Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка за CSS. За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да изключите режима на съвместимост в Internet Explorer). Междувременно, за да осигурим непрекъсната поддръжка, ние ще показваме сайта без стилове и JavaScript.
Порестите силициеви частици бяха получени чрез зол-гел метод с някои модификации, за да се получат макропорести частици. Тези частици бяха дериватизирани чрез полимеризация с обратимо добавяне на фрагментирана верига (RAFT) с N-фенилмалеимид-метилвинилизоцианат (PMI) и стирен за получаване на N-фенилмалеимид интеркалиране на полистирен (PMP) неподвижна фаза. Колона от неръждаема стомана с тесен канал s (100 × 1,8 mm id) бяха опаковани чрез опаковане на суспензия. Оценено PMP колонно разделяне на пептидна смес, състояща се от пет пептида (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, левцин енкефалин) хроматографска производителност) и смилане с трипсин на човешки серумен албумин (HAS). При оптимални условия на елуиране теоретичният брой на плочките на пептидната смес достига до 280 000 плочки/m². Сравнявайки ефективността на разделяне на разработената колона с търговската колона Ascentis Express RP-Amide, беше наблюдавано, че ефективността на разделяне на PMP колоната е по-добра от търговската колона по отношение на ефективността на разделяне и разделителната способност.
През последните години биофармацевтичната индустрия се превърна в разрастващ се глобален пазар със значително увеличение на пазарния дял. С експлозивния растеж на биофармацевтичната индустрия1,2,3, анализът на пептиди и протеини е силно желан. В допълнение към целевия пептид, няколко примеси се генерират по време на пептидния синтез, като по този начин се изисква хроматографско пречистване, за да се получат пептиди с желаната чистота. Анализът и характеризирането на протеини в телесни течности, тъкани и клетки е изключително предизвикателна задача поради големия брой потенциално откриваеми видове в една проба. Въпреки че масспектрометрията е ефективен инструмент за секвениране на пептиди и протеини, ако такива проби се инжектират в масспектрометъра с едно преминаване, разделянето няма да бъде идеално. Този проблем може да бъде смекчен чрез прилагане на разделяне с течна хроматография (LC) преди MS анализ, което ще намали броя на аналитите, влизащи в масспектрометъра в даден момент4,5,6. В допълнение, по време на разделяне на течна фаза, аналитите могат да бъдат фокусирани в тесни области, като по този начин концентрират тези аналити и подобряват чувствителността на откриване на MS. Течната хроматография (LC) напредна значително през последното десетилетие и се превърна в популярна техника в протеомния анализ7,8,9,10.
Течна хроматография с обърната фаза (RP-LC) се използва широко за пречистване и разделяне на пептидни смеси, като се използва октадецил-модифициран силициев диоксид (ODS) като неподвижна фаза11,12,13. Въпреки това, стационарните фази на RP не осигуряват задоволително разделяне на пептиди и протеини поради тяхната сложна структура и амфифилна природа 14,15. Следователно, специално проектирани стационарни фази са необходими за анализиране на пептиди и протеини с полярни и неполярни части, за да взаимодействат и задържат тези аналити16. Хроматографията в смесен режим, която осигурява мултимодални взаимодействия, може да бъде алтернатива на RP-LC за разделяне на пептиди, протеини и други сложни смеси. Приготвени са няколко стационарни фази в смесен режим и колони, пълни с тези фази, са използвани за разделяне на пептиди и протеини17 ,18,19,20,21. Стационарните фази със смесен режим (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, полярна интеркалация/RPLC) са подходящи за разделяне на пептиди и протеини поради наличието както на полярни, така и на неполярни групи22,23,24,25,26,27,28. По същия начин полярните интеркалиращи стационарни фази с ковалентно свързани полярни групи показват добра разделителна способност и уникална селективност за полярни и неполярни аналити, тъй като разделянето зависи от взаимодействието между аналита и неподвижната фаза.Мултимодални взаимодействия 29, 30, 31, 32. Наскоро Zhang et al.30 подготви полиаминова стационарна фаза с терминиран додецил и успешно раздели въглеводороди, антидепресанти, флавоноиди, нуклеозиди, естрогени и няколко други аналити. Полярният интеркалатор има както полярни, така и неполярни групи, така че може да се използва за разделяне на пептиди и протеини, които имат както хидрофобни, така и хидрофилни части. Полярно вградени колони (напр. вграден в амид C18 колони) се предлагат в търговската мрежа под търговското наименование Ascentis Express RP-Amide columns, но тези колони се използват само за анализ на амин 33.
В настоящото изследване беше подготвена и оценена полярно вградена стационарна фаза (полистирен с вграден N-фенилмалеимид) за разделяне на пептиди и трипсинови разграждания на HSA. Стационарната фаза беше приготвена, като се използва следната стратегия. Порестите силициеви частици бяха приготвени съгласно процедурата, дадена в предишната ни публикация с някои модификации на протокола за приготвяне. Съотношението на урея, полиетилен гликол (PEG), TMOS , вода и оцетна киселина се коригират за получаване на силициеви частици с голям размер на порите. Второ, нов лиганд, фенилмалеимид-метил винил изоцианат, беше синтезиран и използван за дериватизиране на силициеви частици за получаване на полярна вградена стационарна фаза. Получената стационарна фаза беше опакована в колона от неръждаема стомана (100 × 1,8 mm id), като се използва оптимизираната схема на опаковане. Опаковката на колоната се подпомага с механична вибрация, за да се осигури образуването на хомогенен слой в колоната. Оценете разделянето на напълнена колона на пептидни смеси, състоящи се от пет пептида;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) и разграждане на трипсин на човешки серумен албумин (HAS). Наблюдава се, че пептидната смес и разграждането на трипсин на HSA се разделят с добра разделителна способност и ефективност. Ефективността на разделяне на PMP колоната е сравнена с тази на колоната Ascentis Express RP-Amide. пептидите и протеините бяха наблюдавани като добре разделени и ефективни в PMP колоната, която беше по-ефективна от колоната Ascentis Express RP-Amide.
PEG (полиетилен гликол), урея, оцетна киселина, триметокси ортосиликат (TMOS), триметил хлорсилан (TMCS), трипсин, човешки серумен албумин (HSA), амониев хлорид, урея, хексан метилдисилазан (HMDS), метакрилоил хлорид (MC), стирен, 4-хидрокси-TEMPO, бензоил пероксид (B PO), HPLC клас ацетонитрил (ACN), метанол, 2-пропанол и ацетон, закупени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ).
Смес от урея (8 g), полиетилен гликол (8 g) и 8 mL 0,01 N оцетна киселина се разбърква в продължение на 10 минути и след това към нея се добавят 24 mL TMOS при леденостудени условия. Реакционната смес се нагрява при 40°C в продължение на 6 часа и след това при 120°C в продължение на 8 часа в автоклав от неръждаема стомана. Водата се излива и остатъчният материал се изпарява. изсушава се при 70°C в продължение на 12 часа. Изсушената мека маса се смила гладко в пещ и се калцинира при 550°C в продължение на 12 часа. Три партиди се приготвят и характеризират за изследване на възпроизводимостта на размера на частиците, размера на порите и повърхностната площ.
Чрез повърхностна модификация на частици от силициев диоксид с предварително синтезиран лиганд фенилмалеимид-метилвинилизоцианат (PCMP), последвано от радиална полимеризация със стирен, се получава съединение, съдържащо полярна група.Стационарна фаза за агрегати и полистиренови вериги. Процесът на приготвяне е описан по-долу.
N-фенилмалеимид (200 mg) и метил винил изоцианат (100 mg) бяха разтворени в сух толуен и 0,1 mL 2,2′-азоизобутиронитрил (AIBN) бяха добавени към реакционната колба за получаване на съполимер на фенилмалеимид-метил винил изоцианат (PMCP). Сместа беше нагрята при 60°C за 3 часа, филтрува се и се суши в пещ при 40°С в продължение на 3 часа.
Изсушени силициеви частици (2 g) се диспергират в сух толуен (100 mL), разбъркват се и се обработват с ултразвук в 500 mL облодънна колба за 10 минути. PMCP (10 mg) се разтваря в толуен и се добавя на капки към реакционната колба през капеща фуния. Сместа се нагрява под обратен хладник при 100°C в продължение на 8 часа, филтрува се и се промива с ацетон и се изсушава при 60°C за 3 часа. След това, PMCP-свързани силициеви частици (100 g) се разтварят в толуен (200 ml) и се добавя 4-хидрокси-TEMPO (2 mL) в присъствието на 100 µL дибутилкалаен дилаурат като катализатор. Сместа се разбърква при 50°C за 8 часа, филтрува се и се суши при 50°C за 3 часове.
Стирен (1 mL), бензоил пероксид BPO (0,5 mL) и TEMPO-PMCP-прикрепени силициеви частици (1,5 g) се диспергират в толуен и се продухват с азот. Полимеризацията на стирен се провежда при 100°C в продължение на 12 часа. Полученият продукт се промива с метанол и се суши при 60°C за една нощ. Показана е общата реакционна схема на фигура 1.
Пробите бяха дегазирани при 393 K за 1 час, за да се получи остатъчно налягане от по-малко от 10-3 Torr. Количеството N2, адсорбирано при относително налягане от P/P0 = 0,99, беше използвано за определяне на общия обем на порите. Морфологията на голи и лигандно свързани силициеви частици беше изследвана със сканираща електронна микроскопия (Hitachi High Technologies, Токио, Япония). Изсушени проби ( голи силициев диоксид и свързани с лиганд частици силициев диоксид) бяха поставени върху алуминиева колона с помощта на залепваща въглеродна лента. Злато беше поставено върху пробите с помощта на Q150T разпрашващо устройство за нанасяне на покритие и 5 nm Au слой беше отложен върху пробите. Това подобрява ефективността на процеса при използване на ниски напрежения и осигурява фино зърно, студено разпрашване. Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash елементен анализатор EA1112 използван за елементен анализ. Анализатор на размера на частиците Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 беше използван за получаване на разпределението на размера на частиците. Голите силициеви частици и лиганд-свързани силициеви частици (5 mg всяка) бяха диспергирани в 5 mL изопропанол, обработени с ултразвук за 10 минути, завихрени за 5 минути и поставени на оптичната маса на Mastersizer. Thermo гравиметричният анализ се извършва със скорост от 5 °C на минута в температурен диапазон от 30 до 800 °C.
Облицовани със стъкло колони с тесен отвор от неръждаема стомана с размери (100 × 1,8 mm id) бяха опаковани с помощта на метода за опаковане на суспензия, като се прилага същата процедура, използвана в Ref.31. Колона от неръждаема стомана (облицована със стъкло, 100 × 1,8 mm вътрешен диаметър) с изходен фитинг, съдържащ 1 µm фрита, беше свързана към пакер за суспензия (Alltech Deerfield, IL, САЩ). Пригответе суспензия от неподвижна фаза чрез суспендиране на 150 mg неподвижна фаза в 1,2 mL метанол и я изпратите в колоната за съхранение. Метанолът беше използван и като разтворител на суспензията като задвижващ разтворител. Напълнете колоната последователно чрез прилагане на налягания от 100 MP за 10 минути, 80 MP за 15 минути и 60 MP за 30 минути. По време на опаковането беше приложена механична вибрация с два шейкъра на GC колона (Alltech, Deerfield, IL, САЩ), за да се осигури равномерно опаковане на колоната. Затворете опаковчика за суспензия и освободете налягането бавно, за да предотвратите повреда в колоната. Изключете колона от модула за опаковане на суспензия и свържете друг фитинг към входа и към системата LC, за да проверите работата му.
Конструирана е LC помпа (10AD Shimadzu, Япония), инжектор (Valco (САЩ) C14 W.05) с 50nL инжекционен контур, мембранен дегазатор (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS капилярен прозорец. Специален µLC детектор на устройство (UV-2075) и облицовани със стъкло микроколони. Използвайте много тесни и къси свързващи тръби, за да минимизирате ефекта на допълнително разширяване на лентата на колоната. След опаковането, капиляри (50 μm id 365 и редуциращи съединителни капиляри (50 μm) бяха инсталирани на изхода 1/16″ на редуциращия съединител. Събирането на данни и хроматографската обработка бяха извършени с помощта на софтуер Multichro 2000. Мониторинг при 254 nm Аналитите бяха тествани за UV абсорбция. Хроматографските данни бяха анализирани от OriginPro8 (Нортхемптън, Масачузетс).
Албумин от човешки серум, лиофилизиран прах, ≥ 96% (агарозна гел електрофореза) 3 mg, смесен с трипсин (1,5 mg), 4,0 M урея (1 mL) и 0,2 M амониев бикарбонат (1 mL). Разтворът се разбърква в продължение на 10 минути и се държи във водна баня при 37°C в продължение на 6 часа, след което се гаси с 1 mL от 0,1% TFA. Филтрирайте разтвора и го съхранявайте под 4 °C.
Разделянето на пептидни смеси и HSA трипсин смилане бяха оценени отделно на PMP колони. Проверете разделянето на пептидната смес и трипсин смилането на HSA от PMP колоната и сравнете резултатите с колоната Ascentis Express RP-Amide. Теоретичният брой на плаките се изчислява, както следва:
SEM изображения на голи силициеви частици и лигандно свързани силициеви частици са показани на ФИГ.2 .SEM изображения на голи силициеви частици (a, b) показват, че за разлика от предишните ни проучвания, тези частици са сферични, в които частиците са удължени или имат нередовна симетрията. Повърхността на лигандните силициеви частици (C, D) е по-плавна, отколкото тази на голите силициеви частици.
Изображения от сканиращ електронен микроскоп на голи силициеви частици (A, B) и лигандно свързани силициеви частици (C, D).
Разпределението на размера на частиците на голи частици силициев диоксид и частици силициев диоксид, свързани с лиганд, са показани на Фигура 3(A). Кривите на разпределение на размера на частиците на базата на обема показват, че размерът на частиците на силициевия диоксид се е увеличил след химическа модификация (Фигура 3A). Данните за разпределението на размера на частиците на частиците силициев диоксид от настоящото изследване и предишното проучване са сравнени в Таблица 1(A). Базираният на обема размер на частиците, d(0,5), на P MP е 3,36 μm, в сравнение с предишното ни проучване с ad(0,5) стойност от 3,05 μm (свързани с полистирен силициеви частици)34. Тази партида имаше по-тясно разпределение на размера на частиците в сравнение с предишното ни изследване поради променливите съотношения на PEG, урея, TMOS и оцетна киселина в реакционната смес. Размерът на частиците на PMP фазата е малко по-голям от този на свързания с полистирен силициев диоксид фаза на частиците, която проучихме по-рано. Това означава, че повърхностната функционализация на силициевите частици със стирен отлага само полистиренов слой (0,97 µm) върху повърхността на силициевия диоксид, докато в PMP фазата дебелината на слоя е 1,38 µm.
Разпределение на размера на частиците (A) и разпределение на размера на порите (B) на голи силициеви частици и свързани с лиганд частици силициев диоксид.
Размерът на порите, обемът на порите и повърхностната площ на частиците силициев диоксид от настоящото изследване са дадени в таблица 1(B). PSD профилите на голите частици силициев диоксид и свързаните с лиганд частици силициев диоксид са показани на фигура 3(B). Резултатите са сравними с предишното ни проучване. Размерите на порите на голите и свързаните с лиганд частици силициев диоксид са съответно 310 и 241, което показва, че размерът на порите намалява с 69 след химическа модификация, както е показано в Таблица 1(B), а промяната на кривата е показана на Фиг. 3(B). По същия начин обемът на порите на силициевите частици намалява от 0,67 до 0,58 cm3/g след химическа модификация. Специфичната повърхностна площ на текущо изследваните силициеви частици е 116 m2/g, което е сравнимо с предишното ни изследване (124 m2/g). показано в таблица 1(B), повърхностната площ (m2/g) на силициевите частици също намалява от 116 m2/g на 105 m2/g след химическа модификация.
Резултатите от елементния анализ на стационарната фаза са показани в таблица 2. Въглеродното натоварване на текущата стационарна фаза е 6,35%, което е по-ниско от въглеродното натоварване на предишното ни изследване (свързани с полистирен силициеви частици, 7,93%35 и 10,21%, съответно) 42. Въглеродното натоварване на текущата стационарна фаза е ниско, тъй като при подготовката на текущата SP, в допълнение към стирен, някои полярни лиганди като напр. Използвани са фенилмалеимид-метилвинилизоцианат (PCMP) и 4-хидрокси-TEMPO. Тегловният процент на азота в текущата стационарна фаза е 2,21%, в сравнение съответно с 0,1735 и 0,85% от теглото на азота в предишни проучвания. Това означава, че тегл.% азот е по-висок в текущата стационарна фаза поради фенилмалеимид. По същия начин въглеродните натоварвания на продуктите ( 4) и (5) са съответно 2,7% и 2,9%, докато въглеродното натоварване на крайния продукт (6) е 6,35%, както е показано в таблица 2. Загубата на тегло е проверена с PMP стационарна фаза и TGA кривата е показана на Фигура 4. TGA кривата показва загуба на тегло от 8,6%, което е в добро съответствие с въглеродното натоварване (6,35%), тъй като лигандите съдържат не само C, но също така N, O и H.
Фенилмалеимид-метилвинилизоцианатният лиганд е избран за повърхностна модификация на силициев диоксид, тъй като има полярни фенилмалеимидни групи и винилизоцианатни групи. Винилизоцианатните групи могат допълнително да реагират със стирен чрез жива радикална полимеризация. Втората причина е да се вмъкне група, която има умерено взаимодействие с аналита и няма силно електростатично взаимодействие между аналита и неподвижната фаза, тъй като p хенилмалеимидната част няма виртуален заряд при нормално pH. Полярността на стационарната фаза може да се контролира от оптималното количество стирен и времето за реакция на свободна радикална полимеризация. Последната стъпка от реакцията (свободнорадикална полимеризация) е критична и може да промени полярността на стационарната фаза. Извършен е елементарен анализ, за ​​да се провери въглеродното натоварване на тези стационарни фази. Беше наблюдавано, че увеличаването на количеството стирен и времето за реакция увеличава въглеродното натоварване на стационарната фаза и обратно. SP, приготвени с различни концентрации на стирен, имат различни въглеродни натоварвания. Отново, заредете тези стационарни фази в колони от неръждаема стомана и проверете техните хроматографски характеристики (селективност, разделителна способност, N стойност и т.н.). Въз основа на тези експерименти беше избрана оптимизирана формула за приготвяне на стационарната фаза на PMP, за да се осигури контролирана полярност и добро задържане на аналита.
Пет пептидни смеси (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, левцин енкефалин) също бяха оценени с помощта на PMP колона с използване на подвижна фаза;60/40 (v/v) ацетонитрил/вода (0,1% TFA) при скорост на потока 80 μL/min. При оптимални условия на елуиране, теоретичният брой на плаките (N) на колона (100 × 1,8 mm id) е 20 000 ± 100 (200 000 плаки/m²). Таблица 3 дава стойностите на N за трите PMP колони и цветността тограмите са показани на Фигура 5A. Бърз анализ на PMP колона при висока скорост на потока (700 μL/min), пет пептида се елуират в рамките на една минута, стойностите на N са много добри, 13 500 ± 330 на колона (100 × 1,8 mm id), съответства на 135 000 плаки/m (Фигура 5B). Три колони с еднакъв размер (100 × 1,8 mm id) бяха опаковани с три различни партиди PMP стационарна фаза, за да се провери възпроизводимостта. Концентрацията на аналита за всяка колона беше записана с помощта на оптималните условия на елуиране и броя на теоретичните блюда N и времето на задържане за отделяне на една и съща тестова смес на всяка колона. Данните за възпроизводимост за PMP колоните са показани в Таблица 4. Възпроизводимостта на PMP колоната корелира добре с много ниски %RSD стойности, както е показано в Таблица 3 .
Разделяне на пептидна смес на PMP колона (B) и Ascentis Express RP-Amide колона (A);подвижна фаза 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), PMP размери на колоната (100 × 1.8 mm id);аналитичен Редът на елуиране на съединенията: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) и 5 ​​(левцинова киселина енкефалин)).
PMP колона (100 × 1,8 mm вътрешен диаметър) беше оценена за разделяне на триптични усвоявания на човешки серумен албумин при високоефективна течна хроматография. Хроматограмата на фигура 6 показва, че пробата е добре разделена и разделителната способност е много добра. Усвоените HSA бяха анализирани при скорост на потока 100 µL/min, подвижна фаза 70/30 ацетонитрил/вода и 0,1% TFA. Както е показано в хроматограмата (Фигура 6) смилането на HSA е разделено на 17 пика, съответстващи на 17 пептида. Ефективността на разделяне на всеки пик в смилането на HSA е изчислена и стойностите са дадени в таблица 5.
Триптично разграждане на HSA (100 × 1.8 mm id) се отделя на PMP колона;скорост на потока (100 uL/min), подвижна фаза 60/40 ацетонитрил/вода с 0.1% TFA.
където L е дължината на колоната, η е вискозитетът на подвижната фаза, ΔP е обратното налягане на колоната и u е линейната скорост на подвижната фаза. Пропускливостта на PMP колоната е 2,5 × 10-14 m2, скоростта на потока е 25 μL/min и се използва 60/40 v/v ACN/вода. Пропускливостта на PMP колоната (100 × 1,8 mm id ) беше подобна на тази от предишното ни проучване Ref.34. Пропускливостта на колоната, пълна с повърхностно порьозни частици, е: 1,7 × 10-15 за 1,3 μm частици, 3,1 × 10-15 за 1,7 μm частици, 5,2 × 10-15 и 2,5 × 10-14 m2 за 2,6 μm частици За 5 μm частици 43. Следователно, пропускливостта на PMP фазата е подобна на тази на 5 μm частици ядро-обвивка.
където Wx е теглото на колоната, пълна с хлороформ, Wy е теглото на колоната, пълна с метанол, и ρ е плътността на разтворителя. Плътности на метанол (ρ = 0,7866) и хлороформ (ρ = 1,484). Общата порьозност на колоните SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm id) 34 и C18-U rea колони 31, които преди това проучихме, бяха съответно 0,63 и 0,55. Това означава, че наличието на карбамидни лиганди намалява пропускливостта на стационарната фаза. От друга страна, общата порьозност на PMP колоната (100 × 1,8 mm id) е 0,60. Пропускливостта на PMP колоните е по-ниска от тази на колоните, пълни с C18-свързани силициеви частици, тъй като в C18-тип стационарни фази С18 лигандите са прикрепени към силициевите частици като линейни вериги, докато в стационарни фази от тип полистирен около него се образува сравнително дебел полимерен слой. В типичен експеримент порьозността на колоната се изчислява като:
Фигури 7A, B показват PMP колоната (100 × 1,8 mm вътрешен диаметър) и колоната Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm вътрешен диаметър), използвайки същите условия на елуиране (т.е. 60/40 ACN/H2O и 0,1% TFA).) от участъка на van Deemter.Избрани пептидни смеси (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, левцин енкефалин) бяха приготвени в 20 µL/ Минималната скорост на потока за двете колони е 800 µL/min. Минималните стойности на HETP при оптимална скорост на потока (80 µL/min) за PMP колоната и колоната Ascentis Express RP-Amide беше съответно 2,6 µm и 3,9 µm. Стойностите на HETP показват, че ефективността на разделяне на PMP колоната (100 × 1,8 mm id) е много по-добра от наличната в търговската мрежа колона Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id). Графиката на van Deemter на фиг. 7(A) показва, че намаляването на стойността на N с увеличаването на потока не е значително в сравнение с предишното ни проучване. По-високата ефективност на разделяне на PMP колоната (100 × 1,8 mm id) в сравнение с колоната Ascentis Express RP-Amide се основава на подобрения във формата на частиците, размера и сложните процедури за опаковане на колоната, използвани в текущата работа34.
(A) графика на van Deemter (HETP спрямо линейна скорост на подвижната фаза), получена с помощта на PMP колона (100 × 1,8 mm id) в 60/40 ACN/H2O с 0,1% TFA. (B) графика на van Deemter (HETP спрямо линейна скорост на подвижната фаза), получена с помощта на колона Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) в 60/4 0 ACN/H2O с 0.1% TFA.
Беше подготвена и оценена полярно вградена полистиролова стационарна фаза за разделяне на синтетични пептидни смеси и трипсинови разграждания на човешки серумен албумин (HAS) във високоефективна течна хроматография. Хроматографската производителност на PMP колоните за пептидни смеси е отлична по отношение на ефективността на разделяне и разделителната способност. Подобрената производителност на разделяне на PMP колоните се дължи на различни причини, като размера на частиците и размера на порите на si частици на лицето, контролиран синтез на стационарната фаза и комплексно опаковане на колоната. В допълнение към високата ефективност на разделяне, ниското обратно налягане на колоната при високи скорости на потока е друго предимство на тази стационарна фаза. PMP колоните показват добра възпроизводимост и могат да се използват за анализ на пептидни смеси и разграждане на трипсин на различни протеини. Ние възнамеряваме да използваме тази колона за разделяне на природни продукти, биоактивни съединения от лечебни растения и гъбични екстракти в течен хром тография. В бъдеще PMP колоните също ще бъдат оценявани за разделяне на протеини и моноклонални антитела.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Изследване на системи за разделяне на пептиди чрез хроматография с обърната фаза Част I: Разработване на протокол за характеризиране на колона.J.Хроматография.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Подобрени активни пептиди, предназначени за лечение на инфекциозни заболявания. Biotechnology.Advanced.36 (2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Синтетични терапевтични пептиди: наука и пазар.откриване на лекарства.15 (1-2) днес, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J.Хроматография.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Усъвършенстваната течна хроматография-масспектрометрия позволява включването на широко насочена метаболомика и протеомика.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Ролята на UHPLC в разработването на лекарства.J.Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Фундаментални и практически аспекти на течната хроматография при свръхвисоко налягане за бързи разделяния.J.Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Приложение на ултрависоко ефективна течна хроматография в разработването на лекарства.J.Хроматография.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Монолитни макропорести хидрогелове, приготвени от емулсии масло във вода с висока вътрешна фаза за ефективно пречистване на ентеровируси. Chemical.Britain.J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ролята на течната хроматография в протеомиката.J.Хроматография. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Нововъзникващи тенденции в разделянето на течна хроматография с обърната фаза на терапевтични пептиди и протеини: теория и приложения.J.Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Двуизмерно разделяне на пептиди с помощта на RP-RP-HPLC система, използваща различни стойности на pH в първото и второто измерение на разделяне.J.Sep. Sci. 28 (14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Бяха изследвани характеристиките на масов трансфер и кинетичните характеристики на високоефективни хроматографски колони, пълни с C18 под-2 μm напълно и повърхностно порьозни частици. J.Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Последни тенденции и аналитични предизвикателства при изолирането, идентифицирането и валидирането на растителни биоактивни пептиди.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Протеомичният пейзаж на царството на живота. Nature 582 (7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Обработка надолу по веригата на терапевтични пептиди чрез препаративна течна хроматография. Молекула (Базел, Швейцария) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Хроматография в смесен режим и нейното приложение към биополимери.J.Хроматография. A 1218 (49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Лиганди за протеинова хроматография в смесен режим: принцип, характеризиране и дизайн.J.Биотехнология.144(1), 3-11 (2009).