Nature.com দেখার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ। আপনি সীমিত CSS সমর্থন সহ একটি ব্রাউজার সংস্করণ ব্যবহার করছেন। সেরা অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি আপডেট করা ব্রাউজার ব্যবহার করার পরামর্শ দিচ্ছি (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে সামঞ্জস্যতা মোড অক্ষম করুন)। এছাড়াও, চলমান সহায়তা নিশ্চিত করার জন্য, আমরা স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়াই সাইটটি দেখাই।
একসাথে তিনটি স্লাইডের একটি ক্যারোজেল প্রদর্শন করে। একসাথে তিনটি স্লাইডের মধ্য দিয়ে যেতে পূর্ববর্তী এবং পরবর্তী বোতামগুলি ব্যবহার করুন, অথবা শেষে স্লাইডার বোতামগুলি ব্যবহার করে একবারে তিনটি স্লাইডের মধ্য দিয়ে যান।
স্ব-একত্রিত নিউরাল অর্গানেলগুলি মানব বিকাশ এবং রোগের মডেলিংয়ের জন্য একটি প্রতিশ্রুতিশীল ইন ভিট্রো প্ল্যাটফর্ম। তবে, অর্গানেলগুলির ভিভোতে বিদ্যমান সংযোগের অভাব রয়েছে, যা পরিপক্কতা সীমাবদ্ধ করে এবং আচরণ নিয়ন্ত্রণকারী অন্যান্য সার্কিটের সাথে একীকরণকে বাধা দেয়। এখানে আমরা দেখাই যে নবজাতক নগ্ন ইঁদুরের সোমাটোসেন্সরি কর্টেক্সে প্রতিস্থাপন করা মানব স্টেম সেল থেকে প্রাপ্ত কর্টিকাল অর্গানেলগুলি পরিপক্ক কোষের ধরণ তৈরি করে যা সংবেদনশীল এবং প্রেরণা-সম্পর্কিত সার্কিটে একীভূত হয়। এমআরআই বেশ কয়েকটি স্টেম সেল লাইন এবং প্রাণীতে প্রতিস্থাপন-পরবর্তী অর্গানেল বৃদ্ধি প্রকাশ করেছে, যখন একক-কোর বিশ্লেষণ কর্টিকোজেনেসিসের অগ্রগতি এবং একটি কার্যকলাপ-নির্ভর ট্রান্সক্রিপশন প্রোগ্রামের উত্থান প্রকাশ করেছে। প্রকৃতপক্ষে, প্রতিস্থাপন করা কর্টিকাল নিউরনগুলি তাদের ইন ভিট্রো প্রতিরূপের তুলনায় আরও জটিল রূপগত, সিনাপটিক এবং অভ্যন্তরীণ ঝিল্লি বৈশিষ্ট্য প্রদর্শন করে, যা টিমোথি'স সিনড্রোমে আক্রান্ত রোগীদের নিউরোনাল ত্রুটি সনাক্তকরণের অনুমতি দেয়। শারীরবৃত্তীয় এবং কার্যকরী ট্রেসিং দেখিয়েছে যে প্রতিস্থাপন করা অর্গানেলগুলি থ্যালামোকর্টিক্যাল এবং কর্টিকোকর্টিক্যাল ইনপুট গ্রহণ করে এবং নিউরাল কার্যকলাপের ভিভো রেকর্ডিংগুলি পরামর্শ দেয় যে এই ইনপুটগুলি মানব কোষে সংবেদনশীল প্রতিক্রিয়া তৈরি করতে পারে। অবশেষে, কর্টিকাল অর্গানয়েডগুলি ইঁদুরের মস্তিষ্ক জুড়ে অ্যাক্সন প্রসারিত করে এবং তাদের অপটোজেনেটিক সক্রিয়করণ পুরষ্কার-সন্ধানী আচরণের দিকে পরিচালিত করে। এইভাবে, প্রতিস্থাপিত মানব কর্টেক্স নিউরনগুলি পরিপক্ক হয় এবং আচরণ নিয়ন্ত্রণকারী হোস্টের সার্কিটে অংশগ্রহণ করে। আমরা আশা করি এই পদ্ধতিটি রোগী থেকে প্রাপ্ত কোষগুলিতে স্ট্র্যান্ড-স্তরের ফেনোটাইপ সনাক্তকরণকে সহজতর করবে যা অন্য উপায়ে সনাক্ত করা যায় না।
মানব মস্তিষ্কের বিকাশ একটি অসাধারণ স্ব-সংগঠন প্রক্রিয়া যেখানে কোষগুলি বংশবৃদ্ধি করে, পার্থক্য করে, স্থানান্তরিত হয় এবং কার্যকরী নিউরোনাল সার্কিট গঠনের জন্য সংযোগ স্থাপন করে যা সংবেদনশীল অভিজ্ঞতার মাধ্যমে আরও পরিমার্জিত হয়। মানব মস্তিষ্কের বিকাশ বোঝার ক্ষেত্রে, বিশেষ করে রোগের প্রেক্ষাপটে, একটি গুরুত্বপূর্ণ সমস্যা হল মস্তিষ্কের টিস্যুতে অ্যাক্সেসের অভাব। মানব কর্টেক্স অর্গানয়েড (hCO; যা মানব কর্টেক্স গোলক নামেও পরিচিত) সহ স্ব-সংগঠিত অর্গানেলগুলি 2,3,4,5,6 উৎপন্ন করতে পারে। তবে, বেশ কয়েকটি সীমাবদ্ধতা স্নায়ু সার্কিটের বিকাশ এবং কার্যকারিতা বোঝার জন্য তাদের বিস্তৃত প্রয়োগকে সীমাবদ্ধ করে। বিশেষ করে, ভিভোতে উপস্থিত কিছু মাইক্রোএনভায়রনমেন্টাল এবং সংবেদনশীল ইনপুটগুলির অনুপস্থিতির কারণে hCO পরিপক্কতা সীমিত কিনা তা স্পষ্ট নয়। উপরন্তু, যেহেতু hCO গুলি এমন সার্কিটে একত্রিত হয় না যা আচরণগত ফলাফল তৈরি করতে পারে, জেনেটিকালি জটিল এবং আচরণগত নিউরোসাইকিয়াট্রিক ব্যাধি মডেলিংয়ে তাদের উপযোগিতা বর্তমানে সীমিত।
একটি অক্ষত জীবন্ত মস্তিষ্কে hCO প্রতিস্থাপন এই সীমাবদ্ধতাগুলি কাটিয়ে উঠতে পারে। পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে ইঁদুর কর্টেক্সে প্রতিস্থাপিত মানব নিউরনগুলি বেঁচে থাকতে, প্রজেক্ট করতে এবং ইঁদুর কোষগুলির সাথে যোগাযোগ করতে সক্ষম হয়7,8,9,10,11,12। তবে, এই পরীক্ষাগুলি সাধারণত প্রাপ্তবয়স্ক প্রাণীদের উপর করা হয়, যা সিনাপটিক এবং অ্যাক্সোনাল ইন্টিগ্রেশনকে সীমাবদ্ধ করতে পারে। এখানে, আমরা একটি প্রতিস্থাপনের দৃষ্টান্ত বর্ণনা করি যেখানে আমরা প্লাস্টিক বিকাশের প্রাথমিক পর্যায়ে ইমিউনোডেফিসিয়েন্ট ইঁদুরের প্রাথমিক সোমাটোসেন্সরি কর্টেক্স (S1) তে hiPS কোষ থেকে প্রাপ্ত 3D hCO প্রতিস্থাপন করেছি। প্রতিস্থাপন করা hCO (t-hCO) নিউরনগুলি উল্লেখযোগ্য পরিপক্কতার মধ্য দিয়ে যায়, থ্যালামোকর্টিক্যাল এবং কর্টিকাল-কর্টিক্যাল ইনপুট গ্রহণ করে যা সংবেদনশীল প্রতিক্রিয়া তৈরি করে এবং পুরষ্কার-সন্ধানী আচরণ চালানোর জন্য ইঁদুরের মস্তিষ্কে অ্যাক্সোনাল প্রক্ষেপণ প্রসারিত করে। t-hCO এর বর্ধিত পরিপক্কতা টিমোথি'স সিনড্রোম (TS) রোগীদের মধ্যে নিউরোনাল ত্রুটি প্রকাশ করেছে, যা ভোল্টেজ-সংবেদনশীল L-টাইপ CaV1.2 ক্যালসিয়াম চ্যানেলে (CACNA1C দ্বারা এনকোডেড) মিউটেশনের কারণে সৃষ্ট একটি গুরুতর জেনেটিক ব্যাধি।
ভিভো সার্কিটে মানুষের কর্টিকাল নিউরন অধ্যয়ন করার জন্য, আমরা স্টেরিওট্যাকটিক্যালি অক্ষত 3D hCO কে প্রারম্ভিক প্রসবোত্তর অ্যাথাইমিক ইঁদুরের S1 তে প্রতিস্থাপন করেছি (প্রসবোত্তর 3-7 দিন) (চিত্র 1a এবং চিত্র 1a-c এর বর্ধিত তথ্য)। এই মুহুর্তে, থ্যালামোকর্টিক্যাল এবং কর্টিকোকর্টিক্যাল অ্যাক্সোনাল প্রক্ষেপণগুলি এখনও তাদের S1 ইনর্ভেশন সম্পন্ন করেনি (রেফারেন্স 13)। সুতরাং, এই পদ্ধতিটি t-hCO ইন্টিগ্রেশন সর্বাধিক করার জন্য ডিজাইন করা হয়েছে এবং এন্ডোজেনাস সার্কিটের উপর প্রভাব কমিয়ে আনা হয়েছে। জীবন্ত প্রাণীদের মধ্যে t-hCO এর অবস্থান কল্পনা করার জন্য, আমরা প্রতিস্থাপনের 2-3 মাস পরে ইঁদুরের T2-ওজনযুক্ত MRI মস্তিষ্ক পুনর্গঠন করেছি (চিত্র 1b এবং বর্ধিত তথ্য, চিত্র 1d)। t-hCO সহজেই পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল এবং t-hCO এর আয়তন পরিমাপ স্থির স্লাইস থেকে গণনা করা পরিমাপের অনুরূপ ছিল (বর্ধিত তথ্য চিত্র 1d,e; P > 0.05)। t-hCO সহজেই পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল এবং t-hCO এর আয়তন পরিমাপ স্থির স্লাইস থেকে গণনা করা পরিমাপের অনুরূপ ছিল (বর্ধিত তথ্য চিত্র 1d,e; P > 0.05)। t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расшированных срезов, e. P> 0,05)। t-hCO সহজেই পর্যবেক্ষণ করা সম্ভব হয়েছিল, এবং আয়তনগত t-hCO পরিমাপ স্থির অংশের জন্য গণনা করা পরিমাপের অনুরূপ ছিল (প্রসারিত তথ্য, চিত্র 1d, e; P > 0.05)।很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）।很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расшированных срезов, e. P> 0,05)। t-hCO সহজেই পর্যবেক্ষণ করা সম্ভব হয়েছিল, এবং আয়তনগত t-hCO পরিমাপ স্থির অংশের জন্য গণনা করা পরিমাপের অনুরূপ ছিল (প্রসারিত তথ্য, চিত্র 1d, e; P > 0.05)।প্রতিস্থাপনের প্রায় 2 মাস পরে আমরা 81% প্রতিস্থাপিত প্রাণীর মধ্যে t-hCO নির্ণয় করেছি (n = 72 প্রাণী; 10টি hiPS কোষ লাইন থেকে hCO; পরিপূরক সারণি 1-এ hiPS কোষ লাইন)। এর মধ্যে 87% সেরিব্রাল কর্টেক্সে অবস্থিত ছিল (চিত্র 1c)। একই প্রতিস্থাপিত ইঁদুরের একাধিক সময় বিন্দুতে সিরিয়াল MRI স্ক্যান করে, আমরা 3 মাসের মধ্যে t-hCO আয়তনে নয় গুণ বৃদ্ধি পেয়েছি (চিত্র 1d এবং প্রসারিত তথ্য, চিত্র 1f)। প্রতিস্থাপনের 12 মাস পরে প্রতিস্থাপন করা প্রাণীদের বেঁচে থাকার হার (74%) বেশি ছিল (প্রসারিত তথ্য, চিত্র 1g এবং পরিপূরক সারণি 2), এবং কোনও প্রকাশ্য মোটর বা স্মৃতিশক্তির দুর্বলতা, গ্লাইওসিস বা ইলেক্ট্রোএনসেফালোগ্রাম (EEG) পাওয়া যায়নি। তথ্য চিত্র 1g এবং পরিপূরক সারণি 2)। 1h–m এবং 3e)।
a, পরীক্ষামূলক নকশার পরিকল্পিত। hiPS কোষ থেকে প্রাপ্ত hCO কে 30-60 দিনের মধ্যে নবজাতক নগ্ন ইঁদুরের S1-এ প্রতিস্থাপন করা হয়েছিল। b, T2-ওজনযুক্ত করোনাল এবং অনুভূমিক MRI চিত্রগুলি প্রতিস্থাপনের 2 মাস পরে S1-এ t-hCO দেখায়। স্কেল বার, 2 মিমি। c, প্রতিটি hiPS কোষ লাইনের জন্য দেখানো এনগ্রাফ্টমেন্ট সাফল্যের হারের পরিমাণ (n = 108, বারের মধ্যে সংখ্যাগুলি hIPS কোষ লাইন প্রতি t-hCO পরিমাণ নির্দেশ করে) এবং কর্টিকাল বা সাবকর্টিক্যাল অবস্থান (n = 88)। d, একটি করোনারি ধমনীর MRI চিত্র (বাম; স্কেল বার, 3 মিমি) এবং সংশ্লিষ্ট 3D ভলিউমেট্রিক পুনর্গঠন (স্কেল বার, 3 মিমি) 3 মাস ধরে t-hCO বৃদ্ধি দেখায়। e, ইঁদুরের সেরিব্রাল কর্টেক্সে t-hCO প্যাটার্নের পর্যালোচনা। স্কেল বার, 1 মিমি। f, t-hCO এর প্রতিনিধিত্বমূলক ইমিউনোসাইটোকেমিক্যাল চিত্রগুলি উপরে বাম থেকে ডানে দেখানো হয়েছে (ডিফারেন্সিশনের সময়): PPP1R17 (4 মাস বয়সী), NeuN (8 মাস বয়সী), SOX9 এবং GFAP (8 মাস বয়সী), PDGFRα; (8 মাস), MAP2 (8 মাস) এবং IBA1 (8 মাস)। স্কেল বার, 20 µm। HNA এর সহ-প্রকাশ মানুষের উৎপত্তির কোষগুলিকে নির্দেশ করে। g, snRNA-seq: Seurat ইন্টিগ্রেশনের পরে সমস্ত উচ্চ-মানের t-hCO নিউক্লিয়াসের ইউনিফাইড ম্যানিফোল্ড এবং প্রক্ষেপণ (UMAP) মাত্রিকতা হ্রাস ইমেজিং (n=3 t-hCO নমুনা, n=2 hiPS কোষ লাইন)। অ্যাস্ট্রোসাইট, অ্যাস্ট্রোসাইট লাইনের কোষ; সাইক প্রোগ, সঞ্চালনকারী প্রোজেনিটর; GluN DL, গভীর গ্লুটামেটারজিক নিউরন; GluN DL/SP, গভীর এবং সাবলামেলার গ্লুটামেটারজিক নিউরন; GluN UL, উপরের স্তরের গ্লুটামেটারজিক নিউরন; অলিগোডেনড্রোসাইট, অলিগোডেনড্রোসাইট; OPC, অলিগোডেনড্রোসাইট প্রোজেনিটর কোষ; RELN, রিলিন নিউরন। h, hCO গ্লুটামেটেরজিক নিউরনের তুলনায় t-hCO গ্লুটামেটেরজিক নিউরনে উল্লেখযোগ্যভাবে আপরেগুলেটেড জিনের জিন অন্টোলজি (GO) টার্ম সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণ (P < 0.05, ভাঁজ পরিবর্তন > 2, নিউক্লিয়ার কমপক্ষে 10% এ প্রকাশিত)। h, hCO গ্লুটামেটেরজিক নিউরনের তুলনায় t-hCO গ্লুটামেটেরজিক নিউরনে উল্লেখযোগ্যভাবে আপরেগুলেটেড জিনের জিন অন্টোলজি (GO) টার্ম সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণ (P < 0.05, ভাঁজ পরিবর্তন > 2, নিউক্লিয়ার কমপক্ষে 10% এ প্রকাশিত)। h, Анализ обогащения терминов জিন অন্টোলজি (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность, эсяк2 изямре > по крайней мере в 10% ядер) h, hCO গ্লুটামেটেরজিক নিউরনের তুলনায় t-hCO গ্লুটামেটেরজিক নিউরনে উল্লেখযোগ্য সক্রিয়তা (সমন্বয়কৃত P<0.05, ভাঁজ পরিবর্তন >2, কমপক্ষে 10% নিউক্লিয়াসে প্রকাশ) সহ জিনের জন্য জিন অন্টোলজি (GO) টার্ম সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণ। h,与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P <0. 2, 在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析. h, 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 变 变 后 05 পি <变化> 2, 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 至少 10% 的本体论(GO) 术语富集分析. h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайнев %1меней) глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) অ্যানালিজ тербоянах h, t-hCO গ্লুটামেটেরজিক নিউরনে জিনগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে আপরেগুলেটেড ছিল (P < 0.05, ভাঁজ পরিবর্তন > 2, কমপক্ষে 10% নিউক্লিয়াসে প্রকাশিত) hCO গ্লুটামেটেরজিক নিউরনের তুলনায় সমৃদ্ধকরণ শব্দটির অন্টোলজিক্যাল (GO) বিশ্লেষণ।বিন্দুযুক্ত রেখাটি 0.05 এর aq মান নির্দেশ করে। i, একটি রেফারেন্স 22 snRNA-seq প্রাপ্তবয়স্ক মোটর কর্টেক্স ডেটাসেট থেকে লেবেল স্থানান্তর ব্যবহার করে t-hCO তে GluN কোষের ধরণের UMAP ইমেজিং। CT — কর্টিকোথ্যালামিক কোষ, ET — এক্সট্রাসেরিব্রাল কোষ, IT — অভ্যন্তরীণ টেলেন্সেফালিক কোষ, NP — প্রক্ষেপণের কাছাকাছি।
এরপর আমরা সাইটোআর্কিটেকচার এবং t-hCO এর সামগ্রিক কোষীয় গঠন মূল্যায়ন করেছি। ইঁদুরের এন্ডোথেলিয়াল কোষের অ্যান্টিবডি স্টেইনিং t-hCO এর সাথে ভাস্কুলারাইজেশন প্রকাশ করেছে, যেখানে IBA1 স্টেইনিং গ্রাফ্ট জুড়ে ইঁদুর মাইক্রোগ্লিয়ার উপস্থিতি প্রকাশ করেছে (চিত্র 1f এবং প্রসারিত তথ্য, চিত্র 3c, d)। ইমিউনোস্টেইনিং মানব নিউক্লিয়ার অ্যান্টিজেন (HNA) পজিটিভ কোষগুলিকে PPP1R17 (কর্টিক্যাল প্রোজেনেটর), NeuN (নিউরন), SOX9 এবং GFAP (গ্লিয়াল-প্রাপ্ত কোষ) অথবা PDGFRα (অলিগোডেনড্রোসাইট প্রোজেনেটর) সহ-প্রকাশ করে (চিত্র 1f) প্রকাশ করেছে। একক কোষ রেজোলিউশনে t-hCO এর কোষীয় গঠন অধ্যয়ন করার জন্য, আমরা প্রায় 8 মাস ধরে পার্থক্য করার পরে একক-কোর RNA সিকোয়েন্সিং (snRNA-seq) সম্পাদন করেছি। ইঁদুরের নিউক্লিয়াসের বাল্ক পরিস্রাবণ এবং অপসারণের ফলে 21,500টি উচ্চ-মানের মানব মনোনিউক্লিয়ার মানচিত্র পাওয়া গেছে (চিত্র 1g এবং প্রসারিত তথ্য, চিত্র 4a, b)। সাধারণ কোষ-ধরণের চিহ্নিতকারীর প্রকাশের ধরণগুলি প্রধান কর্টিকাল কোষ শ্রেণীর ক্লাস্টার চিহ্নিত করেছে, যার মধ্যে রয়েছে গভীর এবং পৃষ্ঠীয় গ্লুটামেটেরজিক নিউরন, সঞ্চালনকারী প্রোজেনিটার, অলিগোডেনড্রোসাইট এবং অ্যাস্ট্রোসাইট বংশ (চিত্র 1g, প্রসারিত তথ্য, চিত্র 4c, এবং পরিপূরক সারণি 3)। SATB2 এবং CTIP2 এর জন্য ইমিউনোস্টেইনিং দেখিয়েছে যে কর্টিকাল উপপ্রকারের উপস্থিতি সত্ত্বেও, t-hCO স্পষ্ট শারীরবৃত্তীয় স্তরবিন্যাস দেখায়নি (প্রসারিত তথ্য, চিত্র 3a)। পর্যায়-মিলিত snRNA-seq hCO অলিগোডেনড্রোসাইটের অনুপস্থিতি এবং GABAergic নিউরনের উপস্থিতি সহ কয়েকটি ব্যতিক্রম ছাড়া বিস্তৃতভাবে অনুরূপ কোষ শ্রেণী তৈরি করেছে, যা পার্শ্বীয় প্রোজেনিটার কোষের জন্য পূর্বে রিপোর্ট করা অনুকূল ইন ভিট্রো অবস্থার প্রতিফলন করতে পারে15 (প্রসারিত তথ্য, চিত্র 4f – i এবং পরিপূরক সারণি 4)। ডিফারেনশিয়াল জিন এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণ t-hCO এবং hCO এর মধ্যে গ্লুটামেটেরজিক নিউরনের মধ্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য প্রকাশ করেছে (পরিপূরক সারণি 5), যার মধ্যে রয়েছে নিউরোনাল পরিপক্কতার সাথে সম্পর্কিত জিনের সেটগুলির সক্রিয়করণ যেমন সিনাপটিক সিগন্যালিং, ডেনড্রাইটিক স্থানীয়করণ এবং ভোল্টেজ-গেটেড চ্যানেল কার্যকলাপ (চিত্র 1h এবং পরিপূরক সারণি 5)। টেবিল 6)। সেই অনুযায়ী, কর্টিকাল গ্লুটামেটেরজিক t-hCO নিউরনগুলি ত্বরিত ট্রান্সক্রিপশনাল পরিপক্কতা প্রদর্শন করেছে।
t-hCO-তে এই ট্রান্সক্রিপশনাল পরিবর্তনগুলি hCO ইন ভিট্রো এবং t-hCO ইন ভিভোর মধ্যে রূপগত পার্থক্যের সাথে সম্পর্কিত কিনা তা স্পষ্ট করার জন্য, আমরা 7-8 মাস পার্থক্যের পরে তীব্র অংশগুলিতে পর্যায়-মিলিত বায়োসাইটিন-পূর্ণ hCO এবং hCO পুনর্গঠন করেছি। hCO নিউরন (চিত্র 2a)। t-hCO নিউরনগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে বড় ছিল, সোমা ব্যাসের 1.5 গুণ, ডেনড্রাইটের দ্বিগুণ এবং ইন ভিট্রো hCO (চিত্র 2b) এর তুলনায় মোট ডেনড্রাইটিক দৈর্ঘ্যে ছয় গুণ বৃদ্ধি পেয়েছিল। এছাড়াও, আমরা hCO নিউরনের তুলনায় t-hCO নিউরনে ডেনড্রাইটিক মেরুদণ্ডের ঘনত্ব উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি লক্ষ্য করেছি (চিত্র 2c)। এটি ইঙ্গিত দেয় যে t-hCO নিউরনগুলি ব্যাপক ডেনড্রাইটিক প্রসারণ এবং শাখা প্রশাখার মধ্য দিয়ে যায়, যা ক্রমাগত কোষ বিস্তারের সাথে মিলিত হয়ে প্রতিস্থাপনের পরে t-hCO-এর নিবিড় বৃদ্ধিতে অবদান রাখতে পারে (চিত্র 1d এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র 1f)। এটি আমাদের ইলেক্ট্রোফিজিওলজিক্যাল বৈশিষ্ট্যগুলি তদন্ত করতে প্ররোচিত করেছিল। ঝিল্লির ক্যাপাসিট্যান্স আট গুণ বেশি ছিল (প্রসারিত তথ্য, চিত্র 8d), বিশ্রাম-অবস্থার ঝিল্লির সম্ভাবনা বেশি হাইপারপোলারাইজড ছিল (প্রায় 20 mV), এবং বর্তমান ইনজেকশন hCO নিউরনের তুলনায় t-hCO নিউরনে সর্বোচ্চ উত্তেজনার হার বেশি করে। ইন ভিট্রো (চিত্র 2d), e), যা t-hCO এর বৃহত্তর এবং আরও জটিল রূপগত বৈশিষ্ট্যের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। এছাড়াও, t-hCO নিউরনে স্বতঃস্ফূর্ত উত্তেজনাপূর্ণ পোস্টসিন্যাপটিক বর্তমান ইভেন্টের (EPSC) ফ্রিকোয়েন্সি উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল (চিত্র 2f), যা ইঙ্গিত করে যে t-hCO নিউরনে পরিলক্ষিত ডেনড্রাইটিক মেরুদণ্ডের বর্ধিত ঘনত্ব কার্যকরী উত্তেজনার সাথে যুক্ত ছিল। যৌন সিন্যাপস। আমরা লেবেলযুক্ত গ্লুটামেটেরজিক নিউরন রেকর্ড করে ইন ভিট্রোতে hCO নিউরনের অপরিণত চরিত্র নিশ্চিত করেছি (প্রসারিত তথ্য, চিত্র 6a-c)।
a, ৮ মাস পার্থক্যের পর বায়োসাইটিন-পূর্ণ hCO এবং t-hCO নিউরনের 3D পুনর্গঠন। b, রূপগত বৈশিষ্ট্যের পরিমাণ নির্ধারণ (n = 8 hCO নিউরন, n = 6 t-hCO নিউরন; **P = 0.0084, *P = 0.0179 এবং ***P < 0.0001)। b, রূপগত বৈশিষ্ট্যের পরিমাণ নির্ধারণ (n = 8 hCO নিউরন, n = 6 t-hCO নিউরন; **P = 0.0084, *P = 0.0179 এবং ***P < 0.0001)। б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179, * P = 0,0179, *** 0179)। b, রূপগত বৈশিষ্ট্যের পরিমাণ নির্ধারণ (n=8 hCO নিউরন, n=6 t-hCO নিউরন; **P=0.0084, *P=0.0179, এবং ***P<0.0001)। b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179 和*0） 0.0179 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179 和*0） 0.0179 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179, * P = 0,0179, *** 0179)। b, রূপগত বৈশিষ্ট্যের পরিমাণ নির্ধারণ (n=8 hCO নিউরন, n=6 t-hCO নিউরন; **P=0.0084, *P=0.0179, এবং ***P<0.0001)।c, ৮ মাস পার্থক্যের পর hCO এবং t-hCO ডেনড্রাইটিক শাখার 3D পুনর্গঠন। লাল তারকাচিহ্নগুলি সম্ভাব্য ডেনড্রাইটিক মেরুদণ্ড নির্দেশ করে। ডেনড্রাইটিক মেরুদণ্ডের ঘনত্বের পরিমাণ নির্ধারণ (n = 8 hCO নিউরন, n = 6 t-hCO নিউরন; **P = 0.0092)। d, বিশ্রামরত ঝিল্লি বিভবের পরিমাণ নির্ধারণ (n = 25 hCO নিউরন, n = 16 t-hCO নিউরন; ***P < 0.0001)। d, বিশ্রামরত ঝিল্লি বিভবের পরিমাণ নির্ধারণ (n = 25 hCO নিউরন, n = 16 t-hCO নিউরন; ***P < 0.0001)। d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001)। d, বিশ্রামের ঝিল্লি বিভব পরিমাণ নির্ধারণ (n = 25 hCO নিউরন, n = 16 t-hCO নিউরন; ***P < 0.0001)। d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）। d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）। d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001)। d, বিশ্রামের ঝিল্লি বিভব পরিমাণ নির্ধারণ (n = 25 hCO নিউরন, n = 16 t-hCO নিউরন; ***P < 0.0001)। e, কারেন্ট ইনজেকশন বৃদ্ধি এবং সর্বাধিক ফায়ারিং হারের পরিমাণ নির্ধারণের মাধ্যমে hCO এবং t-hCO তে পুনরাবৃত্তিমূলক অ্যাকশন পটেনশিয়াল ফায়ারিং (n = 25 hCO নিউরন, n = 16 t-hCO নিউরন; ***P < 0.0001)। e, কারেন্ট ইনজেকশন বৃদ্ধি এবং সর্বাধিক ফায়ারিং হারের পরিমাণ নির্ধারণের মাধ্যমে hCO এবং t-hCO তে পুনরাবৃত্তিমূলক অ্যাকশন পটেনশিয়াল ফায়ারিং (n = 25 hCO নিউরন, n = 16 t-hCO নিউরন; ***P < 0.0001)। e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и количественная оценка максиала максиала действия возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001)। e, hCO এবং t-hCO-তে অ্যাকশন পটেনশিয়াল পুনঃফায়ারিং, যা বর্তমান বৃদ্ধি এবং সর্বাধিক ফায়ারিং হারের পরিমাণ নির্ধারণের মাধ্যমে প্ররোচিত (n = 25 hCO নিউরন, n = 16 t-hCO নিউরন; *** P < 0.0001)। e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的釀大放电率的鏪 5h2神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；**P <0.0001）। E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量化 丞 5 h n 5 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） . e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и количественкая цветаминка скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001)। e, বর্ধিত কারেন্ট সরবরাহ এবং সর্বাধিক ফায়ারিং হারের পরিমাণ নির্ধারণের ফলে hCO এবং t-hCO অ্যাকশন পটেনশিয়ালের পুনরাবৃত্তিমূলক অগ্নিসংযোগ (n = 25 hCO নিউরন, n = 16 t-hCO নিউরন; *** P < 0.0001)। f, 8 মাসের পার্থক্যের সময় hCO এবং t-hCO নিউরনে স্বতঃস্ফূর্ত EPSCs (sEPSCs), এবং সিনাপটিক ইভেন্টের ফ্রিকোয়েন্সির পরিমাণ নির্ধারণ (n = 25 hCO নিউরন, n = 17 t-hCO নিউরন; ***P < 0.0001)। f, 8 মাসের পার্থক্যের সময় hCO এবং t-hCO নিউরনে স্বতঃস্ফূর্ত EPSCs (sEPSCs), এবং সিনাপটিক ইভেন্টের ফ্রিকোয়েন্সির পরিমাণ নির্ধারণ (n = 25 hCO নিউরন, n = 17 t-hCO নিউরন; ***P < 0.0001)। f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка = частоты сипыхинах нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO *** P <0,0001)। f, সিন্যাপটিক ইভেন্ট হারের পার্থক্য এবং পরিমাণ নির্ধারণের 8 মাসের মধ্যে hCO এবং t-hCO নিউরনে স্বতঃস্ফূর্ত EPSCs (sEPSCs) (n=25 hCO নিউরন, n=17 t-hCO নিউরন; ***P<0.0001)। f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化（烞烞烞烜17 টি-এইচসিও 神经元；**P <0.0001）। f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼（CON神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0.0001）। f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка = частоты сипыхинах нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO *** পি <0,0001)। f, সিন্যাপটিক ইভেন্ট হারের পার্থক্য এবং পরিমাণ নির্ধারণের 8 মাসের সময় hCO এবং t-hCO নিউরনে স্বতঃস্ফূর্ত EPSCs (sEPSCs) (n = 25 hCO নিউরন, n = 17 t-hCO নিউরন; *** P<0.0001)।bf এর জন্য, 1208-2 লাইনে hCO এবং t-hCO একই ডিফারেনশিয়াল ব্যাচ থেকে নেওয়া হয়েছে যা সমান্তরালভাবে রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছে। g, t-hCO গ্লুটামেটেরজিক নিউরনে জিনের জিন সেট সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণ (একতরফা ফিশারের সঠিক পরীক্ষা) উল্লেখযোগ্যভাবে আপরেগুলেটেড (P < 0.05, ভাঁজ পরিবর্তন > 2, নিউক্লিয়ার কমপক্ষে 10% এ প্রকাশিত) hCO গ্লুটামেটেরজিক নিউরনের তুলনায় একটি ইন ভিভো মাউস স্টাডি থেকে প্রাথমিক-প্রতিক্রিয়া (ERG) এবং লেট-প্রতিক্রিয়া (LRG) কার্যকলাপ-নির্ভর জিনের জিন সেট এবং ইন ভিট্রো নিউরন থেকে মানব-নির্দিষ্ট LRG উভয়ের জিন সেট সহ। g, t-hCO গ্লুটামেটেরজিক নিউরনে জিনের জিন সেট সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণ (একতরফা ফিশারের সঠিক পরীক্ষা) উল্লেখযোগ্যভাবে আপরেগুলেটেড (P < 0.05, ভাঁজ পরিবর্তন > 2, নিউক্লিয়ার কমপক্ষে 10% এ প্রকাশিত) hCO গ্লুটামেটেরজিক নিউরনের তুলনায় একটি ইন ভিভো মাউস স্টাডি থেকে প্রাথমিক-প্রতিক্রিয়া (ERG) এবং লেট-প্রতিক্রিয়া (LRG) কার্যকলাপ-নির্ভর জিনের জিন সেট এবং ইন ভিট্রো নিউরন থেকে মানব-নির্দিষ্ট LRG উভয়ের জিন সেট সহ। g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацией (скорректирован,
এক্স ভিভো স্লাইসে পরিলক্ষিত t-hCO এর বর্ধিত কার্যকলাপের উপর ভিত্তি করে, snRNA-seq hCO ইন ভিট্রোর তুলনায় t-hCO তে জিন ট্রান্সক্রিপ্টের একটি কার্যকলাপ-নির্ভর আপরেগুলেশন প্রকাশ করেছে। গ্লুটামেটার্জিক t-hCO নিউরনগুলি দেরী প্রতিক্রিয়া কার্যকলাপ নিয়ন্ত্রণকারী জিনের উচ্চ স্তর প্রকাশ করেছে (চিত্র 2g,h), যা ইঁদুর এবং মানুষের নিউরনের পূর্ববর্তী গবেষণায় পাওয়া গিয়েছিল16,17। উদাহরণস্বরূপ, BDNF18, SCG2, এবং OSTN, একটি প্রাইমেট-নির্দিষ্ট কার্যকলাপ-নিয়ন্ত্রক জিন, hCO নিউরনের তুলনায় t-hCO নিউরনে বর্ধিত অভিব্যক্তি দেখিয়েছে (চিত্র 2g-i)। সুতরাং, ট্রান্সক্রিপশনাল, রূপগত এবং কার্যকরী বিশ্লেষণ দ্বারা t-hCO নিউরনগুলি hCO নিউরনের তুলনায় বর্ধিত পরিপক্কতা বৈশিষ্ট্য প্রদর্শন করেছে।
মানুষের মস্তিষ্কের বিকাশের সাথে t-hCO পরিপক্কতার সম্পর্ক আরও মূল্যায়ন করার জন্য, আমরা ভ্রূণ এবং প্রাপ্তবয়স্ক কর্টিকাল কোষের ধরণ 19,20 এবং প্রাপ্তবয়স্ক 21,22 এর ট্রান্সক্রিপ্টোমিক তুলনা করেছি, পাশাপাশি বিকাশের সময় কর্টিকাল জিন এক্সপ্রেশন 23 এর উপর বিস্তৃত তথ্য (প্রসারিত তথ্য, চিত্র 5)। পূর্ববর্তী কাজ 24 এর সাথে, 7-8 মাসের পার্থক্যে বিশ্বব্যাপী hCO এবং t-hCO ট্রান্সক্রিপ্টোম পরিপক্কতার অবস্থা ব্যাপকভাবে ইন ভিভো বিকাশের সময়ের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ এবং দেরী ভ্রূণের জীবনের সমতুল্য (বর্ধিত তথ্য চিত্র 5a)। উল্লেখযোগ্যভাবে, আমরা বয়স-মিলিত hCO এর তুলনায় t-hCO তে ট্রান্সক্রিপ্টোম পরিপক্কতা বৃদ্ধি লক্ষ্য করেছি, সেইসাথে সিনাপটোজেনেসিস, অ্যাস্ট্রোজেনেসিস এবং মাইলিনেশনের সাথে সম্পর্কিত ট্রান্সক্রিপ্টোম সক্রিয়করণ (প্রসারিত তথ্য, চিত্র 5b-d)। কোষীয় স্তরে, আমরা t-hCO তে একটি পাতলা কর্টেক্স সাবটাইপের প্রমাণ পেয়েছি, যেখানে গ্লুটামেটেরজিক নিউরনের ক্লাস্টারগুলি প্রাপ্তবয়স্ক L2/3, L5 এবং L6 নিউরন সাবটাইপের সাথে ওভারল্যাপ করে (চিত্র 1i)। বিপরীতে, গর্ভাবস্থার মাঝামাঝি সময়ে গ্লুটামেটেরজিক t-hCO নিউরন এবং ভ্রূণের কর্টিকাল নিউরনের মধ্যে ক্লাস্টার ওভারল্যাপ আরও সীমিত ছিল (প্রসারিত তথ্য, চিত্র 5e-j)। t-hCO নিউরনগুলি মানুষের প্রসবোত্তর নিউকর্টিক্যাল নিউরনের সাথে কার্যকরীভাবে মিল কিনা তা নির্ধারণ করার জন্য, আমরা মানুষের প্রসবোত্তর কর্টেক্সের তীক্ষ্ণ অংশে মানুষের L2/3 পিরামিডাল নিউরনের ইলেক্ট্রোফিজিওলজিক্যাল রেকর্ডিং এবং শারীরবৃত্তীয় পুনর্গঠন সম্পাদন করেছি (প্রসারিত তথ্য, চিত্র 7a)। L2/3 পিরামিডাল নিউরনের ইলেক্ট্রোফিজিওলজিক্যাল বৈশিষ্ট্যগুলি t-hCO পিরামিডাল নিউরনের (প্রসারিত তথ্য, চিত্র 7e) অনুরূপ ছিল। রূপগতভাবে, প্রসবোত্তর মানব নমুনা থেকে প্রাপ্ত L2/3 নিউরনগুলি hCO এর তুলনায় t-hCO এর সাথে বেশি মিল ছিল, যদিও L2/3 কোষগুলি দীর্ঘ ছিল, সামগ্রিকভাবে আরও শাখা ধারণ করেছিল এবং মেরুদণ্ডের ঘনত্ব বেশি ছিল (চিত্র 3g এবং প্রসারিত তথ্য, চিত্র 7b-)। G)।
a, নিয়ন্ত্রণ এবং TS hiPS কোষ লাইন দ্বারা উৎপাদিত hCO এর নবজাতক ইঁদুরের মধ্যে প্রতিস্থাপন। b, 8 মাস পার্থক্যের পর বায়োসাইটিন-ভরা t-hCO নিউরনের 3D পুনর্গঠন। c, গড় ডেনড্রাইটিক দৈর্ঘ্যের পরিমাণ নির্ধারণ (n = 19 নিয়ন্ত্রণ নিউরন, n = 21 TS নিউরন; **P = 0.0041)। d, নিয়ন্ত্রণ থেকে 3D-পুনর্গঠিত ডেনড্রাইটিক শাখা এবং TS t-hCO8 মাসের পার্থক্যের সময়, এবং ডেনড্রাইটিক মেরুদণ্ডের ঘনত্বের পরিমাণ নির্ধারণ (n = 16 নিয়ন্ত্রণ নিউরন, n = 21 টিএস নিউরন, ***P < 0.0001)। d, নিয়ন্ত্রণ থেকে 3D-পুনর্গঠিত ডেনড্রাইটিক শাখা এবং TS t-hCO8 মাসের পার্থক্যের সময়, এবং ডেনড্রাইটিক মেরুদণ্ডের ঘনত্বের পরিমাণ নির্ধারণ (n = 16 নিয়ন্ত্রণ নিউরন, n = 21 টিএস নিউরন, ***P < 0.0001)। d, 3D-রিকোনস্ট্রুকসিয়া ডেনড্রিটনস ভিয়েট из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оцедритных онлайн шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001)। d, ৮ মাসের পার্থক্য এবং ডেনড্রাইটিক মেরুদণ্ডের ঘনত্ব পরিমাপের সময় নিয়ন্ত্রণ এবং t-hCO TS থেকে ডেনড্রাইটিক শাখাগুলির 3D পুনর্গঠন (n=16 নিয়ন্ত্রণ নিউরন, n=21 TS নিউরন, ***P<0.0001)। d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16个煥烦的量化（n 21 个TS 神经元,***P <0.0001）। d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 只縖 61元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0.0001 ）। d, 3D-রিকোনস্ট্রুকসিয়া ডেন্ড্রিটনিখ ভেটভেই কনট্রোল্যা এবং টিএস টি-এইচসিও চেরেজ 8 মেসেট্যাসেভ ডিফফেরেঞ্জিরোভকি এবং কোলিচেস্টভেন্সিনায়া шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001)। d, ৮ মাসের পার্থক্য এবং ডেনড্রাইটিক মেরুদণ্ডের ঘনত্ব পরিমাপের সময় নিয়ন্ত্রণ ডেনড্রাইটিক শাখা এবং TS t-hCO3 এর 3D পুনর্গঠন (n=16 নিয়ন্ত্রণ নিউরন, n=21 TS নিউরন, ***P<0.0001)।লাল তারকাচিহ্নগুলি অনুমানমূলক ডেনড্রাইটিক মেরুদণ্ড নির্দেশ করে। e, নিয়ন্ত্রণে স্বতঃস্ফূর্ত EPSC এবং 8 মাস পার্থক্যের পরে TS t-hCO নিউরন। f, ক্রমবর্ধমান ফ্রিকোয়েন্সি প্লট এবং সিনাপটিক ইভেন্টগুলির ফ্রিকোয়েন্সি এবং প্রশস্ততার পরিমাণ নির্ধারণ (n=32 নিয়ন্ত্রণ নিউরন, n=26 TS নিউরন; **P=0.0076 এবং P=0.8102)। g, hCO এবং t-hCO তে TS এবং নিয়ন্ত্রণ নিউরনের Scholl বিশ্লেষণ। ড্যাশযুক্ত রেখাগুলি তুলনার জন্য মানুষের L2/3 প্রসবোত্তর পিরামিডাল নিউরন দেখায় (n = 24 নিয়ন্ত্রণ t-hCO নিউরন, n = 21 TS t-hCO নিউরন, n = 8 নিয়ন্ত্রণ hCO নিউরন, এবং n = 7 TS hCO নিউরন)। ডেটা গড় ± স্ট্যান্ডার্ড বিচ্যুতি হিসাবে প্রকাশ করা হয়।
t-hCO-এর উচ্চ স্তরে মানব কর্টেক্স নিউরনের রূপগত এবং কার্যকরী বৈশিষ্ট্যগুলিকে প্রতিলিপি করার ক্ষমতা আমাদেরকে রোগের ফিনোটাইপ সনাক্ত করতে t-hCO ব্যবহার করা যেতে পারে কিনা তা অনুসন্ধান করতে প্ররোচিত করেছিল। আমরা TS-এর উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করেছি, যা CaV1.2 এনকোডিং জিনে ফাংশন-অফ-ফাংশন মিউটেশনের ফলে সৃষ্ট একটি গুরুতর নিউরোডেভেলপমেন্টাল ব্যাধি, যা নিউরনে কার্যকলাপ-নির্ভর জিন ট্রান্সক্রিপশন শুরু করে। আমরা সবচেয়ে সাধারণ প্রতিস্থাপন (p.G406R) এবং তিনটি নিয়ন্ত্রণ (চিত্র 3a) বহনকারী তিনজন TS রোগীর কাছ থেকে hCO পেয়েছি। প্রতিস্থাপনের পরে, আমরা দেখতে পেলাম যে নিয়ন্ত্রণের তুলনায় TS নিউরনে ডেনড্রাইটিক মরফোলজি পরিবর্তিত হয়েছে (চিত্র 3b এবং প্রসারিত তথ্য, চিত্র 8a,b), প্রাথমিক ডেনড্রাইটের সংখ্যা দ্বিগুণ বৃদ্ধি এবং গড় বৃদ্ধি এবং ডেনড্রাইটিক দৈর্ঘ্যের সামগ্রিক হ্রাস (চিত্র 3c এবং বর্ধিত তথ্য, চিত্র 8c)। এটি নিয়ন্ত্রণ নিউরনের তুলনায় TS-তে মেরুদণ্ডের ঘনত্ব বৃদ্ধি এবং স্বতঃস্ফূর্ত EPSC-এর ফ্রিকোয়েন্সি বৃদ্ধির সাথে যুক্ত ছিল (চিত্র 3d–f এবং প্রসারিত তথ্য, চিত্র 8g)। আরও বিশ্লেষণে নিয়ন্ত্রণের তুলনায় t-hCO TS-তে অস্বাভাবিক ডেনড্রাইটিক শাখার ধরণ প্রকাশ পেয়েছে, কিন্তু একই ধরণের পার্থক্যের পর্যায়ে ইন ভিট্রো TS hCO-তে নয় (চিত্র 3g)। এটি TS-তে কার্যকলাপ-নির্ভর ডেনড্রাইটিক সংকোচনের আমাদের পূর্ববর্তী প্রতিবেদনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ এবং ভিভোতে রোগের ফেনোটাইপ সনাক্ত করার জন্য এই ট্রান্সপ্ল্যান্ট প্ল্যাটফর্মের ক্ষমতা তুলে ধরে।
এরপর আমরা জিজ্ঞাসা করলাম যে ইঁদুর S1-এর সাথে t-hCO কোষগুলি কতটা কার্যকরীভাবে একত্রিত হয়। ইঁদুরের S1, ipsilateral ventral basal এবং posterior thalamic nuclei, সেইসাথে ipsilateral motor এবং secondary somatosensory cortices, এবং contralateral S1 (চিত্র 4a) থেকে শক্তিশালী synaptic ইনপুট গ্রহণ করে। innervation প্যাটার্ন পুনরুদ্ধার করার জন্য, আমরা hCO কে রেবিজ ভাইরাস-dG-GFP/AAV-G দ্বারা সংক্রামিত করেছি এবং 3 দিন পরে S1 ইঁদুরে hCO প্রতিস্থাপন করেছি। প্রতিস্থাপনের 7-14 দিন পরে আমরা ipsilateral S1 এবং ventral basal ganglia-এর নিউরনে ঘন GFP এক্সপ্রেশন লক্ষ্য করেছি (চিত্র 4b, c)। এছাড়াও, থ্যালামিক মার্কার নেট্রিন G1-এর অ্যান্টিবডি স্টেনিং t-hCO-তে থ্যালামিক শেষের উপস্থিতি প্রকাশ করেছে (চিত্র 4d, e)। এই অ্যাফারেন্ট প্রক্ষেপণগুলি t-hCO কোষে synaptic প্রতিক্রিয়া তৈরি করতে পারে কিনা তা মূল্যায়ন করার জন্য, আমরা থ্যালামোকর্টিক্যাল স্তরের তীক্ষ্ণ অংশে মানব কোষ থেকে সম্পূর্ণ কোষ রেকর্ডিং করেছি। ইঁদুর S1, অভ্যন্তরীণ ক্যাপসুল, সাদা পদার্থ, t-hCO এর কাছাকাছি তন্তুর বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা বা t-hCO তে অপসিন-প্রকাশকারী থ্যালামিক প্রান্তের অপটোজেনেটিক সক্রিয়করণ AMPA রিসেপ্টর প্রতিপক্ষ NBQX-এর সংস্পর্শে আসা t-hCO নিউরনে স্বল্প-বিলম্বিত EPSC-কে প্ররোচিত করে। (চিত্র 4f, g এবং বর্ধিত তথ্য, চিত্র 9a-g)। এই তথ্যগুলি দেখায় যে t-hCO শারীরবৃত্তীয়ভাবে ইঁদুরের মস্তিষ্কে একত্রিত হয় এবং ইঁদুরের হোস্ট টিস্যু দ্বারা সক্রিয় হতে সক্ষম।
a, জলাতঙ্ক ট্র্যাকিং পরীক্ষার একটি পরিকল্পিত চিত্র। b, GFP এবং t-hCO এবং ইঁদুরের সেরিব্রাল কর্টেক্সের (উপরের প্যানেল) মধ্যে মানব-নির্দিষ্ট STEM121 এক্সপ্রেশন। ইঁদুরের আইপসিলাটারাল ভেন্ট্রাল বেসাল নিউক্লিয়াস (VB) (নীচের বাম) এবং আইপসিলাটারাল S1 (নীচের ডান) এ GFP এক্সপ্রেশনও দেখানো হয়েছে। স্কেল বার, 50 µm। লাল বর্গক্ষেত্রগুলি মস্তিষ্কের সেই অঞ্চলগুলিকে প্রতিনিধিত্ব করে যেখানে ছবিগুলি তোলা হয়েছিল। c, GFP প্রকাশকারী কোষের পরিমাণ নির্ধারণ (n = 4 ইঁদুর)। d, e — t-hCO তে নেট্রিন G1+ থ্যালামিক টার্মিনাল। d t-hCO এবং VB নিউক্লিয়াস ধারণকারী একটি করোনাল অংশ দেখায়। স্কেল বার, 2 মিমি। e t-hCO (বাম) এবং VB (ডান) নিউরনে নেট্রিন G1 এবং STEM121 এক্সপ্রেশন দেখায়। স্কেল বার, 50 µm। কমলা বিন্দুযুক্ত রেখা t-hCO সীমানা নির্দেশ করে। f, g, S1 ইঁদুর (f) বা অভ্যন্তরীণ ক্যাপসুল (g), (বেগুনি) বা (কালো) NBQX (বামে) ছাড়া বৈদ্যুতিক উদ্দীপনার পরে t-hCO নিউরনের বর্তমান চিহ্ন। NBQX (n = 6 S1 নিউরন, *P = 0.0119; এবং n = 6 অভ্যন্তরীণ ক্যাপসুল নিউরন, **P = 0.0022) (মাঝখানে) সহ এবং ছাড়াই EPSC প্রশস্ততা। ইঁদুর S1 (f) বা অভ্যন্তরীণ ক্যাপসুল (g) (ডানে) এর বৈদ্যুতিক উদ্দীপনার প্রতিক্রিয়ায় EPSC দেখানো t-hCO নিউরনের শতাংশ। aCSF, কৃত্রিম সেরিব্রোস্পাইনাল তরল। h, 2P ইমেজিং পরীক্ষার পরিকল্পিত চিত্র (বামে)। t-hCO (মাঝখানে) তে GCaMP6 এর প্রকাশ। স্কেল বার, 100 µm। GCaMP6 এর প্রতিপ্রভ সময়কাল (ডানে)। i, স্বতঃস্ফূর্ত কার্যকলাপ প্রতিপ্রভের Z-স্কোর। j, গোঁফ উদ্দীপনার পরিকল্পিত চিত্র। k, একটি পরীক্ষায় z-স্কোরযুক্ত 2P ফ্লুরোসেন্স ট্র্যাজেক্টোরি, উদাহরণ কোষে সময় শূন্যে হুইস্কার বিচ্যুতির সাথে সারিবদ্ধ। l, সময় শূন্যে হুইস্কার বিচ্যুতির সাথে সারিবদ্ধ সমস্ত কোষের জনসংখ্যা-গড় z-স্কোর প্রতিক্রিয়া (ড্যাশড লাইন) (লাল) বা এলোমেলোভাবে তৈরি টাইমস্ট্যাম্প (ধূসর)। m. অপটিক্যাল মার্কিং-এর উপর পরীক্ষার পরিকল্পিত চিত্র। n, নীল লেজার উদ্দীপনা বা হুইস্কার বিচ্যুতির সময় একটি উদাহরণ t-hCO কোষ থেকে কাঁচা ভোল্টেজ বক্ররেখা। লাল তীরগুলি আলো (উপরে) দ্বারা সৃষ্ট বা হুইস্কার বিচ্যুতির (নীচে) দ্বারা সৃষ্ট প্রথম স্পাইকগুলি নির্দেশ করে। ধূসর ছায়া হুইস্কার বিচ্যুতির সময়কাল নির্দেশ করে। o, পিক লাইট ওয়েভফর্ম এবং হুইস্কার বিচ্যুতির প্রতিক্রিয়া। p, একক প্রচেষ্টার স্পাইকগুলি, উদাহরণের কোষগুলিতে হুইস্কার বিচ্যুতির সাথে সারিবদ্ধ। 0 হুইস্কার বিচ্যুতি (ড্যাশড লাইন) নির্দেশ করে। q, সমস্ত আলোক সংবেদনশীল কোষের জন্য জনসংখ্যা-গড় z-স্কোর ফায়ারিং রেট, সময় শূন্যে হুইস্কার বিচ্যুতির সাথে সারিবদ্ধ (ড্যাশড লাইন) (লাল) বা এলোমেলোভাবে তৈরি টাইমস্ট্যাম্প (ধূসর)। r, হুইস্কার বিচ্যুতি (n = 3 ইঁদুর) (বামে) দ্বারা উল্লেখযোগ্যভাবে সংশোধিত আলোক সংবেদনশীল এককের অনুপাত। সর্বোচ্চ z-স্কোর ল্যাটেন্সি (n = 3 ইঁদুর; n = 5 (হালকা সবুজ), n = 4 (গাঢ় সবুজ), এবং n = 4 (সায়ান) হুইস্কার বিচ্যুতি মড্যুলেশন ইউনিট প্রতি ইঁদুর) (ডানে)। তথ্য গড় ± আদর্শ বিচ্যুতি হিসাবে প্রকাশ করা হয়।
এরপর আমরা জিজ্ঞাসা করলাম যে t-hCO কে ইন ভিভো সংবেদনশীল উদ্দীপনা দ্বারা সক্রিয় করা যেতে পারে কিনা। আমরা S1 ইঁদুরের মধ্যে জিনগতভাবে এনকোডেড ক্যালসিয়াম সূচক GCaMP6 প্রকাশ করে hCO প্রতিস্থাপন করেছি। 150 দিন পর, আমরা ফাইবার ফটোমেট্রি বা দুই-ফোটন ক্যালসিয়াম ইমেজিং করেছি (চিত্র 4h এবং প্রসারিত ডেটা, চিত্র 10a)। আমরা দেখতে পেয়েছি যে t-hCO কোষগুলি সিঙ্ক্রোনাইজড ছন্দবদ্ধ কার্যকলাপ প্রদর্শন করেছে (চিত্র 4i, প্রসারিত ডেটা, চিত্র 10b এবং পরিপূরক ভিডিও 1)। সর্বোচ্চ t-hCO কার্যকলাপ চিহ্নিত করার জন্য, আমরা অ্যানেস্থেটাইজড ট্রান্সপ্ল্যান্ট ইঁদুরের বহির্কোষীয় ইলেক্ট্রোফিজিওলজিক্যাল রেকর্ডিং করেছি (প্রসারিত ডেটা, চিত্র 10c-f)। আমরা MRI চিত্র থেকে স্টেরিওট্যাক্সিক স্থানাঙ্ক তৈরি করেছি; সুতরাং, এই রেকর্ড করা ইউনিটগুলি পুটিভেটিভ মানব নিউরনকে প্রতিনিধিত্ব করে, যদিও ইলেক্ট্রোফিজিওলজি শুধুমাত্র উৎপত্তির একটি প্রজাতি নির্ধারণ করতে দেয় না। আমরা কার্যকলাপের সিঙ্ক্রোনাইজড বিস্ফোরণ পর্যবেক্ষণ করেছি (প্রসারিত ডেটা, চিত্র 10d)। বিস্ফোরণগুলি প্রায় 460 মিলিসেকেন্ড স্থায়ী হয়েছিল এবং প্রায় 2 সেকেন্ডের নীরবতা সময়কাল দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল (প্রসারিত তথ্য, চিত্র 10d, e)। পৃথক ইউনিটগুলি গড়ে প্রতি বিস্ফোরণে প্রায় তিন রাউন্ড গুলি চালিয়েছিল, যা প্রতি বিস্ফোরণে নিবন্ধিত ইউনিটের প্রায় 73%। পৃথক ইউনিটগুলির কার্যকলাপ অত্যন্ত পারস্পরিক সম্পর্কযুক্ত ছিল এবং এই পারস্পরিক সম্পর্ক একই পরিস্থিতিতে রেকর্ড করা টিকাবিহীন প্রাণীদের মধ্যে চিহ্নিত ইউনিটগুলির তুলনায় বেশি ছিল (প্রসারিত তথ্য, চিত্র 10f)। চিহ্নিত মানব-উদ্ভূত নিউরনের স্পাইক প্রতিক্রিয়াগুলিকে আরও বৈশিষ্ট্যযুক্ত করার জন্য, আমরা hCO দিয়ে প্রতিস্থাপন করা অ্যানেস্থেটাইজড ইঁদুরের উপর আলোক-ট্যাগিং পরীক্ষা করেছি যা আলোক-সংবেদনশীল ক্যাটেশন চ্যানেল রোডোপসিন 2 (hChR2) প্রকাশ করে, যার মাধ্যমে নীল আলোর উদ্দীপনার প্রতিক্রিয়ায় t-hCO নিউরনগুলি স্বল্প-বিলম্বিততা স্বীকৃতি (10 মিলিসেকেন্ডের কম) (চিত্র 4m–o)। t-hCO নিউরনগুলি ক্যালসিয়াম ইমেজিংয়ে দেখা যায় এমন ফ্রিকোয়েন্সিতে স্বতঃস্ফূর্ত কার্যকলাপের বিস্ফোরণ প্রদর্শন করেছিল, সেইসাথে আলোর চিহ্নের অনুপস্থিতিতে t-hCO তে সম্পাদিত ইলেক্ট্রোফিজিওলজিক্যাল রেকর্ডিং (প্রসারিত তথ্য, চিত্র 10c-g)। ইন ভিট্রো রেকর্ড করা hCO এর সংশ্লিষ্ট পর্যায়ে কোনও স্বতঃস্ফূর্ত কার্যকলাপ পরিলক্ষিত হয়নি। সংবেদনশীল উদ্দীপনা দ্বারা t-hCO সক্রিয় করা যেতে পারে কিনা তা মূল্যায়ন করার জন্য, আমরা সংক্ষেপে t-hCO থেকে ইঁদুরের গোঁফগুলিকে দূরে সরিয়ে দিয়েছিলাম (চিত্র 4j,m এবং বর্ধিত তথ্য, চিত্র 10h,k)। পূর্ববর্তী গবেষণা অনুসারে 8,10, t-hCO কোষের একটি উপসেট গোঁফের বিচ্যুতির প্রতিক্রিয়ায় বর্ধিত কার্যকলাপ দেখিয়েছিল, যা র্যান্ডম টাইম স্ট্যাম্পের সাথে ডেটা তুলনা করার সময় দেখা যায়নি (চিত্র 4k–q এবং প্রসারিত তথ্য, চিত্র 10h–q)। প্রকৃতপক্ষে, প্রায় 54% অপটো-লেবেলযুক্ত একক ইউনিট হুঁফের উদ্দীপনার পরে উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধিপ্রাপ্ত উত্তেজনার হার দেখিয়েছিল, যা প্রায় 650 ms (চিত্র 4r) এ পৌঁছেছিল। একসাথে নেওয়া হলে, এই তথ্যগুলি ইঙ্গিত দেয় যে t-hCO উপযুক্ত কার্যকরী ইনপুট গ্রহণ করে এবং পরিবেশগত উদ্দীপনা দ্বারা সক্রিয় হতে পারে।
এরপর আমরা অনুসন্ধান করেছিলাম যে t-hCO ইঁদুরের আচরণ নিয়ন্ত্রণের জন্য সার্কিট সক্রিয় করতে পারে কিনা। আমরা প্রথমে অনুসন্ধান করেছিলাম যে t-hCO নিউরনের অ্যাক্সনগুলি ইঁদুরের আশেপাশের টিস্যুতে প্রজেক্ট করে কিনা। আমরা hCO কে একটি লেন্টিভাইরাস এনকোডিং hChR2 দ্বারা EYFP (hChR2-EYFP) এর সাথে সংযুক্ত করে সংক্রামিত করেছি। ১১০ দিন পর, আমরা শ্রবণ, মোটর এবং সোমাটোসেন্সরি কর্টিসেস সহ আইপসিলাটারাল কর্টিকাল অঞ্চলে EYFP এক্সপ্রেশন পর্যবেক্ষণ করেছি, পাশাপাশি স্ট্রাইটাম, হিপ্পোক্যাম্পাস এবং থ্যালামাস সহ সাবকর্টিক্যাল অঞ্চলে (চিত্র ৫ক)। এই এফারেন্ট প্রক্ষেপণগুলি ইঁদুর কোষগুলিতে সিনাপটিক প্রতিক্রিয়া তৈরি করতে পারে কিনা তা মূল্যায়ন করার জন্য, আমরা তীক্ষ্ণ মস্তিষ্কের অংশে ইঁদুরের সেরিব্রাল কর্টেক্স কোষ রেকর্ড করে hChR2-EYFP প্রকাশকারী t-hCO কোষগুলিকে অপটিক্যালি সক্রিয় করেছি। ইঁদুরের পিরামিডাল কর্টেক্স নিউরনে নীল আলো দ্বারা প্ররোচিত স্বল্প-বিলম্বিত EPSC সহ t-hCO অ্যাক্সনগুলির সক্রিয়করণ, যা NBQX দ্বারা অবরুদ্ধ ছিল (চিত্র ৫বি-জি)। উপরন্তু, এই প্রতিক্রিয়াগুলি টেট্রোডোটক্সিন (TTX) দ্বারা অবরুদ্ধ করা যেতে পারে এবং 4-অ্যামিনোপাইরিডিন (4-AP) দ্বারা পুনরুদ্ধার করা যেতে পারে, যা ইঙ্গিত করে যে এগুলি মনোসিন্যাপটিক সংযোগের কারণে হয়েছিল (চিত্র 5e)।
a, অ্যাক্সন ট্র্যাকিংয়ের স্কিম্যাটিক ডায়াগ্রাম (বামে)। t-hCO EYFP এক্সপ্রেশন (ডানে)। স্কেল বার, 100 µm। A1, অডিটরি কর্টেক্স, ACC, অ্যান্টিরিয়র সিঙ্গুলেট কর্টেক্স, d. স্ট্রাইটাম, ডোরসাল স্ট্রাইটাম, HPC, হিপ্পোক্যাম্পাস; ডায়াফ্রাম, ল্যাটারাল সেপ্টাম, mPFC, মিডিয়াল প্রিফ্রন্টাল কর্টেক্স, পিরি, পিরিফর্ম কর্টেক্স, v. স্ট্রাইটাম, ভেন্ট্রাল স্ট্রাইটাম, VPM, থ্যালামাসের ভেন্ট্রোপোস্টোমেডিয়াল নিউক্লিয়াস, VTA, ভেন্ট্রাল টেগমেন্টাল অঞ্চল। লাল বর্গক্ষেত্রগুলি মস্তিষ্কের সেই অঞ্চলগুলিকে প্রতিনিধিত্ব করে যেখানে ছবিগুলি তোলা হয়েছিল। b, উদ্দীপনা পরীক্ষার স্কিম্যাটিক ডায়াগ্রাম। c, d, মানুষের (c) EYFP+ t-hCO বা ইঁদুর (d) EYFP- কোষে নীল আলো-প্ররোচিত ফটোকারেন্ট (উপরে) এবং ভোল্টেজ (নীচে) এর প্রতিক্রিয়ার উদাহরণ। e, f, TTX এবং 4-AR (সবুজ), TTX (ধূসর) বা aCSF (কালো) (e), (বেগুনি) বা (কালো) ছাড়া (nbQX (e) সহ t-hCO অ্যাক্সনের নীল আলো উদ্দীপনার পরে ইঁদুরের নিউরনের বর্তমান চিহ্ন। g, ইঁদুর কোষে নীল আলো দ্বারা প্ররোচিত প্রতিক্রিয়ার বিলম্ব (n = 16 কোষ); অনুভূমিক বারগুলি গড় বিলম্ব (7.13 ms) (বামে) নির্দেশ করে। NBQX (n = 7 কোষ; ***P < 0.0001) (মাঝারি) সহ বা ছাড়াই রেকর্ড করা আলোক-উদ্ভূত EPSC-এর প্রশস্ততা। NBQX (n = 7 কোষ; ***P < 0.0001) (মাঝারি) সহ বা ছাড়াই রেকর্ড করা আলোক-উদ্ভূত EPSC-এর প্রশস্ততা। Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре)। NBQX (n = 7 কোষ; ***P < 0.0001) (মাঝখানে) সহ বা ছাড়াই রেকর্ড করা আলোক-প্ররোচিত EPSC-এর প্রশস্ততা।使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）।使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）। Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре)। NBQX (n = 7 কোষ; ***P < 0.0001) (মাঝখানে) সহ বা ছাড়াই রেকর্ড করা আলোক-প্ররোচিত EPSC-এর প্রশস্ততা।নীল আলোতে সাড়া দেয় এমন EPSC দেখানো ইঁদুর কোষের শতাংশ (ডানদিকে)। h, একটি আচরণগত কাজের পরিকল্পিত চিত্র। d0, দিন 0। i. প্রশিক্ষণের প্রথম দিন (বামে) বা ১৫ তম দিনে (ডানে) অনুকরণীয় প্রাণীদের কর্মক্ষমতা। ১ম দিন (বামে) অথবা ১৫তম দিন (ডান মাঝখানে) সম্পাদিত লিকের গড় সংখ্যা (n = ১৫০টি নীল আলোর পরীক্ষা, n = ১৫০টি লাল আলোর পরীক্ষা; ***P < 0.0001)। ১ম দিন (বামে) অথবা ১৫তম দিন (ডান মাঝখানে) সম্পাদিত লিকের গড় সংখ্যা (n = ১৫০টি নীল আলোর পরীক্ষা, n = ১৫০টি লাল আলোর পরীক্ষা; ***P < 0.0001)। Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с , с = ситом 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001)। ১ম দিন (বামে) অথবা ১৫তম দিন (মাঝে ডানে) সম্পাদিত লিকের গড় সংখ্যা (n = ১৫০টি নীল আলোর পরীক্ষা, n = ১৫০টি লাল আলোর পরীক্ষা; ***P < 0.0001)।第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；**P <0.0001）।第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；**P <0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с , с = ситом 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001)। ১ম দিন (বামে) অথবা ১৫তম দিন (মাঝে ডানে) সম্পাদিত লিকের গড় সংখ্যা (n = ১৫০টি নীল আলোর পরীক্ষা, n = ১৫০টি লাল আলোর পরীক্ষা; ***P < 0.0001)।১ম দিন (মাঝে বামে) অথবা ১৫তম দিন (ডানে) লাল এবং নীল আলোর পরীক্ষার জন্য ক্রমবর্ধমান লিক। NS, উল্লেখযোগ্য নয়। j,k, ১ম বা ১৫তম দিনে hChR2-EYFP (j) প্রকাশকারী t-hCO বা নিয়ন্ত্রণ ফ্লুরোফোর (k) দিয়ে প্রতিস্থাপন করা সমস্ত প্রাণীর আচরণগত বৈশিষ্ট্য (hChR2-EYFP: n = 9 ইঁদুর, ** P = 0.0049; নিয়ন্ত্রণ: n = 9, P = 0.1497)। l, পছন্দের স্কোরের বিবর্তন (n = 9 hChR2, n = 9 নিয়ন্ত্রণ; **P < 0.001, ***P < 0.0001)। l, পছন্দের স্কোরের বিবর্তন (n = 9 hChR2, n = 9 নিয়ন্ত্রণ; **P < 0.001, ***P < 0.0001)। l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001)। l, পছন্দের স্কোরের বিবর্তন (n = 9 hChR2, n = 9 নিয়ন্ত্রণ; **P < 0.001, ***P < 0.0001)। l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001，***P <0.0001）। l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001，***P <0.0001）। l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001)। l, পছন্দের স্কোরের বিবর্তন (n = 9 hChR2, n = 9 নিয়ন্ত্রণ; **P < 0.001, ***P < 0.0001)।m, S1-তে t-hCO-এর অপটোজেনেটিক সক্রিয়করণের প্রতিক্রিয়ায় FOS প্রকাশ। FOS এক্সপ্রেশন (বাম) এবং পরিমাণ নির্ধারণের চিত্রগুলি (প্রতি গ্রুপে n = 3; * পি < 0.05, ** পি < 0.01 এবং *** পি < 0.001) (ডান) দেখানো হয়েছে। FOS এক্সপ্রেশন (বাম) এবং পরিমাণ নির্ধারণের চিত্রগুলি (প্রতি গ্রুপে n = 3; * পি < 0.05, ** পি < 0.01 এবং *** পি < 0.001) (ডান) দেখানো হয়েছে। Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001)। FOS এক্সপ্রেশন (বামে) এবং পরিমাণ নির্ধারণের চিত্রগুলি (প্রতি গ্রুপে n = 3; *P<0.05, **P<0.01, এবং ***P<0.001) দেখানো হয়েছে (ডানে)।显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和***P < 0.001）（叾叾ﾼP显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和***P < 0.001）（叾叾ﾼP Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001)। FOS এক্সপ্রেশন (বামে) এবং পরিমাণ নির্ধারণের চিত্রগুলি (প্রতি গ্রুপে n = 3; *P<0.05, **P<0.01, এবং ***P<0.001) দেখানো হয়েছে (ডানে)।স্কেল বার, ১০০ µm। তথ্য গড় ± BLA, বেসোল্যাটেরাল টনসিল, MDT, ডরসোমেডিয়াল থ্যালামিক নিউক্লিয়াস, PAG, পেরিয়াকুইডাক্টাল ধূসর রঙের স্ট্যান্ডার্ড ত্রুটি হিসাবে প্রকাশ করা হয়।
অবশেষে, আমরা জিজ্ঞাসা করলাম যে t-hCO ইঁদুরের আচরণ পরিবর্তন করতে পারে কিনা। এটি পরীক্ষা করার জন্য, আমরা hChR2-EYFP-প্রকাশকারী hCO কে S1 তে প্রতিস্থাপন করেছি এবং 90 দিন পরে, আমরা আলো সরবরাহের জন্য t-hCO তে অপটিক্যাল ফাইবার স্থাপন করেছি। এরপর আমরা ইঁদুরগুলিকে একটি পরিবর্তিত অপারেন্ট কন্ডিশনিং প্যারাডাইম (চিত্র 5h) দিয়ে প্রশিক্ষণ দিয়েছি। আমরা প্রাণীদের একটি আচরণগত পরীক্ষার চেম্বারে রেখেছি এবং এলোমেলোভাবে 5 সেকেন্ড নীল (473 nm) এবং লাল (635 nm) লেজার উদ্দীপনা প্রয়োগ করেছি। নীল আলো উদ্দীপনার সময় চাটলে প্রাণীরা জলের পুরষ্কার পেয়েছিল কিন্তু লাল আলো উদ্দীপনার সময় চাটতে পারেনি। প্রশিক্ষণের প্রথম দিনে, নীল বা লাল আলো দিয়ে উদ্দীপিত হলে প্রাণীরা চাটতে কোনও পার্থক্য দেখায়নি। তবে, 15 তম দিনে, hChR2-EYFP প্রকাশকারী hCO দিয়ে প্রতিস্থাপন করা প্রাণীরা লাল আলো উদ্দীপনার তুলনায় নীল আলো দিয়ে উদ্দীপিত হলে বেশি সক্রিয় চাটতে দেখা গেছে। নিয়ন্ত্রণ ফ্লুরোফোর প্রকাশকারী hCO দিয়ে প্রতিস্থাপন করা নিয়ন্ত্রণ প্রাণীদের মধ্যে চাটার আচরণের এই পরিবর্তনগুলি পরিলক্ষিত হয়নি (শিক্ষার সাফল্যের হার: hChR2 89%, EYFP 0%, চিত্র 5i-1 এবং পরিপূরক ভিডিও 2)। এই তথ্যগুলি পরামর্শ দেয় যে t-hCO কোষগুলি পুরষ্কার-প্রার্থী আচরণকে উদ্দীপিত করার জন্য ইঁদুরের নিউরনগুলিকে সক্রিয় করতে পারে। এই আচরণগত পরিবর্তনগুলিতে কোন ইঁদুরের t-hCO নিউরাল সার্কিট জড়িত থাকতে পারে তা খুঁজে বের করার জন্য, আমরা 90 মিনিট পরে প্রশিক্ষিত প্রাণী এবং কাটা টিস্যুতে অপটোজেনেটিকভাবে t-hCO সক্রিয় করেছি। ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি প্রেরণাদায়ক আচরণের সাথে জড়িত বেশ কয়েকটি মস্তিষ্কের অঞ্চলে কার্যকলাপ-নির্ভর FOS প্রোটিনের প্রকাশ প্রকাশ করেছে, যার মধ্যে রয়েছে মিডিয়াল প্রিফ্রন্টাল কর্টেক্স, মিডিয়াল থ্যালামাস এবং পেরিয়াকুইডাক্টাল গ্রে ম্যাটার, যা উদ্দীপিত নিয়ন্ত্রণ প্রাণী বা প্রাণীদের মধ্যে প্রকাশিত হয়েছিল। 5 মি)। একসাথে নেওয়া হলে, এই তথ্যগুলি পরামর্শ দেয় যে t-hCO আচরণ চালনা করার জন্য ইঁদুরের নিউরোনাল কার্যকলাপকে পরিবর্তন করতে পারে।
ইন ভিট্রোতে মানব বিকাশ এবং রোগ অধ্যয়নের জন্য নিউরাল অর্গানয়েডগুলি একটি প্রতিশ্রুতিশীল ব্যবস্থার প্রতিনিধিত্ব করে, তবে ইন ভিভোতে বিদ্যমান সার্কিটগুলির মধ্যে সংযোগের অভাবের কারণে এগুলি সীমাবদ্ধ। আমরা একটি অভিনব প্ল্যাটফর্ম তৈরি করেছি যেখানে আমরা মানব কোষের বিকাশ এবং ইন ভিভোতে কার্যকারিতা অধ্যয়ন করার জন্য ইমিউনোকম্প্রোমাইজড প্রারম্ভিক প্রসবোত্তর ইঁদুরের S1-এ hCO প্রতিস্থাপন করেছি। আমরা দেখিয়েছি যে t-hCO ইন ভিট্রোতে পর্যবেক্ষণ করা হয়নি এমন পরিপক্ক কোষের ধরণ তৈরি করে28 এবং t-hCO শারীরবৃত্তীয় এবং কার্যকরীভাবে ইঁদুরের মস্তিষ্কে সংহত হয়। ইঁদুরের নিউরাল সার্কিটে t-hCO এর সংহতকরণ আমাদের মানুষের কোষীয় কার্যকলাপ এবং অধ্যয়ন করা প্রাণীর আচরণের মধ্যে একটি সংযোগ স্থাপন করতে সাহায্য করেছে, যা দেখায় যে t-hCO নিউরনগুলি আচরণগত প্রতিক্রিয়া চালানোর জন্য ইঁদুরের নিউরোনাল কার্যকলাপকে সংশোধন করতে পারে।
আমরা যে প্ল্যাটফর্মটি বর্ণনা করেছি তার ইঁদুরের মস্তিষ্কে মানব কোষ প্রতিস্থাপনের পূর্ববর্তী গবেষণার তুলনায় বেশ কিছু সুবিধা রয়েছে। প্রথমত, আমরা hCO3 প্রারম্ভিক প্রসবোত্তর ইঁদুরের বিকাশমান কর্টেক্সে প্রতিস্থাপন করেছি, যা শারীরবৃত্তীয় এবং কার্যকরী একীকরণকে সহজতর করতে পারে। দ্বিতীয়ত, t-hCO3 এমআরআই পর্যবেক্ষণ আমাদের জীবন্ত প্রাণীদের গ্রাফ্ট অবস্থান এবং বৃদ্ধি অধ্যয়ন করার অনুমতি দিয়েছে, যা আমাদের দীর্ঘমেয়াদী বহু-প্রাণী গবেষণা পরিচালনা করতে এবং বেশ কয়েকটি hiPS কোষ লাইনের নির্ভরযোগ্যতা প্রতিষ্ঠা করতে সহায়তা করেছে। অবশেষে, আমরা বিচ্ছিন্ন একক কোষ সাসপেনশনের পরিবর্তে অক্ষত অর্গানয়েড প্রতিস্থাপন করেছি, যা মানব কোষের জন্য কম ধ্বংসাত্মক এবং ইঁদুরের মস্তিষ্কে মানব কর্টেক্স নিউরনের একীকরণ এবং প্রজন্মকে উৎসাহিত করতে পারে।
আমরা স্বীকার করি যে এই প্ল্যাটফর্মে অগ্রগতি সত্ত্বেও, টেম্পোরাল, স্পেশাল এবং ক্রস-প্রজাতির সীমাবদ্ধতাগুলি উচ্চ বিশ্বস্ততার সাথে মানব স্নায়ু সার্কিট গঠনে বাধা দেয়, এমনকি বিকাশের প্রাথমিক পর্যায়ে প্রতিস্থাপনের পরেও। উদাহরণস্বরূপ, এটি স্পষ্ট নয় যে t-hCO তে পরিলক্ষিত স্বতঃস্ফূর্ত কার্যকলাপ কর্টিকাল বিকাশের সময় পরিলক্ষিত ছন্দবদ্ধ কার্যকলাপের অনুরূপ একটি উন্নয়নমূলক ফেনোটাইপ প্রতিনিধিত্ব করে কিনা, নাকি এটি t-hCO তে উপস্থিত দমনকারী কোষের ধরণের অনুপস্থিতির কারণে। একইভাবে, t-hCO তে ল্যামিনেশনের অনুপস্থিতি চেইন সংযোগকে কতটা প্রভাবিত করে তা স্পষ্ট নয়। ভবিষ্যতের কাজটি অন্যান্য কোষের ধরণ যেমন মানব মাইক্রোগ্লিয়া, মানব এন্ডোথেলিয়াল কোষ এবং GABAergic ইন্টারনিউরনের বিভিন্ন অনুপাতকে একীভূত করার উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করবে যেমনটি অ্যাসেম্বলি 6 ইন ভিট্রো ব্যবহার করে দেখানো হয়েছে, সেইসাথে পরিবর্তিত t-hCO তে নিউরাল ইন্টিগ্রেশন এবং প্রক্রিয়াকরণ কীভাবে ঘটতে পারে তা বোঝার উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করবে। রোগীদের কাছ থেকে প্রাপ্ত কোষে ট্রান্সক্রিপশনাল, সিনাপটিক এবং আচরণগত স্তর।
সামগ্রিকভাবে, এই ইন ভিভো প্ল্যাটফর্মটি একটি শক্তিশালী সম্পদের প্রতিনিধিত্ব করে যা ইন ভিট্রো মানব মস্তিষ্কের বিকাশ এবং রোগ গবেষণার পরিপূরক হতে পারে। আমরা আশা করি যে এই প্ল্যাটফর্মটি আমাদের অন্যথায় অধরা রোগী-প্রাপ্ত কোষগুলিতে নতুন স্ট্র্যান্ড-স্তরের ফেনোটাইপগুলি আবিষ্কার করতে এবং নতুন থেরাপিউটিক কৌশল পরীক্ষা করার অনুমতি দেবে।
আমরা পূর্বে বর্ণিত HiPS কোষ থেকে hCO2.5 তৈরি করেছি। ফিডার লেয়ারে কালচার করা hiPS কোষ থেকে hCO উৎপাদন শুরু করার জন্য, ডিসপেজ (0.35 mg/mL) ব্যবহার করে কালচার ডিশ থেকে hiPS কোষের অক্ষত কলোনিগুলি সরিয়ে hiPS কোষ কালচার মিডিয়াম সহ থালা ধারণকারী অতি-নিম্ন সংযুক্তি প্লাস্টিক কালচারে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল। (কর্নিং) দুটি SMAD ইনহিবিটর ডরসোমরফিন (5 μM; P5499, সিগমা-অ্যালড্রিচ) এবং SB-431542 (10 μM; 1614, টোক্রিস) এবং ROCK ইনহিবিটর Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) দিয়ে পরিপূরক করা হয়েছিল। প্রথম 5 দিনে, hiPS কোষ মাধ্যমটি প্রতিদিন পরিবর্তন করা হয়েছিল এবং ডরসোমরফিন এবং SB-431542 যোগ করা হয়েছিল। সাসপেনশনের ষষ্ঠ দিনে, নিউরাল স্ফেরয়েডগুলিকে নিউরোব্যাসাল-এ (10888, লাইফ টেকনোলজিস), ভিটামিন এ ছাড়া বি-27 সাপ্লিমেন্ট (12587, লাইফ টেকনোলজিস), গ্লুটাম্যাক্স (1:100, লাইফ টেকনোলজিস), পেনিসিলিন এবং স্ট্রেপ্টোমাইসিন (1:100, লাইফ টেকনোলজিস) ধারণকারী নিউরাল মিডিয়ামে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল এবং 24 তম দিন পর্যন্ত এপিডার্মাল গ্রোথ ফ্যাক্টর (EGF; 20 ng ml−1; R&D সিস্টেমস) এবং ফাইব্রোব্লাস্ট গ্রোথ ফ্যাক্টর 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D সিস্টেমস) দিয়ে পরিপূরক করা হয়েছিল। 25 তম দিন থেকে 42 তম দিন পর্যন্ত, মিডিয়ামে মস্তিষ্ক থেকে প্রাপ্ত নিউরোট্রফিক ফ্যাক্টর (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) এবং নিউরোট্রফিন 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) দিয়ে পরিপূরক করা হয়েছিল, প্রতি অন্য দিন মাঝারি পরিবর্তনের সাথে। সাসপেনশনের ষষ্ঠ দিনে, নিউরাল স্ফেরয়েডগুলিকে নিউরোব্যাসাল-এ (10888, লাইফ টেকনোলজিস), ভিটামিন এ ছাড়া বি-27 সাপ্লিমেন্ট (12587, লাইফ টেকনোলজিস), গ্লুটাম্যাক্স (1:100, লাইফ টেকনোলজিস), পেনিসিলিন এবং স্ট্রেপ্টোমাইসিন (1:100, লাইফ টেকনোলজিস) ধারণকারী নিউরাল মিডিয়ামে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল এবং 24 তম দিন পর্যন্ত এপিডার্মাল গ্রোথ ফ্যাক্টর (EGF; 20 ng ml−1; R&D সিস্টেমস) এবং ফাইব্রোব্লাস্ট গ্রোথ ফ্যাক্টর 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D সিস্টেমস) দিয়ে পরিপূরক করা হয়েছিল। 25 তম দিন থেকে 42 তম দিন পর্যন্ত, মিডিয়ামে মস্তিষ্ক থেকে প্রাপ্ত নিউরোট্রফিক ফ্যাক্টর (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) এবং নিউরোট্রফিন 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) দিয়ে পরিপূরক করা হয়েছিল, প্রতি অন্য দিন মাঝারি পরিবর্তনের সাথে।স্থগিতাদেশের ষষ্ঠ দিনে, নিউরাল স্ফেরয়েডগুলিকে নিউরোব্যাসাল-এ (10888, লাইফ টেকনোলজিস), ভিটামিন এ ছাড়া বি-27 সম্পূরক (12587, লাইফ টেকনোলজিস), গ্লুটাম্যাক্স (1:100, লাইফ টেকনোলজিস), পেনিসিলিন ধারণকারী একটি নিউরাল মাধ্যমে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল।и стрептомицин (1:100, লাইফ টেকনোলজিস) এবং дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 ng/ml; R&D সিস্টেম) এবং фактором роста; ng/ml; R&D সিস্টেম) 24-го দিন। এবং স্ট্রেপ্টোমাইসিন (১:১০০, লাইফ টেকনোলজিস) এবং ২৪ তম দিন পর্যন্ত এপিডার্মাল গ্রোথ ফ্যাক্টর (EGF; ২০ ng/ml; R&D সিস্টেমস) এবং ফাইব্রোব্লাস্ট গ্রোথ ফ্যাক্টর ২ (FGF2; ২০ ng/ml; R&D সিস্টেমস) এর সাথে সম্পূরক।২৫ থেকে ৪২ দিন পর্যন্ত, মস্তিষ্ক থেকে প্রাপ্ত নিউরোট্রফিক ফ্যাক্টর (BDNF; ২০ ng ml-১, পেপ্রোটেক) এবং নিউরোট্রফিন ৩ (NT3; ২০ ng ml-১, পেপ্রোটেক) মাধ্যমের সাথে যোগ করা হয়েছিল, প্রতি একদিন পর পর মাধ্যম পরিবর্তন করা হয়েছিল।在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有নিউরোবাসাল-এ（10888，লাইফ টেকনোলজিস）、不含维生素A B27补充剂（12587，লাইফ টেকনোলজিস）、GlutaMax（1:100，লাইফ টেকনোলজিস）、青霉素的神经培养基中和链01Life:01 টেকনোলজিস）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D সিস্টেমস）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天.在 悬浮 的 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 নিউরোবাসাল-এ （10888 ， লাইফ টেকনোলজিস补充剂 （12587, Life Technologies） Glutamax （1: 100, Life TechNOGIS 青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 ， 1（01 Life: প্রযুক্তিসমূহ） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D সিস্টেম）笩謇囤24 সিস্টেম 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, লাইফ টেকনোলজিস), добавку добавку витамина А (12587, লাইফ টেকনোলজিস), গ্লুটাম্যাক্স (1:100, লাইফ টেকনোলজিস), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, লাইফ টেকনোলজিস) ফ্যাক্টরা রোস্তা (EGF; 20 ng ml-1; R&D সিস্টেম) এবং фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; ষষ্ঠ দিনে, নিউরোস্ফিয়ার সাসপেনশনগুলিকে নিউরোব্যাসাল-এ (10888, লাইফ টেকনোলজিস), ভিটামিন এ ছাড়া বি-27 সাপ্লিমেন্ট (12587, লাইফ টেকনোলজিস), গ্লুটাম্যাক্স (1:100, লাইফ টেকনোলজিস), পেনিসিলিন-নিরপেক্ষ স্ট্রেপ্টোমাইসিন (1:100, লাইফ টেকনোলজিস) সম্পূরকযুক্ত একটি সম্পূরক দিয়ে স্যুইচ করা হয়েছিল যার মধ্যে এপিডার্মাল গ্রোথ ফ্যাক্টর (EGF; 20 ng ml-1; R&D সিস্টেম) এবং ফাইব্রোব্লাস্ট গ্রোথ ফ্যাক্টর 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1 ছিল; R&D সিস্টেম) 24-го дня। (R&D সিস্টেম) ২৪ দিন পর্যন্ত।২৫ থেকে ৪২ দিন পর্যন্ত, মস্তিষ্ক থেকে প্রাপ্ত নিউরোট্রফিক ফ্যাক্টর (BDNF; ২০ ng ml-১, পেপ্রোটেক) এবং নিউরোট্রফিক ফ্যাক্টর ৩ (NT3; ২০ ng ml-১, পেপ্রোটেক) প্রতি দুই দিন পর পর কালচার মিডিয়ামে যোগ করা হয়েছিল। মাঝারি একবার পরিবর্তন করা হয়েছিল।৪৩ তম দিন থেকে শুরু করে, hCO কে অসম্পূরক নিউরোব্যাসাল-A মাধ্যমে (NM; 1088022, থার্মো ফিশার) রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল, প্রতি ৪-৬ দিনে মাঝারি পরিবর্তনের সাথে। ফিডারবিহীন পরিস্থিতিতে সংস্কৃত hiPS কোষ থেকে hCO প্রাপ্ত করার জন্য, hiPS কোষগুলিকে Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) দিয়ে ৩৭°C তাপমাত্রায় ৭ মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল, একক কোষে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং AggreWell 800 প্লেটে (34815, STEMCELL Technologies) প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল, যার ঘনত্ব প্রতি কূপে 3 × 106 একক কোষ ছিল এসেনশিয়াল 8 মাধ্যমে, ROCK ইনহিবিটর Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) দিয়ে পরিপূরক করা হয়েছিল। ২৪ ঘন্টা পর, কূপের মিডিয়াগুলিকে ডরসোমরফিন (২.৫ μM; P5499, সিগমা-অ্যালড্রিচ) এবং SB-431542 (10 μM; 1614) দিয়ে পরিপূরক করা এসেনশিয়াল 6 মিডিয়া (A1516401, লাইফ টেকনোলজিস) ধারণকারী মিডিয়াতে উপরে এবং নীচে পাইপেট করা হয়েছিল। , টোক্রিডা)। ২য় থেকে ৬ষ্ঠ দিন পর্যন্ত, এসেনশিয়াল 6 মিডিয়াম প্রতিদিন ডরসোমরফিন এবং পরিপূরক SB-431542 দিয়ে প্রতিস্থাপিত হয়েছিল। ষষ্ঠ দিন থেকে, নিউরোস্ফিয়ার সাসপেনশনগুলি নিউরোব্যাসাল মিডিয়ামে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল এবং উপরে বর্ণিত হিসাবে রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল।
স্ট্যানফোর্ড ইউনিভার্সিটি ল্যাবরেটরি অ্যানিমেল কেয়ার অ্যাডমিনিস্ট্রেটিভ কমিটি (APLAC) কর্তৃক অনুমোদিত পশু যত্ন নির্দেশিকা অনুসারে সমস্ত পশু প্রক্রিয়া সম্পন্ন করা হয়েছিল। গর্ভবতী ইউথাইমিক RNU (rnu/+) ইঁদুর (চার্লস রিভার ল্যাবরেটরিজ) কেনা হয়েছিল অথবা রাখা হয়েছিল। প্রাণীদের খাদ্য এবং জলের সাথে 12 ঘন্টার আলো-অন্ধকার চক্রে রাখা হয়েছিল। তিন থেকে সাত দিন বয়সী নগ্ন (FOXN1–/–) ইঁদুরের ছানাগুলিকে হত্যা করার আগে অপরিণত গোঁফের বৃদ্ধি দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল। কুকুরছানা (পুরুষ এবং মহিলা) 2-3% আইসোফ্লুরেন দিয়ে অবেদন দেওয়া হয়েছিল এবং একটি স্টেরিওট্যাক্সিক ফ্রেমে রাখা হয়েছিল। ডুরা ম্যাটারের অখণ্ডতা বজায় রেখে S1 এর উপরে প্রায় 2-3 মিমি ব্যাসের খুলির একটি ট্রেপানেশন করা হয়েছিল। তারপর ডুরা ছিদ্র করার জন্য ক্র্যানিওটমির ঠিক বাইরে একটি 30-G সুই (প্রায় 0.3 মিমি) ব্যবহার করুন। তারপর একটি পাতলা 3×3 সেমি প্যারাফিল্মে HCO প্রয়োগ করুন এবং অতিরিক্ত মাধ্যমটি সরিয়ে ফেলুন। ২৩ জি, ৪৫° সূঁচের সাথে সংযুক্ত হ্যামিল্টন সিরিঞ্জ ব্যবহার করে, সুচের সবচেয়ে দূরবর্তী প্রান্তে আলতো করে hCO টানুন। তারপর স্টেরিওট্যাক্সিক ডিভাইসের সাথে সংযুক্ত সিরিঞ্জ পাম্পে সিরিঞ্জটি ইনস্টল করুন। তারপর সুচের ডগাটি ডুরায় পূর্বে তৈরি ০.৩ মিমি প্রশস্ত পাংচার গর্তের উপর রাখুন (z = ০ মিমি) এবং সিরিঞ্জটি ১-২ মিমি (z = প্রায় –১.৫ মিমি) সরু করুন যতক্ষণ না সুচটি ডুরা ম্যাটার A এর মধ্যে থাকে। একটি ঘন সিল তৈরি হয়। তারপর সিরিঞ্জটিকে z = -0.5 মিমি হারে কর্টিকাল পৃষ্ঠের কেন্দ্রে তুলুন এবং প্রতি মিনিটে ১-২ µl হারে hCO ইনজেকশন করুন। hCO ইনজেকশন সম্পন্ন হওয়ার পরে, সুচটি প্রতি মিনিটে ০.২-০.৫ মিমি হারে প্রত্যাহার করা হয়, ত্বক সেলাই করা হয় এবং কুকুরছানাটিকে সম্পূর্ণ সুস্থ না হওয়া পর্যন্ত অবিলম্বে একটি উষ্ণ হিটিং প্যাডে রাখা হয়। কিছু প্রাণী দ্বিপাক্ষিকভাবে প্রতিস্থাপন করা হয়েছিল।
স্ট্যানফোর্ড ইউনিভার্সিটি APLAC-অনুমোদিত পশু যত্ন নির্দেশিকা অনুসারে সমস্ত প্রাণীর প্রক্রিয়া সম্পাদিত হয়েছিল। প্রতিস্থাপনের 60 দিনেরও বেশি সময় ধরে ইঁদুরগুলিকে 5% আইসোফ্লুরেন অ্যানেস্থেসিয়া দিয়ে প্ররোচিত করা হয়েছিল এবং ইমেজিংয়ের সময় 1-3% আইসোফ্লুরেন দিয়ে অ্যানেস্থেসিয়া দেওয়া হয়েছিল। ভিজ্যুয়ালাইজেশনের জন্য, একটি 7 টেসলা সক্রিয়ভাবে শিল্ডেড অনুভূমিক বোরহোল স্ক্যানার ব্রুকার (ব্রুকার কর্পোরেশন) একটি আন্তর্জাতিক বৈদ্যুতিক কোম্পানি (IECO) গ্রেডিয়েন্ট ড্রাইভ সহ, 120 মিমি (600 mT/m, 1000 T/m/s) অভ্যন্তরীণ ব্যাস সহ একটি শিল্ডেড গ্রেডিয়েন্ট ইনসার্ট AVANCE ব্যবহার করে ব্যবহার করা হয়েছিল। III, আট-চ্যানেল মাল্টি-কয়েল RF এবং মাল্টি-কোর ক্ষমতা, এবং তার সাথে থাকা প্যারাভিশন 6.0.1 প্ল্যাটফর্ম। 86 মিমি অভ্যন্তরীণ ব্যাস সহ একটি সক্রিয়ভাবে ডিকপলড ভলিউমেট্রিক RF কয়েল এবং শুধুমাত্র রিসিভের জন্য একটি চার-চ্যানেল ক্রায়ো-কুলড RF কয়েল ব্যবহার করে রেকর্ডিং সঞ্চালিত হয়েছিল। অক্ষীয় 2D টার্বো-RARE (পুনরাবৃত্তি সময় = 2500 ms, প্রতিধ্বনি সময় = 33 ms, 2 গড়) 16 টি স্লাইস ক্যাপচার সহ, স্লাইস পুরুত্ব 0.6–0.8 মিমি, 256 × 256 নমুনা ধারণ করে। সংকেতগুলি 2 সেমি অভ্যন্তরীণ ব্যাস সহ একটি কোয়াড্রেচার ট্রান্সসিভার ভলিউমেট্রিক RF কয়েল ব্যবহার করে গৃহীত হয়েছিল (র্যাপিড এমআর ইন্টারন্যাশনাল, এলএলসি)। অবশেষে, 3D রেন্ডারিং এবং আয়তন বিশ্লেষণের জন্য বিল্ট-ইন ইমারিস (বিটপ্লেন) পৃষ্ঠ অনুমান ফাংশন ব্যবহার করুন। একটি সফল প্রতিস্থাপনকে এমন একটি প্রতিস্থাপন হিসাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়েছিল যেখানে প্রতিস্থাপন করা গোলার্ধে ক্রমাগত T2-ওজনযুক্ত MRI সংকেতের ক্ষেত্র তৈরি হয়েছিল। গ্রাফ্ট প্রত্যাখ্যানকে এমন একটি গ্রাফ্ট হিসাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়েছিল যা প্রতিস্থাপন করা গোলার্ধে ক্রমাগত T2-ওজনযুক্ত MRI সংকেতের ক্ষেত্র তৈরি করেনি। সাবকর্টিক্যাল t-hCO পরবর্তী বিশ্লেষণ থেকে বাদ দেওয়া হয়েছিল।
দুই-ফোটন ক্যালসিয়াম ইমেজিংয়ের জন্য hCO তে GCaMP6s স্থিরভাবে প্রকাশ করার জন্য, hiPS কোষগুলিকে pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro দ্বারা সংক্রামিত করা হয়েছিল এবং তারপরে অ্যান্টিবায়োটিক নির্বাচন করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, কোষগুলিকে EDTA-এর সাথে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং পলিব্রিন (5 μg/ml) এবং 15 μl ভাইরাসের উপস্থিতিতে প্রায় 300,000 কোষের ঘনত্বে 1 মিলি এসেনশিয়াল 8 মাধ্যমের মধ্যে স্থগিত করা হয়েছিল। এরপর কোষগুলিকে 60 মিনিটের জন্য সাসপেনশনে ইনকিউব করা হয়েছিল এবং প্রতি কূপে 50,000 কোষের ঘনত্বে বীজ বপন করা হয়েছিল। সঙ্গমের পরে, কোষগুলিকে 5-10 μg ml-1 puromycin দিয়ে 5-10 দিন বা স্থিতিশীল উপনিবেশ দেখা না দেওয়া পর্যন্ত চিকিত্সা করা হয়েছিল। কিছু পরিবর্তন সহ পূর্বে বর্ণিত 5 অনুসারে তীব্র hCO সংক্রমণ সম্পন্ন করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, 30-45 দিন hCO 100 μl স্নায়ু মাধ্যম ধারণকারী 1.5 মিলি এপেনডর্ফ মাইক্রোসেন্ট্রিফিউজ টিউবে স্থানান্তর করুন। তারপর প্রায় ৯০ µl মাধ্যমের অপসারণ করা হয়, ৩-৬ µl উচ্চ টাইটার ল্যান্টিভাইরাস (০.৫ x ১০৮ থেকে ১.২ x ১০৯ পর্যন্ত) টিউবে যোগ করা হয় এবং hCO ৩০ মিনিটের জন্য ইনকিউবেটারে স্থানান্তরিত করা হয়। তারপর প্রতিটি টিউবে ৯০-১০০ µl মাধ্যমের যোগ করুন এবং রাতারাতি টিউবগুলিকে ইনকিউবেটারে ফিরিয়ে দিন। পরের দিন, কম সংযুক্তি প্লেটে তাজা স্নায়ু মাধ্যমে hCO স্থানান্তর করুন। ৭ দিন পর, সংক্রমণের গুণমান কল্পনা এবং মূল্যায়নের জন্য hCO ২৪-ওয়েল কাচের নীচের প্লেটে স্থানান্তরিত করা হয়। pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE এবং pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE VectorBuilder দ্বারা তৈরি করা হয়েছিল। বেশিরভাগ পরীক্ষায় লেন্টিভাইরাস ব্যবহার করা হয় কারণ এটি হোস্ট জিনোমে সংহত হয়, যা সংক্রামিত কোষ লাইনে রিপোর্টার জিন প্রকাশের অনুমতি দেয়। জলাতঙ্ক ফলো-আপের জন্য, ৩০-৪৫ দিনের hCO-কে জলাতঙ্ক-ΔG-eGFP এবং AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (প্লাজমিড #৬৭৫২৮, অ্যাডজিন) দ্বারা সহ-সংক্রমিত করা হয়েছিল, ৩ দিন ধরে পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে ধুয়ে S1-এ ইঁদুরের মধ্যে প্রতিস্থাপন করা হয়েছিল এবং ৭-১৪ দিনের জন্য ভিভোতে রাখা হয়েছিল।
ইমিউনোসাইটোকেমিস্ট্রির জন্য, প্রাণীদের অবেদন দেওয়া হয় এবং ট্রান্সকার্ডিয়ালি PBS দিয়ে পারফিউজ করা হয়, এরপর ৪% প্যারাফর্মালডিহাইড (PBS-তে PFA; ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপি সায়েন্সেস)। মস্তিষ্ক ৪% PFA-তে ২ ঘন্টা বা রাতের জন্য ৪°C তাপমাত্রায় স্থির করা হয়, PBS-তে ৩০% সুক্রোজে ৪৮-৭২ ঘন্টার জন্য ক্রায়োপ্রিজারভ করা হয় এবং ১:১, ৩০% সুক্রোজে এমবেড করা হয়: OCT (টিস্যু-টেক OCT কম্পাউন্ড ৪৫৮৩, সাকুরা ফিনেটেক) এবং করোনাল সেকশন ৩০ µm-এ ক্রায়োস্ট্যাট (লাইকা) ব্যবহার করে তৈরি করা হয়। পুরু সেকশনের ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রির জন্য, প্রাণীদের PBS-তে পারফিউজ করা হয়, এবং মস্তিষ্ক ৩০০-৪০০ µm-এ ব্যবচ্ছেদ করা হয় এবং ভাইব্রাটোম (লাইকা) ব্যবহার করে করোনাল সেকশন করা হয় এবং সেকশনগুলো ৩০ মিনিটের জন্য ৪% PFA-তে স্থির করা হয়। তারপর ক্রায়োসেকশন বা পুরু অংশগুলিকে PBS দিয়ে ধুয়ে ঘরের তাপমাত্রায় (১০% স্বাভাবিক গাধা সিরাম (NDS) এবং ০.৩% ট্রাইটন X-১০০ PBS-তে মিশ্রিত) ১ ঘন্টার জন্য ব্লক করা হয়েছিল এবং ৪°C তাপমাত্রায় ব্লকিং দ্রবণ দিয়ে ব্লক করা হয়েছিল। – ইনকিউবেশন ক্রায়োসেকশনগুলিকে রাতারাতি ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল এবং পুরু অংশগুলিকে ৫ দিনের জন্য ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল। ব্যবহৃত প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলি ছিল: অ্যান্টি-নিউএন (ইঁদুর, 1:500; ab104224, abcam) অ্যান্টি-CTIP2 (ইঁদুর, 1:300; ab18465, abcam), অ্যান্টি-GFAP (খরগোশ, 1:1,000; Z0334, ডাকো), অ্যান্টি-GFP (মুরগি, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), অ্যান্টি-HNA (ইঁদুর, 1:200; ab191181, abcam), অ্যান্টি-নিউএন (খরগোশ, 1:500; ABN78, মিলিপুর), অ্যান্টি-PDGFRA (খরগোশ, 1:200; sc-338, সান্তা ক্রুজ), অ্যান্টি-PPP1R17 (খরগোশ, 1:200; HPA047819, অ্যাটলাস অ্যান্টিবডি), অ্যান্টি-RECA-1 (ইঁদুর, ১:৫০; ab9774, abcam), অ্যান্টি-SCG2 (খরগোশ, ১:১০০; ২০৩৫৭-১-এপি, প্রোটিনটেক), অ্যান্টি-SOX9 (ছাগল, ১:৫০০; AF3075, R&D সিস্টেম), নেট্রিন G1a (ছাগল, ১:১০০; AF1166, R&D সিস্টেম), অ্যান্টি-STEM121 (মাউস, ১:২০০; Y40410, টাকারা বায়ো), অ্যান্টি-SATB2 (মাউস, ১:৫০; ab51502, abcam), অ্যান্টি-GAD65/67 (খরগোশ, ১:৪০০; ABN904, মিলিপুর) এবং অ্যান্টি-IBA1 (ছাগল, ১:১০০; ab5076, abcam)। ব্যবহৃত প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলি ছিল: অ্যান্টি-নিউএন (ইঁদুর, 1:500; ab104224, abcam) অ্যান্টি-CTIP2 (ইঁদুর, 1:300; ab18465, abcam), অ্যান্টি-GFAP (খরগোশ, 1:1,000; Z0334, ডাকো), অ্যান্টি-GFP (মুরগি, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), অ্যান্টি-HNA (ইঁদুর, 1:200; ab191181, abcam), অ্যান্টি-নিউএন (খরগোশ, 1:500; ABN78, মিলিপুর), অ্যান্টি-PDGFRA (খরগোশ, 1:200; sc-338, সান্তা ক্রুজ), অ্যান্টি-PPP1R17 (খরগোশ, 1:200; HPA047819, অ্যাটলাস অ্যান্টিবডি), অ্যান্টি-RECA-1 (ইঁদুর, ১:৫০; ab9774, abcam), অ্যান্টি-SCG2 (খরগোশ, ১:১০০; ২০৩৫৭-১-এপি, প্রোটিনটেক), অ্যান্টি-SOX9 (ছাগল, ১:৫০০; AF3075, R&D সিস্টেম), নেট্রিন G1a (ছাগল, ১:১০০; AF1166, R&D সিস্টেম), অ্যান্টি-STEM121 (মাউস, ১:২০০; Y40410, টাকারা বায়ো), অ্যান্টি-SATB2 (মাউস, ১:৫০; ab51502, abcam), অ্যান্টি-GAD65/67 (খরগোশ, ১:৪০০; ABN904, মিলিপুর) এবং অ্যান্টি-IBA1 (ছাগল, ১:১০০; ab5076, abcam)। Использовались следующие первичные antititela: ANTI-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, abcam), 136, abcam ANTI-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), ANTI- -GFP (kuрица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), ANTI-HNA (мышь, 1:200; ab1919, ab1919), (ক্রোলিক, 1:500; ABN78, মিলিপুর), অ্যান্টি-পিডিজিএফআরএ (ক্রোলিক, 1:200; এসসি-338, সান্টা-ক্রুজ), অ্যান্টি-পিপিপি1আর17 (ক্রোলিক, 1:200; এইচপিএ047819, অ্যাটলাস অ্যান্টিবডি), অ্যান্টি-আরইসিএ-1 (এম:19, 74, অ্যাবক্যাম), অ্যান্টি-এসসিজি2 (করোলিক , 1:100; 20357-1-এপি, প্রোটিনটেক), অ্যান্টি-এসওএক্স9 (কোজিয়, 1:500; AF3075, R&D সিস্টেম), এনট্রিন G1a (কোজিয়, 1:100, R106; সিস্টেম), ANTI-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), ANTI-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), ANTI-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, মিলিপুর) এবং анти-IBA1 (коза, 1 :100; абкама 507)। ব্যবহৃত প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলি ছিল: অ্যান্টি-নিউএন (ইঁদুর, 1:500; ab104224, abcam), অ্যান্টি-CTIP2 (ইঁদুর, 1:300; ab18465, abcam), অ্যান্টি-GFAP (খরগোশ, 1:1000; Z0334, ডাকো), অ্যান্টি-GFP (মুরগি, 1:1000; GTX13970, GeneTex), অ্যান্টি-HNA (ইঁদুর, 1:200; ab191181, abcam), অ্যান্টি-নিউএন (খরগোশ, 1:500; ABN78, মিলিপুর), অ্যান্টি-PDGFRA (খরগোশ, 1:200; sc-338, সান্তা ক্রুজ), অ্যান্টি-PPP1R17 (খরগোশ, 1:200; HPA047819, অ্যাটলাস অ্যান্টিবডি), অ্যান্টি-RECA-1 (ইঁদুর, ১:৫০; ab9774, abcam), অ্যান্টি- SCG2 (খরগোশ, ১:১০০; ২০৩৫৭-১-এপি, প্রোটিনটেক), অ্যান্টি- SOX9 (ছাগল, ১:৫০০; AF3075, R&D সিস্টেম), নেট্রিন G1a (ছাগল, ১:১০০; AF1166, R&D সিস্টেম), অ্যান্টি- STEM121 (মাউস, ১:২০০; Y40410, টাকারা বায়ো), অ্যান্টি- SATB2 (মাউস, ১:৫০; ab51502, abcam), অ্যান্টি- GAD65/67 (খরগোশ, ১:৪০০; ABN904, মিলিপুর) এবং অ্যান্টি- IBA1 (ছাগল, ১:১০০; ab5076, abkam)।使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠,1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334,Dako）,抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970,GeneTex）,抗HNA（小鼠,1:200；ab1911 81, abcam）,抗NeuN（兔,1:500；ABN78,মিলিপুর）,抗PDGFRA（兔, 1:200；sc-338，সান্তা ক্রুজ），抗PPP1R17（兔,1:200；HPA047819,এটলাস抗体）,抗RECA-1（小鼠,1:50；ab9774,abcam）,抗SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems）,Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D সিস্টেম），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔,1:1,000；Z0334,ডাকো）,抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex）,抗HNA（小鼠,1:200；ab 191181, abcam）,抗NeuN（兔,1:500；ABN78,মিলিপুর％弔,抗1: 200;sc-338, সান্তা ক্রুজ), 抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819, Atlas 抗体）,抗RECA-1（小鼠,1:50；ab9774, abcam）,抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075,R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166,R&D順, Systems:2Y40410, টাকারা বায়ো), অ্যান্টি-SATB2 (ইঁদুর, 1:50; ab51502, abcam), অ্যান্টি-GAD65/67 (খরগোশ, 1:400; ABN904, মিলিপুর) এবং অ্যান্টি-IBA1 (ছাগল, 1:100; ab5076, abcam)।ব্যবহৃত প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলি ছিল: অ্যান্টি-নিউএন (ইঁদুর, 1:500; ab104224, abcam), অ্যান্টি-CTIP2 (ইঁদুর, 1:300; ab18465, abcam), অ্যান্টি-GFAP (খরগোশ, 1:1000; Z0334, ডাকো)। , অ্যান্টি-GFP (মুরগি, 1:1000; GTX13970, GeneTex), অ্যান্টি-HNA (মাউস, 1:200; ab191181, abcam), অ্যান্টি-NeuN (খরগোশ, 1:500; ABN78, মিলিপুর), অ্যান্টি-PDGFRA (খরগোশ, 1:200; sc-338, সান্তা ক্রুজ), অ্যান্টি-PPP1R17 (খরগোশ, 1:200; HPA047819, অ্যাটলাস অ্যান্টিবডি), অ্যান্টি-RECA-1 (মাউস, 1:50; ab9774, abcam), অ্যান্টি-SCG2 (খরগোশ), 1:100;20357-1-AP, প্রোটিনটেক), ANTI-SOX9 (কোজা, 1:500; AF3075, R&D সিস্টেমস), NETRIN G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D সিস্টেম), ANTI-STEM121, Y40121; Takara Bio), ANTI-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, মিলিপুর) এবং анти-IBA1 (коза, 1:100, бакама6); 20357-1-AP, প্রোটিনটেক), অ্যান্টি-SOX9 (ছাগল, 1:500; AF3075, R&D সিস্টেম), নেট্রিন G1a (ছাগল, 1:100; AF1166, R&D সিস্টেম), অ্যান্টি-STEM121 (মাউস, 1:200; Y40410, টাকারা বায়ো), অ্যান্টি-SATB2 (মাউস, 1:50; ab51502, abcam), অ্যান্টি-GAD65/67 (খরগোশ, 1:400; ABN904, মিলিপুর), এবং অ্যান্টি-IBA1 (ছাগল, 1:100; ab5076, abkam)।এরপর অংশগুলিকে PBS দিয়ে ধৌত করা হয় এবং ঘরের তাপমাত্রায় (হিমায়িত অংশ) ১ ঘন্টা অথবা ৪°C (ঘন অংশ) রাতভর সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি দিয়ে সেঁকে রাখা হয়। Alexa Fluor সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি (Life Technologies) ১:১০০০ মিশ্রিত ব্লকিং দ্রবণ ব্যবহার করা হয়। PBS দিয়ে ধোয়ার পর, নিউক্লিয়াগুলিকে Hoechst 33258 (Life Technologies) দিয়ে ভিজ্যুয়ালাইজ করা হয়। অবশেষে, স্লাইডগুলিকে একটি মাইক্রোস্কোপে কভারস্লিপ (Fisher Scientific) সহ একটি Aquamount (Polysciences) ব্যবহার করে স্থাপন করা হয় এবং একটি Keyence fluorescent মাইক্রোস্কোপ (BZ-X বিশ্লেষক) অথবা একটি Leica TCS SP8 কনফোকাল মাইক্রোস্কোপ (Las-X) দিয়ে চিত্রটিতে বিশ্লেষণ করা হয়। চিত্রগুলি ImageJ প্রোগ্রাম (Fiji) ব্যবহার করে প্রক্রিয়াজাত করা হয়। t-hCO2 এবং ইঁদুরের কর্টেক্সে মানব নিউরনের অনুপাত পরিমাপ করার জন্য, t-hCO2 এর কেন্দ্রে, ইঁদুরের কর্টেক্সের প্রান্তে বা তার কাছাকাছি ৩৮৭.৫ μm প্রশস্ত আয়তাকার ছবি তোলা হয়। টিস্যুর স্বচ্ছতা, HNA+ নিউক্লিয়াস এবং/অথবা টিস্যু অটোফ্লোরেসেন্সের উপস্থিতির পরিবর্তন মূল্যায়ন করে গ্রাফ্ট মার্জিন নির্ধারণ করা হয়েছিল। প্রতিটি ছবিতে, একই এলাকায় NeuN+ এবং HNA+ কোষের মোট সংখ্যাকে NeuN+ কোষের মোট সংখ্যা দিয়ে ভাগ করা হয়েছিল। চিত্রের সমতলে শুধুমাত্র নিউক্লিয়াসযুক্ত কোষগুলি গণনা করা হয় তা নিশ্চিত করার জন্য, শুধুমাত্র Hoechst+ কোষগুলিকে গণনায় অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছে। পরিসংখ্যানগত ত্রুটি কমাতে কমপক্ষে 1 মিমি দ্বারা পৃথক দুটি চিত্রের গড় করা হয়েছিল।
নমুনা সংগ্রহের এক সপ্তাহ আগে, hCO প্রতিস্থাপনকারী প্রাণীদের (প্রায় 8 মাসের পার্থক্য) একটি অন্ধকার ঘরে রাখুন যেখানে সংবেদনশীল উদ্দীপনা কমাতে গোঁফ ছাঁটা থাকে। পূর্বে বর্ণিত হিসাবে নিউক্লিয়াসের বিচ্ছিন্নতা করা হয়েছিল, কিছু পরিবর্তন সহ। সংক্ষেপে, t-hCO এবং hCO ডিটারজেন্ট-যান্ত্রিক কোষ লাইসিস এবং 2 মিলি গ্লাস টিস্যু গ্রাইন্ডার (D8938, সিগমা-অ্যালড্রিচ/কিম্বল) ব্যবহার করে ধ্বংস করা হয়েছিল। এরপর অপরিশোধিত নিউক্লিয়াসগুলিকে 40 µm ফিল্টার ব্যবহার করে ফিল্টার করা হয়েছিল এবং 4 °C তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য 320 গ্রাম সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং একটি সুক্রোজ ঘনত্ব গ্রেডিয়েন্ট সম্পাদন করা হয়েছিল। সেন্ট্রিফিউগেশন ধাপের পরে (4°C তাপমাত্রায় 20 মিনিটের জন্য 320 গ্রাম), নমুনাগুলিকে 0.2 ইউনিট µl-1 RNase ইনহিবিটর (40 u µl-1, AM2682, অ্যাম্বিয়ন) যোগ করে 0.04% BSA/PBS এ পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল এবং একটি 40 µm প্রবাহ ফিল্টারের মধ্য দিয়ে পাস করা হয়েছিল। এরপর বিচ্ছিন্ন নিউক্লিয়াসগুলিকে 0.02% BSA ধারণকারী PBS-এ পুনরায় সাসপেন্ড করা হয় এবং একটি Chromium Single Cell 3′ চিপে লোড করা হয় (প্রতি লেনে 8,000 কোষের আনুমানিক পুনরুদ্ধার)। snRNA-seq লাইব্রেরিগুলি Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) দিয়ে প্রস্তুত করা হয়েছিল। snRNA-seq লাইব্রেরিগুলি Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) দিয়ে প্রস্তুত করা হয়েছিল। Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью ক্রোমিয়াম একক সেল 3′ GEM, লাইব্রেরি এবং জেল বিড কিট v3 (10x জিনোমিক্স)। snRNA-seq লাইব্রেরিগুলি Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ব্যবহার করে প্রস্তুত করা হয়েছিল। snRNA-seq 文库是使用Chromium একক কোষ 3′ GEM 、Library & Gel Bead Kit v3 (10x জিনোমিক্স) 制备的. snRNA-seq 文库是使用Chromium একক কোষ 3′ GEM 、Library & Gel Bead Kit v3 (10x জিনোমিক্স) 制备的. Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x জিনোমিক্স)। snRNA-seq লাইব্রেরিটি Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ব্যবহার করে প্রস্তুত করা হয়েছিল।বিভিন্ন নমুনা থেকে লাইব্রেরিগুলি নোভাসেক এস৪ (ইলুমিনা) -এ অ্যাডমেরা হেলথ দ্বারা পুল এবং সিকোয়েন্স করা হয়েছিল।
প্রতিটি সম্ভাব্য নিউক্লিয়ার বারকোডের জন্য জিন এক্সপ্রেশন লেভেল 10x জিনোমিক্স সেলরেঞ্জার বিশ্লেষণ সফ্টওয়্যার প্যাকেজ (সংস্করণ 6.1.2) ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল। বিশেষ করে, রিডগুলি mkref কমান্ড দিয়ে তৈরি মানব (GRCh38, এনসেম্বল, সংস্করণ 98) এবং ইঁদুর (Rnor_6.0, এনসেম্বল, সংস্করণ 100) রেফারেন্স জিনোমের সংমিশ্রণের সাথে মিলিত হয়েছিল এবং –include-introns=TRUE কমান্ডের সাহায্যে গণনা ব্যবহার করে ইন্ট্রন অঞ্চলে ম্যাপ করা রিডিং অন্তর্ভুক্ত করে। t-hCO নমুনার জন্য, মানব নিউক্লিয়াসকে রক্ষণশীল প্রয়োজনীয়তার উপর ভিত্তি করে চিহ্নিত করা হয়েছিল যে সমস্ত ম্যাপ করা রিডের কমপক্ষে 95% মানব জিনোমের সাথে মেলে। পরবর্তী সমস্ত বিশ্লেষণ R প্যাকেজ (সংস্করণ 4.1.2) সিউরাট (সংস্করণ 4.1.1)32 ব্যবহার করে সেলরেঞ্জার থেকে ফিল্টার করা বারকোড অ্যারে আউটপুটে সম্পাদিত হয়েছিল।
পরবর্তী বিশ্লেষণে শুধুমাত্র উচ্চমানের নিউক্লিয়াস অন্তর্ভুক্ত করার জন্য, প্রতিটি নমুনার জন্য একটি পুনরাবৃত্তিমূলক ফিল্টারিং প্রক্রিয়া বাস্তবায়িত করা হয়েছিল। প্রথমত, ১০০০-এরও কম অনন্য জিন পাওয়া গেছে এবং মোট মাইটোকন্ড্রিয়ার ২০%-এরও বেশি সহ নিম্নমানের নিউক্লিয়াস সনাক্ত করা হয় এবং অপসারণ করা হয়। পরবর্তীকালে, sctransform(vst.flavor=”v2″) ফাংশন ব্যবহার করে নিয়মিত নেতিবাচক দ্বিপদী রিগ্রেশন দ্বারা কাঁচা জিন নম্বর ম্যাট্রিক্স স্বাভাবিক করা হয়েছিল, যা ডিফল্ট প্যারামিটার ব্যবহার করে 3000টি সর্বাধিক পরিবর্তনশীল জিন সনাক্ত করেছিল। প্রিন্সিপাল কম্পোনেন্ট অ্যানালাইসিস (PCA) ব্যবহার করে উপরের পরিবর্তনশীল জিনগুলিতে মাত্রা হ্রাস করা হয়েছিল ডিফল্ট প্যারামিটার ব্যবহার করে 30 এর ডেটা সেট মাত্রা ব্যবহার করে (dims = 30 হাঁটুর স্থানের ভিজ্যুয়াল পরিদর্শনের ভিত্তিতে বেছে নেওয়া হয়েছিল এবং সমস্ত নমুনা এবং এনসেম্বল বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল)। এরপর আমরা অস্বাভাবিকভাবে কম জিন গণনা (10 তম শতাংশের নীচের মধ্যমা), অস্বাভাবিকভাবে উচ্চ মাইটোকন্ড্রিয়াল জিন গণনা (95 তম শতাংশের উপরে মধ্যমা) এর উপর ভিত্তি করে জিনগুলিকে শনাক্ত করতে পুনরাবৃত্তিমূলক ক্লাস্টারিং (রেজোলিউশন = 1) এর বেশ কয়েকটি রাউন্ড সম্পাদন করেছি যাতে নিম্নমানের পুটেটিভ কোষগুলি সনাক্ত এবং অপসারণ করা যায়। DoubletFinder33 প্যাকেজ ব্যবহার করে সনাক্ত করা সন্দেহভাজন যমজদের ক্লাস্টার এবং/অথবা একটি উচ্চ অনুপাত (95 তম শতাংশের উপরে গড় DoubletFinder স্কোর)। t-hCO নমুনা (n=3) এবং hCO নমুনা (n=3) পৃথকভাবে সংহত করা হয়েছিল উপরের প্যারামিটারগুলির সাথে ইন্টিগ্রেটডেটা ফাংশনটি ইন্টিগ্রেটেড করুন। তারপর উপরে বর্ণিত হিসাবে ইন্টিগ্রেটেড ডেটা সেটের গুণগত ফিল্টারিংয়ের আরেকটি রাউন্ড সঞ্চালিত হয়েছিল।
নিম্নমানের কার্নেলগুলি অপসারণের পর, সমন্বিত ডেটাসেটটি গোষ্ঠীভুক্ত করা হয়েছিল (রেজোলিউশন = 0.5) এবং UMAP34 ভিজ্যুয়ালাইজেশনের উদ্দেশ্যে এমবেড করা হয়েছিল। প্রতিটি ক্লাস্টারের জন্য মার্কার জিনগুলি FindMarkers ফাংশন ব্যবহার করে নির্ধারিত হয়েছিল, যা স্বাভাবিক জিন এক্সপ্রেশন ডেটা থেকে গণনা করা ডিফল্ট প্যারামিটার ব্যবহার করে। আমরা ভ্রূণ এবং প্রাপ্তবয়স্ক কর্টিকাল রেফারেন্স ডেটাসেটগুলিকে মার্কার জিন এক্সপ্রেশন 19,20,21,35 এবং টীকা দিয়ে একত্রিত করে প্রধান কোষ শ্রেণীগুলি সনাক্ত এবং শ্রেণীবদ্ধ করি। বিশেষ করে, MKI67 এবং TOP2A এর এক্সপ্রেশন দ্বারা সঞ্চালিত পূর্বসূরীগুলি চিহ্নিত করা হয়েছিল। প্রোজেনিটর ক্লাস্টারগুলি মাইটোটিক ট্রান্সক্রিপ্টের অনুপস্থিতি, লেট মেটাফেজ ভ্রূণ কর্টেক্সে বর্ণিত মাল্টিপোটেন্ট গ্লিয়াল প্রোজেনিটর ক্লাস্টারগুলির সাথে উচ্চ ওভারল্যাপ এবং EGFR এবং OLIG1 এক্সপ্রেশন দ্বারা সংজ্ঞায়িত করা হয়েছিল। আমরা লেট রেডিয়াল গ্লিয়া থেকে অ্যাস্ট্রোসাইটের পরিপক্কতা পর্যন্ত অ্যাস্ট্রোসাইট পার্থক্যের বিভিন্ন অবস্থা অন্তর্ভুক্ত করতে অ্যাস্ট্রোসাইট শব্দটি ব্যবহার করি। অ্যাস্ট্রোসাইট ক্লাস্টারগুলি SLC1A3 এবং AQP4 এর উচ্চ স্তর প্রকাশ করে এবং ভ্রূণ রেডিয়াল গ্লিয়া এবং/অথবা প্রাপ্তবয়স্ক অ্যাস্ট্রোসাইটের উপপ্রকারের সাথে মানচিত্র তৈরি করতে দেখা গেছে। OPC গুলি PDGFRA এবং SOX10 প্রকাশ করে যখন অলিগোডেনড্রোসাইটগুলি মাইলিনেশন মার্কার (MOG এবং MYRF) প্রকাশ করে। গ্লুটামেটার্জিক নিউরনগুলি নিউরোনাল ট্রান্সক্রিপ্টের উপস্থিতি (SYT1 এবং SNAP25), GABAergic মার্কার (GAD2) অনুপস্থিতি এবং NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, অথবা SATB2 এর এক্সপ্রেশন দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল। GluN নিউরনগুলিকে আরও উপরের (SATB2 এক্সপ্রেশন এবং BCL11B এর ক্ষতি) এবং গভীর (BCL11B এক্সপ্রেশন) উপশ্রেণীতে বিভক্ত করা হয়েছিল। পুটেটিভ সাবপ্লেট (SP) নিউরনগুলি গভীর GluN মার্কার ছাড়াও ST18 এবং SORCS1 এর মতো পরিচিত SP18 মার্কার প্রকাশ করে। কোরয়েড প্লেক্সাস-সদৃশ কোষগুলি TTR এক্সপ্রেশন দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল, এবং মেনিনজিয়াল-সদৃশ কোষগুলি ফাইব্রোব্লাস্ট-সম্পর্কিত জিন এবং রেফারেন্স ডেটা সেটের ম্যাপ করা পিয়াল/ভাস্কুলার কোষগুলি প্রকাশ করে।
Libra R প্যাকেজ (সংস্করণ 1.0.0) ব্যবহার করে বাস্তবায়িত নমুনাগুলিতে পুনরুত্পাদিত একটি নতুন উন্নত ছদ্ম-ব্যাচ পদ্ধতি ব্যবহার করে t-hCO এবং hCO উপশ্রেণীর মধ্যে জিন প্রকাশের ডিফারেনশিয়াল বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। বিশেষ করে, edgeR লগ-সম্ভাবনা পরীক্ষা (সংস্করণ 3.36.0, প্যাকেজ R) প্রতিটি নমুনা প্রতিলিপির জন্য একটি নির্দিষ্ট কোষ শ্রেণীর জন্য কোষে জিনের সংখ্যা যোগ করে গোষ্ঠীগুলির জন্য করা হয়েছিল। হিটম্যাপ ভিজ্যুয়ালাইজেশনের জন্য, edgeR (cpm() ফাংশন) ব্যবহার করে স্বাভাবিককৃত প্রতি মিলিয়ন (CPM) মান গণনা করা হয় এবং স্কেল করা হয় (গড় = 0, স্ট্যান্ডার্ড ডেভিয়েশন = 1 অর্জন করতে)। উল্লেখযোগ্যভাবে আপরেগুলেটেড t-hCO GluN জিনের জিন অন্টোলজি (GO) সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণ করা হয়েছিল (বেঞ্জামিনি-হচবার্গ t-hCO GluN কোষের কমপক্ষে 10% কোষে 0.05 এর কম P মান প্রকাশ করেছেন এবং পরিবর্তনে কমপক্ষে 2 গুণ বৃদ্ধি করেছেন)। ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37 ব্যবহার করে করা হয়েছিল। আমরা ডিফল্ট প্যারামিটার সহ ToppFun অ্যাপ ব্যবহার করি এবং GO-অ্যানোটেটেড হাইপারজিওমেট্রিক পরীক্ষা থেকে গণনা করা বেঞ্জামিনি-হচবার্গ-সংশোধিত P-মানগুলি রিপোর্ট করি।
প্রাথমিক একক-কোষ RNA-seq বা প্রাপ্তবয়স্ক snRNA-seq19,20,21,22 এর রেফারেন্স স্টাডি থেকে প্রাপ্ত টীকাযুক্ত কোষ ক্লাস্টারের সাথে আমাদের snRNA-seq ক্লাস্টারগুলিকে মেলাতে, আমরা একটি জোড়া ডেটাসেট ইন্টিগ্রেশন পদ্ধতি প্রয়োগ করেছি। আমরা Seurat-এ SCTransform (v2) নরমালাইজেশন ওয়ার্কফ্লো ব্যবহার করেছি ডেটাসেটের মধ্যে ক্লাস্টার ওভারল্যাপগুলিকে একীভূত করতে এবং তুলনা করতে (উপরের মতো একই পরামিতি ব্যবহার করে)। গণনা দক্ষতার জন্য প্রতিটি মূল ক্লাস্টারের জন্য পৃথক ডেটাসেটগুলিকে এলোমেলোভাবে 500 কোষ বা কোর পর্যন্ত সাবসেট করা হয়েছিল। পূর্বে বর্ণিত একই পদ্ধতি ব্যবহার করে, ক্লাস্টার ওভারল্যাপকে রেফারেন্স ক্লাস্টারের লেবেলের সাথে ওভারল্যাপ করা প্রতিটি পুল করা ক্লাস্টারের কোষ বা নিউক্লিয়ার অনুপাত হিসাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়েছিল। GluN-গুলিকে আরও শ্রেণীবদ্ধ করার জন্য, আমরা আমাদের GluN কোষগুলিতে রেফারেন্স ডেটাসেট লেবেল বরাদ্দ করতে GluN সাবসেট ডেটার জন্য Seurat-এর TransferData ওয়ার্কফ্লো ব্যবহার করেছি।
t-hCO এবং hCO নমুনার গ্লোবাল ট্রান্সক্রিপ্টোমের পরিপক্কতার অবস্থা মূল্যায়ন করার জন্য, আমরা আমাদের ছদ্ম-বাল্ক নমুনাগুলিকে BrainSpan/psychENCODE23 এর সাথে তুলনা করেছি, যা মানুষের মস্তিষ্কের বিকাশকে বিস্তৃত একটি বৃহৎ RNA ক্রম নিয়ে গঠিত। আমরা গর্ভধারণের 10 সপ্তাহ পরে এবং পরে, 5567 জিনে (আমাদের ডেটা সহ) কর্টিকাল নমুনা থেকে একটি সম্মিলিত প্যাটার্ন-স্বাভাবিক জিন এক্সপ্রেশন ম্যাট্রিক্সের উপর PCA করেছি যা পূর্বে BrainSpan কর্টিকাল নমুনায় সক্রিয় হিসাবে চিহ্নিত হয়েছিল (একটি ঘনক মডেল ব্যবহার করে বয়স দ্বারা ব্যাখ্যা করা বিকাশগত বৈচিত্র্যে 50% এর বেশি হিসাবে সংজ্ঞায়িত)38। এছাড়াও, আমরা পূর্বে বর্ণিত নন-নেগেটিভ ম্যাট্রিক্স ফ্যাক্টরাইজেশন ব্যবহার করে নিউরোডেভেলপমেন্টের প্রধান ট্রান্সক্রিপ্টোম স্বাক্ষরের সাথে সম্পর্কিত জিনগুলি অর্জন করেছি। নন-নেগেটিভ ম্যাট্রিক্স ফ্যাক্টরাইজেশন পদ্ধতি ব্যবহার করে গণনা করা নমুনা ওজনগুলি চিত্র 5b তে ঝু এট আল দ্বারা বর্ণিত পাঁচটি স্বাক্ষরের প্রতিটির জন্য প্রসারিত ডেটা সহ প্লট করা হয়েছে। আবার, কার্যকলাপ নির্ভর ট্রান্সক্রিপশনাল মার্কারগুলি পূর্বে প্রকাশিত গবেষণা থেকে নেওয়া হয়েছিল। বিশেষ করে, পরিপূরক সারণি 3 Hrvatin et al.16 থেকে চাক্ষুষ উদ্দীপনার পরে মাউস ভিজ্যুয়াল কর্টেক্স snRNA-seq সংগ্রহ দ্বারা চিহ্নিত গ্লুটামেটেরজিক নিউরনে ERG এবং LRG উল্লেখযোগ্যভাবে আপরেগুলেটেড হয়েছিল। KCl-সক্রিয় মানব ভ্রূণের মস্তিষ্কের সংস্কৃতি থেকে মানব-সমৃদ্ধ LRG প্রাপ্ত করা হয়েছিল এবং উদ্দীপনার 6 ঘন্টা পরে সংগ্রহ করা হয়েছিল, এবং ফিল্টার করা জিনগুলি মানুষের মধ্যে উল্লেখযোগ্যভাবে আপরেগুলেটেড হয়েছিল কিন্তু ইঁদুরের মধ্যে নয় (পরিপূরক সারণি 4)। এই জিন সেটগুলি ব্যবহার করে জিন সেট সমৃদ্ধকরণের বিশ্লেষণ একমুখী ফিশারের সঠিক পরীক্ষা ব্যবহার করে করা হয়েছিল।
ইঁদুরের মস্তিষ্ক আইসোফ্লুরেন দিয়ে চেতনানাশক করুন, মস্তিষ্ক অপসারণ করুন এবং ঠান্ডা (প্রায় 4°C) অক্সিজেনযুক্ত (95% O2 এবং 5% CO2) সুক্রোজ দ্রবণে রাখুন যাতে 234 mM সুক্রোজ, 11 mM গ্লুকোজ, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM। NaH2PO4, 10 mM MgSO4 এবং 0.5 mM CaCl2 (প্রায় 310 mOsm) থাকে। ইঁদুরের মস্তিষ্কের করোনাল অংশ (300-400 µm) t-hCO3 ধারণকারী একটি Leica VT1200 ভাইব্রেটোম ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল যেমনটি আগে বর্ণনা করা হয়েছে39। এরপর সেকশনগুলিকে একটি সেকশনিং চেম্বারে স্থানান্তরিত করা হয় যেখানে ক্রমাগত ঘরের তাপমাত্রায় অক্সিজেনেশন থাকে এবং aCSF থাকে: ১০ মিলিমিটার গ্লুকোজ, ২৬ মিলিমিটার NaHCO3, ২.৫ মিলিমিটার KCl, ১.২৫ মিলিমিটার NaHPO4, ১ মিলিমিটার MgSO4, ২ মিলিমিটার CaCl2 এবং ১২৬ মিলিমিটার NaCl (২৯৮ মিলিমিটার)। রেকর্ডিংয়ের কমপক্ষে ৪৫ মিনিট আগে। সেকশনগুলিকে একটি নিমজ্জিত চেম্বারে রেকর্ড করা হয়েছিল যেখানে সেগুলিকে aCSF (৯৫% O2 এবং ৫% CO2 ভায়াল) দিয়ে ক্রমাগত পারফিউশন করা হয়েছিল। সমস্ত ডেটা ঘরের তাপমাত্রায় রেকর্ড করা হয়েছিল। t-hCO নিউরনগুলিকে ১২৭ মিলিমিটার পটাসিয়াম গ্লুকোনেট, ৮ মিলিমিটার NaCl, ৪ মিলিমিটার ম্যাগনেসিয়াম ATP, ০.৩ মিলিমিটার সোডিয়াম GTP, ১০ মিলিমিটার HEPES এবং ০.৬ মিলিমিটার EGTA, pH ৭.২, KOH (২৯০ মিলিমিটার) দিয়ে সামঞ্জস্যপূর্ণ অভ্যন্তরীণ দ্রবণ দিয়ে ভরা বোরোসিলিকেট কাচের পাইপেট দিয়ে শেষ করা হয়েছিল। পুনরুদ্ধারের জন্য, রেকর্ডিং দ্রবণে বায়োসাইটিন (0.2%) যোগ করা হয়েছিল।
একটি মাল্টিক্ল্যাম্প ৭০০বি অ্যামপ্লিফায়ার (মলিকুলার ডিভাইস) এবং একটি ডিজিডেটা ১৫৫০বি ডিজিটাইজার (মলিকুলার ডিভাইস) ব্যবহার করে ডেটা সংগ্রহ করা হয়েছিল, ২ কিলোহার্টজে লো-পাস ফিল্টার করা হয়েছিল, ২০ কিলোহার্টজে ডিজিটাইজ করা হয়েছিল এবং ক্ল্যাম্পফিট (মলিকুলার ডিভাইস), অরিজিন (অরিজিনপ্রো)। ২০২১বি, অরিজিনল্যাব) এবং কাস্টম MATLAB ফাংশন (ম্যাথওয়ার্কস) ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। জংশন পটেনশিয়াল JPCalc ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল এবং এন্ট্রিগুলি -১৪ mV এর গণনা করা মানের সাথে সামঞ্জস্য করা হয়েছিল। অপারেশন IV-তে -২৫০ থেকে ৭৫০ পিএ পর্যন্ত ১০-২৫ পিএ ধাপে বর্তমান ধাপের একটি সিরিজ রয়েছে।
পূর্বে বর্ণিত hCO নিউরনের প্যাচ-ক্ল্যাম্প রেকর্ডিংয়ের সময় থ্যালামোকর্টিক্যাল স্লাইসে থ্যালামাস, সাদা পদার্থ এবং S1 অ্যাফেরেন্ট বৈদ্যুতিকভাবে উদ্দীপিত হয়েছিল। সংক্ষেপে, মস্তিষ্ককে 10° কোণে কাত করে একটি 3D প্রিন্টিং টেবিলের উপর স্থাপন করা হয়েছিল এবং মস্তিষ্কের সামনের অংশটি 35° কোণে কাটা হয়েছিল। এরপর মস্তিষ্ককে কাটা পৃষ্ঠের সাথে আঠা দিয়ে ভাগ করা হয়েছিল, থ্যালামোকর্টিক্যাল প্রোট্রুডিং অ্যাক্সনগুলিকে সংরক্ষণ করে। বাইপোলার টাংস্টেন ইলেকট্রোড (0.5 MΩ) একটি দ্বিতীয় মাইক্রোম্যানিপুলেটরে মাউন্ট করা হয়েছিল এবং প্রতি কোষে চারটি অঞ্চল (অভ্যন্তরীণ ক্যাপসুল, সাদা পদার্থ, S1 এবং hCO) উদ্দীপিত করার জন্য কৌশলগতভাবে স্থাপন করা হয়েছিল। 0.03–0.1 Hz এ 300 µA ফ্যাসিক উদ্দীপনার পরে সিনাপটিক প্রতিক্রিয়া রেকর্ড করুন।
hChR2-প্রকাশকারী hCO নিউরনগুলিকে 480 nm-এ সক্রিয় করা হয়েছিল এবং কোষের কাছে hChR2 এক্সপ্রেশন রেকর্ড করার জন্য একটি LED (Prizmatix) দ্বারা উৎপন্ন আলোক স্পন্দনগুলি একটি ×40 অবজেক্টিভ (0.9 NA; অলিম্পাস) এর মাধ্যমে প্রয়োগ করা হয়েছিল। আলোকিত ক্ষেত্রের ব্যাস প্রায় 0.5 মিমি এবং মোট শক্তি 10-20 mW। স্পন্দনের প্রস্থ 10 ms-এ সেট করা হয়েছিল, যা আচরণগত শিক্ষা পরীক্ষার সময় প্রদত্ত স্পন্দনের সাথে মিলে যায়। 1 থেকে 20 Hz পর্যন্ত বিভিন্ন উদ্দীপনা ফ্রিকোয়েন্সি ব্যবহার করা হয়েছিল, তবে পরিমাণ নির্ধারণের জন্য সিরিজের শুধুমাত্র প্রথম স্পন্দন ব্যবহার করা হয়েছিল। সিনাপটিক ইনহিবিটরি বা সুবিধাজনক পথের উপর প্রভাব কমাতে ট্রেনগুলির মধ্যে ব্যবধান সাধারণত 30 সেকেন্ডের বেশি হয়। hChR2 প্রতিক্রিয়া মনোসিন্যাপটিক কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য, আমরা EPSC প্রতিক্রিয়া অদৃশ্য না হওয়া পর্যন্ত বাথটাবে TTX (1 μM) প্রয়োগ করেছি এবং তারপরে 4-অ্যামিনোপাইরিডিন (4-AP; 100 μM) প্রয়োগ করেছি। সাধারণত, কয়েক মিনিটের মধ্যেই একটি প্রতিক্রিয়া ফিরে আসে, LED ফায়ারিং এবং EPSC জেনারেশনের মধ্যে কিছুটা বেশি বিলম্ব হয়। প্রতিক্রিয়াটি AMPA রিসেপ্টর দ্বারা চালিত কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য NBQX (10 μM) ব্যবহার করা হয়েছিল।
পূর্বে বর্ণিত পদ্ধতিতে তীক্ষ্ণ hCO অংশ তৈরি করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, hCO অংশগুলি 4% অ্যাগারোজে এমবেড করা হয়েছিল এবং 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 এবং 10 mM d-(+) -গ্লুকোজ ধারণকারী কোষে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল। অংশগুলিকে লাইকা VT1200 ভাইব্রেটর ব্যবহার করে ঘরের তাপমাত্রায় 200-300 µm এ কেটে ঘরের তাপমাত্রায় ASF এ সংরক্ষণ করা হয়েছিল। তারপর, সরাসরি স্লাইসস্কোপ মাইক্রোস্কোপের (সায়েন্টিফিকা) অধীনে hCO অংশগুলিতে সম্পূর্ণ কোষের প্যাচ-ক্যাম্প রেকর্ডিং করা হয়েছিল। অংশগুলিকে aCSF (95% O2 এবং 5% CO2) দিয়ে পারফিউম করা হয়েছিল এবং ঘরের তাপমাত্রায় কোষ সংকেত রেকর্ড করা হয়েছিল। hCO নিউরনগুলি একটি বোরোসিলিকেট কাচের পাইপেট ব্যবহার করে প্রয়োগ করা হয়েছিল যার দ্রবণে ১২৭ মিলিমিটার পটাসিয়াম গ্লুকোনেট, ৮ মিলিমিটার NaCl, ৪ মিলিমিটার ম্যাগনেসিয়াম ATP, ০.৩ মিলিমিটার সোডিয়াম GTP, ১০ মিলিমিটার HEPES এবং ০.৬ মিলিমিটার EGTA, অভ্যন্তরীণ pH ৭, ২, KOH (অস্মোলারিটি ২৯০) দিয়ে সামঞ্জস্য করা হয়েছিল। পুনরুদ্ধারের উদ্দেশ্যে, অভ্যন্তরীণ দ্রবণে ০.২% বায়োসাইটিন যোগ করুন।
ক্ল্যাম্পেক্স (ক্ল্যাম্পেক্স ১১.১, মলিকুলার ডিভাইস) একটি মাল্টিক্ল্যাম্প ৭০০বি অ্যামপ্লিফায়ার (মলিকুলার ডিভাইস) এবং একটি ডিজিডেটা ১৫৫০বি ডিজিটাইজার (মলিকুলার ডিভাইস) ব্যবহার করে ডেটা সংগ্রহ করেছে, ২ কিলোহার্টজে লো-পাস ফিল্টার করা হয়েছে, ২০ কিলোহার্টজে ডিজিটাইজ করা হয়েছে এবং বিশ্লেষণের জন্য ক্ল্যাম্পফিট (সংস্করণ ১০.৬) ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছে, আণবিক ডিভাইস) এবং কাস্টম MATLAB ফাংশন (MATLAB ২০১৯বি, ম্যাথওয়ার্কস)। জংশন পটেনশিয়াল JPCalc ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল এবং এন্ট্রিগুলি -১৪ mV এর গণনা করা জংশন পটেনশিয়ালের সাথে সামঞ্জস্য করা হয়েছিল। অপারেশন IV-তে -৫০ থেকে ২৫০ পিএ পর্যন্ত ৫-১০ পিএ ধাপে বর্তমান ধাপের একটি সিরিজ রয়েছে।
পিঞ্চড নিউরনের রূপগত পুনর্গঠনের জন্য, অভ্যন্তরীণ দ্রবণে 0.2% বায়োসাইটিন (সিগমা-অ্যালড্রিচ) যোগ করা হয়েছিল। হ্যাকিংয়ের পর কোষগুলিকে কমপক্ষে 15 মিনিটের জন্য প্রাইম করা হয়। তারপর পাইপেটটি ধীরে ধীরে 1-2 মিনিটের জন্য টানা হয় যতক্ষণ না নিবন্ধিত ঝিল্লি সম্পূর্ণরূপে সিল করা হয়। সেকশন ফিজিওলজি পদ্ধতি অনুসরণ করে, সেকশনগুলিকে 4% PFA তে 4° C. তাপমাত্রায় রাতারাতি স্থির করা হয়েছিল, PBS X3 দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং স্ট্রেপটাভিডিন-কনজুগেটেড ডাইলাইট 549 বা ডাইলাইট 405 (ভেক্টর ল্যাবস) দিয়ে 1:1000 পাতলা করা হয়েছিল। প্যাচ ক্ল্যাম্প রেকর্ডিংয়ের সময় ঘরের তাপমাত্রায় 2 ঘন্টা ধরে বায়োসাইটিন (2%; সিগমা-অ্যালড্রিচ) দিয়ে ভরা কোষগুলিকে লেবেল করা হয়েছিল। এরপর সেকশনগুলিকে অ্যাকোয়ামাউন্ট (থার্মো সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে মাইক্রোস্কোপি স্লাইডে মাউন্ট করা হয়েছিল এবং পরের দিন একটি লাইকা TCS SP8 কনফোকাল মাইক্রোস্কোপে একটি সংখ্যাসূচক অ্যাপারচার ×40 1.3, ম্যাগনিফিকেশন ×0.9–1.0, xy সহ একটি তেল নিমজ্জন বস্তু ব্যবহার করে ভিজ্যুয়ালাইজ করা হয়েছিল। নমুনা গ্রহণের হার প্রতি মাইক্রনে প্রায় ৭ পিক্সেল। ১ µm ব্যবধানে Z-স্ট্যাকগুলি ধারাবাহিকভাবে প্রাপ্ত করা হয়েছিল এবং প্রতিটি নিউরনের সম্পূর্ণ ডেনড্রাইটিক ট্রি কভার করার জন্য z-স্ট্যাক মোজাইক এবং লাইকা-ভিত্তিক অটো-স্টিচিং করা হয়েছিল। এরপর neuTube 40 ইন্টারফেস ব্যবহার করে নিউরনগুলিকে আধা-ম্যানুয়ালি ট্র্যাক করা হয়েছিল এবং SWC ফাইল তৈরি করা হয়েছিল। এরপর ফাইলগুলি SimpleNeuriteTracer41 Fiji প্লাগইনে আপলোড করা হয়েছিল (ImageJ, সংস্করণ 2.1.0; NIH)।
স্ট্যানফোর্ড বিশ্ববিদ্যালয়ের ইনস্টিটিউশনাল রিভিউ বোর্ড কর্তৃক অনুমোদিত প্রোটোকল অনুসারে অবহিত সম্মতিতে মানব কর্টিকাল টিস্যু সংগ্রহ করা হয়েছিল। অবাধ্য মৃগীরোগের জন্য অস্ত্রোপচারের অংশ হিসাবে ফ্রন্টাল কর্টেক্স (মিডল ফ্রন্টাল জাইরাস) থেকে রিসেকশনের মাধ্যমে মানব প্রসবোত্তর টিস্যুর দুটি নমুনা (৩ এবং ১৮ বছর বয়সী) সংগ্রহ করা হয়েছিল। রিসেকশনের পরে, বরফ-ঠান্ডা NMDG-aCSF-তে টিস্যু সংগ্রহ করুন যার মধ্যে রয়েছে: ৯২ mM NMDG, ২.৫ mM KCl, ১.২৫ mM NaH2PO4, ৩০ mM NaHCO3, ২০ mM HEPES, ২৫ mM গ্লুকোজ, ২ mM থিওরিয়া, ৫ mM সোডিয়াম অ্যাসকরবেট, ৩ mM সোডিয়াম পাইরুভেট, ০.৫ mM CaCl2 4H2O এবং ১০ mM MgSO4 7H2O। ঘনীভূত হাইড্রোক্লোরিক অ্যাসিড দিয়ে pH 7.3-7.4 এ টাইট্রেট করুন। ৩০ মিনিটের মধ্যে টিস্যু পরীক্ষাগারে পৌঁছে দেওয়া হয় এবং উপরে বর্ণিত পদ্ধতি অনুযায়ী করোনাল সেকশন নেওয়া হয়।
স্ট্যানফোর্ড ইউনিভার্সিটি APLAC-অনুমোদিত পশু যত্ন নির্দেশিকা অনুসারে সমস্ত প্রাণীর প্রক্রিয়া সম্পাদিত হয়েছিল। ইঁদুরগুলিকে (প্রতিস্থাপনের পর ১৪০ দিনের বেশি) ৫% আইসোফ্লুরেন অ্যানেস্থেসিয়া দিয়ে প্ররোচিত করা হয়েছিল এবং অস্ত্রোপচারের মাধ্যমে ১-৩% আইসোফ্লুরেন দিয়ে অ্যানেস্থেসিয়া দেওয়া হয়েছিল। প্রাণীদের একটি স্টেরিওট্যাক্সিক ফ্রেমে (Kopf) স্থাপন করা হয়েছিল এবং ত্বকের নিচের দিকে টেকসই রিলিজ বুপ্রেনরফাইন (SR) ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। খুলি উন্মুক্ত করা হয়েছিল, পরিষ্কার করা হয়েছিল এবং ৩-৫টি হাড়ের স্ক্রু ঢোকানো হয়েছিল। t-hCO লক্ষ্য করার জন্য, আমরা MRI চিত্র থেকে স্টেরিওট্যাক্সিক স্থানাঙ্ক তৈরি করেছি। আগ্রহের স্থানে একটি গর্ত ছিদ্র করা হয়েছিল এবং ফাইবার (৪০০ µm ব্যাস, NA 0.48, Doric) hCO পৃষ্ঠ থেকে ১০০ µm নীচে নামানো হয়েছিল এবং UV-নিরাময়যোগ্য ডেন্টাল সিমেন্ট (Relyx) দিয়ে খুলিতে সুরক্ষিত করা হয়েছিল।
পূর্বে বর্ণিত পদ্ধতিতে ফাইবার ফটোমেট্রিক রেকর্ডিং করা হয়েছিল42। স্বতঃস্ফূর্ত কার্যকলাপ রেকর্ড করার জন্য, ইঁদুরগুলিকে একটি পরিষ্কার খাঁচায় রাখা হয়েছিল এবং একটি ফাইবার অপটিক ফটোমেট্রিক ডেটা অধিগ্রহণ সিস্টেমের সাথে সংযুক্ত একটি 400 µm ব্যাসের ফাইবার অপটিক প্যাচ কেবল (ডোরিক) ইমপ্লান্ট করা ফাইবার অপটিক কেবলের সাথে সংযুক্ত করা হয়েছিল। মোটর কার্যকলাপের 10 মিনিটের রেকর্ডিংয়ের সময়, প্রাণীগুলি খাঁচাটি অন্বেষণ করতে স্বাধীন ছিল। উদ্ভূত কার্যকলাপ রেকর্ড করার জন্য, ইঁদুরগুলিকে (প্রতিস্থাপনের 140 দিনেরও বেশি সময় পরে) আনয়নের জন্য 5% আইসোফ্লুরেন এবং রক্ষণাবেক্ষণের জন্য 1-3% আইসোফ্লুরেন দিয়ে চেতনানাশক দেওয়া হয়েছিল। প্রাণীটিকে একটি স্টেরিওট্যাকটিক ফ্রেমে (Kopf) রাখুন এবং t-hCO এর বিপরীত দিকের গোঁফগুলি প্রায় 2 সেমি পর্যন্ত ছাঁটাই করা হয় এবং একটি পাইজোইলেকট্রিক অ্যাকচুয়েটর (PI) এর সাথে সংযুক্ত একটি জালের মধ্য দিয়ে পাস করা হয়। একটি 400 µm ফাইবার অপটিক প্যাচ কেবল (ডোরিক) ইমপ্লান্ট করা ফাইবারের সাথে সংযুক্ত করা হয়েছিল এবং ডেটা অধিগ্রহণ সিস্টেমের সাথে সংযুক্ত করা হয়েছিল। t-hCO এর বিপরীত দিকের কাঁটাগুলিকে 20 মিনিটের রেকর্ডিং সময়কালে একটি পাইজোইলেকট্রিক ড্রাইভ দ্বারা এলোমেলোভাবে 50 বার (20 Hz এ 2 মিমি, প্রতি উপস্থাপনায় 2 সেকেন্ড) বিচ্যুত করা হয়েছিল। কাস্টম MATLAB কোড দিয়ে বিচ্যুতি সময় নিয়ন্ত্রণ করতে Arduino MATLAB সাপোর্ট প্যাকেজ ব্যবহার করুন। ট্রানজিস্টর-ট্রানজিস্টর লজিক (TTL) পালস ব্যবহার করে ইভেন্টগুলি ডেটা অর্জন সফ্টওয়্যারের সাথে সিঙ্ক্রোনাইজ করা হয়।
ইঁদুরদের (প্রতিস্থাপনের পর ১৪০ দিনের বেশি) ৫% আইসোফ্লুরেন অ্যানেস্থেসিয়া দিয়ে প্ররোচিত করা হয়েছিল এবং অস্ত্রোপচারের মাধ্যমে ১-৩% আইসোফ্লুরেন দিয়ে অ্যানেস্থেসিয়া দেওয়া হয়েছিল। প্রাণীদের একটি স্টেরিওট্যাক্সিক ফ্রেমে (Kopf) স্থাপন করা হয়েছিল এবং বুপ্রেনরফিন SR এবং ডেক্সামেথাসোন ত্বকের নিচের দিকে ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। মাথার খুলি উন্মুক্ত করা হয়েছিল, পরিষ্কার করা হয়েছিল এবং ৩-৫টি হাড়ের স্ক্রু ঢোকানো হয়েছিল। t-hCO লক্ষ্য করার জন্য, আমরা MRI চিত্রগুলি থেকে স্টেরিওট্যাক্সিক স্থানাঙ্ক তৈরি করেছি। প্রতিস্থাপন করা hCO এর উপর সরাসরি একটি উচ্চ গতির ড্রিল দিয়ে একটি বৃত্তাকার ক্র্যানিওটমি (প্রায় ১ সেমি ব্যাস) করা হয়েছিল। হাড় যতটা সম্ভব পাতলা হয়ে গেলে, কিন্তু পুরো হাড়ের মধ্য দিয়ে ড্রিল করার আগে, অবশিষ্ট অক্ষত পেলভিক ডিস্ক অপসারণ করতে ফোর্সেপ ব্যবহার করুন যাতে অন্তর্নিহিত t-hCO প্রকাশ পায়। ক্র্যানিওটমিটি জীবাণুমুক্ত স্যালাইন দিয়ে ভরা হয়েছিল, এবং একটি কভারস্লিপ এবং একটি বিশেষ হেড পিন UV-নিরাময়কারী ডেন্টাল সিমেন্ট (Relyx) দিয়ে খুলির সাথে সংযুক্ত করা হয়েছিল।
Nikon LWD (×16, 0.8 NA) অবজেক্টিভ সহ একটি Bruker মাল্টিফোটন মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে দুই-ফোটন ইমেজিং করা হয়েছিল। GCaMP6 ইমেজিং 920 nm এ করা হয়েছিল, যার 1.4x একক z-প্লেন ম্যাগনিফিকেশন এবং 8x গড়ে 7.5 fps ছিল। ইঁদুরগুলিকে 5% আইসোফ্লুরেন অ্যানেস্থেসিয়া দিয়ে প্ররোচিত করা হয়েছিল এবং 1-3% আইসোফ্লুরেন দিয়ে বজায় রাখা হয়েছিল। ইঁদুরগুলিকে একটি কাস্টম তৈরি হেড ফিক্সচারে স্থাপন করা হয়েছিল এবং লেন্সের নীচে স্থাপন করা হয়েছিল। মোটর কার্যকলাপের 3 মিনিটের পটভূমি রেকর্ডিং পাওয়া গিয়েছিল। রেকর্ডিংয়ের 20 মিনিটের মধ্যে, 50টি পাফ (প্রতিটি উপস্থাপনা 100 ms লম্বা) এলোমেলোভাবে একটি পিকোসপ্রাইসার ব্যবহার করে t-hCO এর বিপরীতে হুইস্কার প্যাডে সরবরাহ করা হয়েছিল। কাস্টম MATLAB কোড দিয়ে বার্স্ট টাইম নিয়ন্ত্রণ করতে Arduino MATLAB সাপোর্ট প্যাকেজ ব্যবহার করুন। TTL পালস ব্যবহার করে ডেটা অ্যাকুইজিশন সফ্টওয়্যার (PrairieView 5.5) এর সাথে ইভেন্টগুলি সিঙ্ক্রোনাইজ করুন। বিশ্লেষণের জন্য, ফিজিতে চালু হওয়া MoCo প্রোগ্রামে অ্যাফাইন সংশোধন ব্যবহার করে xy গতির জন্য চিত্রগুলি সংশোধন করা হয়েছিল। CNMF-E43 ব্যবহার করে পৃথক কোষ থেকে ফ্লুরোসেন্ট ট্রেস নিষ্কাশন। আগ্রহের প্রতিটি অঞ্চলের জন্য ফ্লুরোসেন্স নিষ্কাশন করা হয়েছিল, dF/F বক্ররেখায় রূপান্তরিত করা হয়েছিল এবং তারপর z-স্কোরে রূপান্তরিত করা হয়েছিল।
ইঁদুরদের (প্রতিস্থাপনের পর ১৪০ দিনের বেশি) ৫% আইসোফ্লুরেন অ্যানেস্থেসিয়া দিয়ে প্ররোচিত করা হয়েছিল এবং অস্ত্রোপচারের মাধ্যমে ১-৩% আইসোফ্লুরেন দিয়ে অ্যানেস্থেসিয়া দেওয়া হয়েছিল। প্রাণীদের একটি স্টেরিওট্যাক্সিক ফ্রেমে (Kopf) স্থাপন করা হয়েছিল এবং বুপ্রেনরফিন SR এবং ডেক্সামেথাসোন ত্বকের নিচের দিকে ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। t-hCO এর বিপরীত দিকের গোঁফগুলি প্রায় ২ সেমি কেটে একটি পাইজোইলেকট্রিক অ্যাকচুয়েটরের সাথে সংযুক্ত একটি জালের মাধ্যমে থ্রেড করা হয়েছিল। মাথার খুলিটি উন্মুক্ত এবং পরিষ্কার করা হয়েছিল। মাথার খুলির সাথে একটি স্টেইনলেস স্টিলের গ্রাউন্ড স্ক্রু সংযুক্ত করা হয়েছিল। t-hCO লক্ষ্য করার জন্য, আমরা MRI চিত্রগুলি থেকে স্টেরিওট্যাক্সিক স্থানাঙ্ক তৈরি করেছি। t-hCO এর ঠিক উপরে একটি উচ্চ গতির ড্রিল দিয়ে একটি বৃত্তাকার ক্র্যানিওটমি (প্রায় ১ সেমি ব্যাস) করুন। হাড় যতটা সম্ভব পাতলা হয়ে গেলে, কিন্তু পুরো হাড়ের মধ্য দিয়ে ড্রিল করার আগে, অবশিষ্ট অক্ষত পেলভিক ডিস্কটি অপসারণ করতে ফোর্সেপ ব্যবহার করুন যাতে অন্তর্নিহিত t-hCO প্রকাশ পায়। পৃথক কোষগুলি 32-চ্যানেল বা 64-চ্যানেল উচ্চ-ঘনত্বের সিলিকন প্রোব (ক্যামব্রিজ নিউরোটেক) ব্যবহার করে রেকর্ড করা হয়েছিল, যা গ্রাউন্ড স্ক্রুতে গ্রাউন্ড করা হয়েছিল এবং RHD অ্যামপ্লিফায়ার (ইন্টান) দিয়ে প্রি-এমপ্লিফাইড করা হয়েছিল। ক্র্যানিওটমির মাধ্যমে ইলেক্ট্রোডগুলিকে লক্ষ্য স্থানে নামাতে ম্যানিপুলেটর ব্যবহার করুন, যা জীবাণুমুক্ত স্যালাইন দিয়ে ভরা। ওপেন ইফিস ডেটা অ্যাকুইজিশন সিস্টেম ব্যবহার করে 30 kHz ফ্রিকোয়েন্সিতে ডেটা সংগ্রহ করা হয়েছিল। রেকর্ডিংটি তখনই অব্যাহত ছিল যখন আমরা 10 টিরও বেশি চ্যানেলে অত্যন্ত সম্পর্কযুক্ত ছন্দবদ্ধ স্বতঃস্ফূর্ত কার্যকলাপ সনাক্ত করেছি, যা ইঙ্গিত দেয় যে ইলেক্ট্রোডগুলি গ্রাফ্টে অবস্থিত ছিল (দুই-ফোটন ক্যালসিয়াম ইমেজিং ডেটার উপর ভিত্তি করে)। মোটর কার্যকলাপের 10 মিনিটের পটভূমি রেকর্ডিং পাওয়া গেছে। t-hCO এর বিপরীত দিকের হুইস্কারগুলি 20 মিনিটের রেকর্ডিং সময়কালে একটি পাইজোইলেকট্রিক ড্রাইভ দ্বারা এলোমেলো সময়ে 50 বার (20 Hz এ 2 মিমি, প্রতি উপস্থাপনায় 2 সেকেন্ড) বিচ্যুত হয়েছিল। Arduino (MATLAB 2019b) এর জন্য MATLAB সাপোর্ট প্যাকেজ ব্যবহার করে, কাস্টম MATLAB কোড দিয়ে বিচ্যুতি সময় নিয়ন্ত্রণ করুন। ডেটা অর্জন সফ্টওয়্যারের সাথে ইভেন্টগুলিকে সিঙ্ক্রোনাইজ করতে TTL পালস ব্যবহার করুন।
অপটিক্যাল মার্কিং পরীক্ষার জন্য, 473 nm লেজার (Omicron) এর সাথে সংযুক্ত একটি 200 µm অপটিক্যাল প্যাচ কর্ড (Doric) ক্র্যানিওটমির উপরে স্থাপিত 200 µm অপটিক্যাল ফাইবারের সাথে সংযুক্ত করা হয়েছিল। এর ঠিক আগে, জাম্পার পাওয়ার 20 মেগাওয়াটে সামঞ্জস্য করুন। ক্র্যানিওটমির মাধ্যমে ইলেক্ট্রোডগুলিকে লক্ষ্য স্থানে নামাতে ম্যানিপুলেটর ব্যবহার করুন, যা জীবাণুমুক্ত স্যালাইন দিয়ে ভরা হয়। রেকর্ডিংয়ের শুরুতে, 473 nm (ফ্রিকোয়েন্সি 2 Hz, পালস সময়কাল 10 ms) আলোর দশটি পালস নির্গত হয়েছিল। আলোক সংবেদনশীল কোষগুলিকে এমন কোষ হিসাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়েছিল যারা 70% বা তার বেশি পরীক্ষায় 10 ms আলোর মধ্যে স্পাইক প্রতিক্রিয়া প্রদর্শন করে।
পোস্টের সময়: নভেম্বর-১৯-২০২২
