Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка на CSS. За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer). Междувременно, за да осигурим непрекъсната поддръжка, ще рендираме сайта без стилове и JavaScript.
Съществува необходимост от надеждна in vitro система, която може точно да възпроизведе физиологичната среда на сърцето за тестване на лекарства. Ограничената наличност на системи за култури от човешка сърдечна тъкан доведе до неточни интерпретации на ефектите на сърдечните лекарства. Тук разработихме модел на култура от сърдечна тъкан (CTCM), който електромеханично стимулира сърдечните срези и претърпява физиологично разтягане по време на систоличната и диастоличната фаза на сърдечния цикъл. След 12 дни култивиране, този подход частично подобри жизнеспособността на срезите от сърцето, но не запази напълно тяхната структурна цялост. Следователно, след скрининг на малки молекули, установихме, че добавянето на 100 nM трийодтиронин (T3) и 1 μM дексаметазон (Dex) към нашата среда поддържа микроструктурата на срезите в продължение на 12 дни. В комбинация с третиране с T3/Dex, CTCM системата поддържа транскрипционни профили, жизнеспособност, метаболитна активност и структурна цялост на същото ниво като прясната сърдечна тъкан в продължение на 12 дни. Освен това, прекомерното разтягане на сърдечната тъкан в културата индуцира хипертрофична сърдечна сигнализация, което предоставя доказателства за способността на CTCM да имитира хипертрофични състояния, предизвикани от разтягане на сърцето. В заключение, CTCM може да моделира физиологията и патофизиологията на сърцето в култура за дълги периоди от време, което позволява надежден скрининг на лекарства.
Преди клиничните изследвания са необходими надеждни in vitro системи, които могат точно да възпроизведат физиологичната среда на човешкото сърце. Такива системи трябва да имитират променено механично разтягане, сърдечна честота и електрофизиологични свойства. Животинските модели често се използват като скринингова платформа за сърдечна физиология с ограничена надеждност при отразяване на ефектите на лекарствата в човешкото сърце1,2. В крайна сметка, Идеалният експериментален модел на сърдечна тъканна култура (CTCM) е модел, който е високочувствителен и специфичен за различни терапевтични и фармакологични интервенции, точно възпроизвеждайки физиологията и патофизиологията на човешкото сърце3. Липсата на такава система ограничава откриването на нови лечения за сърдечна недостатъчност4,5 и е довела до кардиотоксичност на лекарствата като основна причина за излизане от пазара6.
През последното десетилетие осем лекарства, които не са свързани със сърдечно-съдовите заболявания, бяха изтеглени от клинична употреба, тъй като причиняват удължаване на QT интервала, водещо до камерни аритмии и внезапна смърт7. Поради това има нарастваща нужда от надеждни предклинични скринингови стратегии за оценка на сърдечно-съдовата ефикасност и токсичност. Неотдавнашното използване на индуцирани от хора плурипотентни кардиомиоцити, получени от стволови клетки (hiPS-CM), при скрининг на лекарства и тестване за токсичност предоставя частично решение на този проблем. Незрелият характер на hiPS-CM и липсата на многоклетъчна сложност на сърдечната тъкан обаче са основни ограничения на този метод. Последните проучвания показват, че това ограничение може да бъде частично преодоляно чрез използване на ранни hiPS-CM за образуване на хидрогелове на сърдечна тъкан малко след началото на спонтанните контракции и постепенно увеличаване на електрическата стимулация с течение на времето. Тези hiPS-CM микротъкани обаче нямат зрелите електрофизиологични и контрактилни свойства на възрастния миокард. Освен това, човешката сърдечна тъкан има по-сложна структура, състояща се от хетерогенна смес от различни клетъчни типове, включително ендотелни клетки, неврони и стромални фибробласти, свързани помежду си чрез специфични набори от извънклетъчни матрични протеини. Тази хетерогенност на некардиомиоцитни популации11,12,13 в сърцето на възрастни бозайници е основна пречка за моделиране на сърдечна тъкан с помощта на отделни клетъчни типове. Тези основни ограничения подчертават важността на разработването на методи за култивиране на интактна миокардна тъкан при физиологични и патологични условия.
Култивирани тънки (300 µm) срези от човешкото сърце се оказаха обещаващ модел на непокътнат човешки миокард. Този метод осигурява достъп до пълна 3D многоклетъчна система, подобна на човешката сърдечна тъкан. Въпреки това, до 2019 г. използването на култивирани сърдечни срези беше ограничено от краткото (24 часа) оцеляване на културата. Това се дължи на редица фактори, включително липсата на физико-механично разтягане, интерфейса въздух-течност и използването на прости среди, които не поддържат нуждите на сърдечната тъкан. През 2019 г. няколко изследователски групи демонстрираха, че включването на механични фактори в системите за сърдечни тъканни култури може да удължи живота на културата, да подобри сърдечната експресия и да имитира сърдечна патология. Две елегантни проучвания 17 и 18 показват, че едноосовото механично натоварване има положителен ефект върху сърдечния фенотип по време на култивиране. Тези проучвания обаче не използваха динамичното триизмерно физико-механично натоварване на сърдечния цикъл, тъй като сърдечните срези бяха натоварени или с изометрични сили на опън 17, или с линейно ауксотонно натоварване 18. Тези методи за разтягане на тъкани доведоха до потискане на много сърдечни гени или до свръхекспресия на гени, свързани с анормални реакции на разтягане. Забележително е, че Питулис и др.19 разработиха динамична вана за култивиране на сърдечни срезове за реконструкция на сърдечния цикъл, използвайки обратна връзка от силови преобразуватели и задвижвания на напрежението. Въпреки че тази система позволява по-точно in vitro моделиране на сърдечния цикъл, сложността и ниската производителност на метода ограничават приложението ѝ. Нашата лаборатория наскоро разработи опростена система за култивиране, използваща електрическа стимулация и оптимизирана среда, за да поддържа жизнеспособността на срези от свинска и човешка сърдечна тъкан до 6 дни20,21.
В настоящия ръкопис описваме модел на сърдечна тъканна култура (CTCM), използващ срези от свинското сърце, който включва хуморални сигнали за рекапитулация на триизмерна сърдечна физиология и патофизиологично раздуване по време на сърдечния цикъл. Този CTCM може да повиши точността на предклиничното прогнозиране на лекарства до ниво, никога досега постигано, като осигури рентабилна сърдечна система със среден капацитет, която имитира физиологията/патофизиологията на сърцето на бозайниците за предклинично тестване на лекарства.
Хемодинамичните механични сигнали играят критична роля за поддържането на функцията на кардиомиоцитите in vitro 22,23,24. В настоящия ръкопис разработихме CTCM (Фигура 1a), който може да имитира сърдечната среда на възрастни чрез индуциране както на електрическа, така и на механична стимулация при физиологични честоти (1,2 Hz, 72 удара в минута). За да се избегне прекомерно разтягане на тъканта по време на диастола, беше използвано 3D печатащо устройство за увеличаване на размера на тъканта с 25% (Фиг. 1b). Електрическото стимулиране, индуцирано от системата C-PACE, беше настроено да започне 100 ms преди систола, използвайки система за събиране на данни, за да се възпроизведе напълно сърдечният цикъл. Системата за тъканни култури използва програмируем пневматичен задвижващ механизъм (LB Engineering, Германия) за циклично разширяване на гъвкава силиконова мембрана, за да предизвика разширяване на сърдечните срезове в горната камера. Системата беше свързана към външна въздушна линия чрез датчик за налягане, което направи възможно точното регулиране на налягането (± 1 mmHg) и времето (± 1 ms) (Фиг. 1c).
a Прикрепете тъканната среза към 7-милиметровия опорен пръстен, показан в синьо, вътре в културалната камера на устройството. Културалната камера е отделена от въздушната камера с тънка гъвкава силиконова мембрана. Поставете уплътнение между всяка камера, за да предотвратите течове. Капакът на устройството съдържа графитни електроди, които осигуряват електрическа стимулация. b Схематично представяне на голямото тъканно устройство, водещия пръстен и опорния пръстен. Тъканните срези (кафяви) се поставят върху устройството с по-голям размер, като водещият пръстен е поставен в жлеба на външния ръб на устройството. Използвайки водача, внимателно поставете опорния пръстен, покрит с тъканно акрилно лепило, върху среза от сърдечна тъкан. c Графика, показваща времето на електрическата стимулация като функция на налягането във въздушната камера, контролирано от програмируем пневматичен задвижващ механизъм (PPD). Устройство за събиране на данни е използвано за синхронизиране на електрическата стимулация с помощта на сензори за налягане. Когато налягането в културалната камера достигне зададения праг, към C-PACE-EM се изпраща импулсен сигнал, за да се задейства електрическа стимулация. d Изображение на четири CTCM, поставени на рафт на инкубатор. Четири устройства са свързани към един PPD чрез пневматична верига, а сензори за налягане са поставени в хемостатичния клапан, за да се следи налягането в пневматичната верига. Всяко устройство съдържа шест тъканни среза.
Използвайки един пневматичен задвижващ механизъм, успяхме да контролираме 4 CTCM устройства, всяко от които можеше да побере 6 тъканни среза (фиг. 1d). При CTCM, налягането на въздуха във въздушната камера се преобразува в синхронно налягане във флуидната камера и индуцира физиологично разширяване на сърдечния срез (фиг. 2a и допълнителен филм 1). Оценката на разтягането на тъканта при 80 mm Hg. Art. показа разтягане на тъканните срези с 25% (фиг. 2b). Доказано е, че този процент разтягане съответства на физиологична дължина на саркомера от 2,2–2,3 µm за нормална контрактилност на сърдечния срез17,19,25. Движението на тъканта беше оценено с помощта на персонализирани настройки на камерата (допълнителна фигура 1). Амплитудата и скоростта на движение на тъканта (фиг. 2c, d) съответстваха на разтягането по време на сърдечния цикъл и времето по време на систола и диастола (фиг. 2b). Разтягането и скоростта на сърдечната тъкан по време на свиване и релаксация останаха постоянни в продължение на 12 дни в култура (фиг. 2f). За да оценим ефекта на електрическата стимулация върху контрактилността по време на култивиране, разработихме метод за определяне на активна деформация, използвайки алгоритъм за засенчване (Допълнителна фигура 2a,b) и успяхме да различим деформации със и без електрическа стимулация. Същият участък от сърцето (фиг. 2f). В подвижната област на разреза (R6-9), напрежението по време на електрическата стимулация беше с 20% по-високо, отколкото при липса на електрическа стимулация, което показва приноса на електрическата стимулация към контрактилната функция.
Представителни следи от измерванията на налягането във въздушната камера, налягането във флуидната камера и движението на тъканите потвърждават, че налягането в камерата променя налягането във флуидната камера, причинявайки съответно движение на тъканния срез. b Представителни следи от процентното разтягане (синьо) на тъканни срези, съответстващи на процентното разтягане (оранжево). c Измереното движение на сърдечния срез е в съответствие с измерената скорост на движение. (d) Представителни траектории на цикличното движение (синя линия) и скоростта (оранжева пунктирана линия) в срез от сърцето. e Количествено определяне на времето на цикъла (n = 19 среза на група, от различни прасета), времето на свиване (n = 19 среза на група), времето на релаксация (n = 19 среза на група, от различни прасета), движението на тъканите (n = 25 среза)/група от различни прасета), пиковата систолична скорост (n = 24(D0), 25(D12) среза/група от различни прасета) и пиковата скорост на релаксация (n = 24(D0), 25(D12) среза/група от различни прасета). Двустранният t-тест на Стюдънт не показва значителна разлика в нито един от параметрите. f Представителни следи от анализ на напрежението на тъканни срези с (червено) и без (синьо) електрическа стимулация, десет регионални области на тъканни срези от един и същ срез. Долните панели показват количественото определяне на процентната разлика в напрежението в тъканни срези със и без електрическа стимулация в десет области от различни срези. (n = 8 среза/група от различни прасета, извършен е двустранен t-тест на Стюдънт; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 среза/група от различни прасета, извършен е двустранен t-тест на Стюдънт; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 среза/група от различни свине, проведен двустранен t-критерий Стюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 секции/група от различни прасета, двустранен t-тест на Стюдънт; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）. （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）. (n = 8 среза/група, от различни свине, двустранен критерий Стюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 секции/група, от различни прасета, двустранен t-тест на Стюдънт; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Лентите за грешки представляват средната стойност ± стандартно отклонение.
В нашата предишна статична биомиметична система за култивиране на сърдечни срезове [20, 21], ние поддържахме жизнеспособността, функцията и структурната цялост на сърдечните срезове в продължение на 6 дни чрез прилагане на електрическа стимулация и оптимизиране на състава на средата. След 10 дни обаче тези цифри спаднаха рязко. Ще се позовем на срези, култивирани в нашата предишна статична биомиметична система за култивиране 20, 21 контролни условия (Ctrl) и ще използваме нашата предварително оптимизирана среда като MC условия и култура при едновременна механична и електрическа стимулация (CTCM), наречена . Първо, установихме, че механичната стимулация без електрическа стимулация е недостатъчна за поддържане на жизнеспособността на тъканите в продължение на 6 дни (Допълнителна фигура 3a,b). Интересното е, че с въвеждането на физио-механична и електрическа стимулация с помощта на STCM, жизнеспособността на 12-дневните сърдечни срези остана същата като в пресните сърдечни срези при MS условия, но не и при Ctrl условия, както е показано чрез MTT анализ (фиг. 1). 3a). Това предполага, че механичната стимулация и симулацията на сърдечния цикъл могат да поддържат тъканните срези жизнеспособни два пъти по-дълго, отколкото е съобщено в нашата предишна статична система за култивиране. Въпреки това, оценката на структурната цялост на тъканните срези чрез имуномаркиране на сърдечен тропонин Т и конексин 43 показа, че експресията на конексин 43 е значително по-висока в тъканите на сърдечния мускул (МС) на 12-ия ден, отколкото в контролите на същия ден. Равномерната експресия на конексин 43 и образуването на Z-дискове обаче не бяха напълно запазени (фиг. 3б). Използваме рамка с изкуствен интелект (ИИ), за да определим количествено цялостта на тъканната структура26, базиран на изображения процес на дълбоко обучение, базиран на оцветяване с тропонин-Т и конексин43, за автоматично определяне на количествено структурната цялост и флуоресценцията на сърдечните срези по отношение на силата на локализация. Този метод използва конволюционна невронна мрежа (CNN) и рамка за дълбоко обучение, за да определи надеждно количествено структурната цялост на сърдечната тъкан по автоматизиран и безпристрастен начин, както е описано в референцията26. МС тъканта показа подобрено структурно сходство с ден 0 в сравнение със статичните контролни срези. Освен това, трихромното оцветяване на Масон разкри значително по-нисък процент фиброза при условия на МС в сравнение с контролните условия на 12-ия ден от култивирането (фиг. 3в). Въпреки че CTCM увеличи жизнеспособността на срезите от сърдечна тъкан на 12-ия ден до ниво, подобно на това на прясна сърдечна тъкан, той не подобри значително структурната цялост на сърдечните срези.
Стълбовидната диаграма показва количествено определяне на MTT жизнеспособността на пресни сърдечни резени (D0) или култура от сърдечни резени в продължение на 12 дни, или в статична култура (D12 Ctrl), или в CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) резена/група от различни прасета, извършен е еднопосочен ANOVA тест; ####p < 0,0001 в сравнение с D0 и **p < 0,01 в сравнение с D12 Ctrl). Стълбовидната диаграма показва количествено определяне на MTT жизнеспособността на пресни сърдечни резени (D0) или култура от сърдечни резени в продължение на 12 дни, или в статична култура (D12 Ctrl), или в CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) резена/група от различни прасета, извършен е еднопосочен ANOVA тест; ####p < 0,0001 в сравнение с D0 и **p < 0,01 в сравнение с D12 Ctrl).Хистограмата показва количественото определяне на жизнеспособността на пресни сърдечни срези от MTT (D0) или култура от сърдечни срези в продължение на 12 дни в статична култура (D12 контрола) или CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 контрола).) ), 12 (D12 MC) срези/група от различни прасета, като е извършен еднофакторен ANOVA тест;####p < 0,0001 в сравнение с D0 и **p < 0,01 в сравнение с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 в сравнение с D0 и **p < 0,01 в сравнение с D12 (контрол). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向 ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl相比，**p。)Хистограма, показваща количественото определяне на жизнеспособността на MTT в пресни сърдечни срези (D0) или сърдечни срези, култивирани в продължение на 12 дни в статична култура (D12 контрола) или CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 контрола)), 12 (D12 MC) срези/група от различни прасета, еднофакторен ANOVA тест;####p < 0,0001 в сравнение с D0, **p < 0,01 в сравнение с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 в сравнение с D0, **p < 0,01 в сравнение с D12 (контрол).B тропонин-T (зелен), коннексин 43 (червен) и DAPI (син) в прясно изолирани сърдечни участъци (D0) или сърдечни участъци, култивирани при статични условия (Ctrl) или CTCM условия (MC) за 12 дни) на представителни имунофлуоресцентни изображения (Blank Scale = 100 µm). Количествено определяне на структурната цялост на сърдечната тъкан чрез изкуствен интелект (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) среза/група, всеки от различни прасета, извършен е еднофакторен ANOVA тест; ####p < 0,0001 в сравнение с D0 и ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl). Количествено определяне на структурната цялост на сърдечната тъкан чрез изкуствен интелект (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) среза/група от различни прасета, извършен е еднофакторен ANOVA тест; ####p < 0,0001 в сравнение с D0 и ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl). Количествена оценка на структурната целостност на сърдечната тъкан с изкуствен интелект (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезове/групи от различни свине, се провежда еднофакторен тест ANOVA; ####p < 0,0001 в сравнение с D0 и ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl). Количествено определяне на структурната цялост на сърдечната тъкан чрез изкуствен интелект (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срези/групи от различни прасета, извършен еднофакторен ANOVA тест; ####p < 0,0001 спрямо D0 и ****p < 0,0001 спрямо D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезове/група всеки от различно прасе, еднопосочен ANOVA тест;####p < 0,0001 与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезове/група всеки от различни прасета, еднопосочен ANOVA тест;####p < 0,0001与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусствен интелект за количествена оценка на структурната целостност на сърдечната тъкан (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезове/група на всяка от различни свине, едностранен тест ANOVA; ####p <0,0001 срещу D0 За сравняване ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl). Изкуствен интелект за количествено определяне на структурната цялост на сърдечната тъкан (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) секции/група от различни прасета, еднофакторен ANOVA тест; ####p<0.0001 срещу .D0 За сравнение ****p < 0.0001 в сравнение с D12 Ctrl). c Представителни изображения (вляво) и количествено определяне (вдясно) за сърдечни резени, оцветени с трихромно багрило на Masson (Scale bare = 500 µm) (n = 10 резена/група, всеки от различно прасе, извършен е еднофакторен ANOVA тест; ####p < 0,0001 в сравнение с D0 и ***p < 0,001 в сравнение с D12 Ctrl). c Представителни изображения (вляво) и количествено определяне (вдясно) за сърдечни резени, оцветени с трихромно багрило на Masson (Scale bare = 500 µm) (n = 10 резена/група, всеки от различни прасета, извършен е еднофакторен ANOVA тест; #### p < 0,0001 в сравнение с D0 и ***p < 0,001 в сравнение с D12 Ctrl). c Представителни изображения (слева) и количествена оценка (справа) на сърдечен срез, украсен с трихромен красителят на Масона (масштаб без покритие = 500 мкм) (n = 10 среза/група от различни свине, изпълнява се едностранен тест ANOVA; #### p < 0,0001 в сравнение с D0 и ***p < 0,001 в сравнение с D12 Ctrl). c Представителни изображения (вляво) и количествено определяне (вдясно) на сърдечни срези, оцветени с трихромно багрило на Masson (непокрита скала = 500 µm) (n = 10 среза/група от различни прасета, извършен еднофакторен ANOVA тест; #### p < 0,0001 в сравнение с D0 и ***p < 0,001 в сравнение с D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl相比）。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Представителни изображения (слева) и количествен анализ (справа) на сърдечен срез, оцветен с трихромен красител на Масона (чиста скала = 500 мкм) (n = 10 среза/група, всяка от друга свиня, протестирано с помощта на еднофакторния дисперсионен анализ ;### #p < 0,0001 в сравнение с D0, ***p < 0,001 в сравнение с D12 Ctrl). c Представителни изображения (вляво) и количествено определяне (вдясно) на сърдечни срези, оцветени с трихромно багрило на Masson (празна проба = 500 µm) (n = 10 среза/група, всеки от различно прасе, тестван чрез еднофакторен дисперсионен анализ;### # p < 0,0001 в сравнение с D0, ***p < 0,001 в сравнение с D12 Ctrl).Лентите за грешки представляват средната стойност ± стандартно отклонение.
Предположихме, че чрез добавяне на малки молекули към културалната среда, целостта на кардиомиоцитите може да се подобри и развитието на фиброза да се намали по време на CTCM културата. Поради това, ние проведохме скрининг за малки молекули, използвайки нашите статични контролни култури20,21 поради малкия брой объркващи фактори. Дексаметазон (Dex), трийодотиронин (T3) и SB431542 (SB) бяха избрани за този скрининг. Тези малки молекули са били използвани преди това в hiPSC-CM култури за индуциране на съзряване на кардиомиоцити чрез увеличаване на дължината на саркомерите, Т-тубулите и скоростта на проводимост. Освен това, както Dex (глюкокортикоид), така и SB са известни с това, че потискат възпалението29,30. Следователно, тествахме дали включването на една или комбинация от тези малки молекули би подобрило структурната цялост на сърдечните срези. За първоначален скрининг, дозата на всяко съединение беше избрана въз основа на концентрациите, обичайно използвани в модели на клетъчни култури (1 μM Dex27, 100 nM T327 и 2.5 μM SB31). След 12 дни култивиране, комбинацията от T3 и Dex доведе до оптимална структурна цялост на кардиомиоцитите и минимално фиброзно ремоделиране (допълнителни фигури 4 и 5). Освен това, използването на двойни или удвоени от тези концентрации на T3 и Dex доведе до вредни ефекти в сравнение с нормалните концентрации (допълнителна фигура 6a,b).
След първоначалния скрининг, извършихме директно сравнение на 4 условия на култивиране (Фигура 4а): Ctrl: сърдечни срези, култивирани в предварително описаната от нас статична култура, използвайки нашата оптимизирана среда; 20.21 TD: T3 и Ctrl s, добавени Dex в сряда; MC: сърдечни срези, култивирани в CTCM, използвайки предварително оптимизираната ни среда; и MT: CTCM с добавени T3 и Dex към средата. След 12 дни култивиране, жизнеспособността на MS и MT тъканите остана същата, както в пресните тъкани, оценени чрез MTT анализ (Фиг. 4b). Интересното е, че добавянето на T3 и Dex към трансуелкови култури (TD) не доведе до значително подобрение на жизнеспособността в сравнение с Ctrl условията, което показва важна роля на механичната стимулация за поддържане на жизнеспособността на сърдечните срези.
Диаграма на експерименталния дизайн, изобразяваща четирите условия на култивиране, използвани за оценка на ефектите от механичната стимулация и добавянето на T3/Dex върху среда в продължение на 12 дни. b Стълбовидната диаграма показва количествено определяне на жизнеспособността 12 дни след култивирането при всичките 4 условия на култивиране (Ctrl, TD, MC и MT) в сравнение с пресни сърдечни резени (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) резена/група от различни прасета, извършен е еднофакторен ANOVA тест; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 в сравнение с D0 и **p < 0,01 в сравнение с D12 Ctrl). b Стълбовидната диаграма показва количествено определяне на жизнеспособността 12 дни след култивирането при всичките 4 условия на култивиране (Ctrl, TD, MC и MT) в сравнение с пресни сърдечни резени (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) резена/група от различни прасета, извършен е еднофакторен ANOVA тест; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 в сравнение с D0 и **p < 0,01 в сравнение с D12 ctrl). b Гистограммата показва количествена оценка на работоспособността през 12 дни след култивиране при всички 4 условия на култивиране (контрол, TD, MC и MT) в сравнение със свежи сърдечни срезове (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезове/група от различни свине, произведени едностранен тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 в сравнение с D0 и **p < 0,01 в сравнение с D12 Ctrl). b Стълбовидната диаграма показва количественото определяне на жизнеспособността на 12-ия ден след култивирането при всичките 4 условия на култивиране (контрола, TD, MC и MT) в сравнение със свежи сърдечни срези (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срези/група от различни прасета, еднофакторен ANOVA тест; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 спрямо D0 и **p < 0,01 спрямо D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD和D12 MT), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001，###p < 0,001 与D0相比，**p < 0,01 与D12控制）.б 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показваща всички 4 условия на култивиране (контрол, TD, MC и MT) в сравнение със свежи сърдечни срезове (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от различни свине 12 (D12 MC) срезове/група, едностранен тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 в сравнение с D0, **p <0,01 в сравнение с контрол D12). b Хистограма, показваща всичките 4 условия на култивиране (контрола, TD, MC и MT) в сравнение със свежи сърдечни срези (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от различни прасета 12 (D12 MC) срези/група, еднофакторен ANOVA тест; ####p<0.0001, ###p<0.001 спрямо D0, **p<0.01 спрямо контрола D12). c Стълбовидната диаграма показва количественото определяне на глюкозния поток 12 дни след култивирането при всичките 4 условия на култивиране (Ctrl, TD, MC и MT) в сравнение с пресни сърдечни резени (D0) (n = 6 резена/група от различни прасета, извършен е еднофакторен ANOVA тест; ###p < 0,001, в сравнение с D0 и ***p < 0,001 в сравнение с D12 Ctrl). c Стълбовидната диаграма показва количественото определяне на глюкозния поток 12 дни след култивирането при всичките 4 условия на култивиране (Ctrl, TD, MC и MT) в сравнение с пресни сърдечни резени (D0) (n = 6 резена/група от различни прасета, извършен е еднофакторен ANOVA тест; ###p < 0,001, в сравнение с D0 и ***p < 0,001 в сравнение с D12 Ctrl). c Гистограммата показва количествена оценка на потока глюкоза през 12 дни след култивиране при всички 4 условия на култивиране (контрол, TD, MC и MT) в сравнение със свежи сърдечни срезове (D0) (n = 6 среза/група от различни свине, едностранно се изпълнява тест ANOVA; ###p < 0,001 в сравнение с D0 и ***p < 0,001 в сравнение с D12 Ctrl). c Хистограмата показва количествено определяне на глюкозния поток 12 дни след култивирането при всичките 4 условия на култивиране (контрола, TD, MC и MT) в сравнение със свежи сърдечни срези (D0) (n = 6 срези/група от различни прасета, извършен еднофакторен ANOVA тест; ###p < 0,001 в сравнение с D0 и ***p < 0,001 в сравнение с D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ，培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показваща количествена оценка на потока глюкоза през 12 дни след култивиране за всички 4 условия на култивиране (контрол, TD, MC и MT) в сравнение със свежи сърдечни срези (D0) (n = 6 среза/група, от различни свине, едностранни Бяха проведени ANOVA тестове; ###p < 0,001 в сравнение с D0, ***p < 0,001 в сравнение с D12 (контрол). c Хистограма, показваща количествено определяне на глюкозния поток на 12 дни след култивирането за всичките 4 условия на култивиране (контрола, TD, MC и MT) в сравнение със свежи сърдечни срези (D0) (n = 6 срези/група, от различни прасета, едностранно). Където бяха проведени ANOVA тестове, ###p < 0,001 в сравнение с D0, ***p < 0,001 в сравнение с D12 (контрола).d Графики за щамов анализ на пресни (сини), 12-ден MC (зелени) и 12-ден MT (червени) тъкани в десет регионални точки на тъканно срязване (n = 4 среза/група, еднофакторен ANOVA тест; няма значителна разлика между групите). e Вулканична диаграма, показваща диференциално експресирани гени в пресни сърдечни срези (D0) в сравнение със сърдечни срези, култивирани при статични условия (Ctrl) или при MT условия (MT) в продължение на 10-12 дни. f Топлинна карта на саркомерни гени за сърдечни срези, култивирани при всяко от условията на култивиране. Грешките представляват средната стойност ± стандартно отклонение.
Метаболитната зависимост от преминаването от окисление на мастни киселини към гликолиза е отличителен белег на дедиференциацията на кардиомиоцитите. Незрелите кардиомиоцити използват предимно глюкоза за производство на АТФ и имат хипопластични митохондрии с малко кристи5,32. Анализите на усвояването на глюкоза показват, че при условия на MC и MT, усвояването на глюкоза е подобно на това в тъканите на ден 0 (Фигура 4в). Ctrl пробите обаче показват значително увеличение на усвояването на глюкоза в сравнение с прясна тъкан. Това показва, че комбинацията от CTCM и T3/Dex подобрява жизнеспособността на тъканите и запазва метаболитния фенотип на 12-дневните култивирани срези от сърце. Освен това, анализът на щама показа, че нивата на щам остават същите, както в прясна сърдечна тъкан в продължение на 12 дни при условия на MT и MS (Фиг. 4d).
За да анализираме цялостното въздействие на CTCM и T3/Dex върху глобалния транскрипционен пейзаж на тъканта на сърдечните срезове, извършихме RNAseq върху сърдечни срезове от всичките четири различни условия на култивиране (Допълнителни данни 1). Интересното е, че MT срезовете показаха високо транскрипционно сходство с прясна сърдечна тъкан, като само 16 диференциално експресирани от 13 642 гена. Въпреки това, както показахме по-рано, Ctrl срезовете показаха 1229 диференциално експресирани гена след 10–12 дни в култура (Фиг. 4e). Тези данни бяха потвърдени чрез qRT-PCR на сърдечни и фибробластни гени (Допълнителна Фиг. 7a-c). Интересното е, че Ctrl срезовете показаха понижена регулация на сърдечните и клетъчните гени и активиране на възпалителни генни програми. Тези данни показват, че дедиференциацията, която обикновено се случва след дългосрочно култивиране, е напълно отслабена при MT условия (Допълнителна Фиг. 8a,b). Внимателното проучване на саркомерните гени показа, че само при MT условия гените, кодиращи саркомера (фиг. 4f) и йонния канал (допълнителна фиг. 9), се запазват, предпазвайки ги от потискане при Ctrl, TD и MC условия. Тези данни показват, че с комбинация от механична и хуморална стимулация (T3/Dex), транскриптомът на сърдечния срез може да остане подобен на пресните сърдечни срезове след 12 дни в култура.
Тези транскрипционни находки се подкрепят от факта, че структурната цялост на кардиомиоцитите в сърдечните срези се запазва най-добре при условия на MT в продължение на 12 дни, както е показано от интактния и локализиран конексин 43 (фиг. 5а). Освен това, фиброзата в сърдечните срези при условия на MT е значително намалена в сравнение с Ctrl и подобна на пресните срези на сърцето (фиг. 5б). Тези данни показват, че комбинацията от механична стимулация и T3/Dex третиране ефективно запазва сърдечната структура в сърдечните срези в култура.
Представителни имунофлуоресцентни изображения на тропонин-Т (зелено), конексин 43 (червено) и DAPI (синьо) в прясно изолирани сърдечни срези (D0) или култивирани в продължение на 12 дни при всичките четири условия на култивиране на сърдечните срези (скала = 100 µm). Количествено определяне на структурната цялост на сърдечната тъкан с помощта на изкуствен интелект (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) среза/група от различни прасета, извършен е еднофакторен ANOVA тест; ####p < 0,0001 в сравнение с D0 и *p < 0,05, или ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl). Количествено определяне на структурната цялост на сърдечната тъкан чрез изкуствен интелект (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) среза/група от различни прасета, извършен е еднофакторен ANOVA тест; #### p < 0,0001 в сравнение с D0 и *p < 0,05, или ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl). Количествена оценка на структурната целостност на тъканите на сърцето с помощта на изкуствения интелект (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезове/група от различни свине, проведен еднофакторен тест ANOVA; #### p < 0,0001 в сравнение с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl). Количествено определяне на структурната цялост на сърдечната тъкан с помощта на изкуствен интелект (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) среза/група от различни прасета, извършен еднофакторен ANOVA тест; #### p < 0,0001 в сравнение с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组）人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。Количествено определяне на структурната цялост на сърдечната тъкан с помощта на изкуствен интелект при различни прасета (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срези/група) с еднофакторен ANOVA тест;#### p < 0,0001 в сравнение с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 в сравнение с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 в сравнение с D12 (Ctrl). b Представителни изображения и количествена оценка на сърдечни срезове, украсени с трихромен красител Масона (масова линия = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезове/група от различни свине, изпълнява се едностранен тест ANOVA; ####p < 0,0001 в сравнение с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl). b Представителни изображения и количествено определяне на сърдечни срези, оцветени с трихромно багрило на Masson (скала = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срези/група от различни прасета, извършен еднофакторен ANOVA; ####p < 0,0001 спрямо D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 спрямо D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MC，，来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 mason 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Представителни изображения и количествена оценка на сърдечни срезове, оцветени с трихром Масона (масштабна линия = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезове от различни свине / групи, един способ ANOVA; ####p < 0,0001 в сравнение с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl). b Представителни изображения и количествено определяне на сърдечни срези, оцветени с трихром на Masson (скала = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срези от различни прасета/група, един ANOVA метод; ####p < 0,0001 в сравнение с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl).Лентите за грешки представляват средната стойност ± стандартно отклонение.
Накрая, способността на CTCM да имитира сърдечна хипертрофия беше оценена чрез увеличаване на разтягането на сърдечната тъкан. При CTCM, пиковото налягане във въздушната камера се увеличи от 80 mmHg до 80 mmHg. Art. (нормално разтягане) до 140 mmHg. Art. (Фиг. 6a). Това съответства на 32% увеличение на разтягането (Фиг. 6b), което преди това беше показано като съответния процент разтягане, необходим на сърдечните срези, за да постигнат дължина на саркомера, подобна на наблюдаваната при хипертрофия. Разтягането и скоростта на сърдечната тъкан по време на свиване и релаксация останаха постоянни в продължение на шест дни култивиране (Фиг. 6c). Сърдечната тъкан от MT условия беше подложена на нормално разтягане (MT (Нормално)) или условия на преразтягане (MT (OS)) в продължение на шест дни. Още след четири дни в културата, хипертрофичният биомаркер NT-ProBNP беше значително повишен в средата при MT (OS) условия в сравнение с MT (нормални) условия (Фиг. 7a). Освен това, след шест дни култивиране, размерът на клетките в MT (OS) (фиг. 7b) се е увеличил значително в сравнение със срези от MT сърце (нормално). В допълнение, ядрената транслокация на NFATC4 е била значително повишена в преразтегнати тъкани (фиг. 7c). Тези резултати показват прогресивното развитие на патологично ремоделиране след хипердистензия и подкрепят концепцията, че CTCM устройството може да се използва като платформа за изследване на сигнализацията на индуцираната от разтягане сърдечна хипертрофия.
Представителни следи от измерванията на налягането във въздушната камера, налягането във флуидната камера и движението на тъканите потвърждават, че налягането в камерата променя налягането във флуидната камера, причинявайки съответно движение на тъканния срез. b Представителни криви на процента на разтягане и скоростта на разтягане за нормално разтегнати (оранжеви) и преразтегнати (сини) тъканни срези. c Стълбчата диаграма, показваща времето на цикъла (n = 19 среза на група, от различни прасета), времето на свиване (n = 18-19 среза на група, от различни прасета), времето на релаксация (n = 19 среза на група, от различни прасета)), амплитудата на движение на тъканите (n = 14 среза/група, от различни прасета), пиковата систолична скорост (n = 14 среза/група, от различни прасета) и пиковата скорост на релаксация (n = 14 (D0), 15 (D6) среза/групи) от различни прасета), двустранният t-тест на Стюдънт не показва значителна разлика в нито един параметър, което показва, че тези параметри остават постоянни в продължение на 6 дни култивиране с пренапрежение. Грешките представляват средната стойност ± стандартно отклонение.
Стълбовидна количествена диаграма на концентрацията на NT-ProBNP в хранителна среда от сърдечни срези, култивирани при условия на нормално разтягане на MT (Norm) или свръхразтягане (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm и D4 MTOS) срези/група от различни прасета, извършен е двуфакторен ANOVA; **p < 0,01 в сравнение с нормално разтягане). Стълбовидна количествена диаграма на концентрацията на NT-ProBNP в хранителна среда от сърдечни срези, култивирани при условия на нормално разтягане на MT (Norm) или свръхразтягане (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm и D4 MTOS) срези/група от различни прасета, извършен е двуфакторен ANOVA; **p < 0,01 в сравнение с нормално разтягане).Количествена хистограма на концентрацията на NT-проби в културна среда от сърдечни резени, култивирани при условия на нормален MT разтягане (норма) или свръхрет (OS) (n = 4 (D2 Mtnorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNORM и D4) .MTOS) филийки /група от различни прасета, двуфакторен анализ на вариация се извършва;**p < 0,01 в сравнение с нормалното разтягане). **p < 0,01 в сравнение с нормалното разтягане). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01). Количествено определяне на концентрацията на NT-ProBNP в сърдечни срезове, култивирани при условия на МТ нормално разтягане (Norm) или свръхразтягане (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) от различни猪的切片/组，可以双向方方发发动 **в сравнение с нормалното разтягане, p < 0,01).хистограма. Количествено определяне на концентрациите на NT-ProBNP в сърдечни срези, култивирани при условия на нормално разтягане на MT (норма) или свръхразтягане (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) и D4 MTOS) срези/група от различни прасета, двуфакторен дисперсионен анализ;**p < 0,01 в сравнение с нормалното разтягане). **p < 0,01 в сравнение с нормалното разтягане). b Представителни изображения за сърдечни срезове, оцветени с тропонин-Т и WGA (вляво) и количествено определяне на размера на клетките (вдясно) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетки/група от 10 различни срезове от различни прасета, извършен е двустранен t-тест на Стюдънт; ****p < 0,0001 в сравнение с нормалното разтягане). b Представителни изображения за сърдечни срези, оцветени с тропонин-Т и WGA (вляво) и количествено определяне на размера на клетките (вдясно) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетки/група от 10 различни среза от различни прасета, извършен е двустранен t-тест на Стюдънт; ****p < 0,0001 в сравнение с нормалното разтягане). b Представителни изображения на сърдечни срезове, украсени с тропонином-Т и АЗП (слева) и количествено определение на размера на клетките (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетки/група от 10 различни среза от различни свине, два-провежда хвостовия t-критерий Стюдента; ****p < 0,0001 в сравнение с сравнение с нормално разтяжение). b Представителни изображения на сърдечни срези, оцветени с тропонин-Т и AZP (вляво) и количествено определяне на размера на клетките (вдясно) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетки/група от 10 различни среза от различни прасета, извършен е двустранен t-тест на Стюдънт; ****p < 0,0001 в сравнение с нормален щам). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比；****p < 0,0001）。 b Представителни изображения на сърдечни резени, оцветени с калкареин-Т и WGA (вляво) и размер на клетките (вдясно) (n = 330 (D6 MTOS), 369 от 10 различни резена (D6 MTNorm)) Клетки/组，两方法有尾学生 t-тест；в сравнение с нормално разтягане, ****p < 0,0001). b Представителни изображения на сърдечни срезове, оцветени тропонином-Т и АЗП (слева) и количествена оценка на размера на клетките (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) от 10 различни среза от различни свине Клетки/група, двустранни критерии Стюдента; ****p < 0,0001 в сравнение със сравнително нормално разтяжением). b Представителни изображения на сърдечни срези, оцветени с тропонин-Т и AZP (вляво) и количествено определяне на размера на клетките (вдясно) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) от 10 различни среза от различни прасета) Клетки/група, двустранен критерий на Стюдънт t; ****p < 0,0001 в сравнение с нормален щам). c Представителни изображения за ден 0 и ден 6 MTOS сърдечни срезове, имуномаркирани за тропонин-Т и NFATC4, и количествено определяне на транслокацията на NFATC4 към ядрата на CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезове/група от различни прасета, извършен е двустранен t-тест на Стюдънт; *p < 0,05). C Представителни изображения за ден 0 и ден 6 MTOS сърдечни резени имуномаркирани за тропонин-T и NFATC4 и количествено определяне на транслокацията на NFATC4 до ядрата на CMS (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) резени/група от различни прасета, двукратен студент t-test се извършват; *P <0,05). c Представителни изображения за сърдечни срезове 0 и 6 дни MTOS, имунообусловени за тропонина-Т и NFATC4, и количествена оценка на транслокациите на NFATC4 в ядрото на кавернозните клетки (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезове/група от различни свине, изпълнява двустранния t-критерий Стюдента; *p < 0,05). c Представителни изображения за сърдечни срези на 0 и 6 дни MTOS, имуномаркирани за тропонин-Т и NFATC4, и количествено определяне на NFATC4 транслокация в ядрото на кавернозните клетки (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срези/група от различни прасета), извършени с двустранен t-тест на Стюдънт; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05). c Представителни изображения на калканин-Т и NFATC4 имуномаркиране 第0天和第6天MTOS сърдечни срезове и NFATC4 от различни NFATC4 易位至CM клетъчно ядро的количество化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组,时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Представителни изображения на сърдечни срезове MTOS на 0 и 6 дни за имуномаркировка на тропонином-Т и NFATC4 и количествена оценка на транслокациите на NFATC4 в ядра CM от различни свине (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/група, два-хвостати t-критерия Стюдента; *p <0,05). c Представителни изображения на MTOS сърдечни срезове на ден 0 и 6 за имуномаркиране с тропонин-T и NFATC4 и количествено определяне на NFATC4 транслокация в ядрото на CM от различни прасета (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезове/група, двустранен t-критерий на Стюдънт; *p < 0,05).Грешките представляват средно ± стандартно отклонение.
Транслационните кардиоваскуларни изследвания изискват клетъчни модели, които точно възпроизвеждат сърдечната среда. В това проучване е разработено и характеризирано CTCM устройство, което може да стимулира ултратънки срези от сърцето. CTCM системата включва физиологично синхронизирана електромеханична стимулация и обогатяване с T3 и Dex течност. Когато срези от свински сърце са били изложени на тези фактори, тяхната жизнеспособност, структурна цялост, метаболитна активност и транскрипционна експресия са останали същите, както в прясна сърдечна тъкан след 12 дни култивиране. Освен това, прекомерното разтягане на сърдечната тъкан може да причини хипертрофия на сърцето, причинена от хиперекстензия. Като цяло, тези резултати подкрепят критичната роля на физиологичните условия на култивиране за поддържане на нормален сърдечен фенотип и предоставят платформа за скрининг на лекарства.
Много фактори допринасят за създаването на оптимална среда за функционирането и оцеляването на кардиомиоцитите. Най-очевидните от тези фактори са свързани с (1) междуклетъчни взаимодействия, (2) електромеханична стимулация, (3) хуморални фактори и (4) метаболитни субстрати. Физиологичните междуклетъчни взаимодействия изискват сложни триизмерни мрежи от множество клетъчни типове, поддържани от извънклетъчна матрица. Такива сложни клетъчни взаимодействия са трудни за реконструкция in vitro чрез съвместно култивиране на отделни клетъчни типове, но могат лесно да бъдат постигнати, използвайки органотипната природа на сърдечните срези.
Механичното разтягане и електрическата стимулация на кардиомиоцитите са от решаващо значение за поддържане на сърдечния фенотип33,34,35. Докато механичната стимулация се използва широко за кондициониране и съзряване на hiPSC-CM, няколко елегантни проучвания наскоро са направили опит за механична стимулация на сърдечни срезове в култура, използвайки едноосно натоварване. Тези проучвания показват, че 2D едноосно механично натоварване има положителен ефект върху фенотипа на сърцето по време на културата. В тези проучвания, срезове от сърцето са били натоварени или с изометрични сили на опън17, линейно ауксотонно натоварване18, или сърдечният цикъл е бил пресъздаден с помощта на обратна връзка от силови преобразуватели и задвижвания на напрежението. Тези методи обаче използват едноосно тъканно разтягане без оптимизация на околната среда, което води до потискане на много сърдечни гени или свръхекспресия на гени, свързани с анормални реакции на разтягане. CTCM, описан тук, предоставя 3D електромеханичен стимул, който имитира естествения сърдечен цикъл по отношение на времето на цикъла и физиологичното разтягане (25% разтягане, 40% систола, 60% диастола и 72 удара в минута). Въпреки че тази триизмерна механична стимулация сама по себе си не е достатъчна за поддържане на целостта на тъканите, е необходима комбинация от хуморална и механична стимулация с помощта на T3/Dex, за да се поддържат адекватно жизнеспособността, функцията и целостта на тъканите.
Хуморалните фактори играят важна роля в модулирането на фенотипа на сърцето при възрастни. Това беше подчертано в HiPS-CM проучвания, в които T3 и Dex бяха добавени към хранителна среда, за да се ускори клетъчното съзряване. T3 може да повлияе на транспорта на аминокиселини, захари и калций през клетъчните мембрани36. В допълнение, T3 насърчава експресията на MHC-α и понижаването на MHC-β, насърчавайки образуването на бързи миофибрили в зрелите кардиомиоцити в сравнение с бавно потрепващите миофибрили при фетален CM. Дефицитът на T3 при пациенти с хипотиреоидизъм води до загуба на миофибриларни ленти и намалена скорост на развитие на тонус37. Dex действа върху глюкокортикоидните рецептори и е доказано, че повишава миокардния контрактилитет в изолирани перфузирани сърца;38 се смята, че това подобрение е свързано с ефекта върху навлизането, управлявано от калциеви отлагания (SOCE)39,40. В допълнение, Dex се свързва със своите рецептори, причинявайки широк вътреклетъчен отговор, който потиска имунната функция и възпалението30.
Нашите резултати показват, че физико-механичната стимулация (MS) подобрява цялостната производителност на културата в сравнение с Ctrl, но не успява да поддържа жизнеспособност, структурна цялост и сърдечна експресия в продължение на 12 дни в култура. В сравнение с Ctrl, добавянето на T3 и Dex към CTCM (MT) култури подобрява жизнеспособността и поддържа подобни транскрипционни профили, структурна цялост и метаболитна активност с прясна сърдечна тъкан в продължение на 12 дни. Освен това, чрез контролиране на степента на разтягане на тъканта, е създаден модел на индуцирана от хиперекстензия сърдечна хипертрофия, използвайки STCM, илюстрирайки гъвкавостта на STCM системата. Трябва да се отбележи, че въпреки че сърдечното ремоделиране и фиброза обикновено включват непокътнати органи, чиито циркулиращи клетки могат да осигурят подходящите цитокини, както и фагоцитоза и други фактори на ремоделиране, секции от сърцето все още могат да имитират фиброзния процес в отговор на стрес и травма. Това е било оценявано преди това в този модел на сърдечен срез. Трябва да се отбележи, че параметрите на CTCM могат да бъдат модулирани чрез промяна на налягането/електрическата амплитуда и честота, за да се симулират много състояния като тахикардия, брадикардия и механична циркулаторна поддръжка (механично ненатоварено сърце). Това прави системата със средна производителност за тестване на лекарства. Способността на CTCM да моделира индуцирана от пренапрежение сърдечна хипертрофия проправя пътя за тестване на тази система за персонализирана терапия. В заключение, настоящото проучване показва, че механичното разтягане и хуморалната стимулация са от решаващо значение за поддържане на културата на срези от сърдечна тъкан.
Въпреки че представените тук данни показват, че CTCM е многообещаваща платформа за моделиране на непокътнат миокард, този метод на култивиране има някои ограничения. Основното ограничение на CTCM културата е, че тя налага непрекъснати динамични механични напрежения върху срезовете, което изключва възможността за активно наблюдение на контракциите на сърдечните срезове по време на всеки цикъл. Освен това, поради малкия размер на сърдечните срезове (7 mm), възможността за оценка на систоличната функция извън културални системи, използващи традиционни сензори за сила, е ограничена. В настоящия ръкопис ние частично преодоляваме това ограничение, като оценяваме оптичното напрежение като индикатор за контрактилната функция. Това ограничение обаче ще изисква допълнителна работа и може да бъде отстранено в бъдеще чрез въвеждане на методи за оптично наблюдение на функцията на сърдечните срезове в културата, като например оптично картографиране с помощта на калций и чувствителни към напрежение багрила. Друго ограничение на CTCM е, че работният модел не манипулира физиологичното напрежение (предварително и последващо натоварване). В CTCM налягането е индуцирано в противоположни посоки, за да се възпроизведе 25% физиологично разтягане в диастола (пълно разтягане) и систола (дължина на свиването по време на електрическа стимулация) в много големи тъкани. Това ограничение трябва да бъде премахнато в бъдещите дизайни на CTCM чрез адекватен натиск върху сърдечната тъкан от двете страни и чрез прилагане на точните зависимости налягане-обем, които се наблюдават в камерите на сърцето.
Ремоделирането, индуцирано от свръхразтягане, описано в този ръкопис, е ограничено до имитиране на хипертрофични хиперразтягащи сигнали. По този начин, този модел може да помогне при изучаването на индуцираната от разтягане хипертрофична сигнализация, без да е необходимо участието на хуморални или невронни фактори (които не съществуват в тази система). Необходими са допълнителни изследвания за увеличаване на множествеността на CTCM, например, съвместното култивиране с имунни клетки, циркулиращи плазмени хуморални фактори и инервацията при съвместно култивиране с невронни клетки ще подобрят възможностите за моделиране на заболявания с CTCM.
В това проучване са използвани тринадесет прасета. Всички процедури с животни са извършени в съответствие с институционалните насоки и са одобрени от Комитета за грижа и използване на животни към Университета в Луисвил. Аортната дъга е закрепена и сърцето е перфузирано с 1 л стерилна кардиоплегия (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL хепарин, pH до 7,4); Сърцата се съхраняват в леденостуден кардиоплегичен разтвор до транспортирането им до лабораторията върху лед, което обикновено е <10 минути. Сърцата се съхраняват в леденостуден кардиоплегичен разтвор до транспортирането им до лабораторията върху лед, което обикновено е <10 минути. сърцата се съхраняват в ледяном кардиоплегичен разтвор до транспортиране в лабораторията на лду, което обикновено отнема <10 минути. Сърцата се съхраняват в леденостуден кардиоплегичен разтвор до транспортирането им до лабораторията върху лед, което обикновено отнема <10 минути.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Задържайте сърцето в ледяната кардиоплегия до транспортиране в лаборатория на лду, обикновено <10 минути. Дръжте сърцата върху ледена кардиоплегия до транспортирането им до лабораторията върху лед, обикновено <10 минути.
Устройството CTCM е разработено в софтуера за компютърно проектиране (CAD) SolidWorks. Камерите за култивиране, разделителите и въздушните камери са изработени от прозрачна акрилна пластмаса, обработена с CNC машина. Опорният пръстен с диаметър 7 мм е изработен от полиетилен с висока плътност (HDPE) в центъра и има жлеб за О-пръстен, в който се побира силиконовият О-пръстен, използван за уплътняване на средата отдолу. Тънка силициева мембрана разделя камерата за култивиране от разделителната плоча. Силиконовата мембрана е лазерно изрязана от силиконов лист с дебелина 0,02″ и има твърдост 35A. Долните и горните силиконови уплътнения са лазерно изрязани от силиконов лист с дебелина 1/16″ и имат твърдост 50A. За закрепване на блока и създаване на херметично уплътнение се използват винтове и крилчати гайки от неръждаема стомана 316L.
Специализирана печатна платка (PCB) е проектирана да бъде интегрирана със системата C-Pace-EM. Гневниците на конектора на швейцарската машина на печатни платки са свързани към графитни електроди чрез медни проводници със сребро и бронзови 0-60 винта, завити в електродите. Отпечатаната платка се поставя в капака на 3D принтера.
Устройството CTCM се управлява от програмируем пневматичен задвижващ механизъм (PPD), който създава контролирано циркулаторно налягане, подобно на сърдечния цикъл. С увеличаването на налягането във въздушната камера, гъвкавата силиконова мембрана се разширява нагоре, принуждавайки средата да се насочва под тъканната област. След това областта на тъканта ще се разтегне от това изтласкване на течността, имитирайки физиологичното разширяване на сърцето по време на диастола. В пика на релаксация е приложена електрическа стимулация чрез графитни електроди, което намалява налягането във въздушната камера и предизвиква свиване на тъканните срези. Вътре в тръбата е разположен хемостатичен клапан със сензор за налягане за откриване на налягането във въздушната система. Налягането, отчетено от сензора за налягане, се подава към колектор за данни, свързан с лаптопа. Това позволява непрекъснато наблюдение на налягането във газовата камера. Когато се достигне максималното налягане в камерата (стандартно 80 mmHg, 140 mmHg OS), устройството за събиране на данни е инструктирано да изпрати сигнал към системата C-PACE-EM, за да генерира двуфазен сигнал за напрежение за 2 ms, настроен на 4 V.
Бяха получени сърдечни срези и условията за култивиране в 6 ямки бяха изпълнени, както следва: Прехвърлете събраните сърца от трансферния съд в тава, съдържаща студена (4°C) кардиоплегия. Лявата камера беше изолирана със стерилно острие и нарязана на парчета от 1-2 cm3. Тези тъканни блокове бяха прикрепени към тъканни подложки с тъканно лепило и поставени във вибрираща микротомна тъканна баня, съдържаща разтвор на Tyrode, и непрекъснато оксигенирана (3 g/L 2,3-бутандион монооксим (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g)). ), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-глюкоза (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M разтвор), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M разтвор), до 1 L ddH2O). Вибриращият микротом беше настроен да реже резени с дебелина 300 µm с честота 80 Hz, хоризонтална амплитуда на вибрациите 2 mm и скорост на придвижване 0,03 mm/s. Тъканната баня беше обградена с лед, за да се поддържа разтворът хладен, а температурата се поддържаше на 4°C. Тъканните срези от микротомната баня се прехвърлят в инкубационна вана, съдържаща непрекъснато оксигениран разтвор на Tyrode върху лед, докато се получат достатъчно срези за една културална плака. За транс-ямкови култури, тъканните срези се прикрепят към стерилни полиуретанови подложки с ширина 6 mm и се поставят в 6 ml оптимизирана среда (среда 199, 1x ITS добавка, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-алкален и 2X антибиотик-противогъбичен). Електрическа стимулация (10 V, честота 1,2 Hz) се прилага към тъканните срези чрез C-Pace. За TD условия, пресен T3 и Dex се добавят в концентрации 100 nM и 1 μM при всяка смяна на средата. Средата се насища с кислород преди подмяна 3 пъти на ден. Тъканните срези се култивират в инкубатор при 37°C и 5% CO2.
За CTCM култури, тъканните срези бяха поставени върху специално изработен 3D принтер в петриева паничка, съдържаща модифициран разтвор на Тирод. Устройството е проектирано да увеличи размера на срезите от сърцето с 25% от площта на опорния пръстен. Това се прави, така че срезите от сърцето да не се разтягат след прехвърляне от разтвора на Тирод в средата и по време на диастола. С помощта на хистоакрилно лепило, срези с дебелина 300 µm бяха фиксирани върху опорен пръстен с диаметър 7 mm. След прикрепване на тъканните срези към опорния пръстен, излишните тъканни срези се отрязват и прикрепените тъканни срези се поставят обратно във ваната с разтвор на Тирод върху лед (4°C), докато се приготвят достатъчно срези за едно устройство. Общото време за обработка на всички устройства не трябва да надвишава 2 часа. След като 6 тъканни срези бяха прикрепени към техните опорни пръстени, CTCM устройството беше сглобено. Камерата за култивиране на CTCM е предварително напълнена с 21 ml предварително окислена среда. Прехвърлете тъканните срези в камерата за култивиране и внимателно отстранете всички въздушни мехурчета с пипета. След това тъканният срез се насочва в отвора и внимателно се притиска на място. Накрая поставете капачката на електрода върху устройството и прехвърлете устройството в инкубатора. След това свържете CTCM към въздушната тръба и системата C-PACE-EM. Пневматичният задвижващ механизъм се отваря и въздушният клапан отваря CTCM. Системата C-PACE-EM е конфигурирана да подава 4 V при 1,2 Hz по време на двуфазно стимулиране в продължение на 2 ms. Средата се сменя два пъти дневно, а електродите се сменят веднъж дневно, за да се избегне натрупването на графит върху електродите. Ако е необходимо, тъканните срези могат да бъдат извадени от техните кладенчета за култивиране, за да се отстранят всички въздушни мехурчета, които може да са попаднали под тях. За условия на MT лечение, T3/Dex се добавя пресен при всяка смяна на средата със 100 nM T3 и 1 μM Dex. CTCM устройствата са култивирани в инкубатор при 37°C и 5% CO2.
За да се получат разтегнати траектории на сърдечни резени, беше разработена специална система от камери. Използвана е SLR камера (Canon Rebel T7i, Canon, Токио, Япония) с макро обектив Navitar Zoom 7000 18-108 мм (Navitar, Сан Франциско, Калифорния). Визуализацията е извършена при стайна температура след замяна на средата с прясна среда. Камерата е позиционирана под ъгъл от 51° и видеото се записва с 30 кадъра в секунда. Първо, софтуер с отворен код (MUSCLEMOTION43) е използван с Image-J за количествено определяне на движението на сърдечните резени. Маската е създадена с помощта на MATLAB (MathWorks, Natick, MA, САЩ), за да се дефинират области от интерес за биещи сърдечни резени, за да се избегне шум. Ръчно сегментирани маски се прилагат към всички изображения в поредица от кадри и след това се предават към плъгина MUSCLEMOTION. Muscle Motion използва средната интензивност на пикселите във всеки кадър, за да определи количествено движението си спрямо референтната рамка. Данните са записани, филтрирани и използвани за количествено определяне на времето на цикъла и оценка на разтягането на тъканите по време на сърдечния цикъл. Записаното видео беше последващо обработено с помощта на цифров филтър от първи ред с нулева фаза. За да се определи количествено разтягането на тъканта (от пик до пик), беше извършен анализ от пик до пик, за да се разграничат пиковете и спадовете в записания сигнал. Освен това се извършва детрендиране с помощта на полином от 6-ти ред, за да се елиминира дрейфът на сигнала. Програмният код беше разработен в MATLAB за определяне на глобалното движение на тъканите, времето на цикъла, времето на релаксация и времето на свиване (Допълнителен програмен код 44).
За анализ на деформацията, използвайки същите видеоклипове, създадени за оценка на механичното разтягане, първо проследихме две изображения, представляващи пикове на движение (най-високата (горна) и най-ниската (долна) точка на движение), съгласно софтуера MUSCLEMOTION. След това сегментирахме тъканните области и приложихме алгоритъм за засенчване към сегментираната тъкан (Допълнителна фигура 2а). Сегментираната тъкан беше разделена на десет подповърхности и напрежението върху всяка повърхност беше изчислено, използвайки следното уравнение: Деформация = (Sup-Sdown)/Sdown, където Sup и Sdown са разстоянията на формата от горната и долната сянка на тъканта, съответно (Допълнителна фигура .2b).
Сърдечните срези бяха фиксирани в 4% параформалдехид в продължение на 48 часа. Фиксираните тъкани бяха дехидратирани в 10% и 20% захароза в продължение на 1 час, след това в 30% захароза за една нощ. След това срезите бяха вградени в съединение за оптимална температура на рязане (OCT съединение) и постепенно замразени в баня от изопентан/сух лед. Съхранявайте OCT блоковете за вграждане при -80 °C до разделянето. Слайдовете бяха приготвени като срези с дебелина 8 μm.
За да премахнете OCT от сърдечни срези, загрейте слайдовете върху нагревателен блок при 95 °C за 5 минути. Добавете 1 ml PBS към всеки слайд и инкубирайте за 30 минути на стайна температура, след което пермирайте срезите, като поставите 0,1% Triton-X в PBS за 15 минути на стайна температура. За да предотвратите свързването на неспецифични антитела с пробата, добавете 1 ml 3% разтвор на BSA към слайдовете и инкубирайте за 1 час на стайна температура. След това BSA беше отстранен и слайдовете бяха измити с PBS. Маркирайте всяка проба с молив. Първични антитела (разредени 1:200 в 1% BSA) (конексин 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) и тропонин-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) бяха добавени в продължение на 90 минути, след това вторични антитела (разредени 1:200 в 1% BSA) срещу миша Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), срещу заешка Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) за допълнителни 90 минути. Промива се 3 пъти с PBS. За да се разграничи целевото оцветяване от фона, използвахме само вторичното антитяло като контрола. Накрая беше добавено DAPI ядрено оцветяване и слайдовете бяха поставени във vectashield (Vector Laboratories) и запечатани с лак за нокти. (-x увеличение) и Keyence микроскоп с 40x увеличение.
За WGA оцветяване беше използван WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) при 5 μg/ml в PBS и беше нанесен върху фиксирани срези за 30 минути при стайна температура. След това слайдовете бяха промити с PBS и към всеки слайд беше добавен Sudan black и инкубирани за 30 минути. След това слайдовете бяха промити с PBS и беше добавена среда за включване vectashield. Слайдовете бяха визуализирани на Keyence микроскоп при 40x увеличение.
OCT беше отстранен от пробите, както е описано по-горе. След отстраняване на OCT, слайдовете бяха потопени в разтвор на Буен за една нощ. След това слайдовете бяха изплакнати с дестилирана вода за 1 час и след това поставени в разтвор на Bibrich с алое киселина и фуксин за 10 минути. След това слайдовете бяха изплакнати с дестилирана вода и поставени в разтвор от 5% фосфомолибден/5% фосфоволфрамова киселина за 10 минути. Без изплакване, слайдовете бяха прехвърлени директно в разтвор на анилиново синьо за 15 минути. След това слайдовете бяха изплакнати с дестилирана вода и поставени в 1% разтвор на оцетна киселина за 2 минути. Слайдовете бяха изсушени в 200 N етанол и прехвърлени в ксилен. Оцветените слайдове бяха визуализирани с помощта на Keyence микроскоп с 10x обектив. Процентът на фиброзната площ беше определен количествено с помощта на софтуера Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT клетъчен анализ на жизнеспособността (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния), каталожен номер V13154, съгласно протокола на производителя с някои модификации. По-специално, използван е хирургически перфоратор с диаметър 6 mm, за да се осигури равномерен размер на тъканта по време на MTT анализа. Тъканите са поставени индивидуално в ямките на 12-ямкова плака, съдържаща MTT субстрат, съгласно протокола на производителя. Срезите се инкубират при 37°C в продължение на 3 часа и живата тъкан метаболизира MTT субстрата, за да образува лилаво формазаново съединение. Заменете MTT разтвора с 1 ml DMSO и инкубирайте при 37°C в продължение на 15 минути, за да се екстрахира лилав формазан от сърдечните срези. Пробите са разредени 1:10 в DMSO в 96-ямкови плаки с прозрачно дъно и интензитетът на лилавия цвят е измерен при 570 nm с помощта на Cytation четец за плаки (BioTek). Показанията са нормализирани спрямо теглото на всеки срез от сърцето.
Средата за сърдечни срезове беше заменена със среда, съдържаща 1 μCi/ml [5-3H]-глюкоза (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) за анализ на усвояването на глюкоза, както е описано по-рано. След 4 часа инкубация, добавете 100 µl от средата към отворена микроцентрифужна епруветка, съдържаща 100 µl 0.2 N HCl. След това епруветката беше поставена в сцинтилационна епруветка, съдържаща 500 μl dH2O, за да се изпари [3H]2O в продължение на 72 часа при 37°C. След това микроцентрифужната епруветка беше извадена от сцинтилационната епруветка и добавете 10 ml сцинтилационна течност. Сцинтилационното броене беше извършено с помощта на течен сцинтилационен анализатор Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). След това беше изчислено потреблението на глюкоза, като се вземат предвид специфичната активност на [5-3H]-глюкозата, непълното равновесие и фона, разреждането на [5-3H]-до немаркирана глюкоза и ефективността на сцинтилационния брояч. Данните са нормализирани спрямо масата на срезите на сърцето.
След хомогенизиране на тъканите в Trizol, РНК беше изолирана от сърдечни срези, използвайки Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874, съгласно протокола на производителя. Подготовката на RNAsec библиотеката, секвенирането и анализът на данните бяха извършени, както следва:
1 μg РНК на проба беше използван като изходен материал за приготвянето на РНК библиотеката. Секвениращите библиотеки бяха генерирани с помощта на NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit за Illumina (NEB, САЩ), следвайки препоръките на производителя, и индексните кодове бяха добавени към атрибутните последователности за всяка проба. Накратко, mRNA беше пречистена от тотална РНК, използвайки магнитни перли, прикрепени с поли-Т олигонуклеотиди. Фрагментацията се извършва с помощта на двувалентни катиони при висока температура в NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Първата верига кДНК беше синтезирана с помощта на произволни хексамерни праймери и M-MuLV обратна транскриптаза (RNase H-). Втората верига кДНК след това се синтезира с помощта на ДНК полимераза I и RNase H. Останалите надвеси се превръщат в тъпи краища чрез екзонуклеазна/полимеразна активност. След аденилиране на 3′ края на ДНК фрагмента, към него се прикрепя NEBNext адаптер със структура на фиба, за да се подготви за хибридизация. За селекция на кДНК фрагменти с предпочитана дължина 150-200 bp. Фрагментите от библиотеката бяха пречистени с помощта на системата AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, САЩ). След това, 3 μl USER Enzyme (NEB, САЩ) с кДНК, селектирана по размер, лигирана с адаптер, беше използвана за 15 минути при 37°C и след това за 5 минути при 95°C преди PCR. PCR беше проведена с помощта на Phusion High-Fidelity ДНК полимераза, универсални PCR праймери и Index (X) праймери. Накрая, PCR продуктите бяха пречистени (система AMPure XP) и качеството на библиотеката беше оценено на система Agilent Bioanalyzer 2100. Библиотеката с кДНК беше секвенирана с помощта на секвенатор Novaseq. Суровите файлове с изображения от Illumina бяха конвертирани в сурови четения с помощта на CASAVA Base Calling. Суровите данни се съхраняват във файлове във формат FASTQ(fq), които съдържат четени секвенции и съответните базови качества. Изберете HISAT2, за да съпоставите филтрираните четения на секвениране с референтния геном Sscrofa11.1. Като цяло, HISAT2 поддържа геноми от всякакъв размер, включително геноми по-големи от 4 милиарда бази, и за повечето параметри са зададени стойности по подразбиране. Прочитанията на сплайсинг от RNA Seq данни могат да бъдат ефективно подравнени с помощта на HISAT2, най-бързата система, налична в момента, със същата или по-добра точност от всеки друг метод.
Изобилието от транскрипти директно отразява нивото на генна експресия. Нивата на генна експресия се оценяват чрез изобилието от транскрипти (брой секвенирания), свързани с генома или екзоните. Броят на прочетените фрагменти е пропорционален на нивата на генна експресия, дължината на гена и дълбочината на секвениране. FPKM (фрагменти на хиляда базови двойки от секвенирани транскрипти на милион базови двойки) бяха изчислени и P-стойностите на диференциалната експресия бяха определени с помощта на пакета DESeq2. След това изчислихме процента на фалшиви открития (FDR) за всяка P стойност, използвайки метода на Бенджамини-Хохберг9, базиран на вградената R-функция „p.adjust“.
РНК, изолирана от сърдечни срези, беше превърната в кДНК при концентрация 200 ng/μl, използвайки SuperScript IV Vilo Master mix от Thermo (Thermo, кат. № 11756050). Количествената RT-PCR беше проведена с помощта на Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-ямкова прозрачна реакционна плака (Thermo, кат. № 4483319) и microamp оптично лепило (Thermo, кат. № 4311971). Реакционната смес се състоеше от 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, кат. № 4444557), 0.5 µl Taqman Primer и 3.5 µl H2O, смесени на ямка. Бяха проведени стандартни qPCR цикли и CT стойностите бяха измерени с помощта на Applied Biosystems Quantstudio 5 real-time PCR инструмент (384-ямков модул; продуктов № A28135). Taqman праймерите бяха закупени от Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). CT стойностите на всички проби бяха нормализирани спрямо гена за поддържане на гена GAPDH.
Освобождаването на NT-ProBNP от средата беше оценено с помощта на NT-ProBNP комплекта (pig) (кат. № MBS2086979, MyBioSource) съгласно протокола на производителя. Накратко, 250 µl от всяка проба и стандарт бяха добавени в два екземпляра към всяка ямка. Веднага след добавяне на пробата, добавете 50 µl от Assay Reagent A към всяка ямка. Разклатете внимателно плаката и запечатайте с уплътнител. След това таблетките бяха инкубирани при 37°C за 1 час. След това аспирирайте разтвора и измийте ямките 4 пъти с 350 µl от 1X промивен разтвор, като инкубирате промивния разтвор за 1-2 минути всеки път. След това добавете 100 µl от Assay Reagent B на ямка и запечатайте с уплътнител за ямка. Таблетката беше леко разклатена и инкубирана при 37°C за 30 минути. Аспирирайте разтвора и измийте ямките 5 пъти с 350 µl от 1X промивен разтвор. Добавете 90 µl от разтвора на субстрата към всяка ямка и запечатайте плаката. Инкубирайте плаката при 37°C за 10-20 минути. Добавете 50 µl стоп разтвор към всяка ямка. Плаката беше незабавно измерена с помощта на четец на плаки Cytation (BioTek), настроен на 450 nm.
Бяха извършени анализи на мощността, за да се изберат размерите на групите, които ще осигурят >80% мощност за откриване на 10% абсолютна промяна в параметъра с 5% процент на грешки от тип I. Бяха извършени анализи на мощността, за да се изберат размерите на групите, които ще осигурят >80% мощност за откриване на 10% абсолютна промяна в параметъра с 5% процент на грешки от тип I. Анализът на мощностите е извършен за избор на размери на група, които осигуряват >80% мощности за открити промени, 10% абсолютно параметри с 5% честота на грешка тип I. Беше извършен анализ на мощността, за да се изберат групи с размери, които биха осигурили >80% мощност за откриване на 10% абсолютна промяна на параметрите с 5% процент на грешки от тип I.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Беше извършен анализ на мощността за избор на размер на групата, която осигуряваше > 80% мощност за открити промени, 10% абсолютно параметри и 5% честота на грешка тип I. Беше извършен анализ на мощността, за да се избере размер на групата, който би осигурил >80% мощност за откриване на 10% абсолютна промяна на параметрите и 5% процент на грешки от тип I.Тъканните срези бяха избрани на случаен принцип преди експеримента. Всички анализи бяха условно сляпи и пробите бяха декодирани едва след като всички данни бяха анализирани. За извършване на всички статистически анализи беше използван софтуерът GraphPad Prism (Сан Диего, Калифорния). За всички статистики, p-стойностите се считат за значими при стойности <0,05. За всички статистики, p-стойностите се считат за значими при стойности <0,05. За цялата статистика p-значенията се считат за значими при стойности <0,05. За всички статистики, p-стойностите се считат за значими при стойности <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 За цялата статистика p-значенията се считат за значими при стойности <0,05. За всички статистики, p-стойностите се считат за значими при стойности <0,05.Двустранен t-тест на Стюдънт беше извършен върху данните само с 2 сравнения. За определяне на значимостта между множество групи беше използван еднофакторен или двуфакторен ANOVA. При извършване на post hoc тестове беше приложена корекцията на Тюки, за да се отчетат множеството сравнения. RNAsec данните имат специални статистически съображения при изчисляване на FDR и p.adjust, както е описано в раздела „Методи“.
За повече информация относно дизайна на изследването вижте резюмето на доклада за изследвания в природата, свързано с тази статия.