Nature.com পরিদর্শন করার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ৷ আপনি যে ব্রাউজার সংস্করণটি ব্যবহার করছেন তাতে CSS-এর জন্য সীমিত সমর্থন রয়েছে৷ সেরা অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি আপডেট করা ব্রাউজার ব্যবহার করার পরামর্শ দিচ্ছি (অথবা Internet Explorer-এ সামঞ্জস্য মোড বন্ধ করুন)৷ ইতিমধ্যে, অব্যাহত সমর্থন নিশ্চিত করতে, আমরা স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়াই সাইটটি প্রদর্শন করব৷
মানুষের অন্ত্রের মরফোজেনেসিস 3D এপিথেলিয়াল মাইক্রোআর্কিটেকচার এবং স্থানিক সংস্থার ক্রিপ্ট-ভিলাস বৈশিষ্ট্যগুলি স্থাপন করে। বহিরাগত মাইক্রোবিয়াল অ্যান্টিজেন এবং তাদের বিপাকীয় পদার্থ থেকে বেসাল ক্রিপ্টে স্টেম সেল কুলুঙ্গি রক্ষা করে অন্ত্রের হোমিওস্ট্যাসিস বজায় রাখার জন্য এই অনন্য কাঠামো প্রয়োজন। অন্ত্রের মিউকোসাল পৃষ্ঠে বাধা। অতএব, 3D এপিথেলিয়াল কাঠামো পুনঃনির্মাণ করা ভিট্রো অন্ত্রের মডেলগুলির নির্মাণের জন্য অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ। উল্লেখযোগ্যভাবে, জৈব মিমেটিক অন্ত্র-অন-এ-চিপ অন্ত্রের স্বতঃস্ফূর্ত 3D মরফোজেনেসিসকে প্ররোচিত করতে পারে, যা বায়োফাইনার এনফিট্যালজিক্যাল ফাংশন প্রদান করে। প্রজননযোগ্য প্রোটোকল একটি মাইক্রোফ্লুইডিক চিপে অন্ত্রে অন্ত্রের মরফোজেনেসিসকে দৃঢ়ভাবে প্ররোচিত করার জন্য সেইসাথে একটি ট্রান্সওয়েল এমবেডেড হাইব্রিড চিপে। আমরা ডিভাইস তৈরির জন্য বিস্তারিত পদ্ধতি বর্ণনা করি, Caco-2 বা অন্ত্রের অর্গানয়েড এপিথেলিয়াল কোষে মাইক্রোফ্লুয়েড প্ল্যাটফর্মের কনভেন্টস ফ্লুয়েড সেটিংয়ের জন্য বিস্তারিত বর্ণনা করি। এবং একাধিক ইমেজিং পদ্ধতি ব্যবহার করে প্রতিষ্ঠিত 3D এপিথেলিয়ার বৈশিষ্ট্য। এই প্রোটোকলটি 5 দিন ধরে বেসোলেটারাল ফ্লুইড প্রবাহ নিয়ন্ত্রণ করে কার্যকরী অন্ত্রের মাইক্রোআর্কিটেকচারের পুনর্জন্ম অর্জন করে। আমাদের ইন ভিট্রো মরফোজেনেসিস পদ্ধতি শারীরবৃত্তীয়ভাবে প্রাসঙ্গিক শিয়ার স্ট্রেস এবং যান্ত্রিক গতি নিযুক্ত করে, যা আমাদের বিদ্যমান ইঞ্জিন বা কোষের জটিল কৌশলের প্রয়োজন হয় না। প্রস্তাবিত প্রোটোকলের বায়োমেডিকাল গবেষণা সম্প্রদায়ের জন্য বিস্তৃত প্রভাব থাকতে পারে, যা বায়োমেডিকাল, ক্লিনিকাল এবং ফার্মাসিউটিক্যাল অ্যাপ্লিকেশনগুলির জন্য ভিট্রোতে 3D অন্ত্রের এপিথেলিয়াল স্তরগুলি পুনরুত্পাদন করার একটি পদ্ধতি প্রদান করে।
পরীক্ষাগুলি দেখায় যে অন্ত্রের এপিথেলিয়াল Caco-2 কোষগুলি অন্ত্র-অন-এ-চিপ1,2,3,4,5 বা বাইলেয়ার মাইক্রোফ্লুইডিক ডিভাইস 6,7-এ অন্তর্নিহিত প্রক্রিয়া সম্পর্কে স্পষ্ট বোঝা ছাড়াই ভিট্রোতে স্বতঃস্ফূর্ত 3D মরফোজেনেসিস করতে পারে। s ভিট্রোতে 3D এপিথেলিয়াল মরফোজেনেসিস প্ররোচিত করার জন্য প্রয়োজনীয় এবং পর্যাপ্ত, যা Caco-2 এবং রোগী থেকে প্রাপ্ত অন্ত্রের অর্গানয়েড দ্বারা প্রদর্শিত হয়েছে।এপিথেলিয়াল কোষগুলিকে যাচাই করা হয়েছিল৷ এই গবেষণায়, আমরা বিশেষভাবে একটি শক্তিশালী Wnt প্রতিপক্ষ, ডিককপফ-1 (DKK-1) এর কোষ উত্পাদন এবং ঘনত্ব বন্টনের উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করেছি, অন্ত্রে-অন-এ-চিপ এবং পরিবর্তিত মাইক্রোফ্লুইডিক ডিভাইসে ট্রান্সওয়েল সন্নিবেশগুলি রয়েছে, যাকে বলা হয় "হাইব্রিড ডেমোনট চিপজেন-এর এক্সটেনশন ডিভিকনটস"। -1, Wnt repressor 1, secreted frizzled-related protein 1, or Soggy-1) on-chip gat morphogenesis inhibits or prestructured 3D epithelial লেয়ারকে ব্যাহত করে, পরামর্শ দেয় যে সংস্কৃতির সময় বৈরী মানসিক চাপ অন্ত্রের মরফোজেনেসিসের জন্য দায়ী, রবপ্রাস্টিক পদ্ধতির জন্য ভিট্রোপ্রেজেন অর্জনের জন্য। elial ইন্টারফেস হল সক্রিয় ফ্লাশিং (যেমন, অন্ত্র-অন-এ-চিপ বা হাইব্রিড-অন-এ-চিপ প্ল্যাটফর্মে) বা ডিফিউশনের মাধ্যমে বেসোলেটারাল কম্পার্টমেন্টে Wnt প্রতিপক্ষের মাত্রা অপসারণ করা বা ন্যূনতমভাবে বজায় রাখা। ব্যাসোল্যাটারাল মিডিয়া (যেমন, ট্রান্সওয়েল বৃহৎ বেসোলেটারাল কূপ সন্নিবেশ থেকে)।
এই প্রোটোকলে, আমরা অন্ত্র-অন-এ-চিপ মাইক্রোডিভাইস এবং ট্রান্সওয়েল-ইনসার্টেবল হাইব্রিড চিপস (ধাপ 1-5) তৈরি করার জন্য একটি বিশদ পদ্ধতি প্রদান করি যাতে পলিডাইমেথিলসিলোক্সেন (পিডিএমএস)-ভিত্তিক ছিদ্রযুক্ত ঝিল্লিতে অন্ত্রের এপিথেলিয়াল কোষগুলিকে সংস্কার করা যায় (পলিডাইমেথাইলসেলক্সেন, 6A, 7-এর ধাপ, 7, 7)। 6B, 7B, 8, 9) এবং ইনডিউসড 3D মরফোজেনেসিস ইন ভিট্রো (ধাপ 10)। এছাড়াও আমরা একাধিক ইমেজিং পদ্ধতি প্রয়োগ করে টিস্যু-নির্দিষ্ট হিস্টোজেনেসিস এবং বংশ-নির্ভর সেলুলার পার্থক্যের নির্দেশক সেলুলার এবং আণবিক বৈশিষ্ট্যগুলি সনাক্ত করেছি (ধাপ 11-24, মানবিক কোষের মতো ক্যাসটিনলিথ কোষ ব্যবহার করে। 2 বা অন্ত্রের অর্গানয়েড, ছিদ্রযুক্ত ঝিল্লির পৃষ্ঠের পরিবর্তন, 2D মনোলেয়ার তৈরি এবং অন্ত্রের জৈব রাসায়নিক এবং বায়োমেকানিকাল মাইক্রোএনভায়রনমেন্টের প্রজনন সহ প্রযুক্তিগত বিবরণ সহ দুটি সংস্কৃতি বিন্যাসে। সংস্কৃতির বেসোল্যাটারাল কম্পার্টমেন্টে মাধ্যম। অবশেষে, আমরা একটি পুনর্জন্মযোগ্য 3D এপিথেলিয়াল স্তরের উপযোগের একটি উপস্থাপনা প্রদান করি যা মরফোজেন-নির্ভর এপিথেলিয়াল বৃদ্ধি, অনুদৈর্ঘ্য হোস্ট-মাইক্রোবায়োম সহ-সংস্কৃতি, প্যাথোজেন সংক্রমণ, প্রদাহজনিত আঘাত, ব্যারিথ্যাম্পিক ব্যাস, এক্সপ্লোরিয়াল ব্যায়াম, ব্যাস-অ্যাম্পেটিক রোগের মডেল তৈরি করতে ব্যবহার করা যেতে পারে। প্রভাবিত করে।
আমাদের প্রোটোকলটি মৌলিক (যেমন, অন্ত্রের মিউকোসাল বায়োলজি, স্টেম সেল বায়োলজি এবং ডেভেলপমেন্টাল বায়োলজি) এবং ফলিত গবেষণায় (যেমন, প্রিক্লিনিকাল ড্রাগ টেস্টিং, ডিজিজ মডেলিং, টিস্যু ইঞ্জিনিয়ারিং এবং গ্যাস্ট্রোএন্টেরোলজি) বিস্তৃত পরিসরের বিজ্ঞানীদের জন্য উপযোগী হতে পারে। ভিট্রোতে অন্ত্রের এপিথেলিয়াম, আমরা কল্পনা করি যে আমাদের প্রযুক্তিগত কৌশলটি অন্ত্রের বিকাশ, পুনর্জন্ম বা হোমিওস্ট্যাসিসের সময় কোষের সংকেতের গতিবিদ্যা অধ্যয়নরত দর্শকদের কাছে প্রচার করা যেতে পারে। উপরন্তু, আমাদের প্রোটোকল বিভিন্ন সংক্রামক এজেন্ট যেমন নরোভাইরাস 8, ক্লোরোভিরাস 2 (সিভারোভাইরাস 8, ক্লোরোভিড-এসএ, সিভিওরস-অ্যাকরোভিড-এসএ) এর অধীনে সংক্রমণকে জিজ্ঞাসাবাদের জন্য দরকারী। ium difficile, Salmonella Typhimurium 9 বা Vibrio cholerae.রোগের প্যাথলজি এবং প্যাথোজেনেসিসের শ্রোতারাও দরকারী। একটি অন-চিপ অন্ত্রের মাইক্রোফিজিওলজি সিস্টেমের ব্যবহার অনুদৈর্ঘ্য সহ-সংস্কৃতি 10 এবং পরবর্তীকালে হোস্ট প্রতিরক্ষা, ইমিউন প্রতিক্রিয়া এবং গ্যাস্ট্রোইনটেস্টাইনাল (GI) ট্র্যাক্টে রোগজীবাণু-সম্পর্কিত আঘাত মেরামতের মূল্যায়নের অনুমতি দিতে পারে। রোগীর 3D অন্ত্রের এপিথেলিয়াল স্তরগুলি ব্যবহার করে 3D অন্ত্রের এপিথেলিয়াল স্তরগুলি প্রস্তুত করা হলে s রোগ, আলসারেটিভ কোলাইটিস, পাউচাইটিস, বা ইরিটেবল বাওয়েল সিনড্রোম সিমুলেট করা যেতে পারে, এই রোগগুলির মধ্যে রয়েছে ভিলাস অ্যাট্রোফি, ক্রিপ্ট শর্টনিং, মিউকোসাল ড্যামেজ, বা ইমপেরাডেলিথ ব্যারিস্টিক বা স্ট্রাইক বা অন্ত্রের ক্ষতি। oids12,13. রোগের পরিবেশের উচ্চতর জটিলতাকে আরও ভালভাবে মডেল করার জন্য, পাঠকরা 3D অন্ত্রের ভিলাস-ক্রিপ্ট মাইক্রোআর্কিটেকচার ধারণকারী মডেলগুলিতে রোগ-প্রাসঙ্গিক কোষের ধরন, যেমন রোগীর পেরিফেরাল ব্লাড মনোনিউক্লিয়ার সেল (PBMCs) যোগ করার কথা বিবেচনা করতে পারেন।টিস্যু-নির্দিষ্ট ইমিউন কোষ, 5.
যেহেতু 3D এপিথেলিয়াল মাইক্রোস্ট্রাকচার বিভাগকরণ প্রক্রিয়া ছাড়াই স্থির এবং কল্পনা করা যেতে পারে, তাই স্থানিক ট্রান্সক্রিপ্টমিক্স এবং উচ্চ-রেজোলিউশন বা সুপার-রেজোলিউশন ইমেজিংয়ে কাজ করা দর্শকরা এপিথেলিয়াল কুলুঙ্গিতে জিন এবং প্রোটিনের স্থানিক গতিবিদ্যার ম্যাপিংয়ে আগ্রহী হতে পারে।প্রযুক্তিতে আগ্রহী। মাইক্রোবায়াল বা ইমিউন উদ্দীপনার প্রতি প্রতিক্রিয়া। উপরন্তু, অনুদৈর্ঘ্য হোস্ট-মাইক্রোবায়োম ক্রসস্টালক 10, 14 যা অন্ত্রের হোমিওস্ট্যাসিস সমন্বয় করে 3D অন্ত্রের মিউকোসাল স্তরে বিভিন্ন অণুজীব প্রজাতির সহ-সংস্কৃতির মাধ্যমে, বিশেষত অণুজীব সম্প্রদায়ের জীবাণু বা জীবাণু সম্প্রদায়ের মধ্যে প্রতিষ্ঠিত হতে পারে।প্ল্যাটফর্মে। এই পদ্ধতিটি মিউকোসাল ইমিউনোলজি, গ্যাস্ট্রোএন্টারোলজি, হিউম্যান মাইক্রোবায়োম, কালচারমিক্স এবং ক্লিনিকাল মাইক্রোবায়োলজি অধ্যয়নরত দর্শকদের জন্য বিশেষভাবে আকর্ষণীয় যা পরীক্ষাগারে পূর্বে অপরিবর্তিত অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটা চাষ করতে চায়। tes যেগুলি ক্রমাগত বেসোলেটারাল কম্পার্টমেন্টগুলিকে পুনরায় পূরণ করে, প্রোটোকলটি যারা ফার্মাসিউটিক্যাল, বায়োমেডিকাল বা উচ্চ-থ্রুপুট স্ক্রীনিং বা খাদ্য শিল্পের জন্য বৈধতা প্ল্যাটফর্ম তৈরি করছে তাদের কাছেও প্রচার করা যেতে পারে। নীতির প্রমাণ হিসাবে, আমরা সম্প্রতি একটি মাল্টিপ্লেক্স হাই-থ্রুপুট সিস্টেমের সম্ভাব্যতা প্রদর্শন করেছি, একটি মাল্টিপলপ্লেক্স হাই-থ্রুপুট সিস্টেমে একাধিক সংযোজন বা স্ক্যান্সফোলেট সিস্টেমের জন্য। -এ-চিপ পণ্যগুলিকে বাণিজ্যিকীকরণ করা হয়েছে16,17,18৷অতএব, আমাদের ইন ভিট্রো মরফোজেনেসিস পদ্ধতির বৈধতা ত্বরান্বিত এবং সম্ভাব্যভাবে অনেক গবেষণা ল্যাবরেটরি, শিল্প বা সরকার এবং নিয়ন্ত্রক সংস্থাগুলি দ্বারা গ্রহণ করা যেতে পারে যাতে ইন ভিট্রো অন্ত্রের মরফোজেনেসিস এর সেলুলার রিপ্রোগ্রামিং বোঝার জন্য ট্রান্সক্রিপ্টোমিক বা ট্রান্সক্রিপ্টোমিক ট্রান্সপোর্টস বা ওষুধের ট্রান্সক্রিপ্টোমিক স্তরে পরীক্ষা করা হয়। 3D অন্ত্রের সারোগেট ব্যবহার করে বা অন্ত্রের মরফোজেনেসিস প্রক্রিয়ার প্রজননযোগ্যতা মূল্যায়ন করতে কাস্টম বা বাণিজ্যিক অঙ্গ-অন-এ-চিপ মডেল ব্যবহার করে।
অন্ত্রের এপিথেলিয়াল মরফোজেনেসিস অধ্যয়ন করতে সীমিত সংখ্যক মানব-প্রাসঙ্গিক পরীক্ষামূলক মডেল ব্যবহার করা হয়েছে, মূলত ভিট্রো.ইন ফ্যাক্টে থ্রিডি মরফোজেনেসিসকে প্ররোচিত করার জন্য বাস্তবায়নযোগ্য প্রোটোকলের অভাবের কারণে, এবং বেশিরভাগ ক্ষেত্রে গুরুত্বপূর্ণ, যেমনটি, জেব্রাফিশ 20, ইঁদুর 21 বা চিকেন 21) আইসলি হিউম্যান ডেভেলপমেন্টাল প্রক্রিয়াগুলি নির্ধারণ করুন Monty ইউকোসাল বা ইমিউন উদ্দীপনা .3 ডি এপিথিলিয়াল স্তরগুলি হোস্ট ফ্যাক্টরগুলির প্রতিক্রিয়াতে স্থানিক কুলুঙ্গি এবং পরিবেশগত বিবর্তন গঠনে কীভাবে প্রতিযোগিতা করে তা অধ্যয়নের জন্য একটি স্থান সরবরাহ করতে পারে (যেমন, অভ্যন্তরীণ বনাম বাইরের শ্লেষ্মা স্তরগুলি, আইজিএ এবং অ্যান্টিমাইক্রোবায়াল পেপটাইডগুলি কীভাবে মঞ্জুরি দেয়)। বিলম্বিত (যেমন, শর্ট-চেইন ফ্যাটি অ্যাসিড) যা সেলুলার সংস্থা এবং স্টেম সেল কুলুঙ্গিগুলিকে বেসাল ক্রিপ্টগুলিতে আকার দেয় se এই বৈশিষ্ট্যগুলি কেবল তখনই প্রদর্শিত হতে পারে যখন 3 ডি এপিথেলিয়াল স্তরগুলি ভিট্রোতে প্রতিষ্ঠিত হয়।
3D অন্ত্রের এপিথেলিয়াল কাঠামো তৈরির আমাদের পদ্ধতির পাশাপাশি, বেশ কয়েকটি ইন ভিট্রো পদ্ধতি রয়েছে৷ অন্ত্রের অর্গানয়েড সংস্কৃতি একটি অত্যাধুনিক টিস্যু ইঞ্জিনিয়ারিং কৌশল যা নির্দিষ্ট মরফোজেন অবস্থার অধীনে অন্ত্রের স্টেম কোষের চাষের উপর ভিত্তি করে 23,24,25৷ যাইহোক, প্রায়শই 3D-এর জন্য কো-হোস্ট বা কো-হোস্টের মডেল ব্যবহার করা হয়। চ্যালেঞ্জিং কারণ অন্ত্রের লুমেন অর্গানয়েডের মধ্যে আবদ্ধ থাকে এবং তাই, অণুজীব কোষ বা এক্সোজেনাস অ্যান্টিজেনের মতো লুমিনাল উপাদানগুলির প্রবর্তন সীমিত।একটি microinjector,26,27 ব্যবহার করে organoid lumens অ্যাক্সেস উন্নত করা যেতে পারে কিন্তু এই পদ্ধতিটি আক্রমণাত্মক এবং শ্রম-নিবিড় এবং সম্পাদন করার জন্য বিশেষ জ্ঞানের প্রয়োজন। উপরন্তু, স্থির অবস্থার অধীনে হাইড্রোজেল স্ক্যাফোল্ডে রক্ষণাবেক্ষণ করা ঐতিহ্যবাহী অর্গানয়েড সংস্কৃতিগুলি ভিভো বায়োমেকানিক্সে সঠিকভাবে সক্রিয়ভাবে প্রতিফলিত হয় না।
বিভিন্ন গবেষণা গোষ্ঠীর দ্বারা নিযুক্ত অন্যান্য পদ্ধতিগুলি জেল পৃষ্ঠে বিচ্ছিন্ন মানব অন্ত্রের কোষগুলিকে সংস্কৃতির মাধ্যমে অন্ত্রের উপকূলীয় কাঠামোর অনুকরণ করার জন্য পূর্বনির্ধারিত 3D হাইড্রোজেল স্ক্যাফোল্ডগুলি ব্যবহার করে৷ 3D-প্রিন্টেড, মাইক্রো-মিলড, বা লিথোগ্রাফিকভাবে তৈরি করা কোষগুলির বিন্যাস এই পদ্ধতিতে হাইড্রোজেল স্ক্যাফোল্ড তৈরি করা হয়। শারীরবৃত্তীয়ভাবে প্রাসঙ্গিক মরফোজেন গ্রেডিয়েন্ট সহ ভিট্রো, স্ক্যাফোল্ডে স্ট্রোমাল কোষগুলিকে অন্তর্ভুক্ত করে একটি উচ্চ অনুপাতের এপিথেলিয়াল গঠন এবং স্ট্রোমা-এপিথেলিয়াল ক্রসস্ট্যাক স্থাপন করে। যাইহোক, প্রাক-গঠিত স্ক্যাফোল্ডের প্রকৃতি স্বতঃস্ফূর্ত মরফোজেনেটিক প্রক্রিয়ার প্রদর্শনকে বাধা দিতে পারে। অন্ত্রের কোষগুলিকে মরফোজেনেসিস করতে হবে এবং শারীরবৃত্তীয় কার্যকারিতা অর্জন করতে হবে। আরেকটি সাম্প্রতিক গবেষণায় একটি মাইক্রোফ্লুইডিক প্ল্যাটফর্মে হাইড্রোজেল স্ক্যাফোল্ড এবং লেজার-এচিং কৌশল ব্যবহার করে প্যাটার্নযুক্ত অন্ত্রের এপিথেলিয়াল স্ট্রাকচার ব্যবহার করা হয়েছে। মাউসের অন্ত্রের অর্গানয়েডগুলি খোদাই করা প্যাটার্ন অনুসরণ করে অন্ত্রের গঠন এবং মাইক্রোফ্লুইড স্ট্রাকচার তৈরি করতে পারে। ics মডিউল৷তবে, এই মডেলটি স্বতঃস্ফূর্ত মরফোজেনেটিক প্রক্রিয়াগুলি প্রদর্শন করে না বা অন্ত্রের যান্ত্রিক গতিবিধি অন্তর্ভুক্ত করে না৷ একই গোষ্ঠীর 3D প্রিন্টিং কৌশলগুলি স্বতঃস্ফূর্ত মরফোজেনেটিক প্রক্রিয়াগুলির সাথে ক্ষুদ্র অন্ত্রের টিউব তৈরি করতে সক্ষম হয়েছিল৷ বিভিন্ন অন্ত্রের মধ্যে জটিল বানান সত্বেও এই মডেলের অন্ত্রের ফ্লু-প্রবাহের ঘাটতি রয়েছে৷ অতিরিক্তভাবে, মডেল অপারেবিলিটি সীমিত হতে পারে, বিশেষ করে বায়োপ্রিন্টিং প্রক্রিয়া সম্পূর্ণ হওয়ার পরে, পরীক্ষামূলক অবস্থার বা কোষ থেকে কোষের মিথস্ক্রিয়াকে বিরক্ত করে। পরিবর্তে, আমাদের প্রস্তাবিত প্রোটোকল স্বতঃস্ফূর্ত অন্ত্রের মরফোজেনেসিস, শারীরবৃত্তীয়ভাবে প্রাসঙ্গিক শিয়ার স্ট্রেস, বায়োমেকানিক্স যা অন্ত্রের গতিশীলতা অনুকরণ করে, অন্ত্রের গতিশীলতা এবং জটিল মাইক্রোসোলজিক্যাল অ্যাকসেসিবিলিটি এবং ইনক্রিপমেন্টাল কম্পাঙ্ক। মডুলারিটির পরিবেশ। অতএব, আমাদের ইন ভিট্রো 3D মরফোজেনেসিস প্রোটোকল বিদ্যমান পদ্ধতির চ্যালেঞ্জগুলি কাটিয়ে উঠতে একটি পরিপূরক পদ্ধতি প্রদান করতে পারে।
আমাদের প্রোটোকল সম্পূর্ণরূপে 3D এপিথেলিয়াল মরফোজেনেসিসের উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করে, শুধুমাত্র সংস্কৃতিতে এপিথেলিয়াল কোষের সাথে এবং মেসেনকাইমাল কোষ, এন্ডোথেলিয়াল কোষ এবং ইমিউন কোষের মতো আশেপাশের কোষগুলির অন্য কোন প্রকার নেই। পূর্বে বর্ণিত হিসাবে, আমাদের প্রোটোকলের মূল হল এপিথেলিয়াল মরফোজেনেসিস ইনডাকশন এপিথেলিয়াল মর্ফোজেনেসিস ইন সাইড মোর্ফোজেনেসিস অ্যাট সিক্রেটেড সাইডমোরোজেন। মাঝারি। যদিও আমাদের অন্ত্র-অন-এ-চিপ এবং হাইব্রিড-অন-এ-চিপের মজবুত মডুলারিটি আমাদেরকে 3D এপিথেলিয়াল স্তর পুনরায় তৈরি করতে দেয়, অতিরিক্ত জৈবিক জটিলতা যেমন এপিথেলিয়াল-মেসেনকাইমাল ইন্টারঅ্যাকশন 33,34, এক্সট্রা সেলুলার ম্যাট্রিক্স (ECM) এবং 3D কোষে জমাকৃত বৈশিষ্ট্যগুলি, যা আমাদের কোষে জমা করে। বেসাল ক্রিপ্টগুলির কুলুঙ্গিগুলি আরও বিবেচনা করা বাকি রয়েছে৷ মেসেনকাইমের স্ট্রোমাল কোষগুলি (যেমন, ফাইব্রোব্লাস্ট) ইসিএম প্রোটিন উত্পাদন এবং ভিভো 35,37,38-এ অন্ত্রের মরফোজেনেসিস নিয়ন্ত্রণে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে৷ আমাদের মডেলে মেসেনকাইমাল কোষের সংযোজন মর্ফোজেনেটিক লেয়ার, ক্যাপসিলিলা এবং ক্যাপসিটিলিক্স প্রক্রিয়াকে উন্নত করে। ) অন্ত্রের মাইক্রোএনভায়রনমেন্টে আণবিক পরিবহন 39 এবং ইমিউন সেল নিয়োগ40 নিয়ন্ত্রণে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। উপরন্তু, টিস্যু মডেলগুলির মধ্যে সংযুক্ত করা যেতে পারে এমন ভাস্কুল্যাচার উপাদানগুলি একটি পূর্বশর্ত যখন টিস্যু মডেলগুলি বহু-অঙ্গের মিথস্ক্রিয়া প্রদর্শনের জন্য ডিজাইন করা হয়। অতএব, কোষের অতিরিক্ত বৈশিষ্ট্যগুলি অন্তর্ভুক্ত করার জন্য অতিরিক্ত কোষের প্রয়োজন হতে পারে। রেজোলিউশন। অন্ত্রের রোগের অনুকরণের প্রেক্ষাপটে সহজাত ইমিউন প্রতিক্রিয়া, অ্যান্টিজেন উপস্থাপনা, সহজাত অভিযোজিত ইমিউন ক্রসস্টাল এবং টিস্যু-নির্দিষ্ট অনাক্রম্যতা প্রদর্শনের জন্য রোগীর থেকে প্রাপ্ত ইমিউন কোষগুলিও অপরিহার্য।
হাইব্রিড চিপগুলির ব্যবহার অন্ত্র-অন-এ-চিপের চেয়ে আরও সহজ কারণ ডিভাইস সেটআপ সহজ এবং ট্রান্সওয়েল সন্নিবেশের ব্যবহার অন্ত্রের এপিথেলিয়ামের স্কেলযোগ্য সংস্কৃতির জন্য অনুমতি দেয়। তবে, পলিয়েস্টার ঝিল্লি সহ বাণিজ্যিকভাবে উপলব্ধ ট্রান্সওয়েল সন্নিবেশগুলি স্থিতিস্থাপক নয় এবং পেরিস্টালটিক-সদৃশ থারব্রীট নড়াচড়ার জায়গায় ট্রান্সওয়েল-এর মতো অনুকরণ করতে পারে না। এপিকাল সাইডে কোন শিয়ার স্ট্রেস ছাড়াই d চিপ স্থির ছিল। স্পষ্টতই, এপিকাল কম্পার্টমেন্টের স্ট্যাটিক বৈশিষ্ট্যগুলি খুব কমই হাইব্রিড চিপগুলিতে দীর্ঘমেয়াদী ব্যাকটেরিয়া সহ-সংস্কৃতিকে সক্ষম করে। যখন আমরা ট্রান্সওয়েল ইনসার্টে 3D মরফোজেনেসিসকে দৃঢ়ভাবে প্ররোচিত করতে পারি, তখন হাইব্রিড বায়োক্লিক্সের সংমিশ্রণ ব্যবহার করে। আইডি প্রবাহ সম্ভাব্য অ্যাপ্লিকেশনের জন্য হাইব্রিড চিপ প্ল্যাটফর্মের সম্ভাব্যতা সীমিত করতে পারে।
অন্ত্র-অন-এ-চিপ এবং হাইব্রিড-অন-এ-চিপ সংস্কৃতিতে মানব ক্রিপ্ট-ভিলাস অক্ষের সম্পূর্ণ-স্কেল পুনর্গঠন সম্পূর্ণরূপে প্রতিষ্ঠিত হয়নি। যেহেতু মরফোজেনেসিস একটি এপিথেলিয়াল মনোলেয়ার থেকে শুরু হয়, তাই 3D মাইক্রোআর্কিটেকচারগুলি জনসংখ্যার কাছাকাছি ক্রিপ্টোলজিক্যাল বৈশিষ্ট্যের অনুরূপ বৈশিষ্ট্য প্রদান করে না। মাইক্রোইঞ্জিনিয়ারযুক্ত 3D এপিথেলিয়ামের বেসাল ক্রিপ্ট ডোমেন, ক্রিপ্ট এবং ভিলাস অঞ্চলগুলি স্পষ্টভাবে চিহ্নিত করা হয়নি। যদিও চিপের উচ্চতর উপরের চ্যানেলগুলি মাইক্রোইঞ্জিনিয়ারড এপিথেলিয়ামের উচ্চতা বৃদ্ধির দিকে পরিচালিত করে, সর্বোচ্চ উচ্চতা এখনও 300-400 সীমাবদ্ধ রয়েছে। es যথাক্রমে ~135 µm এবং ~ 400 µm, এবং ছোট অন্ত্রের ভিলির উচ্চতা ~600 µm41।
ইমেজিং দৃষ্টিকোণ থেকে, 3D মাইক্রোআর্কিটেকচারের সুপার-রেজোলিউশন ইমেজিং একটি চিপের অন্ত্রের মধ্যে সীমাবদ্ধ হতে পারে, যেহেতু অবজেক্টিভ লেন্স থেকে এপিথেলিয়াল স্তর পর্যন্ত প্রয়োজনীয় কাজের দূরত্ব কয়েক মিলিমিটারের ক্রমানুসারে। এই সমস্যাটি কাটিয়ে উঠতে, একটি দূরবর্তী উদ্দেশ্যের প্রয়োজন হতে পারে। উপরন্তু, উচ্চ স্তরের প্রস্তুতির জন্য উচ্চ মাত্রার ইমেজিং ব্যবস্থার প্রয়োজন হয়। PDMS এর। উপরন্তু, যেহেতু একটি চিপে অন্ত্রের স্তর-দ্বারা-স্তর মাইক্রোফ্যাব্রিকেশন প্রতিটি স্তরের মধ্যে স্থায়ী আনুগত্য জড়িত, তাই এপিথেলিয়াল স্তরের পৃষ্ঠের গঠন পরীক্ষা করার জন্য উপরের স্তরটি খোলা বা অপসারণ করা অত্যন্ত চ্যালেঞ্জিং। উদাহরণস্বরূপ, একটি স্ক্যানিং ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপ (SEM) ব্যবহার করে।
PDMS-এর হাইড্রোফোবিসিটি হাইড্রোফোবিক ছোট অণু নিয়ে কাজ করার জন্য মাইক্রোফ্লুইডিক-ভিত্তিক গবেষণায় একটি সীমিত কারণ হয়ে দাঁড়িয়েছে, যেহেতু PDMS এই ধরনের হাইড্রোফোবিক অণুগুলিকে বিশেষভাবে শোষণ করতে পারে না। PDMS-এর বিকল্পগুলি অন্যান্য পলিমারিক পদার্থের সাথে বিবেচনা করা যেতে পারে। বিকল্পভাবে, PDMS-এর সাথে পৃষ্ঠতলের পরিবর্তন (PDMS) বা সারফেস 4-এর পরিবর্তন ene glycol) 43 ) হাইড্রোফোবিক অণুর শোষণ কমানোর জন্য বিবেচনা করা যেতে পারে।
অবশেষে, আমাদের পদ্ধতিটি একটি উচ্চ-থ্রুপুট স্ক্রীনিং বা "এক-আকার-ফিট-অল" ব্যবহারকারী-বান্ধব পরীক্ষামূলক প্ল্যাটফর্ম প্রদানের পরিপ্রেক্ষিতে ভালভাবে চিহ্নিত করা হয়নি। বর্তমান প্রোটোকলের জন্য মাইক্রোডিভাইস প্রতি একটি সিরিঞ্জ পাম্প প্রয়োজন, যা একটি CO2 ইনকিউবেটরে স্থান নেয় এবং বৃহৎ মাপের পরীক্ষা-নিরীক্ষা প্রতিরোধ করে। এই সীমাবদ্ধতাটি উল্লেখযোগ্যভাবে উন্নত করা যেতে পারে, স্কেলওয়েলের 6-9 সংস্কৃতির উন্নতির জন্য। , বা 384-ওয়েল ছিদ্রযুক্ত সন্নিবেশ যা ক্রমাগত পুনরায় পূরণ এবং বেসোলেটারাল মিডিয়া অপসারণের অনুমতি দেয়)।
ভিট্রোতে মানুষের অন্ত্রের এপিথেলিয়ামের 3D মরফোজেনেসিস প্ররোচিত করার জন্য, আমরা একটি লুমেন-ক্যাপিলারি ইন্টারফেস তৈরি করতে দুটি সমান্তরাল মাইক্রোচ্যানেল এবং এর মধ্যে একটি ইলাস্টিক ছিদ্রযুক্ত ঝিল্লি ধারণকারী একটি মাইক্রোফ্লুইডিক চিপ অন্ত্রের ডিভাইস ব্যবহার করেছি। আমরা একটি একক-চ্যানেল মাইক্রোফ্লুয়েড ডিভাইসের ব্যবহারও প্রদর্শন করি যা ক্রমাগত মাইক্রোফ্লুয়েড যন্ত্রের সাহায্যে ব্যাবহার করে। ট্রান্সওয়েল ইনসার্টে উত্থিত পোলারাইজড এপিথেলিয়াল স্তর। উভয় প্ল্যাটফর্মেই, বিভিন্ন মানব অন্ত্রের এপিথেলিয়াল কোষের মরফোজেনেসিস বেসোলেটারাল কম্পার্টমেন্ট থেকে মরফোজেন বিরোধীদের অপসারণের জন্য প্রবাহের দিকনির্দেশক ম্যানিপুলেশন প্রয়োগ করে প্রদর্শন করা যেতে পারে। সম্পূর্ণ পরীক্ষামূলক পদ্ধতি (চিত্র 1) পাঁচটি মাইক্রোওয়েলের অংশ নিয়ে গঠিত। চিপ (পদক্ষেপ 1-5; বক্স 1), (ii) অন্ত্রের এপিথেলিয়াল কোষ (Caco-2 কোষ) বা মানুষের অন্ত্রের অর্গানয়েড তৈরি;বক্স 2-5), (iii) অন্ত্রের চিপস বা হাইব্রিড চিপগুলিতে অন্ত্রের এপিথেলিয়াল কোষের সংস্কৃতি (ধাপ 6-9), (iv) ভিট্রোতে 3D মরফোজেনেসিস আনয়ন (ধাপ 10) এবং (v) ) 3D এপিথেলিয়ালকে বৈশিষ্ট্যযুক্ত করার জন্য (উপযুক্ত গ্রুপ 1-2-এর নীচের মাইক্রোস্ট্রাকচার) 1-2-4-এর জন্য উপযুক্ত গ্রুপের নিয়ন্ত্রণ। স্থানিক, অস্থায়ী, শর্তসাপেক্ষ, বা পদ্ধতিগত নিয়ন্ত্রণের সাথে এপিথেলিয়াল মরফোজেনেসিস তুলনা করে ইন ভিট্রো মরফোজেনেসিসের কার্যকারিতা যাচাই করার জন্য ডিজাইন করা হয়েছিল।
আমরা দুটি ভিন্ন সংস্কৃতি প্ল্যাটফর্ম ব্যবহার করেছি: স্ট্রেইট চ্যানেল বা ননলাইনার কনভল্যুটেড চ্যানেল সহ অন্ত্র-অন-এ-চিপ, বা একটি মাইক্রোফ্লুইডিক ডিভাইসে ট্রান্সওয়েল (TW) সন্নিবেশ ধারণকারী হাইব্রিড চিপ, বক্স 1-এ বর্ণিত হিসাবে তৈরি করা হয়েছে, এবং ধাপ 1 -5 "ডিভাইস ফ্যাব্রিকেশন" একটি একক ইচিপিচিপি তৈরির প্রধান ধাপগুলি দেখায়। lial Cells" এই প্রোটোকলে ব্যবহৃত কোষের উৎস (Caco-2 বা মানুষের অন্ত্রের অর্গানয়েড) এবং সংস্কৃতি পদ্ধতির ব্যাখ্যা করে। "ইন ভিট্রো মরফোজেনেসিস" সামগ্রিক পদক্ষেপগুলি দেখায় যেখানে Caco-2 বা অর্গানয়েড থেকে প্রাপ্ত এপিথেলিয়াল কোষগুলি একটি অন্ত্রের চিপে বা ট্রান্সওয়েল ইনসার্টেড অফ ট্রান্সহেইব্রিসড ইনসার্টেড অফ মোর্ফোজেন দ্বারা সংষ্কৃত হয়। একটি বৈশিষ্ট্যযুক্ত এপিথেলিয়াল কাঠামোর গঠন৷ প্রতিটি তীরের নীচে প্রোগ্রামের ধাপ নম্বর বা বাক্স নম্বর প্রদর্শিত হয়৷ অ্যাপ্লিকেশনটি কীভাবে প্রতিষ্ঠিত অন্ত্রের এপিথেলিয়াল স্তরগুলি ব্যবহার করা যেতে পারে তার উদাহরণগুলি প্রদান করে, উদাহরণস্বরূপ, কোষের পার্থক্য বৈশিষ্ট্যে, অন্ত্রের শারীরবৃত্তীয় অধ্যয়ন, হোস্ট-মাইক্রোবায়োম বাস্তুতন্ত্রের প্রতিষ্ঠা, এবং রোগের মডেলিং-এ ফ্লু-মডেল ফ্লু-ইমেজিং ইমেজ দেখায়৷ অ্যাক্টিন এবং MUC2 অন্ত্রের চিপে উত্পন্ন 3D Caco-2 এপিথেলিয়াল স্তরে প্রকাশ করা হয়েছে৷ MUC2 সংকেত গবলেট কোষে উপস্থিত রয়েছে এবং মিউকোসাল পৃষ্ঠ থেকে নিঃসৃত শ্লেষ্মা রয়েছে৷ অন্ত্রের ফিজিওলজিতে ফ্লুরোসেন্ট চিত্রগুলি দেখায় যে সিয়ালিক অ্যাসিড এবং এন-অ্যাসিটেসিল অ্যাসিডের সাহায্যে শ্লেষ্মা তৈরি হয়৷ in.“হোস্ট-মাইক্রোব কো-কালচারস”-এ দুটি ওভারল্যাপিং চিত্র একটি চিপে অন্ত্রে প্রতিনিধি হোস্ট-মাইক্রোবায়োম সহ-সংস্কৃতি দেখায়। বাম প্যানেলে E. coli-এর সহ-সংস্কৃতি দেখায় যা মাইক্রোইঞ্জিনিয়ারযুক্ত 3D Caco-2-এর সাথে সবুজ ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন (GFP) প্রকাশ করে। 3D Caco-2 এপিথেলিয়াল কোষ, F-actin (লাল) এবং নিউক্লিয়াস (নীল) সহ ইমিউনোফ্লুরোসেন্স স্টেনিং দ্বারা অনুসরণ করা হয়। রোগের মডেলিং ব্যাকটেরিয়া অ্যান্টিজেন (যেমন, লাইপোপলিস্যাকরিড, পিএমসিবি, এলপিএমসি) এবং শারীরবৃত্তীয় চ্যালেঞ্জের অধীনে অন্ত্রের প্রদাহ চিপগুলিতে সুস্থ বনাম ফুটো অন্ত্রকে চিত্রিত করে।সবুজ)। Caco-2 কোষগুলিকে একটি 3D এপিথেলিয়াল স্তর স্থাপনের জন্য সংস্কৃত করা হয়েছিল। স্কেল বার, 50 µm। নীচের সারিতে চিত্র: "কোষের পার্থক্য" রেফারেন্স থেকে অনুমতি নিয়ে অভিযোজিত।অক্সফোর্ড ইউনিভার্সিটি প্রেস;Ref.5 থেকে অনুমতি নিয়ে পুনরুত্পাদন করা হয়েছে।এনএএস;"হোস্ট-মাইক্রোব কো-কালচার" রেফ.3 থেকে অনুমতি নিয়ে অভিযোজিত।এনএএস;রেফারেন্স থেকে অনুমতি নিয়ে অভিযোজিত "ডিজিজ মডেলিং"।এনএএস
অন্ত্র-অন-চিপ এবং হাইব্রিড চিপ উভয়ই PDMS প্রতিলিপি ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল যা সিলিকন ছাঁচ থেকে নরম লিথোগ্রাফি 1,44 দ্বারা ভেঙে ফেলা হয়েছিল এবং SU-8 দিয়ে প্যাটার্ন করা হয়েছিল। প্রতিটি চিপের মাইক্রোচ্যানেলগুলির নকশা হাইড্রোডাইনামিকস যেমন শিয়ার স্ট্রেস এবং হাইড্রোডাইনামিক ডিজাইন, থিম-1, 1,44-এর মতো হাইড্রোডাইনামিক্স বিবেচনা করে নির্ধারিত হয়। ডেটা চিত্র 1a), যা দুটি সমন্বিত সমান্তরাল সোজা মাইক্রোচ্যানেলের সমন্বয়ে গঠিত, একটি জটিল অন্ত্র-অন-এ-চিপ (এক্সটেন্ডেড ডেটা চিত্র 1b) তে বিকশিত হয়েছে যাতে বর্ধিত তরল বসবাসের সময়, ননলাইনার প্রবাহ প্যাটার্ন এবং মাল্টিএক্স 2 কোষের (F2-F2) বর্ধিতকরণের জন্য বাঁকা মাইক্রোচ্যানেলের একটি জোড়া রয়েছে। আরও জটিল অন্ত্রের বায়োমেকানিক্স পুনরায় তৈরি করা দরকার, জটিল অন্ত্র-অন-এ-চিপগুলি বেছে নেওয়া যেতে পারে। আমরা প্রমাণ করেছি যে জটিল অন্ত্র-চিপও 3D মরফোজেনেসিসকে দৃঢ়ভাবে প্ররোচিত করে একই সময় ফ্রেমে মূল অন্ত্র-চিপের তুলনায় একই মাত্রার এপিথেলিয়াল বৃদ্ধির সাথে, নির্বিশেষে সংস্কৃত এবং 3-ডি-কোষের জটিল টাইপ-এর জন্য সংস্কৃত এবং 3D কোষের গঠনের জন্য। চিপ অন্ত্রের নকশাগুলি বিনিময়যোগ্য। পিডিএমএস প্রতিলিপিগুলি সিলিকন মোল্ডে SU-8 প্যাটার্নের সাথে নিরাময় করা হয়েছে যা ডিমোল্ডিংয়ের পরে নেতিবাচক বৈশিষ্ট্য সরবরাহ করে (চিত্র।2a) একটি চিপে অন্ত্র তৈরি করার জন্য, প্রস্তুত উপরের PDMS স্তরটি ক্রমান্বয়ে একটি ছিদ্রযুক্ত PDMS ফিল্মের সাথে বন্ধন করা হয়েছিল এবং তারপরে একটি করোনা ট্রিটার (চিত্র 2b–f) ব্যবহার করে অপরিবর্তনীয় বন্ধনের মাধ্যমে নীচের PDMS স্তরের সাথে সারিবদ্ধ করা হয়েছিল। হাইব্রিড চিপগুলি তৈরি করতে সিঙ্গেল-ডিএমএস-ফ্লুয়েড গ্লাস তৈরি করা হয়েছিল। আইডিক ডিভাইস যা ট্রান্সওয়েল সন্নিবেশ (চিত্র 2h এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র 2) মিটমাট করতে পারে। PDMS রেপ্লিকা এবং গ্লাসের পৃষ্ঠকে অক্সিজেন প্লাজমা বা করোনা চিকিত্সার মাধ্যমে বন্ধন প্রক্রিয়াটি সঞ্চালিত হয়। সিলিকন টিউবের সাথে সংযুক্ত মাইক্রোফ্যাব্রিকেটেড ডিভাইসের জীবাণুমুক্তকরণের পরে, সিলিকন সেটআপের জন্য প্রস্তুত করা হয়েছিল। হিলিয়াম (চিত্র 2g)।
a, SU-8 প্যাটার্নযুক্ত সিলিকন ছাঁচ থেকে PDMS অংশগুলির প্রস্তুতির পরিকল্পিত চিত্র। অপরিশোধিত PDMS দ্রবণটি একটি সিলিকন ছাঁচে (বামে) ঢেলে দেওয়া হয়েছিল, 60 ডিগ্রি সেন্টিগ্রেড (মাঝামাঝি) তাপমাত্রায় নিরাময় করা হয়েছিল এবং (ডানদিকে) ধ্বংস করা হয়েছিল। ভেঙে ফেলা PDMS টুকরো টুকরো করে কেটে নেওয়া হয়েছিল এবং PDMS স্তরের ফটোগ্রাফ তৈরি করার জন্য আরও পরিষ্কার করা হয়েছিল। PDMS ছিদ্রযুক্ত ঝিল্লি তৈরি করতে ব্যবহৃত সিলিকন ছাঁচের, উপরের এবং নীচের PDMS উপাদানগুলির ফটোগ্রাফের একটি সিরিজ এবং একত্রিত অন-চিপ অন্ত্রের ডিভাইস। যেমন, উপরের, ঝিল্লি এবং নীচের PDMS উপাদানগুলির প্রান্তিককরণের পরিকল্পিত। প্রতিটি স্তরকে অপরিবর্তিত বা প্ল্যাকম্যাটিক ট্রিটমেন্ট দ্বারা স্থির করা হয়। ut-on-a-chip ডিভাইসটি সুপারইমপোজড কনভল্যুটেড মাইক্রোচ্যানেল এবং ভ্যাকুয়াম চেম্বার।g, মাইক্রোফ্লুইডিক সেল কালচারের জন্য গাট-অন-এ-চিপের সেটআপ। একটি সিলিকন টিউব এবং সিরিঞ্জের সাহায্যে একত্রিত একটি চিপে গড়া অন্ত্রটি একটি কভারস্লিপে স্থাপন করা হয়েছিল। ডিভাইসটি ডিসট্রিপ 5-এর ডিসট্রিপ 5-এর উপর স্থাপন করা হয়েছিল। সিলিকন tube.h বন্ধ করতে ব্যবহৃত হয়, হাইব্রিড চিপ তৈরির ভিজ্যুয়াল স্ন্যাপশট এবং হাইব্রিড চিপস ব্যবহার করে 3D মরফোজেনেসিস। ট্রান্সওয়েল ইনসার্টগুলি স্বাধীনভাবে অন্ত্রের এপিথেলিয়াল কোষের 2D মনোলেয়ারের সংস্কৃতিতে ঢোকানো হয়েছিল। ট্রান্সওয়েল সন্নিবেশে প্রতিষ্ঠিত সেল স্তরের নীচে মাইক্রোচ্যানেলের মাধ্যমে। স্কেল বার, 1 সেমি.ঘ. রেফারেন্সের অনুমতি নিয়ে পুনরায় মুদ্রিত।4।এলসেভিয়ার।
এই প্রোটোকলে, Caco-2 সেল লাইন এবং অন্ত্রের অর্গানয়েডগুলি এপিথেলিয়াল উত্স হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল (চিত্র 3a)। উভয় ধরণের কোষই স্বাধীনভাবে সংষ্কৃত হয়েছিল (বক্স 2 এবং বক্স 5) এবং অন-চিপ অন্ত্র বা ট্রান্সওয়েল সন্নিবেশের ECM-কোটেড মাইক্রোচ্যানেলগুলি বীজ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। (প্যাসেজ 10 এবং 50 এর মধ্যে) টি-ফ্লাস্কে ট্রাইপসিনাইজেশন ফ্লুইড (বক্স 2) দ্বারা বিচ্ছিন্ন কোষ সাসপেনশন প্রস্তুত করার জন্য সংগ্রহ করা হয়। অন্ত্রের বায়োপসি বা সার্জিক্যাল রিসেকশন থেকে মানব অন্ত্রের অর্গানয়েডগুলিকে ম্যাট্রিজেল স্ক্যাফোল্ড গম্বুজে 24-ওয়েল-ওয়েল সাপোর্ট করার জন্য প্রয়োজনীয় প্ল্যাক-ওয়েল প্ল্যাসফোল্ড ধারণ করা হয়। যেমন Wnt, R-spondin, এবং Noggin) এবং বক্স 3-এ বর্ণিত বৃদ্ধির কারণগুলি প্রতি অন্য দিনে পরিপূরক করা হয়েছিল যতক্ষণ না অর্গানয়েডগুলি ~500 µm ব্যাস পর্যন্ত বৃদ্ধি পায়। সম্পূর্ণভাবে বেড়ে ওঠা অর্গানয়েডগুলি সংগ্রহ করা হয় এবং অন্ত্রে বীজ বপনের জন্য একক কোষে বিচ্ছিন্ন করা হয় বা ট্রান্সওয়েল বিভিন্ন রোগের সূচনা করা হয়েছে (এটি পূর্ববর্তী রোগের 500 পৃষ্ঠায় আমরা রিপোর্ট করতে পারি)। টাইপ 12,13 (যেমন আলসারেটিভ কোলাইটিস, ক্রোনস ডিজিজ, কোলোরেক্টাল ক্যান্সার, বা স্বাভাবিক দাতা), ক্ষত স্থান (যেমন, ক্ষত বনাম অ-ক্ষত এলাকা) এবং ট্র্যাক্টে গ্যাস্ট্রোইনটেস্টাইনাল অবস্থান (যেমন, ডুওডেনাম, জেজুনাম, ইলিয়াম, সেকাম, কোলন বা মলদ্বার)। আমরা একটি অপ্টিমাইজড কোকোলোয়েড বা কোলকোলয়েডের জন্য একটি অপ্টিমাইজড কোলাইটিস প্রদান করি। সাধারণত ছোট অন্ত্রের অর্গানয়েডের তুলনায় মরফোজেনগুলির উচ্চ ঘনত্বের প্রয়োজন হয়।
a, অন্ত্রের চিপে অন্ত্রের মরফোজেনেসিস আনয়নের জন্য কার্যপ্রবাহ। Caco-2 মানব অন্ত্রের এপিথেলিয়াম এবং অন্ত্রের অর্গানয়েডগুলি এই প্রোটোকলটিতে 3D মরফোজেনেসিস প্রদর্শনের জন্য ব্যবহার করা হয়। বিচ্ছিন্ন এপিথেলিয়াল কোষগুলি প্রস্তুতকৃত অন্ত্রে-অন-এ-চিপসেটেড সেল (অ্যাটাচড প্রিপারেশন) এবং সিপসেটেড ডিভাইসে সিড করা হয়। ) 0 (D0) দিনে PDMS ছিদ্রযুক্ত ঝিল্লিতে, apical (AP) প্রবাহ শুরু হয় এবং প্রথম 2 দিন ধরে বজায় রাখা হয় (ফ্লো, AP, D0-D2)। বেসোলেটরাল (BL) প্রবাহও চক্রীয় প্রসারিত গতির সাথে শুরু হয় (প্রসারিত, প্রবাহ, AP এবং BL) যখন 23-এ সম্পূর্ণ হয়। মাইক্রোফ্লুইডিক কালচারের 5 দিন পর স্বতঃস্ফূর্তভাবে লাল (মরফোজেনেসিস, D5)। ফেজ কনট্রাস্ট ইমেজগুলি প্রতিটি পরীক্ষামূলক ধাপ বা সময় বিন্দুতে Caco-2 কোষের প্রতিনিধিত্বমূলক রূপবিদ্যা দেখায় (বার গ্রাফ, 100 µm)। চারটি পরিকল্পিত ডায়াগ্রাম চিত্রিত করে গিউটশের ডানদিকের ক্যাসকেডের অনুরূপ ক্যাসকেডকে চিত্রিত করে। তরল প্রবাহ। -অ্যাক্টিন (সবুজ) এবং নিউক্লিয়াস (নীল) অন্ত্রের চিপগুলিতে এপিথেলিয়াল কোষের ইমিউনোফ্লুরেসেন্স কনফোকাল ভিজ্যুয়ালাইজেশন। মাঝারি পরিকল্পিত দিকে নির্দেশ করা তীরগুলি প্রতিটি কনফোকাল ভিউয়ের জন্য ফোকাল প্লেনের অবস্থান নির্দেশ করে। 13. ইনসেট (উপরের ডানদিকে) প্রদত্ত চিত্রের উচ্চ বিস্তৃতি দেখায়। যেমন, 7.f দিনে নেওয়া অন্ত্রে অর্গানয়েড 3D এপিথেলিয়ামের ডিআইসি ফটোমাইক্রোগ্রাফ, স্টেম সেলের জন্য মার্কার দেখানো ইমিউনোফ্লোরেসেন্স চিত্রগুলি ওভারলেড (LGR5;ম্যাজেন্টা), গবলেট কোষ (MUC2; সবুজ), এফ-অ্যাক্টিন (ধূসর) এবং নিউক্লিয়াস (সায়ান) অন্ত্রের চিপগুলিতে যথাক্রমে (বাম) এবং 13-দিনের (মধ্যম) অর্গানয়েড এপিথেলিয়াল স্তরে জন্মায়। এছাড়াও বর্ধিত ডেটা চিত্র 3 দেখুন, যা LGR2 সিগন্যাল সিগন্যাল সিগন্যাল 5 সিগন্যাল MU সিগন্যাল ছাড়াই দেখাচ্ছে। কালচারের ১৩তম দিনে সেলমাস্ক ডাই (ডান) দিয়ে প্লাজমা মেমব্রেনে দাগ দিয়ে চিপে অন্ত্রে স্থাপিত 3D অর্গানয়েড এপিথেলিয়ামের ইথেলিয়াল মাইক্রোস্ট্রাকচার (ডানদিকে)। অন্যথায় বলা না থাকলে স্কেল বার 50 μm।অক্সফোর্ড ইউনিভার্সিটি প্রেস;গ রেফারেন্স থেকে অনুমতি নিয়ে অভিযোজিত.2.অক্সফোর্ড ইউনিভার্সিটি প্রেস;e এবং f রেফারেন্স দ্বারা অনুমতি সহ অভিযোজিত। 12 ক্রিয়েটিভ কমন্স লাইসেন্স CC BY 4.0 এর অধীনে।
একটি চিপে অন্ত্রে, সফল ECM আবরণের জন্য PDMS ছিদ্রযুক্ত ঝিল্লির হাইড্রোফোবিক পৃষ্ঠকে সংশোধন করা প্রয়োজন৷ এই প্রোটোকলটিতে, আমরা PDMS ঝিল্লির হাইড্রোফোবিসিটি সংশোধন করার জন্য দুটি ভিন্ন পদ্ধতি প্রয়োগ করি৷ Caco-2 কোষের সংস্কৃতির জন্য, পৃষ্ঠতলের সক্রিয়করণ দ্বারা পৃষ্ঠতলের হাইড্রোফোবিসিটি এককভাবে হ্রাস করা হয়েছিল। ECM আবরণ করুন এবং PDMS ঝিল্লির সাথে Caco-2 কোষ সংযুক্ত করুন। যাইহোক, অর্গানয়েড এপিথেলিয়ামের মাইক্রোফ্লুইডিক সংস্কৃতির জন্য রাসায়নিক-ভিত্তিক পৃষ্ঠ ফাংশনালাইজেশনের প্রয়োজন হয় যাতে ইসিএম প্রোটিনের কার্যকরী জমা হয়। পৃষ্ঠ এবং তারপর বিচ্ছিন্ন অর্গানয়েড এপিথেলিয়ামে প্রবর্তন করা হয়। কোষগুলি সংযুক্ত করার পরে, মাইক্রোফ্লুইডিক কোষ সংস্কৃতি শুধুমাত্র মাধ্যমটিকে উপরের মাইক্রোচ্যানেলে পারফিউজ করে শুরু হয় যতক্ষণ না কোষগুলি একটি সম্পূর্ণ মনোলেয়ার তৈরি করে, যখন নীচের মাইক্রোচ্যানেলটি স্থির অবস্থা বজায় রাখে। পৃষ্ঠের সক্রিয়করণের জন্য এই অপ্টিমাইজড পদ্ধতি এবং ইসিএম আবরণটি 3 এপিথেলিয়ামে সংযুক্ত করতে সক্ষম করে। PDMS পৃষ্ঠ।
ট্রান্সওয়েল কালচারে কোষের বীজ বপনের আগে ECM আবরণেরও প্রয়োজন হয়;যাইহোক, ট্রান্সওয়েল কালচারে ছিদ্রযুক্ত সন্নিবেশের পৃষ্ঠকে সক্রিয় করার জন্য জটিল প্রিট্রিটমেন্ট পদক্ষেপের প্রয়োজন হয় না। ট্রান্সওয়েল ইনসার্টে Caco-2 কোষের বৃদ্ধির জন্য, ছিদ্রযুক্ত সন্নিবেশে ECM আবরণ বিচ্ছিন্ন Caco-2 কোষের সংযুক্তিকে ত্বরান্বিত করে (<1 ঘন্টা) এবং টাইট জংশন বাধা গঠন (<1-2 টি কালচার বা ট্রান্সওয়েল ইনসার্টে বা 1-2 দিনের মধ্যে)। ECM-প্রলিপ্ত সন্নিবেশ, ঝিল্লি পৃষ্ঠের সাথে সংযুক্ত (<3 h) এবং অর্গানয়েডগুলি বাধা অখণ্ডতা সহ একটি সম্পূর্ণ মনোলেয়ার তৈরি না হওয়া পর্যন্ত রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়। হাইব্রিড চিপ ব্যবহার ছাড়াই 24-ওয়েল প্লেটে ট্রান্সওয়েল সংস্কৃতিগুলি সঞ্চালিত হয়।
ইন ভিট্রো 3D মরফোজেনেসিস একটি প্রতিষ্ঠিত এপিথেলিয়াল স্তরের বেসোলেটারাল দিকে তরল প্রবাহ প্রয়োগ করে শুরু করা যেতে পারে৷ একটি চিপের অন্ত্রে, এপিথেলিয়াল মরফোজেনেসিস শুরু হয়েছিল যখন মাধ্যমটি উপরের এবং নীচের মাইক্রোচ্যানেলে পারফিউজ করা হয়েছিল (চিত্র 3a,)। পূর্বে বর্ণনা করা হয়েছে যে ফ্লুইড ফ্লোতে ক্রিটিকাল ফ্লো-এর বর্ণনা দেওয়া হয়েছে। দিকনির্দেশক নিঃসৃত মরফোজেন ইনহিবিটরগুলির ক্রমাগত অপসারণের জন্য বগি৷ ছিদ্রযুক্ত ঝিল্লিতে আবদ্ধ কোষগুলিতে পর্যাপ্ত পুষ্টি এবং সিরাম সরবরাহ করতে এবং লুমিনাল শিয়ার স্ট্রেস তৈরি করতে, আমরা সাধারণত একটি চিপের অন্ত্রে দ্বৈত প্রবাহ প্রয়োগ করি৷ হাইব্রিড চিপগুলিতে, ট্রান্সওয়েল সন্নিবেশিত হয়, যার মধ্যে মোচিলিথলি থাকে৷ মাইক্রোচ্যানেলের মাধ্যমে ছিদ্রযুক্ত ট্রান্সওয়েল সন্নিবেশের বেসোল্যাটারাল সাইডের নিচে মাঝারি প্রয়োগ করা হয়েছিল। উভয় কালচার প্ল্যাটফর্মে বেসোলেটারাল প্রবাহ শুরু হওয়ার 3-5 দিন পরে অন্ত্রের মরফোজেনেসিস ঘটেছিল।
মাইক্রোইঞ্জিনিয়ারড 3D এপিথেলিয়াল স্তরগুলির রূপগত বৈশিষ্ট্যগুলি ফেজ কনট্রাস্ট মাইক্রোস্কোপি, ডিফারেনশিয়াল ইন্টারফারেন্স কনট্রাস্ট (ডিআইসি) মাইক্রোস্কোপি, এসইএম, বা ইমিউনোফ্লোরেসেন্স কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি (চিত্র 3 এবং 4) সহ বিভিন্ন ইমেজিং পদ্ধতি প্রয়োগ করে বিশ্লেষণ করা যেতে পারে। 3D এপিথেলিয়াল স্তরগুলি। PDMS এবং পলিয়েস্টার ফিল্মের অপটিক্যাল স্বচ্ছতার কারণে, উভয় অন্ত্র-অন-এ-চিপ এবং হাইব্রিড চিপ প্ল্যাটফর্মগুলি ডিভাইসের বিভাগ বা বিচ্ছিন্নকরণের প্রয়োজন ছাড়াই সিটু ইমেজিং-এ রিয়েল-টাইম প্রদান করতে পারে। ইমিউনোফ্লুরোসেন্স ইমেজিং করার সময়, ফিগার, 4, 4, 3, 3, 4, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 1. % (wt/vol) paraformaldehyde (PFA), তারপরে Triton X-100 এবং 2% (wt/vol) ) বোভাইন সিরাম অ্যালবুমিন (BSA), ক্রমানুসারে। কোষের প্রকারের উপর নির্ভর করে, বিভিন্ন ফিক্সেটিভ, পারমিবিলাইজার এবং ব্লকিং এজেন্ট ব্যবহার করা যেতে পারে। প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলি কোষের উপর নির্ভরশীল, উচ্চ চিহ্নের উপর ভিত্তি করে কোষের চিহ্ন বা চিহ্নগুলি অনুসরণ করে। নিউক্লিয়াস (যেমন, 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) বা F-actin (যেমন, ফ্লুরোসেন্টলি লেবেলযুক্ত ফ্যালোইডিন) লক্ষ্য করে একটি কাউন্টারস্টেইন ডাই সহ সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি দ্বারা ed। ফ্লুরোসেন্স-ভিত্তিক লাইভ ইমেজিংও প্রোডাকশন সিটুতে (মিউকাস সিটু) সঞ্চালিত হতে পারে।1, "কোষের পার্থক্য" এবং "অন্ত্রের শারীরবিদ্যা"), মাইক্রোবিয়াল কোষের এলোমেলো উপনিবেশকরণ (চিত্র 1, "হোস্ট-অণুজীব সহ-সংস্কৃতি"), ইমিউন কোষের নিয়োগ (চিত্র 1, 'ডিজিজ মডেলিং') বা 3D এপিথেলিয়াল এবং 3D epithelial এবং 3D epithelial এবং modify, 3D এর কনট্যুরস। নীচের মাইক্রোচ্যানেল স্তর থেকে উপরের স্তরটিকে আলাদা করতে চিপের উপর অন্ত্র, যেমনটি রেফ-এ বর্ণনা করা হয়েছে। চিত্র 2-তে দেখানো হয়েছে, 3D এপিথেলিয়াল আকারবিদ্যা এবং সেইসাথে অ্যাপিক্যাল ব্রাশ বর্ডারে থাকা মাইক্রোভিলিকে SEM (চিত্র 3b) দ্বারা কল্পনা করা যেতে পারে। ডিফারেন্সিয়েশন মার্কারগুলির অভিব্যক্তি এই PCRNA-এর ক্ষেত্রে এককভাবে করা যেতে পারে। , অন্ত্রের চিপস বা হাইব্রিড চিপসে উত্থিত এপিথেলিয়াল কোষের 3D স্তরগুলি ট্রিপসিনাইজেশনের মাধ্যমে সংগ্রহ করা হয় এবং তারপর আণবিক বা জেনেটিক বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহার করা হয়।
a, একটি হাইব্রিড চিপে অন্ত্রের মরফোজেনেসিস আনয়নের জন্য ওয়ার্কফ্লো৷ একটি হাইব্রিড চিপ প্ল্যাটফর্মে 3D মরফোজেনেসিস প্রদর্শনের জন্য এই প্রোটোকলটিতে Caco-2 এবং অন্ত্রের অর্গানয়েডগুলি ব্যবহার করা হয়৷ বিচ্ছিন্ন এপিথেলিয়াল কোষগুলিকে প্রস্তুত করা হয়েছিল এবং ট্রান্সওয়েলের নীচে সংযোজিত কোষগুলিকে ট্রান্সওয়েল ঢোকানো হয়েছিল (দেখতে ট্রান্সওয়েল সংযোজন করা হয়েছে)। ট্রান্সওয়েল ইনসার্টে পলিয়েস্টার মেমব্রেন, সমস্ত কোষ স্থির অবস্থার (TW সংস্কৃতি) অধীনে সংষ্কৃত হয়েছিল। 7 দিন পর, এপিথেলিয়াল কোষের একটি 2D মনোলেয়ার ধারণকারী একটি একক ট্রান্সওয়েল সন্নিবেশ একটি হাইব্রিড চিপে একত্রিত করা হয়েছিল একটি বেসোলেটারাল ফ্লো (ফ্লো, বিএল), যা শেষ পর্যন্ত একটি মাইক্রোমোরজেন 3 ডি জেনারেশনের দিকে পরিচালিত করে। প্রতিটি পরীক্ষামূলক পদক্ষেপ বা সময় বিন্দুতে স্বাভাবিক দাতা (C103 লাইন) থেকে প্রাপ্ত মানব অঙ্গের এপিথেলিয়াল কোষের আকারগত বৈশিষ্ট্য দেখায়। উপরের স্তরের স্কিম্যাটিক্স প্রতিটি ধাপের জন্য পরীক্ষামূলক কনফিগারেশনকে চিত্রিত করে। বিভিন্ন Z অবস্থানে (উপর, মধ্য এবং নিম্ন;ডান পরিকল্পিত এবং সংশ্লিষ্ট ডটেড লাইন দেখুন)।স্থির ট্রান্সওয়েল (TW; সাদা ড্যাশড বক্সের মধ্যে ইনসেট) বনাম হাইব্রিড কম্পিস্টার্সিং 3ডি, অর্গানয়েড থেকে প্রাপ্ত এপিথেলিয়াল কোষের এফ-অ্যাক্টিন (সায়ান), নিউক্লিয়াস (ধূসর) সি, ফ্লুরোসেন্স কনফোকাল মাইক্রোগ্রাফ (3D কোণীয় দৃশ্য)। যথাক্রমে। 2D উল্লম্ব ক্রস-কাট ভিউগুলির একটি জোড়া (উপরের ডান কোণায় ইনসেট; "XZ") এছাড়াও 2D এবং 3D বৈশিষ্ট্যগুলি দেখায়। রেফারেন্সের অনুমতি নিয়ে 100 µm.c পুনঃমুদ্রিত।এলসেভিয়ার।
প্রচলিত স্থির সংস্কৃতির অবস্থার অধীনে একই কোষগুলিকে (Caco-2 বা অন্ত্রের অর্গানয়েড এপিথেলিয়াল কোষ) দ্বি-মাত্রিক মনোলেয়ারে সংস্কৃতি করে নিয়ন্ত্রণগুলি প্রস্তুত করা যেতে পারে। উল্লেখযোগ্যভাবে, মাইক্রোচ্যানেলগুলির সীমিত আয়তনের ক্ষমতার কারণে পুষ্টির ক্ষয় ঘটতে পারে (অর্থাৎ ~4 µL)। বেসোলেটারাল প্রবাহ প্রয়োগের পরেও তুলনা করা যেতে পারে।
নরম লিথোগ্রাফি প্রক্রিয়াটি একটি পরিষ্কার ঘরে সঞ্চালিত হওয়া উচিত। চিপের প্রতিটি স্তরের জন্য (উপরের এবং নীচের স্তর এবং ঝিল্লি) এবং হাইব্রিড চিপগুলির জন্য, পৃথক সিলিকন ওয়েফারগুলিতে বিভিন্ন ফটোমাস্ক ব্যবহার করা হয়েছিল এবং তৈরি করা হয়েছিল কারণ মাইক্রোচ্যানেলগুলির উচ্চতা আলাদা ছিল৷ উপরের এবং নীচের মাইক্রোচ্যানেলগুলির লক্ষ্য উচ্চতাগুলি 5µ0µ0p0µ0p এবং 5µ0p. m, যথাক্রমে। হাইব্রিড চিপের চ্যানেল টার্গেট উচ্চতা হল 200 µm।
অ্যাসিটোন সহ একটি থালায় একটি 3-ইঞ্চি সিলিকন ওয়েফার রাখুন৷ 30 সেকেন্ডের জন্য প্লেটটি আলতো করে ঘোরান, তারপর ওয়েফারটিকে বাতাসে শুকিয়ে দিন৷ ওয়েফারটিকে আইপিএ সহ একটি প্লেটে স্থানান্তর করুন, তারপর পরিষ্কার করার জন্য 30 সেকেন্ডের জন্য প্লেটটিকে ঘোরান৷
একটি পিরানহা দ্রবণ (হাইড্রোজেন পারক্সাইড এবং ঘনীভূত সালফিউরিক অ্যাসিডের মিশ্রণ, 1:3 (ভোল/ভোল)) ঐচ্ছিকভাবে সিলিকন ওয়েফার পৃষ্ঠ থেকে জৈব অবশিষ্টাংশগুলিকে সর্বাধিক অপসারণের জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে।
পিরানহা দ্রবণ অত্যন্ত ক্ষয়কারী এবং তাপ উৎপন্ন করে৷ অতিরিক্ত নিরাপত্তা সতর্কতা অবলম্বন করা প্রয়োজন৷ বর্জ্য নিষ্পত্তির জন্য, দ্রবণটিকে ঠান্ডা হতে দিন এবং একটি পরিষ্কার, শুকনো বর্জ্য পাত্রে স্থানান্তর করুন৷ গৌণ পাত্রে ব্যবহার করুন এবং বর্জ্য পাত্রে সঠিকভাবে লেবেল দিন৷ অনুগ্রহ করে আরও বিস্তারিত পদ্ধতির জন্য সুবিধার নিরাপত্তা নির্দেশিকা অনুসরণ করুন৷
ওয়েফারগুলিকে 10 মিনিটের জন্য একটি 200 ডিগ্রি সেলসিয়াস হট প্লেটে রেখে ডিহাইড্রেট করুন। ডিহাইড্রেশনের পরে, ওয়েফারটি ঠান্ডা হওয়ার জন্য বাতাসে পাঁচবার নাড়ানো হয়েছিল।
পরিষ্কার করা সিলিকন ওয়েফারের কেন্দ্রে ~10 গ্রাম ফটোরেসিস্ট SU-8 2100 ঢেলে দিন৷ ওয়েফারে সমানভাবে ফোটোরেসিস্ট ছড়িয়ে দিতে টুইজার ব্যবহার করুন৷ মাঝে মাঝে ওয়েফারটিকে একটি 65° সেন্টিগ্রেডের হট প্লেটে রাখুন যাতে ফটোরেসিস্ট কম আঠালো এবং ছড়িয়ে পড়া সহজ হয়৷ সরাসরি হটলেটে রাখবেন না৷
স্পিন আবরণ চালিয়ে ওয়েফারে SU-8 সমানভাবে বিতরণ করা হয়েছিল। 100 rpm/s এর ত্বরণে 500 rpm-এ প্রচারের জন্য SU-8-এর একটি আগত ঘূর্ণন প্রোগ্রাম করুন। চিপে অন্ত্রের উপরের স্তরের জন্য 500 µm উচ্চতা; নীচে "গুরুত্বপূর্ণ পদক্ষেপ" দেখুন) 1,200 rpm এ 300 rpm/s 30 সেকেন্ডের ত্বরণে সেট করা হয়েছে।
প্রধান স্পিন গতি সিলিকন ওয়েফারের SU-8 প্যাটার্নের লক্ষ্য বেধ অনুযায়ী সামঞ্জস্য করা যেতে পারে।
চিপে অন্ত্রের উপরের স্তরের জন্য 500 µm উচ্চতার SU-8 প্যাটার্ন তৈরি করতে, এই বাক্সের স্পিন আবরণ এবং নরম বেক ধাপগুলি (ধাপ 7 এবং 8) ক্রমানুসারে পুনরাবৃত্তি করা হয়েছিল (ধাপ 9 দেখুন) যাতে 250 µm এর দুটি স্তর তৈরি করা হয়, যা SU-8 এর পুরু স্তর এবং SU-8 এর পুরু স্তরটি যুক্ত করতে পারে। , 500 µm উঁচু একটি স্তর তৈরি করে।
SU-8 প্রলিপ্ত ওয়েফারগুলিকে 65 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 5 মিনিটের জন্য সাবধানে একটি হট প্লেটে রেখে ওয়েফারগুলিকে নরম বেক করুন, তারপরে সেটিংসটি 95 ডিগ্রি সেলসিয়াসে পরিবর্তন করুন এবং অতিরিক্ত 40 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করুন।
উপরের মাইক্রোচ্যানেলে SU-8 প্যাটার্নের 500 μm উচ্চতা অর্জন করতে, দুটি 250 μm পুরু SU-8 স্তর তৈরি করতে পদক্ষেপ 7 এবং 8 পুনরাবৃত্তি করুন।
ইউভি মাস্ক অ্যালাইনার ব্যবহার করে, ওয়েফারের এক্সপোজার সময় গণনা করতে প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে একটি ল্যাম্প পরীক্ষা করুন।
এক্সপোজারের সময় নির্ধারণ করার পরে, UV মাস্ক অ্যালাইনারের মাস্ক হোল্ডারে ফটোমাস্ক রাখুন এবং SU-8 প্রলিপ্ত ওয়েফারের উপর ফটোমাস্ক রাখুন।
UV বিচ্ছুরণ কমাতে সিলিকন ওয়েফারের SU-8 প্রলিপ্ত পাশে ফটোমাস্কের মুদ্রিত পৃষ্ঠটি সরাসরি রাখুন।
পূর্বনির্ধারিত এক্সপোজার সময়ের জন্য SU-8 প্রলিপ্ত ওয়েফার এবং ফটোমাস্ককে উল্লম্বভাবে 260 mJ/cm2 UV আলোতে প্রকাশ করুন (এই বাক্সের ধাপ 10 দেখুন)।
UV এক্সপোজারের পরে, SU-8-কোটেড সিলিকন ওয়েফারগুলিকে 5 মিনিটের জন্য 65°C এবং 95°C তাপমাত্রায় 15 মিনিটের জন্য প্রতিটি হট প্লেটে 200 μm উচ্চতা সহ প্যাটার্ন তৈরি করার জন্য বেক করা হয়েছিল। বেক-পরবর্তী সময়টি 95 °C থেকে 30 মিনিটের ফ্যাব্রিকেট প্যাটার্নের সাথে 5µ0 মিমি উচ্চতার সাথে প্রসারিত করুন।
বিকাশকারীকে একটি কাচের থালায় ঢেলে দেওয়া হয়, এবং বেকড ওয়েফারটি থালায় রাখা হয়৷ SU-8 বিকাশকারীর ভলিউম গ্লাস প্লেটের আকারের উপর নির্ভর করে পরিবর্তিত হতে পারে৷ সম্পূর্ণরূপে অপ্রকাশিত SU-8 অপসারণের জন্য পর্যাপ্ত SU-8 বিকাশকারী ব্যবহার করতে ভুলবেন না৷ উদাহরণস্বরূপ, 150 মিমি ব্যাসের একটি গ্লাস ডিশ ব্যবহার করার সময়, একটি 150 মিমি ব্যাসের গ্লাস 3-3 ধারণক্ষমতার ডিশ ব্যবহার করুন৷ মাঝে মাঝে মৃদু ঘূর্ণন সহ 25 মিনিটের জন্য ছাঁচ।
একটি পাইপেট ব্যবহার করে দ্রবণ স্প্রে করে IPA অনুসরণ করে ~10 মিলি তাজা ডেভেলপার দিয়ে উন্নত ছাঁচটি ধুয়ে ফেলুন।
ওয়েফারটিকে একটি প্লাজমা ক্লিনারে রাখুন এবং 1.5 মিনিটের জন্য অক্সিজেন প্লাজমা (বায়ুমণ্ডলীয় গ্যাস, লক্ষ্য চাপ 1 × 10−5 টর, শক্তি 125 ওয়াট) প্রকাশ করুন।
ওয়েফারটিকে একটি ভ্যাকুয়াম ডেসিকেটারে রাখুন যার ভিতরে একটি গ্লাস স্লাইড রয়েছে৷ ওয়েফার এবং স্লাইডগুলি পাশাপাশি রাখা যেতে পারে৷ যদি ভ্যাকুয়াম ডেসিকেটরটিকে একটি প্লেট দ্বারা কয়েকটি স্তরে ভাগ করা হয় তবে স্লাইডগুলিকে নীচের চেম্বারে এবং ওয়েফারগুলিকে উপরের চেম্বারে রাখুন৷ একটি গ্লাস স্লাইডে ফ্লুরোক্টাইল) সিলেন দ্রবণ এবং সিলানাইজেশনের জন্য ভ্যাকুয়াম প্রয়োগ করুন।
হিমায়িত Caco-2 কোষের একটি শিশি একটি 37°C জলের স্নানে গলিয়ে নিন, তারপর গলানো কোষগুলিকে একটি T75 ফ্লাস্কে স্থানান্তর করুন যাতে 37°C প্রিউর্মড Caco-2 মাঝারির 15 মিলি.
Caco-2 কোষগুলিকে ~90% সঙ্গমে পাস করতে, প্রথমে উষ্ণ Caco-2 মাঝারি, PBS, এবং 0.25% ট্রিপসিন/1 মিমি ইডিটিএ একটি 37°C জলের স্নানে।
ভ্যাকুয়াম অ্যাসপিরেশনের মাধ্যমে মাঝারি অ্যাসপিরেট করুন। ভ্যাকুয়াম অ্যাসপিরেশনের পুনরাবৃত্তি করে এবং তাজা পিবিএস যোগ করে 5 মিলি উষ্ণ পিবিএস দিয়ে কোষ দুবার ধুয়ে ফেলুন।