Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Използвате версия на браузъра с ограничена поддръжка на CSS. За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer). Освен това, за да осигурим постоянна поддръжка, показваме сайта без стилове и JavaScript.
Показва карусел от три слайда едновременно. Използвайте бутоните „Предишна“ и „Следваща“, за да се придвижвате през три слайда едновременно, или използвайте плъзгачите в края, за да се придвижвате през три слайда едновременно.
Порести силициеви частици бяха получени чрез зол-гел метод с някои модификации за получаване на частици с широки пори. Тези частици бяха дериватизирани с N-фенилмалеимид-метилвинилизоцианат (PMI) и стирен чрез полимеризация с обратен верижен трансфер-фрагментация (RAFT), за да се получат полиамиди, интеркалирани с N-фенилмалеимид. Стационарна фаза - стирен (PMP). Теснопроходни колони от неръждаема стомана (вътрешен диаметър 100 × 1,8 mm) бяха запълнени със суспензионен пълнеж. Хроматографските характеристики на PMP колоната бяха оценени за разделяне на смес от синтетични пептиди, състояща се от пет пептида (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu аминокиселина енкефалин) и триптичен хидролизат на човешки серумен албумин (HAS). При оптимални условия на елуиране, теоретичният брой плаки със смес от пептиди достигна 280 000 плаки/кв.м. Сравнявайки ефективността на разделяне на разработената колона с търговската колона Ascentis Express RP-Amide, беше наблюдавано, че ефективността на разделяне на PMP колоната е по-висока от търговската колона по отношение на ефективност на разделяне и разделителна способност.
Биофармацевтичната индустрия се превърна в разрастващ се глобален пазар със значително увеличение на пазарния дял през последните години. С експлозивния растеж на биофармацевтичната индустрия1,2,3 има голяма нужда от анализ на пептиди и протеини. В допълнение към целевия пептид, по време на синтеза на пептиди се образуват различни примеси, така че е необходимо хроматографско пречистване, за да се получи желаната чистота на пептида. Анализът и характеризирането на протеини в телесни течности, тъкани и клетки е изключително трудна задача поради големия брой потенциално откриваеми видове, присъстващи в една проба. Въпреки че масспектрометрията е ефективен инструмент за секвениране на пептиди и протеини, ако такива проби се въведат директно в масспектрометъра, разделянето ще бъде незадоволително. Този проблем може да бъде решен чрез извършване на течна хроматография (LC) преди MS анализ, което ще намали количеството аналити, влизащи в масспектрометъра в даден момент4,5,6. Освен това, аналитите могат да се концентрират в тясна област по време на разделяне в течна фаза, като по този начин концентрират тези аналити и увеличават чувствителността на MS откриването. Течната хроматография (LC) е напреднала значително през последното десетилетие и се е превърнала в широко използван метод за протеомен анализ7,8,9,10.
Обратно-фазовата течна хроматография (RP-LC) се използва широко за пречистване и разделяне на смеси от пептиди, използвайки октадецил-модифициран силициев диоксид (ODS) като стационарна фаза11,12,13. Въпреки това, поради сложната си структура и амфотерна природа14,15, стационарните фази на RP не могат да осигурят задоволително разделяне на пептиди и протеини. Следователно, анализът на пептиди и протеини с полярни и неполярни фрагменти изисква специално проектирани стационарни фази, които да взаимодействат и задържат тези аналити16. Смесената хроматография, която предлага мултимодални взаимодействия, може да бъде алтернатива на RP-LC за разделяне на пептиди, протеини и други сложни смеси. Приготвени са няколко стационарни фази от смесен тип и са използвани колони, напълнени с тези стационарни фази, за разделяне на пептиди и протеини17,18,19,20,21. Поради наличието на полярни и неполярни групи, стационарните фази със смесен режим (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, полярна интеркалация/RPLC) са подходящи за разделяне на пептиди и протеини22,23,24,25,26,27,28. , полярните интеркалирани стационарни фази с ковалентно свързани полярни групи показват добри възможности за разделяне и уникална селективност за полярни и неполярни аналити, тъй като разделянето зависи от взаимодействието между аналита и стационарната фаза. Мултимодални взаимодействия 29,30,31,32. Наскоро Zhang et al. 30 получиха бехенил-терминирани стационарни фази на полиамини и успешно разделиха въглеводороди, антидепресанти, флавоноиди, нуклеозиди, естрогени и някои други аналити. Полярният вграден стационарен материал има както полярни, така и неполярни групи, така че може да се използва за разделяне на пептиди и протеини на хидрофобни и хидрофилни части. Полярните инлайн колони (напр. C18 колони с амиден инлайн) се предлагат под търговското наименование Ascentis Express RP-Amide колони, но тези колони са използвани само за анализ на амин 33.
В настоящото изследване беше приготвена полярна вградена стационарна фаза (N-фенилмалеимид, вграден полистирен) и оценена за разделяне на пептиди и триптично разцепване на HSA. За приготвяне на стационарната фаза беше използвана следната стратегия. Порести силициеви частици бяха приготвени съгласно процедурите, описани в предишни наши публикации, с някои промени в схемите за приготвяне 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Съотношенията на урея, полиетиленгликол (PEG), TMOS и водно-оцетна киселина бяха коригирани, за да се получат силициеви частици с големи размери на порите. Второ, беше синтезиран нов фенилмалеимид-метилвинил изоцианатен лиганд и неговите дериватизирани силициеви частици бяха използвани за приготвяне на полярни вградени стационарни фази. Получената стационарна фаза беше запълнена в колона от неръждаема стомана (вътрешен диаметър 100 × 1,8 mm) съгласно оптимизирана схема за запълване. Запълването на колоната се подпомага от механични вибрации, за да се осигури равномерен слой в колоната. Пълнената колона беше оценена за разделяне на смес от пептиди, състояща се от пет пептида (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, левцин-енкефалинов пептид) и триптични хидролизати на човешки серумен албумин (HSA). Наблюдавано е, че пептидната смес и триптичният разградител на HSA се разделят с добра разделителна способност и ефективност. Ефективността на разделяне на PMP колоната беше сравнена с тази на Ascentis Express RP-Amide колоната. Наблюдавано е, че пептидите и протеините имат добра разделителна способност и висока ефективност на разделяне на PMP колоната, а ефективността на разделяне на PMP колоната е по-висока от тази на Ascentis Express RP-Amide колоната.
PEG (полиетиленгликол), урея, оцетна киселина, триметоксиортосиликат (TMOS), триметилхлоросилан (TMCS), трипсин, човешки серумен албумин (HSA), амониев хлорид, урея, хексаметилметакрилоилдисилазан (HMDS), метакрилоилхлорид (MC), стирен, 4-хидрокси-TEMPO, бензоил пероксид (BPO), ацетонитрил (ACN) за HPLC, метанол, 2-пропанол и ацетон. Sigma-Aldrich Company (Сейнт Луис, Мисури, САЩ).
Смес от урея (8 g), полиетиленгликол (8 g) и 8 ml 0,01 N. оцетна киселина се разбърква в продължение на 10 минути и към нея се добавят 24 ml TMOS при охлаждане с лед. Реакционната смес се нагрява при 40°C в продължение на 6 часа и след това при 120°C в продължение на 8 часа в автоклав от неръждаема стомана. Водата се декантира и остатъкът се суши при 70°C в продължение на 12 часа. Изсушените меки блокове се смилат гладко и се калцинират в пещ при 550°C в продължение на 12 часа. Приготвени са и характеризирани три партиди, за да се тества възпроизводимостта на размера на частиците, размера на порите и повърхностната площ.
Полярна група и стационарна фаза за полистиролови вериги. Процедурата за приготвяне е описана по-долу.
N-фенилмалеимид (200 mg) и метилвинилизоцианат (100 mg) се разтварят в безводен толуен, след което към реакционната колба се добавят 0,1 ml 2,2′-азоизобутиронитрил (AIBN), за да се получи съполимер на фенилмалеимид и метилвинилизоцианат (PMCP). Сместа се нагрява при 60°C в продължение на 3 часа, филтрира се и се суши в сушилня при 40°C в продължение на 3 часа.
Изсушени силициеви частици (2 g) бяха диспергирани в сух толуен (100 ml), разбъркани и обработени с ултразвук в продължение на 10 минути в 500 ml колба с кръгло дъно. PMCP (10 mg) беше разтворен в толуен и добавен на капки към реакционната колба през фуния за добавяне. Сместа беше нагрявана под обратен хладник при 100°C в продължение на 8 часа, филтрирана, промита с ацетон и сушена при 60°C в продължение на 3 часа. След това силициевите частици, свързани с PMCP (100 g), бяха разтворени в толуен (200 ml) и към тях беше добавен 4-хидрокси-TEMPO (2 ml) в присъствието на 100 μl дибутилкалаен дилаурат като катализатор. Сместа беше разбъркана при 50°C в продължение на 8 часа, филтрирана и сушена при 50°C в продължение на 3 часа.
Стирен (1 ml), бензоил пероксид BPO (0.5 ml) и силициеви частици, прикрепени към TEMPO-PMCP (1.5 g), бяха диспергирани в толуен и продухани с азот. Полимеризацията на стирена беше проведена при 100°C в продължение на 12 часа. Полученият продукт беше промит с метанол и изсушен за една нощ при 60°C. Общата схема на реакцията е показана на фиг. 1.
Пробите бяха дегазирани при 393 K в продължение на 1 час, докато се получи остатъчно налягане по-малко от 10–3 Torr. Количеството N2, адсорбирано при относително налягане P/P0 = 0.99, беше използвано за определяне на общия обем на порите. Морфологията на чистите и лиганд-свързаните силициеви частици беше изследвана с помощта на сканиращ електронен микроскоп (Hitachi High Technologies, Токио, Япония). Сухи проби (чист силициев диоксид и лиганд-свързани силициеви частици) бяха поставени върху алуминиеви пръти с помощта на въглеродна лента. Златото беше отложено върху пробата с помощта на устройство за разпрашване Q150T, а върху пробата беше отложен слой Au с дебелина 5 nm. Това подобрява ефективността на процеса с ниско напрежение и осигурява фино студено напръскване. Елементният анализ беше извършен с помощта на анализатор на елементен състав Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112. За получаване на разпределението на размера на частиците беше използван анализатор на размера на частиците Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000. Непокрити силициеви частици и свързани с лиганд силициеви частици (по 5 mg всяка) бяха диспергирани в 5 ml изопропанол, обработени с ултразвук в продължение на 10 минути, разбъркани в продължение на 5 минути и поставени върху оптична пейка Mastersizer. Термогравиметричният анализ се извършва със скорост 5 °C в минута в температурния диапазон от 30 до 800 °C.
Колони от неръждаема стомана с тесен отвор, облицовани със стъклени влакна, с размери (ID 100 × 1,8 mm), бяха пълнени чрез метод на пълнене със суспензия, следвайки същата процедура, както в референция 31. Колоната от неръждаема стомана (с облицовка със стъклени влакна, ID 100 × 1,8 mm) и изход, съдържащ фрита с размер на частиците 1 µm, бяха свързани към машина за пакетиране със суспензия (Alltech Deerfield, IL, USA). Пригответе суспензия от стационарната фаза, като суспендирате 150 mg от стационарната фаза в 1,2 ml метанол и я подадете в резервоарна колона. Метанолът беше използван като разтворител за суспензията и контролен разтворител. Напълнете колоната, като приложите последователност от налягане от 100 MP за 10 минути, 80 MP за 15 минути и 60 MP за 30 минути. Процесът на пълнене използва два вибратора за газова хроматография (Alltech, Deerfield, IL, USA) за механични вибрации, за да се осигури равномерно пълнене на колоната. Затворете пакета за суспензия и бавно освободете налягането, за да предотвратите повреда на колоната. Колоната беше откачена от дюзата за суспензия и към входа беше прикрепен друг фитинг и свързан към системата за течна хроматография (LC), за да се тества нейната работа.
Беше конструиран персонализиран MLC с помощта на LC помпа (10AD Shimadzu, Япония), пробоотборник с 50 nL инжекционен контур (Valco (USA) C14 W.05), мембранен дегазатор (Shimadzu DGU-14A) и UV-VIS капилярен прозорец. Детекторно устройство (UV-2075) и емайлирана микроколона. Използвайте много тесни и къси свързващи тръби, за да се сведе до минимум ефектът от допълнителното разширяване на колоната. След напълване на колоната, инсталирайте капилярка (50 µm вътре в диаметър 365) на изхода на редукционния преход 1/16″ и инсталирайте капилярка (50 µm) на редукционния преход. Събирането на данни и обработката на хроматограмите се извършват с помощта на софтуера Multichro 2000. При 254 nm, UV абсорбцията на анализираните вещества се наблюдава при 0. Хроматографските данни бяха анализирани с помощта на OriginPro8 (Northampton, MA).
Човешки серумен албумин, лиофилизиран прах, ≥ 96% (електрофореза в агарозен гел) 3 mg, смесен с трипсин (1,5 mg), 4,0 M урея (1 ml) и 0,2 M амониев бикарбонат (1 ml). Разтворът се разбърква в продължение на 10 минути и се държи във водна баня при 37°C в продължение на 6 часа, след което се гаси с 1 ml 0,1% TFA. Разтворът се филтрира и се съхранява под 4°C.
Разделянето на смес от пептиди и триптично разграден HSA върху PMP колона беше оценено отделно. Проверете триптичната хидролиза на смес от пептиди и HSA, разделени чрез PMP колона, и сравнете резултатите с Ascentis Express RP-Amide колона. Броят на теоретичните плаки се изчислява, като се използва следното уравнение:
SEM изображения на чисти силициеви частици и лиганд-свързани силициеви частици са показани на Фигура 2. SEM изображенията на чисти силициеви частици (A, B) показват сферична форма, в която частиците са удължени или имат неправилна симетрия в сравнение с предишните ни изследвания. Повърхността на силициевите частици, свързани с лиганда (C, D), е по-гладка от тази на чистите силициеви частици, което може да се дължи на полистироловите вериги, покриващи повърхността на силициевите частици.
Сканиращи електронни микрографии на чисти силициеви частици (A, B) и лиганд-свързани силициеви частици (C, D).
Разпределението на размера на частиците на чисти силициеви частици и лиганд-свързани силициеви частици е показано на Фиг. 2.3(A). Кривите на обемното разпределение на размера на частиците показват, че размерът на силициевите частици се е увеличил след химическа модификация (Фиг. 3A). Данните за разпределението на размера на силициевите частици от настоящото проучване и предишното проучване са сравнени в Таблица 1(A). Обемният размер на частиците d(0.5) на PMP е 3.36 µm, в сравнение със стойността на ad(0.5) от 3.05 µm в предишното ни проучване (полистирен-свързани силициеви частици)34. Поради промяната в съотношението на PEG, урея, TMOS и оцетна киселина в реакционната смес, разпределението на размера на частиците на тази партида е по-тясно в сравнение с предишното ни проучване. Размерът на частиците на PMP фазата е малко по-голям от този на свързаната с полистирол силициева фаза, която изследвахме по-рано. Това означава, че повърхностната функционализация на силициеви частици със стирен е отложила само полистиренов слой (0,97 µm) върху повърхността на силициевия диоксид, докато във фазата PMP дебелината на слоя е била 1,38 µm.
Разпределение на размера на частиците (A) и разпределение на размера на порите (B) на чисти силициеви частици и лиганд-свързани силициеви частици.
Размерът на порите, обемът на порите и повърхностната площ на силициевите частици, използвани в това проучване, са показани в Таблица 1 (B). PSD профилите на чисти силициеви частици и лиганд-свързани силициеви частици са показани на Фиг. 3 (B). Резултатите са сравними с предишното ни проучване34. Размерите на порите на чистите и лиганд-свързаните силициеви частици са съответно 310 Å и 241 Å, което показва, че след химическа модификация размерът на порите е намалял с 69 Å, както е показано в Таблица 1 (B), а кривата на изместване е показана на Фиг. Специфичната повърхност на силициевите частици в настоящото проучване е 116 m2/g, което е сравнимо с предишното ни проучване (124 m2/g). Както е показано в Таблица 1 (B), повърхностната площ (m2/g) на силициевите частици след химическа модификация също е намаляла от 116 m2/g до 105 m2/g.
Резултатите от елементния анализ на стационарната фаза са представени в Таблица 2. Съдържанието на въглерод в настоящата стационарна фаза е 6,35%, което е по-ниско отколкото в предишното ни проучване (частици силициев диоксид, свързани с полистирол, съответно 7,93%35 и 10,21%)42. Съдържанието на въглерод в настоящата стационарна фаза е по-ниско, тъй като някои полярни лиганди като фенилмалеимид метил винил изоцианат (PCMP) и 4-хидрокси-TEMPO са били използвани в допълнение към стирен при получаването на SP. Тегловният процент на азот в настоящата стационарна фаза е 2,21% в сравнение с 0,1735 и 0,85% в предишни проучвания42. Това означава, че настоящата стационарна фаза има висок тегловен процент азот поради фенилмалеимида. По подобен начин, продукти (4) и (5) имат съдържание на въглерод съответно 2,7% и 2,9%, докато крайният продукт (6) има съдържание на въглерод 6,35%, както е показано в Таблица 2. Термогравиметричен анализ (TGA) е използван върху стационарната фаза на PMP за тестване за загуба на тегло, а TGA кривата е показана на Фигура 4. TGA кривата показва загуба на тегло от 8,6%, което е в добро съответствие със съдържанието на въглерод (6,35%), тъй като лигандите съдържат не само C, но и N, O и H.
Лигандът фенилмалеимид-метилвинилизоцианат беше избран за модифициране на повърхността на силициевите частици поради неговите полярни фенилмалеимидни и винилизоцианатни групи. Винилизоцианатните групи могат допълнително да реагират със стирен чрез жива радикалова полимеризация. Втората причина е да се вмъкне група, която има умерени взаимодействия с аналита и няма силни електростатични взаимодействия между аналита и стационарната фаза, тъй като фенилмалеимидната част няма виртуален заряд при нормално pH. Полярността на стационарната фаза може да се контролира чрез оптималното количество стирен и времето за реакция на полимеризацията на свободните радикали. Последната стъпка на реакцията (полимеризация на свободните радикали) е критична, тъй като тя променя полярността на стационарната фаза. Беше извършен елементарен анализ, за ​​да се провери съдържанието на въглерод в тези стационарни фази. Наблюдавано е, че увеличаването на количеството стирен и времето за реакция увеличава съдържанието на въглерод в стационарната фаза и обратно. SP, приготвени с различни концентрации на стирен, имат различно въглеродно натоварване. По подобен начин тези стационарни фази бяха поставени върху колони от неръждаема стомана и бяха проверени техните хроматографски характеристики (селективност, разделителна способност, N-стойност и др.). Въз основа на тези експерименти беше избран оптимизиран състав за приготвяне на стационарната фаза на PMP, за да се осигури контролирана полярност и добро задържане на аналита.
PMP колоната беше оценена и за анализ на пет смеси от пептиди (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, левцин-енкефалин), използвайки капацитета на мобилната фаза 60/40 (v/v) ACN/вода (0,1% TFA) при скорост на потока 80 µl/min. При оптимални условия на елуиране (200 000 плаки/m²), броят на теоретичните плаки (N) на колона (100 × 1,8 mm) е 20 000 ± 100. Стойностите на N за трите PMP колони са показани в Таблица 3, а хроматограмите са показани на Фигура 5A. Бърз анализ при висок дебит (700 µl/min) на PMP колона, пет пептида елуирани в рамките на една минута, отлична N стойност от 13 500 ± 330 на колона (100 x 1,8 mm диаметър), еквивалентна на 135 000 плаки/m (Фиг. 5B). Три колони с еднакъв размер (вътрешен диаметър 100 x 1,8 mm) бяха напълнени с три различни партиди PMP стационарна фаза, за да се тества възпроизводимостта. Аналитните вещества бяха записани за всяка колона чрез разделяне на една и съща тестова смес на всяка колона, използвайки оптимални условия на елуиране, брой теоретични плаки N и време на задържане. Данните за възпроизводимост за PMP колоните са показани в Таблица 4. Възпроизводимостта на PMP колоната корелира добре с много ниски стойности на %RSD, както е показано в Таблица 3.
Разделяне на пептидни смеси на PMP колона (B) и Ascentis Express RP-Amide колона (A), мобилна фаза 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), размери на PMP колоната (100 x 1.8 mm вътрешен диаметър), анализ. Ред на елуиране на съединенията: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) и 5 ​​(енкефалин с левцинова киселина).
PMP колона (вътрешен диаметър 100 x 1,8 mm) беше оценена за разделяне на триптинния хидролизат на човешки серумен албумин чрез HPLC. Хроматограмата на Фигура 6 показва, че пробите са добре разделени с много добра разделителна способност. Разтворите на HSA бяха анализирани с помощта на скорост на потока от 100 μl/min, мобилна фаза от 70/30 ацетонитрил/вода и 0,1% TFA. Разцепването на HSA беше разделено на 17 пика, както е показано на хроматограмата (Фиг. 6), съответстващи на 17 пептида. Ефективността на разделяне на отделните пикове от HSA хидролизата беше изчислена и стойностите са показани в Таблица 5.
Триптични хидролизати на HSA бяха разделени на PMP колона (вътрешен диаметър 100 x 1,8 mm), скорост на потока (100 μl/min), мобилна фаза 60/40 ацетонитрил/вода и 0,1% TFA.
където L е дължината на колоната, η е вискозитетът на подвижната фаза, ΔP е обратното налягане на колоната и u е линейната скорост на подвижната фаза. Пропускливостта на PMP колоната е 2,5 × 10–14 m2, дебитът е 25 µl/min, използван е ACN/вода 60/40 v/v. Пропускливостта на PMP колоната (ID 100 × 1,8 mm) е подобна на тази в предишното ни проучване в Ref.34. Пропускливостта на колона, запълнена с повърхностно порести частици, е 1,7×10.6 µm, 2,5×10-14 m2 за частици с размер 5 µm43. Следователно, пропускливостта на PMP фазата е подобна на пропускливостта на частици тип „ядро-обвивка“ с размер 5 μm.
където Wx е масата на колоната, напълнена с хлороформ, Wy е масата на колоната, напълнена с метанол, а ρ е плътността на разтворителя. Плътност на метанола (ρ = 0.7866) и хлороформа (ρ = 1.484). Общата порьозност на колоната със силициеви частици-C18 (100 × 1.8 mm вътрешен диаметър)34 и нашата преди това изследвана колона C18-урея31 е съответно 0.63 и 0.55. Това означава, че наличието на урея лиганди намалява пропускливостта на стационарната фаза. От друга страна, общата порьозност на PMP колоната (вътрешен диаметър 100 × 1.8 mm) е 0.60. PMP колоните са по-малко пропускливи от колоните, пълни със силициеви частици, свързани с C18, защото в стационарните фази от тип C18 лигандите C18 са прикрепени към силициевите частици в линейни вериги, докато в стационарните фази от тип полистирол около частиците се образува относително дебел полимер. слой А. В типичен експеримент, порьозността на колоната се изчислява, както следва:
На фиг. 7А и B са показани графики на Ван Диймтер за PMP колона (вътрешен диаметър 100 x 1,8 mm) и Ascentis Express RP-Amide колона (вътрешен диаметър 100 x 1,8 mm) при едни и същи условия на елуиране, 60/40 ACN/H2O и 0,1% TFA от 20 µl/min до 800 µl/min и за двете колони. Минималните стойности на HETP при оптимална скорост на потока (80 µl/min) са били съответно 2,6 µm и 3,9 µm за PMP колоната и Ascentis Express RP-Amide колоната. Стойностите на HETP показват, че ефективността на разделяне на PMP колоната (100 x 1,8 mm вътрешен диаметър) е много по-висока от тази на предлаганата в търговската мрежа Ascentis Express RP-Amide колона (100 x 1,8 mm вътрешен диаметър). Графиката на ван Диймтер на Фиг. 7(A) показва, че намалението на стойността на N не е значително по-голямо с увеличаване на потока в сравнение с предишното ни проучване. По-високата ефективност на разделяне на PMP колоната (вътрешен диаметър 100 × 1,8 mm) в сравнение с Ascentis Express RP-Amide колоната се основава на подобрената форма и размер на частиците и усъвършенстваната процедура за пълнене на колоната, използвана в настоящата работа34.
(A) Диаграма на Ван Деемтер (HETP спрямо линейна скорост на подвижната фаза), получена на PMP колона (външен диаметър 100 x 1.8 mm) в 60/40 ACN/H2O с 0.1% TFA. (B) Диаграма на Ван Деемтер (HETP спрямо линейна скорост на подвижната фаза), получена на Ascentis Express RP-Amide колона (външен диаметър 100 x 1.8 mm) в 60/40 ACN/H2O с 0.1% TFA.
Полярна стационарна фаза от интеркалиран полистирен беше приготвена и оценена за разделяне на смес от синтетични пептиди и триптичен хидролизат на човешки серумен албумин (HSA) във високоефективна течна хроматография. Хроматографските характеристики на PMP колоните за пептидни смеси са отлични по отношение на ефективност на разделяне и разделителна способност. Подобрената ефективност на разделяне на PMP колоните се дължи на няколко причини, като например размер на частиците силициев диоксид и размер на порите, контролиран синтез на стационарни фази и сложни материали за пълнене на колоната. В допълнение към високата ефективност на разделяне, друго предимство на тази стационарна фаза е ниското обратно налягане в колоната при високи скорости на потока. PMP колоните са с висока възпроизводимост и могат да се използват за анализ на смеси от пептиди и триптично смилане на различни протеини. Възнамеряваме да използваме тази колона за разделяне на биоактивни съединения от природни продукти, екстракти от лечебни растения и гъби в течна хроматография. В бъдеще PMP колоните ще бъдат оценявани и за разделяне на протеини и моноклонални антитела.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Изследване на системи за разделяне на пептиди чрез хроматография с обратна фаза, част I: Разработване на протокол за характеризиране на колоната. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Изследване на системи за разделяне на пептиди чрез хроматография с обратна фаза, част I: Разработване на протокол за характеризиране на колоната.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., and Petersson, P. Изследване на системи за разделяне на пептиди чрез обратнофазова хроматография, Част I: Разработване на протокол за характеризиране на колони. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Изследване на системи за разделяне на пептиди чрез хроматография с обратна фаза, част I: Разработване на протокол за характеристиките на колоната. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Изследване на системи за разделяне на пептиди чрез хроматография с обратна фаза, част I: Разработване на протокол за характеристиките на колоната.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., and Petersson, P. Изследване на системи за разделяне на пептиди чрез обратнофазова хроматография, Част I: Разработване на протокол за характеризиране на колони.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019).
Гомес, Б. и др. Методи за създаване на подобрени активни пептиди за лечение на инфекциозни заболявания. Биотехнологии. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Влиге, П., Лисовски, В., Мартинес, Й. и Хрестчатиски, М. Синтетични терапевтични пептиди: Наука и пазар. Влиге, П., Лисовски, В., Мартинес, Й. и Хрестчатиски, М. Синтетични терапевтични пептиди: Наука и пазар.Влиге П., Лисовски В., Мартинес Дж. и Хресчатски М. Синтетични терапевтични пептиди: наука и пазар.Vliege P, Lisowski V, Martinez J и Khreschatsky M. Синтетични терапевтични пептиди: наука и пазар. откриване на лекарства. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Усъвършенствана протеомна течна хроматография. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Усъвършенствана протеомна течна хроматография.Вижте F., Smith RD и Shen Yu. Усъвършенствана протеомна течна хроматография. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Разширен протеинов състав 液相色谱。Вижте F., Smith RD и Shen Yu. Усъвършенствана протеомна течна хроматография.Журнал по хроматография. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Усъвършенстваната течна хроматография-масспектрометрия е способна да комбинира широкообхватна метаболомика и протеомика. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Чеснут, С. М. и Солсбъри, Дж. Дж. Ролята на UHPLC във фармацевтичното разработване. Чеснут, С. М. и Солсбъри, Дж. Дж. Ролята на UHPLC във фармацевтичното разработване.Чеснут, С.М. и Солсбъри, Дж.Дж. Ролята на UHPLC във фармацевтичното разработване.Чеснут, С. М. и Солсбъри, Дж. Дж. Ролята на UHPLC в разработването на лекарства. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Фундаментални и практически аспекти на течната хроматография с ултрависоко налягане за бързо разделяне. Wu, N. & Clausen, AM Фундаментални и практически аспекти на течната хроматография с ултрависоко налягане за бързо разделяне.Ву, Н. и Клаузен, А. М. Фундаментални и практически аспекти на течната хроматография под високо налягане за бързо разделяне. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Основни и практически аспекти на течната хроматография с ултрависоко налягане за бързо разделяне.Ву, Н. и Клаузен, А. М. Фундаментални и практически аспекти на течната хроматография под високо налягане за бързо разделяне.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Използване на ултра-ефективна течна хроматография във фармацевтичното разработване. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Използване на ултра-ефективна течна хроматография във фармацевтичното разработване.Ren, SA и Chelischeff, P. Използването на ултрависокоефективна течна хроматография във фармацевтичното разработване. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Рен, С.А. и Челичев, П.Ren, SA и Chelischeff, P. Приложение на ултра-ефективна течна хроматография в разработването на лекарства.Журнал по хроматография. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Монолитен макропорест хидрогел, получен от емулсия масло във вода с висока вътрешна фаза за ефективно пречистване на ентеровирус 71. Chemical. project. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ролята на течната хроматография в протеомиката. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ролята на течната хроматография в протеомиката.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. и Wilkins, JA Ролята на течната хроматография в протеомиката. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. и Wilkins, JA Ролята на течната хроматография в протеомиката.J. Chromatography. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Фекете, С., Вутей, Й.-Л. & Guillarme, D. Нови тенденции в разделянето на терапевтични пептиди и протеини чрез течна хроматография с обратна фаза: Теория и приложения. & Guillarme, D. Нови тенденции в разделянето на терапевтични пептиди и протеини чрез течна хроматография с обратна фаза: Теория и приложения. & Guillarme, D. Нови тенденции в разделянето на терапевтични пептиди и белки с помощта на жидкостна хроматография с обращена фаза: теория и приложения. & Guillarme, D. Нови тенденции в разделянето на терапевтични пептиди и протеини чрез течна хроматография с обратна фаза: теория и приложения. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Гийарме, Д.и Guillarmé, D. Нови тенденции в разделянето на терапевтични пептиди и протеини чрез течна хроматография с обратна фаза: теория и приложения.J. Pharm. Biomedical Science. анус. 69, 9–27 (2012).
Гилар, М., Оливова, П., Дейли, А.Е. и Геблер, Дж.К. Двумерно разделяне на пептиди с помощта на RP-RP-HPLC система с различно pH в първо и второ измерение на разделяне. Гилар, М., Оливова, П., Дейли, А.Е. и Геблер, Дж.К. Двумерно разделяне на пептиди с помощта на RP-RP-HPLC система с различно pH в първо и второ измерение на разделяне.Гилар М., Оливова П., Дали А.Е. и Геблер Дж.К. Двумерно разделяне на пептиди с помощта на RP-RP-HPLC система с различно pH в първото и второто измерение на разделяне.Гилар М., Оливова П., Дали А.Е. и Геблер Дж.К. Двумерно разделяне на пептиди с използване на различни стойности на pH в първото и второто измерение на разделяне с помощта на RP-RP-HPLC система. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Изследване на масопреноса и кинетичните характеристики на високоефективни хроматографски колони, запълнени с напълно порести и повърхностно порести C18 частици по-малки от 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Последни тенденции и аналитични предизвикателства в изолирането, идентифицирането и валидирането на растителни биоактивни пептиди. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Мюлер, Дж. Б. и др. Протеомичен пейзаж на царството на живота. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
Де Лука, К. и др. Последваща обработка на терапевтични пептиди чрез препаративна течна хроматография. Molecules (Базел, Швейцария) 26(15), 4688 (2021).
Янг, Й. и Генг, Х. Смесена хроматография и нейните приложения към биополимери. Янг, Й. и Генг, Х. Смесена хроматография и нейните приложения към биополимери.Ян, Ю. и Генг, Х. Смесена хроматография и нейното приложение към биополимери. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Янг, Й. и Генг, Х. Смесена хроматография и нейното приложение в биополимери.Ян, Ю. и Джийн, Х. Смесена хроматография и нейното приложение към биополимери.Журнал по хроматография. A 1218(49), 8813–8825 (2011).