Благодарим ви, че посетихте Nature.com.Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка на CSS.За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer).Междувременно, за да осигурим постоянна поддръжка, ние ще визуализираме сайта без стилове и JavaScript.
Плодовитостта на птиците зависи от способността им да съхраняват достатъчно жизнеспособни сперматозоиди за продължителен период от време в тубулите за съхранение на сперма (SST).Точният механизъм, по който сперматозоидите влизат, пребивават в и напускат SST, остава спорен.Спермата на кокошки шаркаси показва висока склонност към аглутинация, образувайки подвижни нишковидни снопчета, съдържащи много клетки.Поради трудността да се наблюдава подвижността и поведението на сперматозоидите в непрозрачна фалопиева тръба, ние използвахме микрофлуидно устройство с напречно сечение на микроканала, подобно на това на сперматозоидите, за да изследваме аглутинацията и подвижността на сперматозоидите.Това проучване обсъжда как се образуват снопове сперматозоиди, как се движат и възможната им роля за разширяване на пребиваването на спермата в SST.Изследвахме скоростта на сперматозоидите и реологичното поведение, когато потокът от течност се генерира в микрофлуиден канал чрез хидростатично налягане (скорост на потока = 33 µm/s).Сперматозоидите са склонни да плуват срещу течението (положителна реология) и скоростта на снопа сперматозоиди е значително намалена в сравнение с единичните сперматозоиди.Наблюдавано е, че снопчетата сперматозоиди се движат спираловидно и се увеличават по дължина и дебелина, когато се набират повече единични сперматозоиди. Наблюдавани са снопчета сперматозоиди, които се приближават и прилепват към страничните стени на микрофлуидните канали, за да се избегне поглъщането им със скорост на потока течност > 33 µm/s. Наблюдавани са снопчета сперматозоиди, които се приближават и прилепват към страничните стени на микрофлуидните канали, за да се избегне поглъщането им със скорост на потока течност > 33 µm/s. Беше отбелязано, че пучките на сперматозоидите се приближават и прилепват към боковите стенки на микрофлуидните канали, за да се избегне сметаната със скорост на потока течност> 33 mkm / s. Наблюдавано е, че снопчетата сперматозоиди се приближават и прилепват към страничните стени на микрофлуидните канали, за да се избегне отнасянето им при скорост на потока на течността >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 µm/s 扫过。33 µm/s 扫过。 Беше отбелязано, че пучките на сперматозоидите се приближават и прилепват към боковите стенки на микрожидкостния канал, за да се избегне сметането на течностен поток със скорост > 33 mkm/s. Наблюдавано е, че снопчетата сперматозоиди се приближават и прилепват към страничните стени на микрофлуидния канал, за да се избегне отнасянето им от потока течност при >33 µm/s.Сканиращата и трансмисионна електронна микроскопия разкриват, че снопчетата сперматозоиди са поддържани от обилен плътен материал.Получените данни демонстрират уникалната мобилност на сперматозоидите от пиле Шаркази, както и способността на сперматозоидите да аглутинират и да образуват подвижни снопчета, което допринася за по-доброто разбиране на дългосрочното съхранение на сперматозоидите в SMT.
За да се постигне оплождане при хора и повечето животни, сперматозоидите и яйцеклетките трябва да пристигнат на мястото на оплождане в точното време.Следователно чифтосването трябва да се случи преди или по време на овулацията.От друга страна, някои бозайници, като кучета, както и видове, които не са бозайници, като насекоми, риби, влечуги и птици, съхраняват сперматозоиди в репродуктивните си органи за продължителен период от време, докато яйцата им са готови за оплождане (асинхронно оплождане 1 ).Птиците са в състояние да поддържат жизнеспособността на сперматозоидите, способни да оплождат яйца в продължение на 2-10 седмици2.
Това е уникална характеристика, която отличава птиците от другите животни, тъй като осигурява висока вероятност за оплождане след еднократно осеменяване в продължение на няколко седмици без едновременно чифтосване и овулация.Основният орган за съхранение на сперматозоиди, наречен тубул за съхранение на сперматозоиди (SST), се намира във вътрешните гънки на лигавицата при утеровагиналното съединение.Към днешна дата механизмите, чрез които сперматозоидите влизат, пребивават и излизат от банката за сперматозоиди, не са напълно разбрани.Въз основа на предишни проучвания са изказани много хипотези, но нито една от тях не е потвърдена.
Forman4 предположи, че сперматозоидите поддържат пребиваването си в SST кухината чрез непрекъснато осцилаторно движение срещу посоката на потока на течността през протеинови канали, разположени върху SST епителни клетки (реология).АТФ се изчерпва поради постоянната флагеларна активност, необходима за поддържане на сперматозоидите в лумена на SST и подвижността в крайна сметка намалява, докато сперматозоидите не бъдат изнесени от банката за сперматозоиди чрез поток от течност и започнат ново пътуване надолу по възходящата фалопиева тръба, за да оплодят спермата.Яйце (Forman4).Този модел на съхранение на сперма се подкрепя от откриването чрез имуноцитохимия на аквапорини 2, 3 и 9, присъстващи в епителните клетки на SST.Към днешна дата липсват проучвания върху реологията на пилешката сперма и нейната роля в съхранението на SST, вагиналната селекция на сперма и конкуренцията на сперматозоидите.При пилетата спермата навлиза във влагалището след естествено чифтосване, но повече от 80% от сперматозоидите се изхвърлят от влагалището малко след чифтосването.Това предполага, че вагината е основното място за селекция на сперма при птиците.Освен това се съобщава, че по-малко от 1% от сперматозоидите, оплодени във вагината, завършват в SSTs2.При изкуствено осеменяване на пилета във вагината, броят на сперматозоидите, достигащи SST, има тенденция да се увеличава 24 часа след осеменяването.Досега механизмът на селекция на сперматозоидите по време на този процес е неясен и подвижността на сперматозоидите може да играе важна роля в усвояването на SST сперматозоиди.Поради дебелите и непрозрачни стени на фалопиевите тръби е трудно да се наблюдава директно подвижността на сперматозоидите във фалопиевите тръби на птиците.Следователно ни липсват основни познания за това как сперматозоидите преминават към SST след оплождане.
Реологията наскоро беше призната като важен фактор, контролиращ транспорта на сперма в гениталиите на бозайниците.Въз основа на способността на подвижните сперматозоиди да мигрират срещу течението, Zaferani et al8 използваха микрофлуидна система corra за пасивно изолиране на подвижни сперматозоиди от проби от сперма.Този тип сортиране на сперма е от съществено значение за медицинско лечение на безплодие и клинични изследвания и се предпочита пред традиционните методи, които са време и трудоемки и могат да компрометират морфологията и структурната цялост на спермата.Въпреки това, досега не са провеждани проучвания за ефекта на секретите от гениталните органи на пилетата върху подвижността на сперматозоидите.
Независимо от механизма, който поддържа сперматозоидите, съхранявани в SST, много изследователи са наблюдавали, че резидентните сперматозоиди аглутинират глава до глава в SST на пилета 9, 10, пъдпъдъци 2 и пуйки 11, за да образуват аглутинирани снопчета сперма.Авторите предполагат, че има връзка между тази аглутинация и дългосрочното съхранение на сперматозоиди в SST.
Tingari и Lake12 съобщават за силна връзка между сперматозоидите в приемащата сперматозоиди жлеза на пилето и поставят под въпрос дали сперматозоидите на птиците аглутинират по същия начин като сперматозоидите на бозайниците.Те смятат, че дълбоките връзки между сперматозоидите във семепровода може да се дължат на стреса, причинен от присъствието на голям брой сперматозоиди в малко пространство.
При оценка на поведението на сперматозоидите върху прясно окачени предметни стъкла могат да се видят преходни признаци на аглутинация, особено по краищата на капчиците сперма.Въпреки това, аглутинацията често се нарушава от ротационното действие, свързано с непрекъснато движение, което обяснява преходния характер на това явление.Изследователите също забелязват, че когато разредителят се добави към спермата, се появяват удължени „нишковидни“ клетъчни агрегати.
Първите опити за имитиране на сперматозоид са направени чрез премахване на тънка жица от висяща капка, което е довело до удължена везикула, подобна на сперма, стърчаща от капката сперма.Сперматозоидите незабавно се подредиха паралелно във везикулата, но цялата единица бързо изчезна поради 3D ограничението.Следователно, за да се изследва аглутинацията на сперматозоидите, е необходимо да се наблюдава подвижността и поведението на сперматозоидите директно в изолирани тубули за съхранение на сперматозоиди, което е трудно постижимо.Следователно е необходимо да се разработи инструмент, който имитира сперматозоидите, за да подпомогне изследванията на подвижността на сперматозоидите и аглутинационното поведение.Brillard et al13 съобщават, че средната дължина на тубулите за съхранение на сперма при възрастни пилета е 400–600 µm, но някои SST могат да бъдат дълги до 2000 µm.Mero и Ogasawara14 разделиха семенните жлези на разширени и неразширени тубули за съхранение на сперматозоиди, като и двете бяха с еднаква дължина (~500 µm) и ширина на шийката (~38 µm), но средният диаметър на лумена на тубулите беше 56,6 и 56,6 µm.., съответно 11,2 μm, съответно.В настоящото изследване използвахме микрофлуидно устройство с размер на канала 200 µm × 20 µm (W × H), чието напречно сечение е донякъде близко до това на амплифицирания SST.В допълнение, ние изследвахме подвижността на сперматозоидите и поведението на аглутинация в течаща течност, което е в съответствие с хипотезата на Форман, че течността, произведена от епителните клетки на SST, поддържа сперматозоидите в лумена в противоточна (реологична) посока.
Целта на това изследване беше да се преодолеят проблемите с наблюдението на подвижността на сперматозоидите във фалопиевата тръба и да се избегнат трудностите при изучаване на реологията и поведението на сперматозоидите в динамична среда.Използвано е микрофлуидно устройство, което създава хидростатично налягане, за да симулира подвижността на сперматозоидите в гениталиите на пиле.
Когато капка от разредена сперматозоидна проба (1:40) се зареди в микроканалното устройство, могат да бъдат идентифицирани два типа подвижност на сперматозоидите (изолирана сперма и свързана сперма).В допълнение, сперматозоидите са склонни да плуват срещу течението (положителна реология; видео 1, 2). Въпреки че снопчетата сперматозоиди имат по-ниска скорост от тази на самотните сперматозоиди (p <0,001), те повишават процента на сперматозоидите, показващи положителен реотаксис (p <0,001; Таблица 2). Въпреки че снопчетата сперматозоиди имат по-ниска скорост от тази на самотните сперматозоиди (p <0,001), те повишават процента на сперматозоидите, показващи положителен реотаксис (p <0,001; Таблица 2). Въпреки че пучките на сперматозоидите имаха по-ниска скорост, отколкото при единични сперматозоиди (p <0,001), те увеличиха процента на сперматозоидите, демонстриращи положителен реотаксис (p <0,001; таблица 2). Въпреки че снопчетата сперматозоиди имат по-ниска скорост от тази на единични сперматозоиди (p <0,001), те повишават процента на сперматозоидите, показващи положителен реотаксис (p <0,001; Таблица 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子 百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）)）))) Въпреки че скоростта на сперматозоидите беше по-ниска, отколкото при единични сперматозоиди (p <0,001), те увеличиха процента на сперматозоидите с положителна реология (p <0,001; таблица 2). Въпреки че скоростта на снопчетата сперматозоиди е по-ниска от тази на единични сперматозоиди (p <0,001), те повишават процента на сперматозоидите с положителна реология (p <0,001; Таблица 2).Положителната реология за единични сперматозоиди и снопчета се оценява съответно на приблизително 53% и 85%.
Наблюдавано е, че сперматозоидите на пилета шаркаси веднага след еякулацията образуват линейни снопове, състоящи се от десетки индивиди.Тези снопчета се увеличават по дължина и дебелина с течение на времето и могат да останат in vitro няколко часа преди да се разсеят (видео 3).Тези нишковидни снопчета са оформени като сперматозоиди на ехидна, които се образуват в края на епидидима.Установено е, че спермата от кокошка Шаркаши има висока склонност към аглутинация и образуване на мрежест пакет за по-малко от една минута след събирането.Тези греди са динамични и могат да се залепят за всякакви близки стени или статични обекти.Въпреки че снопчетата сперматозоиди намаляват скоростта на сперматозоидите, ясно е, че макроскопски те увеличават своята линейност.Дължината на сноповете варира в зависимост от броя на сперматозоидите, събрани в снопове.Бяха изолирани две части от снопа: началната част, включваща свободната глава на аглутинирания сперматозоид, и крайната част, включваща опашката и целия дистален край на спермата.С помощта на високоскоростна камера (950 fps) се наблюдават свободни глави на аглутинирани сперматозоиди в началната част на снопа, отговорни за движението на снопа поради осцилаторното им движение, влачейки останалите в снопа със спирално движение (Видео 4).Въпреки това, при дълги снопчета е наблюдавано, че някои свободни глави на сперматозоиди са прилепнали към тялото и крайната част на снопчето действа като лопатки, за да помогне за задвижването на снопчето.
Докато при бавен поток от течност, снопчетата сперматозоиди се движат успоредно един на друг, обаче, те започват да се припокриват и да се придържат към всичко, което е неподвижно, за да не бъдат отмити от текущия поток с увеличаване на скоростта на потока.Снопчетата се образуват, когато шепа сперматозоиди се приближат една към друга, те започват да се движат синхронно и се увиват една около друга, след което се придържат към лепкава субстанция.Фигури 1 и 2 показват как сперматозоидите се приближават един към друг, образувайки кръстовище, докато опашките се увиват една около друга.
Изследователите прилагат хидростатично налягане, за да създадат поток от течност в микроканал за изследване на реологията на спермата.Използван е микроканал с размер 200 µm × 20 µm (W × H) и дължина 3.6 µm.Използвайте микроканали между контейнерите със спринцовки, монтирани в краищата.Използвани са хранителни оцветители, за да направят каналите по-видими.
Завържете свързващите кабели и аксесоарите към стената.Видеото е заснето с фазово-контрастен микроскоп.С всяко изображение са представени фазово-контрастни микроскопски и картографски изображения.(A) Връзката между два потока се съпротивлява на потока поради спирално движение (червена стрелка).(B) Връзката между тръбния сноп и стената на канала (червени стрелки), в същото време те са свързани с два други снопа (жълти стрелки).(C) Снопчетата сперматозоиди в микрофлуидния канал започват да се свързват един с друг (червени стрелки), образувайки мрежа от снопчета сперматозоиди.(D) Образуване на мрежа от снопчета сперма.
Когато капка разредена сперма се зареди в микрофлуидното устройство и се създаде поток, се наблюдава движение на снопа сперматозоиди срещу посоката на потока.Снопчетата прилягат плътно към стените на микроканалите, а свободните глави в началната част на снопчетата прилепват плътно към тях (видео 5).Те също така се придържат към всички неподвижни частици по пътя си, като отломки, за да устоят да бъдат пометени от течението.С течение на времето тези снопчета се превръщат в дълги нишки, улавящи други единични сперматозоиди и по-къси снопчета (видео 6).Когато потокът започне да се забавя, дългите линии от сперма започват да образуват мрежа от линии от сперма (Видео 7; Фигура 2).
При висока скорост на потока (V > 33 µm/s), спиралните движения на нишките се увеличават като опит да се уловят много отделни снопчета, образуващи сперматозоиди, които по-добре се съпротивляват на движещата се сила на потока. При висока скорост на потока (V > 33 µm/s), спиралните движения на нишките се увеличават като опит да се уловят много отделни снопчета, образуващи сперматозоиди, които по-добре се съпротивляват на движещата се сила на потока. При висока скорост на потока (V > 33 mkm/s) спиралевидните движения на нитей усилват, тъй като те се опитват да поемат множество отделни сперматозоиди, образуващи пръчки, които по-добре противостоят на дрейфуващия поток. При високи скорости на потока (V > 33 µm/s), спиралните движения на нишките се увеличават, тъй като те се опитват да уловят много отделни сперматозоиди, образуващи снопове, които са по-способни да устоят на движещата се сила на потока.在高流速(V > 33 µm/s) 时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ， 从而更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。 При висока скорост на потока (V > 33 mkm/s) спиралното движение на ните се увеличава в опитите за улавяне на множество отделни сперматозоиди, образуващи пръчки, за да се образува по-добре противодействие на силата на потока на дрейфа. При високи скорости на потока (V > 33 µm/s), спиралното движение на нишките се увеличава в опит да се уловят много отделни сперматозоиди, образуващи снопове, за да се противопоставят по-добре на дрейфовите сили на потока.Те също се опитаха да прикрепят микроканали към страничните стени.
Сноповете сперматозоиди бяха идентифицирани като клъстери от глави на сперматозоиди и извити опашки с помощта на светлинна микроскопия (LM).Снопове сперматозоиди с различни агрегати също са идентифицирани като усукани глави и флагеларни агрегати, множество слети опашки на сперматозоиди, глави на сперматозоиди, прикрепени към опашка, и глави на сперматозоиди с огънати ядра като множество слети ядра.трансмисионна електронна микроскопия (ТЕМ).Сканиращата електронна микроскопия (SEM) показа, че снопчетата сперматозоиди са обвити агрегати от глави на сперматозоиди, а агрегатите от сперматозоиди показват прикрепена мрежа от увити опашки.
Морфологията и ултраструктурата на сперматозоидите, образуването на снопчета сперматозоиди са изследвани с помощта на светлинна микроскопия (половин разрез), сканираща електронна микроскопия (SEM) и трансмисионна електронна микроскопия (ТЕМ), петна от сперматозоиди са оцветени с акридиново оранжево и са изследвани с помощта на епифлуоресцентна микроскопия.
Оцветяването на сперматозоидите с акридиново оранжево (фиг. 3B) показва, че главите на сперматозоидите са слепени заедно и покрити със секреторен материал, което води до образуването на големи снопчета (фиг. 3D).Снопчетата сперматозоиди се състоят от сперматозоидни агрегати с мрежа от прикрепени опашки (фиг. 4A-C).Снопчетата сперматозоиди са съставени от опашките на много сперматозоиди, залепени заедно (фиг. 4D).Тайните (фиг. 4E, F) покриват главите на снопчетата сперматозоиди.
Образуване на снопа сперматозоиди Използването на фазово контрастна микроскопия и петна от сперматозоиди, оцветени с акридиново оранжево, показва, че главите на сперматозоидите се слепват.(A) Ранното образуване на снопчета от сперматозоиди започва със сперматозоид (бял кръг) и три сперматозоида (жълт кръг), като спиралата започва от опашката и завършва в главата.(B) Микрофотография на цитонамазка от сперма, оцветена с акридиново оранжево, показваща прилепнали глави на сперматозоиди (стрелки).Секрецията покрива главата(ите).Увеличение × 1000. (C) Развитие на голям лъч, транспортиран от поток в микрофлуиден канал (с помощта на високоскоростна камера при 950 fps).(D) Микроснимка на цитонамазка от сперма, оцветена с акридиново оранжево, показваща големи кичури (стрелки).Увеличение: ×200.
Сканираща електронна микрофотография на сноп от сперматозоиди и цитонамазка от сперматозоиди, оцветени с акридиново оранжево.(A, B, D, E) са цифрови цветни сканиращи електронни микроснимки на сперматозоиди, а C и F са микроснимки на оцветени с акридиново оранжево сперматозоиди, показващи прикрепване на множество сперматозоиди, обвиващи каудалната мрежа.(AC) Сперматозоидните агрегати са показани като мрежа от прикрепени опашки (стрелки).(D) Адхезия на няколко сперматозоида (с адхезивно вещество, розов контур, стрелка), увиващи се около опашката.(E и F) Агрегати от главата на сперматозоидите (указатели), покрити с адхезивен материал (указатели).Сперматозоидите образуват снопове с няколко вихрови структури (F).(C) ×400 и (F) ×200 увеличения.
Използвайки трансмисионна електронна микроскопия, открихме, че снопчетата сперматозоиди имат прикрепени опашки (фиг. 6A, C), глави, прикрепени към опашки (фиг. 6B), или глави, прикрепени към опашки (фиг. 6D).Главите на сперматозоидите в снопа са извити, представяйки в разрез две ядрени области (фиг. 6D).В снопа на разреза сперматозоидите имат усукана глава с две ядрени области и множество флагеларни области (фиг. 5А).
Цифрова цветна електронна микрография, показваща свързващите опашки в снопчето сперматозоиди и аглутиниращия материал, свързващ главите на сперматозоидите.(A) Прикрепена опашка от голям брой сперматозоиди.Забележете как изглежда опашката както в портретна (стрелка), така и в пейзажна (стрелка) проекция.(B) Главата (стрелка) на спермата е свързана с опашката (стрелка).(C) Няколко опашки на спермата (стрелки) са прикрепени.(D) Аглутинационен материал (AS, син) свързва четири глави на сперматозоиди (лилаво).
Използва се сканираща електронна микроскопия за откриване на глави на сперматозоиди в снопчета сперматозоиди, покрити със секрети или мембрани (Фигура 6В), което показва, че снопчетата сперматозоиди са закотвени от извънклетъчен материал.Аглутинираният материал се концентрира в главата на сперматозоида (сглобка, подобна на глава на медуза; Фиг. 5В) и се разширява дистално, давайки брилянтен жълт вид под флуоресцентна микроскопия, когато се оцвети с акридиново оранжево (Фиг. 6С).Това вещество се вижда ясно под сканиращ микроскоп и се счита за свързващо вещество.Полутънки срезове (фиг. 5C) и петна от сперматозоиди, оцветени с акридиново оранжево, показват снопчета сперматозоиди, съдържащи плътно опаковани глави и навити опашки (фиг. 5D).
Различни фотомикрографии, показващи агрегиране на глави и сгънати опашки на сперматозоиди, използвайки различни методи.(A) Електронна микрофотография с цифрово цветно предаване на напречно сечение на пакет от сперматозоиди, показваща навита глава на сперматозоид с ядро ​​от две части (синьо) и няколко флагеларни части (зелено).(B) Цифрова цветна сканираща електронна микрография, показваща група подобни на медуза глави на сперматозоиди (стрелки), които изглеждат покрити.(C) Полутънък участък, показващ агрегирани глави на сперматозоиди (стрелки) и извити опашки (стрелки).(D) Микроснимка на цитонамазка от сперма, оцветена с акридиново оранжево, показваща агрегати от глави на сперматозоиди (стрелки) и извити прилепнали опашки (стрелки).Имайте предвид, че лепкава субстанция (S) покрива главата на сперматозоида.(D) × 1000 увеличение.
С помощта на трансмисионна електронна микроскопия (Фиг. 7А) също беше отбелязано, че главите на сперматозоидите са усукани и ядрата имат спирална форма, както се потвърждава от петна от сперматозоиди, оцветени с акридиново оранжево и изследвани с помощта на флуоресцентна микроскопия (Фиг. 7В).
(A) Цифрова цветна трансмисионна електронна микрография и (B) Намазка от сперма, оцветена с акридиново оранжево, показваща навити глави и прикрепване на глави и опашки на сперматозоиди (стрелки).(B) × 1000 увеличение.
Интересно откритие е, че сперматозоидите на Sharkazi се агрегират, за да образуват подвижни нишковидни снопове.Свойствата на тези снопове ни позволяват да разберем възможната им роля в абсорбцията и съхранението на сперматозоидите в SST.
След чифтосване сперматозоидите влизат във вагината и преминават през интензивен процес на селекция, което води до навлизане само на ограничен брой сперматозоиди в SST15,16.Към днешна дата механизмите, чрез които сперматозоидите влизат и излизат от SST, са неясни.При домашните птици сперматозоидите се съхраняват в SST за продължителен период от 2 до 10 седмици, в зависимост от вида6.Остават спорове относно състоянието на спермата по време на съхранение в SST.В движение ли са или в покой?С други думи, как сперматозоидите запазват позицията си в SST толкова дълго?
Forman4 предполага, че пребиваването и изхвърлянето на SST може да се обясни от гледна точка на подвижността на сперматозоидите.Авторите предполагат, че сперматозоидите поддържат позицията си, като плуват срещу потока течност, създаден от епитела на SST, и че сперматозоидите се изхвърлят от SST, когато скоростта им падне под точката, в която те започват да се движат назад поради липса на енергия.Zaniboni5 потвърди наличието на аквапорини 2, 3 и 9 в апикалната част на епителните клетки на SST, което може индиректно да поддържа модела за съхранение на сперма на Foreman.В настоящото изследване открихме, че почти половината от сперматозоидите на Sharkashi показват положителна реология в течащата течност и че аглутинираните снопчета сперматозоиди увеличават броя на сперматозоидите, показващи положителна реология, въпреки че аглутинацията ги забавя.Как сперматозоидите се придвижват нагоре по фалопиевата тръба на птицата до мястото на оплождане не е напълно разбрано.При бозайниците фоликулната течност хемопривлича сперматозоидите.Смята се обаче, че хемоатрактантите насочват сперматозоидите да се приближават на големи разстояния7.Следователно други механизми са отговорни за транспортирането на спермата.Съобщава се, че способността на сперматозоидите да се ориентират и да текат срещу течността на фалопиевите тръби, освободена след чифтосване, е основен фактор за насочване на сперматозоидите при мишки.Parker 17 предполага, че сперматозоидите преминават през яйцепроводите, като плуват срещу цилиарното течение при птици и влечуги.Въпреки че не е експериментално демонстрирано при птици, Adolphi18 беше първият, който откри, че птичата сперма дава положителни резултати, когато тънък слой течност между покривното и предметното стъкло се създаде с лента от филтърна хартия.Реология.Hino и Yanagimachi [19] поставят миши яйчник-тръбопровод-маточен комплекс в перфузионен пръстен и инжектират 1 µl мастило в провлака, за да визуализират потока на течност във фалопиевите тръби.Те забелязаха много активно движение на свиване и отпускане във фалопиевата тръба, при което всички мастилени топчета се движеха стабилно към ампулата на фалопиевата тръба.Авторите подчертават значението на потока на тубарната течност от долните към горните фалопиеви тръби за повдигане и оплождане на спермата.Brillard20 съобщава, че при пилетата и пуйките сперматозоидите мигрират чрез активно движение от вагиналния вход, където се съхраняват, до утеро-вагиналното съединение, където се съхраняват.Това движение обаче не е необходимо между утеровагиналното съединение и инфундибулума, тъй като сперматозоидите се транспортират чрез пасивно изместване.Познавайки тези предишни препоръки и резултатите, получени в настоящото изследване, може да се предположи, че способността на сперматозоидите да се движат нагоре (реология) е едно от свойствата, на които се основава процесът на подбор.Това определя преминаването на сперматозоидите през вагината и влизането им в CCT за съхранение.Както предложи Forman4, това може също така да улесни процеса на навлизане на сперматозоидите в SST и неговото местообитание за определен период от време и след това да напуснат, когато скоростта им започне да се забавя.
От друга страна, Matsuzaki и Sasanami 21 предполагат, че сперматозоидите на птиците претърпяват промени в подвижността от латентност към подвижност в мъжките и женските репродуктивни пътища.Инхибирането на резидентната подвижност на сперматозоидите в SST е предложено, за да обясни дългото време на съхранение на спермата и след това подмладяване след напускане на SST.При хипоксични условия Matsuzaki et al.1 съобщава за високо производство и освобождаване на лактат в SST, което може да доведе до инхибиране на резидентната подвижност на сперматозоидите.В този случай значението на реологията на спермата се отразява в селекцията и абсорбцията на сперматозоидите, а не в тяхното съхранение.
Моделът на аглутинация на спермата се счита за правдоподобно обяснение за дългия период на съхранение на спермата в SST, тъй като това е често срещан модел на задържане на сперматозоиди при домашни птици 2,22,23.Бакст и др.2 наблюдава, че повечето сперматозоиди се придържат един към друг, образувайки фасцикуларни агрегати, а единични сперматозоиди рядко се откриват в CCM на пъдпъдъци.От друга страна, Wen et al.24 наблюдава повече разпръснати сперматозоиди и по-малко снопчета сперматозоиди в лумена на SST при пилета.Въз основа на тези наблюдения може да се приеме, че склонността към аглутинация на спермата е различна при различните птици и между сперматозоидите в един и същи еякулат.В допълнение, Van Krey et al.9 предполагат, че произволната дисоциация на аглутинирани сперматозоиди е отговорна за постепенното проникване на сперматозоидите в лумена на фалопиевата тръба.Според тази хипотеза сперматозоидите с по-нисък капацитет на аглутинация трябва първо да бъдат изхвърлени от SST.В този контекст способността на сперматозоидите да аглутинират може да бъде фактор, влияещ върху резултата от конкуренцията на спермата при мръсни птици.В допълнение, колкото по-дълго аглутинираните сперматозоиди се дисоциират, толкова по-дълго се поддържа плодовитостта.
Въпреки че агрегацията на сперматозоидите и агрегацията в снопове са наблюдавани в няколко проучвания 2, 22, 24, те не са описани подробно поради сложността на тяхното кинематично наблюдение в рамките на SST.Направени са няколко опита за изследване на аглутинацията на спермата in vitro.Обширна, но преходна агрегация се наблюдава, когато тънката тел беше отстранена от висящата капка семена.Това води до факта, че от капката излиза удължено мехурче, имитиращо семенната жлеза.Поради 3D ограниченията и кратките времена за сушене на капки, целият блок бързо се разпадна9.В настоящото изследване, използвайки пилета Шаркаши и микрофлуидни чипове, успяхме да опишем как се образуват тези кичури и как се движат.Снопчетата сперматозоиди се образуват веднага след събирането на сперма и е установено, че се движат в спирала, показвайки положителна реология, когато присъстват в потока.Освен това, когато се разглеждат макроскопски, е наблюдавано, че снопчетата сперматозоиди повишават линейността на подвижността в сравнение с изолираните сперматозоиди.Това предполага, че аглутинацията на сперматозоидите може да настъпи преди проникването на SST и че производството на сперматозоиди не е ограничено до малка площ поради стрес, както беше предложено по-рано (Tingari и Lake12).По време на образуването на снопче сперматозоидите плуват синхронно, докато образуват кръстовище, след което опашките им се увиват една около друга и главата на сперматозоида остава свободна, но опашката и дисталната част на сперматозоида се слепват заедно с лепкава субстанция.Следователно свободната глава на лигамента е отговорна за движението, като влачи останалата част от лигамента.Сканиращата електронна микроскопия на снопчетата сперматозоиди показа прикрепени глави на сперматозоиди, покрити с много лепкав материал, което предполага, че главите на сперматозоидите са били прикрепени в снопчета в покой, което може да се е случило след достигане на мястото за съхранение (SST).
Когато цитонамазка от сперматозоиди се оцвети с акридиново оранжево, извънклетъчен адхезивен материал около сперматозоидите може да се види под флуоресцентен микроскоп.Това вещество позволява на снопчетата сперматозоиди да се придържат към всякакви околни повърхности или частици, така че да не се носят с околния поток.По този начин нашите наблюдения показват ролята на адхезията на сперматозоидите под формата на подвижни снопове.Тяхната способност да плуват срещу течението и да се придържат към близките повърхности позволява на спермата да остане по-дълго в SST.
Rothschild25 използва камера за хемоцитометрия, за да изследва плаващото разпределение на говежда сперма в капка суспензия, правейки фотомикрографии през камера с вертикална и хоризонтална оптична ос на микроскопа.Резултатите показват, че сперматозоидите са привлечени от повърхността на камерата.Авторите предполагат, че може да има хидродинамични взаимодействия между спермата и повърхността.Вземайки това предвид, заедно със способността на спермата на пиле Шаркаши да образува лепкави кичури, може да увеличи вероятността спермата да се придържа към SST стената и да се съхранява за дълги периоди от време.
Bccetti и Afzeliu26 съобщават, че гликокаликсът на спермата е необходим за разпознаване и аглутинация на гамети.Forman10 наблюдава, че хидролизата на α-гликозидни връзки в гликопротеин-гликолипидни покрития чрез третиране на птича сперма с невраминидаза води до намалена плодовитост, без да се засяга подвижността на сперматозоидите.Авторите предполагат, че ефектът на невраминидазата върху гликокаликса уврежда секвестрацията на сперматозоидите в утеро-вагиналната връзка, като по този начин намалява плодовитостта.Техните наблюдения не могат да пренебрегнат възможността лечението с невраминидаза да намали разпознаването на спермата и яйцеклетките.Форман и Енгел10 установиха, че плодовитостта е намалена, когато кокошките са осеменени интравагинално със сперма, третирана с невраминидаза.Въпреки това, IVF с третирана с невраминидаза сперма не повлиява плодовитостта в сравнение с контролните пилета.Авторите заключават, че промените в гликопротеин-гликолипидното покритие около сперматозоидната мембрана намаляват способността на сперматозоидите да се оплождат чрез нарушаване на секвестрацията на сперматозоидите в утеро-вагиналното съединение, което от своя страна увеличава загубата на сперматозоиди поради скоростта на утеро-вагиналното съединение, но не засяга разпознаването на спермата и яйцеклетката.
При пуйки Bakst и Bauchan 11 откриват малки везикули и мембранни фрагменти в лумена на SST и наблюдават, че някои от тези гранули са се слели с мембраната на спермата.Авторите предполагат, че тези взаимоотношения могат да допринесат за дългосрочното съхранение на сперматозоиди в SST.Изследователите обаче не уточняват източника на тези частици, независимо дали се секретират от епителните клетки на CCT, произвеждат се и се секретират от мъжката репродуктивна система или се произвеждат от самата сперма.Освен това тези частици са отговорни за аглутинацията.Grützner et al27 съобщават, че епидидималните епителни клетки произвеждат и секретират специфичен протеин, който е необходим за образуването на еднопорни семенни пътища.Авторите също съобщават, че дисперсията на тези снопове зависи от взаимодействието на епидидималните протеини.Nixon et al28 установиха, че аднексите отделят протеин, киселинния, богат на цистеин остеонектин;SPARC участва в образуването на снопчета сперматозоиди при късоклюни ехидни и птицечовки.Разсейването на тези лъчи е свързано със загубата на този протеин.
В настоящото изследване ултраструктурният анализ с помощта на електронна микроскопия показа, че сперматозоидите са прилепнали към голямо количество плътен материал.Смята се, че тези вещества са отговорни за аглутинацията, която се кондензира между и около прилепналите глави, но при по-ниски концентрации в областта на опашката.Предполагаме, че това аглутиниращо вещество се екскретира от мъжката репродуктивна система (епидидимис или семепровод) заедно със спермата, тъй като често наблюдаваме отделяне на спермата от лимфата и семенната плазма по време на еякулация.Докладвано е, че докато птичи сперматозоиди преминават през епидидимиса и семепровода, те претърпяват свързани със съзряването промени, които поддържат способността им да свързват протеини и да придобиват гликопротеини, свързани с плазмената лема.Устойчивостта на тези протеини върху резидентните мембрани на спермата в SST предполага, че тези протеини могат да повлияят на придобиването на стабилност на мембраната на сперматозоидите 30 и да определят тяхната плодовитост 31.Ahammad et al32 съобщават, че сперматозоидите, получени от различни части на мъжката репродуктивна система (от тестисите до дисталните семепроводи), показват прогресивно увеличаване на жизнеспособността при условия на съхранение в течност, независимо от температурата на съхранение, а жизнеспособността при пилета също се увеличава във фалопиевите тръби след изкуствено осеменяване.
Снопчетата сперматозоиди от пиле Шаркаши имат различни характеристики и функции от други видове като ехидни, птицечовки, горски мишки, еленови плъхове и морски свинчета.При пилета шаркаси образуването на снопчета сперматозоиди намалява скоростта им на плуване в сравнение с единичните сперматозоиди.Въпреки това, тези снопове увеличават процента на реологично положителните сперматозоиди и повишават способността на сперматозоидите да се стабилизират в динамична среда.По този начин нашите резултати потвърждават предишното предположение, че аглутинацията на спермата в SST е свързана с дългосрочно съхранение на сперма.Ние също така предполагаме, че склонността на сперматозоидите да образуват снопчета може да контролира скоростта на загуба на сперматозоиди в SST, което може да промени резултата от конкуренцията на сперматозоидите.Според това предположение сперматозоидите с нисък капацитет на аглутинация освобождават първи SST, докато сперматозоидите с висок капацитет на аглутинация произвеждат по-голямата част от потомството.Образуването на снопчета сперматозоиди с една пора е полезно и влияе на съотношението родител-дете, но използва различен механизъм.При ехидните и птицечовките сперматозоидите са разположени успоредно един на друг, за да се увеличи скоростта на движение на лъча.Снопове ехидни се движат около три пъти по-бързо от единични сперматозоиди.Смята се, че образуването на такива снопчета сперматозоиди при ехидните е еволюционна адаптация за поддържане на господство, тъй като женските са безразборни и обикновено се чифтосват с няколко мъже.Следователно сперматозоидите от различни еякулати се конкурират ожесточено за оплождането на яйцеклетката.
Аглутинираните сперматозоиди на пилета шаркаси са лесни за визуализиране с помощта на фазово-контрастна микроскопия, която се счита за предимство, тъй като позволява лесно изследване на поведението на сперматозоидите in vitro.Механизмът, чрез който образуването на сперматозоиди насърчава възпроизвеждането при пилета шаркаси, също е различен от този, наблюдаван при някои плацентарни бозайници, представляващи кооперативно поведение на сперматозоидите, като дървесни мишки, където някои сперматозоиди достигат до яйцата, помагайки на други сродни индивиди да достигнат и повредят своите яйца.да се докажеш.алтруистично поведение.Самооплождане 34. Друг пример за кооперативно поведение в сперматозоидите беше открит при еленови мишки, където сперматозоидите успяха да се идентифицират и комбинират с най-генетично свързаните сперматозоиди и да образуват кооперативни групи, за да увеличат скоростта си в сравнение с несвързаните сперматозоиди35.
Резултатите, получени в това проучване, не противоречат на теорията на Foman за дългосрочно съхранение на сперматозоиди в SWS.Изследователите съобщават, че сперматозоидите продължават да се движат в потока от епителни клетки, покриващи SST за продължителен период от време и след определен период от време енергийните запаси на сперматозоидите се изчерпват, което води до намаляване на скоростта, което позволява изхвърлянето на субстанции с ниско молекулно тегло.енергия на сперматозоидите с потока на течност от лумена на SST Кухината на фалопиевата тръба.В настоящото проучване наблюдавахме, че половината от единичните сперматозоиди показват способността да плуват срещу течащи течности и тяхната адхезия в снопа увеличава способността им да показват положителна реология.Освен това, нашите данни са в съответствие с тези на Matsuzaki et al.1, които съобщават, че повишената секреция на лактат в SST може да инхибира резидентната подвижност на сперматозоидите.Въпреки това, нашите резултати описват образуването на подвижни връзки на спермата и тяхното реологично поведение в присъствието на динамична среда в микроканал в опит да се изясни тяхното поведение в SST.Бъдещите изследвания може да се съсредоточат върху определянето на химическия състав и произхода на аглутиниращия агент, което несъмнено ще помогне на изследователите да разработят нови начини за съхранение на течна сперма и увеличаване на продължителността на плодовитостта.
Петнадесет 30-седмични мъжки шаркаси с голо врат (хомозиготен доминиращ; Na Na) бяха избрани като донори на сперма в проучването.Птиците са отгледани в Изследователската птицеферма към Факултета по селско стопанство, Университет Ашит, провинция Ашит, Египет.Птиците бяха настанени в индивидуални клетки (30 x 40 x 40 cm), подложени на светлинна програма (16 часа светлина и 8 часа тъмнина) и хранени с диета, съдържаща 160 g суров протеин, 2800 kcal метаболизируема енергия, 35 g калций всяка.5 грама наличен фосфор на килограм диета.
Според данни 36, ​​37 спермата е събрана от мъжки чрез коремен масаж.Общо 45 проби от сперма бяха събрани от 15 мъже в продължение на 3 дни.Спермата (n = 15/ден) веднага се разрежда 1:1 (v:v) с Belsville Poultry Semen Diluent, който съдържа калиев дифосфат (1,27 g), мононатриев глутамат монохидрат (0,867 g), фруктоза (0,5 d) безводен натрий.ацетат (0,43 g), трис(хидроксиметил)аминометан (0,195 g), калиев цитрат монохидрат (0,064 g), калиев монофосфат (0,065 g), магнезиев хлорид (0,034 g) и H2O (100 ml), pH = 7, 5, осмоларност 333 mOsm/kg38.Разредените проби от сперма първо се изследват под светлинен микроскоп, за да се гарантира добро качество на спермата (влага) и след това се съхраняват във водна баня при 37°C до използване в рамките на половин час след събирането.
Кинематиката и реологията на сперматозоидите са описани с помощта на система от микрофлуидни устройства.Пробите от сперма бяха допълнително разредени до 1:40 в Beltsville Avian Semen Diluent, заредени в микрофлуидно устройство (вижте по-долу) и кинетичните параметри бяха определени с помощта на система за компютъризиран анализ на сперма (CASA), разработена преди това за микрофлуидно характеризиране.върху мобилността на сперматозоидите в течна среда (Катедра по машинно инженерство, Инженерен факултет, Университет Асиут, Египет).Плъгинът може да бъде изтеглен от: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Бяха измерени скоростта на кривата (VCL, μm/s), линейната скорост (VSL, μm/s) и средната скорост на траекторията (VAP, μm/s).Видеозаписи на сперматозоиди са заснети с помощта на обърнат фазово-контрастен микроскоп Optika XDS-3 (с 40x обектив), свързан към камера Tucson ISH1000 при 30 fps за 3 s.Използвайте софтуера CASA, за да изследвате поне три области и 500 траектории на сперматозоиди на проба.Записаният видеоклип е обработен с помощта на самоделен CASA.Дефиницията на подвижността в приставката CASA се основава на скоростта на плуване на сперматозоидите в сравнение със скоростта на потока и не включва други параметри, като движение от страна на страна, тъй като е установено, че това е по-надеждно при поток на течност.Реологичното движение се описва като движение на сперматозоидите срещу посоката на потока течност.Сперматозоидите с реологични свойства бяха разделени на броя на подвижните сперматозоиди;сперматозоидите, които са били в покой, и конвективно движещите се сперматозоиди са изключени от преброяването.
Всички използвани химикали са получени от Elgomhoria Pharmaceuticals (Кайро, Египет), освен ако не е отбелязано друго.Устройството е произведено, както е описано от El-sherry et al.40 с някои модификации.Материалите, използвани за производството на микроканалите, включват стъклени плочи (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 отрицателен резист (MicroChem, Newton, CA), диацетон алкохол (Sigma Aldrich, Steinheim, Германия) и полиацетон.-184, Dow Corning, Мидланд, Мичиган).Микроканалите са произведени чрез мека литография.Първо, прозрачна защитна маска за лице с желания микроканален дизайн беше отпечатана на принтер с висока разделителна способност (Prismatic, Кайро, Египет и Pacific Arts and Design, Markham, ON).Майсторите са направени с помощта на стъклени плочи като субстрати.Плаките се почистват в ацетон, изопропанол и дейонизирана вода и след това се покриват с 20 цт слой SU8-25 чрез центрофугиране (3000 rpm, 1 min).След това слоевете SU-8 бяха внимателно изсушени (65 ° С, 2 минути и 95 ° С, 10 минути) и изложени на UV радиация за 50 s.Изпичане след излагане при 65°C и 95°C за 1 min и 4 min за омрежване на изложени SU-8 слоеве, последвано от проявяване в диацетон алкохол за 6,5 min.Изпечете силно вафлите (200°C за 15 минути), за да втвърдите допълнително слоя SU-8.
PDMS се приготвя чрез смесване на мономера и втвърдителя в тегловно съотношение 10:1, след което се дегазира във вакуумен ексикатор и се излива върху основната рамка SU-8.PDMS се втвърдява в пещ (120 ° C, 30 минути), след което каналите се изрязват, отделят се от главния и се перфорират, за да позволят тръбите да бъдат прикрепени към входа и изхода на микроканала.Накрая, PDMS микроканалите бяха постоянно прикрепени към микроскопски предметни стъкла с помощта на преносим коронен процесор (Electro-Technic Products, Чикаго, Илинойс), както е описано другаде.Микроканалът, използван в това изследване, е с размери 200 µm × 20 µm (Ш × В) и е с дължина 3,6 cm.
Потокът на течността, предизвикан от хидростатичното налягане вътре в микроканала, се постига чрез поддържане на нивото на течността във входящия резервоар над разликата във височината Δh39 в изходния резервоар (фиг. 1).
където f е коефициентът на триене, дефиниран като f = C/Re за ламинарен поток в правоъгълен канал, където C е константа, зависеща от аспектното съотношение на канала, L е дължината на микроканала, Vav е средната скорост вътре в микроканала, Dh е хидравличният диаметър на канала, g – ускорение на гравитацията.Използвайки това уравнение, средната скорост на канала може да се изчисли, като се използва следното уравнение: