Благодарим ви, че посетихте Nature.com.Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка на CSS.За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer).Междувременно, за да осигурим постоянна поддръжка, ние ще визуализираме сайта без стилове и JavaScript.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) е бобово растение, използвано за производство на храни и подобряване на почвата.Глобалното разширяване на NLL като култура привлече много патогенни гъби, включително антракноза по лупина, която причинява опустошителната болест антракноза.Два алела, Lanr1 и AnMan, които придават повишена резистентност, са използвани в развъждането на NLL, но основните молекулярни механизми остават неизвестни.В това проучване маркерите Lanr1 и AnMan бяха използвани за скрининг на европейски NLL проби.Тестването на ваксината в контролирана среда потвърди ефикасността и на двата резистентни донора.Профилиране на диференциална генна експресия се извършва върху представителни резистентни и чувствителни линии.Резистентността към антракноза се свързва със свръхекспресия на термините на генната онтология „GO:0006952 Защитен отговор“, „GO:0055114 Редокс процес“ и „GO:0015979 Фотосинтеза“.В допълнение, линията Lanr1(83A:476) показва значително препрограмиране на транскриптома бързо след инокулация, докато другите линии показват забавяне на този отговор с около 42 часа.Защитните реакции са свързани с гените TIR-NBS, CC-NBS-LRR и NBS-LRR, 10 протеина, участващи в патогенезата, протеини за трансфер на липиди, ендоглюкан-1,3-β-глюкозидаза, богати на глицин протеини на клетъчната стена и гени от реактивния път на кислорода.Ранните отговори на 83A:476, включително внимателно потискане на гени, свързани с фотосинтезата, съвпадат с успешна защита по време на вегетативната фаза на растеж на гъбичната биология, което предполага, че ефекторът задейства имунитета.Реакцията на Манделуп се забавя, както и общото хоризонтално съпротивление.
Теснолистната лупина (NLL, Lupinus angustifolius L.) е зърнена култура с високо съдържание на протеини, произхождаща от региона на Западното Средиземноморие1,2.В момента се отглежда като хранителна култура за животни и хора.Също така се счита за зелено торене в системите за ротация на културите поради фиксирането на азот от симбиотични азотфиксиращи бактерии и цялостното подобряване на структурата на почвата.NLL е претърпял бърз процес на опитомяване през миналия век и все още е под силен натиск за размножаване3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.С широко разпространеното култивиране на NLL, последователността от патогенни гъбички разработи нови земеделски ниши и причини нови болести, унищожаващи културите. Най-забележителното за фермерите и развъдчиците на лупина е появата на антракноза, причинена от патогенната гъба Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Най-забележителното за фермерите и развъдчиците на лупина е появата на антракноза, причинена от патогенната гъба Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Най-важното за фермерите и селекционерите на люпина е проявата на антракноза, причинена от патогенен гриб Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Най-забележителното за фермерите и развъдчиците на лупина е появата на антракноза, причинена от патогенната гъба Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg , Feiler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Косата。1 Най-поразителният за фермерите и селекционерите люпина е проявата на антракноза, причинена от патогенния гриб Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Най-впечатляващото за фермерите и развъдчиците на лупина е появата на антракноза, причинена от патогенната гъба Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Най-ранните съобщения за болестта идват от Бразилия и Съединените щати, като типичните симптоми се появяват съответно през 1912 и 1929 г.Въпреки това, след около 30 години, патогенът е определен като Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф на Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенасочена морфология. & Х. Шренк,. & Х. Шренк, .и Х. Шренк. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。и Х. Шленк,.Предварителното фенотипизиране на заболяването, извършено в средата на 20-ти век, показа известна резистентност при NLL и екземплярите от жълта лупина (L. luteus L.), но всички тествани екземпляри от бяла лупина (L. albus L.) бяха силно чувствителни15,16.Проучванията показват, че развитието на антракноза е свързано с повишени валежи (влажност на въздуха) и температура (в диапазона 12-28°C), което води до нарушаване на устойчивостта при по-високи температури17, 18. Всъщност времето, необходимо на конидиите да покълнат и да започне заболяването, е четири пъти по-кратко при 24°C (4 часа), отколкото при 12°C (16 часа) при условия на висока влажност19.По този начин продължаващото глобално затопляне доведе до разпространението на антракноза.Болестта обаче е наблюдавана във Франция (1982 г.) и Украйна (1983 г.) като предвестник на предстояща заплаха, но очевидно е била игнорирана от индустрията за производство на лупина по това време20,21.Няколко години по-късно тази опустошителна болест се разпространи по целия свят и също засегна големи страни, произвеждащи лупина, като Австралия, Полша и Германия22,23,24.След епидемия от антракноза в средата на 90-те години, обширен скрининг доведе до идентифицирането на няколко резистентни донори в проби от NLL19.Устойчивостта на NLL към антракноза се контролира от два отделни доминантни алела, открити в различни източници на зародишна плазма: Lanr1 в сорта Tanjil и Wonga и AnMan в сорта.Mandalay 25, 26. Тези алели допълват молекулярните маркери, които поддържат селекцията на устойчива зародишна плазма в развъдните програми 25, 26, 27, 28, 29, 30.Устойчивата линия за размножаване 83A:476, носеща алела Lanr1, беше кръстосана с чувствителната дива линия P27255, за да се получи RIL популация, отделяща се за резистентност към антракноза, което направи възможно присвояването на локуса Lanr1 към хромозома NLL-1131, 32, 33. Изравняване на маркерите на картата на свързване от локуси на фланкираща резистентност към антракноза с геном ic рамка, NLL разкри местоположението на всичките три алела на една и съща хромозома (NLL-11), но в различни позиции 29, 34, 35.Въпреки това, поради малкия брой RIL и голямото генетично разстояние между маркерите и съответните алели, не могат да се направят надеждни заключения относно техните основни гени.От друга страна, използването на обратна генетика при лупини е трудно поради много ниския им потенциал за регенерация, което прави генетичната манипулация тромава37.
Развитието на опитомена зародишна плазма, носеща желания алел в хомозиготно състояние, като 83A: 476 (Lanr1) и Mandelup (AnMan), отвори вратата за изучаване на резистентност към антракноза в лицето на наличието на противоположни комбинации от алели в диви популации.Възможности на молекулярните механизми.Сравнете защитните реакции, генерирани от специфични генотипове.Това проучване оценява ранния транскриптомен отговор на NLL към ваксинация срещу C. lupini.Първо, европейски NLL зародишен плазмен панел, съдържащ 215 линии, беше скриниран с помощта на молекулярни маркери, които маркират алелите Lanr1 и AnMan.След това беше извършено фенотипизиране на антракноза върху 50 NLL линии, предварително избрани за молекулярни маркери, при контролирани условия.Въз основа на тези експерименти, четири линии, различаващи се по резистентност към антракноза и Lanr1/AnMan алелен състав, бяха избрани за диференциално профилиране на защитната генна експресия, използвайки два допълващи се подхода: високопроизводително РНК секвениране и PCR количествено определяне в реално време.
Скринингът на набор от NLL зародишна плазма (N = 215) с маркери Lanr1 (Anseq3 и Anseq4) и AnMan (Anseq4) и AnMan (AnManM1) показа, че само една линия (95726, близо до Salamanca-b) усилва алела „резистентност“ за всички маркери, докато „Наличието на „чувствителни“ алели“ установи съотношението на всички марки ers в 158 (~73,5%) реда.Тринадесет линии произвеждат два „устойчиви“ алела на маркера Lanr1, а 8 линии произвеждат „устойчиви“ алели на Lanr1.маркер.Алелът „резистентност“ на маркера AnMan (допълнителна таблица S1).Две линии са хетерозиготни за маркера Anseq3 и една хетерозиготна за маркера AnManM1.42 линии (19, 5%) носят противоположни фази на алелите Anseq3 и Anseq4, което показва висока честота на рекомбинация между тези два локуса.Антракнозните фенотипове при контролирани условия (допълнителна таблица S2) разкриват променливост в устойчивостта на тестваните генотипове, което се отразява в тежестта на антракнозата.Разликите в средните резултати варират от 1,8 (умерено устойчиви) до 6,9 (чувствителни), а разликите в теглото на растенията варират от 0,62 (чувствителни) до 4,45 g (устойчиви). Имаше значителна корелация между стойностите, наблюдавани в две репликации на експеримента (0,51 за оценки на тежестта на заболяването, P = 0,00017 и 0,61 за теглото на растенията, P <0,0001), както и между тези два параметъра (- 0,59 и - 0,77, P <0,0001). Имаше значителна корелация между стойностите, наблюдавани в две репликации на експеримента (0,51 за резултатите от тежестта на заболяването, P = 0,00017 и 0,61 за теглото на растението, P <0,0001), както и между тези два параметъра (− 0,59 и − 0,77, P <0,0001). Установена е достоверна корелация между значенията, наблюдавани в два повторения експеримента (0,51 за балове на тежестта на заболяването, P = 0,00017 и 0,61 за масата на растенията, P < 0,0001), както и между тези два параметра (-0,59 и -0,77, R < 0,0001) 0,0001). Установена е значителна корелация между стойностите, наблюдавани при две повторения на експеримента (0,51 за оценки за тежест на заболяването, P = 0,00017 и 0,61 за тегло на растението, P < 0,0001), както и между тези два параметъра (- 0,59 и -0,77, P < 0,0001) 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0,51，P = 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间 (- 0,59 和-0,77，P < 0,0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为 分为 0,5 1 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0,59 和– 0,59 和– 0,59和 – 0,59 和 - 0,77, P < 0,0001). Наблюдава се значима корелация между значенията, наблюдавани в две повторения (оценка на тежестта на заболяването 0,51, P = 0,00017 и масата на растенията 0,61, P <0,0001), и между тези два параметра (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. Имаше значителна корелация между стойностите, наблюдавани в дубликат (скор на тежестта на заболяването 0,51, P = 0,00017 и тегло на растението 0,61, P <0,0001) и между тези два параметъра (-0,59 и -0,0001) 0,77, P<0,0001. ).Типичните симптоми, наблюдавани при податливи растения, включват прегъване и усукване на стъблото, наподобяващо структура на „овчарски лък“, последвано от овални лезии с оранжеви/розови спорозоити (допълнителна фигура 1).Австралийските образци, носещи гените Lanr1 (83A:476 и Tanjil) и AnMan (Mandelup), са умерено устойчиви, 0,0331 и 0,0036).Някои линии, които също носят „устойчиви“ алели Lanr1 и/или AnMan, показват симптоми на заболяването.
Интересното е, че няколко NLL линии, на които липсва какъвто и да е „устойчив“ маркерен алел, разкриха високо ниво на резистентност към антракноза (сравнимо или по-високо от това за генотипове Lanr1 или AnMan), като Boregine (P стойност <0,0001 за двата параметъра), Bojar (P стойност <0,0001 за резултат и 0,001 за тегло на растението) и популация B-549/79b (P стойност <0. 0001 за резултат и незначителен за тегло). Интересното е, че няколко NLL линии, на които липсва какъвто и да е „устойчив“ маркерен алел, разкриха високо ниво на резистентност към антракноза (сравнимо или по-високо от това за генотипове Lanr1 или AnMan), като Boregine (P стойност <0,0001 за двата параметъра), Bojar (P стойност <0,0001 за резултат и 0,001 за тегло на растението) и популация B-549/79b (P стойност <0. 0001 за резултат и незначителен за тегло). Интересно е, че няколко линии NLL, лишени от какъвто и да било «резистентен» маркерен алел, показаха високо ниво на устойчивост към антракноза (съставно или по-високо, отколкото за генотипове Lanr1 или AnMan), такива като Boregine (значение P <0,0001 за всички параметри), Bojar (значение P < 0,0001 за оценки и 0,001 за маса растения) и популация B-549/ 79b (значение P <0,0001 за оценка и незначимо за маса). Интересно е, че няколко NLL линии, на които липсва какъвто и да е „устойчив“ маркерен алел, показаха високо ниво на резистентност към антракноза (сравнимо или по-високо от това за генотипове Lanr1 или AnMan), като Boregine (P стойност <0,0001 за двата параметъра), Bojar (P стойност <0,0001 за оценка и 0,001 за тегло на растение) и популация B-549/79b (P стойност <0. 0001 за оценка и не е значимо за тегло).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1 或AnM an 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0,0001，植物重量为0 .001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）。 Интересно е, че някои NLL системи, които нямат никакви „антигенни“ маркери, показват висока хоризонтална резистентност (еквивалентна на Lanr1 или AnMan гени или по-висока), като Boregine (и двата параметъра P <0,0001), Bojar (P стойност <0,0001, тегло на растението 0,001) и щам B-549/79b (P стойност <0,0001, тегло не е значимо). Интересно е, че някои линии на NLL, лишени от каквито и да било маркери на алеите на «резистентност», показаха висока степен на устойчивост на антракноза (сравними или по-високи, отколкото в генотипове Lanr1 или AnMan), като Boregine (значение P за всички параметри <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, маса на растенията 0,001) и популация B-549/79b (оценка ка P-значение <0,0001, маса незначителна). Интересното е, че някои NLL линии, на които липсват никакви маркерни алели за „резистентност“, показват високи нива на резистентност към антракноза (сравними или по-високи от генотипове Lanr1 или AnMan), като Boregine (P-стойност за двата параметъра <0,0001), Bojar (P-стойност <0,0001, тегло на растението 0,001) и популация B-549/79b (P-стойност <0,0 001, теглото не е значимо).Това явление предполага възможността за нов генетичен източник на резистентност, обяснявайки наблюдаваната липса на корелация между маркерните генотипове и фенотиповете на заболяването (P стойности от ~0,42 до ~0,98).По този начин тестът на Колмогоров-Смирнов показа, че данните за резистентност към антракноза са приблизително нормално разпределени за резултати (P-стойности 0,25 и 0,11) и растителна маса (P-стойности 0,47 и 0,55), което предполага, че предполагам, че са включени повече алели от Lanr1 и AnMan.
Въз основа на резултатите от скрининга за резистентност към антракноза, 4 линии бяха избрани за анализ на транскриптоми: 83A:476, Boregine, Mandelup и популация 22660. Тези линии бяха повторно тествани за резистентност към антракс в експерименти с инокулация чрез РНК секвениране, при условие че са същите като в предишния тест.Стойностите на резултата бяха както следва: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) и популация 22660 (6,11 ± 1,29).
Протоколът Illumina NovaSeq 6000 постигна средно 40,5 двойки Mread на проба (29,7 до 54,4 Mread) (допълнителна таблица S3).Резултатите за подравняване в референтната последователност варират от 75,5% до 88,6%.Средната корелация на данните за броя на четенията между експерименталните варианти между биологичните реплики варира от 0,812 до 0,997 (средно 0,959). От 35 170 анализирани гена, 2917 не показват експресия, а останалите 4785 гена са експресирани на незначително ниво (базова средна стойност < 5). От 35 170 анализирани гена, 2917 не показват експресия, а останалите 4785 гена са експресирани на незначително ниво (базова средна стойност < 5). От 35 170 проанализирани гена 2917 не са проявили експресия, а останалите 4785 гена са били експресирани на незначително ниво (базово средно <5). От 35 170 анализирани гена, 2917 не показват експресия, а останалите 4785 гена са експресирани на незначително ниво (базова средна стойност <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达＾,其他他4785 个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5).35,170 От 35 170 проанализирани гена 2917 не са били експресирани, а останалите 4785 гена са имали незначителна експресия (базовото средно значение <5). От 35 170 анализирани гена, 2917 не са били експресирани, а останалите 4785 гена са имали незначителна експресия (базова средна стойност <5).По този начин броят на гените, считани за експресирани (базова средна стойност ≥ 5) по време на експеримента е 27 468 (78,1%) (допълнителна таблица S4).
От първата времева точка, всички NLL линии реагираха на инокулацията на C. lupini (щам Col-08) чрез препрограмиране на транскриптома (Таблица 1), въпреки това бяха наблюдавани значителни разлики между линиите.По този начин, линията на резистентност 83A:476 (носеща гена Lanr1) показва значително препрограмиране на транскриптома в първата времева точка (6 hpi) с 31-69-кратно увеличение на броя на изолираните нагоре и надолу гени в сравнение с други времеви точки в тази времева точка.В допълнение, този пик беше краткотраен, тъй като експресията само на няколко гена остана значително променена във втората времева точка (12 hpi).Интересното е, че Boregine, който също показа високо ниво на резистентност в теста за присаждане, не е претърпял такова масивно транскрипционно препрограмиране по време на експеримента.Въпреки това, броят на диференциално експресираните гени (DEG) е еднакъв за Boregine и 83A:476 при 12 HPI.Както Mandelup, така и популация 22660 показаха DEG пикове в последната времева точка (48 l/s), което показва относително забавяне на защитните реакции.
Тъй като 83A:476 претърпя масово препрограмиране на транскриптом в отговор на C. lupini при 6 HPI в сравнение с всички други линии, ~91% от DEG, наблюдавани в този момент, бяха специфични за родословието (фиг. 1).Въпреки това, имаше известно припокриване в ранните отговори между линиите на изследване, тъй като 68,5%, 50,9% и 52,6% DEG съответно в Boregine, Mandelup и популация 22660 се припокриваха с тези, открити в 83A:476 в определени моменти от време.Въпреки това, тези DEG представляват само малка част (0,97–1,70%) от всички DEG, открити в момента с помощта на 83A:476.В допълнение, 11 DEG от всички линии бяха кохерентни по това време (допълнителни таблици S4-S6), включително общи компоненти на защитните реакции на растенията: липиден трансферен протеин (TanjilG_32225), ендоглюкан-1,3-β-глюкозиден ензим (TanjilG_23384), два индуцируеми от стрес протеина като SAM22 (TanjilG_31528 и TanjilG_3 1531), основен латексов протеин (TanjilG_32352) и два богати на глицин протеини на структурни клетъчни стени (TanjilG_19701 и TanjilG_19702).Имаше също относително голямо припокриване в транскриптомните отговори между 83A:476 и Boregine при 24 HPI (общо 16-38% DEG) и между Mandelup и популация 22660 при 48 HPI (общо 14-20% DEG).
Диаграма на Venn, показваща броя на диференциално експресираните гени (DEG) в линии на теснолистна лупина (NLL), инокулирани с Colletotrichum lupini (щам Col-08, получен от полета с лупина във Wierzhenice, Полша, 1999 г.).Анализираните NLL линии бяха: 83A:476 (резистентни, носещи алел Lanr1), Boregine (устойчиви, неизвестен генетичен произход), Mandelup (умерено резистентни, носещи алел AnMan) и популация 22660 (много чувствителни).Абревиатурата hpi означава часове след ваксинацията.Нулевите стойности са премахнати, за да се опрости графиката.
Наборът от свръхекспресирани гени при 6 hpi беше анализиран за наличието на канонични R генни домени (допълнителна таблица S7).Това проучване разкрива индуциране на транскриптоми на класически гени за устойчивост на болести с NBS-LRR домейни само при 83A:476.Този набор се състоеше от един TIR-NBS-LRR ген (tanjilg_05042), пет CC-NBS-LRR гена (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 и tanjilg_16162) и четири NBS-LR, Tanjilg_16162) и четири NBS-LRRE (tanjilg_16162), както и четири NBS-Lrr (tanjilg_16162) и четири NBS-LRR (TANJILG_16162).Всички тези гени имат канонични домейни, подредени в запазени последователности.В допълнение към гените на домейна NBS-LRR, няколко RLL кинази бяха активирани при 6 hpi, а именно една в Boregine (TanjilG_19877), две в Mandelup (TanjilG_07141 и TanjilG_19877) и в популация 22660 (TanjilG_09014 и TanjilG_10361) и две в 83A 27:47 6.
Гени със значително променена експресия в отговор на инокулация с C. lupini (щам Col-08) бяха подложени на анализ на обогатяване на генна онтология (GO) (допълнителна таблица S8). Най-често срещаният термин за биологичен процес е „GO:0006952 защитна реакция“, който се появява в 6 от 16 (време × линия) комбинации с висока значимост (P стойност <0,001) (фиг. 2). Най-често срещаният термин за биологичен процес е „GO:0006952 защитна реакция“, който се появява в 6 от 16 (време × линия) комбинации с висока значимост (P стойност <0,001) (фиг. 2). Най-често чрезмерно представеният термин на биологичния процес е «GO: 0006952 защитен отговор», който се появява в 6 от 16 (време × линия) комбинация с висока значимост (значение P <0,001) (рис. 2). Най-често свръхпредставеният термин за биологичен процес беше „GO: 0006952 защитна реакция“, който се появи в 6 от 16 (време × родословие) комбинации с висока значимост (P стойност <0.001) (Фиг. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”,，它出现在16 个（时间×线）组合中的6个中，具有高显着性（P 值< 0,001）(图2）). Най-представителният термин за биологичен процес е „GO:0006952 защитна реакция“, който се появява в 6 от 16 (时间×线) комбинации, с висока значимост (P стойност <0,001) (图2) . Най-често чрезмерно представеният термин на биологичния процес е «GO: 0006952 Отбранителен отговор», който се появява в 6 от 16 комбинации (време × линия) с висока значимост (значение P <0,001) (рис. 2). Най-често срещаният термин за биологичен процес е „GO:0006952 Отбранителен отговор“, който се появява в 6 от 16 комбинации (време × линия) с висока значимост (P стойност <0,001) (фиг. 2).Този термин е бил свръхпредставен в две времеви точки в 83A: 476 и Boregine (6 и 24 hpi) и в една времева точка в Mandelup и население 22660 (12 и 6 hpi, съответно).Това е очакван резултат, подчертаващ противогъбичния отговор на резистентните линии.В допълнение, 83A:476 реагира на C. lupini чрез бързо индуциране на гени, свързани с окислителния взрив, представен от термина „GO:0055114 редокс процес“, показващ специфична защитна реакция, докато Boregine разкрива специфични защитни реакции, свързани с термина „GO“.:0006950 Реакция на стрес”.Популация 22660 активира реакцията на хоризонтална резистентност, включваща вторични метаболити, подчертавайки прекомерния брой термини „GO: 0016104 Процес на биосинтеза на тритерпени“ и „GO: 0006722 Процес на метаболизъм на тритерпени“ (и двата термина принадлежат към един и същ набор от гени), като се вземат предвид резултатите от анализа на обогатяване на термина GO, стабилността на реакцията на Mandelup е между Boregine и населението 22660. В допълнение, ранна реакция 83A:476 (6 hpi) и забавена реакция Mandelup и население 22660 включват термина GO:0015979 „фотосинтеза“ и други свързани биологични процеси.
Термините на генната онтология на биопроцеса, избрани в анотацията на диференциално експресирани гени по време на транскриптомни отговори на теснолистна лупина (NLL), инокулирана с антраксна лупина (щам Col-08, получен от полета с лупина във Wierzhenice, Полша, през 1999 г.), са силно преувеличени.Анализираните NLL линии бяха: 83A:476 (резистентни, носещи хомозиготния алел Lanr1), Boregine (резистентни, неизвестен генетичен произход), Mandelup (умерено резистентни, носещи хомозиготния алел AnMan) и популация 22660 (податливи).
Тъй като това проучване имаше за цел да идентифицира гени, които допринасят за резистентност към антракноза, гените, присвоени на термините GO „GO: 0006952 Защитни реакции“ и „GO: 0055114 Редокс процеси“ бяха анализирани с прекъсвания, тъй като базовата линия означава ≥ 30 с поне една линия.× точка във времето, комбинираща статистически значими стойности на log2 (кратна промяна).Броят на гените, отговарящи на тези критерии, е 65 за GO: 0006952 и 524 за GO: 0055114.
83A:476 разкрива два DEG пика, анотирани с термина GO:0006952, първият при 6 гена на инч (64 гена, регулиране нагоре и надолу) и вторият при 24 гена на инч (15 гена, само регулиране нагоре).Boregine също показа, че GO:0006952 достигна своя връх в същата времева точка, но с по-малко DEG (11 и 8) и преференциално активиране.Mandeloop показа два пика на GO:0006952 при 12 и 48 HPI, като и двата носят 12 гена (първият с активиращи гени, а вторият само с потискащи гени), докато популацията 22660 при 6 HPI (13 гена) има по-голямо преобладаване на пика на нарастване.регулиране.Трябва да се отбележи, че 96,4% от GO:0006952 DEG в тези пикове имат един и същ тип отговор (нагоре или надолу), което показва значително припокриване в защитните реакции въпреки разликите в броя на включените гени.Най-голямата група от последователности, свързани с термина GO: 0006952, кодира свързания със стреса глад Message Protein 22 (подобен на SAM22), който принадлежи към клас 10 протеин, свързан с патогенезата (PR-10) и основния протеинов латекс.подобен (MLP-подобен) протеин) протеин (фиг. 3).Двете групи се различават по естеството на изразяване и посоката на отговора.Гените, кодиращи SAM22-подобни протеини, показват последователна и значителна индукция в ранните времеви точки (6 или 12 hpi) и като цяло не реагират в края на експеримента (48 hpi), докато MLP-подобните протеини показват координация при 6 hpi.hpi.83A:476 и Mandelup при 48 к.с./инч, почти всички други точки от данни не реагираха.В допълнение, разликите в експресионните профили на SAM22-подобни протеинови гени следват наблюдаваната вариабилност в резистентността към антракноза, тъй като по-устойчивите линии имат повече времеви точки, значително индуциращи тези гени, отколкото по-чувствителните гени.Друг LlR18A/B-подобен PR-10 ген показва много подобен модел на експресия на SAM22-подобния протеинов ген.
Бяха идентифицирани основните компоненти на термина на биологичния процес „GO:0006952 Defense Response“ и моделите на експресия на кандидат-гените на алелите Lanr1 и AnMan.Скалата Log2 представлява log2 стойности (кратна промяна) между инокулирани (Colletotrichum lupini, щам Col-08, получен от полета с лупина, Wizhenica, Полша, 1999) и контролни (фалшиво инокулирани) растения в една и съща времева точка.Бяха анализирани следните линии на теснолистна лупина: 83A:476 (устойчиви, носещи хомозиготния алел Lanr1), Boregine (устойчиви, неизвестен генетичен произход), Mandelup (умерено устойчиви, носещи хомозиготния алел AnMan) и популация 22660 (податливи).
В допълнение, профилите на експресия на RNA-seq кандидат гени Lanr1 (TanjilG_05042) и AnMan (TanjilG_12861) бяха оценени (Фиг. 3).Генът TanjilG_05042 показа значителен отговор (активиране) при 83A:476 само в първата времева точка (6 hpi), докато TanjilG_12861 беше значим в Mandeloop само в две времеви точки: 6 hpi (регулиране надолу) и 24 hpi (6 hpi).С.).регулируем)).
Най-свръхекспресираните гени в термина GO:0055114 „редокс процес“ са гени, кодиращи протеини на цитохром Р450 и пероксидаза (фиг. 4).За проби, изолирани от 83A:476 при 6 HPI, максимални или минимални стойности на log2 (кратна промяна) (за 86,6% от гените) обикновено се наблюдават между инокулираните и контролните растения, което подчертава силния отговор на този генотип към инокулирания пол.83A: 476 показва най-значимия GO: 0055114 DEG при 6 hpi (503 гена), докато останалите линии при 48 hpi (Boregine, 31 гена; Mandelup, 85 гена; и популация 22660, 78 гена)).В повечето гени от фамилията GO:0055114 са наблюдавани два вида отговори на ваксинация (активиране и инхибиране).Интересното е, че до 97,6% от DEG, идентифицирани за термина GO: 0055114 в Mandelupe при 48 к.с. Тези наблюдения предполагат, че въпреки значително по-малкия мащаб (т.е. броят на мутиралите редокс гени, 85 срещу 503), моделът на забавени транскриптомни отговори на mandeloup към антракноза е подобен на ранния отговор на 83A:4 76.В Boregine и население 22660 това сближаване е по-ниско при съответно 51,6% и 75,6%.
Бяха разкрити моделите на изразяване на основните компоненти на термина на биологичния процес „GO:0055114 Редокс процес“.Скалата Log2 представлява log2 стойности (кратна промяна) между инокулирани (Colletotrichum lupini, щам Col-08, получен от полета с лупина, Wizhenica, Полша, 1999) и контролни (фалшиво инокулирани) растения в една и съща времева точка.Бяха анализирани следните линии на теснолистна лупина: 83A:476 (устойчиви, носещи хомозиготния алел Lanr1), Boregine (устойчиви, неизвестен генетичен произход), Mandelup (умерено устойчиви, носещи хомозиготния алел AnMan) и популация 22660 (податливи).
83A:476 Транскриптомните отговори на инокулация с C. lupini (щам Col-08) също включват координирано заглушаване на гени, приписвани на термина GO:0015979 "фотосинтеза" и други свързани биологични процеси (ФИГ. 5).Този набор GO:0015979 DEG съдържа 105 гена, които са значително потиснати при 6 hpi при 83A:476.В тази подгрупа, 37 гена също бяха регулирани надолу в Mandelup при 48 HPI и 35 по едно и също време в популацията 22660, включително 19 DEG, общи за двата генотипа.Никакви DEG, свързани с термина GO: 0015979, не са значително активирани в която и да е комбинация (ред x време).
Бяха разкрити моделите на изразяване на основните компоненти на термина на биологичния процес „GO:0015979 Фотосинтеза“.Скалата Log2 представлява log2 стойности (кратна промяна) между инокулирани (Colletotrichum lupini, щам Col-08, получен от полета с лупина, Wizhenica, Полша, 1999) и контролни (фалшиво инокулирани) растения в една и съща времева точка.Бяха анализирани следните линии на теснолистна лупина: 83A:476 (устойчиви, носещи хомозиготния алел Lanr1), Boregine (устойчиви, неизвестен генетичен произход), Mandelup (умерено устойчиви, носещи хомозиготния алел AnMan) и популация 22660 (податливи).
Въз основа на резултатите от диференциален експресионен анализ и вероятно участващ в защитните реакции срещу патогенни гъбички, този набор от седем гена беше избран за количествено определяне на профилите на експресия чрез PCR в реално време (допълнителна таблица S9).
Предполагаемият протеинов ген TanjilG_10657 беше значително индуциран във всички изследвани линии и времеви точки в сравнение с контролни (мимически) растения (допълнителни таблици S10, S11).В допълнение, профилът на експресия на TanjilG_10657 показва нарастваща тенденция в хода на експеримента за всички линии.Популация 22660 показва най-високата чувствителност на TanjilG_10657 към инокулация със 114-кратно активиране и най-високото относително ниво на експресия (4.4 ± 0.4) при 24 HPI (фиг. 6а).PR10 LlR18A протеиновият ген TanjilG_27015 също показа активиране във всички линии и времеви точки, със статистическа значимост в повечето точки от данни (фиг. 6b).Подобно на TanjilG_10657, най-високото относително ниво на експресия на TanjilG_27015 се наблюдава в 22660 инокулирана популация при 24 HPI (19,5 ± 2,4).Генът на киселинната ендохитиназа TanjilG_04706 беше значително повишен във всички линии и във всички времеви точки, с изключение на Boregine 6 hpi (фиг. 6с).Той беше силно индуциран в първата времева точка (6 HPI) при 83A:476 (с 10,5 пъти) и умерено повишен в други линии (с 6,6-7,5 пъти).По време на експеримента, експресията на TanjilG_04706 остава на подобни нива в 83A:476 и Boregine, докато в Mandelup и популация 22660 тя значително се увеличава, достигайки относително високи стойности (5,9 ± 1,5 и 6,2 ± 1,5, съответно).Подобният на ендоглюкан-1,3-β-глюкозидаза ген TanjilG_23384 показва високо активиране в първите две времеви точки (6 и 12 hpi) във всички линии, с изключение на популация 22660 (фиг. 6d).Най-високите относителни нива на експресия на TanjilG_23384 се наблюдават във втората времева точка (12 hpi) в Mandelup (2.7 ± 0.3) и 83A:476 (1.5 ± 0.1).При 24 HPI, експресията на TanjilG_23384 е относително ниска във всички изследвани линии (от 0.04 ± 0.009 до 0.44 ± 0.12).
Експресионни профили на избрани гени (ag), разкрити чрез количествена PCR.Числата 6, 12 и 24 представляват часовете след ваксинацията.Гените LanDExH7 и LanTUB6 бяха използвани за нормализиране, а LanTUB6 беше използван за междусерийно калибриране.Лентите за грешки представляват стандартното отклонение въз основа на три биологични повторения, всяко от които е средната стойност на три технически повторения. Статистическата значимост на разликите в нивата на експресия между инокулираните (Colletotrichum lupini, щам Col-08, получен през 1999 г. от полето с лупина във Wierzenica, Полша) и контролните (фалшиво инокулирани) растения са отбелязани над точките от данни (*P стойност <0,05, **P стойност ≤ 0,01, ***P стойност ≤ 0,001). Статистическата значимост на разликите в нивата на експресия между инокулираните (Colletotrichum lupini, щам Col-08, получен през 1999 г. от полето с лупина във Wierzenica, Полша) и контролните (фалшиво инокулирани) растения са отбелязани над точките от данни (*P стойност <0,05, **P стойност ≤ 0,01, ***P стойност ≤ 0,001). Статистическата значимост на разликата в нивата на експресия между инокулираните (Colletotrichum lupini, щам Col-08, получен през 1999 г. с полето на люпина във Верженице, Полша) и контролните (ложно инокулирани) растения, отбелязани над точките на данните (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0 ,001). Статистически значими разлики в нивата на експресия между инокулирани (Colletotrichum lupini, щам Col-08, получен през 1999 г. от поле с лупина във Wierzhenice, Полша) и контролни (фалшиво инокулирани) растения са отбелязани над точките от данни (*P стойност <0,05, **P-стойност ≤ 0,01, ***P-стойност ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， цвят-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物 之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Статистически значими различия в нивата на експресия между инокулирани (Colletotrichum lupini, щамм Col-08, получен от полей люпина във Верженице, Полша, през 1999 г.) и контролни (ложно инокулирани) растения, отбелязани над точките на данни (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Статистически значими разлики в нивата на експресия между инокулирани (Colletotrichum lupini, щам Col-08, получен от полета с лупина във Verzhenice, Полша, през 1999 г.) и контролни (фалшиво инокулирани) растения са отбелязани над точките от данни (*P стойност <0,05, **P-стойност ≤ 0,01, ***P-стойност ≤ 0,001).Анализираните NLL линии бяха: 83A:476 (резистентни, носещи хомозиготния алел Lanr1), Mandelup (умерено резистентни, носещи хомозиготния алел AnMan), Boregine (резистентни, неизвестен генетичен произход) и популация 22660 (податливи).
Кандидат-генът TanjilG_05042 в локуса на Lanr1 показва значително различен модел на експресия от профилите, получени от изследвания на RNA-seq (фиг. 6e).Значително активиране на този ген се наблюдава при Mandelup и популацията 22660 (до 39,7 и 11,7 пъти, съответно), което води до относително високи нива на експресия (до 1,4 ± 0,14 и 7,2 ± 1,3, съответно).83A:476 също така разкрива известно повишено регулиране на гена TanjilG_05042 (до 3,8 пъти), но постигнатите относителни нива на експресия (0,044 ± 0,002) са повече от 30 пъти по-ниски от тези, наблюдавани при Mandelup и популацията 22660.анализирани чрез qPCR показват значителни разлики в нивата на експресия между генотипове в фалшиво ваксинирани (контролни) варианти, достигайки 58-кратна разлика между популациите 22660 и 83A:476, както и между популациите 22660 и 22660. Постигната е двукратна разлика между Boregine и Mandalup.
Кандидат-генът в локуса на AnMan, TanjilG_12861, се активира в отговор на ваксинация в 83A:476 и Mandelup, беше неутрален в популацията 22660 и беше регулиран надолу в Boregine (фиг. 6f).Относителната експресия на гена TanjilG_12861 е най-висока в инокулирания 83А: 476 (0.14±0.01).17.4 kDa клас I протеинов ген на топлинен шок TanjilG_05080 HSP17.4 показва по-ниски относителни нива на експресия във всички изследвани щамове и времеви точки (фиг. 6g).Най-високата стойност се наблюдава при 24 HPI в популацията от 22660 (0,14 ± 0,02, осемкратно увеличение в отговор на ваксинация).
Сравнението на профилите на генна експресия (фиг. 7) разкрива висока корелация между TanjilG_10657 и четири други гена: TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80) и TanjilG_04706 (r = 0.79).Такива резултати могат да показват съвместно регулиране на тези гени по време на защитните реакции.Гените TanjilG_12861 и TanjilG_23384 показват различни профили на експресия с по-ниски стойности на коефициента на корелация на Pearson (съответно от 0,08 до 0,43 и -0,19 до 0,28) в сравнение с други гени.
Корелациите между профилите на генната експресия бяха открити с помощта на количествена PCR.Бяха анализирани следните линии на теснолистна лупина: 83A:476 (устойчива, носеща хомозиготния алел Lanr1), Mandelup (умерено устойчива, носеща хомозиготния алел AnMan), Boregine (устойчива, неизвестен генетичен произход) и популация 22660 (чувствителна).Бяха изчислени три времеви точки (6, 12 и 24 часа след инокулацията), включително инокулирани (Colletotrichum lupini, щам Col-08, получен от полета с лупина във Wierzhenice, Полша, през 1999 г.) и контролни (фалшиво инокулирани) растения.Скалата показва стойността на корелационния коефициент на Pearson.
Въз основа на данни, получени при 6 конски сили на инч, WGCNA беше извършена на 9981 DEG, идентифицирани чрез сравняване на инокулирани и контролни растения, за да се съсредоточи върху ранните защитни реакции (допълнителна таблица S12).Бяха открити двадесет и два генни модула (клъстери) с корелирани (положителни или отрицателни) експресионни профили между генотипове и експериментални варианти. Средно нивата на генна експресия намаляват в ред 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популация 22660 (и в двата варианта обаче тази тенденция е по-силна при контролните растения). Средно нивата на генна експресия намаляват в ред 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популация 22660 (и в двата варианта обаче тази тенденция е по-силна при контролните растения). В средните нива на експресия гените се понижиха в ред 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популация 22660 (в двата варианта, обаче, тази тенденция беше по-силна в контролните растения). Средно нивата на генна експресия намаляват в реда 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популация 22660 (и в двата варианта обаче тази тенденция е по-силна при контролните растения).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Популация 22660 的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强Ｚ）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> население 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种 在在 植物 中 更）...... В средните нива на експресия гените се понижиха в ред 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популация 22660 (също в двата варианта тази тенденция беше по-силна в контролните растения). Средно нивата на генна експресия намаляват в серията 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популация 22660 (обаче и в двата варианта тази тенденция е по-силна при контролните растения).Ваксинацията е довела до повишаване на регулацията на генната експресия, особено в модули 18, 19, 14, 6 и 1 (в низходящ ред на ефект), отрицателна регулация (напр. модули 9 и 20) или с неутрални ефекти (напр. модули 11, 22, 8 и 13).Анализът на обогатяване на термина GO (допълнителна таблица S13) разкри „GO: 0006952 Защитни реакции“ за инокулирания модул (18) с максимално активиране, включително гени, анализирани чрез qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 и TanjilG_27015), както и много инокулирани най-потиснати модули за фотосинтеза (9).Концентраторът на модул 18 (фиг. 8) беше идентифициран като ген TanjilG_26536, кодиращ PR-10-подобен LlR18B протеин, а концентраторът на модул 9 беше идентифициран като ген TanjilG_28955, кодиращ протеина PsbQ на фотосистемата II.Кандидат ген за резистентност към антракноза Lanr1, TanjilG_05042, беше открит в модул 22 (Фиг. 9) и е свързан с термините „GO: 0044260 Клетъчни макромолекулни метаболитни процеси“ и „GO: 0006355 Транскрипционна регулация, шаблониране на ДНК“, носещи центъра TanjilG_01212.генът кодира транскрипционния фактор A-4a при топлинен стрес (HSFA4a).
Претеглен мрежов анализ на генна ко-експресия на модули със свръхпредставени термини на биологичния процес „GO: 0006952 Защитни реакции“.Лигирането беше опростено, за да се подчертаят четирите гена, анализирани чрез qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 и TanjilG_27015).
Претеглен мрежов анализ на генна ко-експресия на модул със свръхпредставен термин на биологичен процес „GO: 0006355: Транскрипционна регулация, шаблониране на ДНК“ и носещ кандидат ген за устойчивост на антракноза Lanr1 TanjilG_05042.Лигирането беше опростено за изолиране на гена TanjilG_05042 и централния ген TanjilG_01212.
Скринингът за устойчивост на антракноза, събран в Австралия, показа, че повечето от ранно освободените сортове са податливи;Kalya, Coromup и Mandelup са описани като умерено устойчиви, докато Wonga, Tanjil и 83A:476 са описани като силно устойчиви26,27,31.имаше същия алел за резистентност, обозначен като Lanr1, а Coromup и Mandelup имаха различен алел, обозначен като AnMan10, 26, 39, докато Kalya предаде различен алел., Lanr2.Скринингът за резистентност към антракноза в Германия доведе до идентифицирането на резистентна линия Bo7212 с кандидат алел, различен от Lanr1, обозначен като LanrBo36.
Нашето проучване разкри много ниска честота (около 6%) на алела Lanr1 в тестваната зародишна плазма.Това наблюдение е в съответствие с резултатите от скрининга на източноевропейската зародишна плазма с помощта на маркерите Anseq3 и Anseq4, които показват, че алелът Lanr1 присъства само в две беларуски линии.Това предполага, че алелът Lanr1 все още не се използва широко от местните програми за развъждане, за разлика от Австралия, където е един от ключовите алели за размножаване с помощта на маркери.Това може да се дължи на по-ниското ниво на резистентност, осигурено от алела Lanr1 в европейски полеви условия в сравнение с австралийския доклад.В допълнение, проучванията на антракнозата в райони с високи валежи в Австралия показват, че реакциите на резистентност, медиирани от алела Lanr1, може да не са ефективни при метеорологични условия, които благоприятстват растежа и бързото развитие на патогена19,42.Всъщност, в настоящото изследване, някои симптоми на антракноза също са наблюдавани в генотипове, носещи алела Lanr1, което предполага, че резистентността може да изчезне при оптимални условия за развитието на C. lupini.В допълнение, възможни са фалшиво положителни интерпретации на присъствието на маркери Anseq3 и Anseq4, които са приблизително 1 cM от локуса Lanr1 28,30,43.
Нашето проучване показа, че 83A: 476, носещ алел Lanr1, реагира на инокулация с C. lupini с широкомащабно препрограмиране на транскриптом в първата анализирана времева точка (6 hpi), докато в Mandelup, носещ алела AnMan, транскриптомните отговори се наблюдават много по-късно.(от 24 до 48 к.с.).Тези времеви вариации в защитните реакции са свързани с разликите в симптомите на заболяването, подчертавайки значението на ранното разпознаване на патогена за успешен отговор на резистентност.За да заразят растителната тъкан, спорите на антракс трябва да преминат през няколко етапа на развитие на повърхността на гостоприемника, включително покълване, клетъчно делене и образуване на апресориум.Придатъкът е инфекциозна структура, която се прикрепя към повърхността на гостоприемника и улеснява проникването в тъканите на гостоприемника.По този начин спорите на C. gloeosporioides в екстракт от грах показват първото делене на ядрото след 75-90 минути инкубация, образуването на зародишна тръба след 90-120 минути и потискане след 4 часа 45 .Mango C. gloeosporioides показва повече от 40% конидиално покълване след 3 часа инкубация и около 20% образуване на апресори след 4 часа.Свързаният с вирулентността CAP20 ген на C. gloeosporioides показа транскрипционна активност в конидии, образуващи епифит, след 3,5 часа инкубация в повърхностен восък от авокадо с високи концентрации на CAP20 протеин след 4 часа и 46 минути.По подобен начин, активността на гените за биосинтеза на меланин в C. trifolii се индуцира по време на 2-часова инкубация, последвана от образуване на апресориум след 1 час.Изследвания на листни тъкани показват, че ягоди, инокулирани с C. acutatum, имат първо потискане при 8 hpi, докато домати, инокулирани с C. coccodes, имат първо потискане при 4 hpi48,49.до голяма степен в съответствие с времевата скала на Colletotrichum spp.инфекциозен процес.Бързите защитни реакции към 83A:476 предполагат участие на гени за резистентност на растенията и ефекторно-задействан имунитет (ETI) в тази линия, докато забавените отговори на Mandelup подкрепят хипотезата 50 за имунитет, предизвикан от микро-молекулен модел (MTI). Ранни отговори на 83A: 476 и Mandelup.Частичното припокриване между регулираните нагоре или надолу гени при забавен отговор също подкрепя тази концепция, тъй като ETI често се счита за ускорен и засилен MTI отговор, който кулминира в програмирана клетъчна смърт на мястото на инфекцията, известна като анафилактичен шок 51,52.
Повечето от гените, приписвани на свръхпредставения термин Gene Ontology GO:0006952 „Отбранителен отговор“, са 11-те хомолози на протеина 22 на съобщението за гладуване, предизвикано от стрес (подобно на SAM22) и седемте основни подобни на латекс протеини (MLP).-подобни протеини 31, 34, 43 и 423 показват сходство на последователностите.SAM22-подобните гени показват значително активиране, което продължава по-дълго, показвайки повишени нива на резистентност към антракноза (83A:476 и Boregine).Въпреки това, MLP-подобни гени бяха регулирани надолу само в линии, носещи кандидат резистентния алел (83A:476/Lanr1 при 6 hpi и Mandelup/AnMan при 24 hpi).Трябва да се отбележи, че всички идентифицирани SAM22-подобни хомолози произхождат от генен клъстер, обхващащ приблизително 105 kb, докато MLP-подобните гени произхождат от отделни региони на генома.Координирано активиране на такива SAM22-подобни гени също беше открито в нашето предишно проучване на резистентност на NLL към инокулация с Diaporthetoxica, което предполага, че те участват в хоризонталните компоненти на защитния отговор.Това заключение също се подкрепя от доклади за положителен отговор на SAM22-подобни гени към нараняване или лечение със салицилова киселина, гъбични индуктори или водороден пероксид.
Доказано е, че MLP-подобните гени реагират на различни абиотични и биотични стресове, включително бактериални, вирусни и патогенни гъбични инфекции в много растителни видове55.Посоките на отговор на определени взаимодействия между растенията и патогените варират от силно нарастване (т.е. по време на заразяване на памука с Verticillium dahliae) до значително намаляване (т.е. след заразяване на ябълково дърво с Alternaria spp.)56,57.Значително понижаване на MLP-подобния 423 ген е наблюдавано по време на защитата на авокадото срещу инфекция с F. niger и по време на инфекция на ябълковото дърво Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola и Alternaria alternata са патотипове на ябълката58,59.В допълнение, ябълковите кали, свръхекспресиращи MLP-подобния 423 ген, имат по-ниска експресия на гени, свързани с резистентност, и са по-податливи на гъбична инфекция59.След Fusarium oxysporum f, MLP-подобният 423 ген също беше потиснат в резистентна зародишна плазма на обикновен фасул.cn.Инфекция на боб 60.
Други членове на семейството PR-10, идентифицирани в нашето изследване на RNA-seq, бяха гените LlR18A и LlR18B в отговор на регулиране нагоре, както и регулиран нагоре (1 ген) или понижен (3 гена) ген за липидния трансферен протеин DIR1..В допълнение, WGCNA подчертава гена LlR18B като център в този модул, който е силно податлив на ваксинация и носи няколко гена за защитна реакция.Гените LlR18A и LlR18B бяха индуцирани в листа от жълта лупина в отговор на патогенни бактерии, както и в стъбла на NLL след инокулация с D. toxica, докато оризовият хомолог на тези гени, RSOsPR10, беше бързо индуциран от гъбична инфекция, предполагаемо включена в сигналния път на жасмоновата киселина53,61,62. Генът DIR1 кодира неспецифични li pid транспортни протеини, които са необходими за появата на системна придобита резистентност (SAR).С развитието на защитни реакции протеинът DIR1 се транспортира от фокуса на инфекцията през флоема, за да индуцира SAR в отдалечени органи.Интересното е, че генът TanjilG_02313 DIR1 е значително индуциран в първата времева точка в линии 84A:476 и популация 22660, но устойчивостта към антракноза се развива успешно само в линия 84A:476.Това може да показва някаква субфункционализация на гена DIR1 в NLL, тъй като останалите три хомолози реагират на инокулация само в линията 83A: 476 при 6 hpi и този отговор е насочен надолу.
В нашето изследване най-често срещаните компоненти, съответстващи на биологичния процес, наречен „GO:0055114 Редокс процес“, са протеин на цитохром Р450, пероксидаза, 9S-/13S-липоксигеназа на линолова киселина и оксидаза на 1-аминоциклопропан-1-карбоксилна киселина.В допълнение, нашият WGCNA дефинира хомолога на HSFA4a като модули, носещи хъб, като кандидата за резистентния ген Lanr1 TanjilG_05042.HSFA4a е компонент на редокс-зависимата регулация на ядрената транскрипция в растенията.
Протеините на цитохром P450 са оксидоредуктази, които катализират NADPH и/или O2-зависимите реакции на хидроксилиране в първичния и вторичния метаболизъм, включително метаболизма на ксенобиотици, както и на хормони, мастни киселини, стероли, компоненти на клетъчната стена, биополимери и биосинтезата на защитни съединения 69. В нашето проучване променливостта във функцията на растителния цитохром P450 е намалена от -1 0,6 log2 (кратна промяна) до 5,7 поради голям брой променени хомолози (37) и разлики в моделите на отговор между специфични гени, отразяващи ревизия нагоре..Използването само на RNA-seq данни за изясняване на предполагаемата биологична функция на NLL гените в такова голямо протеиново суперсемейство би било силно спекулативно.Заслужава да се отбележи обаче, че някои гени на цитохром Р450 са свързани с повишена резистентност към патогенни гъбички или бактерии, включително принос към алергични реакции69,70,71.
Пероксидазите от клас III са многофункционални растителни ензими, участващи в широк спектър от метаболитни процеси по време на растежа и развитието на растенията, както и в отговор на екологични натоварвания като соленост, суша, висок интензитет на светлина и атака на патогени72.Пероксидазите участват във взаимодействието на няколко растителни вида с Anthracis, включително Stylosanthes humilis и C. gloeosporioides, Lens culinaris и C. truncatum, Phaseolus vulgaris и C. lindemuthianum, Cucumis sativus и C. lagenarium73,74,75,76.Отговорът е много бърз, понякога дори при 4 HPI, преди гъбата да проникне в растителната тъкан73.Генът на пероксидазата също реагира на D. toxica NLL инокулация.В допълнение към техните типични функции за регулиране на окислителния взрив или елиминиране на оксидативния стрес, пероксидазите могат да попречат на растежа на патогена чрез създаване на физически бариери въз основа на подсилване на клетъчната стена по време на лигнификация, субединица или омрежване на специфични съединения.Тази функция може да се припише in silico на гена TanjilG_03329, кодиращ предполагаема лигнин-образуваща анион пероксидаза, която беше значително повишена в нашето изследване в резистентната линия 83A:476 при 6 HPI, но не и в други щамове и времеви точки, които не реагираха.
9S-/13S-липоксигеназата на линолова киселина е първата стъпка в окислителния път на липидната биосинтеза78.Продуктите от този път имат множество функции в защитата на растенията, включително укрепване на клетъчната стена чрез образуване на калозни и пектинови отлагания и регулиране на оксидативния стрес чрез производството на реактивни кислородни видове79,80,81,82,83.В настоящото изследване, експресията на 9S-/13S-липоксигеназа на линолова киселина е променена във всички щамове, но в чувствителната популация 22660, регулацията преобладава в различни моменти от време, докато в щамове, носещи резистентен Lanr1 и алел AnMan, тя подчертава диверсификацията на оксилипиновия слой в защитните реакции на антракс между тези генотипове.
Хомологът на 1-аминоциклопропан-1-карбоксилатоксидаза (ACO) беше значително повишен (9 гена) или понижен (2 гена), когато беше инокулиран с лупина.С две изключения, всички тези реакции се появяват при 6 к.с.на 83A:476.Ензимната реакция, медиирана от ACO протеини, е ограничаващата скоростта стъпка в производството на етилен и следователно е силно регулирана84.Етиленът е растителен хормон, който играе различни роли в регулирането на развитието на растенията и реакцията им към абиотични и биотични стресови условия.Индукцията на ACO транскрипция и активирането на етиленовия сигнален път участват в повишаване на устойчивостта на ориза към хемибиотрофната гъба oryzae oryzae чрез регулиране на производството на реактивни кислородни видове и фитоалексини.Много подобен процес на инфекция на листата, открит между M. oryzae и C. lupini88,89, на фона на значително повишаване на регулацията на ACO хомолози в линията 83A:476, докладвано в това проучване, измества възможността за придаване на резистентност към NLL антракноза Етилен като сигнализираща централна стъпка в молекулярните пътища.
В настоящото изследване се наблюдава широкомащабно потискане на много гени, свързани с фотосинтезата, при 6 hpi в 83A: 476 и при 48 hpi в Mandeloop и населението 22660.Степента и прогресията на тези промени е пропорционална на нивото.В този експеримент се наблюдава резистентност към антракноза.Напоследък се съобщава за силна и ранна репресия на свързани с фотосинтезата транскрипти в няколко модела на взаимодействия растение-патоген, включително патогенни бактерии и гъбички.Бързането (от 2 HPI при някои взаимодействия) и глобалното потискане на гени, свързани с фотосинтезата в отговор на инфекция, могат да предизвикат имунитет на растенията въз основа на разгръщането на реактивни кислородни видове и тяхното взаимодействие с пътя на салициловата киселина за медииране на алергични реакции 90,94.
В заключение, механизмите за защитна реакция, предложени за най-устойчивата линия (83A:476), включват бързо разпознаване на патогена от R гена (вероятно TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) и медиирано от алергичен отговор салицилова киселина и сигнализиране на етилен, последвано от установяване на SAR на дълги разстояния.действието се поддържа от протеина DIR-1.Трябва да се отбележи, че биотрофният период за инфекция с C. lupini е много кратък (приблизително 2 дни), последван от некротичен растеж95.Преходът между тези етапи може да бъде свързан с некроза и експресия на етилен-индуцируеми протеини, които действат като тригери за реакции на свръхчувствителност в растенията гостоприемници.Следователно времевият прозорец за успешно улавяне на C. lupini на биотрофния етап е много тесен.Препрограмирането на гени, свързани с редокс и фотосинтеза, наблюдавано в 83A: 476 при 6 hpi, е в съответствие с прогресията на гъбичните хифи и предвещава развитието на успешен защитен отговор на биотрофния етап.Транскриптомните отговори на Mandelup и популацията 22660 може да са твърде забавени, за да уловят гъбичките, преди да преминат към некротичен растеж, но Mandelup може да бъде по-ефективен от популацията 22660, тъй като сравнително бързото регулиране на протеина PR-10 насърчава хоризонталната устойчивост.
ETI, задвижван от каноничния R ген, изглежда е често срещан механизъм за резистентност на боба към антракноза.По този начин, в модела на бобово растение Medicago truncatula, резистентността към антракноза се придава от гена RCT1, член на TIR-NBS-LRR97 растителния R генен клас.Този ген също така придава широкоспектърна резистентност към антракноза при люцерната, когато се прехвърли на чувствителни растения.В обикновения фасул (P. vulgaris) досега са идентифицирани повече от две дузини гени за резистентност към антракноза.Някои от тези гени се намират в региони, в които липсват канонични R гени, но много други са разположени в краищата на хромозомите, носещи NBS-LRR генния клъстер, включително TIR-NBS-LRRs99.Изследването SSR за целия геном също потвърди връзката на гена NBS-LRR с резистентността към антракноза в обикновения боб.Каноничният R ген също беше открит в геномната област, носеща основния локус на устойчивост на антракноза в бяла лупина 101.
Нашата работа показва, че незабавна реакция на резистентност, активирана в ранен стадий на инфекция на растението (за предпочитане не по-късно от 12 hpi), ефективно защитава теснолистната лупина от антракноза, причинена от патогенната гъба Collelotrichum lupini.Използвайки високопроизводително секвениране, ние демонстрирахме профили на диференциална експресия на гени за резистентност към антракноза в NLL растения, медиирани от гените за резистентност Lanr1 и AnMan.Успешната защита включва внимателно проектиране на гените за протеини, участващи в редокс, фотосинтезата и патогенезата в рамките на часове след първия контакт на растението с патоген.Подобни защитни реакции, но забавени във времето, са много по-малко ефективни за защита на растенията от болести.Резистентността към антракс, медиирана от гена Lanr1, наподобява типичния бърз отговор на R гена (имунитет, предизвикан от ефектора), докато генът AnMan най-вероятно осигурява хоризонтален отговор (имунитет, предизвикан от молекулярен модел, свързан с микроби), осигурявайки умерено ниво на устойчивост.
215-те NLL линии, използвани за скрининг за маркери за антракноза, се състоят от 74 сорта, 60 линии, получени чрез кръстосване или размножаване, 5 мутанта и 76 диви или оригинални зародишни плазми.Линиите идват от 17 държави, главно от Полша (58), Испания (47), Германия (27), Австралия (26), Русия (19), Беларус (7), Италия (5) и други линии.от 10 държави.Комплектът включва и референтни устойчиви линии: 83A:476, Tanjil, Wonga, носещи алела Lanr1 и Mandelup, носещи алела AnMan.Линиите са получени от Европейската база данни за генетични ресурси на лупина, поддържана от Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Полша (допълнителна таблица S1).
Растенията се отглеждат при контролирани условия (светлинен период 16 часа, температура 25°C през деня и 18°C ​​през нощта).Бяха анализирани две биологични реплики.ДНК се изолира от триседмични листа с помощта на DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия) съгласно протокола.Качеството и концентрацията на изолираната ДНК се оценяват чрез спектрофотометрични методи (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).Маркерът AnManM1, маркиращ гена за резистентност към антракноза AnMan (получен от cv. Mandelup) и маркерите Anseq3 и Anseq4, фланкиращи гена Lanr1 (получен от cv. Tanjil), бяха анализирани 11,26,28.Хомозиготите за резистентния алел се оценяват като „1″, чувствителните – като „0″, а хетерозиготите – като 0,5.
Въз основа на резултатите от скрининга за маркери AnManM1, AnSeq3 и AnSeq4 и наличието на семена за окончателни последващи експерименти, 50 NLL линии бяха избрани за фенотипиране на резистентност към антракноза.Анализът се извършва в два екземпляра в компютърно контролирана оранжерия с 14-часов фотопериод с температурен диапазон от 22°C през деня и 19°C през нощта.Семената се надраскват (отрязва се обвивката на семето от противоположната страна на зародиша с остро острие) преди сеитба, за да се предотврати латентността на семената поради твърде твърдата обвивка на семената и за да се осигури равномерно покълване.Растенията се отглеждат в саксии (11 × 11 × 21 cm) със стерилна почва (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Варшава, Полша).Инокулацията беше извършена с щам Colletotrichum lupini Col-08, отгледан през 1999 г. от стъблата на теснолистни растения от лупина, отгледани в поле във Верженица, Велика Полша (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E).Вземете зона.Изолатите се култивират в SNA среда при 20°С под черна светлина в продължение на 21 дни, за да се индуцира спорулация.Четири седмици след засяването, когато растенията са достигнали фаза 4-6 листа, инокулирането се извършва чрез пръскане със суспензия от конидии в концентрация 0,5 х 106 конидии на ml.След инокулацията растенията се държат на тъмно в продължение на 24 часа при влажност около 98% и температура 25°C, за да се улесни покълването на конидиите и процеса на инфекция.След това растенията се отглеждат при 14-часов фотопериод при 22°C през деня/19°C през нощта и 70% влажност.Оценката на заболяването беше направена 22 дни след инокулацията и варираше от 0 (имунен) до 9 (много чувствителен) в зависимост от наличието или отсъствието на некротични лезии по стъблата и листата.Освен това, след оценяване, се измерва теглото на растенията.Връзките между маркерните генотипове и фенотиповете на болестта бяха изчислени като точкови корелации от две последователности (липса на хетерозиготни маркери в набора от линии за анализ на фенотипа на устойчивост на антракноза).