Nature.com পরিদর্শন করার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ.আপনি সীমিত CSS সমর্থন সহ একটি ব্রাউজার সংস্করণ ব্যবহার করছেন।সেরা অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি আপডেট করা ব্রাউজার ব্যবহার করার পরামর্শ দিই (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে সামঞ্জস্য মোড অক্ষম করুন)৷উপরন্তু, চলমান সমর্থন নিশ্চিত করার জন্য, আমরা স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়া সাইট দেখাই।
একবারে তিনটি স্লাইডের একটি ক্যারোজেল প্রদর্শন করে৷একবারে তিনটি স্লাইডের মধ্য দিয়ে যেতে পূর্ববর্তী এবং পরবর্তী বোতামগুলি ব্যবহার করুন, অথবা একটি সময়ে তিনটি স্লাইডের মধ্য দিয়ে যেতে শেষে স্লাইডার বোতামগুলি ব্যবহার করুন৷
রক্ত-মস্তিষ্কের বাধা এবং রক্ত-মস্তিষ্কের বাধা বায়োথেরাপিউটিক এজেন্টদের কেন্দ্রীয় স্নায়ুতন্ত্রের লক্ষ্যে পৌঁছাতে বাধা দেয়, যার ফলে স্নায়বিক রোগের কার্যকর চিকিত্সা বাধাগ্রস্ত হয়।ভিভোতে নতুন ব্রেন ট্রান্সপোর্টার আবিষ্কার করার জন্য, আমরা একটি T7 ফেজ পেপটাইড লাইব্রেরি প্রবর্তন করেছি এবং ইঁদুরের একটি ক্যানুলেটেড সচেতন বড় পুল মডেল ব্যবহার করে সিরিয়ালি রক্ত ​​​​এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (CSF) সংগ্রহ করেছি।চার রাউন্ড নির্বাচনের পরে নির্দিষ্ট ফেজ ক্লোনগুলি সিএসএফ-এ অত্যন্ত সমৃদ্ধ হয়েছিল।পৃথক প্রার্থীর পেপটাইডের পরীক্ষায় CSF-তে 1000-গুণেরও বেশি সমৃদ্ধি প্রকাশ পেয়েছে।চিহ্নিত উপন্যাস ট্রানজিট পেপটাইডের সাথে যুক্ত একটি BACE1 পেপটাইড ইনহিবিটর ব্যবহার করে সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে অ্যামাইলয়েড-β-এর মাত্রা 40% হ্রাস দ্বারা মস্তিষ্কে পেপটাইড-মধ্যস্থিত ডেলিভারির জৈব সক্রিয়তা নিশ্চিত করা হয়েছিল।এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে ভিভো ফেজ নির্বাচন পদ্ধতি দ্বারা চিহ্নিত পেপটাইডগুলি একটি থেরাপিউটিক প্রভাব সহ মস্তিষ্কে ম্যাক্রোমোলিকিউলগুলির সিস্টেমিক বিতরণের জন্য কার্যকর বাহন হতে পারে।
সেন্ট্রাল নার্ভাস সিস্টেম (সিএনএস) টার্গেটেড থেরাপি গবেষণা মূলত অপ্টিমাইজ করা ওষুধ এবং এজেন্টদের চিহ্নিত করার উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করেছে যেগুলি সিএনএস-টার্গেটিং বৈশিষ্ট্যগুলি প্রদর্শন করে, মস্তিষ্কে সক্রিয় ড্রাগ ডেলিভারি চালায় এমন প্রক্রিয়াগুলি আবিষ্কার করার জন্য কম প্রচেষ্টা সহ।এটি এখন পরিবর্তিত হতে শুরু করেছে কারণ ওষুধ সরবরাহ, বিশেষ করে বড় অণু, আধুনিক নিউরোসায়েন্স ড্রাগ বিকাশের একটি অবিচ্ছেদ্য অংশ।রক্ত-মস্তিষ্কের বাধা (BBB) ​​এবং রক্ত-মস্তিষ্কের বাধা (BCBB)1 সমন্বিত সেরিব্রোভাসকুলার ব্যারিয়ার সিস্টেম দ্বারা কেন্দ্রীয় স্নায়ুতন্ত্রের পরিবেশ ভালভাবে সুরক্ষিত, যা মস্তিষ্কে ওষুধ সরবরাহ করা কঠিন করে তোলে 1,2।এটি অনুমান করা হয় যে প্রায় সমস্ত বড় অণুর ওষুধ এবং 98% এরও বেশি ছোট অণুর ওষুধ মস্তিষ্ক থেকে বাদ দেওয়া হয়3।এই কারণেই নতুন মস্তিষ্কের পরিবহন ব্যবস্থা সনাক্ত করা খুবই গুরুত্বপূর্ণ যেগুলি সিএনএস 4,5-এ থেরাপিউটিক ওষুধের দক্ষ এবং নির্দিষ্ট ডেলিভারি প্রদান করে।যাইহোক, BBB এবং BCSFB ওষুধ সরবরাহের জন্য একটি দুর্দান্ত সুযোগও উপস্থাপন করে কারণ তারা মস্তিষ্কের সমস্ত কাঠামোর বিস্তৃত ভাস্কুলচারের মাধ্যমে প্রবেশ করে এবং প্রবেশ করে।সুতরাং, মস্তিষ্কে প্রসবের অ-আক্রমণাত্মক পদ্ধতিগুলি ব্যবহার করার বর্তমান প্রচেষ্টাগুলি মূলত অন্তঃসত্ত্বা BBB6 রিসেপ্টর ব্যবহার করে রিসেপ্টর-মিডিয়াটেড ট্রান্সপোর্ট (PMT) এর প্রক্রিয়ার উপর ভিত্তি করে।ট্রান্সফারিন রিসেপ্টর পাথওয়ে 7,8 ব্যবহার করে সাম্প্রতিক মূল অগ্রগতি সত্ত্বেও, উন্নত বৈশিষ্ট্য সহ নতুন ডেলিভারি সিস্টেমের আরও উন্নয়ন প্রয়োজন।এই লক্ষ্যে, আমাদের লক্ষ্য ছিল CSF পরিবহনের মধ্যস্থতা করতে সক্ষম পেপটাইডগুলি সনাক্ত করা, কারণ তারা নীতিগতভাবে সিএনএসে ম্যাক্রোমোলিকিউলস সরবরাহ করতে বা নতুন রিসেপ্টর পথ খোলার জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে।বিশেষ করে, সেরিব্রোভাসকুলার সিস্টেমের নির্দিষ্ট রিসেপ্টর এবং পরিবহনকারীরা (BBB এবং BSCFB) বায়োথেরাপিউটিক ওষুধের সক্রিয় এবং নির্দিষ্ট ডেলিভারির জন্য সম্ভাব্য লক্ষ্য হিসাবে কাজ করতে পারে।সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (CSF) হল কোরয়েড প্লেক্সাস (CS) এর একটি সিক্রেটরি প্রোডাক্ট এবং এটি subarachnoid স্পেস এবং ভেন্ট্রিকুলার স্পেস4 এর মাধ্যমে মস্তিষ্কের ইন্টারস্টিশিয়াল ফ্লুইডের সাথে সরাসরি যোগাযোগ করে।সম্প্রতি এটি দেখানো হয়েছে যে subarachnoid সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড অত্যধিকভাবে মস্তিষ্কের ইন্টারস্টিশিয়ামে ছড়িয়ে পড়ে।আমরা এই subarachnoid ইনফ্লো ট্র্যাক্ট ব্যবহার করে বা সরাসরি BBB এর মাধ্যমে প্যারেনকাইমাল স্পেস অ্যাক্সেস করার আশা করি।এটি অর্জনের জন্য, আমরা একটি শক্তিশালী ভিভো ফেজ নির্বাচন কৌশল প্রয়োগ করেছি যা আদর্শভাবে এই দুটি স্বতন্ত্র পথের যেকোনো একটি দ্বারা পরিবাহিত পেপটাইড সনাক্ত করে।
আমরা এখন সর্বোচ্চ লাইব্রেরি বৈচিত্র্যের সাথে প্রাথমিক নির্বাচন রাউন্ডগুলি নিরীক্ষণের জন্য উচ্চ থ্রুপুট সিকোয়েন্সিং (HTS) সহ CSF স্যাম্পলিং সহ ভিভো ফেজ ডিসপ্লে স্ক্রীনিং পদ্ধতির একটি ক্রমিক বর্ণনা করি।রক্ত দূষণ এড়াতে একটি স্থায়ীভাবে ইমপ্লান্ট করা বড় সিস্টারনা (সিএম) ক্যানুলা দিয়ে সচেতন ইঁদুরের স্ক্রীনিং করা হয়েছিল।গুরুত্বপূর্ণভাবে, এই পদ্ধতিটি সেরিব্রোভাসকুলার বাধা জুড়ে পরিবহন কার্যকলাপ সহ মস্তিষ্ক-টার্গেটিং এবং পেপটাইড উভয়কেই বেছে নেয়।আমরা তাদের ছোট আকারের (~ 60 এনএম) 10 এর কারণে T7 ফেজ ব্যবহার করেছি এবং পরামর্শ দিয়েছি যে তারা ভেসিকল পরিবহনের জন্য উপযুক্ত যা এন্ডোথেলিয়াল এবং/অথবা এপিথেলিয়াল-মেডুলা বাধার ট্রান্সসেলুলার ক্রসিংয়ের অনুমতি দেয়।চার রাউন্ড প্যানিংয়ের পরে, ফেজ জনসংখ্যাকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল যা ভিভো সিএসএফ সমৃদ্ধকরণ এবং সেরিব্রাল মাইক্রোভেসেল অ্যাসোসিয়েশনে শক্তিশালী দেখাচ্ছে।গুরুত্বপূর্ণভাবে, আমরা প্রদর্শন করে আমাদের অনুসন্ধানগুলি নিশ্চিত করতে সক্ষম হয়েছি যে পছন্দের এবং রাসায়নিকভাবে সংশ্লেষিত সেরা প্রার্থী পেপটাইডগুলি সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে প্রোটিন কার্গো পরিবহন করতে সক্ষম।প্রথমত, CNS-এর ফার্মাকোডাইনামিক প্রভাবগুলি BACE1 পেপটাইডের একটি ইনহিবিটরের সাথে একটি অগ্রণী ট্রানজিট পেপটাইডকে একত্রিত করে প্রতিষ্ঠিত হয়েছিল।ভিভো কার্যকরী স্ক্রীনিং কৌশলগুলি কার্যকর প্রোটিন কার্গো বাহক হিসাবে অভিনব মস্তিষ্কের পরিবহন পেপটাইডগুলিকে সনাক্ত করতে পারে তা প্রদর্শন করার পাশাপাশি, আমরা আশা করি একই ধরণের কার্যকরী নির্বাচন পদ্ধতিগুলিও নতুন মস্তিষ্কের পরিবহন পথ সনাক্তকরণে গুরুত্বপূর্ণ হয়ে উঠবে।
প্লেক-ফর্মিং ইউনিট (PFU) এর উপর ভিত্তি করে, ফেজ প্যাকেজিং ধাপের পরে, প্রায় 109 বৈচিত্র্যের সাথে এলোমেলো 12-মের লিনিয়ার T7 ফেজ পেপটাইডের একটি লাইব্রেরি ডিজাইন এবং তৈরি করা হয়েছিল (উপাদান এবং পদ্ধতি দেখুন)।এটি লক্ষ করা গুরুত্বপূর্ণ যে আমরা ভিভো প্যানিং এর আগে এই লাইব্রেরিটি সাবধানে বিশ্লেষণ করেছি।সংশোধিত প্রাইমার ব্যবহার করে ফেজ লাইব্রেরির নমুনাগুলির পিসিআর পরিবর্ধন অ্যামপ্লিকন তৈরি করেছে যা সরাসরি এইচটিএস (পরিপূরক চিত্র 1a) এর জন্য প্রযোজ্য ছিল।ক) HTS11 সিকোয়েন্সিং ত্রুটির কারণে, খ) প্রাইমারের গুণমানের উপর প্রভাব (NNK)1-12, এবং গ) স্ট্যান্ডবাই লাইব্রেরিতে ওয়াইল্ড-টাইপ (wt) ফেজ (কঙ্কাল সন্নিবেশ) উপস্থিতির কারণে, শুধুমাত্র যাচাইকৃত প্লীমআপ সিকোয়েন্স F1b তথ্য বের করার জন্য একটি সিকোয়েন্স ফিল্টারিং পদ্ধতি প্রয়োগ করা হয়েছিল।এই ফিল্টার পদক্ষেপগুলি সমস্ত HTS সিকোয়েন্সিং লাইব্রেরিতে প্রযোজ্য।স্ট্যান্ডার্ড লাইব্রেরির জন্য, মোট 233,868টি রিড প্রাপ্ত হয়েছিল, যার মধ্যে 39% ফিল্টারের মানদণ্ডে উত্তীর্ণ হয়েছিল এবং পরবর্তী রাউন্ডগুলির জন্য লাইব্রেরি বিশ্লেষণ এবং নির্বাচনের জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 1c–e)।পাঠগুলি প্রধানত 36টি নিউক্লিওটাইডের শীর্ষের সাথে 3টি বেস জোড়ার গুণিতক ছিল (পরিপূরক চিত্র 1c), লাইব্রেরি ডিজাইন (NNK) 1-12 নিশ্চিত করে।উল্লেখযোগ্যভাবে, প্রায় 11% লাইব্রেরির সদস্যদের মধ্যে একটি 12-মাত্রিক ওয়াইল্ড-টাইপ (wt) ব্যাকবোন PAGISRELVDKL সন্নিবেশ রয়েছে এবং প্রায় অর্ধেক সিকোয়েন্স (49%) সন্নিবেশ বা মুছে ফেলা রয়েছে।লাইব্রেরি লাইব্রেরির HTS লাইব্রেরিতে পেপটাইডের উচ্চ বৈচিত্র্য নিশ্চিত করেছে: 81% এরও বেশি পেপটাইড সিকোয়েন্স শুধুমাত্র একবার পাওয়া গেছে এবং শুধুমাত্র 1.5% ≥4 কপিতে পাওয়া গেছে (পরিপূরক চিত্র 2a)।রেপার্টয়ারের সমস্ত 12টি অবস্থানে অ্যামিনো অ্যাসিডের ফ্রিকোয়েন্সি (এএ) অবক্ষয়িত NKK সংগ্রহশালা (পরিপূরক চিত্র 2b) দ্বারা উত্পন্ন কোডনগুলির সংখ্যার জন্য প্রত্যাশিত ফ্রিকোয়েন্সির সাথে ভালভাবে সম্পর্কযুক্ত।এই সন্নিবেশগুলি দ্বারা এনকোড করা AA অবশিষ্টাংশগুলির পর্যবেক্ষণকৃত ফ্রিকোয়েন্সি গণনাকৃত ফ্রিকোয়েন্সি (r = 0.893) (পরিপূরক চিত্র 2c) এর সাথে ভালভাবে সম্পর্কিত।ইনজেকশনের জন্য ফেজ লাইব্রেরিগুলির প্রস্তুতির মধ্যে এন্ডোটক্সিন পরিবর্ধন এবং অপসারণের পদক্ষেপগুলি অন্তর্ভুক্ত রয়েছে।এটি পূর্বে 12,13 ফেজ লাইব্রেরির বৈচিত্র্যকে সম্ভাব্যভাবে কমাতে দেখানো হয়েছে।অতএব, আমরা একটি প্লেট-এম্পলিফাইড ফেজ লাইব্রেরি সিকোয়েন্স করেছি যা এন্ডোটক্সিন অপসারণের মধ্য দিয়ে গেছে এবং AA এর ফ্রিকোয়েন্সি অনুমান করার জন্য এটিকে মূল লাইব্রেরির সাথে তুলনা করেছি।একটি শক্তিশালী পারস্পরিক সম্পর্ক (r = 0.995) মূল পুল এবং পরিবর্ধিত এবং বিশুদ্ধ পুল (পরিপূরক চিত্র 2d) এর মধ্যে পরিলক্ষিত হয়েছে, যা নির্দেশ করে যে T7 ফেজ ব্যবহার করে প্লেটে পরিবর্ধিত ক্লোনগুলির মধ্যে প্রতিযোগিতা বড় পক্ষপাতের কারণ হয়নি৷এই তুলনাটি প্রতিটি লাইব্রেরিতে ট্রিপেপটাইড মোটিফের ফ্রিকোয়েন্সির উপর ভিত্তি করে করা হয়েছে, যেহেতু লাইব্রেরির বৈচিত্র্য (~109) এমনকি HTS দিয়েও সম্পূর্ণরূপে ক্যাপচার করা যায় না।প্রতিটি অবস্থানে aa-এর ফ্রিকোয়েন্সি বিশ্লেষণে প্রবেশ করা তথ্যের শেষ তিনটি অবস্থানে একটি ছোট অবস্থান-নির্ভর পক্ষপাত প্রকাশ করেছে (পরিপূরক চিত্র 2e)।উপসংহারে, আমরা উপসংহারে পৌঁছেছি যে লাইব্রেরির গুণমান এবং বৈচিত্র্য গ্রহণযোগ্য ছিল এবং বিভিন্ন রাউন্ডের নির্বাচনের মধ্যে ফেজ লাইব্রেরিগুলির পরিবর্ধন এবং প্রস্তুতির কারণে বৈচিত্র্যের মধ্যে শুধুমাত্র ছোটখাটো পরিবর্তন পরিলক্ষিত হয়েছে।
সিরিয়াল সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড স্যাম্পলিং অস্ত্রোপচারের মাধ্যমে সচেতন ইঁদুরের সিএম-এ একটি ক্যানুলা ইমপ্লান্ট করে সঞ্চালিত করা যেতে পারে যাতে বিবিবি এবং/অথবা বিসিএসএফবি (চিত্র 1a-বি) এর মাধ্যমে শিরায় ইনজেকশন দেওয়া T7 ফেজ সনাক্তকরণের সুবিধা হয়।আমরা ভিভো নির্বাচনের প্রথম তিন রাউন্ডে (চিত্র 1c) দুটি স্বাধীন নির্বাচন অস্ত্র (আর্ম A এবং B) ব্যবহার করেছি।আমরা নির্বাচনের প্রথম তিন রাউন্ডে প্রবর্তিত ফেজের মোট পরিমাণ কমিয়ে ধীরে ধীরে নির্বাচনের কঠোরতা বাড়িয়েছি।প্যানিংয়ের চতুর্থ রাউন্ডের জন্য, আমরা শাখা A এবং B থেকে নমুনাগুলি একত্রিত করেছি এবং তিনটি অতিরিক্ত স্বাধীন নির্বাচন করেছি।এই মডেলে T7 ফেজ কণার ভিভো বৈশিষ্ট্যগুলি অধ্যয়ন করার জন্য, ওয়াইল্ড-টাইপ ফেজ (PAGISRELVDKL মাস্টার ইনসার্ট) লেজের শিরার মাধ্যমে ইঁদুরের মধ্যে ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল।বিভিন্ন সময়ে সেরিব্রোস্পাইনাল তরল এবং রক্ত ​​থেকে ফেজ পুনরুদ্ধার দেখায় যে তুলনামূলকভাবে ছোট T7 আইকোসাহেড্রাল ফেজগুলির রক্তের বগি থেকে দ্রুত প্রাথমিক ক্লিয়ারেন্স ফেজ ছিল (পরিপূরক চিত্র 3)।প্রশাসিত টাইটার এবং ইঁদুরের রক্তের পরিমাণের উপর ভিত্তি করে, আমরা গণনা করেছি যে প্রায় 1% wt।ইনট্রাভেনাস ইনজেকশনের 10 মিনিট পরে প্রশাসিত ডোজ থেকে ফেজ রক্তে সনাক্ত করা হয়েছিল।এই প্রাথমিক দ্রুত পতনের পরে, একটি ধীর প্রাথমিক ক্লিয়ারেন্স 27.7 মিনিটের অর্ধ-জীবনের সাথে পরিমাপ করা হয়েছিল।গুরুত্বপূর্ণভাবে, CSF কম্পার্টমেন্ট থেকে খুব কম ফেজ পুনরুদ্ধার করা হয়েছিল, যা CSF কম্পার্টমেন্টে বন্য-টাইপ ফেজ স্থানান্তরের জন্য একটি নিম্ন পটভূমি নির্দেশ করে (পরিপূরক চিত্র 3)।গড়ে, রক্তে T7 ফেজের মাত্র 1 x 10-3% টাইটার এবং প্রাথমিকভাবে সংক্রমিত ফেজগুলির 4 x 10-8% পুরো নমুনা গ্রহণের সময় (0-250 মিনিট) সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে সনাক্ত করা হয়েছিল।উল্লেখযোগ্যভাবে, সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে ওয়াইল্ড-টাইপ ফেজের অর্ধ-জীবন (25.7 মিনিট) রক্তে পরিলক্ষিত হওয়ার মতোই ছিল।এই তথ্যগুলি দেখায় যে রক্ত ​​থেকে CSF কম্পার্টমেন্টকে আলাদা করার বাধাটি CM-ক্যানুলেটেড ইঁদুরগুলিতে অক্ষত রয়েছে, যা ফেজ লাইব্রেরির ভিভো নির্বাচনের মাধ্যমে ক্লোনগুলি সনাক্ত করতে দেয় যা রক্ত ​​থেকে সহজেই CSF কম্পার্টমেন্টে স্থানান্তরিত হয়।
(a) একটি বড় পুল থেকে সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (CSF) পুনরায় নমুনা নেওয়ার জন্য একটি পদ্ধতি সেট আপ করা।(b) ডায়াগ্রাম কেন্দ্রীয় স্নায়ুতন্ত্রের (CNS) বাধার সেলুলার অবস্থান এবং রক্ত-মস্তিষ্কের বাধা (BBB) ​​এবং রক্ত-মস্তিষ্কের বাধা অতিক্রমকারী পেপটাইড সনাক্ত করতে ব্যবহৃত নির্বাচন কৌশল দেখাচ্ছে।(c) ভিভো ফেজ ডিসপ্লে স্ক্রীনিং ফ্লোচার্টে।নির্বাচনের প্রতিটি রাউন্ডে, ফেজগুলি (তীরের ভিতরের প্রাণী শনাক্তকারী) শিরায় ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল।দুটি স্বাধীন বিকল্প শাখা (A, B) নির্বাচনের 4র্থ রাউন্ড পর্যন্ত আলাদাভাবে রাখা হয়েছে।নির্বাচন রাউন্ড 3 এবং 4 এর জন্য, CSF থেকে বের করা প্রতিটি ফেজ ক্লোন ম্যানুয়ালি সিকোয়েন্স করা হয়েছিল।(d) T7 পেপটাইড লাইব্রেরির (2 x 1012 ফেজ/প্রাণী) ইন্ট্রাভেনাস ইনজেকশনের পর দুটি ক্যানুলেটেড ইঁদুরের নির্বাচনের প্রথম রাউন্ডের নির্বাচনের সময় রক্ত ​​(লাল বৃত্ত) এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (সবুজ ত্রিভুজ) থেকে বিচ্ছিন্ন ফেজের গতিবিদ্যা।নীল বর্গক্ষেত্রগুলি রক্তে ফেজের গড় প্রাথমিক ঘনত্ব নির্দেশ করে, ইনজেকশন দেওয়া ফেজের পরিমাণ থেকে গণনা করা হয়, মোট রক্তের পরিমাণ বিবেচনা করে।কালো বর্গক্ষেত্রগুলি রক্তের ফেজ ঘনত্ব থেকে এক্সট্রাপোলেটেড y লাইনের ছেদ বিন্দু নির্দেশ করে।(e,f) পেপটাইডে পাওয়া সমস্ত সম্ভাব্য ওভারল্যাপিং ট্রিপেপটাইড মোটিফগুলির আপেক্ষিক ফ্রিকোয়েন্সি এবং বিতরণ উপস্থাপন করুন।1000টি রিডিংয়ে পাওয়া মোটিফের সংখ্যা দেখানো হয়েছে।উল্লেখযোগ্যভাবে (p <0.001) সমৃদ্ধ মোটিফগুলি লাল বিন্দু দিয়ে চিহ্নিত করা হয়েছে।(ই) কোরিলেশন স্ক্যাটারপ্লট ইনজেকশন লাইব্রেরির ট্রিপেপটাইড মোটিফের আপেক্ষিক ফ্রিকোয়েন্সি #1.1 এবং #1.2 পশুদের রক্ত ​​থেকে প্রাপ্ত ফেজের সাথে তুলনা করে।(f) রক্ত ​​ও সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে বিচ্ছিন্ন প্রাণীর ফেজ ট্রিপেপটাইড মোটিফ #1.1 এবং #1.2 এর আপেক্ষিক ফ্রিকোয়েন্সিগুলির তুলনা করে পারস্পরিক সম্পর্ক বিচ্ছুরণ।(g, h) রক্তে সমৃদ্ধ ফেজের সিকোয়েন্স আইডি উপস্থাপনা (g) বনাম ইনজেকশন লাইব্রেরি এবং ফেজ সমৃদ্ধ CSF (h) বনাম রক্তে উভয় প্রাণীর ভিভো নির্বাচনের পর।এক-অক্ষরের কোডের আকার নির্দেশ করে যে অ্যামিনো অ্যাসিড সেই অবস্থানে কত ঘন ঘন ঘটে।সবুজ = পোলার, বেগুনি = নিরপেক্ষ, নীল = মৌলিক, লাল = অম্লীয় এবং কালো = হাইড্রোফোবিক অ্যামিনো অ্যাসিড।চিত্র 1a, b এডুয়ার্ড উরিচ দ্বারা ডিজাইন এবং উত্পাদিত হয়েছিল।
আমরা দুটি সিএম ইন্সট্রুমেন্ট ইঁদুরে (ক্লেড এ এবং বি) একটি ফেজ পেপটাইড লাইব্রেরি ইনজেকশন দিয়েছি এবং সেরিব্রোস্পাইনাল তরল এবং রক্ত ​​​​থেকে বিচ্ছিন্ন ফেজ (চিত্র 1 ডি)।লাইব্রেরির প্রাথমিক দ্রুত ক্লিয়ারেন্স ওয়াইল্ড-টাইপ ফেজের তুলনায় কম উচ্চারিত ছিল।উভয় প্রাণীর ইনজেকশনের লাইব্রেরির গড় অর্ধ-জীবন ছিল রক্তে 24.8 মিনিট, বন্য-টাইপ ফেজের মতো এবং CSF-এ 38.5 মিনিট।প্রতিটি প্রাণীর রক্ত ​​এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড ফেজ নমুনাগুলি এইচটিএসের শিকার হয়েছিল এবং সমস্ত চিহ্নিত পেপটাইডগুলি একটি সংক্ষিপ্ত ট্রিপেপটাইড মোটিফের উপস্থিতির জন্য বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।ট্রিপেপটাইড মোটিফগুলি বেছে নেওয়া হয়েছিল কারণ তারা কাঠামো গঠন এবং পেপটাইড-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া 14,15 এর জন্য একটি ন্যূনতম ভিত্তি প্রদান করে।আমরা ইনজেকশন করা ফেজ লাইব্রেরি এবং উভয় প্রাণীর রক্ত ​​থেকে প্রাপ্ত ক্লোনগুলির মধ্যে মোটিফের বিতরণে একটি ভাল সম্পর্ক খুঁজে পেয়েছি (চিত্র 1e)।তথ্য ইঙ্গিত করে যে গ্রন্থাগারের গঠন রক্তের বগিতে সামান্য পরিমাণে সমৃদ্ধ হয়েছে।Weblogo16 সফ্টওয়্যারটির একটি অভিযোজন ব্যবহার করে প্রতিটি অবস্থানে অ্যামিনো অ্যাসিড ফ্রিকোয়েন্সি এবং ঐক্যমত্য ক্রমগুলি আরও বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।মজার বিষয় হল, আমরা রক্তের গ্লাইসিন অবশিষ্টাংশে একটি শক্তিশালী সমৃদ্ধি খুঁজে পেয়েছি (চিত্র 1g)।যখন CSF থেকে নির্বাচিত ক্লোনগুলির সাথে রক্তের তুলনা করা হয়েছিল, তখন শক্তিশালী নির্বাচন এবং মোটিফগুলির কিছু অপসারণ পরিলক্ষিত হয়েছিল (চিত্র 1f), এবং নির্দিষ্ট অ্যামিনো অ্যাসিডগুলি 12-সদস্যের (চিত্র 1h) পূর্বনির্ধারিত অবস্থানে অগ্রাধিকারমূলকভাবে উপস্থিত ছিল।উল্লেখযোগ্যভাবে, পৃথক প্রাণীদের সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডের মধ্যে উল্লেখযোগ্যভাবে পার্থক্য ছিল, যেখানে উভয় প্রাণীর মধ্যে রক্তের গ্লাইসিন সমৃদ্ধি পরিলক্ষিত হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 4a–j)।#1.1 এবং #1.2 পশুদের সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে সিকোয়েন্স ডেটার কঠোর ফিল্টারিংয়ের পরে, মোট 964 এবং 420টি অনন্য 12-মের পেপটাইড পাওয়া গেছে (পরিপূরক চিত্র 1d–e)।বিচ্ছিন্ন ফেজ ক্লোনগুলিকে প্রশস্ত করা হয়েছিল এবং ভিভো নির্বাচনের দ্বিতীয় রাউন্ডের অধীন ছিল।নির্বাচনের দ্বিতীয় রাউন্ড থেকে নিষ্কাশিত ফেজগুলি প্রতিটি প্রাণীতে এইচটিএসের অধীন ছিল এবং সমস্ত চিহ্নিত পেপটাইডগুলি ট্রিপেপটাইড মোটিফগুলির উপস্থিতি বিশ্লেষণ করার জন্য একটি মোটিফ স্বীকৃতি প্রোগ্রামে ইনপুট হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল (চিত্র 2a, b, ef)।CSF থেকে পুনরুদ্ধার করা ফেজের প্রথম চক্রের তুলনায়, আমরা A এবং B (চিত্র 2) শাখায় CSF-এ অনেকগুলি মোটিফের আরও নির্বাচন এবং অপসারণ লক্ষ্য করেছি।একটি নেটওয়ার্ক শনাক্তকরণ অ্যালগরিদম প্রয়োগ করা হয়েছিল যে তারা সামঞ্জস্যপূর্ণ অনুক্রমের বিভিন্ন নিদর্শন প্রতিনিধিত্ব করে কিনা তা নির্ধারণ করতে।বিকল্প ক্লেড A (চিত্র 2c, d) এবং ক্লেড B (চিত্র 2g, h) তে CSF দ্বারা পুনরুদ্ধার করা 12-মাত্রিক ক্রমগুলির মধ্যে একটি স্পষ্ট মিল পরিলক্ষিত হয়েছে।প্রতিটি শাখায় পুল করা বিশ্লেষণে 12-মের পেপটাইড (পরিপূরক চিত্র 5c,d) এর জন্য আলাদা নির্বাচন প্রোফাইল এবং প্রথম রাউন্ডের নির্বাচনের (পরিপূরক চিত্র 5e) তুলনায় দ্বিতীয় রাউন্ডের নির্বাচনের পরে পুল করা ক্লোনগুলির জন্য সময়ের সাথে সাথে CSF/ব্লাড টাইটার অনুপাত বৃদ্ধি পেয়েছে।)
ইন ভিভো ফাংশনাল ফেজ ডিসপ্লে নির্বাচনের পরপর দুটি রাউন্ডের মাধ্যমে সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে মোটিফ এবং পেপটাইড সমৃদ্ধকরণ।
প্রতিটি প্রাণীর প্রথম রাউন্ড থেকে উদ্ধার হওয়া সমস্ত সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড ফেজগুলি (প্রাণী #1.1 এবং #1.2) পুল করা হয়েছিল, প্রশস্ত করা হয়েছিল, এইচটি-সিকোয়েন্স করা হয়েছিল এবং একসাথে পুনরায় ইনজেক্ট করা হয়েছিল (2 x 1010 ফেজ/প্রাণী) 2 SM ক্যানুলেটেড ইঁদুর (#1.1 → #)।2.1 এবং 2.2, 1.2 → 2.3 এবং 2.4)(a,b,e,f) প্রথম এবং দ্বিতীয় নির্বাচন রাউন্ডে সমস্ত CSF-প্রাপ্ত ফেজের ট্রিপেপটাইড মোটিফের আপেক্ষিক ফ্রিকোয়েন্সি তুলনা করে পারস্পরিক সম্পর্ক বিচ্ছুরণ।আপেক্ষিক ফ্রিকোয়েন্সি এবং মোটিফের বন্টন উভয় অভিযোজনে পেপটাইডে পাওয়া সমস্ত সম্ভাব্য ওভারল্যাপিং ট্রিপেপটাইডের প্রতিনিধিত্ব করে।1000টি রিডিংয়ে পাওয়া মোটিফের সংখ্যা দেখানো হয়েছে।যে মোটিফগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে (p <0.001) তুলনা করা লাইব্রেরিগুলির মধ্যে একটিতে নির্বাচিত বা বাদ দেওয়া হয়েছিল লাল বিন্দু দিয়ে হাইলাইট করা হয়েছে৷(c, d, g, h) ভিভো নির্বাচনের রাউন্ড 2 এবং 1 এর উপর ভিত্তি করে সমস্ত CSF-সমৃদ্ধ 12 অ্যামিনো অ্যাসিড দীর্ঘ সিকোয়েন্সের সিকোয়েন্স লোগো উপস্থাপনা।এক-অক্ষরের কোডের আকার নির্দেশ করে যে অ্যামিনো অ্যাসিড সেই অবস্থানে কত ঘন ঘন ঘটে।লোগোটি উপস্থাপন করার জন্য, দুটি নির্বাচন রাউন্ডের মধ্যে পৃথক প্রাণী থেকে প্রাপ্ত CSF সিকোয়েন্সের ফ্রিকোয়েন্সি তুলনা করা হয়েছে এবং দ্বিতীয় রাউন্ডে সমৃদ্ধ ক্রমগুলি দেখানো হয়েছে: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 এবং (h) #1.2–#2.4.(c, d) প্রাণীর একটি নির্দিষ্ট অবস্থানে সর্বাধিক সমৃদ্ধ অ্যামিনো অ্যাসিড2.1 এবং না.2.2 বা (ছ, জ) পশুদের মধ্যে নং।2.3 এবং না.2.4 রঙ দেখানো হয়.সবুজ = পোলার, বেগুনি = নিরপেক্ষ, নীল = মৌলিক, লাল = অম্লীয় এবং কালো = হাইড্রোফোবিক অ্যামিনো অ্যাসিড।
নির্বাচনের তৃতীয় রাউন্ডের পরে, আমরা দুটি প্রাণী থেকে বিচ্ছিন্ন 332 CSF-পুনর্গঠিত ফেজ ক্লোন থেকে 124টি অনন্য পেপটাইড সিকোয়েন্স (#3.1 এবং #3.2) সনাক্ত করেছি (পরিপূরক চিত্র 6a)।সিকোয়েন্স LGSVS (18.7%) এর সর্বোচ্চ আপেক্ষিক অনুপাত ছিল, তারপরে বন্য ধরনের সন্নিবেশ PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), এবং SARGSWREIVSLS (2.2%)।চূড়ান্ত চতুর্থ রাউন্ডে, আমরা তিনটি পৃথক প্রাণী (চিত্র 1c) থেকে দুটি স্বাধীনভাবে নির্বাচিত শাখা পুল করেছি।CSF থেকে উদ্ধারকৃত 925টি সিকোয়েন্সড ফেজ ক্লোনগুলির মধ্যে, চতুর্থ রাউন্ডে আমরা 64টি অনন্য পেপটাইড সিকোয়েন্স পেয়েছি (পরিপূরক চিত্র 6b), যার মধ্যে বন্য-টাইপ ফেজের আপেক্ষিক অনুপাত 0.8% এ নেমে গেছে।চতুর্থ রাউন্ডে সবচেয়ে সাধারণ CSF ক্লোনগুলি হল LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%), %2SSDRL এবং 2%।%))।NNK লাইব্রেরি ডিজাইনের জন্য ডিজেনারেট কোডন ব্যবহার করার সময় লাইব্রেরি প্রাইমারে নিউক্লিওটাইড সন্নিবেশ/মুছে ফেলা বা অকাল স্টপ কোডনগুলির কারণে নির্বাচিত পেপটাইডগুলির দৈর্ঘ্য পরিসীমা।প্রিম্যাচিউর স্টপ কোডনগুলি ছোট পেপটাইড তৈরি করে এবং বেছে নেওয়া হয় কারণ এতে অনুকূল এএ মোটিফ থাকে।সিন্থেটিক লাইব্রেরির প্রাইমারে সন্নিবেশ/মুছে ফেলার ফলে দীর্ঘ পেপটাইড হতে পারে।এটি ডিজাইন করা স্টপ কোডনকে ফ্রেমের বাইরে অবস্থান করে এবং একটি নতুন স্টপ কোডন ডাউনস্ট্রিম প্রদর্শিত না হওয়া পর্যন্ত এটি পড়ে।সাধারণভাবে, আমরা নমুনা আউটপুট ডেটার সাথে ইনপুট ডেটা তুলনা করে চারটি নির্বাচন রাউন্ডের জন্য সমৃদ্ধকরণের কারণগুলি গণনা করেছি।স্ক্রীনিংয়ের প্রথম রাউন্ডের জন্য, আমরা একটি অ-নির্দিষ্ট ব্যাকগ্রাউন্ড রেফারেন্স হিসাবে ওয়াইল্ড-টাইপ ফেজ টাইটার ব্যবহার করেছি।মজার বিষয় হল, প্রথম CSF চক্রে নেতিবাচক ফেজ নির্বাচন খুব শক্তিশালী ছিল, কিন্তু রক্তে নয় (চিত্র 3a), যা পেপটাইড লাইব্রেরির বেশিরভাগ সদস্যের CSF কম্পার্টমেন্টে নিষ্ক্রিয় প্রসারণের কম সম্ভাবনার কারণে হতে পারে বা আপেক্ষিক ফেজগুলি ব্যাকটেরিওর তুলনায় রক্তপ্রবাহ থেকে বেশি দক্ষতার সাথে ধরে রাখা বা অপসারণ করার প্রবণতা।যাইহোক, প্যানিংয়ের দ্বিতীয় রাউন্ডে, উভয় ক্লেডেই CSF-এ ফেজগুলির শক্তিশালী নির্বাচন পরিলক্ষিত হয়েছিল, যা পরামর্শ দেয় যে পূর্ববর্তী রাউন্ডটি পেপটাইডগুলি প্রদর্শনকারী ফেজগুলিতে সমৃদ্ধ ছিল যা CSF গ্রহণকে (চিত্র 3a) প্রচার করে।আবার, উল্লেখযোগ্য রক্ত ​​সমৃদ্ধি ছাড়াই।এছাড়াও তৃতীয় এবং চতুর্থ রাউন্ডে, ফেজ ক্লোনগুলি সিএসএফ-এ উল্লেখযোগ্যভাবে সমৃদ্ধ হয়েছিল।নির্বাচনের শেষ দুটি রাউন্ডের মধ্যে প্রতিটি অনন্য পেপটাইড সিকোয়েন্সের আপেক্ষিক ফ্রিকোয়েন্সি তুলনা করে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে সিকোয়েন্সগুলি নির্বাচনের চতুর্থ রাউন্ডে আরও বেশি সমৃদ্ধ হয়েছিল (চিত্র 3বি)।উভয় পেপটাইড অভিযোজন ব্যবহার করে 64টি অনন্য পেপটাইড সিকোয়েন্স থেকে মোট 931টি ট্রিপেপটাইড মোটিফ বের করা হয়েছিল।চতুর্থ রাউন্ডে সর্বাধিক সমৃদ্ধ মোটিফগুলি ইনজেকশন লাইব্রেরির তুলনায় সমস্ত রাউন্ড জুড়ে তাদের সমৃদ্ধকরণ প্রোফাইলগুলির জন্য আরও ঘনিষ্ঠভাবে পরীক্ষা করা হয়েছিল (কাট-অফ: 10% সমৃদ্ধকরণ) (পরিপূরক চিত্র 6c)।নির্বাচনের সাধারণ নিদর্শনগুলি দেখায় যে বেশিরভাগ অধ্যয়নকৃত উদ্দেশ্যগুলি উভয় নির্বাচন শাখার সমস্ত পূর্ববর্তী রাউন্ডে সমৃদ্ধ হয়েছিল।যাইহোক, কিছু মোটিফ (যেমন SGL, VSG, LGS GSV) প্রধানত বিকল্প ক্লেড A থেকে, অন্যগুলি (যেমন FGW, RTN, WGF, NTR) বিকল্প ক্লেড B তে সমৃদ্ধ হয়েছিল।
CSF-সমৃদ্ধ ফেজ-প্রদর্শিত পেপটাইড এবং স্ট্রেপ্টাভিডিন পেলোডের সাথে সংযুক্ত বায়োটিনিলেটেড লিডার পেপটাইডের CSF পরিবহনের বৈধতা।
(a) ইনজেকশন (ইনপুট = I) ফেজ (PFU) টাইটার এবং নির্ধারিত CSF ফেজ টাইটার (আউটপুট = O) এর উপর ভিত্তি করে চারটি রাউন্ডে (R1-R4) সমৃদ্ধকরণ অনুপাত গণনা করা হয়েছে।শেষ তিনটি রাউন্ডের (R2-R4) সমৃদ্ধকরণের কারণগুলি পূর্ববর্তী রাউন্ড এবং প্রথম রাউন্ডের (R1) ওজন ডেটার সাথে তুলনা করে গণনা করা হয়েছিল।খোলা বারগুলি সেরিব্রোস্পাইনাল তরল, ছায়াযুক্ত বারগুলি প্লাজমা।(***p <0.001, শিক্ষার্থীর টি-টেস্টের উপর ভিত্তি করে)।(b) সর্বাধিক প্রচুর ফেজ পেপটাইডের তালিকা, নির্বাচনের 4 রাউন্ডের পরে CSF-এ সংগৃহীত সমস্ত ফেজগুলির আপেক্ষিক অনুপাত অনুসারে স্থান দেওয়া হয়েছে।সবচেয়ে সাধারণ ছয়টি ফেজ ক্লোন রং, সংখ্যাযুক্ত এবং নির্বাচনের রাউন্ড 3 এবং 4 (ইনসেট) এর মধ্যে তাদের সমৃদ্ধকরণের কারণগুলিতে হাইলাইট করা হয়েছে।(c,d) রাউন্ড 4 থেকে ছয়টি সর্বাধিক সমৃদ্ধ ফেজ ক্লোন, খালি ফেজ এবং প্যারেন্টাল ফেজ পেপটাইড লাইব্রেরিগুলি একটি CSF স্যাম্পলিং মডেলে পৃথকভাবে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।সিএসএফ এবং রক্তের নমুনাগুলি নির্দেশিত সময় পয়েন্টগুলিতে সংগ্রহ করা হয়েছিল।(গ) সমান পরিমাণে 6 টি ক্যান্ডিডেট ফেজ ক্লোন (2 x 1010 ফেজ/প্রাণী), খালি ফেজ (#1779) (2 x 1010 ফেজ/প্রাণী) এবং স্টক ফেজ পেপটাইড লাইব্রেরি (2 x 1012 ফেজ/প্রাণী) ইনজেকশনের মাধ্যমে কমপক্ষে 3 CM প্রাণীর লেজের মধ্যে আলাদাভাবে ইনজেকশন দিতে হবে।সময়ের সাথে সাথে প্রতিটি ইনজেকশন করা ফেজ ক্লোন এবং ফেজ পেপটাইড লাইব্রেরির CSF ফার্মাকোকিনেটিক্স দেখানো হয়েছে।(d) নমুনা নেওয়ার সময় সমস্ত পুনরুদ্ধার হওয়া ফেজ/mL-এর গড় CSF/রক্তের অনুপাত দেখায়।(ঙ) চারটি সিন্থেটিক লিডার পেপটাইড এবং একটি স্ক্র্যাম্বলড কন্ট্রোল বায়োটিনের সাথে স্ট্রেপ্টাভিডিনের সাথে যুক্ত ছিল তাদের এন-টার্মিনাস (টেট্রামার ডিসপ্লে) এর মাধ্যমে ইনজেকশন (টেইল ভেইন iv, 10 মিলিগ্রাম স্ট্রেপ্টাভিডিন/কেজি)।কমপক্ষে তিনটি ইনটুবেটেড ইঁদুর (N = 3)।)CSF নমুনাগুলি নির্দেশিত সময় পয়েন্টগুলিতে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং স্ট্রেপ্টাভিডিন ঘনত্বগুলি CSF অ্যান্টি-স্ট্রেপ্টাভিডিন ELISA (nd = সনাক্ত করা হয়নি) দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল।(*p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001, ANOVA পরীক্ষার উপর ভিত্তি করে)।(f) নির্বাচনের 4র্থ রাউন্ড থেকে অন্যান্য নির্বাচিত ফেজ পেপটাইড ক্লোনের সাথে সবচেয়ে সমৃদ্ধ ফেজ পেপটাইড ক্লোন #2002 (বেগুনি) এর অ্যামিনো অ্যাসিড ক্রমটির তুলনা।অভিন্ন এবং অনুরূপ অ্যামিনো অ্যাসিড খণ্ডগুলো রঙ-কোডেড।
চতুর্থ রাউন্ডে (চিত্র 3b) সমস্ত সমৃদ্ধ ফেজগুলির মধ্যে, CSF স্যাম্পলিং মডেলে আরও পৃথক বিশ্লেষণের জন্য ছয়টি প্রার্থীর ক্লোন নির্বাচন করা হয়েছিল।সমান পরিমাণে ছয়টি ক্যান্ডিডেট ফেজ, খালি ফেজ (কোনও সন্নিবেশ নেই) এবং প্রোফেজ পেপটাইড লাইব্রেরি তিনটি ক্যানুলেটেড সিএম প্রাণীতে ইনজেকশন করা হয়েছিল এবং ফার্মাকোকিনেটিক্স CSF (চিত্র 3c) এবং রক্তে (পরিপূরক চিত্র 7) অ্যাসেস নির্ধারণ করা হয়েছিল।পরীক্ষিত সমস্ত ফেজ ক্লোন CSF কম্পার্টমেন্টকে লক্ষ্য করে খালি কন্ট্রোল ফেজ (#1779) এর চেয়ে 10-1000 গুণ বেশি স্তরে।উদাহরণস্বরূপ, ক্লোন #2020 এবং #2077-এ কন্ট্রোল ফেজের তুলনায় প্রায় 1000 গুণ বেশি CSF টাইটার ছিল।প্রতিটি নির্বাচিত পেপটাইডের ফার্মাকোকিনেটিক প্রোফাইল আলাদা, তবে তাদের সকলেরই উচ্চ CSF হোমিং ক্ষমতা রয়েছে।আমরা সময়ের সাথে সাথে #1903 এবং #2011 ক্লোনগুলির জন্য একটি ধ্রুবক হ্রাস লক্ষ্য করেছি, যখন #2077, #2002 এবং #2009 ক্লোনগুলির জন্য প্রথম 10 মিনিটের মধ্যে বৃদ্ধি সক্রিয় পরিবহন নির্দেশ করতে পারে তবে যাচাই করা প্রয়োজন।ক্লোন #2020, #2002, এবং #2077 উচ্চ স্তরে স্থিতিশীল, যখন ক্লোন #2009 এর CSF ঘনত্ব প্রাথমিক বৃদ্ধির পরে ধীরে ধীরে হ্রাস পেয়েছে।তারপরে আমরা প্রতিটি CSF প্রার্থীর রক্তের ঘনত্বের সাথে আপেক্ষিক ফ্রিকোয়েন্সি তুলনা করি (চিত্র 3d)।প্রতিটি CSF প্রার্থীর গড় টাইটারের সাথে তার রক্তের টাইটারের সমস্ত নমুনা সময়ে পারস্পরিক সম্পর্ক দেখায় যে ছয়জন প্রার্থীর মধ্যে তিনজন রক্তের CSF-তে উল্লেখযোগ্যভাবে সমৃদ্ধ হয়েছিল।মজার বিষয় হল, ক্লোন #2077 উচ্চ রক্তের স্থিতিশীলতা দেখিয়েছে (পরিপূরক চিত্র 7)।পেপটাইডগুলি নিজেরাই সক্রিয়ভাবে CSF কম্পার্টমেন্টে ফেজ কণা ব্যতীত অন্যান্য কার্গো পরিবহন করতে সক্ষম তা নিশ্চিত করার জন্য, আমরা N-টার্মিনাসে বায়োটিনের সাথে ডেরাইভেটাইজ করা চারটি লিডার পেপটাইড সংশ্লেষিত করেছি যেখানে পেপটাইডগুলি ফেজ কণার সাথে সংযুক্ত থাকে।বায়োটিনিলেটেড পেপটাইড (সংখ্যা 2002, 2009, 2020 এবং 2077) স্ট্রেপ্টাভিডিন (এসএ) এর সাথে সংযুক্ত করা হয়েছিল যাতে মাল্টিমেরিক ফর্মগুলি কিছুটা অনুকরণ করে ফেজ জ্যামিতি পাওয়া যায়।এই বিন্যাসটি আমাদেরকে কার্গো-পরিবহনকারী প্রোটিন পেপটাইড হিসাবে রক্ত ​​এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে এসএ এক্সপোজার পরিমাপ করার অনুমতি দেয়।গুরুত্বপূর্ণভাবে, এই SA-সংযোজিত বিন্যাসে (চিত্র 3e) সিন্থেটিক পেপটাইডগুলি পরিচালনা করা হলে ফেজ ডেটা প্রায়শই পুনরুত্পাদন করা যেতে পারে।স্ক্র্যাম্বলড পেপটাইডগুলির প্রাথমিক এক্সপোজার কম ছিল এবং 48 ঘন্টার মধ্যে সনাক্তযোগ্য মাত্রা সহ দ্রুত CSF ক্লিয়ারেন্স ছিল।CSF স্পেসে এই পেপটাইড ফেজ ক্লোনগুলির প্রসবের পথ সম্পর্কে অন্তর্দৃষ্টি পেতে, আমরা ভিভোতে শিরায় ইনজেকশনের 1 ঘন্টা পরে সরাসরি ফেজ কণা সনাক্ত করতে ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি (IHC) ব্যবহার করে পৃথক ফেজ পেপটাইড হিটগুলির স্থানীয়করণ বিশ্লেষণ করেছি।উল্লেখযোগ্যভাবে, ক্লোন #2002, #2077, এবং #2009 মস্তিষ্কের কৈশিকগুলির শক্তিশালী দাগ দ্বারা সনাক্ত করা যেতে পারে, যখন নিয়ন্ত্রণ ফেজ (#1779) এবং ক্লোন #2020 সনাক্ত করা যায়নি (পরিপূরক চিত্র 8)।এটি পরামর্শ দেয় যে এই পেপটাইডগুলি বিবিবি অতিক্রম করে অবিকল মস্তিষ্কে প্রভাবে অবদান রাখে।এই অনুমান পরীক্ষা করার জন্য আরও বিশদ বিশ্লেষণ প্রয়োজন, কারণ BSCFB রুটও জড়িত থাকতে পারে।অন্যান্য নির্বাচিত পেপটাইডের সাথে সর্বাধিক সমৃদ্ধ ক্লোনের (#2002) অ্যামিনো অ্যাসিড ক্রম তুলনা করার সময়, এটি লক্ষ করা গেছে যে তাদের মধ্যে কয়েকটিতে একই রকম অ্যামিনো অ্যাসিড এক্সটেনশন রয়েছে, যা একটি অনুরূপ পরিবহন প্রক্রিয়া নির্দেশ করতে পারে (চিত্র 3f)।
এর অনন্য প্লাজমা প্রোফাইল এবং সময়ের সাথে সাথে CSF-তে উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধির কারণে, ফেজ ডিসপ্লে ক্লোন #2077 আরও দীর্ঘ 48-ঘণ্টার সময় ধরে অন্বেষণ করা হয়েছিল এবং টেকসই SA স্তরের (চিত্র 4a) সাথে মিলিত হয়ে CSF-এর দ্রুত বৃদ্ধি পুনরুত্পাদন করতে সক্ষম হয়েছিল।অন্যান্য চিহ্নিত ফেজ ক্লোনগুলির বিষয়ে, #2077 মস্তিষ্কের কৈশিকগুলির জন্য দৃঢ়ভাবে দাগযুক্ত এবং উচ্চতর রেজোলিউশনে এবং সম্ভবত প্যারেনকাইমাল স্পেসে কিছু দাগ দেখা গেলে কৈশিক মার্কার লেকটিনের সাথে উল্লেখযোগ্য কোলোকালাইজেশন দেখায় (চিত্র 4b)।সিএনএস-এ পেপটাইড-মধ্যস্থ ফার্মাকোলজিকাল প্রভাব পাওয়া যায় কিনা তা তদন্ত করার জন্য, আমরা একটি পরীক্ষা করেছি যাতে i) #2077 ট্রানজিট পেপটাইড এবং ii) BACE1 ইনহিবিটর পেপটাইড SA এর সাথে দুটি ভিন্ন অনুপাতে মিশ্রিত করা হয়েছিল।একটি সংমিশ্রণের জন্য আমরা শুধুমাত্র BACE1 পেপটাইড ইনহিবিটর ব্যবহার করেছি এবং অন্যটির জন্য আমরা #2077 পেপটাইডের BACE1 পেপটাইড ইনহিবিটরের 1:3 অনুপাত ব্যবহার করেছি।উভয় নমুনাই শিরাপথে পরিচালিত হয়েছিল এবং বিটা-অ্যামিলয়েড পেপটাইড 40 (Abeta40) এর রক্ত ​​এবং সেরিব্রোস্পাইনাল তরল মাত্রা সময়ের সাথে পরিমাপ করা হয়েছিল।Abeta40 CSF এ পরিমাপ করা হয়েছিল কারণ এটি মস্তিষ্কের প্যারেনকাইমাতে BACE1 বাধা প্রতিফলিত করে।প্রত্যাশিত হিসাবে, উভয় কমপ্লেক্স উল্লেখযোগ্যভাবে Abeta40 রক্তের মাত্রা হ্রাস করেছে (চিত্র 4c, d)।যাইহোক, শুধুমাত্র পেপটাইড নং এর মিশ্রণ ধারণকারী নমুনা।2077 এবং SA-তে সংযোজিত BACE1 পেপটাইডের একটি ইনহিবিটর সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (চিত্র 4c) এ Abeta40 এর উল্লেখযোগ্য হ্রাস ঘটায়।তথ্য দেখায় যে পেপটাইড নং।2077 CNS-এ 60 kDa SA প্রোটিন পরিবহন করতে সক্ষম এবং BACE1 পেপটাইডের SA-সংযোজিত ইনহিবিটরগুলির সাথে ফার্মাকোলজিক্যাল প্রভাবও প্ররোচিত করে।
(a) T7 ফেজের ক্লোনাল ইনজেকশন (2 × 10 ফেজ/প্রাণী) অন্তত তিনটি CM-ইনটুবেটেড ইঁদুরের মধ্যে CSF পেপটাইড #2077 (RLSSVDSDLSGC) এবং আনইনজেক্টেড কন্ট্রোল ফেজ (#1779) এর দীর্ঘমেয়াদী ফার্মাকোকিনেটিক প্রোফাইল দেখায়।(b) ফেজ-ইনজেকশন করা ইঁদুরের (2 × 10 10 ফেজ/প্রাণী) প্রতিনিধি কর্টিকাল মাইক্রোভেসেলের কনফোকাল মাইক্রোস্কোপিক চিত্র পেপটাইড #2077 এবং জাহাজের (লেক্টিন) কাউন্টারস্টেনিং দেখাচ্ছে।এই ফেজ ক্লোনগুলি 3টি ইঁদুরকে দেওয়া হয়েছিল এবং পারফিউশনের আগে 1 ঘন্টার জন্য সঞ্চালনের অনুমতি দেওয়া হয়েছিল।T7 ফেজ ক্যাপসিডের বিরুদ্ধে পলিক্লোনাল FITC-লেবেলযুক্ত অ্যান্টিবডি দিয়ে মস্তিষ্ককে বিভাগ করা হয়েছিল এবং দাগ দেওয়া হয়েছিল।পারফিউশন এবং পরবর্তী স্থিরকরণের দশ মিনিট আগে, DyLight594-লেবেলযুক্ত লেকটিন শিরায় দেওয়া হয়েছিল।ফ্লুরোসেন্ট চিত্রগুলি কৈশিক এবং পেরিভাসকুলার মস্তিষ্কের টিস্যুর লুমেনে মাইক্রোভেসেল এবং ফেজ (সবুজ) এর লুমিনাল সাইডের লেকটিন স্টেনিং (লাল) দেখাচ্ছে।স্কেল বার 10 µm এর সাথে মিলে যায়।(c, d) বায়োটিনিলেটেড BACE1 ইনহিবিটরি পেপটাইড একা বা বায়োটিনিলেটেড ট্রানজিট পেপটাইড #2077 এর সাথে স্ট্রেপ্টাভিডিনের সাথে মিলিত হয়েছিল এবং তারপরে কমপক্ষে তিনটি ক্যানুলেটেড সিএম ইঁদুর (10 মিলিগ্রাম স্ট্রেপ্টাভিডিন/কেজি) শিরায় ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল।Aβ40 এ BACE1 পেপটাইড ইনহিবিটর-মধ্যস্থতা হ্রাস করা হয়েছে Aβ1-40 ELISA দ্বারা রক্তে (লাল) এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (কমলা) নির্দেশিত সময় পয়েন্টে।ভাল স্পষ্টতার জন্য, গ্রাফে 100% স্কেলে একটি বিন্দুযুক্ত রেখা আঁকা হয়।(c) 3:1 অনুপাতে ট্রানজিট পেপটাইড #2077 এবং BACE1 ইনহিবিটরি পেপটাইড স্ট্রেপ্টাভিডিন দিয়ে চিকিত্সা করা ইঁদুরের রক্তে Aβ40 (লাল ত্রিভুজ) এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (কমলা ত্রিভুজ) এর শতাংশ হ্রাস।(d) রক্তের Aβ40 (লাল বৃত্ত) এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (কমলা চেনাশোনা) স্ট্রেপ্টাভিডিনের সাথে শুধুমাত্র একটি BACE1 ইনহিবিটরি পেপটাইডের সাথে চিকিত্সা করা ইঁদুরের শতাংশ হ্রাস।নিয়ন্ত্রণে Aβ ঘনত্ব ছিল 420 pg/ml (মান বিচ্যুতি = 101 pg/ml)।
বায়োমেডিকাল গবেষণার বিভিন্ন ক্ষেত্রে ফেজ ডিসপ্লে সফলভাবে প্রয়োগ করা হয়েছে17।এই পদ্ধতিটি ভিভো ভাস্কুলার ডাইভার্সিটি স্টাডিজ 18,19 এর পাশাপাশি সেরিব্রাল ভেসেলস 20,21,22,23,24,25,26 লক্ষ্য করে অধ্যয়নের জন্য ব্যবহার করা হয়েছে।এই গবেষণায়, আমরা এই নির্বাচন পদ্ধতির প্রয়োগ শুধুমাত্র সেরিব্রাল জাহাজকে লক্ষ্য করে পেপটাইডগুলির সরাসরি সনাক্তকরণের জন্য নয়, রক্ত-মস্তিষ্কের বাধা অতিক্রম করার জন্য সক্রিয় পরিবহন বৈশিষ্ট্যযুক্ত প্রার্থীদের আবিষ্কারের জন্যও প্রসারিত করেছি।আমরা এখন সিএম ইনটুবেটেড ইঁদুরগুলিতে একটি ইন ভিভো নির্বাচন পদ্ধতির বিকাশ বর্ণনা করি এবং সিএসএফ হোমিং বৈশিষ্ট্য সহ পেপটাইড সনাক্ত করার সম্ভাব্যতা প্রদর্শন করি।12-মের র্যান্ডম পেপটাইডের একটি লাইব্রেরি প্রদর্শনকারী T7 ফেজ ব্যবহার করে, আমরা দেখাতে পেরেছি যে T7 ফেজ যথেষ্ট ছোট (ব্যাস প্রায় 60 এনএম) 10 রক্ত-মস্তিষ্কের বাধার সাথে খাপ খাইয়ে নেওয়ার জন্য, যার ফলে সরাসরি রক্ত-মস্তিষ্কের বাধা বা chorous কে অতিক্রম করে।আমরা লক্ষ্য করেছি যে ক্যানুলেটেড সিএম ইঁদুর থেকে CSF সংগ্রহ করা ভিভো ফাংশনাল স্ক্রীনিং পদ্ধতিতে একটি সুনিয়ন্ত্রিত ছিল এবং নিষ্কাশিত ফেজটি কেবল ভাস্কুলেচারের সাথে আবদ্ধ নয় বরং রক্ত-মস্তিষ্কের বাধা জুড়ে পরিবহনকারী হিসাবেও কাজ করে।উপরন্তু, একই সাথে রক্ত ​​সংগ্রহ করে এবং CSF এবং রক্ত ​​থেকে প্রাপ্ত ফেজে HTS প্রয়োগ করে, আমরা নিশ্চিত করেছি যে CSF এর আমাদের পছন্দটি নির্বাচনের রাউন্ডগুলির মধ্যে সম্প্রসারণের জন্য রক্তের সমৃদ্ধকরণ বা ফিটনেস দ্বারা প্রভাবিত হয়নি।যাইহোক, রক্তের বগি বাছাই পদ্ধতির অংশ, যেহেতু CSF কম্পার্টমেন্টে পৌঁছতে সক্ষম ফেজগুলিকে মস্তিষ্কে নিজেদের সমৃদ্ধ করার জন্য রক্তপ্রবাহে দীর্ঘক্ষণ বেঁচে থাকতে হবে এবং সঞ্চালন করতে হবে।কাঁচা HTS ডেটা থেকে নির্ভরযোগ্য সিকোয়েন্স তথ্য বের করার জন্য, আমরা বিশ্লেষণ কর্মপ্রবাহে প্ল্যাটফর্ম-নির্দিষ্ট সিকোয়েন্সিং ত্রুটিগুলির সাথে অভিযোজিত ফিল্টারগুলি প্রয়োগ করেছি।স্ক্রীনিং পদ্ধতিতে গতিগত পরামিতিগুলিকে অন্তর্ভুক্ত করে, আমরা রক্তে বন্য-টাইপ T7 ফেজ (t½ ~ 28 মিনিট) এর দ্রুত ফার্মাকোকিনেটিক্স নিশ্চিত করেছি 24, 27, 28 এবং সেরিব্রোস্পাইনাল তরল (t½ ~ 26 মিনিট) প্রতি মিনিটে তাদের অর্ধ-জীবন নির্ধারণ করেছি)।রক্তে এবং CSF-এ অনুরূপ ফার্মাকোকিনেটিক প্রোফাইল থাকা সত্ত্বেও, CSF-এ ফেজের রক্তের ঘনত্বের মাত্র 0.001% সনাক্ত করা যায়, যা রক্ত-মস্তিষ্কের বাধা জুড়ে বন্য-টাইপ T7 ফেজের নিম্ন পটভূমি গতিশীলতা নির্দেশ করে।এই কাজটি ভিভো প্যানিং কৌশলগুলি ব্যবহার করার সময় নির্বাচনের প্রথম রাউন্ডের গুরুত্ব তুলে ধরে, বিশেষ করে ফেজ সিস্টেমগুলির জন্য যা দ্রুত সঞ্চালন থেকে পরিষ্কার করা হয়, কারণ কয়েকটি ক্লোন CNS কম্পার্টমেন্টে পৌঁছাতে সক্ষম হয়।এইভাবে, প্রথম রাউন্ডে, লাইব্রেরি বৈচিত্র্যের হ্রাস খুব বড় ছিল, কারণ এই অত্যন্ত কঠোর CSF মডেলে শেষ পর্যন্ত সীমিত সংখ্যক ক্লোন সংগ্রহ করা হয়েছিল।এটি ভিভো প্যানিং কৌশলের মধ্যে বেশ কয়েকটি নির্বাচন পদক্ষেপ অন্তর্ভুক্ত ছিল যেমন CSF কম্পার্টমেন্টে সক্রিয় সঞ্চয়, রক্তের কম্পার্টমেন্টে ক্লোন বেঁচে থাকা এবং প্রথম 10 মিনিটের মধ্যে রক্ত ​​থেকে T7 ফেজ ক্লোন দ্রুত অপসারণ (চিত্র 1d এবং পরিপূরক চিত্র 4M)।)এইভাবে, প্রথম রাউন্ডের পরে, সিএসএফ-এ বিভিন্ন ফেজ ক্লোন চিহ্নিত করা হয়েছিল, যদিও একই প্রাথমিক পুলটি পৃথক প্রাণীদের জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল।এটি প্রস্তাব করে যে বিপুল সংখ্যক লাইব্রেরি সদস্য সহ উত্স লাইব্রেরির জন্য একাধিক কঠোর নির্বাচন পদক্ষেপের ফলে বৈচিত্র্য একটি উল্লেখযোগ্য হ্রাস পায়।অতএব, এলোমেলো ঘটনাগুলি প্রাথমিক নির্বাচন প্রক্রিয়ার একটি অবিচ্ছেদ্য অংশ হয়ে উঠবে, ফলাফলকে ব্যাপকভাবে প্রভাবিত করবে।সম্ভবত মূল লাইব্রেরির অনেক ক্লোনের CSF সমৃদ্ধকরণের প্রবণতা একই রকম ছিল।যাইহোক, এমনকি একই পরীক্ষামূলক অবস্থার অধীনে, প্রাথমিক পুলে প্রতিটি নির্দিষ্ট ক্লোনের অল্প সংখ্যার কারণে নির্বাচনের ফলাফল ভিন্ন হতে পারে।
CSF সমৃদ্ধ মোটিফগুলি রক্তের থেকে আলাদা।মজার বিষয় হল, আমরা পৃথক প্রাণীর রক্তে গ্লাইসিন-সমৃদ্ধ পেপটাইডের দিকে প্রথম স্থানান্তর লক্ষ্য করেছি।(চিত্র 1g, পরিপূরক ডুমুর। 4e, 4f)।গ্লাইসিন পেপটাইড ধারণকারী ফেজ আরও স্থিতিশীল হতে পারে এবং সঞ্চালন থেকে বের হয়ে যাওয়ার সম্ভাবনা কম।যাইহোক, এই গ্লাইসিন-সমৃদ্ধ পেপটাইডগুলি সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডের নমুনাগুলিতে সনাক্ত করা যায়নি, পরামর্শ দেয় যে কিউরেটেড লাইব্রেরিগুলি দুটি ভিন্ন নির্বাচনের ধাপের মধ্য দিয়ে গেছে: একটি রক্তে এবং অন্যটি সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে জমা হতে দেয়।নির্বাচনের চতুর্থ রাউন্ডের ফলে CSF-সমৃদ্ধ ক্লোনগুলি ব্যাপকভাবে পরীক্ষা করা হয়েছে।প্রায় সমস্ত স্বতন্ত্রভাবে পরীক্ষিত ক্লোনগুলি ফাঁকা নিয়ন্ত্রণ ফেজের তুলনায় সিএসএফ-এ সমৃদ্ধ হওয়ার বিষয়টি নিশ্চিত করা হয়েছিল।একটি পেপটাইড হিট (#2077) আরও বিস্তারিতভাবে পরীক্ষা করা হয়েছিল।এটি অন্যান্য হিটের তুলনায় একটি দীর্ঘ প্লাজমা অর্ধ-জীবন দেখিয়েছে (চিত্র 3d এবং পরিপূরক চিত্র 7), এবং মজার বিষয় হল, এই পেপটাইডে সি-টার্মিনাসে একটি সিস্টাইন অবশিষ্টাংশ রয়েছে।এটি সম্প্রতি দেখানো হয়েছে যে পেপটাইডে সিস্টাইনের সংযোজন অ্যালবুমিন 29 এর সাথে আবদ্ধ হয়ে তাদের ফার্মাকোকিনেটিক বৈশিষ্ট্যগুলিকে উন্নত করতে পারে।এটি বর্তমানে পেপটাইড #2077 এর জন্য অজানা এবং আরও অধ্যয়নের প্রয়োজন।কিছু পেপটাইড CSF সমৃদ্ধকরণে একটি ভ্যালেন্স-নির্ভরতা দেখিয়েছে (ডেটা দেখানো হয়নি), যা T7 ক্যাপসিডের প্রদর্শিত পৃষ্ঠের জ্যামিতির সাথে সম্পর্কিত হতে পারে।আমরা যে T7 সিস্টেমটি ব্যবহার করেছি তাতে প্রতিটি ফেজ কণা প্রতি পেপটাইডের 5-15 কপি দেখানো হয়েছে।IHC ইঁদুরের সেরিব্রাল কর্টেক্সে (পরিপূরক চিত্র 8) শিরায় ইনজেকশন দেওয়া প্রার্থীর সীসা ফেজ ক্লোনগুলিতে সঞ্চালিত হয়েছিল।তথ্য দেখায় যে কমপক্ষে তিনটি ক্লোন (নং 2002, নং 2009 এবং নং 2077) BBB এর সাথে যোগাযোগ করেছে৷এই BBB ইন্টারঅ্যাকশনের ফলে CSF জমা হয় নাকি এই ক্লোনগুলি সরাসরি BCSFB-তে চলাচল করে তা নির্ধারণ করা বাকি আছে।গুরুত্বপূর্ণভাবে, আমরা দেখাই যে নির্বাচিত পেপটাইডগুলি তাদের CSF পরিবহন ক্ষমতা ধরে রাখে যখন সংশ্লেষিত হয় এবং প্রোটিন কার্গোতে আবদ্ধ থাকে।SA-তে N-টার্মিনাল বায়োটিনিলেটেড পেপটাইডের আবদ্ধতা মূলত রক্তে এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (চিত্র 3e) এর নিজ নিজ ফেজ ক্লোনগুলির সাথে প্রাপ্ত ফলাফলের পুনরাবৃত্তি করে।অবশেষে, আমরা দেখাই যে সীসা পেপটাইড #2077 SA এর সাথে সংযুক্ত BACE1 এর একটি বায়োটিনিলেটেড পেপটাইড ইনহিবিটরের মস্তিষ্কের ক্রিয়াকে উন্নীত করতে সক্ষম, যা CSF-এ Abeta40 মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করে CNS-তে উচ্চারিত ফার্মাকোডাইনামিক প্রভাব সৃষ্টি করে (চিত্র 4)।আমরা সমস্ত হিটগুলির একটি পেপটাইড সিকোয়েন্স হোমোলজি অনুসন্ধান করে ডাটাবেসের কোনও হোমোলগ সনাক্ত করতে পারিনি।এটি লক্ষ করা গুরুত্বপূর্ণ যে T7 লাইব্রেরির আকার আনুমানিক 109, যখন 12-mers-এর জন্য তাত্ত্বিক লাইব্রেরির আকার হল 4 x 1015। অতএব, আমরা 12-mers পেপটাইড লাইব্রেরির বৈচিত্র্যের স্থানের একটি ছোট ভগ্নাংশ বেছে নিয়েছি, যার অর্থ হতে পারে যে আরও অপ্টিমাইজ করা এই পেপটাইড স্পেস দ্বারা চিহ্নিত করা যেতে পারে।কাল্পনিকভাবে, আমরা কেন এই পেপটাইডগুলির কোনো প্রাকৃতিক সমতুল্য খুঁজে পাইনি তার একটি কারণ মস্তিষ্কে নির্দিষ্ট পেপটাইড মোটিফগুলির অনিয়ন্ত্রিত প্রবেশ রোধ করার জন্য বিবর্তনের সময় অনির্বাচন হতে পারে।
একসাথে নেওয়া, আমাদের ফলাফলগুলি আরও বিশদে ভিভোতে সেরিব্রোভাসকুলার বাধার পরিবহন ব্যবস্থা সনাক্ত এবং বৈশিষ্ট্যযুক্ত করার জন্য ভবিষ্যতের কাজের জন্য একটি ভিত্তি সরবরাহ করে।এই পদ্ধতির মৌলিক সেটআপটি একটি কার্যকরী নির্বাচন কৌশলের উপর ভিত্তি করে তৈরি করা হয়েছে যা শুধুমাত্র সেরিব্রাল ভাস্কুলার বাইন্ডিং বৈশিষ্ট্য সহ ক্লোনগুলি সনাক্ত করে না, তবে এটি একটি গুরুত্বপূর্ণ পদক্ষেপও অন্তর্ভুক্ত করে যেখানে সফল ক্লোনগুলি ভিভোতে জৈবিক বাধাগুলিকে সিএনএস কম্পার্টমেন্টে অতিক্রম করার জন্য অন্তর্নিহিত কার্যকলাপ রয়েছে।এই পেপটাইডগুলির পরিবহনের প্রক্রিয়া এবং মস্তিষ্কের অঞ্চলের জন্য নির্দিষ্ট মাইক্রোভাসকুলেচারের সাথে আবদ্ধ হওয়ার জন্য তাদের পছন্দ ব্যাখ্যা করা।এটি বিবিবি এবং রিসেপ্টরগুলির পরিবহনের জন্য নতুন পথ আবিষ্কারের দিকে পরিচালিত করতে পারে।আমরা আশা করি যে চিহ্নিত পেপটাইডগুলি সরাসরি সেরিব্রোভাসকুলার রিসেপ্টরগুলির সাথে বা বিবিবি বা বিসিএসএফবি এর মাধ্যমে পরিবাহিত লিগ্যান্ডের সাথে আবদ্ধ হতে পারে।এই কাজে আবিষ্কৃত CSF পরিবহন কার্যকলাপ সহ পেপটাইড ভেক্টরগুলি আরও তদন্ত করা হবে।আমরা বর্তমানে BBB এবং/অথবা BCSFB অতিক্রম করার ক্ষমতার জন্য এই পেপটাইডগুলির মস্তিষ্কের নির্দিষ্টতা তদন্ত করছি।এই নতুন পেপটাইডগুলি নতুন রিসেপ্টর বা পথের সম্ভাব্য আবিষ্কারের জন্য এবং মস্তিষ্কে জীববিজ্ঞানের মতো ম্যাক্রোমোলিকিউলস সরবরাহের জন্য নতুন অত্যন্ত দক্ষ প্ল্যাটফর্মের বিকাশের জন্য অত্যন্ত মূল্যবান হাতিয়ার হবে।
পূর্বে বর্ণিত পদ্ধতির একটি পরিবর্তন ব্যবহার করে বড় সিস্টারনা (সিএম) ক্যানুলেট করুন।অ্যানাস্থেটাইজড উইস্টার ইঁদুর (200-350 গ্রাম) একটি স্টেরিওট্যাক্সিক যন্ত্রপাতির উপর মাউন্ট করা হয়েছিল এবং মাথার খুলি উন্মোচিত করার জন্য কামানো এবং অ্যাসেপ্টিকভাবে প্রস্তুত মাথার ত্বকের উপর একটি মাঝারি ছেদ তৈরি করা হয়েছিল।উপরের স্যাশের এলাকায় দুটি গর্ত ড্রিল করুন এবং গর্তগুলিতে ফিক্সিং স্ক্রুগুলি বেঁধে দিন।সিএম-এ স্টেইনলেস স্টিলের ক্যানুলার স্টেরিওট্যাকটিক গাইডেন্সের জন্য পার্শ্বীয় অসিপিটাল ক্রেস্টে একটি অতিরিক্ত গর্ত ড্রিল করা হয়েছিল।ক্যানুলার চারপাশে ডেন্টাল সিমেন্ট লাগান এবং স্ক্রু দিয়ে সুরক্ষিত করুন।ফটো-কিউরিং এবং সিমেন্ট শক্ত করার পরে, ত্বকের ক্ষতটি 4/0 সুপ্রামিড সিউচার দিয়ে বন্ধ করা হয়েছিল।সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (CSF) এর স্বতঃস্ফূর্ত ফুটো দ্বারা ক্যানুলার সঠিক স্থাপন নিশ্চিত করা হয়।স্টেরিওট্যাক্সিক যন্ত্রপাতি থেকে ইঁদুরটিকে সরান, যথাযথ পোস্টোপারেটিভ যত্ন এবং ব্যথা ব্যবস্থাপনা গ্রহণ করুন এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে রক্তের লক্ষণ দেখা না যাওয়া পর্যন্ত এটি অন্তত এক সপ্তাহের জন্য পুনরুদ্ধার করতে দিন।উইস্টার ইঁদুর (Crl:WI/Han) চার্লস নদী (ফ্রান্স) থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল।সমস্ত ইঁদুর নির্দিষ্ট প্যাথোজেন-মুক্ত অবস্থার অধীনে রাখা হয়েছিল।সমস্ত প্রাণী পরীক্ষাগুলি সুইজারল্যান্ডের বাসেল শহরের ভেটেরিনারি অফিস দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল এবং পশু লাইসেন্স নং 2474 (সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড এবং ইঁদুরের মস্তিষ্কে থেরাপিউটিক প্রার্থীদের স্তরের পরিমাপের দ্বারা সক্রিয় মস্তিষ্ক পরিবহনের মূল্যায়ন) অনুসারে সঞ্চালিত হয়েছিল।
সিএম ক্যানুলা হাতে নিয়ে ইঁদুরটিকে আলতো করে সচেতন করুন।ক্যানুলা থেকে দাতুরা সরান এবং স্বতঃস্ফূর্তভাবে প্রবাহিত সেরিব্রোস্পাইনাল তরল 10 μl সংগ্রহ করুন।যেহেতু ক্যানুলার পেটেন্সি শেষ পর্যন্ত আপোস করা হয়েছিল, শুধুমাত্র রক্তের দূষণ বা বিবর্ণতার কোনো প্রমাণ ছাড়াই পরিষ্কার সেরিব্রোস্পাইনাল তরল নমুনাগুলি এই গবেষণায় অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল।সমান্তরালভাবে, লেজের ডগায় একটি ছোট ছেদ থেকে প্রায় 10-20 μl রক্ত ​​হেপারিন (সিগমা-অলড্রিচ) সহ টিউবে নেওয়া হয়েছিল।T7 ফেজের শিরায় ইনজেকশন দেওয়ার পরে বিভিন্ন সময় পয়েন্টে সিএসএফ এবং রক্ত ​​সংগ্রহ করা হয়েছিল।প্রতিটি CSF নমুনা সংগ্রহ করার আগে প্রায় 5-10 μl তরল বাতিল করা হয়েছিল, যা ক্যাথেটারের মৃত ভলিউমের সাথে মিলে যায়।
T7Select সিস্টেম ম্যানুয়াল (Novagen, Rosenberg et al., Innovations 6, 1-6, 1996) এ বর্ণিত T7Select 10-3b ভেক্টর ব্যবহার করে লাইব্রেরি তৈরি করা হয়েছিল।সংক্ষেপে, একটি এলোমেলো 12-মের ডিএনএ সন্নিবেশ নিম্নলিখিত বিন্যাসে সংশ্লেষিত হয়েছিল:
NNK কোডনটি সন্নিবেশে ডাবল স্টপ কোডন এবং অ্যামিনো অ্যাসিড ওভার এক্সপ্রেশন এড়াতে ব্যবহৃত হয়েছিল।N হল প্রতিটি নিউক্লিওটাইডের একটি ম্যানুয়ালি মিশ্রিত সমতুল্য অনুপাত, এবং K হল অ্যাডেনিন এবং সাইটোসিন নিউক্লিওটাইডগুলির একটি ম্যানুয়ালি মিশ্রিত সমতুল্য অনুপাত।37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 3 ঘন্টার জন্য ক্লেনো বাফারে (নিউ ইংল্যান্ড বায়োল্যাবস) ডিএনটিপি (নোভাজেন) এবং ক্লেনো এনজাইম (নিউ ইংল্যান্ড বায়োল্যাবস) দিয়ে আরও ইনকিউবেশনের মাধ্যমে একক আটকে থাকা অঞ্চলগুলিকে ডাবল স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএতে রূপান্তরিত করা হয়েছিল।প্রতিক্রিয়ার পরে, EtOH বৃষ্টিপাত দ্বারা ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ উদ্ধার করা হয়েছিল।ফলস্বরূপ ডিএনএ সীমাবদ্ধ এনজাইম EcoRI এবং HindIII (উভয়ই রোচে থেকে) দ্বারা হজম হয়েছিল।ক্লিভড এবং পিউরিফাইড (QIAquick, Qiagen) সন্নিবেশ (T4 ligase, New England Biolabs) তারপর 10B ক্যাপসিড জিনের অ্যামিনো অ্যাসিড 348 এর পরে একটি প্রি-ক্লিভড T7 ভেক্টরে ফ্রেমে বন্ধন করা হয়েছিল।ইন ভিট্রো প্যাকেজিংয়ের 18 ঘন্টা আগে লিগেশন প্রতিক্রিয়াগুলি 16 ডিগ্রি সেলসিয়াসে ইনকিউবেট করা হয়েছিল।ভিট্রোতে ফেজ প্যাকেজিং T7Select 10-3b ক্লোনিং কিট (Novagen) এর সাথে সরবরাহ করা নির্দেশাবলী অনুসারে সঞ্চালিত হয়েছিল এবং প্যাকেজিং সমাধানটি একবার Escherichia coli (BLT5615, Novagen) ব্যবহার করে lysis করার জন্য প্রশস্ত করা হয়েছিল।গ্লিসারলের স্টক দ্রবণ হিসাবে লাইসেটগুলিকে সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল, টাইট্রেট করা হয়েছিল এবং -80 ডিগ্রি সেলসিয়াসে হিমায়িত করা হয়েছিল।
মালিকানাধীন 454/Roche-amplicon ফিউশন প্রাইমার ব্যবহার করে ব্রোথ বা প্লেটে পরিবর্ধিত ফেজ পরিবর্তনশীল অঞ্চলের সরাসরি PCR পরিবর্ধন।ফরোয়ার্ড ফিউশন প্রাইমারে ভেরিয়েবল অঞ্চল (NNK) 12 (টেমপ্লেট-নির্দিষ্ট), GS FLX টাইটানিয়াম অ্যাডাপ্টার A, এবং একটি ফোর-বেস লাইব্রেরি কী সিকোয়েন্স (TCAG) (পরিপূরক চিত্র 1a):
বিপরীত ফিউশন প্রাইমারে ক্যাপচার পুঁতির সাথে সংযুক্ত বায়োটিন এবং ইমালসন পিসিআর-এর সময় ক্লোনাল পরিবর্ধনের জন্য প্রয়োজনীয় GS FLX টাইটানিয়াম অ্যাডাপ্টার B রয়েছে:
454 GS-FLX টাইটানিয়াম প্রোটোকল অনুসারে অ্যামপ্লিকনগুলিকে 454/Roche পাইরোসেকোয়েন্সিং করা হয়েছিল।ম্যানুয়াল সেঞ্জার সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য (অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেম হিটাচি 3730 xl ডিএনএ বিশ্লেষক), T7 ফেজ ডিএনএ পিসিআর দ্বারা বিবর্ধিত করা হয়েছিল এবং নিম্নলিখিত প্রাইমার জোড়াগুলির সাথে সিকোয়েন্স করা হয়েছিল:
রচে ফাস্ট স্টার্ট ডিএনএ পলিমারেজ কিট (উৎপাদকের নির্দেশ অনুসারে) ব্যবহার করে পৃথক ফলকগুলি থেকে সন্নিবেশগুলি পিসিআর পরিবর্ধনের শিকার হয়েছিল।একটি হট স্টার্ট করুন (95 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 10 মিনিট) এবং 35টি বুস্ট সাইকেল (95 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 50 সেকেন্ড, 50 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 1 মিনিট এবং 72 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 1 মিনিট)।
লাইব্রেরি থেকে ফেজ, ওয়াইল্ড-টাইপ ফেজ, CSF এবং রক্ত ​​থেকে উদ্ধার করা ফেজ, বা পৃথক ক্লোনগুলি Escherichia coli BL5615-এ TB ব্রোথ (Sigma Aldrich) বা 500 cm2 খাবারে (থার্মো সায়েন্টিফিক) 37 ডিগ্রি সেলসিয়াস তাপমাত্রায় 4 ঘন্টার জন্য প্রশস্ত করা হয়েছিল।ট্রিস-ইডিটিএ বাফার (ফ্লুকা অ্যানালিটিক্যাল) দিয়ে প্লেটগুলি ধুয়ে বা জীবাণুমুক্ত পাইপেট টিপস দিয়ে ফলকগুলি সংগ্রহ করে প্লেটগুলি থেকে ফেজ বের করা হয়েছিল।এক রাউন্ড পলিথিন গ্লাইকোল (পিইজি 8000) বৃষ্টিপাত (প্রোমেগা) সহ কালচার সুপারনেট্যান্ট বা নিষ্কাশন বাফার থেকে ফেজকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং ট্রিস-ইডিটিএ বাফারে পুনরায় স্থগিত করা হয়েছিল।
ইন্ট্রাভেনাস (IV) ইনজেকশন (500 μl/প্রাণী) এর আগে এম্প্লিফাইড ফেজটি এন্ডোটক্সিন অপসারণ জপমালা (মিল্টেনি বায়োটেক) ব্যবহার করে 2-3 রাউন্ড এন্ডোটক্সিন অপসারণের শিকার হয়েছিল।প্রথম রাউন্ডে, 2×1012 ফেজ চালু করা হয়েছিল;দ্বিতীয়টিতে, 2×1010 ফেজ;তৃতীয় এবং চতুর্থ নির্বাচন রাউন্ডে, পশু প্রতি 2×109 ফেজ।সিএসএফ-এ ফেজ বিষয়বস্তু এবং নির্দেশিত সময় পয়েন্টে সংগ্রহ করা রক্তের নমুনাগুলি প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে ফলক গণনা দ্বারা নির্ধারিত হয়েছিল (টি 7 সিলেক্ট সিস্টেম ম্যানুয়াল)।ফেজ নির্বাচনটি লেজের শিরাতে বিশুদ্ধ গ্রন্থাগারগুলির অন্তঃসত্ত্বা ইনজেকশন দ্বারা বা পূর্ববর্তী নির্বাচন বৃত্তাকার থেকে সিএসএফ থেকে নেওয়া ফেজের পুনরায় ইনজেকশন দ্বারা সম্পাদিত হয়েছিল এবং পরবর্তী ফসলগুলি 10 মিনিট, 30 মিনিট, 60 মিনিট, 90 মিনিট, 120 মিনিট, 180 মিনিট এবং 240 মিনিট যথাক্রমে সিএসএফ এবং রক্ত ​​নমুনাগুলিতে সঞ্চালিত হয়েছিল।ভিভো প্যানিংয়ের মোট চারটি রাউন্ড পরিচালনা করা হয়েছিল যেখানে দুটি নির্বাচিত শাখা আলাদাভাবে সংরক্ষণ করা হয়েছিল এবং নির্বাচনের প্রথম তিনটি রাউন্ডের সময় বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।নির্বাচনের প্রথম দুই রাউন্ড থেকে CSF থেকে প্রাপ্ত সমস্ত ফেজ সন্নিবেশ 454/Roche pyrosequencing-এর অধীন ছিল, যখন নির্বাচনের শেষ দুই রাউন্ড থেকে CSF থেকে প্রাপ্ত সমস্ত ক্লোন ম্যানুয়ালি সিকোয়েন্স করা হয়েছিল।নির্বাচনের প্রথম রাউন্ড থেকে সমস্ত রক্তের ফেজগুলিও 454/রোচে পাইরোসেকোয়েন্সিংয়ের শিকার হয়েছিল।ফেজ ক্লোন ইনজেকশনের জন্য, নির্বাচিত ফেজগুলিকে ই. কোলাই (BL5615) 500 cm2 প্লেটে 37°C তাপমাত্রায় 4 ঘন্টার জন্য প্রশস্ত করা হয়েছিল।স্বতন্ত্রভাবে নির্বাচিত এবং ম্যানুয়ালি সিকোয়েন্সড ক্লোনগুলি টিবি মাধ্যমে প্রচার করা হয়েছিল।ফেজ নিষ্কাশন, পরিশুদ্ধকরণ এবং এন্ডোটক্সিন অপসারণের পরে (উপরে বর্ণিত), 300 μl মধ্যে 2×1010 ফেজ/প্রাণীকে একটি লেজের শিরায় শিরায় ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল।
সিকোয়েন্স ডেটার প্রিপ্রসেসিং এবং গুণগত ফিল্টারিং।Raw 454/Roche ডেটা বিক্রেতা সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে একটি বাইনারি স্ট্যান্ডার্ড স্ট্রিম ম্যাপ ফরম্যাট (sff) থেকে পিয়ারসন হিউম্যান রিডেবল ফরম্যাটে (fasta) রূপান্তরিত হয়েছে।নিউক্লিওটাইড সিকোয়েন্সের আরও প্রক্রিয়াকরণ মালিকানা সি প্রোগ্রাম এবং স্ক্রিপ্ট (অপ্রকাশিত সফ্টওয়্যার প্যাকেজ) ব্যবহার করে সম্পাদিত হয়েছিল যেমন নীচে বর্ণিত হয়েছে।প্রাথমিক তথ্য বিশ্লেষণের মধ্যে রয়েছে কঠোর মাল্টি-স্টেজ ফিল্টারিং পদ্ধতি।To filter out reads that did not contain a valid 12mer insert DNA sequence, the reads were sequentially aligned to start label (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stop label (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) and background insert (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) using the global Needleman-Wunsch test.প্রান্তিককরণ প্রতি প্রান্তিককরণে 2টি পর্যন্ত অসঙ্গতির অনুমতি দেয়31৷অতএব, স্টার্ট এবং স্টপ ট্যাগ ছাড়াই পড়া এবং ব্যাকগ্রাউন্ড সন্নিবেশ সম্বলিত পঠন, অর্থাৎ, অমিলের অনুমোদিত সংখ্যা অতিক্রমকারী সারিবদ্ধকরণগুলি লাইব্রেরি থেকে সরানো হয়েছে।অবশিষ্ট পাঠের জন্য, N-mer DNA ক্রমটি প্রারম্ভিক চিহ্ন থেকে প্রসারিত এবং স্টপ মার্কের আগে শেষ হওয়ার পূর্বে মূল পঠিত ক্রম থেকে বাদ দেওয়া হয়েছিল এবং আরও প্রক্রিয়া করা হয়েছিল (এর পরে "সন্নিবেশ" হিসাবে উল্লেখ করা হয়েছে)।সন্নিবেশের অনুবাদের পরে, প্রাইমারের 5′ প্রান্তে প্রথম স্টপ কোডনের পরে অংশটি সন্নিবেশ থেকে সরানো হয়।এছাড়াও, প্রাইমারের 3′ প্রান্তে অসম্পূর্ণ কোডনগুলির দিকে পরিচালিত নিউক্লিওটাইডগুলিও সরানো হয়েছিল।শুধুমাত্র ব্যাকগ্রাউন্ড সিকোয়েন্স ধারণকারী সন্নিবেশগুলি বাদ দিতে, অ্যামিনো অ্যাসিড প্যাটার্ন "PAG" দিয়ে শুরু হওয়া অনুবাদিত সন্নিবেশগুলিও সরানো হয়েছিল।লাইব্রেরি থেকে 3টিরও কম অ্যামিনো অ্যাসিডের অনুবাদ-পরবর্তী দৈর্ঘ্যের পেপটাইডগুলি সরানো হয়েছিল।অবশেষে, সন্নিবেশ পুলে অপ্রয়োজনীয়তা সরান এবং প্রতিটি অনন্য সন্নিবেশের ফ্রিকোয়েন্সি নির্ধারণ করুন।এই বিশ্লেষণের ফলাফলগুলিতে নিউক্লিওটাইড সিকোয়েন্স (সন্নিবেশ) এবং তাদের (পড়ুন) ফ্রিকোয়েন্সিগুলির একটি তালিকা অন্তর্ভুক্ত ছিল (পরিপূরক চিত্র 1c এবং 2)।
ক্রম সাদৃশ্য অনুসারে গ্রুপ N-mer DNA সন্নিবেশ: 454/Roche-নির্দিষ্ট সিকোয়েন্সিং ত্রুটিগুলি দূর করতে (যেমন হোমোপলিমার এক্সটেনশন সিকোয়েন্সিংয়ে সমস্যা) এবং কম গুরুত্বপূর্ণ অপ্রয়োজনীয়তা দূর করতে, পূর্বে ফিল্টার করা এন-মের ডিএনএ সিকোয়েন্স ইনসার্ট (সন্নিবেশ) সাদৃশ্য অনুসারে সাজানো হয়।নিম্নরূপ সংজ্ঞায়িত একটি পুনরাবৃত্তিমূলক অ্যালগরিদম ব্যবহার করে সন্নিবেশ (2টি পর্যন্ত অ-ম্যাচিং বেস অনুমোদিত): সন্নিবেশগুলি প্রথমে তাদের ফ্রিকোয়েন্সি (সর্বোচ্চ থেকে সর্বনিম্ন) অনুসারে বাছাই করা হয় এবং যদি সেগুলি একই হয় তবে দৈর্ঘ্য অনুসারে তাদের গৌণ বাছাই অনুসারে (দীর্ঘ থেকে ছোট) )।সুতরাং, সবচেয়ে ঘন ঘন এবং দীর্ঘতম সন্নিবেশগুলি প্রথম "গ্রুপ" সংজ্ঞায়িত করে।গ্রুপ ফ্রিকোয়েন্সি কী ফ্রিকোয়েন্সিতে সেট করা আছে।তারপরে, বাছাই করা তালিকায় থাকা প্রতিটি সন্নিবেশকে জোড়ায় জোড়ায় নিডলম্যান-উন্স অ্যালাইনমেন্টের মাধ্যমে গ্রুপে যুক্ত করার চেষ্টা করা হয়েছিল।যদি একটি প্রান্তিককরণে অমিল, সন্নিবেশ বা মুছে ফেলার সংখ্যা 2-এর থ্রেশহোল্ডের বেশি না হয়, তাহলে গ্রুপে একটি সন্নিবেশ যোগ করা হয়, এবং সামগ্রিক গ্রুপ ফ্রিকোয়েন্সি কত ঘন ঘন সন্নিবেশ করা হয়েছিল তার দ্বারা বৃদ্ধি করা হয়।একটি গোষ্ঠীতে যোগ করা সন্নিবেশগুলিকে ব্যবহৃত হিসাবে চিহ্নিত করা হয় এবং পরবর্তী প্রক্রিয়াকরণ থেকে বাদ দেওয়া হয়।যদি সন্নিবেশ ক্রমটি ইতিমধ্যে বিদ্যমান গ্রুপে যোগ করা না যায়, তাহলে সন্নিবেশ ক্রমটি উপযুক্ত সন্নিবেশ ফ্রিকোয়েন্সি সহ একটি নতুন গ্রুপ তৈরি করতে ব্যবহৃত হয় এবং ব্যবহৃত হিসাবে চিহ্নিত করা হয়।পুনরাবৃত্তি শেষ হয় যখন প্রতিটি সন্নিবেশ ক্রম হয় একটি নতুন গোষ্ঠী গঠনের জন্য ব্যবহার করা হয় বা ইতিমধ্যে বিদ্যমান গোষ্ঠীতে অন্তর্ভুক্ত করা যেতে পারে।সর্বোপরি, নিউক্লিওটাইড সমন্বিত গোষ্ঠীবদ্ধ সন্নিবেশগুলি অবশেষে পেপটাইড সিকোয়েন্সে (পেপটাইড লাইব্রেরি) অনুবাদ করা হয়।এই বিশ্লেষণের ফলাফল হল সন্নিবেশের একটি সেট এবং তাদের সংশ্লিষ্ট ফ্রিকোয়েন্সি যা পরপর পড়ার সংখ্যা তৈরি করে (পরিপূরক চিত্র 2)।
মোটিফ জেনারেশন: অনন্য পেপটাইডের একটি তালিকার উপর ভিত্তি করে, একটি লাইব্রেরি তৈরি করা হয়েছিল যাতে নীচে দেখানো সমস্ত সম্ভাব্য অ্যামিনো অ্যাসিড প্যাটার্ন (aa) রয়েছে।দৈর্ঘ্য 3 এর প্রতিটি সম্ভাব্য প্যাটার্ন পেপটাইড থেকে বের করা হয়েছিল এবং এর বিপরীত প্যাটার্নের সাথে একটি সাধারণ মোটিফ লাইব্রেরির সাথে যুক্ত করা হয়েছিল যাতে সমস্ত নিদর্শন (ট্রিপেপটাইডস) রয়েছে।অত্যন্ত পুনরাবৃত্তিমূলক মোটিফগুলির লাইব্রেরিগুলি ক্রমানুসারে করা হয়েছিল এবং অপ্রয়োজনীয়তা সরানো হয়েছিল।তারপর, মোটিফ লাইব্রেরিতে প্রতিটি ট্রিপেপটাইডের জন্য, আমরা গণনামূলক সরঞ্জাম ব্যবহার করে লাইব্রেরিতে এর উপস্থিতি পরীক্ষা করেছি।এই ক্ষেত্রে, পাওয়া মোটিফ ট্রিপেপটাইড ধারণকারী পেপটাইডের ফ্রিকোয়েন্সি মোটিফ লাইব্রেরিতে মোটিফের সাথে যোগ করা হয় এবং বরাদ্দ করা হয় ("মোটিফের সংখ্যা")।মোটিফ জেনারেশনের ফলাফল হল একটি দ্বি-মাত্রিক অ্যারে যাতে ট্রিপেপটাইড (মোটিফ) এবং তাদের নিজ নিজ মানগুলির সমস্ত ঘটনা থাকে, যা সিকোয়েন্সিং রিডের সংখ্যা যা রিডগুলি ফিল্টার করা, গোষ্ঠীবদ্ধ এবং অনুবাদ করা হলে সংশ্লিষ্ট মোটিফ তৈরি করে।উপরে বিশদভাবে বর্ণিত মেট্রিক্স।
মোটিফ এবং সংশ্লিষ্ট স্ক্যাটারপ্লট সংখ্যার স্বাভাবিকীকরণ: প্রতিটি নমুনার জন্য মোটিফের সংখ্যা ব্যবহার করে স্বাভাবিক করা হয়েছিল
যেখানে ni হল বিষয় সম্বলিত পঠিত সংখ্যা i.এইভাবে, vi নমুনায় মোটিফ i ধারণকারী রিড (বা পেপটাইড) এর শতকরা ফ্রিকোয়েন্সি উপস্থাপন করে।ফিশারের সঠিক পরীক্ষা ব্যবহার করে মোটিফের অ-স্বাভাবিক সংখ্যার জন্য পি-মানগুলি গণনা করা হয়েছিল।উদ্দেশ্যের সংখ্যার কোরিলোগ্রাম সম্পর্কিত, স্পিয়ারম্যানের পারস্পরিক সম্পর্কগুলি R এর সাথে উদ্দেশ্যগুলির স্বাভাবিক সংখ্যা ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল।
পেপটাইড লাইব্রেরির প্রতিটি অবস্থানে অ্যামিনো অ্যাসিডের বিষয়বস্তু কল্পনা করার জন্য, ওয়েব লোগোগ্রাম 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) তৈরি করা হয়েছিল।প্রথমত, 12-মের পেপটাইডের প্রতিটি অবস্থানে অ্যামিনো অ্যাসিডের বিষয়বস্তু একটি 20×12 ম্যাট্রিক্সে সংরক্ষণ করা হয়।তারপর, প্রতিটি অবস্থানে একই আপেক্ষিক অ্যামিনো অ্যাসিড সামগ্রী সহ 1000 পেপটাইডের একটি সেট ফাস্টা-সিকোয়েন্স বিন্যাসে তৈরি হয় এবং ওয়েব-লোগো 3-তে ইনপুট হিসাবে সরবরাহ করা হয়, যা প্রতিটি অবস্থানে আপেক্ষিক অ্যামিনো অ্যাসিড সামগ্রীর একটি গ্রাফিক্যাল উপস্থাপনা তৈরি করে।একটি প্রদত্ত পেপটাইড লাইব্রেরির জন্য।বহুমাত্রিক ডেটাসেটগুলি কল্পনা করার জন্য, তাপ মানচিত্রগুলি R-এ একটি অভ্যন্তরীণভাবে উন্নত সরঞ্জাম ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল (বায়োসহিটম্যাপ, একটি এখনও প্রকাশিত হতে-হওয়ার প্যাকেজ)৷তাপ মানচিত্রে উপস্থাপিত ডেনড্রোগ্রামগুলি ইউক্লিডীয় দূরত্ব মেট্রিকের সাথে ওয়ার্ডের শ্রেণিবদ্ধ ক্লাস্টারিং পদ্ধতি ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল।মোটিফ স্কোরিং ডেটার পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণের জন্য, ফিশারের সঠিক পরীক্ষা ব্যবহার করে অস্বাভাবিক স্কোরিংয়ের জন্য P মানগুলি গণনা করা হয়েছিল।অন্যান্য ডেটাসেটের জন্য P-মানগুলি ছাত্রদের টি-টেস্ট বা ANOVA ব্যবহার করে R তে গণনা করা হয়েছিল।
নির্বাচিত ফেজ ক্লোন এবং ইনসার্ট ছাড়া ফেজগুলিকে লেজের শিরা (300 μl পিবিএস-এ 2×1010 ফেজ/প্রাণী) মাধ্যমে শিরায় ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল।পারফিউশন এবং পরবর্তী স্থিরকরণের দশ মিনিট আগে, একই প্রাণীকে 100 μl DyLight594-লেবেলযুক্ত লেকটিন (ভেক্টর ল্যাবরেটরিজ ইনক।, ডিএল-1177) দিয়ে শিরায় ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল।ফেজ ইনজেকশনের 60 মিনিট পরে, 50 মিলি পিবিএস এবং 50 মিলি 4% পিএফএ/পিবিএস দিয়ে ইঁদুরের হৃদয়ে পারফিউজ করা হয়েছিল।মস্তিষ্কের নমুনাগুলি অতিরিক্তভাবে 4% পিএফএ/পিবিএস-এ রাতারাতি স্থির করা হয়েছিল এবং 4 ডিগ্রি সেলসিয়াসে রাতারাতি 30% সুক্রোজে ভিজিয়ে রাখা হয়েছিল।নমুনাগুলি OCT মিশ্রণে ফ্ল্যাশ হিমায়িত হয়।হিমায়িত নমুনার ইমিউনোহিস্টোকেমিক্যাল বিশ্লেষণ ঘরের তাপমাত্রায় 30 µm ক্রায়োসেকশনে 1% BSA দিয়ে ব্লক করা হয়েছিল এবং 4 °C তাপমাত্রায় T7 ফেজ (Novus NB 600-376A) এর বিরুদ্ধে পলিক্লোনাল FITC-লেবেলযুক্ত অ্যান্টিবডি দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল।রাতারাতি ইনকিউবেট।অবশেষে, বিভাগগুলি পিবিএস দিয়ে 3 বার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং একটি কনফোকাল লেজার মাইক্রোস্কোপ (লাইকা টিসিএস এসপি 5) দিয়ে পরীক্ষা করা হয়েছিল।
ন্যূনতম 98% বিশুদ্ধতা সহ সমস্ত পেপটাইড জেনস্ক্রিপ্ট ইউএসএ দ্বারা সংশ্লেষিত হয়েছিল, বায়োটিনিলেটেড এবং লাইওফিলাইজড।বায়োটিন এন-টার্মিনাসে একটি অতিরিক্ত ট্রিপল গ্লাইসিন স্পেসারের মাধ্যমে আবদ্ধ।ভর স্পেকট্রোমেট্রি ব্যবহার করে সমস্ত পেপটাইড পরীক্ষা করুন।
স্ট্রেপ্টাভিডিন (সিগমা S0677) বায়োটিনিলেটেড পেপটাইডের 5-গুণ সমতুল্য অতিরিক্ত, বায়োটিনিলেটেড BACE1 ইনহিবিটরি পেপটাইড, বা বায়োটিনিলেটেড BACE1 ইনহিবিটরি পেপটাইড এবং BACE1 ইনহিবিটরি পেপটাইড-এর মধ্যে SO/5DM0%-তে BACE1 ইনহিবিটরি পেপটাইডের সংমিশ্রণ (3:1 অনুপাত) মেশানো হয়েছিল।ইনজেকশনের আগে ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টা।স্ট্রেপ্টাভিডিন-কনজুগেটেড পেপটাইডগুলি সেরিব্রাল গহ্বর সহ ইঁদুরের লেজের শিরাগুলির মধ্যে একটিতে 10 মিলিগ্রাম/কেজি ডোজ দিয়ে শিরায় ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল।
স্ট্রেপ্টাভিডিন-পেপটাইড কমপ্লেক্সের ঘনত্ব ELISA দ্বারা মূল্যায়ন করা হয়েছিল।Nunc Maxisorp microtiter প্লেট (Sigma) রাতারাতি 4°C তাপমাত্রায় 1.5 μg/ml মাউস অ্যান্টি-স্ট্রেপ্টাভিডিন অ্যান্টিবডি (থার্মো, MA1-20011) দিয়ে লেপা হয়েছিল।ব্লক করার পর (ব্লকিং বাফার: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% জেলটিন, 1% BSA) ঘরের তাপমাত্রায় 2 ঘন্টা, 0.05% Tween-20/PBS (wash buffer) দিয়ে প্লেটটি ধুয়ে ফেলুন এবং 3 টি ব্লকের জন্য ভালভাবে buff CS-এর সাথে যোগ করা হয়েছে (buffer)। লাসমা 1:10,000, CSF 1:115)।তারপরে প্লেটটি সনাক্তকরণ অ্যান্টিবডি (1 μg/ml, অ্যান্টি-স্ট্রেপ্টাভিডিন-HRP, Novus NB120-7239) সহ 4°C তাপমাত্রায় রাতারাতি ইনকিউব করা হয়েছিল।তিনটি ধোয়ার পদক্ষেপের পরে, 20 মিনিট পর্যন্ত টিএমবি সাবস্ট্রেট দ্রবণে (রোচে) ইনকিউবেশনের মাধ্যমে স্ট্রেপ্টাভিডিন সনাক্ত করা হয়েছিল।1M H2SO4 দিয়ে রঙের বিকাশ বন্ধ করার পরে, 450 nm এ শোষণ পরিমাপ করুন।
স্ট্রেপ্টাভিডিন-পেপটাইড-BACE1 ইনহিবিটর কমপ্লেক্সের কার্যকারিতা নির্মাতার প্রোটোকল (ওয়াকো, 294-64701) অনুসারে Aβ(1-40) ELISA দ্বারা মূল্যায়ন করা হয়েছিল।সংক্ষেপে, CSF নমুনাগুলি স্ট্যান্ডার্ড ডাইলুয়েন্টে (1:23) মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং BNT77 ক্যাপচার অ্যান্টিবডি দিয়ে লেপা 96-ওয়েল প্লেটে 4°C তাপমাত্রায় রাতারাতি ইনকিউব করা হয়েছিল।ধোয়ার পাঁচটি ধাপের পর, এইচআরপি-সংযোজিত BA27 অ্যান্টিবডি যোগ করা হয়েছিল এবং 4° সে. তাপমাত্রায় 2 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল, তারপরে পাঁচটি ধোয়ার ধাপ অনুসরণ করা হয়েছিল।Aβ(1–40) ঘরের তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য টিএমবি দ্রবণে ইনকিউবেশন দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছিল।স্টপ দ্রবণ দিয়ে রঙের বিকাশ বন্ধ হয়ে যাওয়ার পরে, 450 এনএম-এ শোষণ পরিমাপ করুন।Aβ(1-40) ELISA এর আগে প্লাজমা নমুনাগুলি কঠিন ফেজ নিষ্কাশনের শিকার হয়েছিল।96-ওয়েল প্লেটে প্লাজমা 0.2% DEA (সিগমা) তে যোগ করা হয়েছিল এবং 30 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় ইনকিউব করা হয়েছিল।পর্যায়ক্রমে এসপিই প্লেটগুলি (ওসিস, 186000679) জল এবং 100% মিথানল দিয়ে ধোয়ার পরে, এসপিই প্লেটে প্লাজমা নমুনা যোগ করা হয়েছিল এবং সমস্ত তরল সরানো হয়েছিল।নমুনাগুলি ধুয়ে ফেলা হয়েছিল (প্রথমে 5% মিথানল দিয়ে তারপর 30% মিথানল) এবং 2% NH4OH/90% মিথানল দিয়ে নির্গত করা হয়েছিল।ধ্রুবক N2 কারেন্টে 99 মিনিটের জন্য 55 ডিগ্রি সেলসিয়াসে ইলুয়েট শুকানোর পরে, নমুনাগুলি স্ট্যান্ডার্ড ডাইলুয়েন্টগুলিতে হ্রাস করা হয়েছিল এবং উপরে বর্ণিত হিসাবে Aβ(1–40) পরিমাপ করা হয়েছিল।
এই নিবন্ধটি কীভাবে উদ্ধৃত করবেন: Urich, E. et al.ভিভোতে চিহ্নিত ট্রানজিট পেপটাইড ব্যবহার করে মস্তিষ্কে কার্গো ডেলিভারি।বিজ্ঞান.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015)।
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB এবং Moos T. টার্গেটেড থেরাপি ব্যবহার করে মস্তিষ্কে ম্যাক্রোমোলিকুলার ওষুধের ডেলিভারি।নিউরোকেমিস্ট্রি জার্নাল 113, 1-13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010)।
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., এবং Martinez-Martinez, P. রক্ত-মস্তিষ্কের বাধা জুড়ে পেপটাইড এবং প্রোটিন ওষুধের বিতরণ।Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009)।
পারড্রিজ, ডাব্লুএম রক্ত-মস্তিষ্কের বাধা: মস্তিষ্কের ওষুধের বিকাশে বাধা।NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005)।
জোহানসন, KE, ডানকান, JA, Stopa, EG, এবং Byrd, A. উন্নত ড্রাগ ডেলিভারি এবং কোরয়েড প্লেক্সাস-সিএসএফ পথের মাধ্যমে মস্তিষ্কে লক্ষ্য করার সম্ভাবনা।ফার্মাসিউটিক্যাল রিসার্চ 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005)।
পারড্রিজ, ডব্লিউএম ব্রেইন ডেলিভারির জন্য আণবিক ট্রোজান হর্স সহ বায়োফার্মাসিউটিক্যালসের আধুনিকীকরণ।Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008)।
পারড্রিজ, রক্ত-মস্তিষ্কের বাধা জুড়ে WM রিসেপ্টর-মধ্যস্থিত পেপটাইড পরিবহন।এন্ডোক্র রেভ. 7, 314–330 (1986)।
Niewoehner, J. et al.মনোভ্যালেন্ট আণবিক শাটল ব্যবহার করে থেরাপিউটিক অ্যান্টিবডিগুলির মস্তিষ্কের অনুপ্রবেশ এবং কার্যকারিতা বৃদ্ধি করুন।নিউরন 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014)।
বিয়েন-লি, এন. এট আল।ট্রান্সফারিন রিসেপ্টর (TfR) ট্রান্সপোর্ট TfR অ্যান্টিবডির অ্যাফিনিটি ভ্যারিয়েন্টের মস্তিষ্ক গ্রহণ নির্ধারণ করে।J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014)।