишена гемостатична активност), Ct се използва в качеството на скелетната система NFRCS9,10. Следователно, като се имат предвид многобройните му предимства, включително >90% кристална целулоза (участваща в повишена хемостатична активност), Ct беше използван като NFRCS скелетна система9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性，，Ct 被用作NFRCS9 ,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Следователно, като се имат предвид многобройните му предимства, включително над 90% кристална целулоза (помага за подобряване на хемостатичната активност), Ct беше използван като скеле за NFRCS9,10.Ct беше повърхностно покрит (наблюдава се образуване на нано-дебел филм) и свързан с хемостатичен филмообразуващ състав (HFFC).HFFC действа като матригел, задържайки произволно разположени Ct заедно.Разработеният дизайн предава напрежението в дисперсната фаза (усилващи влакна).Трудно е да се получат нанопорести структури с добра механична якост, като се използват минимални концентрации на полимери.Освен това не е лесно да се персонализират различни форми за различни биомедицински приложения.
Фигурата показва диаграма на дизайна на NFRCS, базиран на структурата на крилата на водното конче (A).Това изображение показва сравнителна аналогия на структурата на крилото на водно конче (пресичащите се и надлъжни вени на крилото са свързани помежду си) и микроснимка на напречно сечение на Cp NFRCS (B).Схематично представяне на NFRCS.
NFRC са разработени с помощта на HFFC като непрекъсната фаза за справяне с горните ограничения.HFFC се състои от различни филмообразуващи хемостатични полимери, включително хитозан (като основен хемостатичен полимер) с метилцелулоза (MC), хидроксипропил метилцелулоза (HPMC 50 cp) и поливинил алкохол (PVA)) (125 kDa) като поддържащ полимер, който насърчава образуването на тромби.образуване.Добавянето на поливинилпиролидин K30 (PVP K30) подобрява капацитета за абсорбиране на влага на NFRCS.Беше добавен полиетилен гликол 400 (PEG 400), за да се подобри омрежването на полимера в свързаните полимерни смеси.Три различни HFFC хемостатични състава (Cm HFFC, Ch HFFC и Cp HFFC), а именно хитозан с MC (Cm), хитозан с HPMC (Ch) и хитозан с PVA (Cp), бяха приложени към Ct.Различни in vitro и in vivo проучвания за характеризиране потвърдиха хемостатичната и заздравяващата активност на рани на NFRCS.Композитните материали, предлагани от NFRCS, могат да се използват за персонализиране на различни форми на скелета, за да отговорят на специфични нужди.
В допълнение, NFRCS може да бъде модифициран като превръзка или ролка, за да покрие цялата зона на нараняване на долните крайници и други части на тялото.Специално за бойни наранявания на крайниците, проектираният дизайн на NFRCS може да бъде променен на половин ръка или цял крак (допълнителна фигура S11).NFRCS може да се направи в гривна с тъканно лепило, което може да се използва за спиране на кървене от тежки суицидни наранявания на китката.Нашата основна цел е да разработим NFRCS с възможно най-малко полимер, който може да бъде доставен на голямо население (под прага на бедността) и който може да бъде поставен в комплект за първа помощ.Опростен, ефективен и икономичен като дизайн, NFRCS е от полза за местните общности и може да има глобално въздействие.
Хитозан (молекулно тегло 80 kDa) и амарант са закупени от Merck, Индия.Хидроксипропил метилцелулоза 50 Cp, полиетилен гликол 400 и метилцелулоза бяха закупени от Loba Chemie Pvt.LLC, Мумбай.Поливинил алкохол (молекулно тегло 125 kDa) (87-90% хидролизиран) е закупен от National Chemicals, Гуджарат.Поливинилпиролидин К30 е закупен от Molychem, Мумбай, стерилни тампони са закупени от Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Тамил Наду, с вода Milli Q (система за пречистване на вода Direct-Q3, Merck, Индия) като носител.
NFRCS е разработен с помощта на метод на лиофилизация11,12.Всички HFFC състави (Таблица 1) се приготвят с помощта на механична бъркалка.Пригответе 0,5% разтвор на хитозан, като използвате 1% оцетна киселина във вода чрез непрекъснато разбъркване при 800 rpm на механична бъркалка.Точното тегло на заредения полимер, посочено в таблица 1, се добавя към разтвора на хитозана и се разбърква, докато се получи бистър полимерен разтвор.Към получената смес се добавят PVP K30 и PEG 400 в количествата, посочени в Таблица 1, и разбъркването продължава, докато се получи бистър вискозен полимерен разтвор.Получената баня от полимерен разтвор се обработва с ултразвук в продължение на 60 минути, за да се отстранят уловените въздушни мехурчета от полимерната смес.Както е показано на допълнителна фигура S1 (b), Ct беше равномерно разпределен във всяка ямка на 6-ямкова плака (форма), допълнена с 5 ml HFFC.
Плаката с шест ямки се обработва с ултразвук в продължение на 60 минути, за да се постигне равномерно омокряне и разпределение на HFFC в Ct мрежата.След това замразете шестямковата плака при -20°C за 8-12 часа.Плаките за замразяване се лиофилизират в продължение на 48 часа, за да се получат различни формулировки на NFRCS.Същата процедура се използва за производство на различни форми и структури, като тампони или цилиндрични тампони, или всяка друга форма за различни приложения.
Точно претеглен хитозан (80 kDa) (3%) се разтваря в 1% оцетна киселина с помощта на магнитна бъркалка.Към получения разтвор на хитозан се добавя 1% PEG 400 и се разбърква в продължение на 30 минути.Изсипете получения разтвор в квадратен или правоъгълен съд и замразете при -80°C за 12 часа.Замразените проби се лиофилизират в продължение на 48 часа, за да се получи порест Cs13.
Разработеният NFRCS беше подложен на експерименти с помощта на инфрачервена спектроскопия с преобразуване на Фурие (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Токио, Япония), за да се потвърди химическата съвместимост на хитозана с други полимери 14, 15.FTIR спектрите (ширина на спектралния диапазон от 400 до 4000 cm-1) на всички тествани проби бяха получени чрез извършване на 32 сканирания.
Степента на кръвна абсорбция (BAR) за всички състави беше оценена с помощта на метода, описан от Chen et al.16 с леки модификации.Разработените NFRK от всички състави бяха изсушени във вакуумна пещ при 105 ° C за една нощ, за да се отстрани остатъчният разтворител.30 mg NFRCS (първоначално тегло на пробата – W0) и 30 mg Ct (положителна контрола) бяха поставени в отделни блюда, съдържащи предварителна смес от 3,8% натриев цитрат.На предварително определени интервали от време, т.е. 5, 10, 20, 30, 40 и 60 секунди, NFRCS бяха отстранени и техните повърхности почистени от неабсорбирана кръв чрез поставяне на пробите върху Ct за 30 секунди.Крайното тегло на кръвта, абсорбирана от NFRCS 16, се взема предвид (W1) във всяка времева точка.Изчислете процента на BAR, като използвате следната формула:
Времето за съсирване на кръвта (BCT) се определя, както е докладвано от Wang et al.17 .Времето, необходимо за съсирване на цяла кръв (плъхова кръв, предварително смесена с 3,8% натриев цитрат) в присъствието на NFRCS, се изчислява като BCT на тестовата проба.Различните NFRCS компоненти (30 mg) се поставят във флакони с винтова капачка от 10 ml и се инкубират при 37°C.Към флакона се добавя кръв (0.5 ml) и се добавят 0.3 ml 0.2 М CaCl2 за активиране на кръвосъсирването.Накрая обръщайте флакона на всеки 15 секунди (до 180°), докато се образува твърд съсирек.BCT на извадката се оценява чрез броя на обръщанията 17,18.Въз основа на BCT, два оптимални състава от NFRCS Cm, Ch и Cp бяха избрани за по-нататъшни изследвания за характеризиране.
BCT на съставите Ch NFRCS и Cp NFRCS се определя чрез прилагане на метода, описан от Li et al.19 .Поставете 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS и Cs (положителна контрола) в отделни петриеви панички (37 °C).Кръв, съдържаща 3,8% натриев цитрат, се смесва с 0,2 М CaCl2 в обемно съотношение 10:1, за да започне процеса на кръвосъсирване.20 µl от 0,2 М CaCl2 смес от кръв на плъх се нанася върху повърхността на пробата и се поставя в празна паничка на Петри.Контролата беше кръв, излята в празни петриеви панички без Ct.На фиксирани интервали от 0, 3 и 5 минути, спрете съсирването, като добавите 10 ml дейонизирана (DI) вода към пробата, съдържаща съда, без да нарушавате съсирека.Некоагулираните еритроцити (еритроцити) претърпяват хемолиза в присъствието на дейонизирана вода и освобождават хемоглобин.Хемоглобинът в различни времеви точки (HA(t)) се измерва при 540 nm (λmax хемоглобин) с помощта на UV-Vis спектрофотометър.Абсолютната абсорбция на хемоглобин (AH(0)) за 0 min от 20 µl кръв в 10 ml дейонизирана вода беше взета като референтен стандарт.Относителното поемане на хемоглобин (RHA) на коагулирана кръв се изчислява от съотношението HA(t)/HA(0), като се използва същата партида кръв.
С помощта на анализатор на текстура (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, САЩ) бяха определени адхезивните свойства на NFRK към увредената тъкан.Притиснете цилиндричен съд с отворено дъно към вътрешността на свинската кожа (без слоя мазнина).Проби (Ch NFRCS и Cp NFRCS) се прилагат чрез канюла в цилиндрични форми, за да се създаде адхезия към кожата на прасето.След 3 минути инкубиране при стайна температура (RT) (25°С), адхезионната сила на NFRCS се записва при постоянна скорост от 0.5 mm/sec.
Основната характеристика на хирургическите уплътнители е да повишават съсирването на кръвта, като същевременно намаляват загубата на кръв.Коагулацията без загуба в NFRCS беше оценена с помощта на публикуван преди това метод с леки модификации 19 .Направете микроцентрофужна епруветка (2 ml) (вътрешен диаметър 10 mm) с отвор 8 × 5 mm2 от едната страна на центрофужната епруветка (представляваща отворена рана).NFRCS се използва за затваряне на отвора, а лентата се използва за запечатване на външните ръбове.Добавете 20 µl от 0,2 М CaCl2 към микроцентрофужната епруветка, съдържаща 3,8% предварителна смес от натриев цитрат.След 10 минути микроцентрофужните епруветки се отстраняват от съдовете и се определя увеличаването на масата на съдовете поради изтичането на кръв от NFRK (n = 3).Загубата на кръв Ch NFRCS и Cp NFRCS бяха сравнени с Cs.
Мократа цялост на NFRCS беше определена въз основа на метода, описан от Mishra и Chaudhary21 с незначителни модификации.Поставете NFRCS в ерленмайерова колба от 100 ml с 50 ml вода и завъртете за 60 s, без да образувате капак.Визуална проверка и приоритизиране на пробите за физическа цялост въз основа на събирането.
Силата на свързване на HFFC към Ct беше изследвана с помощта на публикувани преди това методи с незначителни модификации.Целостта на повърхностното покритие беше оценена чрез излагане на NFRK на акустични вълни (външен стимул) в присъствието на milliQ вода (Ct).Разработените NFRCS Ch NFRCS и Cp NFRCS бяха поставени в чаша, пълна с вода и подложени на ултразвук за 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и 30 минути, съответно.След изсушаване, процентната разлика между първоначалното и крайното тегло на NFRCS беше използвана за изчисляване на процентната загуба на материал (HFFC).In vitro BCT допълнително поддържа силата на свързване или загубата на повърхностни материали.Ефективността на HFFC свързването с Ct осигурява коагулация на кръвта и еластично покритие върху повърхността на Ct22.
Хомогенността на разработения NFRCS се определя от BCT на проби (30 mg), взети от произволно избрани общи места на NFRCS.Следвайте гореспоменатата BCT процедура, за да определите съответствието с NFRCS.Близостта между всичките пет проби осигурява равномерно повърхностно покритие и отлагане на HFFC в мрежата Ct.
Номиналната контактна площ с кръв (NBCA) беше определена, както беше докладвано по-рано с някои модификации.Коагулирайте кръвта чрез притискане на 20 µl кръв между двете повърхности на Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS и Cs.След 1 час двете части на стента бяха разделени и ръчно измерена площта на съсирека.Средната стойност на три повторения се счита за NBCA NFRCS19.
Анализът на динамичната сорбция на пари (DVS) беше използван за оценка на ефективността на NFRCS за абсорбиране на вода от външната среда или от мястото на нараняване, отговорно за започване на коагулация.DVS оценява или записва поемането и загубата на пари в проба гравиметрично, като използва ултрачувствителна везна с разделителна способност на масата от ±0,1 µg.Частично налягане на парите (относителна влажност) се генерира от електронен регулатор на масовия поток около пробата чрез смесване на наситени и сухи газове носители. Съгласно насоките на Европейската фармакопея, въз основа на процента на поглъщане на влага от пробите, пробите бяха категоризирани в 4 категории (0–0,012% w/w− нехигроскопични, 0,2–2% w/w леко хигроскопични, 2–15% умерено хигроскопични и > 15% много хигроскопични)23. Съгласно насоките на Европейската фармакопея, въз основа на процента на поглъщане на влага от пробите, пробите бяха категоризирани в 4 категории (0–0,012% w/w− нехигроскопични, 0,2–2% w/w леко хигроскопични, 2–15% умерено хигроскопични и > 15% много хигроскопични)23.В съответствие с препоръките на Европейската фармакопея, в зависимост от процента на абсорбция на влага от пробите, пробите бяха разделени в 4 категории (0–0,012% w/w – нехигроскопични, 0,2–2% w/w леко хигроскопични, 2– петнадесет %).% умерено гигроскопичен и > 15% много гигроскопичен)23. % умерено хигроскопични и > 15% много хигроскопични)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,012% w/w- 非吸湿性、0,2-2% w/w /w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（(0-0,012% W/w- 吸)湿 性 、 、 、 、 0,2-2% W/W 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23。В съответствие с препоръките на Европейската фармакопея, пробите се разделят на 4 класа в зависимост от процента на влага, абсорбирана от пробата (0-0,012% тегловни – нехигроскопични, 0,2-2% тегловни слабо хигроскопични, 2-15% тегловни).% умерено гигроскопичен, > 15 % много гигроскопичен) 23. % умерено хигроскопичен, > 15% много хигроскопичен) 23.Хигроскопичната ефективност на NFCS X NFCS и TsN NFCS се определя на анализатор DVS TA TGA Q5000 SA.По време на този процес бяха получени времето на работа, относителната влажност (RH) и теглото на пробата в реално време при 25°C24.Съдържанието на влага се изчислява чрез точен NFRCS масов анализ, като се използва следното уравнение:
MC е NFRCS влажност.m1 – сухо тегло на НСПВС.m2 е масата на NFRCS в реално време при дадена RH.
Общата повърхностна площ беше оценена с помощта на експеримент за адсорбция на азот с течен азот след изпразване на пробите при 25 ° C в продължение на 10 часа (<7 × 10–3 Torr). Общата повърхностна площ беше оценена с помощта на експеримент за адсорбция на азот с течен азот след изпразване на пробите при 25 ° C в продължение на 10 часа (<7 × 10–3 Torr). Общата площ на повърхността беше оценена с помощта на експеримент за адсорбция на азотен жидък азот след изпаряване на образци при 25 °C в продължение на 10 часа (< 7 × 10–3 Torr). Общата повърхностна площ беше оценена с помощта на експеримент за адсорбция на азот с течен азот, след като пробите бяха изпразнени при 25 ° C в продължение на 10 часа (<7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时）(< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。Температура 25°C Общата площ на повърхността беше оценена с използване на експерименти по адсорбция на азотен жидък азот след изпаряване на проби в продължение на 10 часа при 25°C (< 7 × 10-3 тора). Общата повърхностна площ беше оценена с помощта на експерименти за адсорбция на азот с течен азот, след като пробите бяха изпразнени за 10 часа при 25°C (< 7 x 10-3 torr).Общата повърхностна площ, обемът на порите и размерът на порите на NFRCS бяха определени с Quantachrome от NOVA 1000e, Австрия, като се използва софтуер RS 232.
Пригответе 5% RBC (физиологичен разтвор като разредител) от цяла кръв.След това прехвърлете аликвотна част от HFFC (0,25 ml) в 96-ямкова плака и 5% RBC маса (0,1 ml).Инкубирайте сместа при 37°C за 40 минути.Смес от червени кръвни клетки и серум се счита за положителна контрола, а смес от физиологичен разтвор и червени кръвни клетки като отрицателна контрола.Хемаглутинацията се определя по скалата на Stajitzky.Предложените мащаби са както следва: + + + + плътни гранулирани агрегати;+ + + гладки долни подложки с извити ръбове;+ + гладки долни подложки с накъсани ръбове;+ тесни червени пръстени около ръбовете на гладките подложки;– (отрицателен) отделен червен бутон 12 в центъра на долната ямка.
Хемосъвместимостта на NFRCS е изследвана по метода на Международната организация по стандартизация (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27.Гравиметричният метод, описан от Singh et al.Бяха направени незначителни модификации за оценка на образуването на тромби в присъствието на или на повърхността на NFRCS.500 mg Cs, Ch NFRCS и Cp NFRCS се инкубират във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) за 24 часа при 37°C.След 24 часа PBS се отстранява и NFRCS се третира с 2 ml кръв, съдържаща 3.8% натриев цитрат.На повърхността на NFRCS добавете 0,04 ml 0,1 M CaCl2 към инкубираните проби.След 45 минути се добавят 5 ml дестилирана вода, за да се спре коагулацията.Коагулираната кръв на повърхността на NFRK се третира с 36-38% разтвор на формалдехид.Съсиреците, фиксирани с формалдехид, се изсушават и претеглят.Процентът на тромбоза се оценява чрез изчисляване на теглото на чашата без кръв и проба (отрицателна контрола) и чашата с кръв (положителна контрола).
Като първоначално потвърждение, пробите бяха визуализирани под оптичен микроскоп, за да се разбере способността на HFFC повърхностното покритие, Ct взаимосвързани и Ct мрежа да образуват пори.Тънки участъци от Ch и Cp от NFRCS бяха подрязани с острие на скалпел.Полученият участък се поставя върху предметно стъкло, покрива се с покривно стъкло и краищата се фиксират с лепило.Подготвените слайдове се разглеждат под оптичен микроскоп и се правят снимки при различни увеличения.
Отлагането на полимер в Ct мрежи се визуализира с помощта на флуоресцентна микроскопия въз основа на метода, описан от Rice et al.29. Съставът на HFFC, използван за формулировката, се смесва с флуоресцентно багрило (амарант) и NFRCS (Ch & Cp) се приготвят съгласно метода, споменат по-горе. Съставът на HFFC, използван за формулировката, се смесва с флуоресцентно багрило (амарант) и NFRCS (Ch & Cp) се приготвят съгласно метода, споменат по-горе.Съставът на HFFC, използван за формулиране, се смесва с флуоресцентно багрило (амарант) и NFRCS (Ch и Cp) се получава съгласно споменатия по-горе метод.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。Съставът на HFFC, използван във формулировката, се смесва с флуоресцентно багрило (Амарант) и се получава NFRCS (Ch и Cp), както беше споменато по-рано.Тънки срезове от NFRK бяха изрязани от получените проби, поставени върху предметни стъкла и покрити с покривни стъкла.Наблюдавайте приготвените слайдове под флуоресцентен микроскоп, като използвате зелен филтър (310-380 nm).Изображенията са направени при 4x увеличение, за да се разберат Ct връзките и излишното отлагане на полимер в Ct мрежата.
Повърхностната топография на NFRCS Ch и Cp беше определена с помощта на атомно-силов микроскоп (AFM) с ултра-остър TESP конзола в режим на потупване: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Тайван.Грапавостта на повърхността се определя чрез среден квадрат (RMS) с помощта на софтуер (Scanning Probe Image Processor).Различни местоположения на NFRCS бяха изобразени на 3D изображения, за да се провери еднородността на повърхността.Стандартното отклонение на резултата за дадена област се определя като грапавостта на повърхността.Уравнението RMS беше използвано за количествено определяне на грапавостта на повърхността на NFRCS31.
Проучвания, базирани на FESEM, бяха проведени с помощта на FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Токио, за да се разбере повърхностната морфология на Ch NFRCS и Cp NFRCS, които показаха по-добър BCT от Cm NFRCS.Изследването FESEM е проведено съгласно метода, описан от Zhao et al.32 с малки модификации.NFRCS 20 до 30 mg Ch NFRCS и Cp NFRCS бяха предварително смесени с 20 ul от 3,8% натриев цитрат, предварително смесен с кръв от плъх.20 μl от 0,2 М CaCl2 се добавят към пробите, обработени с кръв, за да се инициира коагулация и пробите се инкубират при стайна температура за 10 минути.В допълнение, излишните еритроцити бяха отстранени от повърхността на NFRCS чрез изплакване с физиологичен разтвор.
Следващите проби се третират с 0,1% глутаралдехид и след това се сушат в пещ с горещ въздух при 37°C за отстраняване на влагата.Изсушените проби бяха покрити и анализирани 32 .Други изображения, получени по време на анализа, са образуване на съсирек на повърхността на отделни памучни влакна, отлагане на полимер между Ct, морфология (форма) на еритроцитите, цялост на съсирека и морфология на еритроцити в присъствието на NFRCS.Нетретирани NFRCS области и третирани с Ch и Cp NFRCS области, инкубирани с кръв, бяха сканирани за елементарни йони (натрий, калий, азот, калций, магнезий, цинк, мед и селен)33.Сравнете процентите на елементарни йони между третирани и нетретирани проби, за да разберете натрупването на елементарни йони по време на образуването на съсирек и хомогенността на съсирека.
Дебелината на Cp HFFC повърхностното покритие върху Ct повърхността се определя с помощта на FESEM.Напречните сечения на Cp NFRCS бяха изрязани от рамката и покрити с разпръскване.Получените проби от разпрашено покритие бяха наблюдавани от FESEM и дебелината на повърхностното покритие беше измерена 34, 35, 36.
Рентгеновата микро-CT осигурява 3D неразрушително изображение с висока разделителна способност и ви позволява да изучавате вътрешното структурно устройство на NFRK.Micro-CT използва рентгенов лъч, преминаващ през пробата, за да запише локалния линеен коефициент на затихване на рентгеновите лъчи в пробата, което помага за получаване на морфологична информация.Вътрешното местоположение на Ct в Cp NFRCS и третирания с кръв Cp NFRCS беше изследвано чрез микро-CT, за да се разбере ефективността на абсорбция и съсирването на кръвта в присъствието на NFRCS37,38,39.3D структурите на третирани с кръв и нетретирани Cp NFRCS проби бяха реконструирани с помощта на микро-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Германия).С помощта на софтуера VG STUDIO-MAX версия 2.2 бяха направени няколко рентгенови изображения от различни ъгли (в идеалния случай 360° покритие), за да се разработят 3D изображения за NFRCS.Събраните проекционни данни бяха реконструирани в 3D обемни изображения с помощта на съответния прост софтуер 3D ScanIP Academic.
В допълнение, за да се разбере разпределението на съсирека, 20 µl предварително смесена цитратна кръв и 20 µl от 0,2 М CaCl2 бяха добавени към NFRCS, за да се инициира съсирването на кръвта.Приготвените проби се оставят да се втвърдят.Повърхността на NFRK се третира с 0, 5% глутаралдехид и се изсушава в пещ с горещ въздух при 30–40 ° C за 30 минути.Кръвният съсирек, образуван върху NFRCS, беше сканиран, реконструиран и беше визуализирано 3D изображение на кръвния съсирек.
Антибактериалните анализи бяха извършени на Cp NFRCS (най-добро в сравнение с Ch NFRCS), като се използва описаният по-горе метод с незначителни модификации.Антибактериалната активност на Cp NFRCS и Cp HFFC се определя с помощта на три различни тестови микроорганизми [S.aureus (грам-положителни бактерии), E.coli (грам-отрицателни бактерии) и бяла кандида (C.albicans)], растящи върху агар в петриеви панички в инкубатор.Равномерно инокулирайте 50 ml от разредената суспензия от бактериална култура в концентрация 105-106 CFU ml-1 върху агарната среда.Изсипете средата в петриево блюдо и я оставете да се втвърди.Бяха направени ямки на повърхността на агаровата плака, за да се напълнят с HFFC (3 ямки за HFFC и 1 за отрицателна контрола).Добавете 200 µl HFFC към 3 ямки и 200 µl pH 7,4 PBS към 4-та ямка.От другата страна на петриевото блюдо поставете 12 mm Cp NFRCS диск върху втвърдения агар и навлажнете с PBS (pH 7,4).Таблетките ципрофлоксацин, ампицилин и флуконазол се считат за референтни стандарти за Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Candida albicans.Измерете зоната на инхибиране ръчно и направете цифрово изображение на зоната на инхибиране.
След институционално етично одобрение, проучването е проведено в Медицинския колеж за образование и изследвания Kasturba в Манипал, Карнатака, в Южна Индия.Експерименталният протокол за in vitro TEG е прегледан и одобрен от институционалния комитет по етика на медицинския колеж Kasturba, Манипал, Карнатака (IEC: 674/2020).Субектите бяха наети от доброволци кръводарители (на възраст от 18 до 55 години) от болничната кръвна банка.Освен това беше получен формуляр за информирано съгласие от доброволците за вземане на кръвни проби.Нативен TEG (N-TEG) ​​беше използван за изследване на ефекта на Cp HFFC формулировката върху цяла кръв, предварително смесена с натриев цитрат.N-TEG е широко признат за ролята си в реанимацията на място, което създава проблеми за клиницистите поради потенциала за клинично значимо забавяне на резултатите (рутинни коагулационни тестове).N-TEG анализът се извършва с помощта на цяла кръв.От всички участници бяха получени информирано съгласие и подробна медицинска история.Проучването не включва участници с хемостатични или тромботични усложнения като бременност/след раждане или чернодробно заболяване.Субектите, приемащи лекарства, които влияят на коагулационната каскада, също бяха изключени от проучването.На всички участници бяха проведени основни лабораторни изследвания (хемоглобин, протромбиново време, активиран тромбопластин и брой на тромбоцитите) съгласно стандартните процедури.N-TEG определя вискоеластичността на кръвния съсирек, първоначалната структура на съсирека, взаимодействието на частиците, укрепването на съсирека и неговия лизис.N-TEG анализът предоставя графични и числени данни за колективните ефекти на няколко клетъчни елемента и плазма.N-TEG анализът се извършва върху два различни обема Cp HFFC (10 ul и 50 ul).В резултат на това 1 ml цяла кръв с лимонена киселина се добавя към 10 μl Cp HFFC.Добавете 1 ml (Cp HFFC + цитратна кръв), 340 µl смесена кръв към 20 µl 0,2 M CaCl2, съдържаща TEG паничка.След това TEG блюда бяха заредени в TEG® 5000, US за измерване на R, K, алфа ъгъл, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% от кръвни проби в присъствието на Cp HFFC41.
Протоколът за изследване in vivo беше прегледан и одобрен от Институционалния комитет по етика на животните (IAEC), Медицински факултет Кастурба, Институт за висше образование Манипал, Манипал (IAEC/KMC/69/2020).Всички експерименти с животни са извършени в съответствие с препоръките на Комитета за контрол и надзор на експериментите с животни (CPCSEA).Всички in vivo изследвания на NFRCS (2 × 2 cm2) са извършени върху женски плъхове Wistar (с тегло от 200 до 250 g).Всички животни бяха аклиматизирани при температура 24-26°C, животните имаха свободен достъп до стандартна храна и вода ad libitum.Всички животни бяха разделени на случаен принцип в различни групи, всяка група се състоеше от три животни.Всички изследвания са извършени в съответствие с Изследвания върху животни: Доклад от експерименти in vivo 43 .Преди изследването животните се анестезират чрез интраперитонеално (ip) приложение на смес от 20-50 mg кетамин (на 1 kg телесно тегло) и 2-10 mg ксилазин (на 1 kg телесно тегло).След изследването обемът на кървене се изчислява чрез оценка на разликата между първоначалното и крайното тегло на пробите, средната стойност, получена от трите теста, се приема като обем на кървене на пробата.
Моделът на ампутация на опашката на плъх беше приложен, за да се разбере потенциалът на NFRCS да модулира кървенето при травма, битка или пътнотранспортно произшествие (модел на нараняване).Отрежете 50% от опашката с острие на скалпел и я поставете на въздух за 15 s, за да осигурите нормално кървене.В допълнение, тестови проби бяха поставени върху опашката на плъх чрез прилагане на натиск (Ct, Cs, Ch NFRCS и Cp NFRCS).Докладвани са кървене и PCT за тестови проби (n = 3)17,45.
Ефективността на контрола на налягането на NFRCS в битка беше изследвана върху модел на повърхностната феморална артерия.Феморалната артерия се разкрива, пунтира се с 24G троакар и се кърви в рамките на 15 секунди.След като се наблюдава неконтролирано кървене, тестовият образец се поставя на мястото на пункцията с приложен натиск.Веднага след прилагането на тестовата проба се записва времето на съсирване и се наблюдава хемостатичната ефективност през следващите 5 минути.Същата процедура се повтаря с Cs и Ct46.
Даулинг и др.47 предложи модел на чернодробно увреждане за оценка на хемостатичния потенциал на хемостатичните материали в контекста на интраоперативно кървене.BCT беше записан за Ct проби (отрицателна контрола), Cs рамка (положителна контрола), Ch NFRCS проби и Cp NFRCS проби.Супрахепаталната празна вена на плъх се разкрива чрез извършване на средна лапаротомия.След това дисталната част на левия лоб се изрязва с ножица.Направете разрез в черния дроб с острие на скалпел и го оставете да кърви за няколко секунди.Точно претеглени Ch NFRCS и Cp NFRCS тестови проби бяха поставени върху увредената повърхност без никакво положително налягане и BCT беше записан.След това контролната група (Ct) приложи натиск, последван от Cs 30 s47, без да наруши нараняването.
In vivo тестове за зарастване на рани бяха проведени с помощта на модел на ексцизионна рана, за да се оценят свойствата за заздравяване на рани на разработените NFRCS на базата на полимер.Модели на ексцизионни рани бяха избрани и изпълнени съгласно предварително публикувани методи с незначителни модификации 19, 32, 48.Всички животни бяха анестезирани, както е описано по-горе.Използвайте перфоратор за биопсия (12 mm), за да направите кръгъл дълбок разрез в кожата на гърба.Подготвените места на рани бяха облечени с Cs (положителна контрола), Ct (разпознавайки, че памучните тампони пречат на заздравяването), Ch NFRCS и Cp NFRCS (експериментална група) и отрицателна контрола без никакво лечение.На всеки ден от изследването площта на раната се измерва при всички плъхове.Използвайте цифров фотоапарат, за да направите снимка на раната и поставете нова превръзка.Процентът на затваряне на раната се измерва по следната формула:
Въз основа на процента на затваряне на раната на 12-ия ден от изследването, кожата на плъх от най-добрата група беше изрязана ((Cp NFRCS) и контролната група) и изследвана чрез H&E оцветяване и трихромно оцветяване на Masson. Въз основа на процента на затваряне на раната на 12-ия ден от изследването, кожата на плъх от най-добрата група беше изрязана ((Cp NFRCS) и контролната група) и изследвана чрез H&E оцветяване и трихромно оцветяване на Masson.Въз основа на процента на затваряне на раната на 12-ия ден от изследването, кожата на плъховете от най-добрата група ((Cp NFRCS) и контролната група) се изрязва и изследва чрез оцветяване с хематоксилин-еозин и трихром на Masson.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和Mas син三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组)Плъхове в най-добрата група ((Cp NFRCS) и контролни групи) бяха изрязани за оцветяване с хематоксилин-еозин и трихромно оцветяване на Masson въз основа на процентно затваряне на раната на 12-ия ден от изследването.Приложената процедура на оцветяване се провежда съгласно описаните по-рано методи 49, 50.Накратко, след фиксиране в 10% формалин, пробите бяха дехидратирани с помощта на серия градирани алкохоли.Използвайте микротом, за да получите тънки срезове (с дебелина 5 µm) от изрязаната тъкан.Тънки серийни срезове от контроли и Cp NFRCS бяха третирани с хематоксилин и еозин за изследване на хистопатологичните промени.Трихромното оцветяване на Masson се използва за откриване на образуването на колагенови фибрили.Получените резултати са изследвани на сляпо от патолози.
Стабилността на пробите Cp NFRCS е изследвана при стайна температура (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) в продължение на 12 месеца51.Cp NFRCS (обезцветяване на повърхността и микробен растеж) беше визуално инспектиран и тестван за устойчивост на износване при сгъване и BCT съгласно горните методи, посочени в раздела Материали и методи.
Мащабируемостта и възпроизводимостта на Cp NFRCS беше изследвана чрез приготвяне на Cp NFRCS с размер 15 × 15 cm2.В допълнение, 30 mg проби (n = 5) бяха изрязани от различни Cp NFRCS фракции и BCT на изследваните проби беше оценен, както е описано по-рано в раздела Методи.
Ние се опитахме да разработим различни форми и структури, използвайки Cp NFRCS композиции за различни биомедицински приложения.Такива форми или конфигурации включват конусовидни тампони за кървене от носа, стоматологични процедури и цилиндрични тампони за вагинално кървене.
Всички набори от данни са изразени като средно ± стандартно отклонение и са анализирани чрез ANOVA с помощта на Prism 5.03 (GraphPad, Сан Диего, Калифорния, САЩ), последвано от теста за множество сравнения на Bonferroni (*p<0.05).
Всички процедури, извършени при изследвания върху хора, са в съответствие със стандартите на Института и Националния изследователски съвет, както и с Декларацията от Хелзинки 1964 г. и нейните последващи изменения или подобни етични стандарти.Всички участници бяха информирани за особеностите на проучването и неговия доброволен характер.Данните за участниците остават поверителни, след като бъдат събрани.Експерименталният протокол за in vitro TEG е прегледан и одобрен от институционалния комитет по етика на медицинския колеж Kasturba, Манипал, Карнатака (IEC: 674/2020).Доброволците подписаха информирано съгласие за вземане на кръвни проби.
Всички процедури, извършени при проучвания върху животни, са извършени в съответствие с Медицинския факултет на Кастуба, Институт за висше образование Манипал, Манипал (IAEC/KMC/69/2020).Всички проектирани експерименти с животни са проведени в съответствие с насоките на Комитета за контрол и надзор на експериментите с животни (CPCSEA).Всички автори следват указанията на ARRIVE.
FTIR спектрите на всички NFRCS бяха анализирани и сравнени със спектъра на хитозана, показан на Фигура 2А.Характерни спектрални пикове на хитозан (записани) при 3437 cm-1 (OH и NH разтягане, припокриване), 2945 и 2897 cm-1 (CH разтягане), 1660 cm-1 (NH2 деформация), 1589 cm-1 (N–H огъване), 1157 cm-1 (мостово разтягане O-), 1067 cm-1 (разтягане C–O, вторично хидро ксил), 993 cm-1 (разтегнат CO, Bo-OH) 52.53.54.Допълнителна таблица S1 показва стойностите на спектъра на абсорбция на FTIR NFRCS за хитозан (репортер), чист хитозан, Cm, Ch и Cp.FTIR спектрите на всички NFRCS (Cm, Ch и Cp) показват същите характерни ивици на абсорбция като чистия хитозан без никакви значителни промени (фиг. 2A).Резултатите от FTIR потвърдиха липсата на химически или физически взаимодействия между полимерите, използвани за разработване на NFRCS, което показва, че използваните полимери са инертни.
In vitro характеризиране на Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS и Cs.(A) представлява комбинираните FTIR спектри на съставите от хитозан и Cm NFRCS, Ch NFRCS и Cp NFRCS при компресия.(B) a) Степен на усвояване на NFRCS от цяла кръв Cm, Ch, Cp и Cg (n = 3);Ct пробите показват по-висока BAR, тъй като памучният тампон има по-висока ефективност на абсорбция;b) Кръв след абсорбция на кръв Илюстрация на абсорбираната проба.Графично представяне на BCT на тестова проба C (Cp NFRCS има най-добрия BCT (15 s, n = 3)). Данните в C, D, E и G бяха показани като средно ± SD, а лентите за грешка представляват SD, ***p <0,0001. Данните в C, D, E и G бяха показани като средно ± SD, а лентите за грешка представляват SD, ***p <0,0001. Данните в C, D, E и G са представени като средно ± стандартно отклонение, а планките с погрешности представляват стандартно отклонение, ***p <0,0001. Данните в C, D, E и G са представени като средно ± стандартно отклонение, а лентите за грешка представляват стандартно отклонение, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001. Данните в C, D, E и G са показани като средно значение ± стандартно отклонение, планките погрешности представляват стандартно отклонение, ***p <0,0001. Данните в C, D, E и G са показани като средно ± стандартно отклонение, лентите за грешки представляват стандартно отклонение, ***p<0,0001.